EA005815B1 - Комбинация ингибиторов транспорта желчных кислот в подвздошной кишке и ингибиторов белка, переносящего эфиры холестерина, для сердечно-сосудистых показаний - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к комбинации сердечно-сосудистых терапевтических соединений, предназначенных для профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания, включая гиперхолестеринемию, атеросклероз или гиперлипидемию. Раскрытые комбинации включают ингибитор транспорта желчных кислот в подвздошной кишке вместе с ингибитором белка, переносящего эфир холестерина (СЕТР).

Description

По данной заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки США сер. № 60/143047, поданной 7 июля 1999 г., и предварительной заявки США сер. № 60/113955, поданной 23 декабря 1998 г.

Настоящее изобретение относится к способам лечения сердечно-сосудистых заболеваний и, конкретно, оно относится к комбинациям соединений, композициям и способам их применения в медицине, в частности, для профилактики и лечения гиперлипидемических состояний, таких как состояния, связанные с атеросклерозом, гиперхолестеринемией и другими заболеваниями коронарной артерии у млекопитающих. Более конкретно, данное изобретение относится к соединениям, ингибирующим соединение, транспортирующее (транспортер) желчные кислоты в подвздошной кишке (ΙΒΑΤ). Данное изобретение также относится к соединениям, ингибирующим активность белка, переносящего эфиры холестерина (СЕТР).

Описание уровня техники

Установлено, что гиперлипидемические состояния, связанные с повышенными концентрациями общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности (БИБ), являются основными факторами риска сердечно-коронарной недостаточности и особенно атеросклероза. Так как высокие уровни холестерина БИБ увеличивают риск атеросклероза, способы снижения уровня холестерина БОБ в плазме могли бы быть терапевтически полезными для лечения атеросклероза и других заболеваний, связанных с накоплением липидов в кровеносных сосудах. Данные заболевания включают, не ограничиваясь ими, сердечно-коронарную недостаточность, заболевание периферических сосудов и удар.

Атеросклероз лежит в основе большей части заболеваний коронарной артерии (САО), основной причины заболеваемости и смертности в современном обществе. Было показано, что высокий уровень холестерина БОБ (выше приблизительно 180 мг/дл) и низкий уровень холестерина НЭБ (ниже 35 мг/дл) вносят важный вклад в развитие атеросклероза. Неблагоприятные соотношения НОБ/БИБ отрицательно влияют на другие заболевания или факторы риска, такие как заболевания периферических сосудов, удар и гиперхолестеринемия.

Обнаружено, что нарушение рециркуляции желчных кислот из просвета кишечного тракта уменьшает уровни сывороточного холестерина. Были накоплены эпидемиологические данные, показывающие, что такое уменьшение приводит к улучшению состояния атеросклероза. 81ейгоп5ку в 1и1егас1юи οί Ы1е ас1Й8 апй с1ю1е51его1 νίίΐι попкуйетк адепк йаушд йуросйокйетоктк рторейкк, ВюсЫтка е1 Βίοрйуыса Ас1а, 1210, 255-287 (1994) обсуждает биохимию, физиологию и известные активные агенты, имеющие отношение к желчным кислотам и холестерину.

Показано, что временные патофизиологические взаимодействия согласуются с нарушениями энтерогепатической циркуляции желчных кислот у людей с наследственной утратой ΙΒΑΤ активности, как опубликовано НеиЫ, ЕЕ., е1 а1. См. Рптагу Вйе Ас1й МаЫЬюгрйоп: ИеГесйуе ίη Уйто 11еа1 Асйуе Вйе Ас1й Ттапкрой, Сайтоеп1его1оду, 83, 804-11 (1982).

В другом подходе к уменьшению рециркуляции желчных кислот система транспорта желчных кислот в подвздошной кишке является предполагаемой фармацевтической мишенью для лечения гиперхолестеринемии, основанного на нарушении энтерогепатической циркуляции с помощью специфических ингибиторов транспорта (Кгатег, е1 а1., 1п1ейта1 Вйе Ас1й АЬкотрйоп Т1е 1оитпа1 оГ Вю1одка1 Сйеткйу, 268 (24) 18035-46 (1993)).

В нескольких индивидуальных патентных заявках НоесНй Ак1кпде5е115с11ай раскрывает полимеры, включающие различные встречающиеся в природе составные части энтерогепатической циркуляционной системы и их производные, включая желчную кислоту, которые ингибируют физиологический транспорт желчных кислот, с целью достаточного уменьшения уровня холестерина БОБ, указанные полимеры являются эффективными в качестве лекарственных препаратов, и, в частности, для применения в качестве гипохолестеринемических агентов. Индивидуальные патентные заявки Ноесйй, которые раскрывают такие соединения, ингибирующие транспорт желчных кислот, отдельно перечислены ниже.

К1. Патентная заявка Канады № 2025294.

В2. Патентная заявка Канады № 2078588.

В3. Патентная заявка Канады № 2085782.

В4. Патентная заявка Канады № 2085830.

К5. Заявка ЕР № 0379161.

В6. Заявка ЕР № 0549967.

В.7. Заявка ЕР № 0559064.

В.8. Заявка ЕР № 0563731.

Выбранные бензотиепины раскрыты в мировой патентной заявке номер XVО 93/321146 для многочисленных применений, включая метаболизм жирных кислот и коронарные сосудистые заболевания.

Известно, что другие выбранные бензотиепины могут применяться в качестве гиполипемических и гипохолестеринемических агентов, особенно, для лечения или профилактики атеросклероза, как раскрыто в заявке № ЕР 508425. Патентная заявка Франции, РВ 2661676, раскрывает дополнительные бензотиепины для применения в качестве гиполипемических и гипохолестеринемических агентов. Кроме того, патентная заявка № νθ 92/18462 перечисляет другие бензотиепины для применения в качестве гиполи

- 1 005815 пемических и гипохолестеринемических агентов. Патент США № 5994391 (Бее с1 а1.). Каждый из бензотиепиновых гиполипемических и гипохолестеринемических агентов, описанных в данных индивидуаль ных патентных заявках, ограничен амидом, связанным с атомом углерода, соседним по отношению к фенильному циклу сопряженного бициклобензотиепинового цикла.

Дополнительные бензотиепины, которые могут применяться для лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, раскрыты в патентной заявке № РСТ/Б8 95/10863. Другие бензотиепины, которые могут применяться для профилактики и лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, а также фармацевтические композиции таких бензотиепинов, описаны в РСТ/Б8 97/04076. Еще другие бензотиепины и их композиции, которые могут применяться для профилактики и лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, описаны в заявке США с серийным № 08/816065.

В описании \Ус11еоте ЕоипбаНоп Ытйеб патентной заявки № νθ 93/16055 Нуро11р1бет1с Вепхо11иа/ерте Сотроипбк раскрыто, что ίη νίΙΐΌ ингибирование транспорта желчных кислот коррелирует с гиполипемической активностью. Данная публикация описывает ряд гиполипидемических бензотиазепиновых соединений. Дополнительные гиполипидемические бензотиазепиновые соединения (особенно 2,3,4,5-тетрагидробензо-1-ти-4-азепиновые соединения) раскрыты в патентной заявке № XVО 96/05188. Особенно применяемым бензотиазепином, раскрытым в νθ 96/05188, является соединение формулы В-2. Дополнительные гиполипидемические бензотиазепиновые соединения описаны в патентной заявке № νθ 96/16051.

(3К,5К.)-3-бутил-3-этил-2,3,4,5-тетрагидро-7,8-диметокси-5-фенил-1,4-бензотиазепина 1,1-диоксид Другие бензотиазепиновые соединения, которые могут применяться для контролирования уровня холестерина, описаны в патентной заявке РСТ № νθ 99/35135. В данное описание включено соединение В-7.

Далее ингибиторные соединения 1ВАТ включают класс нафталиновых соединений, описанных Т. 1сЫйа§Ы е1 а1. в 1. РНагтасок Ехр. ТНег.. 284(1), 43-50 (1998). В данном классе особенно полезным является соединение 8-8921 (метил 1-(3,4-диметоксифенил)-3-(3-этилвалерил)-4-гидрокси-6,7,8-триметокси-2-нафтоат). Структура 8-8921 показана в формуле В-20. Дополнительные нафталиновые соединения или производные лигнина, которые могут применяться для лечения или профилактики гиперлипидемии или атеросклероза, описаны в патентной заявке РСТ № νθ 94/24087.

Было показано, что ингибирование белка, переносящего эфир холестерина (СЕТР), эффективно изменяет соотношение НББ/БББ в плазме и, как предполагается, подавляет развитие и/или возникновение некоторых сердечно-сосудистых заболеваний. СЕТР представляет собой белок плазмы, который содействует перемещению эфиров холестерина и триглицеридов между различными липопротеинами крови (Та11, 1. Ь1р1б Кек., 34, 1255-74 (1993)).

Перемещение эфира холестерина от НЭБ к БББ с помощью СЕТР приводит к снижению холесте

- 2 005815 рина НОБ. Следовательно, ингибирование СЕТР должно приводить к увеличению уровня холестерина НББ и снижению уровня холестерина БОБ в плазме, обеспечивая посредством этого терапевтически улучшенный профиль липидов плазмы. Данный эффект раскрыт в МсСаййу, Мебюша1 Век. Рсук.. 13, 139-59 (1993). Дополнительно он также описан в δίΐοτί, Рйагтас. Тйег., 67, 443-47 (1995)). Данное явление впервые было продемонстрировано 8\тепкоп с! а1., (1. ΒίοΙ. Сйеш., 264, 14318 (1989)) с помощью моноклональных антител, специфически ингибирующих СЕТР. У кроликов данные антитела вызывают увеличение уровня холестерина НОБ и уменьшение уровня холестерина БОБ в плазме. 8оп с! а1. (Βίοсй1ш. Вюрйук. Ас!а. 795, 743-480 (1984)) описывают белки человеческой плазмы, ингибирующие СЕТР. Патент США 5519001, включенный в данный документ в качестве ссылки, выданный Кикйетайа е! а1., описывает пептид, состоящий из 36 аминокислот, полученный из аро С-1 бабуина, который ингибирует активность СЕТР. Сйо е! а1. (ВюсЫш. Вюрйук. Ас1а, 1391, 133-144 (1998)) описывает пептид плазмы свиньи, который ингибирует человеческий СЕТР. Βοηίη е! а1. (1. Рерйбе Век., 51, 216-225 (1998)) раскрывает декапептидный ингибитор СЕТР. Депспептидный грибковый метаболит раскрыт как ингибитор СЕТР Небде е! а1. в Вюотд. Меб. Сйет. Бей., 8, 1277-80 (1998).

Существует несколько сообщений о непептидных соединениях, действующих как ингибиторы СЕТР. Ваттей е! а1. (1. Ат. Сйет. 8ос, 188, 7863-63 (1996)) описывают ингибиторы СЕТР, содержащие циклопропан. Другие ингибиторы СЕТР, содержащие циклопропан, описаны Кио е! а1. (1. Ат. Сйет. 8ос, 117, 10629-34 (1995)). Р|е!хопка е! а1. (Вюотд. Меб. Сйет. Бей., 6, 1951-54 (1996)) описывают фосфонатсодержащие аналоги эфира холестерина в качестве ингибиторов СЕТР. Соуа1 е! а1. (Вюотд. Меб. Сйет. Бей., 5, 605-610 (1995)) описывают А1ебепбю1-А и -В и родственные сесквитерпеновые соединения в качестве ингибиторов СЕТР. Бее е! а1. (1. Апййюйск, 49, 693-96 (1996)) описывают ингибиторы СЕТР, полученные из насекомых и грибков. Викй е! а1. (Б1р1бк, 25, 216-220, (1990)) описывают ацетилбромид холестерина в качестве ингибитора СЕТР. Мойоп апб 2Пусгкшй (1. Б1р1б Век., 35, 836-47 (1982)) описывают, что п-хлорртутьфенилсульфонат, п-гидроксиртутьбензоат и этилртутьтиосалицилат ингибируют СЕТР. Соппо1у е! а1. (Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт., 223, 42-47 (1996)) описывают другие цистеинмодифицированные реагенты в качестве ингибиторов СЕТР. Х1а е! а1. описывают 1,3,5-триазины в качестве ингибиторов СЕТР (Вюотд. Меб. Сйет. Бей., 6, 919-22 (1996)). В1кда1ег е! а1. (Б1р1бк, 29, 811-8 (1994)) описывают 4-фенил-5-тридецил-4Н-1,2,4-триазолтиол в качестве ингибитора СЕТР. Другие триазоловые ингибиторы СЕТР описаны в патентной заявке США с серийным № 09/153360, включенной в данный документ в качестве ссылки. 81коткк1 е! а1. раскрывают другие новые ингибиторы СЕТР в патентной заявке РСТ № АО 9914204.

Замещенные 2-меркаптоанилинамидные соединения могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, и такие терапевтические соединения описаны Н. 8Ыпка1 е! а1. в патентной заявке РСТ № АО 98/35937.

Некоторые замещенные гетероалкиламиновые соединения известны как ингибиторы СЕТР. В европейской патентной заявке № 796846 8с1ишб! е! а1. описываются 2-арилзамещенные пиридины как ингибиторы белка, переносящего эфир холестерина, которые могут применяться в качестве сердечнососудистых агентов. Одним из заместителей углерода С₃ пиридинового цикла может быть гидроксиалкильная группа. В европейской патентной заявке № 801060 Οο\ν апб Апдй! описывают гетероциклические производные, замещенные продуктом добавления альдегида к алкиламину с получением 1гидрокси-1-аминов. Опубликовано, что данные соединения являются агонистами в3-адренергических рецепторов, которые могут применяться при лечении диабетов и других нарушений. В патентной заявке Великобритании № 2305665 Е1ксйет е! а1. раскрывают 3-агонистзамещенные вторичным аминоспиртом пиридиновые производные, которые могут применяться для лечения некоторых нарушений, включающих нарушения уровня холестерина, и атеросклеротические заболевания. В европейской патентной заявке № 818448 (включенной в данный документ в качестве ссылки) 8сйпйб! е! а1. описывают тетрагидрохинолиновые производные как ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина. В европейской патентной заявке № 818197 8сйшек е! а1. описывают пиридины с конденсированными гетероциклами как ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина. Вгапбек е! а1. в патентной заявке Германии № 19627430 описывают бициклические конденсированные пиридиновые производные как ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина. В патентной заявке РСТ № АО 9839299 Ми11ег-Ойетапп е! а1. описывают хинолиновые производные как ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина.

Полициклические соединения, которые могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, также раскрыты А. Оотига е! а1. в патенте Японии № 10287662. Например, терапевтические соединения, имеющие структуры С-1 и С-8, получают путем культивирования Решсййит крр.

Циклоалкилпиридины, которые могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, раскрыты 8сйпйб! е! а1. в европейском патенте № ЕР 818448. Например, терапевтическое соединение, имеющее структуру С-9, раскрыто как особенно эффективное в качестве ингибитора СЕТР.

Замещенные тетрагидронафталиновые соединения, которые могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, описаны в патентной заявке № АО 9914174. Конкретно, в данном описании в качестве ингибитора СЕТР описано соединение (88)-3-циклопентил-1-(4-фторфенил)-2-[(8)-фтор(4-трифторметилфенил)метил]-8-гидрокси-6-спироциклобутил-5,6,7,8-тетрагидронафтилин.

- 3 005815

Некоторые 4-гетероарилтетрагидрохинолины, которые могут применяться в качестве ингибиторов СЕТР, описаны в патентной заявке РСТ № νθ 9914215. Например, в данном описании в качестве ингибитора СЕТР описан 3-(4-трифторметилбензоил)-5,6,7,8-тетрагидрохинолин-5-он.

В литературе были описаны некоторые комбинированные терапии, предназначенные для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Комбинирование ингибиторов ΙΒΑΤ с ингибиторами НМС СоА редуктазы, которые могут применяться для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, раскрыты в патентной заявке США № 09/037308.

Комбинированная терапия с использованием флювастатина и ницеритррла описана 1. 8акак1 е! а1. (И.). Данные исследователи сделали вывод, что комбинация флювастатина и ницеритрола в дозе, составляющей 750 мг/дневную дозу, по-видимому, не увеличивает и не ослабляет полезных эффектов флювастатина.

Ь. СакЫп-НетрЫ11 е! а1. (1. Ат. Меб. Аккос, 264 (23), 3013-17 (1990)) описывают благоприятные действия комбинированной терапии с использованием колестипола и ниацина на атеросклероз коронарных сосудов. Описанные действия включают отсутствие прогрессирования и регрессию нативных бляшек в коронарной артерии.

Комбинированная терапия с использованием аципимокса и симвастатина демонстрирует благоприятное влияние на уровень НЭ1 у пациентов с высокими уровнями триглицеридов (Ν. НоодегЬгидде е! а1., I 1п!егпа1 Меб., 241, 151-55 (1997)).

Комбинированная терапия с использованием ситостанолового эфира маргарина и правастатина описана Н. ОуШпд е! а1. (1. Ыр1б Век., 37, 1776-85 (1996)). Авторы сообщают, что в результате данной терапии одновременно ингибируется абсорбция холестерина и значительно снижается уровень холестерина ЬПЬ у людей с инсулиннезависимым диабетом.

ΒΐΌ\νπ е! а1. (№\ν Епд. 1. Меб., 323 (19), 1289-1339 (1990)) описывают комбинированную терапию с использованием ловастатина и колестипола, в результате которой уменьшается развитие атеросклеротических бляшек и увеличивается регрессия бляшек по сравнению с использованием одного ловастатина.

Комбинированная терапия с использованием ингибитора секреции ароВ и ингибитора СЕТР раскрыта Сйапд е! а1. в патентной заявке РСТ № νθ 9823593.

Висй е! а1. (патентная заявка РСТ № XVО 9911263) описывают комбинированную терапию, включающую амлодипиновое и статиновое соединения, предназначенную для лечения субъектов, страдающих от грудной жабы, атеросклероза, одновременно от гипертонии и гиперлипидемии, и для лечения симптомов остановки сердца. Висй е! а1. описывает в патентной заявке РСТ № νθ 9911259 комбинированную терапию, включающую амлодипин и аторвастатин.

8сой е! а1. (патентная заявка РСТ № νθ 9911260) описывает комбинированную терапию, включающую аторвастатин и антигипертонический агент.

Оейтаг апб О1Ькоп (патентная заявка Великобритании № ОВ 2329334 А) заявляют терапевтическую композицию, которая может применяться для уменьшения уровней липопротеинов низкой плотности и холестерина в плазме, данная композиция включает ингибитор НМО СоА редуктазы и агент, образующий комплексы с желчью.

Вышеприведенные ссылки демонстрируют, что в настоящее время существует необходимость в поиске безопасных, эффективных агентов, которые могут быть использованы для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Краткое описание изобретения

В данном документе описываются комбинированные терапии с использованием сердечнососудистых препаратов, направленные на удовлетворение существующей в настоящее время потребности в поиске безопасных и эффективных агентов, которые можно применять для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Одним из объектов настоящего изобретения является комбинированная терапия, включающая применение первого количества ингибитора ΙΒΑΤ и второго количества другого сердечно-сосудистого терапевтического препарата, который может применяться для профилактики или лечения гиперлипидемии, атеросклероза или гиперхолестеринемии, где упомянутое первое и второе количества вместе составляют антигиперлипидемическое, антиатеросклеротическое или антигиперхолестеринемическое эффективное количество данных соединений. Например, одно из многих воплощений настоящего изобретения относится к комбинированной терапии, включающей терапевтические дозировки ингибитора ΙΒΑΤ и ингибитора СЕТР. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к комбинированной терапии, включающей терапевтические дозировки бензотиепинового ингибитора ΙΒΑΤ и ингибитора СЕТР.

Настоящее изобретение также относится к применению любой из описанных здесь сердечнососудистых комбинированных терапий для профилактики или лечения гиперхолестеринемии, атеросклероза или гиперлипидемии. Следовательно, в одном из воплощений настоящего изобретения раскрывается способ профилактики или лечения гиперлипидемического состояния, включающий введение пациенту, нуждающемуся в лечении, комбинации в дозированной лекарственной форме, где комбинация включает первое количество соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второе количество соединения, ингибирующего СЕТР, где первое количество и второе количество вме

- 4 005815 сте составляют антигиперлипидемическое эффективное количество данных соединений.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения атеросклеротического состояния, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, комбинации в дозированной лекарственной форме, где комбинация включает первое количество соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второе количество соединения, ингибирующего СЕТР, где первое количество и второе количество вместе составляют антиатеросклеротическое эффективное количество данных соединений.

Далее настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения гиперхолестеринемии, включающему введение пациенту, нуждающемуся в лечении, комбинации в дозированной лекарственной форме, где комбинация включает первое количество соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второе количество соединения, ингибирующего СЕТР, где первое количество и второе количество вместе составляют антигиперхолестеринемическое эффективное количество данных соединений.

Далее объем настоящего изобретения станет более понятен из из подробного описания, приведенного ниже. Однако следует понимать, что приведенные ниже подробное описание и примеры, хотя и определяют предпочтительные воплощения данного изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, так как различные изменения и модификации в пределах духа и объема данного изобретения являются очевидными специалисту в данной области из подробного описания.

Подробное описание предпочтительных воплощений

Нижеследующее подробное описание приводится для того, чтобы помочь специалистам в данной области при практическом осуществлении настоящего изобретения. Тем не менее, данное подробное описание не следует истолковывать как чрезмерно ограничивающее настоящее изобретение, так как рядовые специалисты в данной области могут осуществлять модификации и вариации воплощений, обсуждаемых в данном документе, не ограничивая объема настоящего изобретения.

Содержание каждой из ссылок, цитирующихся в данном документе, включая содержание ссылок, цитирующихся в пределах данных первичных ссылок, включено здесь в качестве ссылки во всей своей полноте.

a. Определения.

Следующие определения приводятся для того, чтобы помочь читателю в понимании подробного описания настоящего изобретения.

Транспортер желчных кислот в подвздошной кишке, или ΙΒΑΤ, является синонимом апикального натрий-созависимого транспортера желчных кислот, или Α8ΒΤ.

Бензотиепиновый ингибитор ΙΒΑΤ относится к ингибитору транспорта желчных кислот в подвздошной кишке, который включает терапевтическое соединение, включающее структуру 1,1-диоксид 2,3,4,5-тетрагидро-1-бензотиепина.

В данном документе термин ингибитор СЕТР или соединение, ингибирующее СЕТР обозначает любое терапевтическое соединение, полученное из химических или биологических источников, которое ингибирует активность белка, переносящего эфир холестерина.

Комбинированная терапия относится к введению двух или более терапевтических агентов для лечения гиперлипидемического состояния, например, атеросклероза и гиперхолестеринемии. Такое введение включает совместное введение данных терапевтических агентов, по существу, одновременно, например, в одной дозированной форме, имеющей фиксированное соотношение активных ингредиентов, или в нескольких отдельных дозированных формах для каждого ингибиторного агента. Кроме того, такое введение также включает последовательное применение терапевтических агентов каждого типа. В любом случае, режим лечения обеспечивает благоприятные эффекты от приема лекарственных препаратов при лечении гиперлипидемического состояния.

Фраза терапевтически эффективный относится к определенному для комбинированной терапии общему количеству ингибиторов. Данное общее количество позволяет достичь цель, которая состоит в уменьшении или устранении гиперлипидемического состояния.

Терапевтическое соединение относится к соединению, которое может применяться для профилактики или лечения гиперлипидемического состояния, включая атеросклероз и гиперхолестеринемию.

b. Комбинации.

Комбинации согласно настоящему изобретению имеют ряд применений. Например, в результате регулирования дозировки и медицинского мониторинга индивидуальные дозы терапевтических соединений, использующихся в комбинациях настоящего изобретения, будут ниже, чем обычные дозы терапевтических соединений при использовании в монотерапии. Уменьшение дозы обеспечивает преимущества, включающие уменьшение побочных эффектов индивидуальных терапевтических соединений по сравнению с монотерапией. Кроме того, уменьшение побочных эффектов при комбинированной терапии по сравнению с монотерапией приводит к увеличению согласия пациентов с режимами лечения.

К другому применению настоящего изобретения относятся комбинации, имеющие дополнительные эффекты или дополнительные способы действия. Например, некоторые ΙΒΑΤ ингибиторы контролируют уровни холестерина в сыворотке крови путем ингибирования реабсорбции желчных кислот в подвздош

- 5 005815 ной кишке. Напротив, ингибиторы СЕТР ингибируют перемещение эфиров холестерина и триглицеридов между различными липопротеинами крови.

Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, охватывают широкий ряд терапевтических соединений. Некоторые ингибиторы ΙΒΑΤ, которые могут применяться в настоящем изобретении, раскрыты в патентной заявке № РСТ/и8 95/10863, включенной в данный документ в качестве ссылки. Другие ΙΒΑΤ ингибиторы описаны в РСТ/ϋδ 97/04076, включенной в данный документ в качестве ссылки. Очередные ΙΒΑΤ ингибиторы, которые могут применяться в настоящем изобретении, описаны в заявке США с серийным номером 08/816065, включенной в данный документ в качестве ссылки. Другие ингибиторные соединения ΙΒΑΤ, которые могут применяться в настоящем изобретении, описаны в \νϋ 98/40375, включенной в данный документ в качестве ссылки. Дополнительные ингибиторные соединения ΙΒΑΤ, которые могут применяться в настоящем изобретении, описаны в заявке США с серийным номером 08/816065, включенной в данный документ в качестве ссылки. Следующие ингибирующие соединения ΙΒΑΤ, которые могут применяться в настоящем изобретении, раскрыты в патенте США № 5994391, включенном в данный документ в качестве ссылки. ΙΒΑΤ ингибиторы, представляющие в настоящем изобретении особый интерес, включают соединения, приведенные в табл. 1, а также диастереомеры, энантиомеры, рацематы, соли и таутомеры ингибиторов ΙΒΑΤ, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

- 6 005815

- 7 005815

- 8 005815

- 9 005815

- 10 005815

РЕС = полимерная цепь полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3400

полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3400

полиэтиленгликоля с молекулярной массой 3400

- 11 005815

В-31	” Д ч°н
	V НУ	сг о
В-32	ГУЧЛ	3
	1 ·$ ОН
	V
	°\/ыг=<С^	202Н
	Чу
В-33	о, „о
	ЧКГ 9
	0Ζ χ Я - ВВС к	1000
В-34	0..Р г~ гНЛгтС
	1 2$ ΌΗ	0
	р ме	2’0 О
	V но

э-35	ό Л
3-36	Хл ' 9 У Ν ν ΝΗ, ϊ ЫН
Ξ-37	‘ А Чй V оНх^ОуЧЛ* *С>ы со2н
2-38	Ли >Чл а
В-39	°Чз° ,,С0=С ’ = 0 .

- 12 005815

Некоторые индивидуальные соединения, ингибирующие СЕТР, которые могут применяться в настоящем изобретении, отдельно описаны в следующих индивидуальных патентных заявках, каждая из которых включена в данный документ в качестве ссылки.

К.9. Патентная заявка США, серийный № 60/101661.

К10. Патентная заявка США, серийный № 60/101711.

К11. Патентная заявка США, серийный № 60/101660.

К12. Патентная заявка США, серийный № 60/101664.

К13. Патентная заявка США, серийный № 60/101668.

К14. Патентная заявка США, серийный № 60/101662.

К15. Патентная заявка США, серийный № 60/101663.

К16. Патентная заявка США, серийный № 60/101669.

К17. Патентная заявка США, серийный № 60/101667.

К18. Патентная заявка США, серийный № 09/401916.

К19. Патентная заявка США, серийный № 09/405524.

К20. Патентная заявка США, серийный № 09/404638.

К21. Патентная заявка США, серийный № 09/404 638.

К22. Патентная заявка США, серийный № 09/400915.

К23. Патент США № 5932587.

К24. Патент США № 5925645.

Соединения, ингибирующие СЕТР, представляющие в настоящем изобретении особый интерес, включают соединения, приведенные в табл. 2, а также диастереомеры, энантиомеры, рацематы, соли и таутомеры ингибиторов СЕТР, приведенных в табл. 2.

___Таблица 2

Номер соединения	Структура
	! О СН η ί 1 ~
	Η°ΎιΓ	он
С-1		.^ο
		Υ-он
	Ο—
	Ρί
С-2	τ ίΎ
		СГЧН -Λ
	Α
с-з	Υ
		сг2н
	/ Ν--Ν
С-4	п_С13827'^А11< I	Υ
	η
	υ	^ОСНз

- 13 005815

- 14 005815

- 15 005815

Соединения (например, соединения, ингибирующие транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, или соединения, ингибирующие СЕТР), которые могут применяться в настоящем изобретении, могут не иметь асимметричных атомов углерода, или, альтернативно, данные соединения могут иметь один или несколько асимметричных атомов углерода. Если использующиеся соединения имеют один или несколько асимметричных атомов углерода, следовательно, они включают рацематы и стереоизомеры, такие, как диастереомеры и энантиомеры, в чистом виде и в виде смесей. Такие стереоизомеры могут быть получены с помощью традиционных методов, либо путем использования энантиомеров в качестве исходных веществ, либо путем разделения изомеров соединений настоящего изобретения.

Изомеры могут включать геометрические изомеры, например, цис-изомеры или транс-изомеры, относительно двойной связи. Считается, что к соединениям, использующимся в настоящем изобретении, относятся все такие изомеры.

Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, также включают таутомеры.

Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, как описано ниже, включают их соли, сольваты и пролекарственные препараты.

Дозировки, композиции и способы введения

Композиции настоящего изобретения могут быть введены для профилактики и лечения гиперлипидемических заболеваний или состояний с помощью любого способа, предпочтительно перорального, который обеспечивает контакт данных соединений с местом их действия в организме, например, в подвздошной кишке, плазме или печени млекопитающего, например человека.

Для профилактики или лечения состояний, указанных выше, соединения, используемые в композициях и способах настоящего изобретения, могут использоваться сами по себе. Фармацевтически приемлемые соли являются особенно подходящими для медицинских применений, так как они лучше растворяются в воде, чем исходные соединения. Безусловно, такие соли должны иметь фармацевтически приемлемый анион или катион. Подходящие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли соединений настоящего изобретения, по возможности, включают производные неорганических кислот, таких как хлористо-водородная, бромисто-водородная, фосфорная, метафосфорная, азотная, сульфоновая и серная кислоты, и органических кислот, таких как уксусная, бензолсульфоновая, бензойная, лимонная, этан-сульфоновая, фумаровая, глюконовая, гликолевая, изотионовая, молочная, лактобионовая, малеиновая, яблочная, метансульфоновая, янтарная, толуолсульфоновая, виннокаменная и трифторуксусная кислоты. Для медицинских целей особенно предпочтительными являются хлориды. Соли подходящих фармацевтически приемлемых оснований включают соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, и соли щелочно-земельных металлов, такие как соли магния и кальция.

Анионы, используемые в настоящем изобретении, конечно, также должны быть фармацевтически приемлемыми и могут быть также выбраны из вышеприведенного списка.

Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, могут быть представлены с приемлемым носителем в виде фармацевтической композиции. Носитель, конечно, тоже должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и не должен быть вредным для реципиента. Носитель может быть твердым или жидким, или тем и другим, и предпочтительно входит вместе с соединением в состав дозированной композиции, например таблетки, которая может содержать от 0,05 до 95 мас.% активного соединения. Могут также присутствовать другие фармакологически активные вещества, включая другие соединения настоящего изобретения.

Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть получены с помощью любого из хорошо известных методов фармацевтики, состоящего, по существу, в смешивании компонентов.

Необязательно комбинация настоящего изобретения может включать композицию, включающую соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и соединение, ингибирующее СЕТР. В такой композиции соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздош

- 16 005815 ной кишке, и соединение, ингибирующее СЕТР, могут присутствовать в дозированной лекарственной форме, например в виде пилюли, капсулы или жидкости, которая содержит оба соединения.

Данные соединения могут быть введены с помощью любого традиционного средства, доступного для применения вместе с фармацевтическими препаратами, либо в виде индивидуальных терапевтических соединений, или в виде комбинации терапевтических соединений.

Количество соединения, необходимое для достижения желательного биологического эффекта, конечно, зависит от ряда факторов, таких, как конкретное выбранное соединение, предназначенное для применения, способ введения и клиническое состояние реципиента.

В основном, общая дневная доза ингибитора ΙΒΑΤ может находиться в интервале приблизительно от 0,01 до 1000 мг/день, предпочтительно приблизительно от 0,1 до 50 мг/день, более предпочтительно приблизительно от 1 до 10 мг/день.

В случае ингибитора СЕТР подходящая в основном дневная доза составляет приблизительно от 0,01 до 100 мг/кг массы тела/день и предпочтительно приблизительно от 0,5 до 20 мг/кг массы тела/день.

Дневные дозы, описанные в предыдущих параграфах для разных терапевтических соединений, могут быть введены пациенту в одной дозе или в пропорционально разделенных нескольких дозах. Разделенные дозы могут быть введены от 2 до 6 раз в день. Дозы могут быть в виде композиции с непрерывным высвобождением, эффективным для получения желательных результатов.

В случае фармацевтически приемлемых солей определенные выше массы относятся к массе кислотного или основного эквивалента терапевтического соединения, получающегося из соли.

При пероральной доставке комбинаций согласно настоящему изобретению могут использоваться композиции, как хорошо известно в данной области, предназначенные для обеспечения пролонгированной или непрерывной доставки лекарственного препарата к желудочно-кишечному тракту с помощью любого из механизмов. Они включают, без ограничения, рН-чувствительное высвобождение из дозированной формы, основанное на изменении рН в тонком кишечнике, медленную эрозию таблетки или капсулы, удерживание в желудке на основе физических свойств композиции, биоадгезию дозированной формы к слизистой выстилке кишечного тракта, или ферментативное высвобождение активного препарата из дозированной формы. Для некоторых из терапевтических соединений, которые могут применяться в настоящем изобретении (например, ингибиторов ΙΒΑΤ или ингибиторов СЕТР), желательным эффектом является продление промежутка времени, в течение которого молекула активного препарата доставляется к месту действия (например, к подвздошной кишке), путем манипуляции с дозированной формой. Таким образом, композиции с энтеропокрытием и с энтеропокрытием с контролируемым высвобождением входят в объем настоящего изобретения. Подходящие энтеропокрытия включают фталат ацетатцеллюлозы, фталат поливинилацетата, фталат гидроксипропилметилцелюлозы и анионные полимеры метакриловой кислоты и метилового эфира метакриловой кислоты.

Комбинации настоящего изобретения могут быть доставлены перорально в твердой, полутвердой или жидкой форме. В случае жидкой или полутвердой формы, комбинации настоящего изобретения могут, например, существовать в виде жидкости, сиропа или содержаться в гелевой капсуле (например, в гелевом колпачке). В одном воплощении, если ингибитор ΙΒΑΤ применяется в комбинации настоящего изобретения, то ингибитор ΙΒΑΤ может являться жидкостью, сиропом, или содержаться в гелевой капсуле. В другом воплощении, если ингибитор СЕТР применяется в комбинации настоящего изобретения, то ингибитор СЕТР может являться жидкостью, сиропом или содержаться в гелевой капсуле.

Доза любого из данных терапевтических соединений может быть удобно введена посредством вливания со скоростью, составляющей приблизительно от 10 до 100 нг/кг массы тела в минуту. Жидкости для вливания, подходящие для этой цели, могут содержать, например, приблизительно от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно приблизительно от 1 нг до 10 мг на миллилитр. Дозированные формы могут содержать, например, приблизительно от 1 мг до 10 г соединения настоящего изобретения. Таким образом, ампулы для инъекций могут содержать, например, приблизительно от 1 до 100 мг.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением включают композиции, подходящие для перорального, ректального, местного, щечного (например, подъязычного) и парентерального (например, подкожного, внутримышечного, внутрикожного или внутривенного) введения, хотя наиболее подходящий способ в каждом данном случае зависит от природы и тяжести состояния, подлежащего лечению, а также от природы конкретного используемого соединения. В большинстве случаев предпочтительным способом введения является пероральное введение.

Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут присутствовать в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, пастилки или таблетки, каждая из которых содержит ранее определенное количество по меньшей мере одного терапевтического соединения, применимого в настоящем изобретении; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде эмульсий масло-в-воде или вода-в-масле. Как указано, такие композиции могут быть получены с помощью любого подходящего фармацевтического метода, который включает стадию объединения активного соединения(й) и носителя (который может состоять из одного или нескольких вспомогательных ингредиентов). В основном, композиции получают путем равномерного и однородного смешивания активного соединения с жидким или мелкоразмельченным твердым носителем,

- 17 005815 или с обоими, и затем, при необходимости, придают продукту форму. Например, таблетка может быть получена путем прессования или формования порошка или гранул соединения, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящем устройстве соединения в свободно-текучем виде, таком, как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим агентом, смазочным агентом, инертным разбавителем и/или поверхностно-активным/диспергирующим агентом(ами). Формованные таблетки могут быть получены путем формования в подходящем устройстве порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем.

Фармацевтические композиции, подходящие для щечного (подъязычного) введения, включают таблетки, содержащие соединение настоящего изобретения во вкусовой основе, обычно, сахарозе, и гуммиарабик или трагакант, и пастилки, содержащие соединение в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик.

Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, обычно включают стерильные водные препараты соединения настоящего изобретения. Данные препараты предпочтительно вводят внутривенно, хотя введение может также осуществляться путем подкожной, внутримышечной или внутрикожной инъекции. Такие препараты традиционно могут быть получены путем смешивания соединения с водой и приведения полученного раствора в стерильную и изотоническую по отношению к крови форму. Композиции для инъекции в соответствии с данным изобретением обычно содержат от 0,1 до 5% мас./мас. соединения, раскрытого в данном документе.

Фармацевтические композиции, подходящие для ректального введения, предпочтительно присутствуют в виде дозированных свечей. Они могут быть получены путем смешивания соединения настоящего изобретения с одним или несколькими традиционными твердыми носителями, например кокосовым маслом, и затем придания формы полученной смеси.

Фармацевтические композиции, подходящие для местного применения на коже, предпочтительно находятся в виде мази, крема, лосьона, пасты, геля, спрея, аэрозоля или масла. Носители, которые могут применяться, включают петролатум (например, вазелин), ланолин, полиэтиленгликоли, спирты, а также комбинации двух или более из данных веществ. Активное соединение обычно присутствует в концентрации, составляющей от 0,1 до 50 мас.% от массы композиции, например, от 0,5 до 2%.

Также возможно чрескожное введение. Фармацевтические композиции, подходящие для чрескожного введения могут присутствовать в виде отдельных пластырей, приспособленных для того, чтобы оставаться в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение продолжительного периода времени. Подходящим является, если такие пластыри содержат соединение настоящего изобретения в необязательно забуференном водном растворе, растворенное и/или диспергированное в липкой основе, или диспергированное в полимере. Подходящая концентрация активного соединения составляет приблизительно от 1 до 35%, предпочтительно от 3 до 15%. Особого внимания заслуживает способ, при котором соединение может быть доставлено из пластыря посредством электротранспорта или ионтофореза, например, как описано в Рйагшасеи11са1 Векеагсй, 3(6), 318 (1986).

В любом случае, количество активного ингредиента, которое может быть объединено с веществами-носителями с получением дозированной формы, предназначенной для введения, зависит от хозяина, подлежащего лечению, и конкретного способа введения.

Твердые дозированные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки, гелевые колпачки и гранулы, указанные выше, содержащие одно или несколько соединений, применимых в настоящем изобретении, смешанных по меньшей мере с одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие дозированные формы могут также содержать, как известно в обычной практике, вещества, отличные от инертных разбавителей, например, смазывающие агенты, такие как стеарат магния, или солюбилизирующие агенты, такие как циклодекстрины. В случае капсул, таблеток, порошков, гранул, гелевых колпачков и пилюль дозированные формы могут также включать забуферивающие агенты. Таблетки и пилюли могут быть также получены с энтеропокрытиями.

Жидкие дозированные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно применяющиеся в данной области, такие как вода. Такие композиции могут также включать адъюванты, такие как увлажняющие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, а также подсластители, ароматизаторы и отдушки.

Препараты для инъекций, например, стерильные водные или маслянистые суспензии для инъекций, могут быть получены в соответствии с известными в данной области способами, с использованием подходящих диспергирующих агентов или отвердителей, а также суспендирующих агентов. Стерильные препараты для инъекций могут также представлять собой стерильный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3бутандиоле. К приемлемым средам и растворителям, которые могут применяться, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно применяются стерильные нелетучие масла. Для этого могут использоваться любые мягкие нелетучие масла, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в

- 18 005815 получении препаратов для инъекций находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота. Фармацевтически приемлемые носители охватывают все вышеупомянутые носители и т.п.

В комбинированной терапии введение двух или более терапевтических агентов, используемых в настоящем изобретении, может происходить последовательно, в отдельных композициях, или может быть осуществлено путем одновременного введения в одной или в раздельных композициях. Введение может осуществляться пероральным способом, или посредством внутривенных, внутримышечных или подкожных инъекций. Композиции могут находиться в виде шариков или в виде водных или неводных изотонических стерильных растворов или суспензий для инъекций. Данные растворы и суспензии могут быть получены из стерильных порошков или гранул, имеющих один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей, или связующее вещество, такое как желатин или гидроксипропилметилцеллюлоза, вместе с одним или несколькими добавками, такими как из смазывающий агент, консервант, поверхностно-активный или диспергирующий агент.

Фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, может находиться в виде, например, таблетки, капсулы, суспензии или жидкости. Капсулы, таблетки и др. могут быть получены с помощью традиционных способов, хорошо известных в данной области. Фармацевтическую композицию предпочтительно получают в виде дозированной формы, содержащей конкретное количество активного ингредиента или ингредиентов. Примерами дозированных форм являются таблетки или капсулы. Они могут преимущественно содержать одно или несколько терапевтических соединений в количестве, описанном выше. Например, в случае ингибитора ΙΒΑΤ доза находится в интервале, который может составлять приблизительно от 0,01 до 500 мг/день, или представляет собой любую другую дозу, в зависимости от конкретного ингибитора, как известно в данной области. В случае соединения, удаляющего желчные кислоты, доза находится в интервале, который может составлять приблизительно от 1000 до 30000 мг/день, или представляет собой любую другую дозу, в зависимости от конкретного соединения, удаляющего желчные кислоты, как известно в данной области.

Активные ингредиенты могут быть также введены путем инъекции в виде композиции, в которой, например, в качестве подходящего носителя могут применяться физиологический раствор, декстроза или вода. Подходящей дневной дозой каждого активного терапевтического соединения является такая доза, которая обеспечивает такой его уровень в сыворотке крови, какой обеспечивается в результате перорального введения, как описано выше.

Терапевтические соединения могут быть также введены посредством комбинации способов пероральный/пероральный, пероральный/парентеральный или парентеральный/парентеральный.

Фармацевтические композиции, предназначенные для применения в способах лечения настоящего изобретения, могут быть введены в пероральной форме или путем внутривенного введения. При комбинированной терапии предпочтительно пероральное введение. Дозировка при пероральном введении может находиться в пределах режима, указанного для однократной дневной дозы: или для однократной дозы каждый следующий день, или для нескольких разделенных доз в течение дня. Терапевтические соединения, которые составляют комбинированную терапию, могут быть введены одновременно, либо в объединенной дозированной форме, либо в отдельных дозированных формах, предназначенных, по существу, для одновременного перорального введения. Терапевтические соединения, которые составляют комбинированную терапию, могут быть также введены последовательно, причем каждое терапевтическое соединение вводят согласно режиму, указанному для двухстадийного приема. Таким образом, режим может требовать последовательного введения терапевтических соединений с разделенным приемом отдельных активных агентов. Период времени между несколькими стадиями приема может варьироваться от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от свойств каждого терапевтического соединения, таких как активность, растворимость, биодоступность, период полужизни в плазме и кинетический профиль терапевтического соединения, а также в зависимости от приема пищи, возраста и состояния пациента. Циркадная вариация концентрации целевой молекулы также может определять интервал оптимальной дозы. Терапевтические соединения комбинированной терапии, введенные или одновременно, по существу одновременно, или последовательно, могут включать режим, требующий введения одного терапевтического соединения пероральным способом, а другого терапевтического соединения внутривенным способом. Вводят ли терапевтические соединения комбинированной терапии пероральным или внутривенным способом, отдельно или вместе, каждое такое терапевтическое соединение содержится в подходящей фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемые эксципиенты, разбавители или другие компоненты композиций. Примеры подходящих фармацевтически приемлемых композиций, содержащих терапевтические соединения, предназначенных для перорального введения, приведены выше.

Режим лечения

Дозировочный режим для профилактики, облегчения или улучшения болезненного состояния, включающего гиперлипидемию как одно из заболеваний, например, атеросклероза, или для защиты от или лечения повышенных уровней холестерина в плазме или в крови, с помощью соединений и/или композиций настоящего изобретения, выбирают в соответствии с рядом факторов. Данные факторы включают тип, возраст, вес, пол, диету и медицинское состояние пациента, тяжесть заболевания, способ вве

- 19 005815 дения, фармакологические характеристики, такие как активность, эффективность, фармакокинетика и токсикологические профили конкретного применяемого соединения, в случае использования системы доставки лекарственного препарата, и в случае, если соединение вводят как часть комбинации лекарственных препаратов. Таким образом, применяемый в действительности дозировочный режим может широко варьироваться и, следовательно, может отклоняться от предпочтительного дозировочного режима, приведенного выше.

Начальное лечение пациента, страдающего от гиперлипидемического состояния, может начинаться с доз, указанных выше. Лечение обычно должно продолжаться по мере необходимости, в течение периода от нескольких недель до нескольких месяцев или лет, до тех пор, пока гиперлипидемическое болезненное состояние не будет подавлено или устранено. Для определения эффективности комбинированной терапии состояние пациентов, подвергающихся лечению соединениями или композициями, раскрытыми в данном документе, обычно можно отслеживать, например, измеряя сывороточные уровни общего холестерина и холестерина ЬЭЬ с помощью любого из методов, хорошо известных в данной области. Непрерывный анализ таких данных позволяет изменять режим лечения в процессе лечения так, чтобы в любой момент времени вводить оптимальные эффективные количества каждого типа терапевтического соединения, и, кроме того, определить продолжительность лечения. Таким образом, режим лечения/дозировочный распорядок могут быть рационально изменены в процессе курса лечения так, чтобы обеспечить введение самого низкого количества терапевтических соединений, которые вместе проявляют удовлетворительную эффективность, и так, чтобы введение продолжалось в течение времени, необходимого для удовлетворительного лечения гиперлипидемического состояния.

Потенциальным преимуществом комбинированной терапии, раскрытой в данном документе, является снижение количества любого индивидуального терапевтического соединения, или всех терапевтических соединений, эффективного для лечения гиперлипидемических состояний, таких как атеросклероз и гиперхолестеринемия. Снижение дозы обеспечивает преимущества, включающие уменьшение побочных эффектов индивидуальных терапевтических соединений по сравнению с монотерапией.

Одно из нескольких воплощений настоящего изобретения включает комбинированную терапию, включающую применение первого количества ингибитора ΙΒΑΤ и второго количества другого сердечнососудистого терапевтического препарата, применяемого для профилактики или лечения гиперлипидемии, атеросклероза или гиперхолестеринемии, где упомянутые первое и второе количества вместе составляют количество упомянутых соединений, эффективное против гиперлипидемического, атеросклеротического или гиперхолестеринемического состояний. Например, одно из многих воплощений настоящего изобретения представляет комбинированную терапию, включающую терапевтические дозы ингибитора ΙΒΑΤ и ингибитора СЕТР. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет комбинированную терапию, включающую терапевтические дозы бензотиепинового ингибитора ΙΒΑΤ и ингибитора СЕТР.

Настоящее изобретение может включать комбинированную терапию, в которой используют два или более терапевтических соединений, описанных или включенных в данном документе. Комбинированная терапия может включать два или более терапевтических соединений, относящихся к различным классам химических соединений, например, ингибитор ΙΒΑΤ может быть терапевтически объединен с ингибитором СЕТР. Терапевтические комбинации могут включать более двух терапевтических соединений. Например, такая терапия может включать применение ингибитора ΙΒΑΤ, ингибитора СЕТР и ингибитора НСМ СоА редуктазы. Альтернативно, два или более терапевтических соединений, относящихся к одному классу химических соединений, могут составлять терапию, например комбинированную терапию, включающую два или более ингибитора ΙΒΑΤ или два или более ингибитора СЕТР.

Следующее воплощение настоящего изобретения включает применение любой из сердечнососудистой комбинированной терапии, описанной в данном документе, для профилактики или лечения гиперхолестеринемии, атеросклероза или гиперлипидемии.

Следующие неограничивающие примеры служат для иллюстрации различных аспектов настоящего изобретения.

с. Примеры.

Табл. 3 иллюстрирует примеры некоторых комбинаций настоящего изобретения, где комбинация включает первое количество ингибитора ΙΒΑΤ и второе количество ингибитора СЕТР, где упомянутые первое и второе количества вместе составляют количество упомянутых соединений, эффективное против гиперлипидемического, атеросклеротического или гиперхолестеринемического состояний.

- 20 005815

Таблица 3

Номер примера	Компонент 1	Компонент 2
1	В-1	С-1
2	В-1	С-2
3	В-1	С-3
4	В-1	С-4
5	В-1	С-5
6	В-1	С-6
7	В-1	С-7
8	В-1	С-8
9	В-1	С-9
10	В-1	С-10
11	В-1	С-11
12	В-1	С-12
13	В-1	С-13
14	В-1	С-14
15	В-1	С-15
16	В-1	С-16
17	В-1	С-17
18	В-1	С-18
19	В-1	С-19
20	В-1	С-20
21	В-2	С-1

- 21 005815

	22	ί В-2	С-2
	23	В-2	С-3
	24	В-2	С-4
	25	В-2	С-5
26	В-2	С-б
27	В-2	С-7
	28	В-2	С-8
	29	В-2	С-9
	30'	В-2	С-10
	31	В-2	С-11
	32	В-2	С-12
	33	В-2	С-13
34	В-2	С-14
35	В-2	С-15
36	В-2	С-16
	37	В-2	С-17
	38	В-2	С-18
39	В-2	С-19
40	В-2	С-20
	41	В-3	С-1
	42	лПз	С-2
43	в-з	С-3
44	В-3	С-4
45	В-З .	С-5
	46	в-з	С-6
	47	в-з	С-7
	48	в-з	С-8
	49	в^з	С-9
	50	в-з	С-10
	51	в-з	С-11
	52	в-з	С-12
53	в-з	С-13
54	в-з	С-14
	55	в-з	С-15
56	в-з	С-16
57	в-э	С-17
58	в-з	С-18
59	в-з	С-19
60	в-з	С-20
61	В-4	С-1
62	В-4	С-2
63	В-4	С-3
64	В-4	С-4
65	В-4	С-5
66	В-4	С-б
67	В-4	С-7
68	В-4	С-8

- 22 005815

69	< В-4	С-9
70	В-4	С-10
71	В-4	С-11
72	В-4	С-12
73	В-4	С-13
74	В-4	С-14
75	В-4	С-15
76	В-4	С-16
77	В-4	С-17
78	В-4	С-18
79	В-4	С-19
80	В-4	С-20
81	В-5	С-1
82	В-5	С-2
83	В-5	С-3
84	В-5	С-4
85	В-5	С-5
86	В-5	С-б
87	В-5	С-7
88	В-5	С-8
89	В-5	С-9
90	В-5	С-10
91	В-5	С-11
92	В-5	С-12
93	В-5	С-13
94	В-5	С-14
95	В-5	С-15
96	В-5	С-16
97	В-5	С-17
9В	В-5	С-18
99	В-5	С-19
100	В-5	С-20
101	В-6	С-1
102	В-б	С-2
103	В-6	С-3
104	В-б	С-4
105	В-б	С-5
106	В-б	С-б
107	В-б	С-7
108	В-б	С-8
109	В-б	С-9
110	В-б	С-10
111	В-б	С-11
112	В-6	С-12
113	В-б	С-13
114	Э-б	С-14
115	В-б	С-15

- 23 005815

116	5-6	С-16
117	В-б	С-17
11В	В-б	С-18
119	В-б	С-19
120	В-6	С-20
121	В-7	С-1
122	В-7	С-2
123	В-7	С-3
124	В-7	С-4
125	В-7	С-5
126	В-7	С-б
127	В-7	С-7
128	В-7	С-8
129	В-7	С-9
130	В-7	С-10
131	В-7	С-11
132	В-7	С-12
133	В-7	С-13
134	В-7	С-14
135	В-7	С-15
136	В-7	С-16
137	В-7	С-17
138	В-7	С-18
139	В-7	С-19
140	В-7	С-20
141	В-В	С-1
142	в-в	С-2
143	В-8	С-3
144	В-В	С-4
145	В-8	С-5
146	В-В	С-б
147	В-В	С-7
148	В-8	с-в
149	В-В	С-9
150	В-В	С-10
151	В-В	С-11
152	В-8	С-12
153	В-8	С-13
154	В-8	С-14
155	В-8	С-15
156	В-8	С-16
157	В-8	С-17
158	В-8	С-18
159	В-8	С-19
160	В-8	С-20
161	В-9	С-1
162	В-9	С-2

- 24 005815

163	В-9	С-3
164	В-9	С-4
165	В-9	С-5
166	В-9	С-б
167	В-9	с-7
166	В-9	С-8
169	В-9	С-9
170	В-9	С-10
171	В-9	С-11
172	В-9	С-12
173	В-9	С-13
174	В-9	С-14
175	В-9	С-15
176	В-9	С-16
177	В-9	С-17
178	В-9	С-18
179	В-9	С-19
180	В-9	С-20
181	В-10	С-1
182	В-10	С-2
183	В-10	С-3
184	В-10	С-4
185	В-10	С-5
186	В-10	С-6
187	В-10	С-7
188	В-10	С-8
189	В-10	С-9
190	В-10	С-10
191	В-10	С-11
192	В-10	С-12
193	В-10	С-13
194	В-10	С-14
195	В-10	С-15
196	В-10	С-16
197	В-10	С-17
198	Э-10	С-18
199	В-10	С-19
200	В-10	С-20
201	В-11	С-1
2 02	В-11	С-2
203	В-11	С-3
204	В-11	С-4
205	В-11	С-5
206	В-11	С-б
207	В-11	С-7
208	В-11	С-8
209	В-11	С-9

- 25 005815

210	В-11	I С-10 '
211	В-11	с-11
212	В-11	С-12
213	В-11	С-13
214	В-11	С-14
215	В-11	С-15
216	В-11	С-16
217	В-11	С-17
218	В-11	С-18
219	В-11	с-19
220	В-11	С-20
221	В-12	С-1
222	В-12	С-2
223	В-12	С-3
224	В-12	С-4
225	В-12	С-5
226	В-12	С-6
227	В-12	С-7
228	В-12	С-8
229	В-12	С-9
230	В-12	С-10
231	В-12	С-11
232	В-12	С-12
233	В-12	С-13
234	В-12 ’	С-14
235	В-12	С-15
238	В-12	С-16
237	В-12	С-17
238	В-12	С-18
239	В-12	С-19
240	В-12	С-20
241	0-13	С-1
242	В-13	С-2
243	В-13	С-3
244	В-13	С-4
245	0-13	С-5
248	0-13	С-б
247	0-13	С-7
248	В-13	С-8
249	В-13	С-9
250	В-13	С-10
251	В-13	С-11
252	В-13	С-12
253	В-13	С-13
254	В-13	С-14
255	В-13	С-15
256	В-13	С-16

- 26 005815

' 257	В-13 '	| С-17
256	В-13	С-18
259	В-13	С-19
260	В-13	С-20
261	В-14	С-1
262	В-14	С-2
263	В-14	С-3
264	В-14	С-4
265	В-14	С-5
266	В-14	С-6
267	В-14	С-7
266	В-14	С-8
269	В-14	С-9
270	В-14	С-10
271	Э-14	С-11
272	В-14	С-12
273	В-14	С-13
274	В-14	С-14
275	В-14	С-15
276	В-14	С-16
277	В-14	С-17
276	В-14	С-18
279	В-14	С-19
280	В-14	С-20
281	В-15	С-1
282	В-15	С-2
283	В-15	С-3
284	В-15	С-4
285	В-15	С-5
286	В-15	С-6
267	В-15	С-7
268	В-15	С-8
289	В-15	С-9
290	В-15	С-10
291	В-15	С-11
292	В-15	С-12
293	В-15	С-13
294	В-15	С-14
295	В-15	С-15
296	В-15	С-16
297	В-15	С-17
298	В-15	С-18
299	В-15	С-19
300	В-15	С-20
301	В-16	С-1
302	В-16	С-2
303	В-16	С-3

- 27 005815

304	В-16	е-4 ......
305	В-16	С-5
306	В-16	С-6
307	В-16	С-7
зов	В-16	С-8
309	В-16	С-9
310	В-16	С-1С
311	В-16	С-11
312	В-16	С-12
313	В-16	С-13
314	В-16	С-14
315	В-16	С-15
316	В-16	С-16
317	В-16	С-17
318	В-16	С-18
319	В-16	С-19
320	3-16	С-20
321	3-17	С-1
322	В-17	С-2
323	3-17	С-3
324	В-17	С-4
325	В-17	С-5
326	В-17	С-б
327	В-17	С-7
328	В-17	С-8
329	В-17	С-9
330	В-17	С-10
331	В-17	С-11
332	В-17	С-12
333	В-17	С-13
334	3-17	С-14
335	В-17	С-15
336	3-17	С-16
337	В-17	С-17
338	3-17	С-18
339	В-17	С-19
340	В-17	С-20
341	В-18	С-1
342	В-18	С-2
343	В-18	С-3
344	В-18	С-4
345	В-18	С-5
346	6-18	С-б
347	В-18	С-7
348	В-18	С-8
349	В-18	С-9
350	В-18	С-10

- 28 005815

351	В-18	04'
352	Ξ-1Θ	С-12
353	В-18	С-13
354	В-18	С-14
355	В-18	С-15
356	В-18	С-16
357	В-18	С-17
35Θ	В-18	С-18
359	В-18	С-19
360	В-18	С-20
361	В-19	С-1
362	В-19	С-2
363	В-19	С-3
364	В-19	С-4
365	В-19	С-5
366	В-19	С-6
367	9-19	С-7
366	Э-19	С-8
369	В-19	С-9
370	В-19	С-10
371	В-19	С-11
372	В-19	С-12
373	В-19	С-13
3 74	В-19	С-14
375	В-19	С-15
376	В-19	С-16
377	В-19	С-17
378	В-19	С-18
379	В-19	С-19
380	В-19	С-20
381	В-20	С-1
382	В-20	С-2
383	В-20	С-3
384	В-20	С-4
ЗВ5	В-20	С-5
386	В-20	С-6
387	В-20	С-7
388	В-20	С-8
389	В-20	С-9
390	В-20	С-10
391	В-20	С-11
392	В-20	С-12
3 93	В-20	С-13
394	В-20	С-14
395	В-20	С-15
396	В-20	С-16
3 97	В-20	С-17

- 29 005815

398	В-20	С-18
399	В-20	С-19
400	В-20	С-20
401	В-21	С-1
402	В-21	С-2
403	В-21	С-3
404	В-21	С-4
405	В-21	С-5
406	В-21	С-6
407	В-21	С-7
408	В-21	С-8
409	В-21	С-9
410	В-21	С-10
411	В-21	С-11
412	В-21	С-12
413	В-21	С-13
414	В-21	С-14
415	В-21	С-15
416	В-21	С-16
417	В-21	С-17
418	В-21	С-1В
419	В-21	С-19
420	В-21	С-20
421	В-22	С-1
422	В-22	С-2
423	В-22	С-Э
424	В-22	С-4
425	В-22	С-5
426	В-22	С-б
427	В-22	С-7
428	В-22	С-8
429	В-22	С-9
430	В-22	С-10
431	В-22	С-11
432	В-22	С-12
433	В-22	С-13
434	5-22	С-14
435	В-22	С-15
436	В-22	С-16
437	В-22	С-17
438	В-22	С-18
439	В-22	С-19
440	В-22	С-20
441	В-23	С-1
442	В-23	С-2
443	В-23	С-3
444	В-23	С-4

- 30 005815

445	В-23	С-5 ’
446	В-23	С-6
447	В-23	С-7
448	В-23	С-8
449	В-23	С-9
450	В-23	С-10
451	В-23	С-11
452	В-23	С-12
453	В-23	С-13
454	В-23	С-14
455	В-23	С-15
456	В-23	С-16
457	В-23	С-17
458	В-23	С-18
459	В-23	С-19
460 .	В-23	С-20
461	В-24	С-1
462	В-24	С-2
463	В-24	С-3
464	В-24	С-4
465	В-24	С-5
466	В-24	С-6
467	В-24	С-7
468	В-24	С-8
469	В-24	С-9
4 70	В-24	С-10
471	В-24	С-П
4 72	В-24	С-12
473	В-24	С-13
474	В-24	С-14
475	В-24	С-15
476	В-24	С-16
477	В-24	С-17
478	В-24	С-18
479	В-24	С-19
480	В-24	С-20
481	В-25	С-1
482	В-25	С-2
483	В-25	С-3
484	В-25	С-4
485	В-25	С-5
486	В-25	С-б
487	В-25	С-7
488	В-25	С-8
489	В-25	С-9
490	В-25	С-10
491	В-25	С-11

- 31 005815

492 ~ ί В-25 С-12

493 В-25 С-13

494 В-25 С-14

495	В-25	С-15
496	В-25	С-16
4 97	В-25	С-17
4 98	В-25	С-10
499	В-25	С-19
500'	В-25	С-20
501	В-26	С-1
502	В-26	С-2
503	В-26	С-3
504	В-26	С-4
505	В-26	С-5
506	В-26	С-6
507	В-26	С-7
508	В-26	С-8
509	В-26	С-9
510	В-26	С-10
511	В-26	С-11
512	В-26	С-12
513	В-26	С-13
514	В-26	С-14
515	В-26	С-15
516	В-26	С-16
517	В-26	С-17
518	В-26	С-10
519	В-26	С-19
520	3-26	С-20
521	В-27	С-1
522	В-27	С-2
523	В-27	С-3
524	В-27	С-4
525	В-27	С-5
526	В-27	С-б
527	В-27	С-7
528	В-27	С-8
529	В-27	С-9
530	В-27	С-10
531	В-27	С-11
532	В-27	С-12
533	В-27	С-13
534	В-27	С-14
535	В-27	С-15
536	В-27	С-16
537	В-27	С-17
538	В-27	С-10

- 32 005815

539	3-27	С-19
540	3-27	С-20
541	В-28	С-1
542	В-28	С-2
543	В-28	С-3
544	В-28	С-4
545	В-28	С-5
546	В-28	С-б
547	В-28	С-7
548	В-28	С-8
549	В-28	С-9
550	В-28	С-10
551	3-28	С-11
552	В-28	С-12
553	В-28	С-13
554	В-28	С-14
555	В-28	С-15
556	3-28	С-16
557	9-28	с-17
558	В-28	С-18
559	В-28	С-19
560	В-28	С-20
561	В-29	С-1
562	В-29	С-2
563	В-29	С-3
564	В-29	С-4
565	В-29	С-5
566	В-29	С-6
567	В-29	С-7
568	В-29	С-8
569	В-29	С-9
570	В-29	С-10
571	В-29	С-11
572	В-29	С-12
573	В-29	С-13
574	В-29	С-14
575	В-29	С-15
576	В-29	С-16
577	В-29	С-17
578	В-29	С-18
579	В-29	С-19
580	В-29	С-20
581	В-30	С-1
582	В-30	С-2
583	В-30	С-3
584	В-30	С-4
585	В-30	С-5

- 33 005815

385	I в-зо	: ' С-6..........
587	1 В-30	I С-7
588	в-зо	С-8
589	В-30	С-9
590	в-зо	С-10
591	в-зо	С-11
592	в-зо	С-12
593	в-зо	С-13
594	в-зо	С-14
595	в-зо	С-15
596	в-зо	С-16
597	в-зо	С-17
598	в-зо	С-18
599	в-зо	С-19
600	в-зо	С-20
601	В-31	С-1
602	В-31	С-2
603	В-31	С-3
604	В-31	С-4
605	В-31	С-5
606	В-31	С-6
607	В-31	С-7
608	В-31	С-8
609	В-31	С-9
610	В-31	С-10
611	В-31	С-11
612	В-31	С-12
613	В-31	С-13
614	В-31	С-14
615	В-31	С-15
616	В-31	С-16
617	В-31	С-17
618	В-31	С-18
619	В-31	С-19
620	В-31	С-20
621	В-32	С-1
622	В-32	С-2
623	В-32	С-3
624	В-32	С-4
625	В-32	С-5
626	В-32	С-6
627	В-32	С-7
628	В-32	с-а
629	В-32	С-9
630	В-32	С-10
631	В-32	С-11
632	В-32	С-12

- 34 005815

633	В-32	С-13
634	В-32	С-14
635	В-32	С-15
636	В-32	С-16
637	В-32	С-17
638	В-32	С-18
639	В-32	С-19
640	В-32	С-20
641	В-33	С-1
642	В-33	С-2
643	В-33	С-3
644	В-33	С-4
645	В-33	С*5
646	В-33	С-6
647	В-33	С-7
648	В-33	С-8
649	В-33	С-9
650	В-33	С-10
651	В-33	С-11
652	В-33	С-12
653	В-33	С-13
654	В-33	С-14
655	В-33	С-15
656	В-33	С-16
657	В-33	С-17
658	В-33	С-18
659	В-33	С-19
660	В-33	С-20
661	В-34	С-1
662	В-34	С-2
663	Э-34	2-3
664	В-34	С-4
665	В-34	С-5
666	В-34	С-б
667	В-34	С-7
668	В-34	С-8
669	В-34	С-9
670	В-34	С-10
671	В-34	С-11
672	В-34	С-12
673	В-34	С-13
674	В-34	С-14
675	В-34	С-15
676	В-34	С-16
677	В-34	С-17
678	В-34	С-18
679	В-34	С-19

- 35 005815

= 90	| 3-34	ί С-20
όθΐ	3-35	! с-1
6В2	В-35	С-2
633	В-35	С-3
694	В-Э5	С-4
695	В-35	С-5
696	В-35	С-б
597	В-35	С-7
538	В-35	С-8
589	В-35	С-9
= 90	В-35	с-ю
691	В-35	С-11
592	В-35	С-12
593	В-35	С-13
594	В-35	С-14
= 95	В-35	С-15
596	В-35	С-16
5Э* '	В-35	С-17
£98	В-35	С-13
699	В-35	С-19
700	В-35	С-20
701	В-36	С-1
702	В-36	С-2
703	В-36	С-3
704	В-36	С-4
705	В-Зб	С-5
705	В-Зб	С-6
707	В-Зб	С-7
708	В-Зб	С-8
709	В-Зб	С-9
710	В-Зб	С-10
711	В-Зб	С-11
712	3-36	С-12
713	З-Эб	С-13
714	В-Зб	С-14
715	В-Зб	С-15
715	В-Зб	С-16
717	В-Зб	С-17
718	В-Зб	С-18
719	В-Зб	С-19
720	В-3 б	С-20
721	В-37	С-1
722	В-37	С-2
723	В-37	С-3
724	В-37	С-4
725	В-37	С-5
726	В-37	С-б

- 36 005815

727	В-37	С-7
728	В-37	С-8
729	В-37	С-9
730	В-37	С-10
731	В-37	С-11
732	В-37	С-12
733	В-37	С-13
734	В-37	С-14
735	В-37	С-15
736	В-37	С-16
737	В-37	С-17
738	В-37	С-18
739	В-37	С-19
740	В-37	С-20
741	В-38	С-1
742	В-38	С-2
743	В-38	С-3
744	В-38	С-4
745	В-38	С-5
746	В-38	С-6
747	В-38	С-7
748	В-38	С-8
749	В-38	С-9
750	В-38	С-10
751	В-38	С-11
752	В-38	С-12
753	В-38	С-13
754	В-38	С-14
755	В-38	С-15
756	В-38	С-16
757	в-зе	С-17
758	В-38	С-18
759	В-38	С-19
760	5-38	С-20
761	В-40	С-1
762	В-40	С-2
763	В-40	С-3
764	В-40	С-4
765	В-40	С-5
768	В-40	С-6
767	В-40	С-7
768	В-40	С-8
769	В-40	С-9
770	В-40	С-10
771	В-40	С-11
772 .	В-40	С-12
773	В-40	С-13
774	' В-40	С-14
775	, В-40	С-15
776	В-40	С-16
777	В-40	С-17
778	В-40	С-18
779	В-40	С-19
780	В-40	С-20

Биологические анализы

Применение комбинаций в соответствии с настоящим изобретением может быть продемонстрировано с помощью следующих исследований. Данные исследования проводят т уйго и на животных моделях, используя, по существу, методы, которые могут продемонстрировать применение настоящего изобретения.

1п уйго анализ соединений, ингибирующих ΙΒΑΤ-опосредованное поглощение [¹⁴С]-таурохолата (ТС) в клетках Н14.

Клетки почек детеныша хомяка (ВНК), трансфицированные с использованием кДНК человеческого ΙΒΑΤ (клетки Н14), высевали в количестве 60000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты Τор-Соиη! для

- 37 005815 культивирования тканей для проведения исследования в течение 24 ч после высевания, 30000 клеток/лунку для исследования в течение 48 ч и 10000 клеток/лунку для исследования в течение 72 ч.

В день исследования монослой клеток осторожно промывали один раз с помощью 100 мкл буфера для анализа (среда Игла, модифицированная по Дульбекко, содержащая 4,5 г/л глюкозы + 0,2% (мас./об.) не содержащего жирных кислот бычьего сывороточного альбумина - (РАР)В8А). К каждой лунке добавляли 50 мкл двухкратного концентрата тестируемого соединения в буфере для анализа вместе с 50 мкл 6 мкМ [¹⁴С]-таурохолата в буфере для анализа (конечная концентрация [¹⁴С]-таурохолата 3 мкМ). Культуральные планшеты инкубировали 2 ч при 37°С, после чего каждую лунку осторожно промывали дважды с помощью 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером по Дульбекко (РВ8) с температурой 4°С, содержащего 0,2% (мас./об.) (РАР)В8А. Затем лунки осторожно промывали один раз 100 мкл 4°С РВ8, не содержащего (РАР)В8А. К каждой добавляли 200 мкл жидкого сцинтиллятора, планшеты нагревали в закрытом состоянии и встряхивали 30 мин при комнатной температуре, после чего в каждой лунке измеряли количество радиоактивности на счетчике Раскагб Тор-Соипк

Ιη νίΐτο анализ соединений, ингибирующих поглощение [¹⁴С]-аланина.

Анализ поглощения аланина проводили по способу, идентичному таурохолатному анализу, за исключением того, что меченный таурохолат заменяли на меченный аланин.

Измерение концентрации желчных кислот в фекалиях крысы.

Общий выход фекалий от индивидуально размещенных крыс собирали в течение 24 или 48 ч, сушили в токе азота, растирали в порошок, перемешивали и взвешивали. Приблизительно 0,1 г отбирали и экстрагировали органическим растворителем (бутанол/вода). После разделения и высушивания остаток растворяли в метаноле и количество присутствующих желчных кислот измеряли с помощью ферментного анализа, используя взаимодействие 3а-гидроксистероид-дегидрогеназы с желчными кислотами с восстановлением ΝΆΌ (см. МазЫде, Р. с1 а1. С1ш. СНет., 27, 1352 (1981), включенный в данный документ в качестве ссылки).

Анализ введения препарата крысе через желудочный зонд.

Самцам крыс АшЧег (275-300 г) вводили ингибиторы 1ВАТ, используя перорально желудочные зонды. Лекарственный препарат или среду для лекарства (0,2% ΤΑΕΕΝ 80 в воде) вводят один раз в день (9:00-10:00 утра) в течение 4 дней в различных дозах в конечном объеме 2 мл на килограмм массы тела. (ΤΑΕΕΝ 80 представляет собой поверхностно-активное вещество 20 молярный моноолеат полиэтиленоксид сорбитана, произведенный 1С1 Зрес1а11у Сйеш1са18, АбтшдЮп, Оек-шаге, И.8.А.). Общие фекальные образцы собирали в течение последних 48 ч периода лечения и анализировали на содержание желчных кислот, используя ферментный анализ, как описано ниже. Эффективность соединения определяли путем сравнения увеличения концентрации фекальных желчных кислот (РВА) у крыс, получающих лекарственный препарат, со средним значением концентрации РВА у крыс, получающих среду для лекарства.

Поглощение [³Н]-таурохолата в мембранных везикулах ворсистого эпителия (ВВМУ).

Мембраны ворсистого эпителия подвздошной кишки кролика получали из замороженной слизистой оболочки с помощью метода осаждения кальцием, описанного Ма1а11ч еΐ а1. (ВюсЫтюа ВюрЬузка Ас1а, 554, 259 (1979), включен в данный документ в качестве ссылки). Способ для измерения таурохолата, по существу, являлся таким, как описан Кгатег еΐ а1. (ВюсЫтка ВюрБузка Ас1а, 1111, 93 (1992), включен в данный документ в качестве ссылки), за исключением того, что аналитический объем составлял 200 мкл вместо 100 мкл, т.е. при комнатной температуре 190 мкл раствора, содержащего 2 мкМ [³Н]-таурохолата (0,75 мкКи), 20 мМ Ιτίδ, 100 мМ №С1, 100 мМ маннитол, рН 7,4, инкубировали 5 с с 10 мкл мембранных везикул ворсистого эпителия (60-120 мкг белка). Инкубацию инициировали путем добавления ВВМУ при энергичном перемешивании и реакцию останавливали путем добавления 5 мл охлажденного во льду буфера (20 мМ НерезЭпз, 150 мМ КС1), сразу после этого фильтровали через найлоновый фильтр (поры 0,2 мкм) и промывали еще 5 мл останавливающего буфера.

Измерение концентрации печеночного холестерина (НЕРАТ1С СНОЬ).

Ткань печени взвешивали и гомогенизировали в смеси хлороформ/метанол (2:1). После гомогенизации и центрифугирования супернатант отделяли и сушили в атмосфере азота. Остаток растворяли в изопропаноле и содержание холестерина измеряли с помощью ферментного анализа, используя сочетание холестериноксидазы и пероксидазы, как описано А11аш, С.А. еΐ а1., С1ш. СНет., 20, 470 (1974) (включен в данный документ в качестве ссылки).

Измерение активности НОМ СоА-редуктазы печени (НОМ СоА).

Микросомы печени получали путем гомогенизации образцов печени в фосфатно-сахарозном буфере, затем отделяли путем центрифугирования. Вещество конечного осадка ресуспендировали в буфере и аликвоту анализировали на активность НОМ СоА-редуктазы путем инкубации в течение 60 мин при 37°С в присутствии ¹⁴С-НОМ-СоА (Όπροηΐ-ΝΕΝ). Реакцию останавливали путем добавления 6Ν НС1, после чего центрифугировали. Аликвоту супернатанта разделяли с помощью тонкослойной хроматографии, пятно, соответствующее продукту ферментативной реакции, соскабливали с пластинки, экстрагировали и радиоактивность определяли путем сцинтилляционного счета (ссылка: Акег1ипб, I. апб В|огкНет, I. (1990) I. Ь1р1б Кез. 31, 2159).

- 38 005815

Измерение активности холестерин 7-а-гидроксилазы в печени (7а-ОНаке).

Печеночные микросомы получали путем гомогенизации образцов печени в фосфатно-сахарозном буфере, затем отделяли путем центрифугирования. Вещество конечного осадка ресуспендировали в буфере и аликвоту анализировали на активность холестерин 7-а-гидроксилазы путем инкубации в течение 5 мин при 37°С в присутствии ΝΆΌΡΗ. После экстракции петролейным эфиром органический растворитель упаривали и остаток растворяли в смеси ацетонитрил/метанол. Продукт ферментативной реакции разделяли путем ввода аликвоты экстракта в колонку ВЭЖХ с обращенной фазой С₁₈ и количественно определяли элюирующееся вещество с помощью детекции при 240 нм (ссылка: Нойои, РЭ.. е! а1. (1994) 1. С1ш. 1пуек1. 93, 2084).

Определение сывороточного холестерина (8ЕВ.СНОБ, ΗΌΕ-СНОЬ, ΤΟΙ и УБЭБ + БЭБ).

Общий сывороточный холестерин (8ЕКСНОБ) измеряли с помощью ферментного анализа с использованием набора от \Уако Ете СйеткаП (Шсйтопб, УЛ); холестерин С11, № по каталогу 276-64909. Холестерин НЭБ (НЭБ-СНОБ) анализировали, используя тот же набор, после осаждения УБЭБ и БЭБ. с помощью НЭБ холестеринового реагента, 81дта Сйет1са1 Со., № по каталогу 352-3 (декстран сульфатный метод). Общие сывороточные триглицериды (контрольные) (ΤΟΙ) анализировали с помощью ферментативной реакции с использованием 8щта Сйет1са1 Со. ОРО-Тгтбег, № по каталогу 337-В. Концентрации холестерина УБЭБ и БЭБ (УБЭБ + БЭБ) рассчитывали как разность между общим холестерином и холестерином НЭБ.

Измерение концентрации желчных кислот в фекалиях хомяка (ЕВЛ).

Общий выход фекалий от индивидуально размещенных хомяков собирали в течение 24 или 48 ч, сушили в токе азота, растирали в порошок и взвешивали. Приблизительно 0,1 г отбирали и экстрагировали органическим растворителем (бутанол/вода). После разделения и высушивания остаток растворяли в метаноле и количество присутствующих желчных кислот измеряли с помощью ферментного анализа, используя реакцию 3а-гидроксистеро ид-дегидрогеназы с желчными кислотами с восстановлением ΝΆΌ (см. МакЫде, Е. е1 а1. С1ш. Сйет., 27, 1352 (1981), включенный в данный документ в качестве ссылки).

Собачья модель для оценки лекарственных препаратов, снижающих уровень липидов.

Самцов коротконогих гончих собак, полученных из такого источника, как питомник Маршалла, весом 6-12 кг, кормили один раз в день в течение 2 ч и давали воду с либитумом. Собак случайным образом определяли в дозировочные группы, состоящие из 6-12 собак каждая, такие как среда для лекарства, в. ж.; 1 мг/кг, в. ж.; 2 мг/кг, в.ж.; 4 мг/кг, в.ж.; 2 мг/кг, р.о. (порошок в капсуле). Внутрижелудочное введение дозы терапевтического вещества, растворенного в водном растворе (например, 0,2% раствор Тетееп 80 [полиоксиэтилена моноолеат, 81дта Сйет1са1к Со., 81. Бошк, МО]) может быть осуществлено с помощью желудочного зонда. Перед началом получения дозы образцы крови брали из латеральной подкожной вены передней конечности утром перед кормлением для оценки уровней холестерина (общего и НЭБ) и триглицеридов в сыворотке. В течение нескольких последующих дней животные получали дозу утром, перед кормлением. Животным позволяли есть 2 ч, после чего остатки пищи удаляли. Фекалии собирали в течение двухдневного периода в конце исследования и анализировали на содержание желчных кислот или липидов. В конце периода лечения также брали образцы крови для сравнения с уровнями липидов в сыворотке до исследования.

Статистически достоверное значение определяли с помощью стандартного Т-теста Стьюдента при р<0,05.

Измерение липидов в сыворотке собак.

Кровь собирали из латеральной подкожной вены передней конечности собак, не получающих пищу, в пробирки для отделения сыворотки (Уаси1ашег 88Т, Вес1оп Э|ск1П5оп апб Со., Егапкйп Бакек, N1). Кровь центрифугировали 20 мин при 2000 об./мин и сыворотку декантировали.

Общий холестерин измеряли в 96-луночном формате с помощью ферментного диагностического набора \Уако (холестерин С11) (\Уако Сйеткак, Ктсйтопб, УА), с использованием реакции холестериноксидазы с образованием пероксида водорода, который измеряли колориметрически. Стандартную кривую для концентраций холестерина от 0,5 до 10 мкг получали, используя первые две колонки планшета. Образцы сыворотки (20-40 мкл, в зависимости от ожидаемой концентрации липидов) или известные сывороточные контрольные образцы добавляли в отдельные лунки с повторами. Воду добавляли в таком количестве, чтобы довести объем в каждой лунке до 100 мкл. К каждой лунке добавляли аликвоту окрашивающего реагента объемом 100 мкл и планшеты считывали при 500 нм после 15 мин инкубации при 37° стоградусной шкалы.

Холестерин НЭБ анализировали с помощью набора 81дта № 352-3 (81дта С11еииса1 Со., 81. Бошк, МО), с использованием декстрансульфата и ионов Мд для избирательного осаждения БЭБ и УБЭБ. Каждый сывороточный образец объемом 150 мкл добавляют в отдельные микроцентрифужные пробирки с последующим добавлением 15 мкл холестеринового реагента НЭБ (81дта 352-3). Образцы перемешивали и центрифугировали 5 мин при 5000 об./мин. Затем аликвоту супернатанта объемом 50 мкл смешивали с 200 мкл физиологического раствора и анализировали по методу, использующемуся для измерения общего холестерина.

- 39 005815

Триглицериды измеряли с помощью набора 81дта № 337 в формате 96-луночного планшета. По данной методике измеряют глицерин после его высвобождения в результате взаимодействия триглицеридов с липопротеинлипазой. Для получения стандартной кривой используют стандартные растворы глицерина (81дта 339-11) с концентрацией, находящейся в интервале от 1 до 24 мкг. Образцы сыворотки (20-40 мкл, в зависимости от ожидаемой концентрации липидов) или известные сывороточные контрольные образцы добавляли в лунки с повторами. Воду добавляли в таком количестве, чтобы довести объем в каждой лунке до 100 мкл и к каждой лунке также добавляли окрашивающий реагент объемом 100 мкл. После перемешивания и инкубации в течение 15 мин планшеты считывали при 540 нм и значения концентраций триглицеридов рассчитывали по стандартной кривой. В опыте также использовали дубликат планшета с использованием контроля ферментного реагента для корректировки эндогенного глицерина в образцах сыворотки.

Измерение желчных кислот в фекалиях собаки.

Для определения концентрации фекальных желчных кислот (ΡΒΑ) собирали образцы фекалий каждого животного. Сбор фекалий проводили в течение последних 48 ч исследования, в течение двух последовательных 24-часовых периодов между 9:00 и 10:00 утра каждый день, перед получением препаратов и кормлением. Отдельные двухдневные сборы фекалий от каждого животного взвешивали, объединяли и гомогенизировали с дистиллированной водой в процессоре (СиШпай) до получения гомогенной взвеси. Приблизительно 1,4 г гомогената экстрагировали в конечной концентрации 50% третичный бутанол/дистиллированная вода (2:0,6) в течение 45 минут в водяной бане при 37°С и центрифугировали 13 мин при 2000 х д Концентрацию желчных кислот (ммоль/день) определяли с помощью 96-луночной ферментативной аналитической системы (1,2). Аликвоту фекального экстракта объемом 20 мкл добавляли к двум сериям каждого из тройных повторов лунок в 96-луночном аналитическом планшете. Для контроля качества анализа также анализировали стандартизированный раствор таурохолата натрия и стандартизированный раствор фекального экстракта (предварительно полученный из объединенных образцов и характеризованный по концентрации присутствующих в нем желчных кислот). Подобным образом к двум сериям тройных повторов лунок добавляли 20-микролитровые аликвоты таурохолата натрия, серийно разбавленные для получения стандартной кривой. К каждой лунке добавляли реакционную смесь, содержащую 1М гидразингидрат, 0,1М пирофосфат и 0,46 мг/мл ΝΑΌ. Затем к одной из двух серий тройных повторов добавляли аликвоту фермента 3а-гидроксистероид-дегидрогеназы (Η8Ό; 0,8 ед./мл) или аналитического буфера (0,1 М пирофосфат натрия) объемом 50 мкл. Все реагенты были получены от 8щта Οιοιηίοαΐ Со., 81. Ьошк, МО. После 60 мин инкубации при комнатной температуре измеряли оптическую плотность при 340 нм и рассчитывали среднее значение каждой серии тройных повторов образцов. Различие в оптической плотности ± Η8Ό фермент использовали для определения концентрации желчных кислот (мМ) в каждом образце на основе стандартной кривой таурохолата. Для расчета соответствующей концентрации ΡΒΑ в ммоль/кг/день использовали концентрацию желчных кислот в экстракте, массу гомогената фекалий (граммы) и массу тела животного. Для определения увеличения (значение дельта) концентрации ΡΒΑ в результате лечения среднюю концентрацию ΡΒΑ (ммоль/кг/день), полученную для группы, получающей среду для лекарства, вычитали из концентрации ΡΒΑ, полученной для группы, получающей лекарственный препарат.

Анализ липидов плазмы кроликов.

Липиды плазмы анализировали с помощью стандартных методов, как описано 1. В. 8с1ш11 е1 а1., 1. СИи. 1пуе§1., 91, 1453-1458 (1993), включенного в данный документ в качестве ссылки. Группы самцов новозеландских белых кроликов сажали на стандартную диету (100 г/день), дополненную 0,3% холестерина и 2% кукурузного масла (2еЦ1ег БоШеге, 1пс., Сагбпеге, ΡΑ). Воду с либитумом давали в свободном доступе. Группы контрольных и обработанных животных умерщвляли после 1 и 3 месяцев обработки. Ткани удаляли для характеристики атеросклеротических бляшек. Для определения концентрации липидов в плазме брали образцы крови.

Липиды плазмы.

Плазму для анализа липидов получали путем забора крови из ушной вены в ЭДТА-содержащие пробирки (Уаси1а1пег; Βес1оη Э|скеп5оп & Со., КиНегГогб, N1), с последующим отделением клеток путем центрифугирования. Общий холестерин определяли с помощью ферментного анализа с использованием реакции холестериноксидазы (С.Л. ΑΙΙηίπ е1 а1., С1ш. С1ет., 20, 470-475 (1974), включен в данный документ в качестве ссылки). Холестерин НПЬ также измеряли с помощью ферментного анализа, после избирательного осаждения ЬПЬ и УЪПЬ под действием декстрансульфата и магния (С.В. ХУагшск е1 а1., Сйп. С1ет., 28, 1379-1388 (1982), включен в данный документ в качестве ссылки). Уровни триглицеридов в плазме определяли путем измерения количества глицерина, высвобождающегося под действием липопротеинлипазы, посредством анализа с использованием связанного фермента (6. ΒυοαίΘ е1 а1., Сйп. С1ет., 19, 476-482 (1973), включен в данный документ в качестве ссылки).

Атеросклероз.

Животных умерщвляли путем инъекции пентобарбитала. Торакальные аорты быстро удаляли, фиксировали погружением в 10% нейтральный забуференный формалин и окрашивали маслянистым красным О (0,3%). После одного продольного надреза вдоль стенки, противоположной устью, сосуды закре

- 40 005815 пляли открытыми для оценки площади, занимаемой бляшками. Процент площади, покрытой бляшками, определяют из значений общей исследуемой площади и окрашенной площади путем порогового анализа с использованием анализатора изображения подлинного окрашивания (УИеоте1пс 150; Атспеап Ιηηονί8Ϊοη, Шс., 8ап О|едо. СА), сопряженного с цветовой камерой (ТозЫЬа 3ССЭ). установленной на аналитическом микроскопе. Тканевой холестерин измеряли с помощью ферментного анализа, как описано, после экстракции смесью хлороформ/метанол (2:1) в соответствии с методом, описанным Ео1с11 е1 а1. (I. ΒίοΙ. СНет., 226, 497-509 (1957), включен в данный документ в качестве ссылки).

Сосудистый ответ ίη νίΙΐΌ.

После инъекции пентобарбитала натрия абдоминальные аорты быстро вырезают и помещают в насыщенный кислородом бикарбонатный буфер Кребса. После удаления периваскулярной ткани вырезают круговые сегменты диаметром 3 мм, помещают при 37°С в мускульную баню, содержащую бикарбонатный раствор Кребса, и подвешивают между двумя неокрашенными стальными проволоками, одна из которых присоединена к преобразователю усилия (Сгазз ШзРитеШ Со., Оитсу, МА). Изменение усилия в ответ на добавление к водяной бане ангиотензина ΙΙ записывали на регистрирующем устройстве.

Анализ активности СЕТР в человеческой плазме (меченный тритием эфир холестерина).

Кровь получали от здоровых добровольцев. Кровь собирали в пробирки, содержащие ЭДТА (пул плазмы, содержащей ЭДТА). Пул человеческой плазмы, содержащей ЭДТА, которую хранили ранее при -20°С, оттаивают при комнатной температуре и центрифугируют 5 мин для удаления каких-либо частичек. Меченные тритием НЭС с радиоактивной меткой, введенной во фрагмент эфира холестерина ([³Н]СЕ-НПЬ), как описано Мойоп ηηά Ζί1\ΌΓ3ΐηίΙ (I. Вю1. СНет., 256, 11992-95 (1981)), добавляют к плазме до получения конечной концентрации (25 мкг/мл холестерина). Ингибиторные соединения добавляют к плазме следующим образом. Равные объемы плазмы, содержащей [³Н]СЕ-НПЬ (396 мкл) добавляют с помощью пипетки в микропробирки (ТйепиЬе®, Вю-Каб 1аЬога1опез, Негси1ез, СА). Готовили серийные разведения в ΌΜ8Θ (или в некоторых случаях в альтернативных растворителях, таких как диметилформамид или этанол) базовых растворов соединений в ΌΜ8Θ с концентрацией, составляющей обычно 20-50 мМ. Затем к каждой из пробирок, содержащих плазму, добавляли четыре мкл каждого из серийных разведений ингибиторных соединений или только ΌΜ8Θ. Содержимое пробирок сразу перемешивали. После этого тройные повторы аликвот (100 мкл) из каждой пробирки с плазмой переносят в лунки 96-луночных круглодонных полистирольных микротитровальных планшетов (Сотшд, Соттд, ΝΥ). Планшеты герметично закрывали пластиковой пленкой и инкубировали 4 ч при 37°С. Опытные лунки содержали плазму с разведениями ингибиторных соединений.

Контрольные лунки содержали плазму только с ΌΜ8Θ. Пустые лунки содержали плазму только с ΌΜ8Θ, которые оставляли в микропробирках при 4°С в течение 4 ч инкубации и добавляли к лункам микротитровального планшета в конце периода инкубации. ΑΓΏΓ и ЬВЬ осаждали путем добавления 10 мкл осаждающего реагента (1% (мас./об.) декстрансульфата (Пех1га11р50)/0,5 М хлорид магния, рН 7,4) во все лунки. Содержимое лунок перемешивают на миксере для планшет и затем инкубируют 10 мин при температуре окружающей среды. Планшеты затем центрифугируют при 1000 х д в течение 30 мин при 10°С. Затем супернатанты (50 мкл) из каждой лунки переносят в 96-луночные планшеты Р1со1а1е™ (Раскагб, Μе^^άеη, СТ), содержащие 250:1 Μ^с^οзс^ηΐ™-40 (Раскагб, Μе^^άеη, СТ). Планшеты нагревают в герметично закрытом состоянии (Тор8еа1™-Р, Раскагб, Μе^^άеη, СТ) в соответствии с инструкциями производителя и перемешивают в течение 30 мин. Радиоактивность измеряют на сцинтилляционном счетчике для микропланшет (ТорСоииЕ Раскагб, Μе^^άеη, СТ). Значения 1С₅₀ определяют как концентрацию ингибиторного соединения, ингибирующую перенос [³Н]СЕ из [³Н]СЕ-НПЬ супернатанта в осажденные УБ-ОБ и ГЭГ на 50% по сравнению с переносом, полученным для контрольных лунок. Максимальный процент переноса (в контрольных лунках) определяли, используя следующеее уравнение:

Процент переноса, определенного в лунках, содержащих ингибиторные соединения, по отношению к контролю, определяют следующим образом:

% от контроля ^Р^юяияратю^ообразца

Значения 1С₅₀ рассчитывали из графиков зависимости процента от контроля от концентрации ингибиторного соединения.

Активность СЕТР ίη νίΙΐΌ.

Способность соединений ингибировать активность СЕТР оценивали, используя ίη νίΙΐΌ анализ, в котором измеряли скорость переноса радиоактивно меченного эфира холестерина ([³Н]СЕ) от донорных частиц НИЬ к акцепторным частицам ЬВЬ. Подробности анализа предоставлены С1спп е1 а1. (С1спп ηηά Μе1ΐοη ^иаηΐ^Г^саί^οη ок Ско1ез1:егу1 Ез1ег ТгащГег Рго1ет (СЕТР): А) СЕТР АсЕтку ηηά В) 1ттипос11ет1са1 Аззау оГ СЕТР Рго1еш, Μеΐк. Еп/утоГ 263, 339-351 (1996)). СЕТР получали из не содержащей сыворотки кондиционированной среды клеток СНО, трансфицированных кДНК, кодирующей СЕТР (ХУаид, 8.

- 41 005815 с1 а1. ί. ΒίοΙ. СНсш. 267, 17487-17490 (1992)). Для измерения активности СЕЕТ [³Н]СЕ-меченные НИБ, БИБ, СЕΤР и аналитический буфер (50 мМ трис(гидроксиметил)аминометан, рН 7,4; 150 мМ хлорид натрия; 2 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота; 1% бычий сывороточный альбумин) инкубировали в объеме 200 мкл в течение 2 ч при 37°С в 96-луночных планшетах. БОБ избирательно осаждали путем добавления 50 мкл смеси 1% (мас./об.) декстрансульфат/0,5 М хлорид магния, энергично перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 10 мин. Раствор (200 мкл) переносили на фильтровальный планшет (М1Шроге). После фильтрации радиоактивность, присутствующую в осажденных БЭБ. измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Коррекцию неспецифического переноса или осаждения осуществляли путем включения образцов, не содержащих СЕТР. Скорость переноса [³Н]СЕ, определенная с помощью данного анализа, является линейной функцией от времени и концентрации СЕТР, до 25-30% переносимого [³Н]СЕ.

Активность тестируемых соединений определяли с помощью вышеописанного анализа в присутствии различных концентраций тестируемых соединений и путем определения концентрации, требующейся для 50% ингибирования переноса [³Н]СЕ от НИБ к БОБ. Данное значение определяли как ГС₅₀. Значения ГС50, определенные с помощью данного анализа, являются точными, если Ιί'₅₀ выше 10 нм. В случае, если соединения имеют более высокую ингибиторную активность, точные значения ΙΟ₅₀ могут быть определены с использованием более длительного времени инкубации (до 18 ч) и более низких концентраций СЕТР (<50 нМ).

Ингибирование активности СЕТР ίη νίνο.

Ингибирование активности СЕТР под действием тестируемого соединения определяли путем введения соединения животному посредством внутривенной инъекции или перорально через зонд, измерения количества меченного тритием эфира холестерина ([³Н]СЕ), перенесенного от частиц НИБ к частицам УБББ и БИБ, и сравнения данного количества перенесенного эфира с количеством, наблюдаемым у контрольных животных.

Самцов золотистых сирийских хомяков держали на пищевой диете, содержащей 0,24% холестерина, в течение по меньшей мере двух недель перед исследованием. В случае животных, получающих дозы препарата внутривенно, непосредственно перед экспериментом животных анестезировали пентобарбиталом. Анестезию поддерживали в течение всего эксперимента. Внутренние катетеры вставляли в яремную вену и сонную артерию. В начале эксперимента все животные получали 0,2 мл раствора, содержащего [³Н]СЕ-НИБ, чрез яремную вену. [³Н]СЕ-НИБ представляет собой препарат человеческих НИБ, содержащих меченный тритием эфир холестерина, его получали по способу С1епп е1 а1. (Ме111. ЕпхутоБ 263, 339-351 (1996)). Соединение в виде базового раствора с концентрацией 80 мМ растворяли в среде (2% этанол: 98% РЕ6 400, 81дта СНет1са1 Сотрапу, 8ΐ. Бошк, МБыиг υδΑ) и вводили либо путем инъекции болюса, либо путем непрерывного вливания. Через 2 мин после введения дозы [³Н]СЕ-НИБ животные получали 0,1 мл тестируемого раствора, введенного в яремную вену. Контрольные животные получали 0,1 мл раствора для внутривенного введения, представляющего собой среду для лекарства, без тестируемого соединения. Через 5 мин брали первые образцы крови (0,5 мл) из сонной артерии и собирали в стандартные микропробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту. Для промывания катетера и замены объема крови вводили физиологический раствор (0,5 мл). Последующие образцы крови брали по тому же методу через 2 и 4 ч. Образцы крови хорошо перемешивали и держали на льду до завершения эксперимента. Плазму получали путем центрифугирования образцов крови при 4°С. Плазму (50 мкл) обрабатывали 5 мкл осаждающего реагента (декстрансульфат, 10 г/л; 0,5 М хлорид магния) для удаления УБИБ/БИБ. После центрифугирования полученный супернатант (25 мкл), содержащий НИБ, анализировали на наличие радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Процент [³Н]СЕ, перенесенного от НИБ к БИБ и УБИБ (% переноса), рассчитывали на основе общей радиоактивности в одинаковых образцах плазмы до осаждения. Обычно количество переноса от НИБ к БИБ и УБИБ у контрольных животных составляет от 20 до 35% через 4 ч.

Альтернативно, не анестезированные животные получали дозу тестируемого соединения перорально через зонд в виде суспензии в 0,1% метилцеллюлозе в воде. В определенный для каждого соединения момент времени, когда уровень тестируемого вещества в плазме достигает своего пика (С_тах) после перорального введения, животных анестезировали пентобарбиталом и затем вводили 0,2 мл раствора, содержащего [³Н]СЕ-НИБ в яремную вену, как описано выше. Контрольные животные получали 0,25 мл раствора, представляющего собой среду для лекарства, не содержащего тестируемое соединение, путем перорального введения через зонд. Через 4 ч животных умерщвляли, собирали образцы крови и процент [³Н]СЕ, перенесенного от НИБ к БИБ и УБИБ (% переноса), анализировали как описано выше.

Альтернативно, ингибирование активности СЕТР под действием тестируемого соединения определяли путем введения соединения мышам, которые были отобраны на основе наличия экспрессии человеческого СЕТР (ΙιΟΈΤΡ) в результате трансгенных манипуляций (ΙιΟΈΤΡ мыши). Тестируемые соединения вводили путем внутривенной инъекции или перорально через зонд и определяли количество меченного тритием эфира холестерина ([³Н]СЕ), перенесенного от частиц НИБ к частицам БИБ и УБИБ, и сравнивали с перенесенным количеством, наблюдаемым у контрольных животных. Мышей С57В1/6, которые являются гомозиготными по отношению к гену ΙιίΈΤΡ, держали на пищевой диете с высоким содержа

- 42 005815 нием жира, такой, как ΤΌ88051, как описано Νίκΐιίηη е1 а1. (I. Ыр1б Век., 31, 859-869 (1990)), в течение последних двух недель перед исследованием. Мыши получали перорально через зонд дозу тестируемого соединения в виде суспензии в 0,1% метилцеллюлозе в воде, или внутривенно инъекцию болюса тестируемого соединения в 10% этанола и 90% полиэтиленгликоля. Контрольные животные получали раствор, представляющий собой среду для лекарства, не содержащий тестируемого соединения, путем перорального введения через зонд или путем внутривенной инъекции болюса. В начале эксперимента всем животным вводили в хвостовую вену 0,05 мл раствора, содержащего [³Н]СЕ-НПЬ. [³Н]СЕ-НПЬ представляет собой препарат человеческих НОЙ. содержащих меченный тритием эфир холестерина, его получали по способу 61епп е1 а1. (Ме111. Еп/утоЕ 263, 339-351 (199.6)). Через 30 мин животных обескровливали и кровь собирали в стандартные микропробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту. Образцы крови хорошо перемешивали и держали на льду до завершения эксперимента. Плазму получали путем центрифугирования образцов крови при 4°С. Плазму разделяли и анализировали с помощью гельфильтрационной хроматографии, и определяли относительные количества [³Н]СЕ во фракциях, содержащих νΣΏΕ, БОБ и НОБ.

Процент [³Н]СЕ, перенесенного от НОБ к БОБ и νΣΏΕ (% переноса), рассчитывали на основе общей радиоактивности в одинаковых образцах плазмы до осаждения. Обычно количество переноса от НОБ к БЭБ и νΕΌΕ у контрольных животных составляет от 20 до 35% через 30 мин.

Анализ абсорбции холестерина в кишечнике.

Показано, что ряд соединений ингибируют абсорбцию холестерина из кишечного тракта. Данные соединения снижают уровень холестерина в сыворотке путем уменьшения абсорбции в кишечнике как экзогенного (диетарного), так и эндогенного (секретирующегося из желчного пузыря в кишечный тракт) холестерина.

У хомяков применение двойного изотопного метода плазменного соотношения для измерения абсорбции холестерина в кишечнике было усовершенствовано и оценено, как описано Тиг1еу е!.а1. (ί. Ыр1б Век. 35, 329-339 (1994), включен в данный документ в качестве ссылки).

Самцы хомяков весом 80-100 г получали пищу и воду с либитумом в комнате с 12-часовыми чередующимися световыми и темновыми периодами. Четыре часа в световом периоде каждому хомяку вводили вначале внутривенно дозу 2,5 мкКи [1,2-³Н]холестерина, суспендированного в Ιηίπιΐίρίά (20%) и затем перорально дозу [4-¹⁴С]холестерина в масле из среднецепочечных триглицеридов (МСТ). В.в. дозу давали путем введения смеси Ιηίπιΐίρίά объемом 0,4 мл в дистальную бедренную вену. Пероральную дозу давали путем введения масляной смеси МСТ объемом 0,6 мл в желудок через зонд, представляющий собой полиэтиленовую трубку. Через 72 ч хомяков обескровливали и определяли количество ³Н и ¹⁴С в плазме и в исходном кодичестве введенной метки с помощью жидкостной сцинтилляционной спектрометрии. Абсорбцию холестерина рассчитывали на основе следующего уравнения:

% пероральной дозы на мл 72- часового образца плазмы

Процент абсорбированного холестерина = %в.в.дозынамл72-часовогообразцаплазмы

Примеры, описанные в данном документе, могут быть осуществлены путем замены в общем или конкретно описанных терапевтических соединений или инертных ингредиентов на применяемые в предшествующих примерах.

Очевидно, что в объеме данного изобретения разными способами могут осуществляться вариации. Такие вариации не изменяют объем настоящего изобретения, и подразумевается, что все такие модификации и эквиваленты, являющиеся очевидными специалисту в данной области, включены в объем нижеприведенной формулы изобретения.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Терапевтическая комбинация, включающая от 0,01 до 1000 мг/день соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и от 0,01 до 100 мг/кг веса/день соединения, ингибирующего белок - переносчик эфира холестерина, причем общее количество указанных соединений вместе составляет количество, эффективное против гиперлипидемического состояния, атеросклеротического состояния или гиперхолестеринемического состояния, причем указанное соединение, ингибирующее белок - переносчик эфира холестерина, включает соединение С-12 общей формулы

   - 43 005815 или его энантиомеры или рацематы.
2. 2. Терапевтическая комбинация, включающая от 0,01 до 1000 мг/день соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и от 0,01 до 100 мг/кг веса/день соединения, ингибирующего белок - переносчик эфира холестерина, причем общее количество указанных соединений вместе составляет количество, эффективное против гиперлипидемического состояния, атеросклеротического состояния или гиперхолестеринемического состояния, причем указанное соединение, ингибирующее белок - переносчик эфира холестерина, включает соединение С-12 общей формулы или его энантиомеры или рацематы,
3. 3. Терапевтическая комбинация по п.1, отличающаяся тем, что соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, представляет собой соединение общей формулы В-5
4. 4. Терапевтическая комбинация по п.1, отличающаяся тем, что соединение, ингибирующее белок - 44 005815 переносчик эфира холестерина, включает соединение С-12 общей формулы
5. 5. Терапевтическая комбинация по п.4, отличающаяся тем, что соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, включает соединение формулы В-5
6. 6. Способ профилактики или лечения гиперлипидемического состояния, включающий введение пациенту, нуждающемуся в лечении, комбинации в дозированной форме, где комбинация включает от 0,01 до 1000 мг/день соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и от 0,01 до 100 мг/кг веса/день соединения, ингибирующего белок - переносчик эфира холестерина, причем их количество составляет антигиперлипидемически эффективное количество, причем указанное соедине- или его энантиомеры или рацематы.
7. 7. Способ профилактики или лечения атеросклеротического состояния, включающий введение пациенту, нуждающемуся в лечении, комбинации в дозированной форме, где комбинация включает от 0,01 до 1000 мг/день соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и от 0,01 до 100 мг/кг веса/день соединения, ингибирующего белок - переносчик эфира холестерина, причем их общее количество составляет антиатеросклеротически эффективное количество, причем указанное соединение, ингибирующее белок - переносчик эфира холестерина, включает соединение С-12 общей формулы

   - 45 005815 или его энантиомеры или рацематы.
8. 8. Способ профилактики или лечения гиперхолестеринемии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в лечении, комбинации в дозированной форме, где комбинация включает от 0,01 до 1000 мг/день соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и от 0,01 до 100 мг/кг веса/день соединения, ингибирующего белок - переносчик эфира холестерина, причем их общее количество составляет антигиперхолестеринемически эффективное количество и причем указанное соединение, ингибирующее белок - переносчик эфира холестерина, включает соединение С-12 общей формулы или его энантиомеры или рацематы.