DK175315B1 - Fremgangsmåder til fremstilling af enzymatisk aktivt lysozym, syntetisk gen for humant lysozym og gærceller, der er i stand til at udtrykke det syntetiske gen - Google Patents

Description

DK 175315 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af aktivt humant lysozym ved dyrkning af gensplejsede gærceller. Nærmere bestemt drejer det sig om en fremgangsmåde, hvor aktivt humant lysozym fremstilles med højt udbytte og udskilles af gærcellerne, hvorefter det let kan udvindes og oprenses.

5

Lysozym er et fællesnavn for en række enzymer, som forekommer vidt omkring i naturen og vides at katalysere hydrolysen af peptidoglycan, der er den vigtigste bestanddel af den bakterielle cellevæg. Som følge af denne aktivitet har lysozym antibakteriel virkning, og lysozym menes derfor at indgå i de forskellige former for barrierer mod bakteriel infektion, som findes i 10 de fleste levende organismer. I insekter, som mangler lymphocytter og immunoglobuliner, sikres immunresponset efter bakteriel infektion derfor af et enzymsystém med mange indgående faktorer, et såkaldt mult'rfaktorielt enzymsystem, hvor lysozym er en vigtig komponent (se fx D.

Hultmark et al.. Eur. J. Biochem., b. 106, s. 7,1980). Da lysozym er så udbredt i højere dyrearter, må det have stor betydning, skønt dets fysiologiske rolle stadig er ukendt (se R. Ragh-15 nathan, ITCS Med. Sci., b. 13, s. 480, 1985): Man har foreslået, at det har en stimulerende virkning på immunsystemet (se P. Jolles, Biomedicine, b. 25, s. 276, 1976). Man har vist, at humant lysozym i fysiologiske doser stimulerer phagocytosen in vitro af gærcller ved hjælp af polymorphonucleære leukocytter (se M. Klockars & P. Roberyts, Acta haemat., b. 58, s. 289, 1976). Man har også foreslået, at lysozym har en generel rolle som overvåger af membraner og 20 i forbindelse med makrophagers anti-tumor-funktion (se E.F. Osserman et al., Nature, b. 243, s.

331, 1973). For nylig har man vist, at lysozym i sig selv har en vis anti-tumor-virkning (se R.

Raghnathan, Cancer Detection and Prevention, b. 5, s. 78, 1982). Kyllingelysozym bruges allerede farmaceutisk til en række formål, især i Japan.

25 Kyllingelysozym tilhører en klasse nært sammenhørende enzymer, som også indeholder humant lysozym, og som benævnes c-lysozymer ("c” for "chicken", kylling). Disse lysozymtyper er ejendommelige ved at have lignende fysikokemiske egenskaber, bl.a. en molekylvægt på omkring 15.000, meget tæt homologi i aminosyresekvenser og tertiær struktur, samme enzymatiske aktivitet, fx en vis chitinase-aktivitet; i modsætning til g-lysozymer ("g" for "goose", gås), der 30 har en molekylvægt på omkring 20.000 og ingen chitinase-aktivitet (se oversigtsartiklen af P.

Jolles & J. Jolles i Mol. & Cell. Biochem., b. 63, s. 165,1984).

På trods af disse strukturelle og fysikokemiske ligheder kan lysozymer i samme klasse imidlertid have helt forskellige immunologiske egenskaber. Fx krydsreagerer kyllingelysozym og humant 35 lysozym ikke med deres respektive antistoffer (se A. Faure & P. Jolles, FEBS Lett., b. 10, s.

237, 1970). Derfor er humant lysozym særligt egnet til farmaceutiske formål og i fødevarer.

Kyllingelysozym findes i rigt mål og udnyttes faktisk, fra æggehvide, men humant lysozym kan -----------;-1

I DK 175315 B1 I

I 2 I

I ikke tilvejebringes i store mængder til kommercielle formål, kun ved at dyrke celler, hvis DNA er I

I manipuleret, så det udtrykket enzymet. I

I Det er nu i praksis almindeligt at klone og udtrykke et gen, som koder for ét heterologt protein, fx I

I 5 et protein af human oprindelse, i en mikrobiel vært. Adskillige detaljerede eksempler kan findes I

i patentlitteraturen, og nogle af disse fremgangsmåder har allerede kommercielt båret frugt. I

I Dette gælder fx for fremstilling af human insulin, væksthormon og alpha-interferon, som er * I

I udtrykt i den gramnegative bakterie Escherichia coli. I denne vært kan man let opnå høje I

I ekspressionsniveauer; imidlertid er det dannede protein ofte koncentreret i form af store inklusi- I

I 10 onslegemer, hvor det er uopløseligt og på inaktiv form. I disse tilfælde er det nødvendigt at I

anvende en dyr og besværlig renatureringsproces for at få fat i det fysiologisk aktive protein, og I

I udbyttet i disse proteiner kan være så lavt som omkring 20%, hvilket fx er tilfældet med prochy- I

I mosin (se F.A.P. Marston et al., Biotechnology, b. 2, s. 800, 1984). Samme fænomen opleves, I

I når et DNA-segment, som koder for humant lysozym, udtrykkes i E. coli. Efter ultralydbehand- I

I 15 ling af cellerne findes det syntetiserede humane lysozym navnlig i tilknytning til cellestykkerne. I

I Ydermere er proteinet ikke aktivt og afviger fra det native humane lysozym ved at indeholde en I

I ekstra N-terminal methioningruppe (se M. Muraki et al., Agric. Biol. Chem., b. 49, s. 2829, I

I 1985). I

I 20 For at undgå disse vanskeligheder har man forsøgt at udtrykke humant lysozym i den grampo- I

I sitive bakterie Bacillus subtilis, som vides aktivt at udskille et antal hydrolytiske enzymer i det I

eksterne medium, og som finder udstrakt anvendelse som vært for ekspression og sekretion af I

heterologe proteiner. I tilfældet med humant lysozym har man imidlertid på det sidste vist, at det I

udskilte protein er enzymatisk inaktivt, sandsynligvis på grund af en forkert bindingsdannelse I

I 25 (se K. Yoshimuraet al., Biochem. &Biophys. Res. Comm., b. 145, s. 712,1987). I

I Andre værter end bakterier kan også anvendes til fremstilling af heterologe proteiner, fx euka- I

I ryotiske mikroorganismer, bl.a. gær, navnlig Saccharamocyes cerevisiae, eller endda filamen- ' I

tøse svampe. Som typisk eksempel på fremstilling af et humant protein med højt udbytte i gær I

I 30 kan nævnes den intracellulære ekspression af aktivt superoxiddismutasé (se den internationale I

I patentansøgning WO 85/01503). Når imidlertid DNA, som koder for færdigt humant lysozym, I

I udtrykkes i gær, observeres det samme fænomen som i E. coli, dvs., at lysozym forefindes I

I tilknyttet cellestykkerne, hvorfra det må ekstraheres ved anvendelse af opløsende midler, fx I

I koncentreret urinstof (se EP 0 181 634, s. 47). På det seneste har man fået flere oplysninger. I

I 35 som viser, at færdigt lysozym udtrykt i gær faktisk fås på uopløselig og inaktiv form, formodent- I

H lig som følge af en forkert dannelse af disulfidbindinger (se T. Hayakawa et al., Gene, b. 56, s. I

I 53,1987). I

DK 175315 B1 3

Som åbenbaret i BE 901,223 kan enzymatisk aktivt lysozym fås fra gensplejset gær, forudsat at det DNA, som koder for det færdige protein, sammensmeltes med en leader-sekvens, som koder for et signalpeptid, der genkendes af gærcellens sekretionsmaskineri. I dette tilfælde afsondres det færdige protein gennem plasmamembranen, hvorefter det, afhængigt af betingel-5 seme, udskilles til kulturmediet. I dette patentskrift vises det altså, at udtrykning i gær af et komplet cDNA-materiale, der koder for kyllinge-præ-lysozym, resulterer i dannelse af enzymatisk aktivt lysozym, som for en stor dels vedkommende, dvs. 73%, findes på opløst form i kulturmediet. Senere er det vist, at den N-terminale sekvens for det således dannede kyllinge-lysozym er identisk med det native enzyms, dvs. Lys-Val-Phe-Gly-Arg-Cys-Glu-Leu-Ala-Ala {se 10 J. Oberto et al., 11. Int. Symp. Special. Yeast Mol. Biol. & Genetics, Vama, Nov 4-9 1985; BE 903,626). Disse resultater viser, at signalsekvensen for kyllingelysozym spaltes korrekt af gærens sekretionssystem, hvilket muliggør anvendelsen af denne signalsekvens til at sikre sekretionen eller afsondringen af lysozym fra diverse kilder, jf. kravene, fx krav 3, i BE 901,223.

Dette har for nylig været anvendt i tilfældet med humant lysozym (se Y. Jigami et al., Gene, b.

15 43, s. 273, 1986 og K. Yoshimura et al., se ovenfor). Imidlertid er de rapporterede udbytter relativt små.

At kunne få udskilt lysozym fra gærcellerne er af stor praktisk betydning. Det således fremstillede enzym er ikke kun aktivt og identisk med det native protein, men det udvindes og oprenses 20 let ved hjælp af velkendte metoder, som fx beskrevet i BE 903,626, se ovenfor, uden at man må formale cellerne eller anvende dyre og komplekse fraktionerings- og renatureringsprocedurer.

En anden fordel ved at have det ønskede protein udskilt fra cellerne er muligheden for til andet formål at udvinde disse, fx som en kilde til proteiner og vitaminer i foderpræparater. Det høje proteinindhold, den gode aminosyresammensætning og fraværet af cellulose i gærceller gør 25 disse værdifulde som supplerende foder til kalve, smågrise og andet afkom af husdyr.

For økonomisk forsvarligt at kunne fremstille en relativt stor mængde af et middelværdigt enzym som lysozym ved fermentering er det ikke nok at sørge for at få det udskilt fra cellerne. Det er også nødvendigt at fremstille det i højt udbytte. I overensstemmelse hermed er det et formål 30 med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af enzymatisk aktivt lysozym i højt udbytte. Det er også et formål med opfindelsen at opnå dette under betingelser, hvor denaturering af enzymet minimeres, og hvor det fås på koncentreret form, så den videre oprensning lettes. Denne opfindelse er af særlig interesse, når det dannede lysozym er relativt toksisk for gærcellen, nærmere bestemt når humant lysozym skal fremstilles.

35 Andre formål og fordele ved opfindelsen vil fremgå af den følgende beskrivelse og af eksemplerne.

I DK 175315 B1 I

I I

I Disse formål opnås, når der anvendes en fermenteringsproces, hvor gærceller med passende I

I modificeret DNA bringes til at producere og udskille humant lysozym under vækstbegrænsede I

I betingelser. I

I 5 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af enzymatisk aktivt lyso- I

zym, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bringer voksende gærceller, hvis I

I DNA er genetisk modificeret, i kontakt med et kulturmedium under vækstbegrænsede betingel- I

I ser, og at man inducerer disse gærceller til at syntetisere og udskille enzymatisk aktivt lysozym. I

I 10 Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af enzymatisk aktivt lysozym, I

I hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker gærceller, hvis DNA er genetisk I

modificeret, i et kulturmedium, der represserer syntese af enzymatisk aktivt lysozym, at man I

I bringer de voksende gærceller i kontakt med et kulturmedium under vækstbegrænsede betin- I

I gelser, og at man inducerer disse gærceller til at syntetisere og udskille enzymatisk aktivt I

I 15 lysozym. I

I Opfindelsen angår yderligere et syntetisk gen for humant lysozym, som er udvalgt fra gruppen I

omfattende følgende sekvens: I

I AAGGTTTTCGAAAGATGTGAGCTAGCTAGAA I

TTCCAAAAGCTTTCTACACTCGATCGATCTT I

I CTTTGAAGAGATTGGGTATGGACGGTTACAGAGGTATCTCCTTGGCTAACTGGATGTGTTTGGCC I

GAAACTTCTCTAACCCATACCTGCCAATGTCTCCATAGAGGAACCGATTGACCTACACAAACCGG I

I AAGTGGGAATCTGGTTACAACACCAGAGCTACCAACTACAACGCTGGTGACAGATCTACCGACTA I

TTCACCCTTAGACCAATGTTGTGGTCTCGATGGTTGATGTTGCGACCACTGTCTAGATGGCTGAT I

I CGGTATCTTCCAAATCAACTCCAGATACTGGTGTAACGACGGTAAGACCCCAGGTGCTGTTAACG

GCCATAGAAGGTTTAGTTGAGGTCTATGACCACATTGCTGCCATTCTGGGGTCCACGACAATTGC '

CTTGTCACTTGTCCTGTTCTGCTTTGTTGCAAGACAACATCGCTGACGCTGTCGCCTGTGCTAAG

GAACAGTGAACAGGACAAGACGAAACAACGTTCTGTTGTAGCGACTGCGACAGCGGACACGATTC

I AGAGTTGTTAGAGACCCACAAGGTATCAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAACAGATGTCAAAACAG

TCTCAACAATCTCTGGGTGTTCCATAGTCTCGAACCCAACGAACCTCTTTGTCTACAGTTTTGTC

I AGACGTTAGACAATACGTCCAAGGTTGTGGTGTT

TCTGCAATCTGTTATGCAGGTTCCAACACCACAA

DK 175315 B1 5 og den mutant heraf, hvor koden i position 4 i det færdige protein er ændret fra GAA (glutaminsyre) til GGA (glycin).

Opfindelsen skal i det følgende forklares nærmere i forbindelse med tegningen, hvor 5 fig. 1 viser en sekvens af et syntetisk gen, der koder for humant lysozym, som er syntetiseret med af gær foretrukne koder (J.L. Bennetzen og B.D. Hali, J. Biol. Chem.., b. 257, s.

3026, 1982) under anvendelse af phosphoramid-kemi på en DNA-syntetisator af mærket Applied Biosystems, 10 fig. 2 plasmidet pAB24AGScLysH, som kan anvendes til ekspression i gær af humant lysozym, og som er fremkommet ved insertion af en ekspressionskassette for humant lysozym omfattende den regulerbare ADH2-GAP-promotor, lysozymsignalsekvensen fra kylling, genet for humant lysozym vist i fig. 1 og GAP-terminatoren i gær - E. coli - shuttle-vektoren pAB24, 15 fig. 3 en sekvens af en mutant af det humane lysozymgen med Gly-4, der er konstrueret ved anvendelse af et syntetisk fragment fra Spel-sædet i kytlingesignalsekvensen til Nhelsædet i det humane gen, i hvilket koden i position 4 i det færdige protein er ændret fra GAA (glutaminsyre) til GGA (glycin), fig. 4 plasmidet pAB24AGScLysHGIy4, som er identisk med det i fig. 2 viste, bortset fra, at 20 mutantgenet i fig. 3 er sat i stedet for det humane lysozymgen fra fig. 1, fig. 5 plasmidet pAB24AGScLysC, som er identisk med det i fig. 2 viste, bortset fra, at ekspressionskassetten består af ADH2-GAP-promotoren, et komplet kyllingelysozym-cDNA-materiale og ADH1-terminatoren, fig. 6 plasmidet pAB24GScLysC, som er identisk med det i fig. 2 viste, bortset fra, at eks-25 pressionskassetten består af den konstitutive GAP-promotor, det samme kyllingelyso- zym-cDNA som i fig. 5 og GAP-terminatoren, fig. 7 plasmidet pAB24AGAIphaFLysH, som stort set er identisk med det i fig. 2 viste, bortset fra, at alpha-leadersekvensen er sat i stedet for kyllingelysozymsignalsekvensen, fig. 8 plasmidet YIP5AGScLysH, som er fremstillet ved insertion i integrationsplasmidet YIP5 30 af den samme humane lysozym-ekspressionskassette, som blev anvendt ved konstruk tionen af plasmidet pAB24AGScLysH, der er vist i fig. 2, fig. 9 et flow-sheet for en særlig udførelsesform for opfindelsen, hvor det udskilte lysozym udvindes ved ekstraktion fra det flydende medium, og fig. 10 et flow-sheet for en anden udførelsesform for opfindelsen, hvor lysozymffemstillingen 35 udføres under sådanne betingelser, at den udskilte del af enzymet forbliver tilknyttet gærcellernes vægge.

I DK 175315 B1

I 6 I

I Som tidligere nævnt blev gensplejsede gærceller første gang i stand til at producere og udskille I

I enzymatisk aktivt lysozym med kyllingelysozym som modelforbindelse. Nærmere bestemt I

I besrives i eksempel 2.2 i BE 901.223 transformationen af en Ieu2-stamme af Saccharomyces I

I serevisiae (GRF18) med et plasmid (plys50), som omfatter hele sekvensen af det endogene 2- I

I 5 mikrom .-plasmid, det defektive LEU2-gen fra plasmid pJDB219 (se J.D. Beggs. Nature, b. 275, . I

I s. 104, 1978) til selektion i gær, bakteriesekvenser til replikation og selektion i E. coli og en I

I ekspressionskassette, hvor et komplet kyllingelysozym-cDA-materiale er underlagt den trans- I

skriptionelle kontrol af gærpromotoren p415. I dette eksempel bekræftes ekspressionen og se- I

I kretionen af lysozym af både de homogeniserede cellers og det cellefrie kulturmediums evne til I

I 10 at lysere celler af Micrococcus lysodeikticus. Den samlede aktivitet er 162 enheder/ml, nemlig I

I 118 enheder i mediet og 44 enheder tilknyttet cellerne. I

I Samme resultat fås, når der anvendes et andet 2-microm.-baseret ekspressionsplasmid, hvor I

transskriptionen af kyllingelysozym-cDNA-materialet sikres i kraft af den stærke, konstitutive I

I 15 promotor i GAP-genet, som koder for glyceraldehydphosphatdehydrogenase. I det første forsøg I

I på at udtrykke humant lysozym blev den DNA-del i sidstnævnte konstruktion, som koder for I

I færdigt kyllingelysozym, erstattet med et syntetisk DNA-segment, der koder for færdigt humant I

I lysozym. Den anvendte i fig. 1 viste sekvens er primært dannet for at udnytte koder, som S. I

I cerevisiae foretrækker for at opnå ekspression på højt niveau af egne gener. Desuden anven- I

20 des tavse mutationer til indføring af unikke restriktionsenzymsæder til brug ved en eventuel I

I efterfølgende sekvensmanipulation. Ved anvendelse af denne konstruktion observeres ingen I

leu+-transformanter efter transformation på sædvanlig måde og selektion på medier uden leu- I

I cin, hvilket man ellers ville forvente. Tilsyneladende reduceres altså cellernes levedygtighed, I

I når humant lysozym aktivt syntetiseres i gær-protoplaster, muligvis på grund af interferens med I

I 25 syntesen af chitin, som er en normal bestanddel af gærcellevæggen (se E. Cabib & R. Roberts, I

I Ann. Rv. Biochem., b. 51 s. 763, 1982). I

I Imidlertid har det vist sig, at aktiv lysozymsyntese finder sted, tilsyneladende uden nogen * I

ødelæggende virkning på cellefysiologien, når transskriptionen af det samme humane lysozym- I

I 30 kodende DNA-segment underkastes en regulerbar promotors kontrol, forudsat at depressionen I

I heraf udføres under vækstbegrænsede betingelser. Når derimod lysozymsyntesen sker under I

I betingelser, som tillader vækst, forringes ikke kun biomasseproduktionen, men hvad værre er, I

I lysozymsyntesen begrænses så meget, at den ikke længere er af praktisk interesse. For I

I kyllingelysozym observeres ikke en tilsvarende afhængighed som for humant lysozym, hvis I

I 35 syntese afhænger af vækstbegrænsede betingelser. Og dette er overraskende i betragtning af I

I de to enzymers ensartethed med hensyn til enzymatiske egenskaber. I første omgang vil man I

I måske tilskrive denne forskel det faktum, at humant lysozym har en specifik aktivitet, som er I

I omkring 2,5 gange højere end den specifikke aktivitet for kyllingelysozym (se R.E. Canfield et al. I

DK 175315 B1 7 i "Lysozyme", red. E.F. Osserman, R.E. Canfield og S. Beychok, Academic Press, 1974, s. 63).

Når imidlertid den primære struktur af sidstnævnte ændres ved sædedirigeret mutagenisering, således at Glu-gruppen i position 4 erstattes med en Gly-gruppe som i kyllingelysozym, observeres den samme inhibering af lysozymsyntesen under vækstbetingelser, hvorimod den speci-5 fikke aktivitet af det muterede protein med M. lysodeikticus som substrat ikke er signifikant højere end aktiviteten af kyllingelysozym.

Det er altså i overensstemmelse hermed et vigtigt formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde, hvor vækst og lysozymsyntese følger efter hinanden i stedet for 10 at optræde samtidigt. Dette kan let opnås ved at anvende en represserbar gærpromotor ved transskriptionen af det DNA-segment, som koder for lysozym. Der kendes flere promotorer af denne type. Fx kan man anvende promotoren for det gen, der koder for sur phosphatase, jf.

EP 100,561. Som det fremgår af EP 213,593 hænger denne egenskab sammen med tilstedeværelsen, foran PH05-genet, af to aktiveringssekvenser, som kan anvendes til konstruktion af 15 regulerbare hybridpromotorer, fx ved fusion med promotoren for GAP-genet. Som beskrevet i EP 164,556 kan der konstrueres flere af disse hybridpromotorer ved kombination af forskellige gærpromotorer, navnlig stærke promotorer fra de gener, der koder for glycolytiske enzymer som GAP, og et regulerende område, der svarer til forskellige represserbare gener, fx GAL1, GAL10, PH05, SUC2, MAL6S, MAL6T, CYC1, ADH2 eller gener, som er under generel aminosyrekon-20 tral, fx HiS1, HiS3, HiS4, TRP5 eller LEU3. Fx represseres ADH2-genet af glucose, og det derepresseres i nærvær af en ikke-fermenterbar carbonkilde, fx ethanol. Ved at anvende sådanne regulerbare promotorer er det muligt ved omhyggelig kontrol af kulturmediets sammensætning at få lysozymekspressionen koblet til eller ffa, uafhængigt af væksten. Andre gærpromotorer, som reguleres ved en temperaturændring, kan også anvendes.

25

En anden vigtig egenskab ved opfindelsen er, som ovenfor nævnt, at lysozymet, som bliver udtrykt i gær, også udskilles derfra under vækstbegrænsede betingelser. Dette er også overraskende, når man tager i betragtning, at de fleste eksperimentelle rapporter, som for tiden er tilgængelige, påpeger, at proteinsekretionen i gær er korrelleret til cellevæksten (se R. Schekman, 30 TIBS, juli 1982, s. 243). Når gærcellerne derimod fastholdes i den stationære fase, stiger mængden af udskilt lysozym, som findes uden for plasmamembranen, på bekostning af den mængde, som findes intracellulært.

For at sikre sekretion af lysozym gennem plasmamembranen er det nødvendigt, som det vil 35 være bekendt for fagfolk, at det DNA-segment, som koder for lysozym, på passende måde udstyres med en leadersekvens, der koder for et signalpeptid, som tillader det translaterede protein at blive translokeret ind i det endoplasmatiske reticulums lumen, hvor det bliver til det færdige enzym. Denne leadersekvens kan være en hvilken som helst sekvens, der koder for et

I DK 175315 B1 I

I I

I hvilket som helst signalpeptid, homologt eller heterologt, som genkendes og spaltes korrekt af I

I gærens sekretionsmaskineri. Som allerede omtalt ovenfor får man en effektiv sekretion ved at I

I anvende den sekvens, der koder for signalpeptidet for kyllingelysozym, men der kan også I

I anvendes sekvenser, der koder for andre heterologe signalpeptider. På den anden side kan I

I 5 man også anvende homologe signalsekvenser. Fx består en effektiv og veldokumenteret sekre- I

I torisk ekspressionsmetode i at anvende leaderområdet for forstadierne til gærens parringsphe- I

I rormoners ("mating pheronmones") alpha- og a-faktorer (se fx EP 116,201 og EP123,289). I

I Det DNA-segment, som koder for lysozym, og som skal eksprimeres ved fremgangsmåden iføl- I

I 10 ge opfindelsen, kan have en hvilken som helst DNA-sekvens, der koder for humant lysozym, I

I dvs. for et protein med muramidaseaktivitet og stort set den samme aminosyresekvens som I

I nativt humant lysozym. Der kan være tale om et cDNA-materiale, som er fremkommet ved I

I revers transskription af mRNA fra det native humane gen. Alternativt kan det være et hvilket I

I som helst syntetisk DNA-segment, der koder for humant lysozym som defineret ovenfor. Det er I

I 15 en stor fordel ved den sidstnævnte metode, at nucleotidsekvensen i det således syntetiserede I

I DNA-segment kan udformes således, at den omfatter de koder, som anvendes hyppigst i gær, I

I for at forbedre translationseffektiviteten. I overensstemmelse med den ovennævnte definition I

I må altså et hvilket som helst DNA-segment, der koder for et protein, hvor nogle modifikationer af I

I praktiske årsager er foretaget, i forhold til nativt humant lysozym, fx forbedret termisk stabilitet I

I 20 og/eller specifik aktivitet, betragtes som værende en del af den foreliggende opfindelse. I

I For at få udtrykt og udskilt lysozym i henholdsvis fra gær må der konstrueres en ekspressions- I

I kassette omfattende de forskellige elementer, dvs. i retningen fra 5' til 3', den represserbare I

I promotor, DNA-sekvensen der koder for et passende signalpeptid, DNA-segmentet der koder . . I

I 25 for lysozym og, fortrinsvis, en transskriptionsterminator fra gær, hvilken kassette på passende I

I vis må indsættes i en ekspressionsvektor for gær. En mulighed består i at anvende et plasmid, I

I som kan replikere autonomt i gær og blive til et stort antal kopier, ligesom de plasmider der I

I anvendes som markør for det defektive LEU2-gen. Blandt foretrukne ekspressionsplasmider I

I kan nævnes sådanne, som er afledt af gærens endogene 2-microm.-plasmid, især sådanne I

I 30 som omfatter hele sekvensen af dette. I dette tilfælde er det muligt ved transformationen at I

I anvende cir°-stammer af gær, dvs. stammer som er befriet for deres 2-microm.-plasmid. De I

I således opnåede transformanter indeholder kun det chimære plasmid, som er konstrueret med I

I lysozymgenet. Antallet af kopier heraf er derfor maksimeret, og man får minimeret plasmid- I

I ustabiliteten, som skyldes rekombinationsreaktioner. Ikke desto mindre foretrækkes det at I

I 35 integrere ekspressionskassetten i gærens genom for at få maksimal ekspressionsstabilitet. Ved I

I kloge kombinationer af diverse konstruktionselementer, hvoraf mange allerede tilhører den I

I kendte teknik, kan man således anvise et stort antal ekspressionssystemer. I

DK 175315 B1 9

Den gær, som kan anvendes ved udøvelse af opfindelsen, vil fortrinsvis være af genus Saccha-romyces cerevisiae, dvs. bagegær. En begrundelse herfor er, at dens biologiske egenskaber er relativt velkendte. En anden vigtig grund er, at S. cerevisiae typisk er en GRAS-mikroorganis-me (GRAS = generally recognized as safe), som er særligt velegnet, når man vil leve op til 5 "Good Industrial Large Scale Practice", som denne for nylig blev defineret af OECD (Organization for Economic Cooperation and Development). Imidlertid kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen også med fordel udøves ved anvendelse af andre arter af gær, fx Kluyver-omyces lactis, Pichia pastoris. Saccharomycopsis lipolytica, Schwannomyces alluvius, Schizo-saccharomyces pombe m.fi.

10 Når et DNA-segment, som koder for humant lysozym, underkastes en represserbar promotors kontrol, som beskrevet ovenfor, vil fagfolk vide, at det er muligt at dyrke værtsorganismen, så man undgår at få syntetiseret enzymet. For at opnå dette må man fastholde sådanne vækstbetingelser, at promotoren forbliver represseret. Hvis man fx anvender PH05-promotoren, må 15 man føre kontrol med mængden af uorganisk phosphat i kulturmediet, så der er en tilstrækkelig stor mængde til stede, fx ved kontrolleret tilsætning af uorganisk phosphat til mediet, indtil den ønskede cellekoncentration er opnået. Ved herefter at afbryde tilsætningen, forudsat at de andre næringsstoffer ikke forefindes i begrænsende mængde, vil koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet falde som resultat af den fortsatte vækst, således at den når en værdi, der er 20 lav nok til at inducere lysozymsyntesen, men som ikke kan sikre aktiv vækst.

Hvis man på lignende måde anvender en promotor, som er represseret af glucose og derepres-seres af ethanol, fx ADH2-promotoren, må koncentrationen af glucose fastholdes på et niveau, som er højt nok til at sikre væksten, men ikke lysozymsyntesen. Ved anvendelse af disse 25 betingelser får man produktion af ethanol som konsekvens af den såkaldte Crabtree-effekt (se fx O. Kåppeli et al., CRC Critical Reviews in Biotechnology, b. 4, nr. 3, s. 299,1986). Ved herefter at afbryde glucosetilledningen vil lysozymsyntesen finde sted på bekostning af det således dannede ethanol. 1 2 3 4 5 6 -- ------ - -- — -----—— I en foretrukket udførelsesform for opfindelsen foretages dyrkningen af gæren og lysozympro- 2 duktionen som separate operationer. Fremvæksten af gæren i fravær af lysozymsyntese sker i 3 et første medium, indtil en ønsket celletæthed nås. Så overføres cellerne til et medium, som er 4 udvalgt til at opnå lysozymsyntese, men kun begrænset vækst. Den største fordel ved denne 5 fremgangsmåde er, at der uafhængigt af hinanden kan anvendes optimale betingelser for begge 6 operationer. Disse operationer kan udføres batchvis, semi-kontinuert som i fed-batch-operatio-ner eller helt kontinuert.

I DK 175315 B1 I

I 10 I

I Fig. 9 viser mere detaljeret en særlig udførelsesform for opfindelsen. Gæren dyrkes i en fer- I

I menteringstank 1, hvortil ledes luft 2 og passende næringsstoffer 3. Disse næringsstoffer må I

I tilledes i tilstrækkelig mængde til at sikre aktiv vækst og represseret lysozymsyntese,, jf. I

I ovenfor. Næringsstofferne omfatter en carbonkilde. som kan være ren glucose eller saccharose I

5 eller industrielle affaldsvæsker, fx melasse. De andre for væksten nødvendige næringsstoffer I

I kan forekomme i form af uorganiske salte, fx (NH^SC^ og KH2PO4, der eventuelt kan supple- I

I res med vækstfaktorer som aminosyrer, vitaminer og metalsalte, som almindeligvis bruges ved I

I produktion af bagegær. Alternativt kan de tilvejebringes i form af mere komplekse naturlige pro- I

dukter som gærekstrakt, pepton, maltekstrakt o.l. I

I 10 I

I Dyrkningen af gæren vil blive fortsat, indtil den højest muligt cellekoncentration, der er forenelig I

med normal procesoperation, opnås. I de fleste tilfælde vil den opnåede gærkoncentration i I

tank 1 være mellem 0,5 og 10% af tør vægt, navnlig mellem 3 og 6%. Under 0,5% bliver de I

I volumener, der skal håndteres, ude af proportion med mængden af nyttige produkter, der skal I

I 15 udvindes, og over 10% opstår der praktiske problemer, fx på grund af en høj viskositet for cel- I

I leopslæmningen. I

I Den i tank 1 producerede biomasse sendes gennem et rør 4 til en centrifuge 5, hvor den opkon- I

I centreres. Det klare medium recirkuleres i det mindste delvis til tank 1 via et rør 6, idet det I

I 20 resterende medium ledes til kloak. Den koncentrerede opslæmning af celler overføres gennem I

et rør 7 ti en tank 8. En del af denne opslæmning kan også recirkuleres til tank 1 gennem et rør I

I 9; dette er især interessant ved kontinuert drift til opnåelse af en høj celletæthed og en høj I

biomasseproduktion. I

25 I tank 8 tilledes næringsstoffer via et rør 10 og luft via et rør 11. Betingelserne i denne tank vil I

være således, at lysozymekspressionssystemet fuldstændig derepresseres, og derfor afhænger I

betingelserne af den udvalgte promotor til kontrol af gentransskriptionen. Af de ovenfor nævnte I

grunde er det også vigtigt, at disse betingelser justeres, således at væksten begrænses, fx ved I

at begrænse koncentrationen af nogle faktorer, som er nødvendige for væksten, men ikke for I

I 30 proteinsyntesen. I

I Opslæmningen af lysozymproducerende gærceller ledes fra tank 8 gennem et rør 12. Cellerne I

skilles fra mediet i en centrifuge 13, og mediet recirkuleres i det mindste delvis til en tank 8 via I

I et rør 14 efter lysozymekstraktion i en ekstraktionsenhed 15. Denne sidste operation kan let I

I 35 foretages ved adsorption på en ionbytter eller ved anvendelse af materialer med affinitet, hvorfra I

I enzymet let kan udvindes ved eluering med fx vandig NaCI fra et rør 16. Eluatet sendes heref- I

ter via et rør 17 til en oprensningsenhed 18, hvor det underkastes en behandling, der eventuelt I

DK 175315 B1 11 er en kombination af andre klassiske oprensningsmetoder som ultrafiltrering, krystallisering o.l.

Til slut kan man få et tørt, salgsklart produkt ved frysetørring eller spraytørring (ikke vist).

Ved udøvelsen af opfindelsen kan det være en fordel, i det mindste af to grunde, i tank 8 at an-5 vende betingelser, som gør, at en større del af det lysozym, som udskilles fra gærcellerne, forbliver tilknyttet cellevæggen. Den første grund er, at det celleassocierede lysozym er beskyt* tet mod deaktivering, som lidt efter lidt finder sted, når enzymet frigives til mediet. Den anden grund er, jf. BE 903,626, at en væsentlig del af det celleassocierede lysozym kan udvindes på koncentreret form ved en simpel vaskeprocedure med en vandig opløsning af et uorganisk salt.

10 I fig. 10 er vist en udførelsesfomn for fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvor sådanne betingelser er anvendt i tank 8. Gæropslæmningen trækkes fra tank 8 gennem røret 12. I centrifugen 13 skilles cellerne fra mediet, som i det mindste delvis recirkuleres til tank 8 via røret 14, idet det resterende medium ledes til kloak. Cellerne fra centrifugen 13 bringes i et rør 19 i kontakt med en vandig opløsning af et uorganisk salt fra et rør 20, hvorved det lysozym, som er 15 knyttet til cellevæggen, frigøres herfra. Dette salt må være vandopløseligt, relativt neutralt og fortrinsvis ikke-toksisk for gærcellerne. Som eksempler kan nævnes: NaCI, KCI, ΝβΝΟβ, KNO3, Na2S04< (NH4)2SC>4 o.l. Af økonomiske årsager vil NaCI sædvanligvis blive foretrukket. Koncentrationen heraf til opnåelse af effektiv udvinding af det celleassocierede lysozym er ikke kritisk; den kan fx variere mellem 0,2 og 2,0 Μ. I praksis kan man med fordel anvende en 20 NaCI-koncentration på mellem 0,5 og 1,0 M. Koncentrationer under 0,5 M resulterer sædvanligvis i en dårligere udvinding, hvor en stor del af det dannede lysozym tabes med de resterende celler. På den anden side set vil koncentrationer over 1,0 M i almindelighed ikke medføre nogen forbedringer. Det således frigjorte lysozym skilles så fra de resterende celler i en centrifuge 24 og kan yderligere oprenses i en enhed 18 på samme måde som ovenfor. Gærcelle-25 væggen i sig selv kan altså virke som og udnyttes som et adsorberende materiale ved udvinding af enzymet.

For at anvende denne sidstnævnte metode er det vigtigt at begrænse koncentrationen af uorganiske salte i tank 8. Hvis det omvendt foretrækkes at udvinde den største del af enzymet fra 30 mediet ved ekstraktion i enheden 15, som beskrevet ved omtalen af den første udførelsesform, er det bedre at forøge koncentrationen af uorganiske salte i tank 8. Ttl dette formål kan der anvendes de samme salte i samme koncentrationsområde som beskrevet ovenfor ved udvinding af det celleassocierede lysozym. Som det vil fremgå af de følgende eksempler, kan tilstedeværelsen af salt i høj koncentration være ødelæggende for gærens vækst, men ikke for 35 gærens produktion af lysozym under vækstbegrænsede betingelser. Det er derfor en yderligere fordel ved den foreliggende totrinsfremgangsmåde, at der tilvejebringes en fremgangsmåde til dyrkning af gær under betingelser, som er optimale for biomasseproduktion, og at der efterføl-

I DK 175315 B1 I

I 12 I

I gende induceres en syntese af lysozym under betingelser, som sikrer optimal udskillelse af I

I enzymet til mediet. I

I Oe resterende gærceller, hvad enten disse stammer fra den ene eller anden fremgangsmåde, I

I 5 kan udvindes og anvendes som sådan, eventuelt efter yderligere presning, tørring eller lignende I

I behandling. De resterende celler kan også delvis recirkuleres til tank 8 til yderligere lysozym- I

I produktion, eller de kan recirkuleres til fermentoren 1 som en kilde til næringsstoffer og vækst- I

I faktorer, eventuelt efter passende iturivning. I

I 10 Opfindelsen skal i det følgende forklares nærmere ved hjælp af nogle eksempler. I

I EKSEMPLER I

I 1. Plasmid-medieret ekspression af (1) humant lysozym, (2) en gly-4-mutant af hu- I

I 15 mant lysozym og (3) kyllingelysozym i gær ved anvendelse af kyllingelysozymsig- I

I nalsekvensen til sekretionen I

I 1.1 Konstruktion af ekspressionsvektoreme I

1.1.1 Humant lysozym I

I 20 Der syntetiseres oligonucleotider svarende til sekvensen af genet for humant lysozym med I

I koder, som foretrækkes af gær, ved anvendelse af phosphoramidkemi på en DNA-syntetisator I

I af mærket Applied Biosystems. De enkelte oligonucleotider udformes ved anvendelse af et I

I computerprogram, der maksimerer overlap og minimerer forkert annealing (forening eller nude- I

I insyrehybridisering). Alle molekylerne bærer phosphat i 5'-enden, undtagen i den 5'-terminale I

I 25 ende. Hele genet forenes og sammenligeres, og det samlede ligeringsprodukt (se fig. 1) isole- I

res fra en agarosegel. Herefter phosphoryleres det i den 5'-terminale ende med T4-polynucleo- I

I tidkinase og ligeres ind i plasmidet pAGAPI, som er behandlet med Ncol og Sall og alkalisk I

I phosphatase. pAGAPI er et derivat af pPGAP (se J. Travis et al., J. Biol. Chem., b. 260, s. I

I 4384, 1985), hvor GAP-promotoren (promotor for glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasege- I

I 30 net, 491) er erstattet med den hybride promotor ADH2-GAP (se L.S. Cousens et al.. Gene, b. I

61, s. 265, 1987). Lysozymgenet underkastes herefter en dideoxysekvensanalyse, og den I

I dannede sekvens verificeres. Ekspressionskassetten bestående af ADH2-GAP-promotoren, I

kyllingelysozymsignalsekvensen, det humane lysozymgen og GAP-terminatoren bortskæres I

I med BAMH1 og indsættes i gær-E.coli-shuttlevektoren pAB24 (se P.J. Barr et al., J. Exp. Med., I

I 35 b. 165, s. 1160,1987). Det resulterende plasmid, pAB24AGScLysH, er vist i fig. 2. I

DK 175315 B1 13 1.1.2 Gly-4-fTuitanten af humant lysozym

Med henblik på at få det analoge plasmid i det humane lysozymgen til at indeholde en glu-4-til-gly-4-mutation anvendes standardmetoder til syntese af en del af genet fra Spel-sædet i kyllin-5 gesignalsekvensen til Nhei-sædet i det humane gen, hvor koden i position 4 i det færdige protein ændres fra GAA (glutaminsyre) til GGA (glycin). Ved rekonstruktion af ekspressionsvektoren fås plasmidet pAB24AGScLysHGIy4, som er vist i fig. 4.

1.1.3 Kyllingelysozym 10 På tilsvarende måde kan man fremstille et plasmid med kyllingelysozymgenet, ledet af ADH2-GAP-promotoren. Dette plasmid, pAB24AGScLysC, er vist i fig. 5.

1.2 Ekspression og sekretion af lysozymer i gær 15

Disse tre plasmider transformeres ind i S. cerevisiae, stamme GRF180, et derivat af GRF18 (E.

Erhart & C.P. Hollenberg, J. Bact.. b. 156, s. 625,1983), hvorfra den endogene 2-microm.-cirkel er fjernet, og der selekteres for leucinprototrophe. Transformanterne dyrkes i et minimalmedium uden leucin med 8% glucose i 2 døgn ved 28°C. De anvendes herefter til inokulering af et 20 komplekst medium (YEP: 1% gærekstrakt + 2% pepton) med 8% glucose i forholdet 1:150, og kulturerne ryster med 180 rpm ved 28°C. Efter 5 døgn udtages repræsentative prøver på 10 ml, de centrifugeres ved 2500 x g i 10 minutter, og lysozymaktiviteten i kultursupernatanten (S-fraktionen) bestemmes. Der analyseres som beskrevet af D. Shugar (se Biochim. Biophys.

Acta, b. 8, s. 302, 1952) ved anvendelse af Micrococcus lysodeikticus som substrat. En aktivi-25 tetsenhed defineres som den mængde enzym, der leder til et fald i absorbansen ved 450 nm på 0,001/min. ved anvendelse af en opslæmning af M. lysodeikticus i 66 mM kaliumphosphat, pH 6,24, ved 25*C i en reaktionsblanding på 1 ml.

Celler af transformanterne opslæmmes i 1 ml 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH 6,5, med 0,5 M 30 NaCI og inkuberes i 5 minutter ved 4°C. Cellerne fjernes ved centrifugering, og lysozymaktiviteten i saltvaskevandet (fraktion S-j) bestemmes. For at bestemme mængden af intracellulær lysozym omrystes celle-pellets i 5 minutter med glaskugler i 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH 6,5, med 0,5 M NaCI og 0,05% Triton X-100 i en Braun-homogenisator. Efter separation af cellestykkerne ved centrifugering ved 12.500 x g bestemmes lysozymaktiviteten i den opløselige 35 intracellulære fraktion (fraktion S2). De opnåede resultater er vist i tabel 1.

I DK 175315 B1 I 14 I TABEL 1 I Ekspression af diverse lysozymgener I ved anvendelse af den regulerede ADH2-GAP-promotor I 5 I Lysozym Medium . OD Lysozymaktivitet: (U/ml) Plasmid- I SD SA S2 Total u/OD stabilitet (%) I 10 I Human Glucose 29 48 2854 9660 12562 433 97 I Ethanol 16 0 114 82 196 12 11 I Human Glucose 32 0 731 4616 5347 167 90 I Gly-4 Ethanol 17 0 46 12 58 3 39 15 I Kyl- Glucose 34 452 1400 3930 5782 170 97 linge Ethanol 18 208 270 1070 1548 86 95 20 Den totale lysozymaktivitet er 433 U/OD (aktivitetsenheder pr. enhed for optisk densitet) for hu- mant lysozym, 167 U/OD for mutanten af humant lysozym og 170 U/OD for kyllingelysozym ved I fremvækst i glucoseholdigt medium. I alle tre tilfælde udskilles mellem 14 og 32% af den totale aktivitet; den findes i mediet (S0) og/eller tilknyttet cellerne, hvorfra den kan frigives uden at I ødelægge cellerne ved en NaCI-vask (S-j), idet denne sidste aktivitet svarer til den fraktion af I 25 lysozymet, som udskilles men stadig er adsorberet til gærcellernes vægge.

I 1.3 Isolering, oprensning og karakterisering af de udskilte lysozymer

Med henblik på oprensning af de gær-afledede rekombinante lysozymer dyrkes kulturer af de tre 30 plasmidtransformanter af stammen GRF180 i 5 døgn i YEP-mediet med 8% glucose, se oven- I for. Cellerne opkoncentreres ved centrifugering i 15 minutter ved 2500 x g, og herefter genop- slæmmes de i samme volumen 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH 6,5, med 0,5 M NaCI. Efter 60 minutters inkubering ved 4°C opsamles supematanten ved centrifugering, fortyndes 10 gange I med 0,1 M natriumphosphatbuffer, pH 6,5, og påsættes en fast-flow-søjle fra Pharmacia med 35 CM-Sepharose. De lysozymholdige fraktioner, se ovenfor, pooles, opkoncentreres ved ultrafil- I trering på en Amicon Diaflow membran, afsaltes på en søjle af mærket Sephadex G-25 og frysetørres.

DK 175315 B1 15

Lysozymproparaternes specifikke aktivitet bestemmes ved først at bestemme lysozymaktiviteten som beskrevet ovenfor og dernæst at bestemme promotorkoncentrationen ved anvendelse af Biorads promotorassay med kyllingelysozym som standard De opnåede resultater er vist i tabel 2.

5 TABEL 2

De oprensede lysozympræparaters specifikke aktivitet 10

Lysozym Oprindelse Specifik aktivitet _ ________________ (enheder pr mikrog. protein)__

Humant ftelk 756 Gær 727 15 Human Gly-4 Gær 281

Ky Hinge- Æggehvide 263 Gær 302 20 På basis af de i tabel 1 angivne værdier er den totale syntetiserede mængde af de tre lysozymer i glucosemediet 17, 19 og 19 mg/l for henholdsvis humant lysozym, mutanten af det humane lysozym og kyllingelysozym. Ved SDS-polyacrylamid-gelanalyse ser man, at alle tre prøver vandrer som enkelte bånd med samme mobilitet som de tilsvarende kontrolprøver, nemlig humant mælkelysozym for de humane proteiner og æggehvidelysozym for kytlingeenzymet. Alle 25 tre proteiner har en enkelt N-terminal lysingruppe, hvilket konstateres ved en automatisk Ed-man-nedbrydning, og yderligere sekvensanalyse giver de sekvenser, som man kunne forvente ud fra DNA-sekvenserne. Kyllingesignalsekvensen processes altså korrekt fra alle tre proteiner.

Sammenligningseksempel 1 30

Dyrkningsproceduren fra eksempel 1.2 gentages for alle tre proteiner, dog anvendes 1 % ethanol som carbonkilde i stedet for 8% glucose. I dette medium sker cellevækst og lysozymsyntese samtidigt. Når lysozymaktiviteten i de tre kulturer bestemmes, får man de i tabel 1 viste resultater. Både for det humane og for mutanten af det humane protein forårsager vækst i ethanol et 35 drastisk fald i lysozym produktionen til under 5% af niveauet ved vækst i 8% glucose. I modsætning hertil falder kyllingelysozymekspressionen kun til 50% af niveauet ved dyrkning i 8% glucose.

I DK 175315 B1 I

I 16 I

I Disse resultater viser klart, at man for at opnå syntese i gær af humant lysozym (det autentiske I

I eller en mutant deraf, ikke kytlinge-), som er aktivt nok til at være af praktisk interesse, må I

I arbejde under omstændigheder, hvor, i overensstemmelse med opfindelsen, væksten ikke fore- I

I går samtidigt. I

I 5 . I

I Flere forsøg er foretaget for at vurdere plasmidstabiliteten under de i ovennævnte eksempler I

I anvendte dyrkningsbetingelser. Disse forsøg består i, at man i petriskåle bestemmer den I

I fraktion af gærcellerne, som stadig udviser leucinprototrophi ved afslutningen af eksperimentet, I

I dvs. de celler som har bevaret lysozymekspressionsplasmidet. Disse resultater er også vist i I

I 10 tabel 1. De viser, at i tilfældet med humant lysozym (autentisk eller en mutant deraf, ikke I

I kyllinge-) har celler, som er dyrket i nærvær af ethanol, stort set tabt plasmidet. Det virker altså, I

I som om væksten er så svækket af syntesen af humant lysozym, at celler, som har tabt plasmi- I

I det som resultat af mitotisk segregering, hurtigt kommer til at dominere over de stadig plasmid- I

I bærende celler. I

I 15 I

I Sammenligningseksempel 2 I

I Ved anvendelse af standardmetoder indsættes de tre lysozymgener, hvis ekspression i gær er I

I vist i eksempel 1, i ekspressionskassetter ved anvendelse af den stærke, konstitutive GAP- I

I 20 promotor. Kyllingelysozymkonstruktionen er vist i fig. 6; plasmiderne med humant lysozym og I

I med mutanten heraf er ens, bortset fra lysozymgenerne. Når disse plasmider transformeres I

I over i stammen GRF180 og der selekteres for leucinprototrophe, fås ingen transformanter med I

I plasmiderne for humant lysozym og for mutanten heraf, hvorimod der let fås transformanter med I

I kyllingelysozymekspressionsplasmidet. Disse transformanter dyrkes som beskrevet i eksempel I

I 25 1, og iysozymaktiviteten bestemmes. Den samle kyllingelysozymaktivitet er 110 U/OD sam- I

I menlignet med 173 U/OD for det regulerede ekspressionsplasmid, som bærer ADH2-GAP- I

I promotoren. I

I Dette bekræfter den konklusion, som blev draget fra sammenligningseksempel 1, at syntesen af I

I 30 humant lysozym er ødelæggende for voksende gærceller. For at være sikker på at denne I

I virkning ikke kun gælder den særlige gærstamme, som blev anvendt ved de ovennævnte for- I

I søg, gentages transformationsproceduren fra dette sammenligningseksempel med stammen I

I AH22 (A. Hinnen et a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, b. 75, s. 1929, 1978), stammen S150-2B (C. I

I Hadfield et al., Gene, b. 52, s. 59,1987), stammen Y-294 (G.S. Brugge et al., Mol. Cell. Biol., b. I

I 35 7, s. 2180, 1987) og stammen MC16 cire (A.B. Futcher & B.S. Cox, J. Bact., b. 157, s. 283, I

I 1984). Der opnås stort set de samme resultater som med stammen GRF180. I

DK 175315 B1 17 2. Plasmid-medieret ekspression af humant lysozym i gær ved anvendelse af alpha· faktor-leader til sekretion 2.1 Konstruktion af ekspressionsvektoren 5 Plasmid pAB24AGalphaFLysH (se fig. 7) fremstilles ved at isolere NheJ-BamH1 -fragmentet med det meste af det humane lysozym uden kyllingesignalsekvensen og GAP-terminatoren fra plasmid pAB24AGScLysH (fig. 2).. En syntetisk Xba-Nhe-adaptor anvendes til at linke dette fragment til et BamH1-Xba-fragment med ADH2-GAP-promotoren sammensmeltet med alpha-faktor-leaderen (se A.J. Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, b. 81, s. 4642,1984). Den re-10 suiterende BamHI-ekspressionskassette bestående af promotor, alpha-faktor-leader, genet for humant lysozym og terminator indsættes i plasmid pAB24, hvorved man får pAB24AGalphaFLysH, som er vist i fig. 7.

2.2 Ekspression og sekretion af humant lysozym 15

Dette plasmid transformeres over i gærstammen GRF180, et cir°-derivat af GRF18, og der selekteres for leucinprototrophe. Transformanter dyrkes i et leucinselektivt medium med 8% glucose i 2 døgn og fortyndes herefter 1 -.20 over i YEP-mediet med 2% glucose. Efter 3 døgns vækst ved 30“C høstes cellerne, og lysozymaktiviteten bestemmes som beskrevet ovenfor.

20 Resultaterne er vist i tabel 3.

TABEL 3

Ekspression og sekretion af humant lysozym 25 ved anvendelse af alpha-faktor-leader

Plasmid Medium Lysozymaktivitet (U/ml) SQ + S2 Total 30 ρΛΒ24 YEP+2% glucose 000 PAB24AGalphaFLysH YEP+2% glucose 114 136 250

Det fremgår tydeligt, at lysozym eksprimeres og sekreteres af alpha-faktor-leader-lysozym-35 fusionskonstruktionen, skønt niveauerne er lavere end med kyllingesignalet.

I DK 175315 B1 I

I 18 I

I 3. Integration-medieret ekspression af humant ly sory m i gær I

I 3.1 Konstruktion af integrationsvektoren I

I Ekspressionskassetten for humant lysozym, hvis konstruktion er beskrevet i eksempel 1.1, bort- I

I 5 skæres fra plasmid pAB24AGScLysH (se fig. 2) ved nedbrydning med restriktionsenzymet I

I BamH1 og indsættes i integrationsplasmidet YIP5 (se K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. I

I USA, b. 76, s. 1035, 1979), hvorved man får plasmidet YIP5AGSCLysH, som er vist i fig. 8. I

I 3.2 Ekspression og sekretion af humant lysozym I

I 10 I

I Dette plasmid lineariseres med Sac2 i GAP-terminatoren og transformeres herefter over i I

I stammen GRF181, et ura3-deletionsderivat af GRF180. Uracilprototrophe selekteres på uracil- I

I selektive plader med 8% glucose. Transformanter dyrkes herefter i et uracilselektivt medium I

med 8% glucose og fortyndes 1:20 over i YEP-mediet med 8% glucose til ekspression. Efter 5 I

I 15 døgn høstes kulturerne, og lysozymaktiviteten bestemmes som beskrevet ovenfor. Resulta- I

I terne er vist i tabel 4. Lysozymaktiviteten er tydeligvis til stede i disse integranter, men niveau- I

I erne er lavere end for den plasmid-medierede ekspression under samme betingelser. I

I TABEL 4 I

I 20 I

I Ekspression af humant lysozym fra GRF 181-integranter I

I Integrant nr 123456 I

I OD 23 23 21 22 21 22 I

I Lysozymaktivitet I

I so + S1 (u/ml) 501 282 207 139 174 1397 I

I s2 (U/ml) 224 128 64 73 374 59 I

I Total 825 410 271 211 548 1456 I

I U/OD 36 18 13 10 26 66 I

DK 175315 B1 19 4. Natriumchlorids indflydelse på fordelingen af G ly-4-mutanter af humant lysozym i kulturer af transformeret gær Gærstammen GRF180, som er transformeret med plasmidet pAB24AGScLysHGIy4 {se fig. 4) 5 dyrkes i minimalmedium uden leucin og med 8% glucose i 3 døgn ved 28“C. Den resulterende kultur bruges så til inokulering i forholdet 1:50 af et komplekst YEP-medium med 8% glucose.

Der anvendes samme fremgangsmåde til bestemmelse af lysozym som i eksempel 1 på de kulturer, som opnås efter 89 og 209 timers inkubation ved 28eC. For at bestemme virkningen af uorganiske satte på fordelingen af lysozym suppleres en repræsentativ del af kulturen med NaCI 10 til en koncentration på 0,5 M efter 89 timer, og inkubationen fortsætter som med kontrolkulturen.

I et andet forsøg med samme inokulum er NaCI i koncentrationen 0,5 M til stede fra begndelsen.

De opnåede resultter er vist i tabel 5.

TABEL 5 15

NaCI’s indflydelse på sekretion af Gly-4-mutanten af humant lysozym fra transformeret gær 20

Inkubations- NaCI OD Lysozymaktivitet Lv sozymf ordel inq ( tid (timer) (0.5 M) U/ml U/OD SQ Sl S2 89 - 33 3625 110 0 11 89 209 - 33 3946 120 2 30 68 209 + 27 3436 127 52 3 45 25 89 + . 21 1562 74 29 1 70 209 + . 22 1542 70 67 2 31

De i tabel 5 viste værdier viser, at det meste lysozym i det konventionelle YEP-medium findes 30 intracellulært (Sj-fraktionen), og i desto højere grad, jo kortere inkubationstiden er. I modsætning hertil findes lysozym, når NaCI tilsættes systemet, hovedsagelig i SD- og S-|-fraktionen, dvs. overvejende udskilt. Stort set den samme fordeling af lysozym ses. når NaCI er til stede fra starten; i dette tilfælde er væksten dog noget hæmmet. 1

Samme type resultat fås, når der anvendes gærceller, som er transformeret til at producere autentisk humant lysozym.

I DK 175315 B1 I

I 20 I

5. Indflydelse af et syntetisk kulturmedium for gær på syntese og sekretion af I

I humant lysozym I

I Gærstammen GRF180, som er transformeret med plasmid pAB24AGScLysH (se fig. 2) dyrkes i I

I 5 minimalmedium uden leucin og med 8% glucose. Efter 48 timer ved 28°C høstes cellerne ved I

I centrifugering og genopslæmmes i det samme volumen af et syntetisk medium, hvis sammen* I

sætning er angivet i tabel 6. I

TABEL 6 21 DK 175315 B1

Syntetisk medium til syntese og ekskretion af humant lysozym KH2PO4 6 g

MgS04.7H20 3 6

CaCl2.2H20 0.1 g

NaCl 0.1 g (NH4)2SO4 ^0 g

Caseinhydrolysat 20 g

Vitamin mix. 10 ml

Biotin 0.002 %

Folsyre 0.002 %

Kalciumpantothenat o 4 %

Nikotinsyre 0.4 %

Pyridoxin HCl 0.4 %

Thiamin - HCl 0.4 % p-aminobenzoesyre 0.2 l j

Riboflavin 0.2 %

Myoinositol 2.0 %

Sporelementopløsning 10 ml

MnSO^ 0.4 %

ZnSO^ 0.4 %

FeCl2 0.2 %

Natriummolybdat 0.2 %

Borsyre 0.5%

Kobbersulfat 0.04 %

Kl 0.1 %

Supplerende nucleotider og aminosyrer 40 ml

Adenin 1 %

Urldin 1 %

Tryptophan 1 %

Mcthionin 1 %

Cystcin 1 %

Threonin· 1 %

Hiscidin 0.05 % vand . ad 1 liter

I DK 175315 B1 I

I 22 I

I Af sammenligningsgrunde genopslæmmes en repræsentativ del af cellerne i frisk YEP-medium. I

I Begge medier suppleres med 8% glucose. De resulterende opslæmninger inkuberes yderligere I

I ved 28°C i 90 timer, og lysozymfordelingen i kulturerne bestemmes som beskrevet i eksempel I

I 1. De opnåede resultater er vist i tabel 7. I

I 5 I

I TABEL 7 I

I Mediets indflydelse på syntesen og sekretionen I

af humant lysozym fra transformerede gærceller I

I io ----------------------------------------------------------------- I

I Medium OD Lysozymaktivitet Lysozymfordelinq (*) I

(+8% glucose) U/ml U/OD SQ Sj S2 I

I Syntetisk 59 10992 186 68 5 27 I

Komplekst (YEP) 56 6542 117 4 19 77 I

I 15 I

I Tallene i tabel 7 bekræfter tallene fra det foregående eksempel i den konklusion, at YEP-mediet, I

I skønt det er gunstigt for væksten, ikke fremmer en kraftig udskillelse: omkring 3/4 af det dan- I

I nede lysozym forbliver intracellulært. I modsætning hertil udskilles i det anvendte syntetiske I

I medium omkring 3/4 af lysozymet, hvoraf 93% frigives til opløsningen, dvs. på en form som let I

I 20 kan udvindes på konventionel måde, fx ved ultrafiltrering. I

I Imidlertid har andre forsøg vist, at dette syntetiske medium ikke særlig godt sikrer aktiv vækst. I

I Det virker altså igen, som om det er vigtigt, som anvist i den foreliggende opfindelse, at adskille I

I biomasseproduktion og lysozymdannelse og separat vælge de betingelser i de to trin, hvor man I

I 25 fåroptimal produktion af humant lysozym. I

Claims (18)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af enzymatsk aktivt lysozym, kendetegnet ved at omfatte følgende trin: 5 at man bringer voksende gærceller, hvis DNA er genetisk modificeret, i kontakt med et kulturmedium under vækstbegrænsede betingelser, og at man inducerer disse gærceller til at syntetisere og udskille enzymatisk aktivt lysozym.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det lysozym, som produceres og 10 udskilles af gærcellerne, er toksisk for dem.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det lysozym, som produceres og udskilles af gærcellerne, er humant lysozym eller mutanter heraf.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at induktionen af lysozymsyntesen sikres med en regulerbar promotor, især en represserbar promotor, hvor lysozymsyntesen induceres ved at derepressere promotoren, navnlig en promotor fra gruppen omfattende PH05, ADH2, GAL1, GAL10, SUC2, MAL6S, MAL6T, CYC1, promotorer for gener, som er involveret i generel aminosyrekontrol, termosensitive promotorer og ud fra disse konstruerede hybridpromo-20 torer.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at promotoren udvælges fra gruppen omfattende PH05 og hybridpromotorer, som er konstrueret med foranliggende aktiverings-sekvenser herfor. 25

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at promotoren er ADH2-GAP-hy-brid promotoren.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en større del af lysozymet ud-30 skilles til kulturmediet.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at kulturmediet indeholder en mængde af et uorganisk salt, som medvirker til lysozymets frigivelse fra gærcellernes vægge og ud i kulturmediet, navnlig et vandopløseligt salt, som ikke er toksisk for gærcellerne, især et salt 35 udvalgt fra gruppen omfattende NaCI, KCI, NaN03, Na2S04, ganske særligt NaCI. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at koncentrationen af det uorganiske salt er 0,2-2 M, især 0,5-1 M. I DK 175315 B1 I I 24 I

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mindst 50% af det udskilte ly- I I sozym forbliver tilknyttet gærens cellevæg, idet da navnlig koncentrationen af uorganiske salte I er mindre end 0,2 Μ. I I 5 11. Fremgangsmåde til fremstilling af enzymatisk aktivt lysozym, kendetegnet vedat I I omfatte følgende trin: I I at man dyrker gærceller, hvis DNA er genetisk modificeret, i et kulturmedium, som represserer I I syntesen af enzymatisk aktivt lysozym, I I at man bringer de voksende gærceller i kontakt med et kulturmedium under vækstbegrænsede I I 10 betingelser, og at man inducerer disse gærceller til at syntetisere og udskille enzymatisk aktivt I lysozym. I

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at det lysozym, som produceres I og udskilles af gærcellerne, er toksisk for dem. I I 15 I

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det lysozym, som syntetiseres I I og udskilles af gærcellerne, er humant lysozym eller mutanter heraf. I

14. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at induktionen af lysozymsynte- I I 20 sen sikres med en regulerbar promotor, især en represserbar promotor, hvor lysozymsyntesen I I induceres ved at derepressere promotoren, navnlig en promotor udvalgt fra gruppen omfattende I I PH05, ADH2, GAL1, GAL10, SUC2, MAL6S, MAL6T, CYC1, promotorer for gener, der er invol- I I veret i generel aminosyrekontrol, termosensitive promotorer og hybridpromotorer, der er kon- I I strueret herudfra. I I 25 I

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at promotoren udvælges fra I I gruppen omfattende PH05 og de hybridpromotorer, som er konstrueret med de foranliggende I I aktiveringssekvenser herfor. I i I I 30 16. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at promotoren er ADH2-GAP- I I hybridpromotoren. I

17. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at mindst 50% af lysozymet I I udskilles til kulturmediet. I DK 175315 B1

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at kulturmediet indeholder en mængde af et uorganisk salt. som bevirker frigivelse af lysozymet fra gærcellernes vægge og ud i kulturmediet, navnlig et vandopløseligt salt, som ikke er toksisk for gærcellerne, især et uorganisk salt udvalgt fra gruppen omfattende NaCI, KCI, NaNC>3. Na2S04 og (NH^SO^ ganske 5 særligt NaCI.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at koncentrationen af det uorganiske salt er 0,2-2 M, navnlig 0,5-1 M.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at mindst 50% af det udskilte lysozym forbliver tilknyttet gærcellernes vægge, idet da navnlig koncentrationen af uorganiske salte er mindre end 0,2 M.

21. Syntetisk gen for humant lysozym, kendetegnet ved, at det er udvalgt fra gruppen 15 omfattende følgende sekvens AAGGTTTTCGAAAGATGTGAG TTCCAAAAGCTTTCTACACTC CTAGCTAGAACTTTGAAGAGATTGGGTATGGACGGTTACAGAGGTATCTCCTTGGCTAACTGGAT GATCGATCTTGAAACTTCTCTAACCCATACCTGCCAATGTCTCCATAGAGGAACCGATTGACCTA 20 GTGTTTGGCCAAGTGGGAATCTGGTTACAACACCAGAGCTACCAACTACAACGCTGGTGACAGAT CACAAACCGGTTCACCCTTAGACCAATGTTGTGGTCTCGATGGTTGATGTTGCGACCACTGTCTA CTACCGACTACGGTATCTTCCAAATCAACTCCAGATACTGGTGTAACGACGGTAAGACCCCAGGT 25 GATGGCTGATGCCATAGAAGGTTTAGTTGAGGTCTATGACCACATTGCTGCCATTCTGGGGTCCA GCTGTTAACGCTTGTCACTTGTCCTGTTCTGCTTTGTTGCAAGACAACATCGCTGACGCTGTCGC CGACAATTGCGAACAGTGAACAGGACAAGACGAAACAACGTTCTGTTGTAGCGACTGCGACAGCG 30 CTGTGCTAAGAGAGTTGTTAGAGACCCACAAGGTATCAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAACAGAT GACACGATTCTCTCAACAATCTCTGGGTGTTCCATAGTCTCGAACCCAACGAACCTCTTTGTCTA GTCAAAACAGAGACGTTAGACAATACGTCCAAGGTTGTGGTGTT CAGTTTTGTCTCTGCAATCTGTTATGCAGGTTCCAACACCACAA 35 og den mutant heraf, hvor koden i position 4 i det færdige protein er ændret fra GAA (glutaminsyre) til GGA (glycin). I DK 175315 B1 I I 26 I I 22. Gærcelle, kendetegnet ved, at den er genetisk modificeret, således at den er i I I stand til at udtrykke det syntetiske gen ifølge krav 21, idet det navnlig samtidig gælder, at 5'- I I enden af det syntetiske gen er sammensmeltet i fase med en leader-sekvens, der koder for et I I signal peptid, som genkendes og spaltes korrekt af gærens sekretionsmaskineri, navnlig signal- I I 5 peptidet for kyllingelysozym. I I 23. Gærcelle ifølge krav 22, kendetegnet ved. at ekspressionen af det syntetiske gen I I kontrolleres af en regulerbar promotor, især en represserbar promotor, hvor lysozymproduktio- I I nen kan induceres ved at derepressere promotoren, navnlig en promotor, som er udvalgt fra I I 10 gruppen omfattende PH05, ADH2, GAL1, GAL10, SUC2, MAL6S, MAL6T, CYC1, promotorer I I for gener, som er involveret i generel aminosyrekontrol. termosensitive promotorer og hybrid- I I promotorer, som er konstrueret herudfra. I I 24. Gærcelle ifølge krav 23, kendetegnet ved, at promotoren udvælges fra gruppen I I 15 omfattende PH05 og hybridpromotorer, som er konstrueret med dennes foranliggende aktive- I I ringssekvens. I I 25. Gærcelle ifølge krav 23, kendetegnet ved, at promotoren er ADH2-GAP-hybridpro- I I motoren. I I 20 I I 26. Gærcelle ifølge krav 22, kendetegnet ved, at værtsstammen tilhører genus Saccha- I I romyces cerevisiae, idet den navnlig udvælges fra gruppen omfattende stammerne GRF18, I I GRF180, AH22, MC16 cir“, S150-2B og Y-294. I