DK174905B1 - DNA-sekvens og fremgangsmåde til den fremstilling, gærhybridvektorer og Saccharomyces cerevisiae indeholdende sekvensen henholdsvis vektoren og fremgangsmåder til deres fremstilling samt deres anvendelse ved fremstilling af polypeptider - Google Patents

Description

i* i DK 174905 B1

Den foreliggende opfindelse angår DNA-fragmenter indeholdende promotorerne for generne for Saccharomyces cerevisiae sur phosphatase, gærhybridvektorer indeholdende disse promotorer, # som kan transformere Saccharomyces cerevisiae, samt Saccha- 5 romyces cerevisiae transformeret med disse gærhybridvektorer. Opfindelsen angår tillige fremgangsmåder til fremstilling af DNA-fragmenterne, gærhybridvektorerne samt Saccharomyces cerevisiae under anvendelse af rekombinant DNA teknologi.

Desuden angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling 10 af polypeptider, som er kodet ved hjælp af indsatte gendele i gærhybridvektorerne, og som er nyttige ved behandling af sygdomme hos mennesker og dyr.

Med udviklingen af rekombinant DNA teknologi er det blevet mu-15 ligt at foretage kontrolleret mikrobiologisk produktion af nyttige polypeptider, især farmakologisk interessante polypeptider. Størsteparten af den hidtil gennemførte forskning indenfor rekombinant DNA teknologien har været gennemført med prokaryote organismer. Som følge af udviklede fremgangsmåder 20 er det nu velkendt at indføre DNA, som koder for eukaryote proteiner, i disse organismer. Adskillige bakteriearter, især Escherichia coli stammer, som er blevet modificeret ved hjælp af denne nye teknologi, er nu tilgængelige og muliggør kommerciel fremstilling af polypeptider af meget stor betydning, så-25 som insulin, humant leukocyt- og fibroblast-interferon og humant væksthormon.

Til mange formål vil det i fremtiden imidlertid være ønskeligt eller nødvendigt at anvende eukaryote systemer ved den kommer-3° cielle fremstilling af proteiner, især farmakologisk vigtige v proteiner. Da gær hører til eukaryoterne, har de mange biolo giske processer tilfælles med andre eukaryoter, især med pattedyrceller. Da mange farmakologisk vigtige proteiner syntetiseres af pattedyrceller, kan slægtskabet mellem de to systemer 35 være fordelagtigt. Eksempelvis ligner sekretionsprocessen i gær sekretionsprocessen i celler hos højerestående dyr, og det er kendt, at gærceller er i stand til at spalte signalsekvenser (uladet N-terminal del af et protein, som sædvanligvis fraspal- DK 174905 B1 2 tes under den sekretoriske transport) (47). Glycosylerings-systemet er forbundet med sekretionsprocessen. De grundlæggende trin, som fører til glycosylerede proteiner, ligner hinanden i alle eukaryoter, og det antages, at gærceller 5 i modsætning til prokaryote celler kan danne proteiner, som ♦ er glycosyleret nøjagtigt (selv om nogle sluttrin i processen må modificeres).

Endvidere indeholder gærceller ikke endotoksiner. I proteinpræparater fra Escherichia coli findes ofte kontaminerende 10 endotoksiner, som skal fjernes ved dyre rensningstrin.

Da gær er en mikroorganisme, er gærceller lette at dyrke. Den cellemasse, som kan opnås pr. rumfang dyrkningsvæske, er væsentligt større for gær end for Escherichia coli. Endvidere har man et godt kendskab til gærs opførsel i ferroenterings-15 fasen, og der kendes allerede fremgangsmåder til fermentering i stor målestok.

I de seneste år har bagergær, Saccharomyces cerevisiae, vakt stigende interesse blandt molekylærbiologer, som beskæftiger sig roed grundforskning og udvikling. Denne udvikling skyldes 20 i stor udstrækning dannelsen ’.af et transformationssystem (Hinnen et al. (1), Beggs (2)), som muliggør anvendelsen af denne mikroorganisme til gensplejsningsprocesser, såsom indføring og kloning af heterologt DRA. Ligesom ved de prokaryo-tiske systemer er plasmider de foretrukne vektorer til anven-25 delse ved transformering af gærceller, dvs. til indføring af rekorabinant DNA i gærceller.

Vektorer, som er egnede til transformering af gærceller, gærceller transformeret med disse plasmider, polypeptider dan- » net ved hjælp af de transformerede gærceller og fremgangsmå-30 der til deres fremstilling er kendt fra forskellige patentansøgninger og andre publikationer:

Den generelle gærtransformeringsmetode er beskrevet af Hin- 3 DK 174905 B1 nen et al. (1), Beggs (2), Hicks et al. (3) og Struhl et al. (4).

Kopiering af et humant interferon-gen bundet til DNA·fragmenter i 5'-sidesekvenserne i Saccharomyces cerevisiae alkohol v dehydrogenase 1 (ADH1) genet i et plasmid og transformeret 5 til gærceller er beskrevet af Hitzeman et al. (5).

Transformeringen af Saccharomyces cerevisiae med et plasmid indeholdende det kromosomale kanin Ø-globin-gen er beskrevet af Beggs et al. (6) . Som anført i denne publikation er genet ikke transkriberet korrekt, og der kunne ikke påvises 10 nogen splejsning af de primære β-globin transkriptionsdele.

Eukaryote celler, såsom gær og især pattedyrceller, som er kotrans formeret med fremmed DNA, der koder for et polypep-tid, og som er bundet med en inducerbar promotor, og med ubundet DNA, som tillader identificeringen af de transformere-15 de celler, samt en fremgangsmåde til fremstilling deraf er beskrevet i PCT patentansøgning nr. 81/02425 (7) .

En DNA sekvens, som koder for et eukaryotisk replika tionssted, eukaryote vektorer, som bevirker mi totisk stabilitet ved lavt kopiantal, og som indeholder et eukaryotisk replika-20 tionssted, samt gærceller transformeret med disse.vektorer er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 48081 (8).

Hybrid DNA'er indeholdende bl.a. et eukaryotisk værtsegment, som kopierer autonomt, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt en fremgangsmåde til højfrekvenstransformering af 25 eukaryote celler, f.eks. gær, med disse hybrid DNA'er, er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 45573 (9).

t

Plasmider indeholdende ovalbumin-genet kontrolleret ved hjælp af promotoren fra Escherichia coli β-lac Z-genet, og som kan transformeres til gærceller, er beskrevet i DE offentliggørel-30 sesskrift nr. 2.923.297 (10) og fransk patentansøgning nr. 2.458.585 (11).

4 DK 174905 B1

Endelig er hybridplasmider indeholdende DNA fra et bakterie plasmid, hele eller dele af DNA'et fra gær 2μ plasmidet og gær URA3-genet samt gær transformeret med disse hybridplasmider beskrevet i europæisk patentansøgning nr. 11562 (12).

5 v 1 løbet af de senere år er der blevet gjort store fremskridt indenfor gensplejsningsområdet, og de første systemer, som anvender genetisk manipulerede mikroorganismer, især stammer af enterobakterien Escherichia coli, er nu i drift. Der er 10 imidlertid et behov for andre og bedre .systemer, især eukaryote systemer, såsom gær, som er egnede til industriel produktion af proteiner i økonomisk og stor målestok. Forskellige gærvektorer er for tiden tilgængelige til genkloning. Til effektiv kopiering af fremmede gener i gær skal struktur-15 kodning s sekvens er kombineres med kraftige gærpromotorer, som fordelagtigt bør udvise regulatoriske træk, som muliggør eksogen kontrol af genkopiering (gene expression). Det er tillige formålet med opfindelsen at tilvejebringe gærpromotorer, som opfylder disse betingelser. Det er desuden for-20 målet med opfindelsen at tilvejebringe hybridvektorer indeholdende disse promotorer og fremmede strukturgener kontrolleret af disse promotorer.

1. DNA-fragmenter indeholdende sur phosphatase qærpromotorer og deres fremstilling_

Ved den foreliggende opfindelse tilvejebringes gærpromotorer, som er blevet isoleret for nylig, og som har gode kopieringsegenskaber, samt en fremgangsmåde til fremstilling deraf.

30 Gærpromotorerne er afledt af genom DNA'et fra gær, især fra *

Saccharomyces cerevisiae. Mindst to strukturgener (PH03 og PH05) og adskillige regulatoriske gener (PH02, PH04, PHO80, 35 PH081, PH085) indgår i kopieringen af sur phosphatase i gær (jfr. f.eks. reference (13)). PH05 og PH03 koder for hen- 5 DK 174905 B1 holdsvis en repressiv (reguleret) og en strukturel sur phosphatase i gær. PHOB-genet er undertrykt ved høje koncentrationer af uorganisk phosphat og ikke undertrykt ved lav v forekomst (starvation) af uorganisk phosphat (sædvanligvis 5 i stor udstrækning under passende fysiologiske betingelser), hvorimod PH03-genet kopieres strukturmæssigt ved lave koncentrationer. Undertrykkelsesenzymet er glycosyleret og har en molekylvægt på ca. 490 kilodalton (14).

10 Promotorerne, som kontrollerer sur phosphatase generne, har ikke været isoleret eller anvendt ved den kendte rekombinant DNA teknologi, og derfor har deres nukleotidsekvenser ikke været klarlagt, I modsætning til andre gærpromotorer anvendt i nyere rekombinant DNA teknologi (f.eks. ADH1), koder DNA 15 sekvenserne, som følger direkte efter sur phosphatase gærprano-torerne, for signalpeptider, som antages at indgå i sekretionsprocessen, Det ville være fordelagtigt at binde et område, som koder for et fremmed protein, til en gær-signal-sekvens, som sikrer in vivo transport af proteinet gennem 20 gærcellemembranen. Det ville resultere i en formindskelse af produktnedbrydning og kontaminering af produktet med materiale fra værtcellen og ville lette produktudvindingen.

Det er en ulempe ved de hidtil anvendte promotorer i rekom-25 binant DNA teknologi, at de pågældende gener transskriberes strukturmæssigt. Det kopierede polypeptid kan enten være toksisk overfor gærcellen {fungicidvvirkning) eller kan i det mindste hæmme celleformering (fungistatisk virkning), eller polypeptidet kan nedbrydes enzymatisk i cellen, især 30 hvis det udsættes for gærproteaser i lang tid. I alle de nævnte tilfælde vil udbyttet af det ønskede polypeptid være lavt.

tf

Disse ulemper kan undgås ved anvendelse af PH05-promotoren og vektorer indeholdende denne promotor. PH05-promotoren kan være undertryk eller ikke-undertrykt, idet man blot forøger 35 eller formindsker koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet. Promotoren kan således være undertrykt under gærens vækstfase og kan være ikke-undertrykt udelukkende under den tidlige stationære fase ved maksimal celletæthed, hvilket 6 DK 174905 B1 tillader kopiering af genet kontrolleret ved hjælp af PH05-promotoren. Denne egenskab kombineret med et højt transskriptionsniveau gør, at PH05-promotoren er den promotor der anvendes i den foreliggende opfindelse.

5 *

Den foreliggende opfindelse angår et DNA-fragment, som indeholder en undertrykkende Saccharomyces cerevisiae sur phosphatase promotor (PH05) omfattende sekvensen

G

10 ATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTT

atgtgcgctgctttaatgttttctcatgtaagcggacgtcgtctataaacttcaaacgaa ' GGTAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCA CGTTTTC G CATAG AACG CAACTG CACAATG CCAAAAAAAGTAAAAGTG ATT AAAAGAGTT 15 AATTG AATAG G CAATCTCTAAATG AATC G ATACAACCTTG G CACTCACACGTG GGACTAG CACAG ACTAAATTTAT 6ATTCT G GTCC CT GTTTT CGAAG AG ATC G CACAT G CCAAATTAT caaattggtcaccttacttggcaaggcatatacccatttgggataagggtaaacatcttt gaattgtcgaaatgaaacgtatataagcgctgatgttttgctaagtcgaggttagtatgg cttcatctctcatgagaataagaacaacaacaaatagagcaagcaaattcgagattacca atgtttaaatctgttgtttattcaattttagccgcttctttggccaatgcaggtaccatt cccttaggcaaactagccgatg eller underfragmenter deraf, som bibeholder promotorfunktio-25 nen.

Eventuelt efterfølges sur Saccharomyces cerevisiae phosphatase promotoren af hele eller en del af signalsekvensen af kodningsområdet for den sure gær-phosphatase, som er natur-30 ligt bundet til promotoren. Endvidere kan DNA-fragmentet indeholde sekvenser, som er nødvendige for effektiv translation af mRNA. * 35 <3 7 DK 174905 B1

Foretrukne DNA-restriktionsfragmenter har sekvensen atccgaaagttgtattcaacaagaatgcgcaaatatgtcaacgtatttggaagtcatctt * atgtgcgctgctttaatgttttctcatgtaagcggacgtcgtctataaacttcaaacgaa 5

GGTAAAAGGTTCATAGCGCn I I I LU IGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCA CGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTT AATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAG CACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTAT 10 CAAATTGGTCACCTTACTTGGCAAGGCATATACCCATTTGGGATAAGGGTAAACATCTTT

gaattgtcgaaatgaaacgtatataagcgctgatgttttgctaagtcgaggttagtatgg

CTTCATCTCTCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGAGATTACCA

atgtttaaatctgttgtttattcaattttagccgcttctttggccaatgcaggtaccatt 15 cccttaggcaaactagccgatg og underfragmenter deraf, som bibeholder promotorfunktionen,

G

atccgaaagttgtattcaacaagaatgcgcaaatatgtcaacgtatttggaagtcatctt 2 o atgtgcgctgctttaatgttttctcatgtaagcggacgtcgtctataaacttcaaacgaa

G GTΑΑΑΑ G G TT CATAGCGCTTTTTCTTTG TCTGCACAAAGΑΑΑΤAT ATATTAAATTAGCA

CGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTT

AATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAG

_ c CACAGACTAAATTTATGATrCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTAT

25

CAAATrGGTCACCTTACTTGGCAAGGCATATACCCATTTGGGATAAGGGTAAACATCTTT

GAATTGTCGAAATGAAACGTATATAAGCGCTGATGTTTTGCTAAGTCGAGGTTACTATGG

cttcatctctcatgagaataagaacaacaacaaatagagcaagcaaattcggg 30 og

-G

« atccgaaagttgtattcaacaagaatgcgcaaatatgtcaacgtatttggaagtcatctt.

atgtgcgctgctttaatgttttctcatgtaagcggacgtcgtctataaacttcaaacgaa ggtaaaaggttcatagcgctttttctttgtctgcacaaagaaatatatattaaattagca 35 cgttttcgcatagaacgcaactgcacaatgccaaaaaaagtaaaagtgattaaaagagtt aattgaataggcaatctctaaatgaatcgatacaaccttggcactcacacgtgggactag 8 DK 174905 B1

CACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTAT

CAAATTGGTCACCTTACTTGGCAAGGCATATACCCATTTGGGATAAGGGTAAACATCTTT

ff GAATTGTCGAAATGAAACGTATATAAGCGCTGATGTTTTGCTAAGTCGAGGTTAGTATGG 5 CTTCATCTCTCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGAGATTAGG *

Ifølge den foreliggende opfindelse kan et DNA-fragment fremstilles ved, at man (A) fremstiller det sure phosphatase PH05-gen ved komplemen-10 tering af Saccharomyces cerevisiae-stammer, som mangler sur phosphatase PH05, ved transformering med plasmid DNA fra et Saccharomyces cerevisiae-bibliotek indeholdende vildtypeko-pien af genet og isolerer genet, (B) fremstiller subkloner af det dannede gen og 15 (C) identificerer beliggenheden af promotorområdet for oven nævnte underkloner og isolerer DNA fragmenter indeholdende sur phosphatase PH05-promotoren ved restriktionsnedbrydning og til fremstilling af underfragmenter afkorter de dannede DNA restriktionsfragmenter ved nedbrydning med en restrik-20 tionsendonuklease eller med en passende exonuklease.

I det følgende beskrives de enkelte trin, som indgår i fremstillingen af DNA-fragmentet, mere detaljeret: 25 (1) Et Saccharomyces cerevisiae bibliotek dannes under anvendelse af vild-type gær DNA klonet i et hybrid bakterie-gær-plasmid (især Escherichia coli), som indeholder egnede markører, som kan kopiere i både bakterieceller og gærceller (angående egnede markører henvises 30 til det følgende). 1

Kloner indeholdende et sur phosphatase Saccharomyces ‘ cerevisiae-PH05-gen, udvælges ved transformation af en gærstamme, som er mangelfuld med hensyn til sur phospha-35 tase PH05, under anvendelse af plasmidblandinger fra ovenstående bibliotek.

9 DK 174905 B1 (3) Plasmider indeholdende et sur phosphatase gen isoleres fra den transformerede gær og forstærkes ved tilbagetransformering til Escherichia coli, idet der selekte-v res for den phenotypiske egenskab hos bakteriemarkøren 5 {f.eks. ampicillinresistens) .

(2') Med en alternativ metode opdeles genbiblioteket i underdele, som anvendes til at transformere Saccharomyces cere-visiae stammer, som er mangelfulde med hensyn til sur phos-10 phatase PH05, og (3’) positive dele opdeles igen og transformeres som ovenfor, indtil en enkelt klon er identificeret.

(4) Plasmid DNA'et fra den identificerede klon isoleres, nedbrydes med egnede restriktionsendonukleaser, og frag- !5 menterne reklones ind i en passende gærvektor.

(5) DNA-fragmenter indeholdende et sur phosphatase Saccharomyces cerevisiae-PH05-gen kan identificeres ved at transformere Saccharomyces cerevisiae stammer, som er 2 0 mangelfulde med hensyn til sur phosphatase-PH05 fra gær, med vektorerne. På denne måde kan grænserne for sur phosphatase PH05-generne bestemmes med en nøjagtighed på ca. 300 basepar.

25 (6) DNA-sekvensering af de identificerede fragmenter tjener til lokalisering af PHCS-prarotoronråderrae, sur phosphatase PH05 proteinkodningsområderne og endvidere restriktionsstedet eller -stederne, som kan være nyttige ved fortsat behandling, f.eks. til afskæring af DNA-sekvens er, som ikke 30 er nødvendige for promotorfunktionen, med restriktions endonukleaser.

Afhængigt af valget af restriktionsendonukleaserne kan DNA-fragmenterne indeholdende sur phosphatase promotoren også 35 ved 3·- og 5’-enderne indeholde oprindelige side-DNA- sekvenser, som ikke påvirker promotorfunktionen, og som kan anvendes som forbindelsessekvenser i de efterfølgende klonings- 10 DK 174905 B1 processer. Om ønsket kan disse ekstra sekvenser forkortes ved nedbrydning med en restriktionsendonuklease (om muligt) eller med en egnet eksonuklease, f.eks. Bal31. Endvidere kan fragmenterne bindes til kemisk syntetiserede DNA-binde-5 led, som fortrinsvis indeholder genkendelsessekvensen fra * en passende resfriktionsendonuklease. Dette muliggør en hensigtsmæssig binding af sur phosphatase promotoren med fremmed polypeptid kodningsområder. Det er også muligt at isolere og/eller danne et DNA-fragment, som indeholder sur 10 phosphatase Saccharomyces cerevisiae-promotoren og hele eller en del af den tilstødende signalsekvens fra sur phosphatase protein-kodningsområdet. Når det dannede hybrid DNA er bundet til et hensigtsmæssigt afskåret fremmed polypeptid-kodningsområde, vil det dannede hybrid DNA kopieres i Saccha-15 romyces cerevisiae til dannelse af polypeptider med sur phosphatase signalsekvenser eller sammensmeltede (fused) signalsekvenser.

De omhandlede sur phosphatase Saccharomyces cerevisiae pro-20 motorer kan anvendes til at kontrollere kopieringen af et gær-polypeptidkodningsområde eller et ikke-gær-polypeptidkodningsområde i en gærhybridvektor.

2. Gærhvbridvektorer indeholdende sur phosphatase gæroromo-25 torer og deres fremstilling

Den foreliggende opfindelse angår også gærhybridvektorer, der hovedsagelig består af en Saccharomyces cerevisiae sur phosphatase (PH05) promotor og et gær-polypeptidkodningsom-30 råde eller et ikke-gær-polypeptidkodningsområde, som kontrolleres af promotoren, med den begrænsning, at det nævnte gærpolypeptidkodningsområde ikke er PH05-genet.

De her anvendte udtryk "vektor", "gærhybridvektor", "DNA-35 sekvenser" osv. refererer især til dobbeltstrengede DNA'er.

11 DK 174905 B1

Enkeltstrenget DNA er imidlertid også omfattet af disse udtryk. Vektorer og gaerhybridvektorer kan være lineære eller har fortrinsvis cirkulær form.

a 5 Gærpolypeptidkodningsområdet (gen) eller ikke-gær-polypep-kodningsområdet kontrolleret af en af de ovenfor anførte promotorer kan være afledt af genom DNA eller af cDNA fremstillet over mRNA eller kan være fremstillet kemisk. Ikke-gær-polypeptidkodningsområderne (gener) stammer fra vira, 10 prokaryote celler eller eukaryote celler, herunder fra højere eukaryote celler, især fra menneskeceller. Når disse gener kopieres i vært-gærcellen, kan de bevirke fremstilling af mange forskellige polypeptider, herunder glycosylerede polypeptider, såsom enzymer , der f.eks. kan anvendes til 15 fremstilling af levnedsmidler eller til gennemførelse af enzymatiske reaktioner i kemien, eller ikke-enzymatiske poly-peptider, f.eks. hormoner, polypeptider med immunomoduleren-de, antivirale og anticancer egenskaber, antistoffer, virus antigener, vacciner, koagulationsfaktorer, fødevarer og lig-20 nende. Sådanne gener koder f.eks. for amylaser, proteaser, lysozym, viral thymidin kinase, rennin, β-lactamase, glucose isomerase, secretin, thymosin, relaxin, calcitonin, somatostatin, humant væksthormon eller væksthormon fra kvæg, insulin, luteiniseringshormonet, det parathyroide hormon, 25 adrenocorticotropin, B-endorphin, det melanocyt-stimulerende hormon, β-lipotropin, urogastron, interferon, såsom humant interferon, f.eks. et humant interferon-α- eller -β-polypep-tid afledt af humane leukocytceller, lymfoblastoide celler eller fibroblast celler, eller humant interferon-γ, lymfo-30 kiner, tumor necrose faktor, anti-rennin-antistof, hepatitis A virus antigen, hepatitis B virus (HBV) overflade eller kerne antigener, hepatitis non-A non-B virus antigen, humane histo-kompatibile antigener, mund- og klovsyge virus antigen, 35 12 DK 174905 B1 influenza haemagglutinin, fjerkræpest haemagglutinin, serum albumin, ovalbumin, thaumatin, egliner eller plasminogen-aktivatorer.

Et valgt polypeptidkodningsområde kan eventuelt indbefatte 5 en signalsekvens eller en del deraf. Som anført ovenfor kan dette bevirke et kondenseret protein indeholdende PH05 signalsekvensen eller en hybrid signalsekvens indeholdende dele af PH05 signalsekvensen og dele af signalsekvensen for det fremmede polypeptid sammen med det fremmede voksne polypep-10 tid. I begge tilfælde favoriseres de kombinationer, som fører til spaltningen af signalsekvensen efter modning af det fremmede polypeptid.

Bortset fra en sur phosphatase promotor og et gær eller et ikke-gaer polypeptidkodningsområde kan de omhandlede poly-15 peptidvektorer indeholde yderligere DNA-sekvens eller sekvenser, som er betydningsløse eller mindre vigtige for promotorens funktion, dvs. for kopieringen af polypeptidkodnings-området, men som kan udøve vigtige funktioner, f.eks. propageringen af gærcellerne transformeret med disse hybrid 20 vektorer. Den eller de ekstra DNA-sekvenser kan fremstilles fra prokaryote og/eller eukaryote celler og kan omfatte kromosomale og/eller extra-kromosomale DNA-sekvenser. Ekstra DNA-sekvenserne kan f.eks. stamme fra (eller bestå af) plasmid DNA, såsom bakteriel eller eukaryotisk plasmid DNA, virus 25 DNA og/eller kromosomal DNA, såsom bakteriel kromosomal DNA fra gær eller højere eukaryoter. Foretrukne hybrid vektorer indeholder yderligere DNA-sekvenser afledt af bakterieplasmi-der, især Escherichia coli plasmid pBR322 eller beslægtede plasmider, bakteriofag λ, gær 2y plasmid og/eller gær kromo-30 somal DNA.

Fortrinsvis bærer de yderligere DNA-sekvenser et gær-kopie-ringsorigin og en selektiv genetisk markør for gær. Hybridvektorer indeholdende et gær-kopieringsorigin, f.eks. det eller de kromosomale selvstændigt kopierende segmenter, holdes 35 ekstrakromosomalt i gærcellen efter transformering og kopieres 13 DK 174905 B1 selvstændigt ved mitose. Hybridvektorer indeholdende sekvens homologe til gær 2y plasmid DNA kan også anvendes. Disse hybridvektorer vil blive integreret ved rekombination·i 2μ plas-v mider, som allerede findes i cellen, eller de vil kopiere 5 autonomt. 2μ sekvenser er særligt egnede til højfrekvens-transformationsplasmider og kan fremkalde høje kopiantal.

Endvidere kan hybridvektorerne ifølge opfindelsen indeholde en DNA-sekvens fra et gen, som findes i værtsgærkromosomet (f.eks. PH05), hvis promotor kan være bundet til gær- eller 10 non-gær-polypeptidkodningsområdet. Som følge af den homologe sekvens kan hele vektoren indføres stabilt i værtskromosomet ved rekombination. Under propagering vil de dannede celler tilbageholde det indførte genmateriale selv uden selektivt tryk.

15 Med hensyn til den selektive genmarkør for gær kan der anvendes et vilkårligt markørgen, som letter udvælgelsen af transformanter som følge af den fenotypiske ekspression af markøren. Egnede markører for gær er især sådanne, som udtrykker antibiotisk resistens eller, i tilfælde af auksotrofe 20 gærmutanter, gener, som komplementerer værtslæsioner. Tilsvarende gener giver f.eks. resistens til det antibiotiske cycloheximid eller tilvejebringer prototrofi i en’auksotrof gærmutant, f.eks. URA3, LEU2, HIS3 eller TRPl genet. Det er endvidere muligt som markører at anvende strukturgener, som 25 er forbundet med en selvstændigt kopieringssegment, forudsat at værten, som skal transformeres, er auksotrof for det produkt, som udtrykkes af markøren.

„ Det er en fordel, at de yderligere DNA-sekvenser, som findes i hybridvektorerne ifølge opfindelsen, også indeholder et 30 kopieringsorigin og en selektiv genetisk markør for en bakterievært, især Escherichia coli. Der er nyttige træk forbundet med tilstedeværelsen af et Escherichia coli kopieringsorigin og en Escherichia coli markør i en gærhybridvektor.

For det første kan der fås store mængder hybridvektor DNA

14 DK 174905 B1 ved vækst og udvidelse i Escherichia coli, og for det andet kan opbygningen af hybridvektorer hensigtsmæssigt foretages i Escherichia coli under anvendelse af alle mulighederne indenfor klonteknologien baseret på Escherichia coli/ Escheri-5 chia coli plasmider, såsom pBR322 og lignende, som indehol-der såvel Escherichia coli kopieringsorigin som Escherichia coli genetiske markører, som medfører resistens overfor antibiotika, f.eks. tetracyclin og ampicillin, og som fordelagtigt anvendes som del af gærhybridvektorerne.

10

De yderligere DNA-sekvenser, som f.'eks. kopieringsorigin og genetiske markører for gær og en bakterievært (se ovenfor), betegnes i det følgende som "vektor DNA", som sammen med sur phosphatase promotoren og gær- eller ikke-gær-polypep-15 tidkodningsområdet danner en hybridvektor ifølge opfindelsen .

^®^-kybridvektorerne kan fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved at indføre et DNA fragment, 20 der hovedsagelig består af Saccharomyces cerevisiae sur phosphatase (PH05) promotor, og et gær- eller ikke-gær-polypep-tidkodningsområde, som kontrolleres af promotoren, i et vektor DNA.

25 Der kan anvendes hensigtsmæssigt planlagt (mapped^ lineær eller fortrinsvis cirkulær vektor DNA, f.eks. bakterie plasmid DNA eller lignende (se ovenfor), som har mindst ét restriktionssted, fortrinsvis to eller flere restriktionssteder. Det er en fordel, at vektor DNA'et allerede indehol-30 der kopieringsområder og genmarkører for gær og/eller en bakterievært. Vektor DNA'et spaltes ved anvendelse af en passende restriktionsendonuklease. Det spaltede DNA bindes " til det DNA-fragment, som indeholder sur phosphatase promotoren, og til DNA-segmentet, som koder for et gær- eller 35 ikke-gær-polypeptid. Inden eller efter bindingen til promotoren og polypeptidkodningsområdet (eller samtidigt dermed), er det også muligt at indføre kopieringsområdér og/eller markører for gær eller en bakterievært. I alle tilfælde skal 15 DK 174905 B1 restriktions- og anelleringsbetingelserne vælges således, at der ikke sker nogen forstyrrelse af de væsentlige funktioner i vektor DNA'et og promotoren. Gærhybridvektoren kan opbygges sekvensvis eller ved sammenbinding af to DNA-segmen-5 ter, som indeholder alle de sekvenser, som har interesse.

Der kan anvendes forskellige former for teknik til sammenbinding af DNA-segmenter in vitro. Korte ender (helt base-parrede DNA duplekser) dannet ved hjælp af visse restrik-10 tions endonukleaser kan bindes direkte med T .4 DNA-ligase.

Det er mere almindeligt# at DNA-segmenter bindes gennem deres enkeltstrengede kohæsive ender og lukkes kovalent ved hjælp af en DNA-ligase, f.eks. T 4 DNA-ligase. Sådanne enkeltstrengede kohæsive ender ("cohesive termini") kan dannes ved 15 spaltning af DNA med en anden type endonukleaser, som danner forskudte eller enkeltstrengede ender (de to strenge i DNA duplekset spaltes forskellige steder i en afstand af nogle få nukleotider). Enkeltstrenge kan også dannes ved addition af nukleotider til korte ender eller forskudte eller enkelt-20 strengede ender under anvendelse af terminal transferase ("homopolymeric tailing") eller ved simpelthen at fjerne én streng fra et DNA-segment med kort ende med en egnet ekso-nuklease, såsom λ-eksonuklease. En anden metode til fremstilling af forskudte eller enkeltstrengede ender består i, at der 25 til DNA-segmentet med korte ender bindes et kemisk fremstillet bindings DNA (linker DNA), som indeholder et genkendelsessted for en endonuklease, som danner forskudte eller enkeltstrengede ender, hvorefter det dannede DNA nedbrydes med den pågældende endonuklease.

30

Med henblik på opnåelse af effektiv kopiering skal genet, * som koder for et gær- eller ikke-gær-protein, være rigtigt anbragt med hensyn til sekvenserne, som indeholder de trans-skriptionelle (sur phosphatase promotor) og translationelle 35 funktioner (ribosom bindingssteder). For det første skal bindingen af DNA-segmentet indeholdende promotoren med polypep-tidkodningsområdet opnås i den rigtige orientering. Hvis to orienteringer er mulige, kan den korrekte bestemmes ved kon- 16 DK 174905 B1 ventionel restriktionsanalyse. Gærhybridvektorer indeholdende et ukorrekt orienteret indsat gen kan genorienteres ved fjernelse af det indsatte gne med en egnet restriktionsendo-nuklease, hvorefter genet atter bindes med gærhybrid-vektor-5 fragmentet. I alle tilfælde kan ukorrekt orientering undgås ved binding af to DNA-segmenter, som hver har forskellige restriktionssteder ved enderne. Endvidere bør konstruktionen af hybridvektoren gennemføres på en sådan måde, at der kan opnås korrekt transskriptionsinitiering og terminering.

10 Med hensyn til det sidste punkt skal transskriptet fortrinsvis ende i en DNA-sekvens afledt af gærkromosom DNA eller 2μ plasmid. Fordelagtigt slutter transskriptet i en DNA-sekvens indeholdende transskriptionstermineringssignaler fra et gærgen, f.eks. fra PH05 eller PH03. For det andet skal der dan-15 nes et korrekt aflæsningssystem. Sædvanligvis er nukleotid-sekvensen for både promotorområdet og polypeptidkodnings-området kendt inden bindingen eller kan let bestemmes (f.eks.

(15)), således at der ikke er problemer med tilvejebringelse af det korrekt aflæsningssystem. Endvidere kan der være 20 behov for specifikke sekundære DNA-strukturer til endnu mere effektiv kopiering af genet.

Et foretrukket område til binding af sur phosphatase promotoren til en fremmed kodningssekvens er mellem major sur 25 phosphatase mRNA starten og ATG'en i sur phosphatase kodningsområdet f.eks. ved anvendelse af PH05 promotoren indenfor et stræk på ca. 40 bp mellem major PH05 mRNA starten og ATG'en i PH05 sur phosphatase kodningsområdet. Til en forbindelse i dette område skal den fremmede kodningssekvens have sin egen ATG til translationsinitiering, da den ellers skal forsynes med et yderligere syntetisk oligonukleotid.

J

Da mange polypeptider fra højere organismer primært kopieres som præ-polypeptider bestående af signalpeptider knyttet til 35 N-termini i fuldt udviklede (mature) polypeptider, kan det være nyttigt at indbefatte en signalsekvens i det indsatte gen. Egnede signalsekvenser er sådanne, der er bundet natur- 17 DK 174905 B1 ligt til polypeptidgenet, som skal kopieres, eller til sur phosphatase promotoren. Eventuelt kan sammensmeltede signalsekvenser fremstilles ved at sammenbinde (ligere) eri del af sur phosphatase signalsekvensen med en del af polypeptid-5 signalsekvensen. Hvis der ønskes en direkte kopiering af et fuldt udviklet (mature) polypeptid, er det nødvendigt at fjerne signalsekvenser eller dele deraf, som eventuelt følger efter promotorområdet eller eventuelt er anbragt forud for kodningsområdet for det fuldt udviklede polypeptid, f.eks.

10 ved nedbrydning med en eksonuklease, f.eks. med Bal31.

Intermediate produkter, såsom vektorer, der stadig mangler en eller flere vigtige funktioner, samt de endelige gærhybrid-vektorer ifølge opfindelsen kan transformeres til en bakterievært, især Escherichia coli, af de ovenfor anførte årsager 15 (f.eks. produktion af store mængder af henholdsvis interroedi-ære produkter og hybridplasmider) . Bakterievektorer, såsom Escherichia coli plasraidet pBR322 og de fragmenter deraf, som indeholder et bakteriereplikationsområde og en genmarkør eller -markører, er de mest foretrukne vektorer af denne grund.

20 Ved anvendelse af en sådan bakterievektor omfatter sluttrinene ved fremstillingen af gærhybridvektorer fortrinsvis også indførelsen af en genetisk markør og et kopietingsområde for gær.

DNA-segmenter, som kan indsættes i bakterievektoren til fremstilling af gærhybridvektorerne ifølge opfindelsen, såsom et 25 selvstændigt kopieringssegment (ars, jfr. (4)), sekvenser af gær 2\i plasmid (2) eller gærmarkør DNA (jf. 16) , kan isoleres fra henholdsvis gærkromosomal DNA og gær 2y plasmid DNA på konventionel måde. Genet, som koder for et gær- eller et ikke-gær-polypeptid, kan isoleres fra kromosomal eller ekstra-30 kromosomal DNA afledt af cDNÅ fremstillet via mENA-vejen (se ovenfor) under anvendelse af konventionel teknik (f.eks. 17, 18) eller kan syntetiseres kemisk.

Ved en foretrukken udførelsesform omfatter fremgangsmåden 35 til fremstilling af gærhybridvektorerne følgende trin: 18 DK 174905 B1 (1) dannelse af et Saccharomyces cerevisiae bibliotek under anvendelse af vildtype gær DNA, (2) isolering af sur phosphatase genet, især HK)5-genet, og 5 kloning deraf i et bakterieplasmid, såsom pBR322, eller et biologisk funktionelt, især et intakt kopieringsområ-de og selektionsmarkørholdigt fragment deraf, (3) insætning i plasmidet af en genetisk markør for gær, såsom TRP1-genet, og et gær kodningsområde, såsom et kro- 10 mosomalt selvstændigt kopierende segment eller alternativt gær 2 plasmidsekvenser i et passende, restriktionssted, (4) insætning af et DNA-segment, som koder for et gærpolypep-tid eller et ikke-gær-polypeptid, såsom humaninterferon eller HBV overfladeantigen, på en sådan måde, at sur 15 phosphatase promotoren kontrollerer polypeptidkodnings- segmentet, og (5) eventuel indsætning af en DNA-sekvens indeholdende trans-skriptionstermineringssignaler fra et gær-gen, f-eks.

fra PH05, efter (downstream) polypeptidkodningsområdet.

20 Det er ligeledes muligt at ændre rækkefølgen af trinene, f.eks. trin 3 til 5, f.eks. ved først at indføre polypeptid-kodningssegmentet og derefter at indsætte den genetiske markør og kopiieringsområdet for gær i rekombinant-plasraidet dannet i trin 2.

25 Inden indsætning af en genmarkør for gær, et gærkopieringsområde og et polypeptidkodningssegment kan man eventuelt fjerne uvæsentlige funktioner, såsom sur phosphatase strukturgenet, fra rekombinant-plasmidet dannet i trin 2.

Specielt bindes DNA-segmentet, som koder for et gærpolypep- J

30 tid eller et ikke-gær-polypeptid, til sur phosphatasepromotoren (trin 4) i området mellem major sur phosphatase mRNA starten ogATG1 en i sur phosphatase kodningsområdet. Eventuelt indføres et syntetisk bindeled indeholdende et passende restriktionssted for at tillade forbindelsen mellem DNA- 35 segmentet og sur phosphatase promotoren.

19 DK 174905 B1

Intermediære gærhybridvektorer indeholdende Saccharomyces cerevisiae sur phosphatase promotoren, og som stadig mangler gær- eller ikke-gær-polypept idkodning s sekvensen, kan frem-„ stilles ved hjælp af de ovenfor beskrevne trin (1), (2), 5 (3) og eventuelt (5), hvor sur phosphatase promotoren for trinsvis er termineret i området mellem major sur phosphatase mRNA starten og ATG'en i sur phosphatase genet og/eller, om ønsket, indføres et syntetisk bindeled indeholdende et passende restriktionssted for at tillade indsættelsen af et 10 DNA-segment, som koder for et gærpolypeptid eller et ikke-gær-polypeptid.

3. Transformation af Saccharomvces cerevisiae med gærhvbrid-vektorer indeholdende gær sur phosphatase promotorer.

15

Opfindelsen omfatter tillige en fremgangsmåde til fremstilling af transformerede gærceller, som er i stand til at danne gær-polypeptider eller ikke-gær-polypeptider, ved hvilken Saccharomyces cerevisiae transformeres med en vilkårlig af 20 de ovenfor i kapitel 2 beskrevne gærhybridvektorer.

Transformeringen af gær med gærhybridvektorerne kan gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder beskrevet i litteraturen, f.eks. i overensstemmelse med fremgangsmåden beskre-2 5 vet af Hinnen et al. (1) . Denne fremgangsmåde kan opdeles i tre trin: (1) Fjernelse af gærcellevæggen.

(2) Behandling af de såkaldte "nøgne" gærceller (spheroplaster) med det transformerende DNA i nærværelse af PEG (poly- 2+ 30 ethylenglycol) og Ca -ioner.

(3) Regenerering af cellevæggen og udvælgelse af de transformerede celler i et fast agarlag.

35 20 DK 174905 B1

Foretrukne fremgangsmåder er følgende: ad (1) : Gærcelle væggen fjernes enzymatisk vinder anvendelse af forskellige glucosidasepræparater, såsom snegletarmsaft (f.eks. Glusulase® eller Helicase®) eller enzymblandinger fremstillet 5 ud fra mikroorganismer (f.eks. Zymolyase·) i osmotisk stabiliserede opløsninger (f.eks. 1 M sorbitol).

ad (2) : Gærspheroplasterne sammenklumper i nærværelse af PEG/ og der induceres lokale fusioner af cytoplasroamembranerne. Dannelsen af sandsynlige sammensmeltningsbetingelser ("fusion-10 like") er af afgørende betydning, og mange transformerede gærceller vil blive diploide eller endog triploide under transformationsprocessen. Fremgangsmåder, som tillader selektion af sammensmeltede spheroplaster kan anvendes til koncentrering af transformanter, f.eks. kan transformerede celler let iso-15 leres blandt forudvalgte fusionsprodukter.

ad (3) : Da gærceller uden cellevæg ikke deler sig, er det nødvendigt, at cellevæggen regenereres. Denne regenerering gennemføres hensigtsmæssigt ved indlejring af spheroplasterne i agar. Eksempelvis blandes smeltet agar (ca. 50°C) med sphero-20 plasterne. Ved afkøling af opløsningen til gærdyrkning s temperaturer (ca. 30°C) dannes der et fast lag. Dette agarlag skal forhindre hurtig diffusion og tab af vigtige makromolekyler fra spheroplasterne og derved lette regenereringen af cellevæggen. Imidlertid kan regenerering af cellevæggene også op-25 nås (skønt med lavere virkningsgrad) ved at placere spheroplasterne på overfladen af præformede agarlag.

Det foretrækkes at fremstille regenereringsagaren på en sådan måde, der tillader regenerering og udvælgelse af transformerede celler på samme tid. Da gær-gener, som koder for enzy-30 mer ved biosyntetisk aminosyresyntese, sædvanligvis anvendes som selektive markører (jf. kapitel 2), gennemføres regenereringen fortrinsvis i gærainimalmediumagar. Hvis der imidlertid kræves en meget høj grad af regenerering kan der fordelagtigt anvendes en to-trins-metode: (1) regenerering af 35 cellevæggen i et rigt komplekst medium og (2) udvælgelse af de transformerede celler ved kopiplettering af cellelaget på selektive agarplader.

21 DK 174905 B1

Hvis gærhybridvektoren ikke indeholder nogen markørgener, kan de transformerede celler også identificeres ved hjælp af andre fremgangsmåder. Sådanne fremgangsmåder indbefatter . f.eks. in situ hybridisering med et mærket DNA-fragment, 5 som er homologt med hensyn til sekvenser i gærhybridkvektoren (f.eks. ifølge Hinnen et al. (1)), in situ immunoanalyse, forudsat at antistoffet for produktet fra det introducerede gen er tilgængeligt, eller andre screeningsmetoder, som bestemmer genprodukter, som er indkodet ved hjælp af det el-10 ler de transformerende plasmider.

Eventuelt kan gæren kotransformeres med en gærhybridvektor ifølge opfindelsen og en anden vektor indeholdende en genetisk markør for gær. Hvis de to forskellige vektorer har DNA-sekven-15 ser tilfælles (disse kan være bakteriesekvenser, som forekommer i vektorerne), kan der foregå rekombinering, som fører til et sammensmeltet hybridmolekyle, som kan udvælges.

Opfindelsen angår endvidere Saccharomyces cerevisiae-værter, 20 som er transformeret med gaerhybridvektorer, der indeholder en Saccharomyces cerevisiae sur phosphatase (PH05) promotor og et gær- eller ikke-gær-polypeptidkodningsområde.

4. Dyrkning af transformerede gærceller og inducering af poly-25 peptidsyntese Gærceller transformeret med selvstændigt kopierende plasmider, f.eks. plasmider indeholdende gær 2p plasmid DNA, har i varierende udstrækning tendens til at miste det indførte hybrid-30 plasmid (jf. (16)). Af denne årsag er det nødvendigt at dyrke sådanne gærceller under selektive betingelser, dvs. betingelser, som kræver kopieringen af et plasmidindkodet gen for vækst. De fleste selektive markører, som anvendes for tiden, er gener, som koder for enzymer for aminosyrebiosyntese eller 35 purinbiosyntese. Dette gør det nødvendigt at anvende syntetiske minimalmedier, som mangler den tilsvarende aminosyre eller purinbase- Nogle gener, som bibringer antibiotisk resistens, kan imidlertid lige så godt anvendes (f.eks. gener, 22 DK 174905 B1 der bibringer resistens mod cycloheximider eller mod amino-glycosidet G 418 (21)). Gærceller transformeret med vektorer indeholdende antibiotisk resistens gener dyrkes i komplekse medier indeholdende det tilsvarende antibiotikum, hvorved der kan opnås større dyrkningshastigheder og højere celle-tætheder.

Gærceller transformeret med DNA integreret i kromosomerne kræver ikke selektive vækstbetingelser. Disse transformerede celler er tilstrækkeligt stabile, til at der kan foregå vækst uden selektivt tryk. På grund af ovenstående forhold dyrkes disse celler fordelagtigt i komplekse medier.

15 133 den regulerede sur phosphatase premotor PH05 er undertrykkende, er det nødvendigt at tilpasse dyrkningsmediets sammensætning for at opnå maksimale koncentrationer af mRNA transskripter, dvs. vækstmediet skal indeholde uorganisk phosphat i lav koncentration for at ophæve undertrykkelsen (derepression) 20 af PH05 promotoren.

5. Isolering og rensning af det kopierede polypeptid

Opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde til fremstilling 25 af et gær-polypeptid eller et ikke-gær-polypeptid såsom humant interferon eller HBV overfladeantigen, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter følgende trin: (1) dyrkning af en Saccharomyces cerevisiae stamme transformeret med en gærhybridvektor indeholdende en gær 30 sur phosphatase (PH05) promotor og et gær- eller ikke-gær-polypeptidpodningsområde under passende næringsbetingelser og (2) isolering og rensning af polypeptidet.

35 De transformerede Saccharomyces cerevisiae ifølge den foreliggende opfindelse dyrkes i et væskemedium indeholdende 23 DK 174905 B1 / assimilerbare carbon- og nitrogenkilder og uorganiske salte.

Der kan anvendes forskellige carbonkilder. Som eksempler på foretrukne carbonkilder kan nævnes assimilerbare carbon-5 hydrater, såsom glucose, maltose, mannitol eller lactose, eller et acetat, som kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Egnede nitrogenkilder indbefatter f.eks. aminosyrer, f.eks. casaminosyrer, peptider og proteiner og deres nedbrydningsprodukter, såsom trypton, pepton eller kødekstrakt, 10 endvidere gærekstrakt, maltekstrakt, majsstøbevand samt ammoniumsalte, såsom ammoniumchlorid, amrtioniumsulfat eller ammoniumnitrat, som kan anvendes alene eller i passende blandinger. Uorganiske salte kan endvidere eksempelvis indbefatte sulfater, chlorider, phosphater og carbonater af natrium, ka-15 lium, magnesium og calcium.

Dyrkningsmediet kan endvidere også indeholde vækstfremmende stoffer og/eller stoffer, som udøver et selektionstryk med henblik på at forhindre tab af hybridplasmidet. Stoffer, som 20 har vækstfremmende virkning, er f.eks. sporstoffer, såsom jern, zink, mangan og lignende, eller enkelte aminosyrer.

Hvis hybridplasmidet indeholder et gen, som bevirker resistens mod et antibiotisk stof, vil celler indeholdende et sådant 25 hybridplasmid overleve i et medium, der er tilsat det antibiotiske stof, hvorimod celler, som har mistet hybridplasmidet, samt kontaminerende mikroorganismer, som er følsomme overfor antibiotika, ikke vil overleve. Hvis hybridplasmidet indeholder et gen, som tilvejebringer prototrofi i en auxo-30 trop gærmutant, f.eks. LEU2 genet eller HIS3 genet, kan der udøves et selektionstryk ved at udelade genproduktet, såsom leucin eller histidin, i dyrkningsmediet.

Da den dyrkede Saccharomyces cerevisiae er blevet transforme-35 ret med et hybridplasmid indeholdende den regulerede sur phosphatase promotor PH05, må indholdet af uorganisk phosphat 24 DK 174905 B1 i dyrkningsmediet formindskes efter fordyrkningsfasen for at sikre maksimale koncentrationer af mRNA transskriptor og følgelig maksimale udbytter af polypeptider.

5 Dyrkningen gennemføres under anvendelse af konventionel teknik. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, pH-værdi i mediet og fermenteringstiden, vælges på en sådan måde, at der opnås maksimale koncentrationer af polypeptider. En

Saccharomyces cerevisiae dyrkes fortrinsvis under aerobe 10 betingelser i submers kultur med rystning eller omrøring ved en temperatur fra ca. 25 til ca. 35°C, fortrinsvis ved ca. 30°C, ved en pH-værdi på 4-8, f.eks. i en pH-værdi på ca. 7, og i ca. 4 til ca. 20 timer, fortrinsvis indtil der er opnået maksimale polypeptidudbytter.

15

Nar de transformerede Saccharomyces cerevisiae er dyrket til en tilfredsstillende celletæthed, består det første trin til udvinding af det kopierede polypeptid i frigørelse af polypeptidet fra cellens indre. Ved de fleste metoder 20 fjernes cellevæggen først ved enzymatisk nedbrydning med glucosidaser (jf. afsnit 3). Derpå behandles de dannede sphæroplaster med detergenter, såsom "Triton"®. Eventuelt kan der til oplukning af cellerne anvendes mekaniske kræfter, såsom forskydningskræfter (f.eks. X-presse, fransk presse) 25 eller rystning med glasperler. Den dannede polypeptidblanding kan koncentreres med hensyn til det ønskede polypeptid på konventionel måde, f.eks. ved fældning med ammoniumsulfat eller trichloreddikesyre, gelelektroforese, dialyse, kromatografi, f.eks. ionbytterkromatografi, størrelsesudelukkelses-30 kromatografi, HPLC eller HPLC med omvendt fase og lignende.

Den endelige rensning af det forrensede produkt kan f.eks. opnås ved antistofaffinitet-kromatografi. Principielt kan rensningstrinnene (bortset fra lyseringen af cellerne) gennemføres i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Stae-35 helin et al. (22) udviklet til human leukocyt interferon.

25 DK 174905 B1

Eksempelvis kan isoleringen og rensningen af det ønskede polypeptid gennemføres under anvendelse af følgende trin: (1) lysering af gercellerne med glucosidase, (2) behandling med et detergent, 5 (3) fjernelse af størsteparten af ikke-proteinmaterialet ved behandling med polyethylenimin, (4) fældning af polypeptiderne ved mætning af opløsningen med ammo ni ums ul f a t, (5) dialyse i en passende pufferblanding, 10 (6) søjlekromatografi på DEAE-cellulose, (7) affinitetskromatografi på en monoklonal antistofsøj le og (8) adskillelse efter molekylstørrelse på en passende "Sephadex"®-søjle.

15

For at opnå et tilstrækkelig rent produkt kan detvise sig at være nødvendigt at anvende yderligere rensningstrin, f.eks. kationbytterkromatografi eller anionbytterkromatografi, adsorption på hydroxylapatit, HPLC med omvendt fase osv. På 20 den anden side kan et eller flere af de omtalte trin eventuelt udelades, eller rækkefølgen af trinene kan ændres.

Når det ønskede polypeptid udskilles af Saccharomyces cerevi-siae i det periplasmatiske rum, kan der anvendes en simplifi-25 ceret fremgangsmåde: Polypeptidet kan udvindes uden lysering af cellerne ved enzymatisk fjernelse af cellevæggen eller ved behandling med kemiske midler, f.eks. thiolreagen-ser eller EDTA, som fremkalder beskadigelse af cellevæggen, hvilket muliggør frigørelse af polypeptidet. I det tilfælde, 30 hvor polypeptidet udskilles til dyrkningsvæsken, kan det udvindes direkte derfra.

Polypeptiderne, som kan fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse, er nyttige og værdifulde til behandling eller 35 forebyggelse af sygdomme hos mennesker og dyr,(f.eks. interferon, HBV overfladeantigen, osv.), eller de kan anvendes som levnedsmidler, foder, foderadditiver eller i enzymatiske 26 DK 174905 B1 reaktioner (jf. 2 ovenfor). Det er klart, at fremstillingen af naturligt forekommende derivater af polypeptiderne, såsom proteolytisk spaltede polypeptider og/eller glycosylerede 5 polypeptider, også er omfattet af den foreliggende opfindelse.

Opfindelsen angår især DNA-fragmenterne, gærhybridvektorerne, den transformerede Saccharomyces cerevisiae og fremgangsmå-10 derne til fremstilling af polypeptiderne som beskrevet i eksemplerne.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen: IS Fig. 1 viser en partiel restriktions-endonuklease-plan for plasmiderne pJDB207/PHO5, PH03 og pBR322/PH05Bam-Sal anvendt som kilder for henholdsvis PH05 genet og DNA sekvensering.

Fig. 2 viser lokaliseringen af PH05 og PH03 sur phosphatase 20 generne i et 5,1 Kb BamHI fragment isoleret fra en gær-gen-samling.

Fig. 3 viser DNA sekvensen i promotorområdet for PH05.

Fig. 4 er et skematisk diagram, som viser konstruktionen af plasmiderne p30IFN2(8.') og p30IFN2' (8,’) .

25 1 .1·.-·

Fig. 5 viser bindingen af PH05 promotor DNA med IFN*-8£ cDNA

ved dannelsen af plasmid p30lFNl(8£).

Fig. 6 viser skematisk konstruktionen af plasmid pJDB207/ IFN21 (8J).

Fig. 7 viser skematisk konstruktionen af rekombinant DNA molekyler indeholdende Namalwa cDNA.

Fig. 8 illustrerer skematisk den anvendte teknik til fremstil- Λ lingen af den IFN mRNA specifikke 13mer DNA primer.

35 27 DK 174905 B1

Fig. 9 viser skematisk identificeringen af kloner indeholdende human lymfoblastoid IFN cDNA.

Fig.10 -14 viser DNA-sekvenserne og tilsvarende aminosyre-sekvenser i de indsatte cDNA'er i plasmiderne S CG-pBR322/HLycIFN-l’b, -&1# -4^ -8J og -5χ.

Fig.15 viser dannelsen af plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-l, og fig.16 viser DNA- og aminosyresekvenserne i det indsatte cDNA.

Fig.17 illustrerer dannelsen af plasmid CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 og fig. 18 viser DNA- og aminosyresekvenserne i det indsatte 10 cDNA.

Fig.19 viser DNA- og aminosyresekvenserne i det indsatte cDNA i plasmid CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2.

Fig.20 illustrerer dannelsen af plasmid p31 indeholdende et PH05 termineringsfragment.

15 Fig.21 viser nukleotidsekvensen for Sau3A-PstI PH05 transskriptions terminerings fragmentet.

Fig.22 viser skematisk dannelsen af plasmiderne p31/IFl(5^), p31/IF2(51)# p31/IF3(51) og p31/IF2(1*b).

Fig.23 illustrerer skematisk dannelsen af plasmid p31/IF(8£).

20 Fig.24 viser skematisk dannelsen af en korrekt PH05-HBVs-saraling i plasmid pBR322/PH05/HBVsA14.

Fig.25 viser DNA-sekvensen omkring PH05 promotor- og HBVs- kodningsområdefusionspunktet i plasmid pBR322/PH05/HBVs.

Fig.26 viser skematisk dannelsen af gærkopieringsplasmiderne 25 pJDB207/PHO5/HBVsA14 og jPDB207/PHO5/HBVsA14t.

Fig.27 viser skematisk dannelsen af garkopieringsplasmiderne pJDB207/IF2(l'b)Δ og pJDB207/IF2(5^ Δ72.

Fig.28 viser nukleotidsekvenserne for plasmiderne pJDB207/IF2 (5^)Δ72 og pJDB207/IF2(5^JΔ82 omkring XhoI-samlingen 30 mellem det 3’-ikke-translaterede område i IFN-5^ og PH05 transskriptionsterminerings-området.

Fig.29 viser dannelsen af plasmid CG-pBR322/HLycIFN(α-3)-252.

Fig.30 viser strukturerne af plasmiderne CG-pBR322/HLycIFN (a-2)-261 og CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258.

35 Fig.31 viser skematisk fremgangsmåden til udslettelse af PH05 signalsekvensen i kopieringsplasmid p31 og specielt dannelsen af plasmid p31/R.

28 DK 174905 B1

Pig.32 viser skematisk samlingen af kloner dannet ved den i £ig.31 illustrerede fremgangsmåde.

Pig.33 og 34 viser nukleotidsekvenserne i BamHI-EcoRI-restriktionsfragmenterne indeholdende PH05/R og 5 PH05/Y promotorområderne.

Fig.35-37 viser skematisk fremgangsmåden til indsættelse af IFN-a-3, -a-2 og -a-1 DNA i plasmid p31/R.

Fig.38 viser skematisk dannelsen af plasmid pJDB207R/IF(a-3).

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

10 I eksemplerne anvendes følgende forkortelser:

EtBr: ethi di umb romid BSA: okseserumalbumin DTT: 1/4-dithiothreitol (l,4-dimercapto-2,3-butandiol) EDTAs ethylendiamintetraeddikesyre 15 SDS: natriumdodecylsulfat TNE: opløsning indeholdende 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl

(pH 7,5), og 1 mM EDTA

Tris*HCl: tris-(hydroxymethyl)-aminoraethan, pH-værdi indstillet med HC1 20 PMSF: phenylmethansulfonylf luorid TE: opløsning indeholdende 10 mM Tris*HCl (pH 7,5) og 1 mM EDTA.

Eksempel 1.

Dannelse af et Saccharomyces cerevisiae bibliotek 25 30 ug gær DNA med total høj molekylvægt (23) fra vildtype

Saccharomyces cerevisiae stamme S288C inkuberes i 30 minutter ved 37°C med 2 enheder EcoRI methylase (New England Biolabs) i 250 ul EcoRI methyleringspuffer som anbefalet af leverandøren. DNA fældes med ethanol, resuspenderet i 500 μΐ 25 mM 30 Tris*HCl pH 8,5, 2 mM MgCl2 (EcoRI* puffer)(24) og nedbrydes med EcoRI (Boehringer), indtil størrelsesfordelingen for DNA-fragmenterne har et maksimum i området 30-50 kb (en Xhol ned- 29 DK 174905 B1 brydning af XDNA giver omtrentlig 33 kb og 17 kb markører) .

Gær DNA'et nedbrudt under EcoRI* betingelser fraktioneres med hensyn til størrelse på en saccharose-gradient (5-20% saccharose i 10 mM Tris*HCl pH 7,5, 1 mM EDTA) i 6 timer 5 ved 38.000 omdrejninger pr. minut i en SW 40 rotor. 30 Fraktioner, hver på 0,4 ml,udtages fra toppen af gradienten.

Fraktion 16 indeholder DNA-fragmenter med en størrelse på 30-40 kb. DNA'et i denne fraktion (3 yg) fældes med ethanol og bindes i 16 timer ved 15°C i samlet rumfang på 15 yl til 10 1 yg kosmid vektor pYcl (25), lineariseret med EcoRI. Bin dingen gennemføres med 300 enheder T4 DNA ligase (New England Biolabs) under anvendelse af puffersystemet beskrevet af leverandøren. DNA'et indføres in vitro i bakteriofag λ (26) , og de samlede fager anvendes til at transducere Escherichia 15 coli stamme HB101 (t-, m^, leu-, pro-, recA-). Effektiviteten ved transduceringen er ca. 5000 ampicillinreistente kolo- Έ> nier pr. yg pYcl vektor. 3000 amp kolonier udtages og dyrkes hver for sig i hullerne i mikrotiterplader i LB medium (10 g Bacto-Trypton (Difco), 5 g Bacto gærekstrakt (Difco), 20 10 g NaCl) indeholdende 100 yg/ml ampicillin.

Eksempel 2.

Isolering af det regulerede sur phosphatase gen PH05

Kopier af gen-samlingen dyrkes på LB agarplader (LB medium plus 15 g/1 agar) indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Celle-25 materialet fra 500 kolonier vaskes af pladerne og samles. Derefter isoleres DNA fra de enkelte væskesamlinger på følgende måde:

Cellerne isoleres ved centrifugering (Sorvall, GSA rotor, 10 minutter ved 600 omdr./min., 4°C), resuspenderes i 100 ml 30 TE (10 mM Tris.HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) og centrifugeres atter under de ovenfor anførte betingelser. Cellematerialet resuspenderes i 3 ml Tsuc (50 mM Tris.HCl, pH 7,5, 25% (vægt/rumfang) saccharose) og overføres til SS-34 polypropylen Sorvall-rør. Alle de efterfølgende trin gennemføres på is: 35 0,3 ml lysozymopløsning (10 xng/ml, indkøbt fra Worthington, 30 DK 174905 B1 11.000 enheder/mg) tilsættes. Efter 5 minutter tilsættes 1,2 ml EDTA (500 raM, pH 8,0), og efter yderligere 5 minutter tilsættes 4,8 ml detergent (0,1% "Triton X-100"* (Merck), 50 mM EDTA, 50 mM Tris.HCl, pH 8,0). Efter 5 minutters for-5 løb centrifugeres lysatet i en forafkølet SS-34 rotor i 40 minutter ved 4°C. Supematanten fjernes omhyggeligt, og der tilsættes fast CsCl (8,3 g CsCl til 8,7 ml supernatant). Efter tilsætning af ethidiumbromid (Sigma)(slutkoncentration 1 mg/ml supernatant) overføres opløsningen til 13,5 ml quick 10 Seal polyallomer-rør (Beckman) og centrifugeres i en Beckman Ti50 rotor i 40 timer ved 40.000 omdr./min. To fluorescerende bånd kan gøres synlige med langbølget ultraviolet lys (366 nm) .Det nederste bånd indeholder overspiralformet (super-coiled) plasmid DNA, som opsamles ved at perforere røret fra 15 siden med en 2 ml injektionssprøjte (18G nål). Ethidiumbromi-det fjernes ved ekstraktion 5 gange med lige store rumfang isopropanol (mættet med CsCl), og produktet overføres til 30 ml Corex-rør. 2,5 rumfang TE tilsættes, og DNA'et fælles med ethanol. Opløsningen henstår derfor i 12-15 timer ved 20 -2Q°C. Det udfældede DNA opsamles ved centrifugering i en

Sorvall HB-4 rotor i 30 minutter ved 12.000 omdr./min. ved 0°C og genopløses i 200 yl TE. 50-100 yg hybridplasmid DNA udvindes fra en 100 ml kultur.

Plasmid DNA fra disse samlinger anvendes til at transformere 25 S.cerevisiae stamme AH216 (a, his3, leu3, pho3, pho5) under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Hinnen et al. (1).

Gærtransformanter kopieringsplatteres på lav P^-minimal medium (som "Difco yeast minimal medium without amino acids" tilsat 20 g/1 glucose, men fremstillet ud fra bestanddelene 30 i overensstemmelse med Difco's recept (Difco Manual, Difco Laboratories, Detroit, USA), idet der dog er anvendt 0,03 g/1 KH2P04 plus 1 g/1 KC1 i stedet for 1 g/1 KH2P04J og farves for sur phosphatase aktivitet ved overlejring med farvningsagar (1% Difco agar i 100 mM acetatpuffer pH 4,0, 2 mg/ml 35 Fast Blue B Salt (Serva) og 0,2 mg/ml a-naphthylphosphat (Serva)]. Kolonier med et funktionelt PH05 gen farver rødt ved ikke-undertrykning af genet på lav P^-medium. Ved gen- 31 DK 174905 B1 tagan opsamling (17) af gen-samlingen 3 fås selvstændige kloner, som udviser sur phosphatase aktivitet, der kan slukkes eller undertrykkes.

En af disse kloner (pG7) underkastes yderligere analyse.

5 Hybridplasmidet har en størrelse på 42 kb. EcoRI og BamHI fragmenter af pG7 underklones i henholdsvis pBR322/HIS3 (16) og pJDB207 (28). Restriktionsnedbrydningerne gennemføres som anbefalet af leverandøren (New England Biolabs), og bindinger (ligations) udføres i 20 yl med 150 enheder T4 ENA ligase 10 (New England Biolabs) og 20 yg/ml af de enkelte nedbrudte plasmider (betingelser som foreslået af New England Biolabs) .

Et 5,1 kb BamHI fragment, som er en del af et 8 kb EcoRi fragment, underklones i gærvektor pJDB207, og efter transformering af gærstairune AH216 udløser dette hybridplasmid 15 (pJDB207/PHO5,PH03, se fig. 1) høj phosphatase aktivitet under ikke-slukkede eller ikke-undertrykte (lav p -)betingelser (PH05 gen) og lave aktivitetsniveauer i normal gær minimal medium (kopiering af pH03 genet).

Eksempel 3.

20 Lokalisering af PHQ5 genet og DNA sekvensanalvse

Til lokalisering af PH03 og PH05 i BamHI fragmentet udnyttes mønsteret for Sau3A restriktionsteder og et enkelt PstI sted. Nedbrydning af BamHI fragmentet med restriktionsendonuklease Sau3A (New England Biolabs) danner 6 fragmenter (A-F, fig. 2) . 25 Underkloning af et partielt Sau3A nedbrydningsprodukt til

BamHI stedet i den selvkopierende gærvektor pJDB207 fører til plasmider med forskellige kombinationer af Sau3A fragmenter. Disse plasmider anvendes derefter til pho3,pho5 mutant gær S.cerevisiae AH216. Transformanterne kontrolleres for sur 30 phosphatase aktivitet efter dyrkning på enten lav P^- eller normale minimal medium plader. Kloner indeholdende mindst Sau3A fragmenter A og B (fig. 2, nr. 1-4) kopierer sur phos- 32 DK 174905 B1 phatase i samme mængde (kvalitative bedømmelser efter overlejring roed sur phosphatase farvnings agar, som beskrevet i eksempel 2) som hele 5,1 kb BamHI fragmentet. Kopieringen reguleres sædvanligvis ved hjælp af koncentrationen af uor-5 ganisk phosphat i mediet. Kloner, som kun har Sau3A-fragment A (fig. 2, nr. 5, 6), kopierer lave koncentrationer af sur phosphatase, som ikke påvirkes af koncentrationen af uorganisk phosphat i mediet. Dette indicerer, at information, som bieres af Sau3A-fragment A, er tilstrækkelig til 10 strukturel sur phosphatase (PH03) kopiering.Sau3A-fragment B (fig. 2, nr. 7) alene fører ikke til nogen kopiering (expression) af sur phosphatase hverken under udslukkede eller ikke-udslukkede betingelser. En underklon med den fuldstændige sekvens mellem BamHI- og Pstl-stederne (fig.2, nr. 10) 15 udviser reguleret, men ikke strukturel (constitutive) syntese af sur phosphatase. Denne underklon må derfor indeholde gær PH05 genet (16).

Den nøjagtige lokalisering af PH05 genet bestemmes ved hjælp af DNA sekvensering under anvendelse af fremgangsmåden ifølge 20 Maxaro og Gilbert (15). Et 623bp BamHI-Sall restriktionsfragment klones i plasmid pBR322 (se fig. 1), under ombytning af BamHI-Sall fragmentet, som strækker sig fra stilling 375 til 650 (pBR322 nomenklatur), under anvendelse af nedbrydnings-og bindingsbetingelser som beskrevet ovenfor (alle enzymer 25 er fra New England Biolabs) . DNA-fragmenter fra det indsatte BamHI-Sall DNA mærkes asymmetrisk ved 5'-enderne på følgende steder: BamHI(-541), Sau3A(-200) og Sall(+82), (angående nummerering se fig. 3a). Nukleotidsekvensen for det indsatte 623bp BamHI-Sall DNA er vist i fig. 3a. Dette viser, at den 30 indsatte del indeholder PH05 promotor-området og dele af PH05 phosphatase protein-kodningsområdet.

33 DK 174905 B1

Eksempel 4.

%

Dannelse af plasmid p30 (se fig. 4) a) Eliminering af Ball restriktions stedet i', plasmid pBR322 5 Skemaet vist i fig. 4 kræver eliminering af det entydige Ball restriktions sted i plasmid pBR322. 3 vg pBR322 nedbrydes fuldstændigt med restriktionsendonukleaserne Ball (BRL) og Pvull (Biolabs) i overensstemmelse med forskrifterne fra leverandøren. Ball/PvuII-dobbeltnedbrydningen af 10 pBR322 resulterer i to restriktionsfragmenter med en størrelse på 3738 bp og 622 bp. De to fragmenter adskilles på en lavtsmeltende agarose gel (sigma) i TBE (90 mM Tris.HCl pH 8,3, 2,5 mM EDTA, 90 mM borsyre)puffer. DNA båndene farves med ethidiumbromid og gøres synlige ved belysning med 15 langbølget ultraviolet lys ved 366 nm. Det stykke agarose, som indeholder 3738 bp fragmentet, udskæres fra gelen, bringes på væskeform ved 65°C, indstilles på 500 mM NaCl og inkuberes ved 65°C i 20 minutter. Der tilsættes 1 rumfang phenol (bragt i ligevægt med 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl). Den vandige fase genektraheres to gange med 20 phenol og én gang med chloroform. DNA'et fældes med 2,5 rumfang koldt absolut ethanol og opsamles ved centrifugering. DNA-massen vaskes med koldt 80%'s ethanol og tørres derpå i vakuum. DNA'et resuspenderes i TE i en koncentration på 0,15 mg/ml.

25 Det isolerede 3738 bp DNA-fragment har to såkaldte korte eller dobbeltstrengede ender som følge af dobbeltnedbrydninger- 34 DK 174905 B1 ne med Ball og PvuII. DNA'et cycliseres ved sammenbinding af de dobbeltstrengede ender. 0,6 yg DNA inkuberes natten over ved stuetemperatur i 30 yl 60 him Tris.HCl pH 7,.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4mM ATP og 900 enheder T4 DNAJligase (Bio-5 labs). 5 yl alikvoter af bindingsblandingen blandes med 50 yl calciumbehandlet, transformationskompetente Escherichia coli HB101 celler, fremstillet linder anvendelse af fremgangsmåden ifølge Mandel et al. (29). Blandingen holdes på is i 5 minutter, hvorefter den inkuberes i 2 minutter ved 37°C og hen- 10 står i 10 minutter ved stuetemperatur inden den anbringes

R

LB agarplader indeholdende 100 yg/ml ampicillin. 6 amp kolonier udtages og dyrkes hver for sig i 100 ml LB-medium {som ovenfor, men uden agar) indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles ud fra cellerne under anvendelse af 15 den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde. Restriktionsnedbrydninger med Haelll (fra Biolabs, nedbrydningsbetingelser som anbefalet af leverandøren), PvuII og Ball af plasmiderne analyseres på en 1,5%’s agarose-gel i TBE puffer. Restriktionsmønsteret og den beregnede størrelse af det nyligt dan-20 nede samlings fragment indicerer, at plasmiderne er identiske og indeholder alle pBR322 sekvenserne bortset fra Ball-PvuII fragmentet. Disse plasmider mangler Ball restriktionsstedet og betegnes derfor som pBR322ABalI.

b) Kloning af et gær .5,1 kb BamHI restriktionsfragment inde-25 holdende PH05 og PH03 i pBR322 Ball pJDB207/PH05,PH03 (se fig. 1) indeholder en gær 5,1 BamHI indsætningsdel med generne for reguleret og strukturmæssig gær sur phosphatase (PH05 og PH03). pJDB207/PHO5,PHO3 samt plasmid pBR322ABalI nedbrydes med restriktionsendonuklease 30 BamHI. Efter fuldstændig nedbrydning inaktiveres enzymet i · 2 minutter ved 65°C. Begge DNA'er fældes med ethanol og re-suspenderes i 10 mM Tris.HCl pH 8,0 ved en koncentration på 0,2 mg/ml. 0,5 yg af de to BamHI-nedbrudte DNA'er kombineres og bindes i 20 yl bindingspuffer (soro anbefalet af New Eng-35 land Biolabs} indeholdende 300 enheder T4 DNA ligase i 20 ti- 35 DK 174905 B1 mer ved 15°C. 5 μΐ alikvoter af bindingsblandingen sættes til 50 μΐ calciumbehandlet E.coli HB101 celler, og transformeringen gennemføres på samme måde som beskrevet i eksempel 4a. De transformerede Escherichia coli celler testes for

- R S

5 resistens mod ampicillin og tetracyclin. 8 amp , tet kolonier isoleres og dyrkes i 100 ml LB medium indeholder 100 pg/ml ampicillin. Plasmid DNA isoleres fra cellerne (se eksempel 2). Restriktionsnedbrydninger med BamHI viser, at 4 plasmider indeholder en 5,1 kb indsat del foruden 10 3,7 kb vektorfragmentet (pBR322ABalI). Restriktionsnedbryd ninger med Sall (New England Biolabs) fastlægger orienteringen af det indsatte 5,1 kb fragment: 2 plasmider har den indsatte del orienteret som vist i fig. 4. Et af disse betegnes som p30. Transskriptionsretningen i PH05, PH03 gener-15 ne i 5,1 kb indsætningsdelen er mod uret som vist i fig. 4.

Eksempel 5.

IndsAning af fremmed DNA i p30 (se fig. 4) a) Isolering af et 3,9 kb EooRI-Ball fragment af p30 (fragment A) 10 ug p30 DNA nedbrydes med restriktionsendonuklease Ball.

20 Efter ekstraktion med phenol/chloroform fældes DNA'et med ethanol. DNA'et resuspenderes i 100 yl TE puffer. Restriktionsfragmenterne adskilles på en præparativ 0,8% lavt smeltende agarose-gel (Sigma) . Et 5,1 kb fragment indeholdende vektordelen af p30 elueres fra gelen på samme måde som be-25 skrevet i eksempel 4a. DNA'et renses ved adsorption af DNA*et på en DE52 (Whatman) ionbyttersøjle i en puffer med lavt saltindhold (150 mM NaCl, 19 mM Tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) og efterfølgende eluering med en pufferopløsning med stort saltindhold (1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 8,0 og 1 mM EDTA).

30 DNA'et fældes med ethanol, hvorefter det yderligere nedbrydes med EcoRI (Boehringer). 3,9 kb EcoRI-Ball restriktions fragmentet adskilles igen på en præparativ 0,8% lavt smeltende agarose-gel, genvindes som beskrevet i eksempel 4a og fældes med ethanol. Dette DNA-fragment kaldes fragment A.

37 DK 174905 B1 eksempel 4a)). Blanderne anbringes på LB agarplåder tilsat 100 yg/ml ampicillin. Pladerne inkuberes ved 37°C i 16 timer.

Der fremstilles ca. 300 ampicillinresistente kolonier af Escherichia coli HB101. Plasmid DNA fra 8 ampicillinresisten-5 te kolonier isoleres, analyseres, og deres struktur bestemmes ved sammeligning af bevægeligheden af restriktionsfragroenter-ne fremkommet efter spaltning med EcoRI og Haelll med standard DNA [bakteriofag λ DNA nedbrudt med Hindlll (New England Biolabs), p30 plasmid DNA nedbrudt med Haelll og EcoRI). Efter 10 verificering af strukturen af samlingerne fås 5 plasmider, som har den korrekte struktur. Et af disse plasmider, som indeholder PH05 promotoren bundet til 8^-interferon-polypeptid-kodningsområdet (se fig. 5) kaldes p30IFNl(8^).

Eksempel 6.

15 Addition af kopieringsomr&de og selektiv markør for gær (se fig. 4) a) Isolering af et 1,5 kb EcoRI fragment fra plasmid Yrp7 og binding deraf til plasmid p30IFNl(8£)

For at lette bindingsreaktionen renses 1,5 kb EcoRI restrik-20 tionsfragmentet. .Plasmid Yrp7 (4) spaltes med EcoRI, de to fremkomne fragmenter adskilles på en 0,8% agarose-gel, og 1,5 kb fragmentet, som indeholder et autonomt kopierende gærsegment, og gær TRPl-genet renses og isoleres under anvendelse af den i eksempel 4a) beskrevne fremgangsmåde. Der foreta-25 ges binding (som anbefalet af New England Biolabs) med 20 yg/ml EcoRI "cut" p30IFNl(8p og 10 yg/ml af 1,5 kb EcoRI restriktionsfragmentet fra Yrp7, idet der anvendes 100 enheder T4 ligase.

b) Transformering af Escherichia coli JA 194 med de bundne frag-30 menter

Plasmider indeholder TRP1 gær-genet kan direkte selekteres ved transformation af Escherichia coli trpC mutants tamme JA 194 38 DK 174905 B1 (trpC, leuB,Bl). Escherichia coli trpC genet koder for Escherichia coli N-(5 '-phosphoribosyl)-rathranilat-isomerase. Escherichia coli trpC mutanter kan komplementer es med gær TRP1 genet (4). Transformeringen af Escherichia coli stamme JA 194 5 gennemføres på samme måde som beskrevet for Escherichia coli HB101 (se eksempel 4a)) med følgende ændring: inden anbringelse af blandingerne på agarplader henstilles cellerne i 1 ml LB medium ved 37°C i 60 minutter, cellerne vaskes én gang med Escherichia coli M9 minimal medium (30) og anbringes på 10 M9 minimal mediumplader tilsat .vitamin Bl (1 yg/ml) og L-leu-cin (20 mg/ml). Pladerne inkuberes i 2 dage ved 37°c. Der udvindes ca. 1000 tryptophan prototrofe Escherichia coli kolonier .

c) Isolering og karakterisering af hybrid plasmider 15 Trp+ kolonier renses på LB plader tilsat 100 yg/ml aropicillin.

De enkelte kolonier udtages, og plasmiderne isoleres under anvendelse af den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde. Rensede plasmider analyseres ved bestemmelsen af størrelsen af restriktionsfragmenterne dannet efter spaltning med EcoRI, 20 Hindlll, PstI og Bglll (Biolabs). Der fås to forskellige typer plasmider, som indeholder 1,5 kb EcoRI restriktionsfragmentet i de to mulige orienteringer (se fig. 4). De kaldes p30IFN2(8£) og p30IFN2'(8£) som angivet i fig. 4.

Eksempel 7.

25 Transformering af Saccharomyces cerevisiae RH971 og inducering af interferon-produktionen

Plasmider p30IFN2(8p og p30IFN2'(8£) indføres hver for sig i Saccharomyces cerevisiae stamme RH971 (a, trpl, leu2, his4) på samme måde som beskrevet af Hinnen et al. (1). 1 yg plasmid 30 DNA sættes til 100 yl af en sfæroplastsxispension, og blandingen behandles med polyethylenglycol som beskrevet (1) . Sfæroplaster blandes med 10 ml regenereringsagar og anbringes på plader med gær-minimal-medium uden leucin. Efter inkubering 39 DK 174905 B1 i 3 dage ved 30°C fås ca. 1000 transformerede celler.

En enkelt gær-koloni fra gær-transformationspladerne [betegnet henholdsvis Saccharomyces cerevisiae RH971/p3QIFN2(8^) og /p30IFN2'(8£)J udtages og anbringes i 10 ml gær-minimal-medium 5 i en 100 ml Erlenmeyer-kolbe og dyrkes ved 30°C og 200 omdr./min. i 24 timer til en tæthed på ca. 2-3 x 107 celler/ml. Cellerne vaskes en gang med 20 ml lav-P^ minimal-medium. 3 ml af de re-suspenderede celler anvendes til inokulering af henholdsvis 300 ml lav-P^ minimal-medium og 300 ml normal minimal-medium 10 i 1000 ml Erlenmeyer-kolber. Inkuberingen gennemføres ved 30°C og 160 omdr./min. Induceringen af PH05 promotoren følges ved at måle forekomsten af sur phosphatase aktivitet i hele celler som beskrevet af Toh-e et al. (31). Cellerne dyrkes til ca. 1-2 x 10 7 celler/ml (26-30 timers inkubering).

15 Eksempel 8.

Fremstilling af gærcelleekstrakter og bestemmelse af interferon indholdet.

Celler fra 300 ml dyrkningsmediet (se eksempel 7) med en tæt- 7 hed på 1-2 x 10 /ml isoleres ved centrifugering i en Sorvall 20 GSA rotor i 5 minutter ved 8000 omdr./min. ved 4°G. Cellerne vaskes én gang med 100 ml vand, resuspenderes i 6 ml iskold lyseringsblanding [0,1 M kaliumphosphatpuffer pH 7,4, 1% (rum-fang/rurafang) Triton X-100,0,0001M PMSF (Merck)] og overføres til et 30 ml corex rør. Suspensionen centrifugeres atter i 25 5 minutter i en Sorvall SS-34 rotor ved 8000 omdrejninger ved 4°C, hvorefter der foretages resuspendering i 3 ml lyseringsblanding ved 0°C. 4 g glasperler (0,4 mm i diameter) sættes til cellerne, og suspensionen rystes på et hvirvelblandeappa-tur (Scientific Instruments Inc., USA) med fuld hastighed i 30 30 sekunder, hvorefter der afkøles i 1 minut i et isbad. Denne rystningsprocedure gentages 5-10 gange, indtil mere end 90% af cellerne er lukket op (kontrol under lysmikroskop). Cellerester og glasperler fjernes fra opløsningen ved centrifugering i 10 minutter ved 8000 omdr./min. ved 4°C i en Sorvall 40 DK 174905 B1 HB-4 rotor. Supernatanten overføres til Eppendorf-rør, fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -60°C. Interferonaktiviteten bestemmes under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Armstrong (32) og under anvendelse af CCL-23 celler og vesi-5 culær stomatitis virus (VSV) som challenger virus. Resultaterne er anført i nedenstående tabel 1.

Tabel 1

Interferonaktivitet i Saccharomyces cerevisiae stamme RH971 efter transformation med rekombinant plasmiderne henholdsvis 10 p30IFN2(8p og p30lFN2'(8|) og tillige med plasmid pJDB207 /IFN2'(8|) (se eksempel 9).

Interferonaktivitet udtryk i enh./ml gærcelleekstrakt

Plasmid p30lFN2(8£) p30lFN2’(8£) pJDB207/lFN2 ’ (8^' 15 slukkede betingelser 0 30 100 (normalt phosphatindhold) ikke-slukkede betingelser (lavt phosphatind- 700 7000 50000 20 · hold)

Eksempel 9.

Indsættelse af interferon-genet i højkopierings-gær 2jj vektoren pJDB 207 (se fig. 6)

Plasmid p30IFN2'(8|) nedbrydes med restriktionsendonukleaserne 25 Hindlll og BamHI under anvendelse af leverandørens specifikationer (Biolabs). Der dannes to fragmenter med størrelsen 4,0 kb og 2,0 kb. 2,0 kb restriktionsfragmentet isoleres og renses ved elektroforese på lavt smeltende agarose-gel som beskrevet under trin 4a).

41 DK 174905 B1

Plasmid pJDB207 (28) nedbrydes med restriktionsendonukleaser-ne Hindlll og BamHI. Der dannes tre fragmenter. 6,5 kb restriktionsfragmentet adskilles på samme måde som beskrevet ovenfor.

5 0,3 g af 2,0 kb fragmentet (indeholdende PH05 promotoren bun det til interferonrrprotein-kodningsområdet) bindes i 15 timer til 6,5 kg vektorfragmentet i et samlet rumfang på 20 yl under anvendelse af 300 enheder T4 DNA ligase under de af leverandøren (Biolabs) foreskrevne betingelser. Escherichia coli 10 HB101 celler transformeres, og ampicillinresistente kolonier udvælges. Plasmid DNA'et isoleres, og den korrekte struktur af det isolerede plasmid DNA verificeres ved restriktionsnedbrydninger under anvendelse af Hindlll og BamHI med p30IFN2' (8£) og pJDB207 nedbrudt med de samme enzymer som mole-15 kylvægtstandarder. Det dannede nye plasmid betegnes PJDB207/IFN2' (8£) .

Plasmid pJDB207/IFN2'(8^) transformeres til Saccharomyces cere-visiae stamme RH971 på samme måde som beskrevet (1) under udvælgelse af leucinprototrofe kolonier. En enkelt leucinproto-;: 20 trof gærkoloni [betegnes Saccharomyces cerevisiae RH971/ pJDB207/IFN2' (8£)] udtages og dyrkes på samme måde som beskrevet i eksempel 7. Interferonindholdet bestemmes på samme måde som beskrevet i eksempel 8. Resultaterne er anført i tabel 1.

Eksempel 10.

25 Fremstilling af Escherichia coli stammer transformeret med re-kombinant plasmider indeholdende kodningsområderne for humane lymfoblastoide .interferoner A. Isolering af poly(A) RNA beriget med HuIFN mRNA (fig. 7) a) Inducering af Namalwaceiler 30 Namalwaceiler dyrkes i dyrkningsmediet RPMI 1640 indeholdende 10%*s føtal kalveserum ved 37°C. Når der er nået en celletæt- 42 DK 174905 B1 hed på 3 x 10^ celler/ml, centrifugeres suspensionen ved 800 G i 10 minutter ved stuetemperatur. De isolerede celler resuspenderes i 200 ml dyrkningsmedium indeholdende .glutamin (0.027 rumfangsprocent), penicillin (200 enheder/ml) og strep-5 tomycin (50 g/ml). Cellerne inkuberes i 90 minutter ved 37°C med Newcastle disease virus (NDV 110) ved et forhold på 190 HAU/10^ celler (HAU: hæmagglutinationsenheder). Ved tilsætning af frisk dyrkningsmedium indstilles celletætheden

på 1,3 x 10^ celler/ml, og cellesuspensionen rystes ved 34°C

g 10 med 100 omdr./min. Efter 12 timers forløb isoleres 6 x 10 celler, som resuspenderes i 50 ral phosphatpufret saltopløsning ("PBS", 1 liter PBS indeholder 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPQ^ og 2 g KH^PO^). Inden cellerne isoleres, udtages en prøve, og interferonaktiviteten bestemmes i overensstemmelse 15 med fremgangsmåden ifølge Armstrong (32) under anvendelse af humane CCL-23 celler og vesiculær stomatitis virus (VSV) som challenger virus. Interferonaktiviteten bestemmes til 4300 IFN enheder/ml.

b) Sprængning af cellerne og deproteinisering g 20 Cellesuspensionen (6 x 10 celler i 50 ml PBS) sættes ved stuetemperatur til 800 ml lyseringspuffer bestående af 0,05 M Tris.HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 5 iriM EDTA og 2% SDS- (krystallinsk research kvalitet, Serva). Lysatet nedbrydes med 0,2 mg/ml præinkuberet (2 timer ved 37°C) protease (Protease P, type VI, 25 Sigma) ved stuetemperatur i 1 timer under omrøring af opløsningen. Opløsningen deproteiniseret ved ekstraktion med 3 gange 500 ml phenol mættet med TNE og med 5 ganga 500 ml chloroform. Der fås 500 ml nukleinsyrer bestemt ved absorbansen ved 260 nm.

c) Fjernelse af kontaminerénde DNA og RNA

30 Den let viskose vandige opløsning fremstillet som beskrevet ovenfor (trin Ab) indstilles på 0,3 M NaCl, og der tilsættes 1 g oligo(dT)-cellulose (type 7, P-L Biochemicals). Efter om-, røring i 30 minutter ved stuetemperatur centrifugeres suspensionen i 1 liter Sorvall flasker i en Sorvall RC-3 centrifuge 35 ved 4000 omdr./min. i 10 minutter ved stuetemperatur, og 43 DK 174905 B1 oligo(dT) celluloseopslæmning vaskes to gange med 40 ml 2 gange TNE indeholdende 0,5% SDS. Det bundne poly(A) RNA elueres derpå ved vaskning med 5 gange 2,5 ml H20. Udbyttet er 720 yg poly(A) RNA, hvilket bestemmes ved måling af den 5 optiske tæthed. Supernatant RNA-opløsningen fra den første adsorption adsorberes endnu en gang på 1 g oligo (dΓ) cellulose, og der elueres som beskrevet ovenfor, hvorved der fås 320 yg poly (A) RNA. Eluaterne hældes sammen, indstilles til TNE, og poly(A) RNA'et fældes med 67%'s ethanol ved ~20°C 10 i 10 timer. RNA'et isoleres ved centrifugering med 10.000 omdr./min. i en'Sorwall RC-5B centrifuge i 10 minutter ved 0°C. Bundfaldet (1 mg) genopløses i 1 ml 1 mM EDTA.

RNA'et analyseres for HuIFN mRNA aktivitet ved injektion i oocyter fra Xenopus laevis på følgende måde: 15 50 ni af RNA-opløsningen injiceres til hver enkelt af en grup pe på 20 oocyter. Oocyterne inkuberes i Barth-medium (2 mM Tris, 88 mM NaCl, 1 mM KC1, 0,33 mM Ca (NC>3) 2 .H20, 0,41 mM CaCl2.2H20, 0,82 mM MgS04.7H20, 2,4 mM NaHCO^, 0,01 mg/ml penicillin, 0,01 mg/ml streptomycin, idet opløsningen er 20 indstillet på pH-værdien 7,6 med HCl) i overensstemmelse med Gurdon (33), Barth (34) og Colman et al. (35). De injicerede oocyter inkuberes i 42-48 timer, og inkubationsmediet udtages, centrifugeres i 5 minutter i en Eppendorf-eentrifuge, og supernatanten anbringes ved -20°C eller -80°C, indtil den 25 skal anvendes til analysen. IFN-aktiviteten bestemmes i alt væsentligt '.ved e fremgangsmåden ifølge Armstrong (32) , idet der dog anvendes VSV som challenger virus på Hep-2-celler (Flow Laboratories) . Oocytekstrakten har en specifik aktivitet på 600 IE interferon pr. yg RNA injiceret.

30 d) Berigelse af poly(A) RNA'et med HuIFN mRNA

Poly(A) RNA'et ledes gennem en Chelex-100-sØjle (200-400 roesh, Bio-Rad) med et lejerumfang på 0,5 ml. Søjlen skylles med 1 ml 1 mM EDTA.

DK 174905 B1 44

Eluatet (1 mg poly(A) PNA i 2 ml EDTA) opvarmes i 2 minutter til 100°C og underkastes centrifugering gennem en saccharose-densitets gradient (6 portioner 14 ml saccharoseopløsning med en saccharosekoncentration, der stiger fra 5 til 23% (m/v) 5 og indeholder 50 mM Tris.HCl (pH-værdi 7,5), 0,2 M NaCl og 1 mM EDTA). Centrifugeringen gennemføres i en TST 41-rotor (Kontron AG) med 35.000 omdr./min. i 16 timer ved 5°C. Der opsamles 0,3 ml fraktioner med en ISCO gradient-opsamler.

Til hver fraktion sættes 2 rumfang ethanol, og opløsningen 10 henstår i 10 timer ved -20°C. Det udfældede mRNA fracentrifugeres (Sorvall, HB-4 rotor ved 0°C, 10·.000 omdr./min. i 10 minutter) . Bundfaldet fra hver fraktion genopløses i 25 1 1 mM EDTA, og hver fraktion testes for human IFN mRNA-akti-tet som beskrevet ovenfor (trin Ac), idet der kun injiceres 15 10 oocyter pr. RNA-prøve i stedet for 20. Resultaterne er anført i den efterfølgende tabel 2.

45 DK 174905 B1

Tabel 2

HuIFN mRNA aktivitet for fraktioner af saccharose-densitets gradient.

Fraktion nr. IFN aktivitet (enh./ml) 5 1-18 19 162 20 162 21 162 22 162 10 23 ikke testet 24 729 25 ikke testet 26 405 27 ikke testet 15 28 486 29 ikke testet 30 162 31 ikke testet 32 162 20 33 ikke testet 34 54 35-40 ikke testet

Fraktionerne 23-29 hældes samme, og poly(A) RNA’et renses yder ligere på følgende måde: 25 Poly(A) RNA opløsningen indstilles til 2 x TNE i 0,5%'s SDS og sættes til ,en 200 yl oligo(dT) cellelulosesøjle. Søjlen vaskes med 2 ml 2 x TNE i 0,5%’s SDS, og poly(A) RNA'et elue-res ved vaskning med 5 gange 0,5 ml ϊ^Ο. Eluatet indstilles til TNE, og opløsningen ekstraheres 2 gange med et lige så 30 stort rumfang phenol (mættet med TNE) og 2 gange med et lige så stort rumfang chloroform. Poly(A) RNA'et fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 10 timer og iéoi-eres ved centrifugering i en HB-4-rotor som beskrevet ovenfor.

46 DK 174905 B1

Poly (A) RNA'et opløses i 100 vi 0,5 mM EDTA. Udbyttet er 40 ug bestemt ved måling af den optiske tæthed.

En prøve af poly(A) RNA'et analyses for human IFN-aktivitet som beskrevet ovenfor under anvendelse af 20 oocyter pr. ana-5 lyse. Poly(A) RNA præparatet har en specifik aktivitet på 8100 IE interferon pr. y<g RNA.

B· Fremstilling af dobbeltkædet cDNA (fig. 7)

Poly(A) RNA beriget med HuIFN mRNA (jfr. trin Ad) anvendes som skabelon til fremstilling af dobbeltkædet cDNA i alt 10 væsentligt som beskrevet af Efstratiadis et al. (36 ) , Mania-tis et al. (37) og Hoeijmakers et al. (38)* a) Syntese af første kæde 250 yl reaktionsblanding indeholdende 40 mM Tris.HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 5 mM MgCl0, 0,5 mM DTT (Calbiochem.) , i 32

15 1 mM dGTP, dCTP, dTTP (P-L· Biochemicals) og 1 mM P-cLATP

(Amersham, specifik aktivitet 50.000 cpm/nmol), 20 ug/ml oligo (dT) -^2-18 Biochemicals), 40 ug/ml poly(A) RNA

og 100 enheder aviært myeloblastosis virus (AMV) revers-transskriptase (Life Science.^ Inc., St. Petersburg, Florida) 20 inkuberes i 80 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved at indstille opløsningen på 10 mM EDTA og 0,1% SDS. Blandingen ekstraheres en gang med 1 rumfang phenol. Den vandige fase reekstraheres med 1 rumfang chloroform og sættes til en kolonne med 3 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, fine) .

25 Der udtages fraktioner på 0,1 ml. Radioaktiviteten af hver fraktion bestemmes ved måling af Cerenkov-strålingen. Radioaktive fraktioner hældes sammen, og nukleinsyrerne fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 10 timer. Prøven centrifugeres i en HB-4-rotor i 20 minutter ved 10.000 omdr./min.

30 ved 0°C. Bundfaldet opløses i 95 yl H2O, 5 yl 10N NaOH

tilsættes, og blandingen inkuberes ved 25°C i 40 minutter.

Efter neutralisering med 5 M eddikesyre tilsættes 50 yl vand og 2 rumfang ethanol, og prøven henstår ved -20°C i 10 timer. Bundfaldet isoleres ved centrifugering som be-35 skrevet ovenfor og genopløses i 200 ul 0,1 mM EDTA. Udbyttet af enkeltkædet cDNA er 3,7 yg. Størrelsen af cDNA'et 47 DK 174905 B1 er 700-1.500 nukleotider i længden, bestemt ud fra dets elektroforetiske mobilitet i en 6%'s polyacrylamidgel i Tris-borat-EDTA (108 g Tris, 9,3 g dinatrium EDTA og 55 g borsyre pr. liter opløsning med pH-værdi 8,3) indeholdende 5 7 M urinstof, i forhold til markør DNA*er af kendt længde (39)* b) Syntese af anden kæde og S^-endonukleasenedbrydning

Den dannede cDNA-opløsning opvarmes til 100°C i 90 sekunder, lynafkøles og inkuberes i en 400 yl reaktionsblan-10 ding indeholdende 0,1 M kaliumphosphatpuffer (pH-værdi 6,9), 10 mM MgCl-, 10 mM DTT (Calbiochem), 1 mM dATP, 1 mM dCTP, Δ 3 1 mM dTTP (P-L, Biochemicals), 1 mM H-dGTP (Amersham, specifik aktivitet 94.000 cpm/nmol) og 165 enheder/ml E.coli DNA polymerase I (Biolabs, New England) i 8 timer 15 ved 15°C. Reaktionen afsluttes ved tilsætning af EDTA og SDS til slutkoncentrationer på henholdsvis 10 mM og 0,1%. Blandingen ekstraheres med phenol og chloroform, kromato-graferes over Sephadex G-50 (Pharmacia, fine, 2 ml lejerumfang) og fældes med ethanol som beskrevet ovenfor (trin 20 Ba) .

Det dannede DNA behandles i en 50 yl inkuberingsblanding indeholdende 0,25 M NaCl, 50 mM natriumacetat (pH-værdi 4,5) og 1 mM ZnSO^ med 6 enheder S^-endonuklease (P-L Biochemi-cals) ved 37°C i 30 minutter. Reaktionen afbrydes med 25 0,1% SDS og 10 mM EDTA. Reaktionsblandingen deproteinise- res med 1 rumfang phenol (mættet i 50 mM natriumacetat, pH-værdi 4,5) og chloroform. Den vandige fase kromatogra-feres på en søjle med 2 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, fine) i TNE. Der opsamles fraktioner på 100 yl, og Cerenkov-strå-30 lingen bestemmes for hver enkelt fraktion. De udelukkede fraktioner hældes sammen, og DNA’et fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 10 timer soro beskrevet ovenfor. Bundfaldet centrifugeres i en HB-4-rotor (se ovenfor), og det isolerede bundfald opløses i 100 yl opløsning indeholdende 35 10 mM Tris.HCl (pH-værdi 7,5) og 0,5 mM EDTA. Der fås 4 yg DNA.

48 DK 174905 B1 DNA*et fraktioneres gennem en saccharose-densitetsgradient (5-23%) i 50 mM Tris.HCl (pH-værdi 7,5) og 1 mM EDTA i en TST-6O-rotor (Kontron AG). Centrifugeringen gennemføres ved 55.000 omdr./min. i 5 timer ved 15°C. Den DNA-fraktion, 5 som aflejres hurtigere end et 800 basepar markør DNA, som kører i en parallelgradient, hældes sammen/ indstilles til TNE og fældes med 67%»s ethanol ved-2Q°C i 10 timer.

Der fas 0,4 yg dobbeltkæde t c DNA.

C. Fremstilling af pBR 322-bundet c DNA (flg. 7) 10 a) Fremstilling af dCMP-forlanget OPNÅ 3’-enderne i 0,1 yg af det fremstillede ds cDNA forsynes med poly(dC)-haler i et reaktionsmedium på 10 yl indeholdende 100 mM natriumcacodylat (pH-værdi 7/2), 2,5 mM CoCl2, 50 yg BSA (Calbiochem.) pr. ml, 1 mM dCTP og 10 enheder 15 terminal-deoxynukleotidyltransferase (P-L Biochemicals) pr. yg ds cDNA. Efter inkubering (20 minutter ved 27°C) , tilsættes EDTA til 10 mM, og prøven henstår ved -20°C til senere anvendelse.

b) Fremstilling af Pst I-spaltet, dGMP-forlænget pBR 322 20 10 yg pBR 322 plasmid-DNA spaltes med 10 enheder Pst I

endonuklease (Biolabs) i en 10.0 yl opløsning indeholdende 50 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,5), 6 mM MgClj, 6 -mM 2-mercaptoethanol og 100 yg/ml gelatine i 1 time ved 37°C. Opløsningen ekstraheres med 1 rumfang phenol og chloroform.

25 Opløsningen indstilles til TNE,. og det lineariserede DNA fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 5 timer.

Det lineariserede plasmid-DNA forlænges med dGMP i en 200 yl reaktionsblanding indeholdende 100 mM natriumcacodylat (pH 7,2), 5 mM MgCl2, 20 mM NaH2P04, 50 yg BSA pr. ml, 1 mM 30 dGTP og 100 enheder terminal-deoxynukleotidyltranferase (P-L Biochemicals). Efter inkubering i 20 minutter ved 37°C tilsættes EDTA til 10 mM, og reaktionsblandingen fryses ved -20°C til senere anvendelse.

49 DK 174905 B1 c) Annelering af dGMP-forlænget pBR 322 til dCMP-forlæn- get ds cDNA_

En blariding af dCMP-forlænget dobbeltkædet cDNA (0,1 ug) og lineariseret pBR 322 med dGMP-haler (0,5 ug) i 500 yl 5 TNE-puffer inkuberes ved 65PC i 1 time, ved 46°C i 1 time, ved 37°C i 1 time og ved 20°C i 1 time. Opløsningen indeholdende pBR 322-bundet cDNA sættes på is og anvendes straks til transformeringen.

D. Transformering af Escherichia coli HB 101 med det anne- 10 lerede Hybridolasmid_

Calciumbehandlet Escherichia coli HB 101 forberedes til transformeringen ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Mandel et al. (29).

10 yl reaktionsblanding indeholdende de annelerede pBR 322 15 hybridplasmid DNA'er fremstillet som beskrevet ovenfor (trin Cc) sættes til en blanding indeholdende 150 yl calciumbehandlet Escherichia coli HB 101 i 10 mM MgClj/ 10 mM CaCl2 og 10 mM Tris.HCl (pH-værdi 7,5) i et. samlet rumfang på 200 yl.

20 Blandingen afkøles i is i 20 minutter, opvarmes til 42°C i 1 minut og inkuberes ved 20°C i 10 minutter. Der- tilsættes 1 ml tryptonmedium (tryptonmediet indeholder 10 g Bacto-Trypton (Difco), 1 g gærekstrakt (Difco), 1 g glucose, 8 g NaCl og 294 mg CaCl2«2..H20 i 1 liter destilleret vand), 25 og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 37°C ved rystning med 300 omdr./min. Blandingen udhældes på to agarplader (McConkey agar, Difco, 0,6 ml/plade) tilsat 10 yg/ml tetracyclin (Sigma). Pladerne inkuberes ved 37°C i 12-17 timer. Der fås ca. 5.600 tetracyclinresistente kolonier 30 af transformeret Escherichia coli HB 101.

E. Identificering af kloner indeholdende HuIFN cDNA

a) Syntese af en 13-mer oliqodeoxynukleotidprimer (fig. 8)

Et oligodeoxynukleotid, som er komplementært til et stræk (stretch) på 13 nukleotider, som er fælles for både HuIFN-35 a^- og HuIFN-B-mRNA, fremstilles kemisk ved anvendelse af 50 DK 174905 B1 phosphotriestermetoden (jfr. Itakura et al. (40) , de Rooi j et al. (41)). De enkelte trin i syntesemetoden er vist i fig. 8. Udgangsmaterialerne angivet i linie 1 i fig.. 8 (mono- og dideoxynukleotider med beskyttelsesgrupper) er 5 kendt fra litteraturen. Beskyttelsesgrupperne fraspaltes ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet af Itakura et al.: Deblokeringen af 5'-mo norne thoxy tri tyl (M>- eller -dime-thoxytrityl (D)-substituerede hydroxylgrupper gennemføres med eddikesyre (80%'s) ved stuetemperatur, og β-cyano-10 ethylphosphatgrupperne spaltes med 0,1 N natriumhydroxid i en blanding af dioxan og vand (4:1) ved stuetemperatur. Kondensationen af byggestenene gennemføres ved anvendelse af triisopropylbenzensulfonylchlorid som aktiveringsmiddel til dannelse af oligodeoxynukleotider op til den helt 15 beskyttede 13-mere primer anført i linie 7 i fig. 8 . Det sidste trin (fuldstændig fjernelse af alle beskyttelsesgrupper) gennemføres på følgende måde:

En opløsning indeholdende 64,6 mg af det helt beskyttede 13-mere oligodeoxynukleotid i 3 ml dioxan og. 1 ml acetoni-20 tril behandles med 200 mg syn-p-nitrobenzaldoxim og 124 mg N ,N ,N ,N -tetramethylguanidiiv og blandingen henstår i 27 timer. Der tilsættes 10 ml ammoniak (25%'s), og opløsningen henstår i 24 timer ved 50°C. Efter fordampning-af opløsningsmidlet i vakuum opløses remanensen i vand, indstilles 25 på pH-værdien 4 med eddikesyre, og opløsningen ekstra- heres 20 gange med chloroform. Den vandige opløsning inddampes i vakuum, og remanensen opløses i 1 ml eddikesyre j(80$rs). Opløsningen henstår i 1 time, fortyndes med 6 ml vand, ekstraheres 3 gange med chloroform og lyofiliseres.

30 Den tredje del af det dannede råprodukt renses ved kromatografi på DEAE-Sephadex A 25 (søjlestørrelse: 10x1,3 cm) gennem en 200 ml 0,2-1,2 M triethylamraoniumhydrogencarbonat-gradient. Eluering af hovedfraktionen forløber ved en gradientkoncentration på 0,87 M. Hovedfraktionen, der består 35 af det rene produkt, hvilket konstateres ved en HPLC-ana-lyse, fordampes tre gange med vand, filtreres gennem 10 ml Dowex 50 W (NH4-salt) og lyofiliseres. HPLC (permafase AAX, 51 DK 174905 B1 søjlestørrelse 90χ0,3 cm, 60°C, 2 ml/min., gradient: A = 0,005 M KH2P04, B * 0,5 M KH2PC>4, 0,5 M KC1, pH 4,5, 20% A -^ 100% B på 30 min.): tR 11,8 min.

32 b) Fremstilling af en P-mærket human IFN-α- og IFN-β- 5 specifik cDNA-sporinqsdel (fig. 9)_ 40 pmol af den syntetiske 13-mere oligodeoxynukleotidprimer (jfr. trin Ea) og 40 pmol [y-^P]-ATP (5.700 Ci-mmol Amersham) kombineres i 100 yl 50 mM Tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2 og 5 mM DTT. Der tilsættes 50 enheder T4~poly-10 nukleotidkinase (P-L Biochémicals), og efter 30 minutters forløb ved 37°C tilsættes yderligere 20 enheder af enzymet, hvorefter inkuberingen fortsættes i yderligere 15 minutter ved 37°C. Den vandige opløsning indeholdende den 22P-mærke-de primer renses ved ekstraktion med phenol. Yderligere 15 rensning opnås ved kromatografi på en 4 ml Sephadex G-50 (Pharmacia, fine)-søjle i 1 mM Tris.HCl (pH 8,0). Der opsamles fraktioner på 0,1 ml. Radioaktiviteten for hver fraktion bestemmes ved måling af Cerenkov-strå1ingen. Der opnås en specifik aktivitet på 4.10** Cerenkov com pr. pmol 20 oligodeoxynukleotid. Den ^2P-mærkede primer (40 pmol) lyo-filiseres, resuspenderes i 91 yl H20 indeholdende 14 yg poly(A) RNA (fra Inducerede Namalwaceller, fremstillet som beskrevet i trin A) og opvarmes i 60 sekunder til 100°C.

Der tilsættes 9 yl 4 M KCl, og blandingen inkuberes ved 25 25°C i 60 minutter. Der tilsættes 450 yl reverstransskripta- seblanding, således at reaktionsrumfanget indeholder 40 mM Tris.HCl (pH 8), 4 mM MgCl2# 1 mM DTT (Calbiochem, Inc,), 74 mM KCl, 1 mM af dATP, dGTP, dCTP og dTTP (P-L Bioche-micals) og 90 enheder aviært myeloblastosisvirus (AMV)-30 reverstransskriptase. Inkubationen fortsættes i 1 time ved 37°C. Opløsningen ekstraheres med 1 rumfang phenol (mættet med hensyn til TNE), og nukleinsyrerne fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C i 10 timer. Bundfaldet isoleres ved centrifugering (HB-4-rotor, 20 min., 10.000 omdr./ 35 min., 0°C), hvorpå det genopløses i 20 yl farveblanding indeholdende 90% (rumfang/rumfang) formamid (Merck, pro analysis), 1 mM EDTA, 0,05% bromphenolblåt og 0,05% xylencyanolblåt- Prøven opvarmes til 90°C i 2 minutter og 52 DK 174905 B1 sættes til en 5%'s polyacrylamidgel i Tris-borat-EDTA (jfr. Peacock et al. (39.)}. I autodiagrammet ses et enkelt bånd, som migrerer mellem 267 bp- og 435 bp- P-mærkede markør DNA-fragmenter dannet ved Hae Ill-nedbrydningen af 5 plasmidet pBR 322. Det P-mærkede cDNA-fragment ekstra-heres fra gelen og renses som beskrevet af Mueller e.t al.

(42). Der fås 20.000 Cerenkov cpm af den ^P-mærkede humane IFN-α- og IFN-3“Specifikke cDNA-sporingsdel.

c) Testning for kolonier indeholdende HulFN cDNA (fiq. 9) 10 1650 af de transformante kolonier fremstillet som beskrevet ovenfor (trin D) overføres til nitrocellulosefiltre BA 85 (Schleicher & Schuell, diameter 8 cm). Cellerne lyseres, og DNA'et denatureres og fikseres til filtrene in situ under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Grunstein og Hog-15 ness (20). Filtrene med kolonierne præhybridiseres i 4 x SET (en opløsning indeholdende 0,15 M NaCl, 30 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA), 0,1% (vægt/rumfang) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,1% (vægt/rumfang) polyvinylpyrrolidon (PVP-360, Sigma), 0,1% (rumfang/rumfang) BSA, 0,5% SDS, 50 yg/ml 20 denatureret kalve thymus DNA (fremstillet som følger: 5 mg kalve-thymus DNA (type I, Sigma) koges i 10 minutter i 0,5 M NaOH til forskydning af DNA'et, neutraliseres med 5 M eddikesyre og fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C. Bundfaldet isoleres ved centrifugering i en HB-4-rotor i 10 25 minutter ved 0°C og genopløses i 500 yl 0,5 mM EDTA) ved 65°C i 4 timer under anvendelse af 20 ml blandinger pr.

3 32 filter og hybridiseres med 10 Cerenkov cpm af den P-mærkede sporingsdel pr. nitrocellulosefilter i 5 x SET, 0,02% (vægt/rumfang) Ficoll, 0,01% polyvinylpyrrolidon, 30 0,02% (rumfang/rumfang) BSA, 0,2% SDS og 50 yg/ml dena tureret kalve-thymus DNA. Hybridiseringen gennemføres ved 65°C i 36 timer.

Filtrene skylles en gang i chloroform, to gange i SET, 0,5% SDS ved stuetemperatur og to gange i SET, 0,5% SDS 35 il time ved 60°C og en gang med 3 mM Trizma-base ved stuetemperatur i 1 time. Filtrene tørres ved aftrykning på 3 MM-papir (Whatman), og en røntgenfilm eksponeres med 53 DK 174905 B1 filtrene under anvendelse af en skærm (Ilford intensifying screen) ved -80°C i 72 timer.

Ni positive kolonier identificeres på autoradiogrammet, og de anvendes til fortsat undersøgelse.

5 Da de primære kloner af transformerede celler lejlighedsvis indeholder mere end én art rekombinant DNA-molekyler, isoleres hybridplasmid DNAerne fra de ni positivt hybridiserede kloner og anvendes til retransformering af Escherichia coli hb-101 som beskrevet ovenfor.

10 Hybridplasmid DNA'et isoleres på følgende måde: 1 koloni anvendes til inokulering af 10 ral tryptonroediura tilsat 10 yg/ml tetracyclin som ovenfor i en 25 ml Erlenmeyer-kolbe.. Kulturen rystes i 15-18 timer ved 37°C med 300 omdr./min. Cellerne isoleres ved centrifugering (Sorvall, 15 HS-4-rotor, 10 min. med 4000 omdr./min-, 4°C). Der fås ca. 0,1 g celler, som resuspenderes i 1 ml 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). 0,25 ml lysozymopløsning (10 mg/ml i 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), lysozym fås fra sigma) tilsættes, og efter inkubering ved 0°C i 10 min. tilsættes 0,15 ml 0,5 M 20 EDTA (pH 7,5). Efter yderligere 10 minutter ved 0°C.til-! sættes 60 yl 2% Triton X-100 (Merck). Efter 30 minutters forløb ved 0°C centrifugeres prøven i 30 minutter ved 15.000 omdr./min. og 4°C i en Sorvall SA-600-rotor.

Den ovenstående væske deproteiniseres med 1 rumfangsdél·.

25 phenol (mættet med TNE). Faserne adskilles ved centrifugering (Sorvall HB-4-rotor) i 10 minutter ved 5.000 omdr./ min. ved 4°C. Den øvre fase ekstraheres to gange med 1 rumfangsdel chloroform. RNAse A fra pancreas (Sigma, 10 mg/ml i TNE, forvarmet i 10 minutter ved 85°C) tilsæt-30 tes til en slutkoncentration på 25 yg/ml, og blandingen inkuberes i 40 minutter ved 37°C. Opløsningen indstilles derefter på 1 M NaCl og 10% polyethylenglycol 6000 (Fluka, autoklaveret i 20 minutter ved 120°C) og inkuberes ved -10°C i 2 timer. Bundfaldet isoleres i en Sorvall 35 HB-4-rotor (20 minutter ved 10.000 omdr./min., 0°C) og genopløses i 100 yl TNE. DNA-opløsningen ekstraheres med 54 DK 174905 B1 1 rumfang phenol# og DNA'et fældes med 2 rumfang ethanol ved -80°C i 10 minutter.

Bundfaldet fracentrifugeres i en Eppendorf centrifuge, og DNA'et genopløses i 20 μΐ 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) 5 og 0,5 mM EDTA. Fra 10 ml kultur fas 8-10 μ g hybrid-plas-mid DNA.

Escherichia coli HB-101 transformeres med hvert enkelt af de ni isolerede hybrid DNA'er, og de transformerede celler overføres til agarplader indeholdende tetracyclin, som 10 beskrevet ovenfor (trin 4) . Fra hver transformering udtages tre tetracyclinresistente kloner, 10 ml kulturer fremstilles, og hybrid DNA'erne isoleres fra kulturerne som beskrevet ovenfor.

Alle DNA-prøverne analyseres før og efter retransformeringen 15 ved spaltning med Pst I endonuklease og elektroforese gennem en 1% agarosegel i 50 mM Tris-acetat (pH 7,8) og 1 mM EDTA. Alle prøverne udviser identiske spaltningsmønstre før og efter retransformationen.

Et af de reklonede rekombinant DNA-roolekyler giver 2 bånd, 20 et med mobiliteten af Pst I-spaltet pBR 322, det andet med en mobilitet svarende til ca. 1000 bp. Det betegnes CG-pBR 322/HLycIFN-l'b.

Et andet rekombinant DNA giver 3 bånd, et med mobiliteten for Pst I-spaltet pBR 322, et med en mobilitet på ca. 600 bo 25 og et med en mobilitet, på ca. 150 bp. Rekombinant DNA-mo-lekylet i denne klon betegnes CG-pBR 322/HLycIFN-f3^.

d. Karakterisering af klonerne CG-pBR 322/HLycIFN-l'b og CG-pBR 322/HLycIFN^

Rekombinantplasmid DNA'erne fra klonerne CG-pBR 322/HLyc-30 IFN-l'b og CG-pBR 322/HLycIFN-fJ^ isoleres fra kulturerne som beskrevet ovenfor (trin Ec) og karakteriseres ved bestemmelse af nukleotidsekvensen af den indsatte cDNA-del under anvendelse af fremgangsmåden som beskrevet af Maxam og Gilbert (15). I princippet anvendes følgende 55 DK 174905 B1 metode:

Det isolerede rekombinantplasmid DNA nedbrydes med forskellige restriktionsendonukleaser. Enzymerne anvendes i alt væsentligt som beskrevet af leverandøren (New England 5 Biolabs)r idet dog BSA erstattes med gelatine i enzympufferne. Opløsningen indeholdende det spaltede DNA de-proteiniseres med phenol (mættet med TNE). DNA*et fældes med ethanol# genopløses i 50 mH Tris.HCl (pH 8,0)ved en DNA-koncentration på 50 yg/ml og inkuberes med 0,1 enhe-10 der alkalisk kalvetarmphosphatase (calf intestinal alkaline phosphatase) (Boehringer) pr. pmol DNA S'-ender i 30 minutter ved 37°C. Enzymet inaktiveres ved opvarmning af opløsningen i 60 minutter til 65°C. DNA'et renses ved DEAE-cellulosekromatografi som beskrevet af Mueller et 15 al. (42) og fældes med ethanol. DNA'et mærkes derpå 5'-terminalt med [γ- PJ-ATP {>5000 Ci/mmol, Amersham) og T4-polynukleotidkinase (P-L Biochemicals) i alt væsentligt som beskrevet af Maxam og Gilbert (15) , idet dog DNA'et ikke denatureres inden kinasereaktionen. Sædvan-20 ligvis er de specifikke aktiviteter 1-3.10**. cpm/pmol 5’-ender.

De mærkede DNA-fragmenter spaltes med en anden restrik-tionsendonuklease, og produkterne adskilles ved el-ektro-forese gennem en 6%, 8% eller 10% po ly ac ryl amidgel i Tris-25 borat-EDTA-puffer. DNA-fragmenterne ekstraheres fra gelen og renses som beskrevet af Mueller et al. (42). Til bestemmelsen af nukleo tidsekvenserne nedbrydes DNA-f ragmenterne kemisk, og produkterne adskilles ved polyacrylamid-gelelektroforese som beskrevet af Maxam og Gilbert (15).

30 Specielt behandles de isolerede plasmid DNA'er fra klonen CG-pBR 322/HLycIFN-l'b på følgende måde. 5 yg af plas-midet DNA nedbrydes med Bgl II, mærkes 5'-terminalt og spaltes med Pvu II. Pvu II-Bgl II*- og Bgl II-Pvu II*-DNA-fragmenterne isoleres på en 6% polyacrylamidgel. (* angiver 35 mærkningsstedet). Separat nedbrydes 5 ug af plasmidet med Alu I, markeres 5*-terminalt og spaltes med Pst I. Pst I-Alu I*-DNA-fragmentet isoleres på en 8% polyacrylamidgel.

56 DK 174905 B1

De enkelte fragmenter nedbrydes og sekvenseres derpå i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert. Den fremkomne nukleotidsekvens er angivet i fig.10.

Et stræk på ca. 25-35 deoxyguanosinrester er i 5'-enden 5 foran den indsatte cDNA-del. Den viste nukleotidsekvens ligner en del sekvensen af IFN-α (type F) cDNA beskrevet • af Goeddel et al. [(43), jfr. også Weissmann (44)], men den udviser ikke desto mindre en hel del tydelige afvigelser (punktmutationer), hvoraf nogle påvirker de resulte-10 rende aminosyrer (jfr. fig.10).

Det isolerede plasmid DNA fra klonen CG-pBR 322/HLycIFN-£^ behandles på tilsvarende måde. 5 pg af plasmidet nedbrydes med Pvu II og mærkes 5’-terminalt. Halvdelen af blandingen spaltes med pst I, og resten spaltes med Bgl II. pst I-15 Pvu II*- og Bgl II-Pvu II*-fragmenterne isoleres ved elek-troforese på en 6% polyacrylamidgel og nedbrydes som beskrevet ovenfor. Nukleotidsekvensen (N-terminalsekvens) er anført i fig. 5 og viser, at den indsatte cDNA-del begynder ved nukleotid nr. 102 i IFN-β^ cDNA’et som beskre-20 vet af Taniguchi et al. (45). Den indsatte cDNA-del er derfor i stand til at kode for human IFN-β^, som mangler 11 aminosyrer ved N-afslutningen. Den indsatte cDNA-del er flankeret ved 5'-enden af et stræk på ca. 20-25 deoxyguanosinrester og udviser en punktmutation ved stilling 25 153, hvori en C-rest omdannes til en T-rest uden påvirkning af den resulterende aminosyre.

e. Identificering af kloner indeholdende rekombinant DNA-molekyler, som kryds-hybridiserer til indsatte dele af CG-pBR 322/HLycIFN-l'b og CG-pBR 322/HLycIFN-^ 30 Rekombinantplasmid DNA*erne fra klonerne CG-pBR 322/HLyc-IFN-l'b og CG-pBR 322/HLycIFN-&1 isoleres fra kulturerne som beskrevet ovenfor (trin Ec). CG-pBR 322/HLycIFN-l'b plasmid-DNA'et (5 pg) nedbrydes med Bgl II, mærkes 5'-ter-minalt og spaltes med Pvu II. Separat nedbrydes det iso-35 lerede CG-pBR 322/HLycIFN-f3^ plasmid-DNA (5 pg) med Pvu II, mærkes 5'-terminalt og spaltes med Bgl II. Pvu II- 57 DK 174905 B1

Bgl II* (351 bp) DNA-fragmentet (prøve A) og Pvu II*-Bgl II (368 bp) DNA-fragmentet (prøve B) isoleres fra en 8% polyacrylamidgel som beskrevet ovenfor (trin Ed) og anvendes til in situ kolonihybridisering (se nedenfor).

5 Spaltningen af plasmid DNA'erne, mærkningen og rensningen af DNA-fragmenterne gennemføres på samme måde som beskrevet ovenfor (trin Ed).

4000 af de transformante kolonier fremstillet som beskrevet ovenfor (trin D) overføres til nitrocellulosefiltre 10 BA 85 (Schleicher & Schuell, diameter 8 cm). Cellerne lyseres, og deres DNA denatureres og fikseres til filtrene in situ ved fremgangsmåden ifølge Grunstein og Hog-ness (20). Hybridiseringer til prøverne A og B (begge prøver er blandede) foretages som beskrevet ovenfor (trin 15 Ec). Ved autoradiografi identificeres 6 positive kolonier, hvoraf 3 betegnes E. COli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-S^og E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8| 20 og anvendes til yderligere undersøgelser. Plasmid DNA'erne fra disse kloner isoleres, retransforroeres og reisoleres som beskrevet ovenfor (trin Ec, Ed).

For at bestemme naturen af de indsatte dele i rekombinant-DNA'erne foretages bestemmelse af nukleotidsekvenserne i 25 de indsatte cDNA-dele (delvis eller fuldstændigt) ved anvendelse af den ovenfor beskrevne almindelige fremgangsmåde (trin Ed).

Nærmere betegnet nedbrydes 5 ug af hver af de isolerede plasmid-DNA * er CG-pBR 322/HLycIFN-41 og CG-pBR 322/HLycIFN-30 8£ med Pvu II, mærkes 5’-terminalt og spaltes med Pst I.

DNA-fragmenterne fraktioneres på en 8% polyacrylamidgel, og Pst I—Pvu II* (-120 bp) fra 8^-DNA og Pst Ι-Pvu II* (82 bp) fra 4^-DNA isoleres som sædvanligt.

58 DK 174905 B1

Det isolerede plasmid-DNA CG-pBR 322/HLycIFN-5^ behandles på følgende måde. 5 pg af plasmid-DNA'et nedbrydes ' med Hae III, mærkes S’-terminalt og spaltes med Pst I.

Pst I-Hae III* (57 bp) DNA-fragmentet isoleres på en 10%'s 5 polyacrylamidgel. Separat nedbrydes 5 pg af plasmidet med EcoR 1/ mærkes 51-terminalt og spaltes med Pst I.

Pst Ι-EcoR I* (235 bp) og EcoR I*-Pst I (-700 bp) DNA-fragmenterne isoleres på en 8%’s polyacrylamidgel. De forskellige DNA-fragmenter underkastes sekvensanalyse 10 under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert (15) .

Nukleotidsekvenserne i de indsatte cDNA-dele er vist i fig.12-14.1 fig. 12 er nukleotidsekvensen i den indsatte cDNA-del af CG-pBR 322/HLycIFN-4^ vist. Den indsatte del 15 støder ved 5'-enden op til et stræk på 23 deoxyguanosin-rester og omfatter en del af IFN-c^ (1·©) cDNA'et beskrevet af Streuli et al. (46)- I det 3'-extracistroniske område er der nogle mindre afvigelser (punktmutationer) og et stræk på yderligere 318 nukleotider. Nukleotidse-20 kvensen for den indsatte cDNA-del af CG-pBR 322/RLycIFN-er vist i fig.13 . Den indsatte del støder ved 5'-enden op til et stræk på 20-23 deoxyguanosinrester og ligner, men er ikke identisk med det IFN-α (type D) cDNA, som er beskrevet af Goeddel et al. [(43), jfr. også Mantei et 25 al. (27)1. Bortset fra forskelle i cDNA-områderne før og efter IFN-kodningssekvensen indeholder IFN-genet i stillingerne 28-30 en GCC-triplet og i stillingerne 409-411 en GCG-triplet, som koder for alanin i stedet for henholdsvis GTC og GTG, der koder for valin. Nukleotidsekvensen 30 for den indsatte cDNA-del af CG-pBR 322/HLycIFN-5^ (se fig.14) viser et stræk på 17 deoxyguanosinrester ved 5'-enden. Nukleotidsekvensen er beslægtet med nukleotidsekvensen i IFN-α (type B) cDNA beskrevet af Goeddel et al. (43). Der er imidlertid yderligere nukleotider ved 35 5'-enden i den indsatte cDNA-del i HLycIFN-5^, og der findes ligeledes punktmutationer, udskæringer og indsætninger i det extracistroniske område og i IFN-kodningse-kvensen, især i stillingerne 22 og 361-372.

59 DK 174905 B1 P. Syntese af humane interferoner ved hjælp af Escherichia coli indeholdende humane IFN-specifikke rekombinant- DNA-molekyler________________

De 5 kloner, som indeholder humane IFN-specifikke rekom-5 binant DNA-molekyler, nemlig E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l*b E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-41 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8| og 10 E. coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-^ afprøves for IFN-aktivitet, hvilket i hvert enkelt tilfælde gennemføres på følgende måde:

Kulturer af den tilsvarende Escherichia coli-klon (30 ml suspensioner) dyrkes i tryptonmedium til en optisk tæthed 15 ca> 1* Cellerne isoleres og resuspenderes i 0,5 ml af en vandig opløsning indeholdende 30 mM NaCl og 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lysozym (Sigma) tilsættes til 1 mg/ml. Efter 30 minutter ved 0°C fryses suspensionerne (flydende nitrogen) og optøes (ved 37°C) 5 gange og cen-20 trifugeres i 20 minutter ved 20.000 omdr./min. i en SS Sorvall-rotor ved 4°C. De ovenstående væsker afprøves for IFN-aktivitet under anvendelse af den cytopatiske bioanalyse ifølge Armstrong (29) som beskrevet i trin lc.

Der findes følgende aktiviteter: 25 Ekstraktkilde IFN-aktivitet E. coli HB 101 indeholdende rekombinant-DNA (IE ml) CG-pBR 322/HLycIFN-l1 b 0*,0 CG-pBR 322/HLycIFN-41 0;0 30 CG-pBR 322/HLycIFN-51 10.000;10.000 CG-pBR 322/HLyclFN-8| 100;100 CG-pBR 322/HLycIFN-Ba 0*,0

Muligvis indeholder kloner, som ikke udviser målelige IFN-aktiviteter, rekombinant-DNA'er, hvori den indsatte 60 DK 174905 B1

HuLyIFN-cDNA-del har en forkert orientering med hensyn til transskriptionsretningen. Rekombinant-DNA*et fra en sådan klon (CG-pBR 322/HLycIFN-l'b) indeholdende en indsat cDNA-del i fuld længde reorienteres derfor på 5 følgende måde:

Plasmid-DNA'et fra klonen Escherichia coli (HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b isoleres som beskrevet ovenfor (trin Ec) og spaltes med Pst I. 0,5 yg af det spaltede DNA i 20 yl af en pufferblanding indeholdende 20 roM Tris.HCl 10 (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 25 mM NaCl og 50 yg/ml gelatine behandles med 0,2 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) og 0,5 mM ATP i 2 timer ved 15°C. Escherichia coli HB 101 transformeres med cDNA-blandingen som beskrevet ovenfor (trin 0). Transformerede kolonier udvælges på McConkey-15 agarplader tilsat tetracyclin, hvorefter de genanbringes på nitrocellulosefiltre. 4 bakteriekolonier, som hybridi-serer til det ^P-mærkede Pvu II-Bgl II*-fragment (351 bp) fra rekombinant-DNA'et CG-pBR 322/HLycIFN-l'b (jfr. trin Ee) betegnes Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-20 l'b^ tH l'b^. Ekstrakter af de fire kloner fremstilles og afprøves for IFN-aktivitet som beskrevet ovenfor. Der opnås følgende aktiviteter:

Ekstraktkilde IFN-aktivitet E. coli HB 101 indeholdende 25 rekombinant-DNA (IE ml) CG-pBR 322/HLycIFN-l'bj^ 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-l* b2 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-l’b3 0;0 CG-pBR 322/HLycIFN-l’b4 30;30 30 Plasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-l'b^ indeholder derfor en indsat cDNA-del, som er i stand til at styre syntesen af et polypeptid med IFN-aktivtet.

61 DK 174905 B1 G. Dannelse af rekombinantplasmider, som kan producere polypeptider med IFN-aktivitet i høj koncentration, og transformering af Escherichia coli HB 101 med disse plasmider_ 5 I. Dannelse af CG-PBR (AP)/LyIFN-a-1 rekombinantplasmld For at forøge udbyttet af det IFN-specifikke protein fra klonen Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l'b gennemføres nedenstående synteserække som vist skematisk i fig.15.

10 a. Fremstilling af cDNA-indsætningsdelen

Rekombinantplasmid-rDNA'et (150 yg) fra klonen Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-l’b spaltes med Pst I (Biolabs) under anvendelse af standardfremgangsmåder (jfr. trin Ed). Efter ekstraktion med phenol og fæld-15 ning med ethanol isoleres den afskårne indsætningsdel ved hjælp af saccharosegradientcentrifugering (5-23%) i 50 mM Tris.HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Centrifugeringen gennemføres ved 35.000 omdr./min- i en TST-41-rotor (Kon-tron AG) ved 15°C i 16 timer. Der opsamles .fraktioner 20 på 0,3 ml med en ISCO-gradientkollektor med 1 ml/min. Fraktionerne indeholdende det lille fragment (dvs. indsætningsdelen) hældes sammen. DNA'et fældes med ethanol som sædvanlig, og bundfaldet isoleres ved centrifugering i en HB-4-rotor (Sorvall) ved 10.000 omdr./min. ved 0°C 25 i 10 minutter. Bundfaldet genopløses i 60 yl 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA. Der udvindes 30 yg DNA bestemt ved måling af den optiske tæthed.

DNA-indsætningsdelen (10 yg) nedbrydes med Hae III (Biolabs), og fragmenterne fraktioneres på en 2% agarose-30 gel i en opløsning indeholdende 50 mM Tris, 50 mM borsyre, 1 mM EDTA og 0,5 yg/ml ethidiumbromid. De største DNA-fragmenter, Hae III-Pst I (869 bp) og Hae III-Hae III (82 bp, jfr. fig. 15, henholdsvis fragmenterne 3 og 4), udskæres hver for sig fra gelen, overføres ved hjælp af en injek-35 tionssprøjte til 5 ml 0,15 M NaCl, 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA og elueres natten over ved rystning. Eluatet 62 DK 174905 B1 ledes gennem en 100 yl DE-52 (Whatman) pasteur-pipette-søjle til absorption af DNA'et. Søjlen vaskes med 2 ml af den samme puffer, og DNA'et elueres med 400 yl af en opløsning indeholdende 1,5 M NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0) 5 og 1 mM EDTA. DNA'et fældes med 2 rumfang ethanol ved -20°C natten over. Bundfaldet fracentrifugeres i en Eppendorf-centrifuge.

Hae III-Hae III-DNA-fragmentet (82 bp) genopløses og nedbrydes med Sau 3A (Biolabs). Enzymet inaktiveres ved 10 opvarmning til 65°C i 30 minutter. Der tilsættes 1 yg af Hae Ill-Pst I DNA-fragmentet (869 bp), opløsningen indstilles til 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,5 mM ATP, og der tilsættes T4 DNA-ligase (Biolabs) til 30 enheder/yl reaktionsrumfang. Opløsningen inkuberes i 10 timer ved 15 15°C- Efter ekstraktion med phenol og chloroform fraktio neres blandingen på en 2% agarosegel i Tris-borat-EDTA i nærværelse af ethidiumbromid. Sau 3A-Pst I DNA-fragmentet (jfr. fig. 15, fragment 5) ekstraheres som beskrevet ovenfor, fældes med ethanol og genopløses i 10 yl af en 20 opløsning indeholdende 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA.

b. Fremstilling af DNA-fragmentet indeholdende det lactamaseregulerende område (ApPr) af pBR 322_

Plasmidet pBR 322 spaltes med Pst I (jfr. trin Cb) og 25 behandles med 4 enheder/ml af exonukleasen Bal 31 (Bethes-da Research Lab.) ved 30°c i 4-10 minutter til fjernelse af segmentet, som koder for β-lactamasen.

En kemisk DNA-binder med formlen 51-ATGTGTGATCACACAT-3' 30 syntetiseres under anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde (trin Ea). Binderen.adderes til det Bal 31-behandlede pBR 322 DNA på konventionel måde.Det dannede hybridmolekyle spaltes med restriktionsendonukleaser Bel I (Biolabs) og Ecor i. Nedbrydningsprodukterne fraktioneres på en 8% 63 DK 174905 B1 polyacrylamidgel i Tris-borat-EDTA som beskrevet ovenfor (trin Ba). DNA-fragmenter (ApPr DNA-fragmenter), som mi-grerer mellem 184 bp- og 234 bo-markerings DNA*er isoleres som beskrevet ovenfor (trin la) og fældes med etha-5 nol på sædvanlig måde. Bundfaldet genopløses i en opløsning indeholdende 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) og 0,05 mM EDTA.

c. Ligering af ApPr DNA-fragmentet til cDNA-indsæt-ningsdelen

Opløsningerne indeholdende ApPr DNA-fragmenterne og cDNA-10 indsætningsdelen hældes sammen. Blandingen indstilles til 10 mM MgCl2* 10 mM DTT og 0,5 mM ATP og inkuberes med 30 enheder/\il T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 12 timer. Efter ekstraktion med phenol og chloroform fraktioneres blandingen på en 1% lavtsmeltende saccha-15 rosegel (Biorad). Det dannede ApPr-cDNA-fragment bindes til det store fragment fra pBR 322 spaltet med både Pst I (Biolabs) og EcoR I (Biolabs) på følgende måde. Gelstykket indeholdende ApPr cDNA-fragmentet (ca. 20 vil) blandes med Pst Ι-EcoR I-fragmentet fra pBR 322, smeltes ved 65°C 20 i 2 minutter, afkøles til 37°C, indstilles til 0,5 mM ATP, 10 mM DTT og 10 mM MgCl2 og inkuberes med 30 enhe-der/yl T4 DNA-ligase (Biolabs) i 12 timer ved 15°c.

En tiendedel af rumfanget af en opløsning indeholdende 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaCl2 og 100 mM MgCl2 25 sættes til opløsningen indeholdende plasmidet CG-pBR(AP)/ LyIFN-a-1. De kombinerede opløsninger opvarmes i 10 minutter til 65°C til inaktivering af ligasen, hvorefter de . afkøles til 37°C. Opløsningen anvendes derpå til trans- 2+ formeringen af Ca -behandlet Escherichia coli HB 101 som 30 beskrevet ovenfor (trin d)· og der fremstilles plader på McConkey-agar tilsat 10 pg/ml tetracyclin. De transformerede kolonier testes for IFN-aktivitet (jfr. trin F).

64 DK 174905 B1

Klonen, som danner den største IFN-aktivitet, udvælges og betegnes Escherichia coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-l.

Der findes en aktivitet på 40.000 (XE/ml), som repræsenterer en 1300 gange stimulering sammenlignet roed den 5 oprindelige klon Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLyc-IFN-l'b.

Rekombinantplasmid DNA'et fra klonen CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1 isoleres fra kulturen som beskrevet ovenfor (trin Cc) og karakteriseres ved bestemmelse af nukleotidsekvensen af 10 cDNA-indsætningsdelen (IFN-gen) og det &-lactamaseregule-rende område. Resultaterne fremgår af fig. 16 .

65 DK 174905 B1 II. Fremstilling af rekombinantplasroidet CG-pBR (AP) /LylFN-a-3

Udbytterne af det IFN-specifikke protein fra klonen Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8| forbedres på 5 følgende måde (jf. fig. 17).

a. Fremstilling af DNA-fragmentet Indeholdende det β-lactamaseregulerende område fra CG-pBR(AP)/LvIFN-g-1 CG-pBR(AP)/LyIFN-α-Ι DNA (100 ug) spaltes· med Hind III (Biolabs) og Bgl II (Biolabs). Efter ekstrahering med phenol 10 og fældning med ethanol isoleres det fraspaltede DNA-frag-ment ved anvendelse af saccharosedensitetsgradientcentri-fugering (5-23%) i 50 mM Tris*HCl (pH-værdi 8/0) og 1 mM EDTA. Centrifugeringen gennemføres ved 58000 rpm i en TST 60 rotor (Kontron AG) ved 15°C i 4 timer. Der opsam-15 les fraktioner på 0,2 ml som beskrevet ovenfor. Fraktionerne indeholdende det lille fragment (Hind III-Bgl II) hældes sammen, og DNA'et udfældes med ethanol som sædvanligt. Bundfaldet genopløses i 80 pi 10 mM Tris*HCl (pH-værdi 7,5) og 0,05 mM EDTA. Der udvindes 16 ug DNA be-20 stemt ved måling af den optiske tæthed.

DNA-fragmentet (Hind III-Bgl II) (4 ug) spaltes med -Sau 3A (Biolabs), og nedbrydningsprodukterne fraktioneres på en 6%.'s polyacrylamidgel i tris-borat-EDTA som beskrevet ovenfor. DNA-fragmenterne farves i EtBr (0,5 ug/ml), 25 Hind III-Sau 3A DNA-fragmentet (239 bp) ekstraheres og isoleres på den ovenfor beskrevne måde. DNA’et udfældes med ethanol på sædvanlig måde. Bundfaldet genopløses i 20 ul 10 mM Tris*Hcl (pH-værdi 7,5) og 0,05 mM EDTA.

b. Fældning af den indsatte cDNA-del 30 Den indsatte cDNA-del spaltes fra rekombinantplasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-8£ med Pst I på samme måde som beskrevet ovenfor (afsnit la).

66 DK 174905 B1 cDNA-indsætningsdelen (2 yg) spaltes med 2,5 enheder Sau 3A (Biolabs) i 10 yg/ml EtBr og inkuberes ved 37°C i 60 minutter. Spaltningsprodukterne ekstraheres med phenol, og DNA'et fældes i ethanol på den ovenfor beskrevne må-5 de. DNA-fragmenterne fraktioneres på en 1,2%’s agarosegel i en opløsning indeholdende 50 mM Tris, 50 mM borsyre, 1 mM EDTA og 0,5 yg/ml ethidiumbromid.

Det næststørste DNA (Sau 3A-Pst X: 693 bp) ekstraheres fra gelen og renses under anvendelse af den i afsnit la) 10 beskrevne fremgangsmåde. DNA'et genopløses i 20 yl 10 mM Tris-HCl (pH-værdi 7,5) og 0,05 mM EDTA.

c. Ligering af Hind III-Sau 3A DNA-fragmentet til cDNA-indsætninqsdelen (Sau 3A-Pst I)

Lige store mængder af de to DNA-fragmenter (- 50 ng) in-15 kuberes i en opløsning indeholdende 10 mM lo mM

DTT, 0,5 mM ATP og 30 enheder/yl T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15°C i 3 timer. Blandingen inkuberes i 15 minutter ved 80°C og indstilles på 50 mM NaCl. DNA-blandingen spaltes med 0,5 enheder Pst I (Biolabs) og en enhed Hind 20 III (Biolabs) i 20 minutter ved 37°C. DNA'et ekstraheres med phenol, der fældes med ethanol,.og produktet genop— løses i 20 yl 10 mM Tris*HCl (pH-værdi 7,5) og 0,05 mM EDTA.

Halvdelen af den fremkomne blanding ligeres til det 25 store Hind III-Pst I DNA-fragment fra plasmidet pBR 322 (- 100 ng) i 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,5 mM ATP indeholdende 30 enheder/yl T4 DNA-ligase (Biolabs) i 2 timer ved 15^0.

En tiendedel af rumfanget af den ovenfor fremstillede op- 67 DK 174905 B1 løsning anvendes til transformering af Escherichia coli HB 101 som beskrevet ovenfor under trin D. De transformerede kolonier anvendes til afprøvning for IFN-aktivi-tet som beskrevet ovenfor (jf* trin F) .

5 Klonen, som syntetiserer IFN-aktivitet i højeste koncentration, udvælges og betegnes Escherichia coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3.

IFN-aktiviteten bestemmes som beskrevet ovenfor (trin F) ♦

Der konstateres en aktivitet på 70.000 (IE/ml), hvilket 10 repræsenterer en 700 gange stimulering sammenlignet med den oprindelige klon Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/ HLycIFN-8^.

Rekombinantplasmidet DNA'et fra klonen CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3 isoleres fra kulturen som beskrevet ovenfor (trin Cc) 15 og karakteriseres ved bestemmelse af nukleo tidsekvens en i cDNA-indsætningsdelen (IFN-gen) og i det β-lactamase-regulerende område. Resultaterne er vist i .fig. 18.

Fremstillingsfremgangsmåden for plasmidet CG-pBR (-AP)/Ly IFN-a-3 kan generelt anvendes til alle α-IFN cDNA-gener eller 20 hensigtsmæssigt spaltede kromosomale α-IFN-gener. -

Eksempelvis fremstilles plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 ud fra plasmidet CG-pBR 322/HLycIFN-5^ på samme måde som beskrevet for plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-3. Dette nye plasmid indeholder DNA-indsætningsdelen fra CG-pBR 3 22/ 25 HLycIFN-5^ og det β-lactamaseregulerende område fra CG-pBR(AP)/LyIFN-a-1. En klon med betegnelsen Escherichia coli HB 101 CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 udvælges som beskrevet ovenfor. Der konstateres en IFN-aktivitet på 50.000 (IE/ml), hvilket repræsenterer en femdobbelt stimulering sammenlig-30 net med den oprindelige Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-5^. Nukleotidsekvensen i cDNA-indsætnings-delen og det β-lactamaseregulerende område i plasmidet CG-pBR(AP)/LyIFN-a-2 bestemmes som beskrevet ovenfor og er angivet i fig- 19- 68 DK 174905 B1 III. Deponering af fremstillede mikroorganismer

Mikroorganismer og rekombinant DNA molekyler fremstillet som beskrevet i eksempel 10 er eksemplificeret ved kulturer deponeret i kultursamlingen i Agricultural Research Culture Collection (NRRL) den 14.september 1981 og er tildelt føl-5 gende deponeringsnumre:

Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLyclFN-&1: NRRL B-12528

Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLyclFN-41: NRRL B-12529

Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLyclFN-l'bi NRRL B-I2530

Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-51: NRRL B-12531 10 Escherichia coli HB 101 CG-pBR 322/HLycIFN-8J: NRRL B-12532

Eksempel 11.

De lymfoblastoide IFN-l'b og IFN-5^ kodningssekvenser af Escherichia coli plasmiderne CG-pb322/HLycIFN-l*b og -51 (jf. eksempel 10) kan underklones i plasmid p30 (jf. eksem-15 pel 4) på samme måde som beskrevet for IFN-8^ i eksempel 5 og 6. En partiel nedbrydning med restriktionsendonuklease t

Haelll er nødvendig. Gærhybridplasmiderne fremstillet på denne måde er p30IFN2(l'b), p30IFN2'(1'b), p30lFN2(51> og p30IFN2' (5χ) .

20 Disse fremstillede hybridplasmider kan anvendes til at transformere Saccharomyces cerevisiae RH971 som beskrevet i eksempel 7. Der kan udvælges følgende kolonier indeholdende et hybridplasmid med en indsat lymfoblastoid IFN cDNA-del:

Saccharomyces cerevisiae RH971/p30IFN2(l*b) 25 Saccharomyces cerevisiae RH971/p30IFN2'(1'b)

Saccharomyces cerevisiae RH971/p30IFN2(5^)

Saccharomyces cerevisiae RH971/p30XFN2'(5^)

Eksempel 12.

Analogt med den i eksempel 9 beskrevne fremgangsmåde kan der 69 DK 174905 B1 ud fra pi asraiderne p30lFN2 (1 'b), -(5^, -(8') og P30IFN2 ’ (1 'b) , -(5^) fremstilles nedenstående gærhybridplasraider: PJDB207/IFN2(l'b), pJDB207/IFN2'(1*b), pJDB207/IFN2(5^, PJDB207/IFN2*(5χ) og pJDB207/IFN2(8£).

5 Disse hybridplasmider kan transformeres til Saccharomyces cerevisiae stamme RH971 under udvælgelse af leucin prototrofe kolonier. Der kan dannes følgende kolonier indeholdende et hybridplasmid med en indsat lyfoblastoid IFN cDNA-del:

Saccharomyces cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2(l’b) 10 Saccharomyces cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2'(1’b)

Saccharomyces cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2(5^)

Saccharomyces cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2'(5^)

Saccharomyces cerevisiae RH971/pJDB207/IFN2(8p

Eksempel 13.

Fremstilling af et kopieringsplasmid indeholdende PHQ5 pranoto-15 ren og PH05 transskriptionstermineringssignaler (se fig. 20) a) Eliminering af EcoRI restriktionsstedet i plasmid p30:

Fremgangsmåden illustreret i fig. 20-22 kræver eliminering af det entydige EcoRI restriktionssted i plasmid p30. 5 ug p30 DNA (jf. eksempel 4) nedbrydes fuldstændigt med restrik-20 tionsendonuklease EcoRI (Boehringer). Til anbringelse på de dannede klæbrige ender inkuberes 1 ug EcoRI nedbrudt p30 i 50 μΐ 50 mM NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, 1 mM DTT, 0,25 mM dATP og 0,25 mM dTTP i 30 minutter ved 37°C med 1 enhed DNA polymerase (Klenow stort fragment, BRL). DNA'et som 25 udvindes ved ethanolfældning, bindes på sædvanlig måde og anvendes til transformering af kompetente Escherichia coli HB101 celler som beskrevet i eksempel 4. Kloner som er resi-stente overfor EcoRI nedbrydning betegnes som p30/EcoRI .

70 DK 174905 B1 b) Isolering af et 0/37 kb Sau3A-PstI PHQ5 transskriptions-termineringsfragment PH05 transskriptet er blevet kortlagt ved hjælp af si nuklease kortlægning (mapping) (48). Signalerne for transskriptions-5 terminering er lokaliseret i et 0,37 kb Sau3A-PstI fragment af PH05 genet. Nukleotidsekvensen af Sau3A-PstI fragmentet er anført i fig. 21.

5 ug pJDB207/PHO5,PHO3 DNA (jf. eksempel 2) nedbrydes fuldstændigt med restriktionsendonukleaser Sau3A og Pstl. Restrik-10 tionsfragmenterne adskilles på en lodret 1/5% lavt smeltende agarosegel i TB puffer. 0,37 kb Sau3A-PstI fragmentet lokaliseres ved farvning med ethidiumbromid, og der udskæres en mindst mulig gelblok indeholdende dette DNA fragment.

c) Kloning af Sau3A-PstI PH05 fragmentet i Ml3mp9 15 Ml3mp9 fag DNA er en nyttig kloningsvektor med en gruppe entydige restriktions steder (49) . 5 ug Ml3mp9 DNA nedbrydes fuldstændigt roed restriktionsendonukleaserne BamHI og Pstl. Det større 7,2 kb DNA-fragment adskilles fra et meget lille fragment (8 bp) på en 0.8% lavt smeltende agarosegel. Gelblokken 20 indeholdende det store DNA-fragment skæres ud af gelen. Gelblokke med 0,37 kb Sau3A-PstI fragmentet af pJDB207/PHO5,PHO3 (jf. eksempel 13b)) og 7,2 kb BamHI-PstI fragmentet af M13mp9 smeltes ved 65°C, blandes i omtrent ækvimolære mængder og fortyndes med vand til en agarosekoncentration på 0,3%. Der 25 gennemføres binding i en 200 ul opløsning indeholdende 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 19 mM MgClj, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 enheder T4 DNA ligase (Biolabs). Der foretages transduktion af kompetente celler af stammen Escherichia coli JM101 (Ca++) i overensstemmelse med håndbogen "M13 cloning and DNA sequencing 30 system" udgivet af New England Biolabs. Fager fra et antal hvide plaques dyrkes og analyses med hensyn til størrelsen af de indsatte DNA-dele ved spaltning med restriktionsendonukleaser EcoRI og Pstl.

71 DK 174905 B1

En Ml3mp9 afledt klon indeholdende Sau3A-PstI PH05 trans-skriptionstermineringsfragmentet isoleres og betegnes Ml3mp9/PH05 (Sau3A-PstI).

d) Kloning af PH05 transskriptionstermineringsfragmentet i 5 p30/BcoRlR

Det oprindelige PH05 transskriptionstermineringsfragment klonet i fag M13mp9 (M13mp/PH05(Sau3A-PstI)) gehklones som et Haelll-Hindlll fragment i plasmid p30/EcoRI spaltes med Ball og Hindlll: Ml3mp/PH05(Sau3A-PstI) DNA spaltes fuld-10 stændigt med restriktionsendonukleaserne Haelll og Hindlll.

De dannede to DNA-fragmenter adskilles på en 1,5%'s lodret lavtsmeltende agarosegel i TBE puffer. 0,39 kb fragmentet t> isoleres i en gelblok udskåret af gelen. p30/EcoRI DNA nedbrydes med Ball og Hindlll. Det store 3,98 kb fragment 15 adskilles på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel i TBE puffer og isoleres ved udskæring af en gelblok indeholdende DNA-fragmentet.

Gelblokke indeholdende 0,39 kb Haelll-Hindlll PH05 trans- skriptionstermineringsfragmentet og 3,98 kb Ball-Hindlll frag- R o 20 mentet af p30/EcoRI smeltes ved 65 C og blandes i omtrentlig ækvimolære mængder. Ligering og transformation af-kompetente Escherichia coli HB101 celler gennemføres som beskrevet i eksempel 4. DNA fra transformerede celler analyseres ved spaltning med ball og Haelll. En klon indeholdende PH05 trans-25 skriptionstermineringsfragmentet analyseres yderligere og betegnes som p31 (se fig. 20),

Kopieringsplasmid p31 indeholder PH05 promotorområdet med en del af signalsekvensen af PH05 og i nabostilling dertil et DNA-fragment med PH05 transskriptionstermineringssignaler-ne. Fremmede kodningssekvenser, som skal kopieres eller ud-30 trykkes i denne vektor, kan hensigtsmæssigt indsættes mellem promotor- og transskriptionstermineringssekvenser.

72 DK 174905 B1

Eksempel 14.

Insætning af lymfoblastoid interferon-5^ DNA 1 plasmid p31 (se fig, 22) a) Isolering af Haelll-Hpal fragmenter af plasmid CG-5 pBR32 2/HLycIFN-S1

Escherichia coli stamme HB101 CG-pBR322/HLycIFN-5^ (se eksempel 10E) dyrkes i 100 ml LB medium tilsat 10 yg/ml tetracyc-lin, og plasmid DNA'et isoleres under anvendelse a£ den i eksempel 2 beskrevne fremgangsmåde, 10 yg CG-pBR322/HLycIFN-5^ 10 DNA nedbrydes fuldstændigt med restriktionsendonukleaser PstI og Hpal. Restriktionsfragmenterne adskilles på en præparativ 0,8% lavt smeltende agarosegel. Pstl-Hpal fragmentet på ca.

860 bp indeholdende IFN-5^ kodningssekvensen udskæres fra gelen og elueres fra agarosegelen under anvendelse af den i 15 eksempel 4a) beskrevne fremgangsmåde, hvorefter der foretages rensning ved hjælp af DE52 ionbytningskromatografi under anvendelse af den i eksempel 5a beskrevne fremgangsmåde.

Pstl-Hpal fragmentet indeholder 3 HaelXI steder: i stilling 41, 65 og 146 (fra ATG'et) i IFN~51 kodningssekvensen. Par-20 tielt Haelll nedbrydning fører til 3 Haelll-Hpal fragmenter på henholdsvis 699 bp, 789 bp og 804 bp . Haelll nedbrydning reguleres omhyggeligt til opnåelse af omtrentlig lige store mængder af alle tre fragmenter. Blandingen af fragmenterne ekstraheres med phenol, fældes med ethanol og resuspenderes 25 i 10 mM Tris pH8 ved en koncentration på 0,1 mg/ml.

b) Fremstilling af Ball spaltet, dephosphoryleret plasmid p31 6 yg p31 DNA (se eksempel 13d)) nedbrydes fuldstændigt med restriktionsendonuklease Ball (BRL). Efter phenolekstraktion og fældning med ethanol genopløses DNA'et i 100 yl 50 mM Tris 30 pK 8,0, og opløsningen ledes gennem et 50 yl lag af ækvili-breret Chelex 100 (BioRAD) i en siliconebehandlet Pasteur pipette. Den gennemstrømmende væske og 450 yl af den efterføl- 73 DK 174905 B1 gende vaskevæske hældes sammen. Der tilsættes 0/4 enheder kalvetarm alkalisk phosphatase (Boehringer). Efter inkube-ring i 1 time ved 37°C inaktiveres enzymet ved 65°c i 1,5 timer. NaCl-koncentrationen i inkubationsblandingen indstilles 5 til 150 mM. Det lineariserede dephosphorylerede p31 DNA renses ved DE52 ionbytningskromatografi (se eksempel 5a)).

Efter fældning med ethanol resuspenderes DNA'et i 10 mM Tris pH 8 ved en koncentration på 0,3 mg/ml.

c) Binding af lineariseret, dephosphoryleret p31 DNA til 10 Haelll-Hpal fragmenterne af IFN-5,^ DNA

0,6 yg dephosphoryleret p31 vektor DNA spaltet med Ball bindes til 0,5 yg partielle Haelll-Hpal fragmenter af IFN-5^ DNA (se eksempel 14a)}. Bindingen gennemføres i 10 yl 60 mM Tris pH 7,5, 19 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP og 300 enheder T4 DNA 15 ligase (Biolabs) natten over ved stuetemperatur. En 1 yl af bindingsblandingen sættes til 50 yl calciumbehandlede transformeringskompetente Escherichi coli HB101 celler. Transformeringsmetoden er beskrevet i eksempel 4a.

Transformerede amp kolonier dyrkes hver for sig i LB medium 20 indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Der fremstilles plasmid DNA under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes e*t al., (50), og de analyseres ved nedbrydning med restriktionsendonuklease BstEII (et entydigt sted i PH05 promotoren)..

20 Kloner indeholdende den indsatte IFN-5^ del analyseres yder-25 ligere ved BstEII-EcoRI dobbeltnedbrydninger til bestemmelse af orienteringen og størrelsen af den indsatte del. Blandt 8 kloner med den indsatte del i den rigtige orientering findes alle tre forventede størrelser. Størrelsen svarer til de tre HaeIII^_3-HpaI fragmenter dannet ved partiel Haelll ned-30 brydning af IFN-S^genet (jfr. eksempel 14a)). Klonerne betegnes som p31/IFX(5^), p31)IF2(5^) og p31/IF3(5^) med indsatte IFN-5^ dele med henholdsvis 804 bp (Haelllj-Hpal), 780 bp (HaeIII2-HpaI) og 699 bp (HaeIII3“HpaI).

74 DK 174905 B1

Eksempel 15.

Indføring af lymphoblastoid interferon-1*b DNA 1 plasmid p31 (se fig. 22) a) Isolering af Haelll-Rsal fragmenter af plasmid 5 CG-pBR322/HLycIFN-l1b: 10 yg CG-pBR322/HLycIFN-l’b (se eksempel 10E) nedbrydes med restriktionsnukleaser PstI og Rsal. Restriktionsfragmenterne separeres på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel.

Et Pstl-Rsal fragment på 870 bp isoleres fra gelen og ren-10 ses under anvendelse af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde (eksempel 14a).

Pstl-Rsal-fragmentet indeholder tre Haelll-steder: ved position 13, 37 og 118 fra ATG'et i IFN-l'b· kodningssekvensen.

Ved partiel Haelll-nedbrydning fås tre Haelll-Rsal fragmen-15 ter på henholdsvis 735 bp, 816 bp og 840 bp. Blandingen af fragmenter phenolekstraheres, hvorefter der foretages ethanolfældning og resuspendering i 10 mM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 0,1 mg/ml.

b) Binding af lineariseret, dephosphoryleret p31 DftA til 20 Haelll-Rsal fragmenter af IFN-l'b DNA

0,6 yg dephosphoryleret p31 vektor DNA spaltet med Ball (se eksempel 14b) bindes til 0,5 yg partielle Haelll-Rsal fragmenter af IFN-l'b DNA. Bindingsproceduren, transformationen af kompetente Escherichia coli HB 101-celler 25 med bindingsblandingen og udvælgelsen af de transformerede amp -kolonier gennemføres på samme måde som beskrevet i eksempel 14c. Plasmid DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes et al. (50) og analyseres ved nedbrydning med restriktionsendonuklease BstEII.

30 7 kloner indeholdende den indsatte IFN-l'b-del analyseres ved hjælp af BstEII-PvuII-dobbeltnedbrydninger. To kloner 75 DK 174905 B1 viser sig at indeholde Haelll^-Rsal fragmentet (816 bp) i den rigtige orientering. Denne konstruktion betegnes som p31/IF2(l'b).

Eksempel 16.

5 Indføring af lymphoblastoidt interferon-8^ DNA i plasmid p31 (se fig. 23) a) Isolering af et 1,46 kb Sall-EcoRI fragment af plasmid p30IFNl(8p 5 yg p30IFNl(8^) DNA (se eksempel 5d) nedbrydes med restrik-10 tionsendonukleaser Sall og EcoRI. Et 1,46 kb Sall-EcoRI fragment indeholdende PH05 promotoren bundet til proteinkodning sområdet af IFN-8£ separeres på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel. DNA-båndet lokaliseres ved farvning med ethidiumbromid og udskæres af gelen.

15 b) Isolering af et 3,5 kb Sall-EcoRI fragment af plasmid p31 5 yg p31 DNA (se eksempel 13d) nedbrydes fuldstændigt med restriktionsendonukleaser Sall og EcoRI. 3,5 kb vektorfragment indeholdende PH05 transkriptionstermineringssekvensen separeres på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel, og DNA-bån-20 det udskæres.

c) Binding af et 1,46 kb Sall-EcoRI fragment af p30IFNl(8^) til et 3,5 kb Sall-EcoRI fragment af p31

Gelblokke med 0,67 yg af 3,5 kb Sall-EcoRI fragmentet af p31 og 0,5 yg af 1,46 kb Sall-EcoRI fragmentet af 25 p30IFNl(8p bindes i 240 yl under anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde ved 15°C natten over. 10 yl af bindingsblandingen anvendes til at transformere kompetente Escherichia coli HB101-celler.

J>

Transformerede amp -kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium 76 DK 174905 B1 indeholdende 100 v9F/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes et al.

(50) og analyseres ved nedbrydning med restriktionsendonuklea-se BstEII (et entydigt sted i PH05 promotoren)- Et antal 5 kloner indeholdende de indsatte IFN-8^-dele analyseres ved BstEII-PvuII-dobbeltnedbrydninger. De indeholder alle 1,46 kb Sall-EcoRI fragmentet. De identiske kloner betegnes som p31/IF(8£).

Eksempel 17.

10 Underkloning af gen-konstruktioner i gærvektoren pJDB2Q7 med højt kopital

Konstruktionerne beskrevet i eksempel 14-16 indeholder PH05 promotoren, forskellige interferonkodningsområder og PH05 transkriptionstermineringssignalerne i et tandemarrangeroent 15 alle indsat i en pBR322 afledt vektor. Til kopiering i gær underklones hele indsætningsdelen såsom i gær-vektor pJDB207 (28), hvilket tillader udvælgelse af leucinprototrofe kolonier (jf. eksempel 9 og fig. 6).

2 tig af henholdsvis p31/IF(8|) DNA, pSl/IFK^) DNA, 20 p31/IF2(51) DNA, pSl/IFS^) DNA og p31/IF2(l'b) DNA ned brydes med restriktionsendonuklease Sall og Hindlll. Restriktionsfragmenterne adskilles på en præparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Det lille fragment (med en størrelse på ca. 2 kb) for hver nedbrydning udskæres af gelen.

25 10 yg pJDB207 DNA nedbrydes med restriktionsendonukleaser

Sall og Hindlll. Det store 6,2 kb fragment isoleres fra en præparativ 0,8% lavtsmeltende agarosegel. Gelblokke indeholdende DNA-fragmetnerne smeltes ved 65°C og fortyndes med vand til formindskelse af agarosekoncentrationen til 30 ca. 0,3%.

Hvert af 2 kb Sall-Hindlll fragmenterne af plasmiderne 77 DK 174905 B1 P3b/IF(8£), p31/IPl(51) , p31/IF2(5χ), p31/IF3(51) og p31/lF2(l'b) blandes med en ækvimolær mængde af 6,2 kb Hindlll-sall fragment af pJDB207. Der gennemføres bindinger i 100 μΐ i 4 timer ved 15°C. 10 pi af hver enkelt bin-5 dingsblanding anvendes til at transformere kompetente Escherichia coli HFlOl-celler under anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde. Adskillige amp -kolonier fra hvert forsøg dyrkes enkeltvis i LB-medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA’et analyseres med 10 hensyn til størrelsen af indsætningsdelen ved spaltning med restriktionsendonukleaser Hindli og Sall. De dannede kloner med de korrekte indsætningsdele betegnes pJDB207/IF (8^) , pJDB207/IFl(51) , pJDB207/IF2(5χ) (jf. fig. 27), pJDB207/IF3(51) og pJDB207/IF2 (1 'b) (jf. fig. 27).

15 Eksempel 18.

Transformering af Saccharomyces cerevisiae AH220 og induce-ring af interferon-produktion

Plasmider pJ0B207/IF (8£) , pJDB207/IFl(5^, pJDB207/IF2 (5χ) , pJDB207/IF3(51) og pJDB207/IF2(l,b) indføres hver for sig 20 i Saccharomyces cerevisiae stamme AH220 (a, trpl, leu2-3, leu2-112, his3, pho5, pho3) under anvendelse af transformerings fremgangsmåden beskrevet af Hinnen et al. (1). Transformerede gærceller udvælges på plader med minimalt gærmedium, som mangler leucin. Enkelte transformerede gærkolo-25 nier udtages og dyrkes under anvendelse af den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde. De enkelte gærkolonier betegnes på følgende måde:

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF(8£),

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/lFl(5^) , 30 Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(5^) ,

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF3(5^) og Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(1'b).

78 DK 174905 B1

Eksempel 19.

Fremstilling af garcelleekstrakter og bestemmelse af interferon-indholdet

Celleekstrakter fremstilles,og interferonaktiviteten bestem-5 mes på samme måde som beskrevet i eksempel 8. Resultaterne er anført i nedenstående tabel 3.

Tabel 3.

- Interferonaktivitet i Saccharomyces cerevisiae stamme AH220 efter transformering med følgende rekombinantplasmider: 10 Plasmider . . .-Interferonaktivitet _Enh./ml garcelleekstrakt_ pJDB207/IF(8^) 1 107 pJDB207/IFl(51) 5 · 101 pJDB207/IF2(51) 5 · 101 15 pJDB207/IF3(51) 3 * 103 pJDB207/IF2(1'b) 4 - 103

Eksempel 20.

Kopiering af hepatitis B virus overflade (HBVs) antigen under kontrol af gær PH05 promotoren 20 a) Konstruktion : af en fusion mellem PHQ5 promotoren og HBVs protein-kodningsområdet yg DNA fra plasmid pHBVl30 (51) nedbrydes med restrik-tionsendonuklease Aval som anbefalet af leverandøren (New England Biolabs). Der fås et fragment på 1336 basepar, som 25 indeholder hele proteinkodningsområdet for HBVs, herunder 27 basepar af en potentiel præ-HBVs sekvens (se fig. 2 i ref.

51: Aval fragmentet spænder over DNA segmentet fra Xho-ste- 79 DK 174905 B1 det til et Aval-sted 62 basepar efter BamHI-stedet anbragt mellem overfladekodningsområdet og kernekodningsområdet) . Fragmentet på 1336 basepar renses ved elektroforese på blød agarose (0,8% agarose-gel) under anvendelse af den i 5 eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde.

5 yg plasmid pBR322/PH05 Barn-Sal (se fig. 1) afskæres med restriktionsnukleaser Sall og Aval (position 1424 i pBR322), dg det dannede 3,9 kb vektor fragment indeholdende pBR322 sekvenser sammen med PH05 Barn-Sal segmentet renses ved elek-10 troforese på blød agarose som beskrevet ovenfor.

1 yg af fragmentet på 1336 basepar bindes til 3 pg af 3,9 kb vektorfragmentet i 50 yl 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl^, lO mM DTT, 1 mM ATP og 600 enheder T4 DMA ligase (Biolabs) ved 15°C i 4 timer. Transformering af Escherichia coli HB101 15 til ampicillinresistens og plasmidisolering gennemføres på samme måde som beskrevet i eksempel 4a.

Plasmidets korrekte struktur bekræftes ved restriktionsanalyse, Det således fremstillede nye plasmid betegnes pBR322/PHO5/HBVs (se fig. 24).

20 b) Justering af PH05 promotoren til det eksakte HBVs proteinkodningsområde

Ved den beskrevne fusion dannes et DNA sekvensarrangement som vist i fig. 25. Sekvensdata tages fra fig. 3 (PH05) og fra Pasek et al. (52, HBVs). nRNA initieringsstedet bestem-25 mes ved konventionel SI kortlægning (mapping) (48) under anvendelse af BamHI-Sal fragmentet af pBR322/PH05 Bam-Sal (fig. 1). Til eliminering af PH05 proteinkodningsområdet i pBR322/PH05/HBVs nedbrydes 5 yg af plasmidet med restrik-tionsendonuklease Kpnl (betingelserne anført af leverandø-30 ren, New England Biolabs), hvorved der fås et lineariseret plasmid. 1 yg lineariseret plasmid nedbrydes med 1 enhed exonuklease 80 DK 174905 B1

Bal31 (Bethesda Research Laboratory) ved 30°C i 45 sekun-der i 12 mM CaCl2, 12 mM MgCl2, 300 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,1 i et samlet rumfang på 100 yl. Reaktionen afbrydes ved ekstraktion med phenol som beskrevet ovenfor.

5 Efter fældning med ethanol resuspenderes DNA'et i 50 yl TE.

1 yg DNA bibringes atter cirkelform ved binding med T4 DNA ligase i et rumfang på 20 yl (angående betingelser se eksempel 4a). Efter transformering af Escherichia coli HB101 til 10 ampicillinresistens (se eksempel 4a) isoleres plasmid DNA som beskrevet, og de enkelte plasmidpræparater analyseres ved restriktionsanalyse med følgende enzymer: Haelll, PstI, BstEII og Hhal. Denne analyse tillader bestemmelse af tilstedeværelsen af Hhal-stedet (6 basepar før starten af 15 HBVs proteinkodningsområdet) og giver et mål for størrelsen af sletningen. DNA sekvensen i samlingsområdet bestemmes under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilbert (15) (radioaktiv mærkning af BstEII-stedet i position -374, se fig. 3). Slutpunkterne for sletningen dannet 20 i et’af plasmiderne er vist i fig. 24. Dette plasmid betegnes pBR322/PH05/HBVsål4.

c) Overføring af PH05-HBVS fusionen til gærplasmidet pJDB207 (se fig. 26) 5 pg DNA af plasmid pBR322/PH05/HBVs^l4 nedbrydes med restrik-25 tionsendonuklease BamHI (New England Biolabs, betingelserne er beskrevet af leverandøren). Et 1,8 kb BamHI fragment fremstilles ved elektroforese med blød agarosegel (0,8% agarose) under anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde. 2 yg af gærvektoren pJDB207 nedbrydes med 30 det samme enzym. 1 yg nedbrudt pJDB207 og 1 yg af 1,8 kb BamHI restriktionsfragmentet bindes i et samlet rumfang på 20 yl under anvendelse af de i eksempel 20a beskrevne betingelser. Transformering af Escherichia coli HB101 til ampicillinresistens og isolering af plasmid DNA gennemføres under 35 anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde. De 81 DK 174905 B1 enkelte plasmider analyseres ved BamHI restriktionsanalyse, og orienteringen af det indsatte BamHI fragment bestemmes ved dobbeltnedbrydning med Hindlll/BstEII. Konstruktionen er vist i fig, 26. Det dannede plasmid er vist i fig. 26 5 og betegnes pJDB207/PH05/HBVsA14.

Plasraidet transformeres til gærstamme AH220 som beskrevet i eksempel 7. Transformerede gærceller udvælges, inkuberes i væskemedium og dyrkes under ikke-undertrykningsbetingel-ser under anvendelse af den i eksempel 7 beskrevne fremgangs-10 måde. En enkelt transformeret gærkoloni betegnes Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/HBVsA14.

Fremstilling af celleekstrakt gennemføres under anvendelse af den i eksempel 8 beskrevne fremgangsmåde, og mængden af dannet HBVs protein bestemmes under anvendelse af Abbott 15 radioimmunanalyse (51) . Under forudsætning af, at HBVs-anti-genet dannet af gær reagerer på samme måde som antigenet i t humanserum, findes ca. 2 pgHBVs-antigen pr. ml gærekstrakt tinder ikke-udslukningsbetingelser. Under slukningsbetingelser er indholdet mindre end 0,001 yg/ml.

20 d) Overføring af PH05-HBVs fusionen til et gærplasroid indeholdende en HP05 transkrlptionstermineringssekvens 5 yg DNA fra plasmid pJDB207/IF(8£) (eksempel 17) nedbrydes med BamHI som beskrevet ovenfor, og 6,9 kb vektordelen isoleres ved elektroforese på blød agarose (0,8% agarose) un-25 der anvendelse af den i eksempel 4 beskrevne fremgangsmåde, 5 yg pBR322/PH05/HBVsA14 nedbrydes med BamHI som beskrevet ovenfor, og 1,8 kb BamHI fragmentet isoleres ved elektro-forese på blød agarosegel. 1 ug af 6,9 kb vektorfragmentet bindes med 1 yg af 1,8 kb BamHI fragmentet i et samlet rum-30 fang på 20 yl under anvendelse af de i eksempel 20a beskrevne betingelser. Transformeringen af Escherichia coli HBlOl til ampicillinresistens og plasmidioslering gennemføres under anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde. Plasmidanalyse gennemføres ved hjælp af restriktions- 82 DK 174905 B1 endonukleasenedbrydninger. Det dannede plasmid er vist i fig. 26 og betegnes pJDB207/PH05/HBVsål4. Transformation af gærstamme AH220 og udvælgelse af de transformerede celler gennemføres under anvendelse af den i eksempel 7 beskrev-5 ne fremgangsmåde. En enkelt transformeret gærkoloni betegnes Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/HBVsål4t.

Eksempel 21.

Hepatitis B virus (HBV) DNA sekvenser afskåret fra plasmider pBR322-PstI dG:HBV-Kpnl dC, lO pBR322-PstI dG:HBV-BamHI dC, pBR322-PstI dG:HBV-BG1IX dC, pBR322-PstI dG:HBV-EcoRI dC, pBR322-BamHI: HBV-BamHI, pBR322-EcoRI: HBV-EcoRI, 15 pBR322-PstI dG:HBV-Kpnl dC, pBR322-PstI’ dG:pHBVll4-PstI dC, ((pBR322-EcoRI Hindlll: Lac promotorsekvens)-Hindlll:HBV114-Hhal Hindlll bindere)-BamHI, pUR2-EcoRI: HBV114-Hhal EcoRI bindere, 20 pUR2-EcoRI: HBV114-Hhal EcoRI bindere pBR322-PstI dG:pHBV114-AvaI dC, og pBR322-PstI dGspHBV114-Taq dC, ' som beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning 13828 kan indsættes (fortrinsvis efter passende tilpasning 25 af enderne) i plasmider p30 eller p31 i overensstemmelse med fremgangsmåden eksempel 5, 14 eller 15 og derefter i plasmid pJDB207 i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge eksempel 17. Transformering af Saccharomyces cerevisiae gennemføres tinder anvendelse af den i eksempel 18 beskrev-30 ne fremgangsmåde. Kopiering af polypeptider, som udviser HBV antigenisitet, bestemmes under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 20c.

83 DK 174905 B1

Eksempel 22.

Sletning af 3' ikke-translaterefle DNA sekvenser i plasmider PJDB207/IF2(51) og PJDB207/IF2(l'b) (se fig. 27 og 28)

Fremstillingen af plasmiderne pJDB207/IF2(5^) og 5 pJDB207/IF2 (l'b) (jfi eksempel 17) resulterer i dannelsen af et relativt langt 3' ikke-translateret område på henholdsvis ca. 440 bp og 480 bp. For at forkorte dette område i de fremstillede produkter nedbrydes DNA'et med exo-nuklease Bal31 fra et entydigt SmI-sted i midten af dette 10 område. Xho bindere indføres, og DNA'et bringes på cirkulær form ved binding (ligation).

a) Bal31 nedbrydning af Smal spaltede plasmider pJDB207/ IF2(51) og pJDB207/IF2(l’b) 20 yg af de enkelte plasmid DNA'er nedbrydes med restrik-15 tionsendonuklease Smal. Efter ekstraktion med phenol/chloro-form fældes DNA’et med ethanol. DNA'et resuspenderes i 10 ntM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 0,5 mg/ml. 10 yg af de Smal spaltede DNA*er nedbrydes hver for sig med to enheder endonuklease Bal31 (BRL) i lOO yl 20 mM Tris pH 20 8,00, lOO mM NaCl, 12 mM MgClj, 12 mM CaCl2 og 1 mM EDTA.

Alikvoter på 3 yg DNA udtages efter henholdsvis 90, 120 og 150 sekunders inkuberingstid ved 30°C og blandes straks med 50 yl phenol og 60 pliΊΝΕ. Efter ekstraktion med phenol/ chloroform og fældning med ethanol resuspenderes DNA'et i 25 10 mM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 100 yg/ml. Til analyse af den exonukleolytiske nedbrydning af Bal31 nedbrydes alikvoter af 0,7 yg DNA fra hvert tidspunkt med Hindlll/EcoRI for pJDB207/IF2(5^)-afledte prøver eller med PvuII/Hindlll for pJDB207/IF2(l’b)-afledte prøver. Til 30 yderligere forsøg anvendes DNA'erne fra 90 sekunders tidspunktet.

84 DK 174905 B1 b) Addition af Xhol bindere til de Bal31 behandlede DNA'er 2,2 yg af hver af plasmid DNA pJDB207/IF2 (5^) og pJDB207/ IF2(l‘b) inkuberes efter 90 nedbrydning i 90 sekunder med Bal31 (se eksempel 22a) i 1 time ved 37°C med 2,8 enheder 5 Klenov DNA polymerase (stort fragment af polymerase I, BRL) i 35' vil 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 0,1 mM dNTP's.

3 yg Xhol bindere 5'-CCTCGAGG-3', Collaborative Research) behandles med kinase i 50 yg 6mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 4 mM DTT, 0,5 mM ATP og 35 enheder T4 polynukleotidkinase lo (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C.

0,67 yg kinasebehandlede Xhol bindere og 0,4 yg Bal31 behandlet DNA med korte ender af plasmid pJDB207/IF2(5^) eller pJDB207/IF2(l'b) bindes natten over ved stuetemperatur i 25 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM 15 ATP‘og 450 enheder T4 DNA ligase. Det bunde DNA adskilles fra overskud af bindere ved fældning med isopropanol i nærværelse af 10 mM EDTA, 0,3 M natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol. Efter inkubering i 35 minutter ved stuetemperatur afsættes DNA'et ved centrifugering.

20 Det fracentrifugerede materiale lufttørres og resuspenderes i 17 yl 6 mM Tris pH 7,9, 150 mM NaCl, 6 mM MgCl2 og. 6 mM mercaptoethanol. Xhol enderne bundet til DNA'et spaltes med Xhol, DNA'et fældes med isopropanol som beskrevet ovenfor og bringes på cirkulær form ved binding (ligation).

25 Efter en bindingstid på 6 timer ved 150°C i 50 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 enheder T4 DNA ligase sættes 10 yl ligeringsblanding til 100 pi calcium-behandlede, transformeringskompetente Escherichia coli HBlOl-celler (se eksempel 4a).

30 72 transformerede amp -kolonier indeholdende plasmider med en IFN-5^ indsat del dyrkes hver for sig i LB-medium indeholdene 100 mg/1 ampicillin. Plasmid DNA analyseres ved nedbrydning med Haelll. Restriktionsmønsteret muliggør be- 85 DK 174905 B1 dømmelse af den omtrentlige størrelse af sletningen foretaget med Bal31. To kloner analyseres yderligere og afprøves for interferonaktivitet. De betegnes pJDB207/IF2(5^)Δ72 og pJDB207/IF2(51)A82.

5 Nukleotidsekvensen på begge sider af den nye binding (Xhol binder) mellem det 3' ikke-translaterede område i IFN-5^ genet og PH05 transskriptionstermineringsområdet er anført i fig. 28.

R

På tilsvarende måde dyrkes 60 amp kolonier indeholdende 10 plasmider med en IFN-l'b indsat del hver for sig i LB medium indeholdende 100 mg/1 ampicillin. Plasmid DNA analyseres som beskrevet ovenfor. En klon udvælges og afprøves for IFN-aktivitet. Den betegnes pJDB207/IF2(l'b)Δ.

Eksempel 23.

15 Fremstilling af rekombinant plasmider indeholdende flytbare IFN-5^, -8^ og -l'b cDNÅ indsætningsdele, som kan anvendes til direkte kopiering af fuldtudviklet lymfoblastoid IFN (se fig. 29 og 30).

a) Fremstilling af cDNA indsætningsdelene 20 cDNA indsætningsdelene afskæres fra rekombinant plasmiderne CG-pBR322/HLycIFN-8^f CG-pBR322/HLycIFN-l'b, CG-pBR322/ HLycIFN-5^ ved nedbrydning af 150 yg plasmid DNA med PstI (Biolabs) under anvendelse af den af leverandøren anbefalede fremgangsmåde. Efter ekstraktion med phenol og fældning med 25 ethanol isoleres de afskårne indsætningsdele ved hjælp af saccharose-densitets-gradient-centrifugering (5-23%) i 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Centrifugeringen gennemføres ved 35.000 omdr./min. i en TST 41 rotor (Kontron AG) ved 15°C i 16 timer. Der opsamles 0,3 ml fraktioner med en 30 ISCO gradient kollektor ved 1 ml/min. Fraktionerne indeholdende det lille fragment (dvs. insætningsdelen) hældes sam- 86 DK 174905 B1 men. DNA'et fældes med ethanol på sædvanlig måde, og bund-faldet isoleres ved centrifugering i en HB-4 rotor (Sorvall) ved 10.000 omdr./min. ved 0°C i 10 minutter. Bundfaldet genopløses i 60 yl 19 mM Tris-HCl {pH 7,5) og 0,05 mM EDTA.

5 Der udvindes ca. 30 ug DNA bestemt ved måling af den optiske tæthed.

2 ug af hver af c DNA indsætning s del ene nedbrydes med 2,5 enheder Sau3A (Biolabs) i 10 yg/ml EtBr og inkuberes ved 37 C i 60 minutter. Nedbrydningsblandingerne ekstraheres med 10 phenol, og DNA'et fældes i ethanol som beskrevet ovenfor.

DNA-fragmenterne fraktioneres på en 1,2% agarosegel i en opløsning indeholdende 50 mM Tris, 50 mM borsyre, 1 mM EDTA og 0,5 yg/ml ethidiumbromid.

Det næststørste DNA-fragment (Sau 3A-PstI) fra hver af de 15 tre nedbrydninger udskæres fra gelen, sprøjtes gennem en tynd nål ved hjælp af en sprøjte over i 5 ml 0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA og elueres natten over ved rystning. Eluatet ledes gennem en 100 yl DE-52 (Whatman) Pasteur-pipettesøjle til adsorbering af DNA'et. Søjlen vaskes 20 med 2 ml af den samme puffer, og DNA'et elueres med 400 yl af en opløsning indeholdende 1,5 M NaCl-, ..50 mM Tris (pH 8,0) og 1 mM EDTA. DNA’et fældes med 2 rumfang ethanol-ved -20°C natten over. Bundfaldene isoleres ved centrifugering i en Eppendorf-centrifuge og genopløses i 10 μΐ 10 mM Tris.HCl 25 (pH 7,8), 0,05 mM EDTA.

b) Fremstilling af acceptor plasmid DNA-fragmentet 1. Nedbrydning af plasmid pBR322 med EcoRI og 10 yg plasmid DNA pBR322 nedbrydes med 15 enheder EcoRI (Biolabs) i 60 minutter ved 37°C under de betingelser, som leve-30 randøren anbefaler. Efter ekstraktion med phenol og fældning med ethanol genopløses DNA'et i 25 yl og de forskudte eller enkeltstrengede ender fjernes ved behandling af DNA'et 87 DK 174905 B1 med 20 enheder endonuklease (P-L Biochemicals) i 350 yl af en opløsning indeholdende 250 mM NaCl, 30 mM natriumacetat (pH 4,5), 1 mM ZnS04 ved 30°C i 30 minutter. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af EDTA (pH 7,5) ved 10 mM.

5 DNA*et ekstraheres med phenol, koncentreres ved fældning med ethanol og genopløses i 50 pi 10 mM Tris.HCl (pH 7,8), 0,05 mM EDTA.

2. Binding af en kemisk syntetiseret DNA binder til pBR322 nedbrudt med EcoRI og 10 Der fremstilles to oligodeoxynukleotider med formlen 5'-AATTCTATGTGT-3' og 5 '-GATCACACATAGAATT-3' under anvendelse af den i eksempel 10 Ea beskrevne fremgangsmåde .

15 De syntetiske oligodeoxynukleotider phosphoryleres ved deres 5'-ender ved inkubering af 80 pmol af hver af oligodeoxy- 32 -1 nukleotiderne med 20 yCi Ιγ- P]-ATP (6700 Ci.mmol , Amersham) i en 80 μΐ reaktionsblanding indeholdende 0,1 mM rATP (Sigma), 50 mM Tris*HCl (pH 9,5) , 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og*20 enheder 20 Γ4 polynukleotid kinase (P-L Biochemicals) i 30 minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved frysning af blandingen ved -80°C.

Den dannede radioaktivt phosphorylerede binder med formlen

t3 2P)-AATTCTATGTGT

TTAAGATACACACTAG-(3 2 P ] 25 inkuberes derpå med 6 yg pBR322 spaltet, med EcoRI og (se ovenfor] i et reaktionsrumfang på 200 μΐ indeholdende 9,5 mM rATP (Sigma), 0,1 mM DTT (Calbiochem), 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 3 10 mM MgCl2 og 4 x 10 enheder T^ DNA ligase (Biolabs) under inkubering af blandingen i 2 timer ved 15°c.

88 DK 174905 B1

Opløsningen deproteiniseres ved ekstraktion med phenol, og DNA'et koncentreres ved fældning med ethanol. DNA'et genopløses i 100 μΐ 19 mM Tris.HCl (pH 7,5), 0,05 mM EDTA og centrifugeres gennem en saccharosegradient (5-23%) i 50 mM 5 Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA. Centrifugeringen gennemføres ved 60.000 omdr./min. i en TST 60 rotor (Kontron AG) ved 15°C i 2,5 timer. Der udtages 0,2 ml fraktioner med en ISCO

gradient opsamler med 1 ml/min. Fraktionerne indeholdende 32 det I P)-mærkede plasmid DNA (fraktioner 11-14 ud af 22 -10 fraktioner) hældes sammen, DNA'et fældes med ethanol og nedbrydes med 12 enheder Bell (Biolabs) som anbefalet af leverandøren. Efter ekstraktion med phenol og fældning med ethanol behandles det nedbrudt DNA med 10 enheder PstI (Biolabs) under anvendelse af den af leverandøren anbefalede fremgangs-15 måde. Den phenolekstraherede nedbrydningsblanding centrifugeres derpå gennem en (5-23%) saccharose densitet gradient i 15 timer ved 35.000 omdr./min. ved 15°C i en TST 41 rotor (Kontron AG). Der udtages 0,3 ml fraktioner (se ovenfor), og 32 fraktionerne indeholdende det store ( P]-mærkede BclI-PstI 20 DNA-fragment (fraktioner 27-31 ud af 42 fraktioner) hældes sammen og koncentreres ved fældning med ethanol. DNA'et genopløses i 20 yl Tris.HCl pH 7,8, 0,05 mM EDTA.

c) Binding af acceptor plasmid fragmentet til cDNA indsætningsdelene 25 2 yl af acceptor plasmid DNA-fragmentet (ca. 10 ng) (se ovenfor) inkuberes med 5 μΐ af hver af cDNA indsætningsdelene (ca. 20 ng) (se ovenfor) i et reaktionsrumfang indeholdende 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 0,1 mM rATP, 0,1 mM DTT og 400 enheder T^ DNA ligase i 10 μΐ i 3 timer ved 15°C.

30 5 y 1 af reaktionsblandingerne sættes derpå til-en blanding in deholdende 150 yl calcium-behandlet Escherichia coli HB 191 i 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 og 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) i et samlet rumfang på 200 yl.

89 DK 174905 B1

Blandingen afkøles i is i 20 minutter, opvarmes til 42°C i 1 minut og inkuberes ved 20°C i 10 minutter. 1 ml tryp-tonmedium (tryptonmedium indeholder 10 g Bacto-Trypton (Difco), 1 g gærekstrakt (Difco), 1 g glucose, 8 g NaCl og 294 mg 5 CaC1.2 ^0 i 1 liter destilleret vand) tilsættes, og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 37°C under omrystning ved 300 omdr./min. Blandingen overføres til to agarplader (McConkey agar, Difco, 0,6 ml pr. plade) tilsat 10 yg/ml tetracyclin (Sigma). Pladerne inkuberes ved 37°C i 12-17 ti-10 mer. Der fås ca. 1000 kolonier pr. transformeringsblanding.

Fire kolonier udtages fra hver transformeringsblanding til yderligere analyse.

d) Restriktionsanalyse af hybrldplasmiderne

Med henblik på yderligere analyse af de potentielle hybrid 15 plasmider isoleres plasmid DNA'et fra 12 kolonier (4 fra hver af de 3 bindingsblandinger, se ovenfor).

Hybrid plasmid DNA'et isoleres på følgende måde: 1 koloni anvendes til inokulering af 10 ml tryptonmedium tilsat 10 yg/ml tetracyclin som ovenfor i en 25 ml Erlenmeyerkolbe.

20 Kulturen rystes i 15-18 timer ved 37°C ved 300 omdr./min.

Cellerne isoleres ved filtrering (Sorvall, HS-4 rotor, 10 minutter ved 4000 omdr./min., 4°C). Der fås ca. 0,1 g celler, som resuspenderes i 1 ml 50 mM Tris.HCl (pH 8.0). Der tilsættes 0,25 ml lysozymopløsning (10 mg/ml i 50 mM Tris.HCl 25 (pH 8,0), lysozymet er fra Sigma), og efter inkubering ved 0°C i 10 minutter tilsættes 0,15 ml 0,5 M EDTA (pH 7,5) .

Efter yderligere 10 minutters forløb ved 0°C tilsættes 60 yl 2% Triton X-100 (Merck). Efter 30 minutters forløb ved 0°C centrifugeres prøven i 30 minutter ved 15.000 omdr./min. og 30 en temperatur på 4°C i en Sorval SA-600 rotor. Supernatanten deproteiniseres med 1 rumfang phenol (mættet med TNE). Faserne adskilles ved centrifugering (Sorval HB-4 rotor) i 10 minutter ved 5000 omdr./min. ved 4°C. Den Øvre fase ekstraheres to gange med 1 rumfang chloroform. Der tilsættes RNAse A 35 udvundet fra pancreas (Sigma, 10 mg/ml Thed "hensyn til TNE) , 90 DK 174905 B1 forvarmet i 20 minutter ved 85°C) til en slutkoncentration på 25 pg/ml, og blandingen inkuberes i 40 minutter ved 37°C. Derpå indstilles opløsningen til 1 M NaCl og 10%'s poly-ethylenglycol 6000 (Fluka, autoklaveret i 20 minutter ved 5 120°C), og der inkuberes ved -10°C i 2 timer. Bundfaldet isoleres i en Sorvall HB-4 rotor (20 minutter ved 10.000 omdrejninger pr. minut, 0°c) og genopløses i 100 pi TNE. DNA-opløsningen ekstraheres med 1 rumfang phenol, og DNA’et fældes med 2 rumfang ethanol ved -80°C i 10 minutter.

10 Bundfaldet isoleres ved centrifugering i en Eppendorf-centri-fuge, og DNA* ét genopløses i 20 pi 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Fra 10 ml kultur udvindes 8-10 pg hybrid plasmid DNA.

Alle plasmid DNA'erne analyseres ved hjælp af følgende dob-15 beltnedbrydninger: 0,5 pg DNA nedbrydes med Hindlll (Biolabs) og PvuII (Biolabs), Hindlll og PstI (Biolabs), Hindlll og BamH^ (Biolabs), EcoRI (Biolabs) og PstI under anvendelse af standardfremgangsmåder, og der foretages fraktionering med hensyn til størrelse på en 1,5% agarosegel i 40 mM Tris.

20 acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA indeholdende 0,5 pg/ml EtBr.

Hybrid plasmiderne med de ønskede restriktionsenzymmønstre udvælges. Resultaterne er vist i fig. 29 og 30. Plasmid DNA indeholdende den indsatte del afledt af pBR322/HLyclFN-8£ eller pBR322/RLycIFN-51 eller pBR322/HLycIFN-l'b betegnes 25 henholdsvis CG-pBR322/HLycIFN (<x-3)-252 og CG-pBR322/HLyc IFN (0.-2)-261 cg OG-pBR322/HLycXFN(a-l)-258. '

For yderligere at bekræfte strukturen af samlingspunktet mellem binderen og begyndelsen af kodningssekvensen i IFN cDNA'erne, bestemmes nukleotidsekvensen i dette område.

30 2 pg af den isolerede plasmid DNA CG-pBR322/HLyclFN (a-1) -258 nedbrydes med EcoRI, mærkes i 5'-endestillingen og spaltes med PstI. DNA-fragmenterne fraktioneres på en 6%'s polyacryl-amid-gel, og EcoRI*-PstI (9,4 bp) DNA-fragmentet ekstraheres som beskrevet ovenfor. DNA-fragmentet underkastes sekvens- 91 DK 174905 B1 analyse under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Maxam og Gilberg (15) .

Strukturen ved samlingspunktet mellem binderen og starten af kodningssekvensen i IFN cDNA'erne i plasmider 5 CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 og CG-pBR322/HLycIFN(a-3)-252 bekræftes på tilsvarende måde.

I plasmiderne CG-pBR322/HLycIFN(a-1)-258, (a-2)-261 og (4—3)-252 findes der foran IFN kodningssekvenserne følgende nukleotidsegment indeholdende et EcoRI restriktionssted:

10 EcoRI Sau3A

-NGAATTCTATGTGTGATC......

-NCTTAAGATACACACTAG......

t-> IFN gen

Eksempel 24.

15 Sletning af PHQ5 signalsekvensen i kopieringsplasmidet p31 (se fig. 31)

Kopieringplasmidet p31 indeholder PH05 promotor sekvensen, som indbefatter mRNA startstederne, translationsstartcocon 20 ATG'et i sur phosphatase og yderligere 40 nukleotider, som koder for en del af sur phosphatase signalsekvensen. I denne konstruktion fjernes nukleotiderne for signalsekvensen og ATG'et ved nedbrydning med Bal31. EcoRI bindere indføres for at opnå binding af PH05 promotoren til passende fuld-25 stændige kodningssekvenser (f.eks. interferongener).

a) Bal31 nedbrydning af Ball spaltet plasmid p30 20 yg p30 DNA (se eksempel 4b)) nedbrydes med restriktions-endonuklease Ball, hvorved der fås to fragmenter på henholds- DK 174905 B1 92 *

vis 3,7 og 5,1 kb. Efter ekstraktion med phenol/chloroform fældes DNA'et med ethanol. DNA'et resuspenderes i 10 mM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 0,5 yg/ml. 9 yg Ball spaltet p30 DNA nedbrydes med 2 enheder exonuclease Bal31 (BRL) i 5 100 yl 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 12 mM MgClj, 12 mM

CaCl2 og 1 mM EDTA. Alikvoter på 2 yg DNA udtages efter inkubering i henholdsvis 15 sekunder, 30 sekunder, 45 sekunder og 60 sekunder ved 30°c og blandes straks med 50 yl phenol og 60 yl TNE. Efter ekstraktion med phenol/chloroform 10 og fældning med ethanol resuspenderes DNA’et i 10 mM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 100 yg/ml. Til analyse af udstrækningen af exonucleolytisk spaltning ved Bal31 nedbrydes 0,5 yg DNA fra de enkelte tidspunkter ved endonuklease BamHI og analyseres på en 1,5% agarosegel i Tris-borat-puffer 15 pH 8,3. I gennemsnit er 70 bp fjernet fra hver ende af fragmentet efter nedbrydning i 45 sekunder med Bal31. Til yderligere forsøg anvendes DNA, som har været behandlet i 45 sekunder .

93 DK 174905 B1 b) Addition af EcoRI bindere til det Bal31-behandlede DNA To a26Q enheder af EcoRI bindere (5*-GGAATTCC-3*, BRL) re-suspenderes i 250 yl 10 mM Tris pH 8, 1 jnM EDTA. 2 yg EcoRI bindere kinasebehandles i 75 yl 60 aM Tris pH 7,5, 10 mM 5 MgCl2, 15 mM DDT, 10 ym ATP og 33 enheder T4 polynukleotid kinase (Boehringer) Efter 1 times forløb ved 37°C henstilles blandingen til afkøling ved stuetemperatur, hvorefter den opbevares ved -20°C.

De anellerede, dobbeltstrengede EcoRI bindere ligeres 10 eller bindes med deres korte ender til det Bal31-behandle-de DNA fragmenter. Et halv mikrogram Bal31-behandlede DNA (se eksempel 24a) inkuberes i 16 timer ved stuetemperatur med den 50-dobbelte mængde kinasebehandlede EcoRI bindere i 20 yl 60 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP 15 og 600 enheder T4 DNA ligase (Biolabs). Efter inaktivering af T4 DNA ligasen (10 minutter ved 65°C) spaltes overskuddet af EcoRI bindere med 50 enheder EcoRI (Boehringer) i et rumfang på 50 yl. DNA'et ekstraheres med phenol/chloroform, fældes med ethanol og resuspenderes i 10 mM Tris, 20 1 mM EDTA.

Restriktionsendonuklease EcoRI spalter ikke blot terminalt adderede EcoRI bindere i begge Ball fragmenter (3,7 kb og 5,1 kb), men også ved et indre EcoRI sted i 5,1 kb fragmentet, hvorved der dannes et 3,9 kb fragment og et 1,2 kb 25 fragment. 3,7 kb og 3,9 kb fragmenterne adskilles fra 1,2 kb fragmentet på en 0,8%'s lavtsmeltende agarosegel (Sigma) i 90 mM Tris-HCl pH 8,3, 90 mM borsyre og 2,5 mM EDTA. DNA7 båndene farves med ethidiumbromid og gøres synlige ved belysning med langbølget ultraviolet lys ved 366 nm. De to 30 DNA fragmenter på 3,7 kb og 3,9 kb er ikke adskilt. De udskæres af gelen i en enkelt gelblok og ekstraheres under anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde.

De lineære fragmenter, der afsluttes i EcoRI klæbrige ender, bringes på cirkulær form ved binding. Ca. 0,25 yg fragmen-35 ter bindes i 100 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgC^* 10 mM DTT, 1 mM ATP og 600 enheder T4 DNA ligase i 4 timer ved 94 DK 174905 B1 15°C.

10 μΐ alikvoter af bindingsblandingen sættes til 100 yl calciumbehandlede/ transformationskompetente Escherichia p coli HB101 celler (se eksempel 4a). 35 transformerede, amp 5 kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 yg/ ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Holmes et. al., (50) og analyseres ved dobbeltnedbrydning med EcoRI/BamHI.

c) Nukleotidsekvensanalyse til bestemmelse af stillingen 10 af EcoRI binderadditionen_

Størsteparten af de 35 kloner vil afvige indbyrdes med hensyn til stillingen af EcoRI binderaddition i i pH05 promotorområdet afhængigt af graden af Bal31 nedbrydning i de enkelte DNA molekyler. Med henblik på nukleotidsekvensana-15 lyse nedbrydes plasmid DNA med EcoRI. Efter ekstraktion med phenol/chloroform fældes det spaltede DNA med ethanol. Der foretages dephosphorylering og 5'-terminalmarkering af DNA'et under anvendelse af den i eksempel 10Ed beskrevne fremgangsmåde. De mærkede DNA fragmenter spaltes med en anden re-20 striktionsendonuklease, BamHI. Produkterne adskilles på en 0,8%' lavtsmeltende agarosegel. Det 0,5-0,6 kb 5’-mærkede EcoRI-BamHI fragment isoleres fra lavtsmeltende agarose under anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde. Til bestemmelse af nukleotidsekvensen i nabostilling 25 til EcoRI binderen nedbrydes de forskellige DNA fragmenter kemisk, og produkterne adskilles ved polyacrylgelelektro-forese som beskrevet af Maxam og Gilbert (15) .

De forskellige kloner og positionen for det tilsvarende sidste nukleotid i PH05 sekvensen (derefter efterfulgt af en 30 EcoRI binder) er anført i nedenstående tabel 4 (se også fig. 32).

95 DK 174905 B1

Tabel 4

Klon position af sidste nukleotid i PH05 sekvensen pE +25 pG +16 5 pe +15 pd +12 pY · - 4 pR -10 pP -16 10 pV -18 pL -21 pN -22 pC -24 pH -27 15 pS -28 pk -29 pi -38 pM -50 pO -53 20 pF -59 pro -67 pK -73 pi -81 ph -137 25 d) Isolering af et 0,53 kb BamHI-EcoRI fragment indeholden- de PHQ5/R promotoren:_

Plasmid pR indeholder PHQ5/R promotoren på et 534 bp BamHI-EcoRI fragment. I overensstemmelse med den i fig. 3 anførte nummerering dækker fragmentet PH05 promotorsekvenserne fra 30 nukleotid -541 (BamHI sted) til nukleotid -10. En EcoRI

binder, bundet til nukleotid -10 (se eksempel 24b) bidrager til 2 G-rester efter EcoRI spaltning.

Plasmid pR nedbrydes med restriktionsendonukleaser BamHI og EcoRI. 0,53 kb BamHI-EcoRI fragmentet separeres på en 0,8% 35 lavtsmeltende agarosegel og isoleres under anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde. Nukleotidsekven-sen er anført i fig. 33.

r “tt-- 96 DK 174905 B1 På analog måde nedbrydes plasmid pY, og der isoleres et 0,53 kb BamHI-EcoRI fragment indeholdende PH05/Y promotoren. Nukleotidsekvensen er anført fig. 34.

e) Ombytning af Sall-EcoRI fragmentet plasmid p31 med 5 et Sall-EcoRI fragment af de hidtil ukendte konstruktioner__ 5 yg plasmid p31 (jfr. eksempel 13d) nedbrydes med restrik-tionsendonuklease Sall. Det spaltede DNA fældes med ethanol og resuspenderes i 50 yl 100 mM Tris pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 5 mM MgC^· DNA'et nedbrydes fuldstændigt med EcoRI. Re striktionsfragmenterne adskilles på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. Et 3,5 kb DNA fragment isoleres i en lille gelblok indeholdende DNA båndet.

15 5 yg af hver af klonerne pR og pY (jfr. tabel 4 og fig. 32) nedbrydes med Sall og EcoRI på samme måde som beskrevet ovenfor. 0,8 kb DNA fragmenterne isoleres i små blokke af lavtsmeltende agarosegel.

0,67 yg af 3,5 kb' Sall-EcoRI fragmentet af vektor p31 bin-20 des til 0,34 yg af 0,8 kb Sall-EcoRI fragmentet af henholdsvis plasmid pR eller pY. Passende gelblokke indeholdende DNA fragmenterne blandes og smeltes ved 65°C. Den flydende gel fortyndes tre gange. Der foretages binding i et samlet rumfang af 240 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2# 10 mM 25 DTT, 1 mM ATP med 750 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) natten over ved 15°C. 2 yl alikvoter af hver af blandingerne sættes til 100 yl calciumbehandlede, transformationskompetente Eschericia coli HB101 celler (se eksempel 4a).

R

8 transformerede amp kolonier dyrkes hver for sig i LB-30 medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA analyseres ved restriktionsanalyse. Klonerne i hver gruppe er identiske. En klon for hver gruppe anvendes i det efterfølgende og betegnes som henholdsvis p31/R eller p31/Y (fig. 31).

97 DK 174905 B1

Eksempel 25

Indføring af lymphoblastoidt interferon-α-3- DNA i plasmid p31/R eller p31/Y (jfr. fiq. 35_

Denne konstruktion forbinder PH05 promotorområdet til ge-5 net, som koder for færdig udviklet interferon-a-3. Hverken signalsekvenserne i PH05 eller interferon er til stede, men der findes en EcoRI binder, som er indført på samlingsstedet.

Plasmid p31/R (se eksempel 24e) indeholder PH05 promotor-10 sekvensen, som afsluttes 9 nukleotider før ATG'et i sur phosphatase genet med en EcoRI binder 5'-GGAATTCC-3'. Det lymphoblastoide interferon-a-3 gen i plasmid CG-pBR322/HLyc IFN(a-3)-252 (se eksempel 23) er specifikt tilpasset til samlingen til EcoRI binderen i PH05 promotoren. De yder-15 ligere nukleotider ved 5'-enden i kodningssekvensen i fuldt udviklede interferon-a-3 giver et EcoRI restriktionssted og et ATG, som er nødvendigt for transplationen af interferongenet (jfr. fig. 29) . Stort set samme kontruk-tion gennemføres også ved plasmid p31/Y (se eksempel 24e) .

20 a) Fremstilling af EcoRI-spaltet, dephosphoryleret plasmid p31/R___ 5 pg plasmid p31/R nedbrydes fuldstændigt med restriktions-endonuklease EcoRI (Boehringer). Efter ekstrkation med phenol/chloroform fældes DNA'et med ethanol og resuspen-25 deres i 100 μΐ 50 mM Tris pH 8,0. DNA*et ledes gennem

Chelex 100 (BioRAD), dephosphoryleres med kalvetarm alkalisk phosphatase (Boehringer), og det dephosphorylerede DNA renses ved DE52 ionby tterkroma tograf i som beskrevet i eksempel 14b. DNA*et resuspenderes i 10 mM Tris.HCl 30 pH 7,5, 1 mM EDTA ved en koncentration på 0,2 mg/ml.

b) Isolering af et 0,6 kb EcoRI fragment af plasmid CG-pBR322/HLycIFN(a-3)-252 indeholdende IFN-a-3 kod- ninqssekvensen_ 10 pg plasmid G-pBR322/HLycIFN(α-3)-252 nedbrydes med re-35 striktionsendonuklease EcoRI. Nedbrydningen resulterer i 98 DK 174905 B1 to fragmenter på 3,8 kb og 0,6 kb. 0,6 kb fragmentet indeholder området, som koder for interferon-a-3. Fragmentet isoleres på en 0,6% lavtsmeltende agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer. Gelstykket indeholdende 0,6 kb DNA fragmen-5 tet udskæres af gelen og anvendes til binding.

c) Binding af lineariseret dephosphoryleret p31/R DNA og 0,6 kb EcoRI fragmentet af IFN-a-3 DNA_ 1,5 ug dephosphoryleret p31/R vektor DNA spaltet med EcoRI bindes til 0,19 pig af 0,6 kb EcoRI fragmentet af IFN-a-3.

10 Sidstnævnte fragment er indeholdt i en lille blok lavtsmeltende agarosegel, som smeltes ved 65°C. Den smeltede gel fortyndes to gange. Der foretages binding i et samlet rumfang af 220 vil 60 mM Tris pH 7,5, 10 aM MgC^, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 800 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) 15 natten over ved 15°C. En 10 μΐ alikvot af bindingsblandingen sættes til 100 yl calciumbehandlede transformationskompetente Eschericia coli HB101 celler {se eksempel 4a).

R

6 transformerede amp kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 pg/rol ampicillin. Plasmid DNA 20 fremstilles under anvendelse af fremgangsmåden ifølge

Holmes et. al., (50), og analyseres ved dobbeltnedbrydninger med Bglll/BstEII til bestemmelse af orienteringen og størrelsen af den indsatte del. En af disse kloner betegnes p3lR/IF (ct-3) .

25 Den samme konstruktion gennemføres med p31/Y (se eksempel t> 24e) . Plasmider fra 6 transformerede amp kolonier analyseres. 2 kloner har den rigtige orientering af den indsatte del. En af disse betegnes p31Y/IF(a-3).

Eksempel 26 30 Indføring af lymphoblastoid interferon-a-2 DNA i plas-mid p31/R (se fig. 36)_

Denne konstruktion forbinder PHQ5 promotoren til det fuldt udviklede interferon-a-2 kodnings område.

99 DK 174905 B1 a) Isolering af et 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragment af vektor P31/R_|__ 10 yg af vektor p31/R nedbrydes fuldstændingt med Hindlll.

Pufferen indstilles med 0,1 rumfang 1 M Tris pH 7,5. Det 5 Hindlll-spaltede p31/R DNA nedbrydes derpå med EcoRI. 3.9 kb Hindlll-EcoRI fragmentet isoleres fra en 0,8% lavtsmelten-de agarosegel i en gelblok udskåret af gelen.

b) Isolering af et 0,9 kb Xbal-Hindlll fragment af pJDB207/ ^2(5^ 10 5 yg plasmid pJDB207/IF2(5^) (jfr. eksempel 17) nedbrydes fuldstændigt med Hindlll. Pufferen indstilles med 0,1 rumfang 1 M Tris pH 7,9. Det Hindlll-spaltede plasmid nedbrydes derpå med Xbal. 0,9 kb XbaX-Hindlll fragmentet indeholder en del af interferon-a-2:—kodningssekvensen og ned-15 strøms PH05 transskriptionstermineringssignalerne. 0,9 kb fragmentet separeres på en 0,8% lavtsmeltende agarosegel og udskæres af gelen.

c) Isolering af et 252 bp EcoRI-Xbal fragment af plasmid CG-pBR322/HLycIFN(a-2)-261 indeholdende en del af IFN- 20 α-2-kodningssekvensen_ 10 yg plasmid CG-pBR322/HLyclFN(α-2)-261 (se eksempel 23) nedbrydes med Xbal i 100 yl 6 mM Tris pH 7,9, 150 mM NaCl, 6 mM MgCl2 og 6 mM mercaptoethanol. Efter fuldstændig nedbrydning med Xbal nedbrydes det lineariserede plasmid DNA 25 delvis med 3 enheder EcoRI (Boehringer). Efter 20 minutter ved 37°C afbrydes nedbrydningen ved nedfrysning til -70°C.

DNA fragmenterne analyseres på em 1,5% agarosegel i Tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 252 bp EcoRI-Xbal fragmentet indeholder 5'-delen af den fuldstændige interferon-a-2-30 kodningssekvens (op til Xbal stedet) med den specifikke binder for samlingen med PH05 promotoren. 252 bp fragmentet isoleres i en lille gelblok fra en 0,8% lavtsmeltende agarosegel.

d) Binding af DNA fragmenter 35 3 DNA fragmenter beskrevet i eksempel 26a-c med passende 100 DK 174905 B1 klæbrige ender bindes i én reaktion: 0,67 ug af 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragmentet af vektor p31/R, 0,16 ug af 0,9 kb Xbal-Hindlll fragmentet af pJDB207/IF2(5^) og ca. 70 ng 250 bp EcoRI-Xbal fragmentet af CG-pBR322/ 5 HLycIFN(a-2)-261 bindes. Alle tre DNA fragmenter er indeholdt i små gelblokke af lavtsmeltende agarose. De tre stykker agarosegel anbringes sammen, smeltes ved 65°C og fortyndes tre gange. Bindingen gennemføres i samlet rumfang af 450 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 10 1 mM ATP med 1200 enheder T4 ligase ved 15°C i 16 timer.

En 10 μΐ alikvot af bindingsblandingen sættes til 100 yl calciumbehandlede transformationskompetente Escherichia coli HB101 celler (se eksempel 4a).

D

12 transformerede amp kolonier dyrkes hver for sig i LB 15 medium indeholdende 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Holmes et.al. (50), og analyseres ved dobbeltnedbrydning med BamBI/Hindlll. Alle kloner udviser et identisk nedbrydningsmønster. En af dem betggnes p31R/IF(a-2) .

20 I stedet for 0,9 kb Xbal-Hindlll fragmentet af pJDB207/ IF2(5^) kan der anvendes et 0,5 kb Xbal-Hindlll fragment af plasmid pJDB207/IF2 (5χ) Δ72 eller pJDB207/IF2 (5χ) Δ82' (se eksempel 22) til bindingen- Endvidere kan der i stedet for 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragmentet af vektor p31/R til bin-25 ding en anvendes 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragmentet af vektor p31/Y.

Betingelser for binding af DNA fragmenterne og transformationen af Escherichia coli HB101 er de samme som beskrevet ovenfor.

30 12 transformerede amp kolonier fra hver binding dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 vg/ml ampicillin. Plasmid DNA analyseres ved dobbeltnedbrydning med BamHI/

Hindlll. De dannede kloner betegnes p3lR/IF(α-2)Δ72, p3lR/!F(a-2)^82, p31Y/IF(a-2), p31Y/IF(a-2)Δ72 og p31/IF(a-2)Δ82.

101 DK 174905 B1

Eksempel 27

Indføring af lymphoblastoidt interferon-α-Ι i plasmid p31/R (se fig. 37)___ a) Isolering af 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragment af vektor 5 p31/R;_ 10 yg af vektor p31/R nedbrydes med Hindlll og EcoRI som beskrevet i eksempel 26a. De dannede 0,4 kb og 3,9 kb fragmenter adskilles på en præparativ 0,8% lavtsmeltende aga-rosegel. 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragmentet elueres fra gelen 10 under anvendelse af den i eksempel 4a beskrevne fremgangsmåde. DNA'et renses ved DE52 (Whatman) ionbytningskromatografi (se eksempel 5a), fældes med ethanol og resuspen-deres i 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA i en koncentration på 0,1 mg/ml.

15 b) Isolering af 0,9 kb PvuII-Hindlll fragment af pJDB207/ IF2 (1 *b) :_ 5 yg plasmid pJDB207/IF2 (l'b) (jfr. eksempel 17) nedbrydes med PvuII og Hindlll. De dannede fragmenter på 0,9 kb og 7,3 kb adskilles på en præparativ 0,8% lavtsmeltende 20 agarosegel. 0,9 kb fragmentet elueres fra gelen og renses under anvendelse af den i eksempel 27a beskrevne fremgangsmåde. DNA'et resuspenderes i 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA i en koncentration på 0,05 mg/ml.

c) Isolering af, et286 bp.EcoRI-PvuII fragment af plasmid 25 CG-pBR322/HLycIFN(α-1)-258 indeholdende en del af IFN-a-1 kodningssekvensen_ 10 yg plasmid CG-pBR322/HLycIFN(α-1)-258 (se eksempel 23) nedbrydes med PvuII og EcoRI. Et 286 bp restriktionsfragment adskilles fra et 4,2 kb fragment på en præparativ 0,8% lavt-30 smeltende agarosegel. 286 bp EcoRI-PvuII fragmentet elueres fra gelen og renses under anvendelse af den i eksempel 27a beskrevne fremgangsmåde. DNA’et resuspenderes i 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA i en koncentration på 0,03 mg/ml.

102 DK 174905 B1 d) Binding af DNA-fragroenter 0,5 yg af 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragmentet af vektor p31/R, 0,25 yg af 0,9 kb PvuII-Hindlll fragmentet af pJDB207/IF2(1 ’b) og 0,1 yg af 286 bp EcoRI-PvuII fragmentet af plasmid 5 CG-pBR322HLycIFN(a-1)-258 bindes i 16 timer ved 15°C i 20 yl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 5 mM ATP og 600 enheder DNA ligase. En 3 yl alikvot af bindingsblandingen sættes til 100 yl calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia coli HB101 celler (se eksempel 4a)).

10 12 transformerede, amp kolonier dyrkes hver for sig i LB

medium med 100 yg/ml ampicillin. Plasmid DNA analyseres ved dobbeltnedbrydning med BamHI/Hindlll. En klon, som fremkalder et 1,4 kb BamHI fragment og et 390 bp BamHI-Hindlll fragment, analyseres yderligere og betegnes p3lR/IF(a-1) .

15 3,9 kb Hindlll-EcoRI fragmentet af vektor p31/R kan ombyttes med Hindlll-EcoRI fragmentet af vektor p31/Y. I stedet for 0,9 kb PvuII-Hindlll fragmentet af pJDB207/IF2(1’b) kan der anvendes et 0,45 kb PvuII-Hindlll fragment af pJDB207/XF2(1'b)Δ til bindingen. De dannede kloner analyseres 20 pa samme måde som beskrevet ovenfor. Klonerne betegnes p31R/IF(a-1)Δ , p3lY/IF(a-l) og p31Y/IF(a-1)Λ.

Eksempel 28.

Underkloning af genkonstruktioner i gærvektoren pJDB207 1 højt kopiantal (se fig. 38).

25 Konstruktionerne beskrevet i eksempel 25-27 indeholder PH05 promotoren, forskellige interferon kodningsområder og PH05 transskriptionsterminalsignalerne i et tandemarrangement, alle indsat i en pBR322-afledt vektor. Sall-Hindlll fragmenter indeholdende hele arrangementet bindes til 6,2 kb Sall- 30 Hindlll fragmentet af pJDB207 under anvendelse af den eksempel 17 beskrevne fremgangsmåde.

103 DK 174905 B1 2 yg plasmid p31R/IF(a-3) nedbrydes med restriktionsendonukle-aser Sall og Hindlll. Restriktionsfragmenterne adskilles på en præparativ 0,8% lavt smeltende agarosegel. Det lille fragment (størrelse på 1,8 kb) udskæres af gelen.

5 Plasmid pJDB207 nedbrydes med restriktionsendonukleaser Sall og Hindlll, og den største fragment på 6,2 kb isoleres under anvendelse af den i eksempel 17 beskrevne fremgangsmåde.

Binding af DNA-fragmenterne og transformation af kompetente Escherichia coli HB101 celler gennemføres ved anvendelse af 10 den i eksempel 17 beskrevne fremgangsmåde. 8 amp kolonier dyrkes hver for sig i LB medium indeholdende 100 yg/ml am-picillin. Plasmid DNA’et analyseres med hensyn til størrelsen af den indsatte del ved spaltning med restriktionsendonukleaser Hindlll og Salll. En klon med den korrekte indsatte 15 del udvælges og betegnes pJDB207R/lF (a-3).

På tilsvarende måde, idet man starter ud fra plasmiderne p31Y/IF(a-3), p31R/IF(a-2), p3lR/IF(a-2)Δ72, p3lR/IF(a-2)Δ82, p31Y/IF(a-2), p31Y/IF(a-2) Δ72, p3lY/IF(α-2·)Δ82, p31R/IFtD , p31R/IF(a-1)Δ, p3lY/IF(a-l) og p3lY/IF(a-1)Δ, fremstilles 20 nedenstående kloner med korrekte indsatte dele: pJDB207Y/IF (a-3) , pJDB207R/IF(a-2) , pJDB207R/IF(a-2)Δ72, pJDB207R/IF(a-2)Δ82, 25 pJDB207Y/IF(a-2), pJDB207Y/IF(a-2)Δ72, pJDB207Y/IF(a-2)Δ82, pJDB207R/IF(a-1), pJDB207R/IF (a-1) Δ, 30 pJDB207Y/IF(a-1) og pJDB207Y/IF(a-1)Δ.

104 DK 174905 B1

Eksempel 29.

Transformation af Saccharomyces cerevisiae ΛΗ220 og induktion af interferonproduktion

Plasmider pJDB207/IF2 (5^72, pJDB207/!F2 (5χ)Δ82, 5 pJDB207/IF2 (1 'b) Δ» pJDB207R/IF (a-3) , pJDB207Y/IF (a-3) , pJDB207R/IF(ar2) , pJDB207R/IF (a-2) Δ72, pJDB207R/IF(a-2)Δ82, pJDB207Y/IF(a-2), pJDB207Y/IF(a-2)Δ72, pJDB207Y/IF(a-2)A82, pJDB207P/IF(a-1), pJDB207R/IF(a-1)Δ, pJDB207Y/IF(a-1) og pJDB207Y/IF(a-1)Δ (se henholdsvis eksem-10 pel 22 og 28) indføres hver for sig i Saccharomyces cerevi- · siae stamme AH220 (a, trpl, leu2-3, leu2-112, his3, pho5, pho3) under anvendelse af transformationsmetoden beskrevet af Hinnen et al. (1) . Transformerede gærceller udvælges på gærminimalmediumplader, som mangler leucin. Enkelte transfor-15 merede gærkolonier udtages og dyrkes under anvendelse af den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde. De forskellige gærkolonier betegnes på følgende måde;

Saccharomyces cerevisiae AH220/pjDB207/IF2(5^)Δ72,

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(51)Δ82, 20 Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207/IF2(l'b)Δ,

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-3),

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-3),

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-2),

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(α-2)Δ72, 25 Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-2)Δ82,

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(a-2),

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/IF(α-2)Δ72, Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207,Y/IF (α-2) Δ82 ,

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-1), 30 Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207R/IF(a-1)Δ,

Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207Y/lF(a-1) og Saccharomyces cerevisiae AH220/pJDB207y/IF(a-1)Δ 105 DK 174905 B1

Eksempel 30.

Transformation af Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 og induktion af interferonproduktion

Analogt med fremgangsmåden beskrevet i eksempel 29 transfor- 5 meres Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 (a, his3-ll,

R

his3-15, leu2-3, leu2-112, can ) med plasmiderne anført i eksempel 29. De forskellige gærkolonier betegnes på følgende måde:

Saccharomyces cerevisiae GKF18/pJDB207/IF2(5^)Δ72, 10 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pjDB207/IF2(5^)A82,

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/IF2(l’b)Δ,

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207R/IF(a-3).,

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207Y/IF(a-3),

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-2), 15 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(a-2)Δ72, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(α-2)Δ82,

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207Y/IF(a-2),

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207Y/IF(a-2)Δ72,

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207Y/IF(α-2)Δ82, 20 Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF (α -1) ,

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/IF(α-1)Δ,

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207Y/IF(α-1) og Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207Y/IF(α-1)Δ.

Eksempel 31.

25 Fremstilling af gærcelleekstrakter og bestemmelse af interferonkoncentrationen

Celler fra 50 ml dyrkningsmedium med en celletæthed på 7 1-2 x 10 /ml samles ved centrifugering i en Sorval GSA rotor i 10 minutter ved 3000 omdrejninger pr. minut. Celler resuspen-30 deres i 2ml 0,1 Μ KI^PO^ pH 7,4, og centrifugeres ved stuetemperatur i 5 minutter ved 3000 omdr./min. Det udfældede celler resuspenderes i 1,2 ml iskold lyseringsblanding 106 DK 174905 B1 [0,1 M kaliumphosphatpuffer pH 7,4, 1% (rumfang/rumfang)

Triton X-100, 0,1 mM PMSF (Merck)) og overføres til et 30 ml Corex-rør. 1,6 g glasperler (0,4 mm i diameter) sættes til cellerne, og suspensionen rystes på et hvirvelblan-5 deapparatur (Scientific Instruments Inc., USA) med fuld hastighed i 30 sekunder, hvorefter der afkøles i 1 minut i et isbad. Denne omrystningsmetode gentages 5-10 gange, indtil mere end 90% af cellerne er blevet nedbrudt (kontrol under lysmikroskop).

10 Cellerester og glasperler fjernes fra opløsningen ved centrifugering i 10 minutter ved 8000 orodr./min. ved 4°c i en Sor-vall HB-4 rotor. Supernatanten overføres til Eppendorf-rør, som fryses i flydende nitrogen og opbevares ved -60°C. Interferonaktiviteten bestemmes under anvendelse af metoden 15 ifølge Armstrong (32) samt under anvendelse af humane CCL-23 celler og vesikulær stomatitis virus (VSV) som challenger viruset. Resultaterne er anført i tabel 5.

Interferonaktiviteten i Saccharomyces cerevisiae stamme AH220 og GRF18 efter transformeringen med et rekombinant plasmid 20 er stort set identisk. Tabel 6 viser en sammenligning af interferonaktiviteterne hos begge stammer efter transformering roed de soro eksempler anførte plasmider.

107 DK 174905 B1

Tabel 5

Interferonaktivitet i Saccharomyces cerevisiae stamme AH220 efter transformering med følgende rekombinant plasmider:

Interferonaktivitet udtrykt i 5 Plasmider Eksem- enh./ml gærcel^ enh./l gærcelle- pel leekstrakt kultur p^n^OT/IFia’p 17 1·107 2-10® pJDB207B/IF (or-3) 28 1-10® 2-109 pJDB207Y/IF(o-3) 28 1-108 2-109 10 pJDB207/IFl(51) 17 7-105 1.4-107 PJDB207/IF2(51> 17 5-105 1.0·107 PJDB207/IF3(51> 17 3·103 6.3-104 PJDB207/IF2(51)A72 22 5·105 1·10? pJDB207/IF2(51)A82 22 5-105 1·107 15 pJDB207R/TF(tr-2) 28 1-107 2*10® pJDB207R/IF(e-2)A72 28 1-107 2*10® pJDB207B/IF(a-2)&82 28 1·107 2·10® pJDB207X/IF (α-2) 28 WO7 2 ΊΟ® pJDB207l/IF(a-2)A72 28 1·10? 2·10® 20 pJDB207Y/IF(a-2)A82 28 1·10? 2·10® pJDB207/IF2(l'b) 17 Α-10® 8*104 pJDB207/IF2(l*b)A 22 1·103 2·104 pJDB207B/IF(a-l) 28 5* ΙΟ4 1*106 ρ.Π)Β2071ί/ΙΓ(ότΊ)Δ 28 4*104 8·10® 25 pJDB207Y/lF(«~l) 28 5*ΙΟ4 1·106 pJDB207T/IF(<i-l)a 28 4*104 8.105 108 DK 174905 B1

Tabel 6

Sammenligning af interferonaktivitet i Saccharomyces cere-visiae stammer AH220 og GRF18 efter transformering med følgende rekombinantplasmider:

Interferonaktivitet (enh./l gærcelle-5 Plasmider kultur) AH220 GRF18 pJDB207/IF(8£) 2 x 10® 2 x 10® pJDB207R/IF(a-3) 2 x 109 2 x 109 pJDB207/IF2{51) 1 x 107 9 χ 106 10 pJDB207R/IF(a-2) 2 x 10® 2 x 10® pJDB207R/IF(α-2)Δ82 2 x 10® 2 x 10®

Eksempel 32.

Fremstilling af interferon-a-2 ved hjalp af en rekombinant-stamme af gæren Saccharomyces cerevlsiae i 300 litér skala 15 Saccharomyces cerevisiae stamme GRFl8/pJDB207R/IF(α-2)Δ82 bærer et plåsmid, som indeholder en leucinmarkør, der tillader selektiv opretholdelse af plasmidet i værtsorganismen, et strukturgen for humant interferon-a-2 og sur phosphatase PH05 promotoren, som tillader kopiering af IFN-a-2-genet i 20 medier indeholdende begrænsende mængder uorganisk phosphat.

Stammen holdes på agarskrårør fremstillet ud fra et define-» ret medium, som mangler aminosyren leucin, for at sikre tilbageholdelse af plasmidet. Frisk inokulerede skrårør inkuberes i 24 timer ved 30°C. Overfladekulturen af ét skrårør 25 resuspenderes i 3 ml for dyrkningsmedium, som derefter overføres til en første rystekolbeforkultur. 500 ml-kolben har en enkelt prelplade og indeholder 100 ml fordyrket medium med følgende sammensætning (værdier i g/1): Gærekstrakt (Difco) 10,0, L-asparagin 6,6, KI^PO^ 1,0, MgS0^.7H20 1,0, L-histi-30 din 0,02 og D-glucose (monohydrat) 33,0.

109 DK 174905 B1

Mediet, som er fremstillet under anvendelse af deioniseret vand, har en pH-værdi på ca. 6,0. Glucosen steriliseres særskilt. Denne første prækultur inkuberes i 24 timer ved 30°C på et orbitalrystebord med 5 cm's vandring ved en hastighed 5 på 250 perioder" pr. minut.

Den første forkulturkolbe indeholder mediet for de andre forkulturkolber. Disse kolber tilføres en inokulummængde på 1% rumfang/rumfang. Mediet og inkubationsbetingelserne er identiske med dem, der anvendes ved den første forkultur.

10 Dyrkningsveskerne fra 36 sådanne kolber kombineres til tilvejebringelse af 1% rumfang/rumfang inokulum til hovedproduktionsfermenter ingsapparatet.

Produktionsfermenteringsapparatet har et samlet rumfang på ca. 500 liter, indeholder 4 prelplader og en enkelt 6-bladet 15 pladeturbineomrører med en diameter på 230 mm. Omrøringshastigheden er 450 omdr./min., overtrykket er 0,3 bar og beluftningshastigheden er 1 vol/vol/min.

Fermenteringsbeholderen indeholder 300 liter medium, som har følgende sammensætning (værdier angives i g/1): L-asparagin 20 2,0, L-histidin 0,02, KH2P04 0,03, MgSO4.7H20 0,5,NaCl 0,1,

CaCl2.2H20 0,1, KCl 1,0, D-glucose (monohydrat) 20,0, vitaminopløsning, 5 ml/1 og sporelementopløsning 5 ml/1.

Mediet indstilles på pH-værdien 7,2 under anvendelse af NaOH inden sterilisering. Glucosen, vitaminerne og sporstof-25 ferne steriliseres separat og sættes til mediet. Stamopløsnin-gerne for vitaminer og sporelementer har følgende sammensætninger (i g/1): Vitaminer - biotin 0,0002, calcium-D-panto-thenat 0,04, folinsyre 0,0002, nicotinsyre 0,04, p-amino-benzoesyre 0,02, pyridoxin-hydrochlorid 0,04, riboflavin 0,02, 30 thiamin-hydrochlorid 0,04 og inositol 0,2 i 1 liter deioniseret vand, sporstoffer - borsyre 0,05, CuS04.5H20 0,004,

Kl 0,01, FeCl3.6H20 0,02, MnS04.4H20 0,04, Na2Mo04.2H20 0,02 og ZnS04-7H20 0,04 i 1 liter deioniseret vand. Fermenterings-temperaturen er 30°C. pH-Værdien falder til en værdi på ca.

110 DK 174905 B1 4,0-4,2, men kan om ønsket reguleres til en mellemliggende værdi under anvendelse af natriumhydroxid. Efter dyrkning i ca. 18 timer nås det maksimale udbytte af interferon [bestemt ifølge Armstrong (32)J Den optiske tæthed, som ud-5 gør ca. 2,0 enheder, og sur phosphatase aktiviteten er nyttige indikationer for fermenteringens fremskridt. Dyrkningsvæsken kan om nødvendigt afkøles til 10°C inden indhøstnin-gen af gærcellerne.

Eksempel 33.

10 Isolering og rensning af HLylFN-a-2 a) Fremstilling af polypeptidopløsninqen til den roonoklonale antistofsøjle

Et samlet rumfang på 600 liter dyrkningsvæske med en pH-værdi på 4,1 afkøles til til 10°C. Cellerne isoleres ved hjælp af 15 en slamfjernelsescentrifuge (Alfa-Laval BRPX-207). Den klare supernatant indeholder ingen IFN-aktivitet. Resterende super-natantvæske indeholdt : i cellerne fortrænges ved vaskning med 20 lyseringspuffer A [100 mM KH2PC>4, 500 mM NaCl, 0,1% rumfang/rumfang Triton-X-100® og 0,1 mM PMSF indstillet med 20 KOH til pH 7,5]. Indholdet af centrifugeskålen (7-liter) udtømmes under fuldstændig fjernelse, og slamfjernelsescentrifugen vaskes én gang med 5 liter lyseringspuffer A. Den fremkomne cellemasse fortyndes med puffer A til 60 liter og har en pH-værdi på 7,3. Suspensionen afkøles til 5-10°C og ledes 25 gennem en DYNO®-mølle (type KD5) med en tilførselshastighed på 100 1/time. Møllen er forsynet med polyurethan-omrørings-plader og 4200 ml glasperler med en diameter på 0,5-0,75 mm diameter, og den drives med en omrøringshastighed på 1625 omdr./min. Suspensionen af de oplukkede celler (pH ca. 7,3) 30 centrifugeres som beskrevet ovenfor. Supernatanten (75 liter) koncentreres til 3 liter ved ultrafiltrering. 300 ml af denne polypeptidopløsning ledes gennem en H1P100 hulfilterpatron ved hjælp af et Amicon DC-2 hulfibersystem. Til filteret sæt- 111 DK 174905 B1 tes yderligere 2 liter puf fer sy stem B 130 mM Tris.HCl, 500 mM NaCl, Indstillet på pH 8,5J. De sammenblandede filtrater og vaskevæsker {2 liter) koncentreres til 100 ml ved hjælp af en H1P10 hulfilterpatron. Koncentratet adsor-5 beres på en søjle af DEAE-Trisacryl· M DEAE (LKB Ltd.) .

Søjlen vaskes, hvorefter den elueres med puffer C (200 mM NaCl, 25 mM Tris.HCl ved pH 8,5). Eluatet har en interferonaktivitet på 1,4 x 106 lE/mg polypeptid ved analyse ifølge Armstrong (32). Eluatet opbevares ved -20°C inden 10 yderligere rensning på den monoklonale antistofsøjle.

b) Rensning af humant LyIFN-a-2 på en monoklonal antistof søjle

Den monoklonale antistofsøjle NK2 (fra firma CELLTECH U.K.) (lejerumfang 20 ml) ækvilibreres med 20 mM Na-phosphat, 154 mM NaCl, pH 7,4, og portioner af den ovenfor fremstillede 15 polypeptidopløsning sættes til søjlen ved stuetemperatur med en strømningshastighed på 50 ml/time. De første fraktioner indeholdende de ikke-adsorberede polypeptider og 100 ml PBS vaskevæske kasseres. Andre uspecifikke bundne polypeptider elueres med 110 ml PBS indeholdende yderligere 0,5 NaCl og 20 0,2% Triton X 100®. Søjlen vaskes med 200 ml 20 mM Na-phos phat, 0,3 M NaCl, pH 7,4, hvorefter de specifikt adsorberede polypeptider elueres med 50 ml puffer D (0,1 M citronsyre, 0,3 M NaCl, pH 2). Denne opløsning indstilles på pH 6,3 med 2 N natriumhydroxidopløsning og koncentreres ved 4°C ved mw 25 hjælp af en nedsænkelig CX molekylseparator (Millipore®). Koncentratet sættes til en søjle med Sephadex G-25® (fine) (2,6 x 34 cm, lejerumfang 200 ml) ækvilibreret med 0,025 M histidin.HCl ved pH 6,3. Søjlen elueres med den samme histi-din.HCl-buffer ved 4°C og en strømningshastighed på 42 ml/time. 30 20 Fraktioner på 10,5 ml udtages. Polypeptidholdige fraktioner påvises ved hjælp af deres optiske absorption ved 280 nm. Fraktioner 7 og 8 indeholder polypeptidet med IFN-aktivitet, som lokaliseret ved analyse ifølge Armstrong (32) . De aktive fraktioner indeholdende LyIFN-a-2 opbevares ved -20°C indtil 35 yderligere anvendelse. IFN-aktiviteten i fraktionerne er 1,8 x 10^ IE/mg polypeptid (32).

112 DK 174905 B1

Ved lyofilisering af de ovenfor fremstillede fraktioner fra 1 ml opløsninger fås 20-40 yg polypeptid.

SDS-polyacrylamidgelelektroforese (jf. (53)) giver en molekylvægt for det fremstillede LyIFN-a-2 på ca. 18 kDalton.

5 Eksempel 34.

Interferonudsklllelse fra transformerede gærceller til dyrkningsmediet

For at fastlægge virkningen af en N-terminal proteinsignal-sekvens på proteinsekretion dyrkes gærstamme Saccharomyces 10 cerevisiae GRFl8/pJDB207/IF(8£) (indeholdende en hybridsig-nalsekvens, jf. eksempel 17) og gærstamme Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207R/IF(a-3) (uden signalsekvens) som beskrevet i eksempel 28. Mængden af det producerede interferon i dyrkningsmediet samt mængden af interferon i celleekstrak-15 terne (fremstillet som beskrevet i eksempel 31) bestemmes/ og resultaterne er anført i tabel 7.

Tabel 7·

Sammenligning af interferonudsklllelse fra transfermeret Saccharomyces cerevisiae GKF18 stammer til dyrkningsmediet; 20 Interferonaktivitet (enh./l gær-

Saccharomyces cerevisiae cellekultur) stamme celleekstrakt dyrkningsmedium 3RF18/pJDB207R/IF(a-3) 1,5 x 109 <3 X 104 3RF18/pJDB207/IF(8') 2 x 108 2 x 107 -i---- 113 DK 174905 B1

Referencer 1. A.Hinnen et al., "Transformation of yeast", Proc.Natl. Acad.Sci. USA T±> 1929 (1978) 2. J.D.Beggs, "Transformation of yeast by a replicating 5 hybrid plasmid", Nature 275, 104 (1978) 3. J.Hicks et al., "Properties of yeast transformation".

Cold Spring Harbor, Symp.Quant.Biol. 4Z, 1305 (1979) 4. K.Struhl et al., "High-frequency transformation of yeast, autonomous replication of hybrid DNA molecyles", 10 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76, 1035 (1979) 5. R.A.Hitzeman et al., "Expression of a human gene for interferon in yeast". Nature 293, 717 (1981) 6. J.D.Beggs et al., "Abnormal expression of chromosal rabbit (5-globin gene in Saccharomyces cerevisiae", 15 Nature 283, 835 (1980) 7. R.Axel, "The use of eukaryotic promoter sequences in the production of proteinaceous materials", PCT patentansøgning 81/02425 8. J.A.Carbon et al., "DNA capable of replication and stable 20 mitotic maintenance in a host eukaryote, method of pre paration thereof and eukaryotic cell containing same", europæisk patentansøgning 48081 (The regents of the University of California) 9. D.T.Stinchcomb et al., "Eukaryotic autonomously replicat- 25 ing segment", europæisk patentansøgning 45573 (The board of trustees of Leland Stanford Junior University) 10. "Plasmidvektoren, Hybridplasmide und ihre Verwendung zur Herstellung von Proteinen", DE offentliggørelsesskrift nr. 2.923.297 (Institut Pasteur) 30 11. "Procédé de production de prot§ines par expression des génes correspondents dans des microorganismes et vecteurs susceptibles d'etre mis en oeuvre dans de tels procédés", FR patentansøgning 2.458.585 (Institut Pasteur) 12. M.Aigle et al., "Nouveaux plasmides hybrides et micro-35 organismes les contenant", europæisk patentansøgning nr. 11562 (Agence nationale de valorisation de la recherche) 114 DK 174905 B1 13. A.Schurr et al., J.Gen.Microbiol. 65, 291 (1971) og A.Toh-e et al.. Mol.Gen.Genet. 162, 139 (1978) 14. P.Mildner et al-, Biochim.Biophys.Acta 429, 274 (1976) 15. A.M.Maxam et al. i "Methods in Enzymology", bd. 65, 5 side 499, New York 1980 16. A.Hinnen et al., "Vectors for cloning in yeast", Curr.

Top.Microbiol.Immunol. 9£, 101 (1982) 17. A.Hinnen et al. i "Eukaryotic Gene Regulation", bd. 14, side 43, New York 1979 10 18. "Genetic Engineering" (udg. A.M.Chakrabarty), West Palm

Beach 1978 19. J.Lodder, "The Yeasts", Amsterdam 1971 20. M.Grunstein et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 72, 3961 (1979) 21. A.Jimenez et al.. Nature 287, 869 (1980) 15 22. T.Staehelin et al., J.Biol.Chem. 256, 9750 (1981) 23. M.V.Olson et al., J.Mol.Biol. 132, 387 (1979) 24. H.Meyer, FEBS Lett. 90, 341 (1978) 25- B.Hohn et al. i "Genetic Engineering", bd. 2, side 169,

New York 1980 20 26. B.Hohn i "Methods in Enzymology", bd. 68, side 299,

New York 1979 27. N.Mantei et al., Gene 10, 1 (1980) 28. J.D.Beggs i "Genetic Engineering", bd. 2, side 175,

New York 1981 25 29. M.Mandel et al., J.Mol.Biol. 53, 159 (1970) 30. J.H.Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor 1972 31. A.Toh-e et al., J.Bacteriol. 113, 727 (1973) 32. J.A.Armstrong, Appl.Microbiol. 2JL, 723 (1971) 30 33. J.B.Gurdon, J.Embryol.Exp.Morph. 2£, 401-414 (1968) 34. Barth, J.Embryol.Exp.Morph. 7, 210-222 (1959) 35. A.Colman, Cell 17, 517 (1979) 36. A.Efstratiadis et al., Cell A, 367-378 (1975) 37. T.Maniatis et al., Cell 8, 163-182 (1976) 35 38. J.H.J.Hoeijmakers et al., Gene 8, 391-417 (1980) 39. A.C.Peacock et al., Biochemistry £, 1818 (1967) 40. K.Itakura et al., J.Am.Chem.Soc. 97, 7327 (1975) 115 DK 174905 B1 41. J.F.M.de Rooij et al., Reel .Trav. Chim. Pays-Bas 98, 537-548 (1979) 42. W.Mueller et al., J.Mol.Biol. 124, 343 (1978) 43. D.V.Goeddel et al., Nature 290, 20 (1981) 5 44. C.Weissmann, europæisk patentansøgning nr. 32134 (Bio- gen N.V.) 45. T.Taniguchi et al.. Gene 10^, 11 (1980) 46. M.Streuli et al., Science 209, 1343 (1980) 47. Perlman et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 73, 781 (1982) 10 48. A.J.Berk et al., Cell 12, 721-732 (1977) 49. J.Messing, i det. 3. Cleveland/Svmposium om macromolekyler: Recombinant DNA (udg. A.Walton), Elsevier, Amsterdam 1981, pp. 143-153 50. D.S.Holmes et al., Anal.Biochero. 114, 193-197 (1981) 15 51. N.M.Gough et al., J.Mol.Biol. 162, 43-67 (1982) 52. Pasek et al., Nature 282, 575-579 (1979) 53. U.K.Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970).

Claims (29)

1. DNA restriktionsfragment, kendetegnet ved, at det hovedsagelig består af den undertrykkende Saccha-5 romyces cerevisiae sur phosphatase (PH05) promotor omfattende sekvensen G atccgaaagttgtattcaacaagaatgcgcaaatatgtcaacgtatttggaagtcatctt ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAA 10 GGTAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCA CGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAAT GCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTT AATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAG CACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTAT 15 CAAATTGGTCACCTTACTTGGCAAGGCATATACCCATTTGGGATAAGGGTAAACATCTTT gaattgtcgaaatgaaacgtatataagcgctgatgttttgctaagtcgaggttagtatgg cttcatctctcatgagaataagaacaacaacaaatagagcaagcaaattcgagattacca ATGnTAAATCTGTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCCAATGCAGGTACCATr 20 CCCTTAGGCAAACTAGCCGATG eller underfragmenter deraf, som beholder promotorfunktionen. 1 · DNA fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har sekvensen

25 G ATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTT ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAA GGTAAAAGGTTCATAGCGC rm IC1' Π GTCTGCACAAAGAAATATATATTAAA7TAGCA CGTTTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTT 30 AATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAG CACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTAT CAAATTG GTCACCTTACTTG GC AAGGCATATACCCATTTG G G ATAAG GGTAAACATCTTT GAATTGTCGAAATGAAACGTATATAAGCGCTGATGTTTTGCTAAGTCGAGGTTAGTATGG 3 5 CTTCATCTCTCATGAGAATAAGAACAACAACAAATAGAGCAAGCAAATTCGAGATTACCA ATGTTTAAATCTGTTGTTrATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCCAATGCAGGTACCATT CCCTTAGGCAAACTAGCCGATG DK 174905 B1 og underfragmenter deraf, som bibeholder promotorfunktionen.

3. DNA fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har sekvensen

5 G atccgaaagttgtattcaacaagaatgcgcaaatatgtcaacgtatttggaagtcatctt ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAA G GTAAAAG GTTCATAGCG CTTTTTCTTTGTCTG CACAAAG AAATAT AT ATTAAATTAG CA ^ o CGTTTTCGCATA6AACGCAACTGCACAAT GCCAAAAAAAGTAAAAGT GATTAAAAGAGTT AATTGAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAG CACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTAT CAAATTG GTCACCTTACTTG G C AAG GCATATACCCATTTGG G ATAAGG GTAAACATCTTT gaattgtcgaaatgaaacgtatataagcgctgatgttttgctaagtcgag gttactatg g 15 cttcatctctcatgagaataagaacaacaacaaatagagcaagcaaattcggg

4. DNA fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 20 det sekvensen G atccgaaagttgtattcaacaagaatgcgcaaatatgtcaacgtatttggaagtcatctt atgtgcgctgctttaatgttttctcatgtaagcggacgtcgtctataaacttcaaacgaa ggtaaaaggttcatagcgctttttctttgtctgcacaaagaaatatatattaaattagca 25 cgttttcgcatagaacgcaactgcacaatgccaaaaaaagtaaaagtgattaaaagagtt aattgaataggcaatctctaaatgaatcgatacaaccttggcactcacacgtgggactag CACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTnTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATrAT CAAATTGGTCACCTTACTTGGCAAGGCATATACCCATTTGGGATAAGGGTAAACATCTTT 30 GAATTGTCGAAATGAAACGTATATAAGCGCTGATGTTTTGCTAAGTCGAGGTTAGTATGG CTT CATCTCTCATG AG AAT AAG ?AC AACAACAAATAG AG CAAG CAAATTCG AG ATTAG G

5. Fremgangsmåde til fremstilling af et DNA-fragment ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at man 35 (A) fremstiller det sure phosphatase PH05-gen ved komplemen- tering af Saccharomyces cerevisiae-stammer, som mangler sur DK 174905 B1 phosphatase PH05, ved transformering med plasmid DNA fra et Saccharomyces cerevisiae-bibliotek indeholdende vildtypeko-pien af genet og isolerer genet, (B) fremstiller subkloner af det dannede gen og 5 (C) identificerer beliggenheden af promotorområdet for oven nævnte underkloner og isolerer DNA fragmenter indeholdende sur phosphatase PH05-promotoren ved restriktionsnedbrydning og til fremstilling af underfragmenter afkorter de dannede DNA restriktionsfragmenter ved nedbrydning med en restrik-10 tionsendonuklease eller med en passende exonuklease.

6. Gærhybridvektor, kendet egnet ved, at den indeholder en Saccharomyces cerevisiae sur phosphatase promotorsekvens ifølge krav 1-4 og et gær- eller ikke-gærpoly- 15 peptidkodningsområde, som er kontrolleret af promotoren, med den begrænsning, at det nævnte gærpolypeptidkodningsområde ikke er PH05-genet.

7. Gærhybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet 20 ved, at gær- eller ikke-gærpolypeptidkodningsområdet koder for et humant interferon.

8. Gærhybridvektor ifølge krav 7, kendetegnet ved, at gær- eller ikke-gærpolypeptidkodningsområdet koder 25 for et humant lymfoblastoid-interferon.

9. Gærhybridvektor ifølge krav 6-8, kendetegnet ved, at den indeholder yderligere DNA sekvenser afledt af gruppen bestående af et bakterieplasmid, bakteriofag λ, 30 gær 2 μ plasmid og/eller gær kromosomal DNA.

10. Gærhybridvektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den indeholder gær kromosomal DNA omfattende et autonomt kopieringssegment og et markørgen. 35

11. Gærhybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet DK 174905 B1 ved, at den omfatter transskriptionstermineringssignaler for et gærgen.

12. Gærhybridvektor ifølge krav 11, kendeteg- 5 net ved, at den indeholder transskriptionstermineringssig-naler for PH05 genet.

13. Gærhybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at der inden gær- eller ikke-gærpolypeptidkodnngsområdet 10 findes en signalsekvens.

14. Gærhybridvektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at gær- eller ikke-gærpolypeptidkodningsområdet er forbundet med sur phosphatase PH05 promotoren mellem den 15 major sur phosphatase PH05 mRNA start og ATG for sur phosphatase PH05 kodningsområdet.

15. Gærhybridvektor ifølge krav 14, kendetegnet ved, at de yderligere DNA sekvenser omfatter et kopie- 20 ringsudgangspunkt for Escherichia coli og en selektiv genetisk markør for Escherichia coli.

16. Gærhybridvektor ifølge krav 14, kendetegnet ved, at de yderligere DNA sekvenser omfatter et gær kopie- 25 ringsudgangspunkt og en selektiv genetisk markør for gær.

17. Gærhybridvektor ifølge krav 15, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter et gær kopieringsudgangspunkt og en selektiv genetisk markør for gær. 30

18. Fremgangsmåde til fremstilling af en gærhybridvektor ifølge krav 6-17, kendetegnet ved, at man i en vektor DNA indfører et DNA fragment, der hovedsagelig består af Saccharomyces cerevisiae sur phosphatase (PH05) promotor 35 ifølge krav 1-4 og et gær- eller ikke-gærpolypept idkodnings -område, som er kontroleret af promotoren. DK 174905 B1

19. Saccharomyces cerevisiae, kendetegnet ved, at den er transformeret med en gærhybridvektor ifølge krav 6-17.

20. Fremgangsmåde til fremstilling af en transformeret Saccharomyces cerevisiae ifølge krav 19, kendetegnet ved, at man transformerer Saccharomyces cerevisiae med en gærhybridvektor ifølge krav 6-15.

21. Fremgangsmåde til fremstilling af et gær- eller ikke- gærpolypeptid, kendetegnet ved, at man (1) dyrker transformeret Saccharomyces cerevisiae ifølge krav ^1'9 og (2) isolerer og renser polypeptidet.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 21 til fremstilling af et gær- eller ikke-gærpolypeptid, kendetegnet ved, at den transformerede Saccharomyces cerevisiae dyrkes i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare carbonkilder og nitrogenkilder og uorganiske salte. 20

23. Fremgangsmåde ifølge krav 21 til fremstilling af et gær- eller'ikke-gærpolypeptid, kendetegn et ved at dyrkningsmediet indeholder uorganisk phosphat i lav koncentration. 25

24. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at polypeptidet er et humant interferon.

25. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet 30 ved, at det humane interferon er et humant lymphoblastoidt interferon.

26. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at det humane lymphoblastoide interferon er IFN-a-1. 35

27. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet DK 174905 B1 ved, at det humane lymphoblastoide interferon er IFN-a-2.

28. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at det humane lymphoblastoide interferon er IFN-a-3.