DK173175B1

DK173175B1 - Polypeptid indeholdende fragmenter fra de to human respiratorisk syncytial virus-glycoproteiner F og G, vaccine indeholdende dette og ekspressionssystem indeholdende en DNA-sekvens, der kan udtrykke polypeptidet

Info

Publication number: DK173175B1
Application number: DK199001532A
Authority: DK
Inventors: Michael Wathen
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1987-12-23
Filing date: 1990-06-22
Publication date: 2000-03-06
Also published as: JP2716503B2; CA1320163C; EP0396563A1; EP0396563B1; NO902802D0; AU2785089A; FI102382B1; DK153290D0; FI903154A0; FI102382B; NO902802L; MX9203458A; DK153290A; AU617739B2; DE3878468D1; US5194595A; NO300254B1; WO1989005823A1; ATE85622T1; DE3878468T2

Description

6 i DK 173175 B1

Den foreliggende opfindelse angår DNA-præparater, der koder for hidtil ukendte, kimære glycoproteiner, der kan anvendes til frembringelse af virus-specifikke immunrespons -reakt ioner mod human respiratorisk syncytial virus, 5 HRSV. DNA-præparaterne omfatter strukturelle gener, der koder for glycoproteinerne og ekspressions- og replikations-plasmider, der indeholder de strukturelle gener. Opfindelsen angår også værtsceller, der er transformeret med de ovennævnte DNA-præparater samt, vacciner fremstillet ud fra 10 glycoproteinerne.

HRSV blev opdaget i 1956 og findes verden over. Den forårsager sygdomme i det øvre og nedre respiratoriske system, navnlig hos spædbørn og mindre børn. Cirka 30 procent af hospitalsindlagte småbørn med akut respiratorisk sygdom 15 har respiratorisk syncytial virusinfektion. Hos ældre børn og voksne er sygdommen mildere. Hos spædbørn kræver denne alvorlige lidelse ofte hospitalsindlæggelse.

Infektioner med respiratorisk syncytial virus vedrører alle segmenter af det respiratoriske system og er i almin-20 delighed forbundet med feber, hoste, løbende næse og træthed og diagnosticeres klinisk som bronchitis, bronchiolitis, lungebetændelse, croup eller virusinfektion. Hos ældre børn og voksne er viruset i almindelighed begrænset til replika-tion i den øvre del af åndedrætssystemet. Spædbørn kan an-25 gribes mere alvorligt, når viruset angriber lungerne, og beskadigelse af lungerne kan være permanent.

Primær infektion med respiratorisk syncytial virus forekommer tidligt i livet, i almindelighed inden 4 års alderen. Blandt børn har sygdom forårsaget, at dette virus 3 0 har tendens til at forekomme mindst én gang om året i forholdsvis skarpt definerede udbrud af flere måneders varighed. Epidemier er skarpt afgrænsede, i almindelighed i 3 til 5 måneder. Ved undersøgelser af familier har det vist sig, at * børn i de tidlige skoleår hyppigt indfører viruset i hjemmet 35 og inficerer yngre medlemmer af familien mere alvorligt end 2 DK 173175 B1 andre familiemedlemmer. Den kliniske konsekvens af infektionen er alvorligst den første gang og bliver mildere hos ældre individer, der er immunologisk bedre beskyttede.

Sekundære virkninger af respiratorisk syncytial virus 5 kan strække sig fra en svag infektion til alvorlig lungebetændelse og dødsfald. Inflammation af Åndedrætssystemet er ansvarlig for de fleste symptomer. Fuldstændig helbredelse sker i de fleste tilfælde i løbet af én til tre uger under produktion af antistoffer, der synes at vedvare livet igen-10 nem. I De Forenede Stater har ca. 30 procent af 1 år gamle spædbørn og 95 procent af fem år gamle børn cirkulerende respiratorisk syncytialt virus-antistof. Gen-infektioner hos ældre spædbørn, børn og voksne med antistoffer er for det meste milde sygdomme i den øvre del af det respiratoriske 15 system i form af forkølelser.

Omend lave udbytter af virus i cellekultur har hindret HRSV-research, er viruset blevet grundigt studeret. HRSV er et paramyxovirus, der indeholder en enkelt negativ streng af RNA, der transkriberes i 10 overvejende monocistroniske 20 budbringere. Budbringerne er blevet isoleret og translateret in vitro. Produkterne er blevet karakteriseret ved gelelek-troforese, peptidkortlægning og immuno-udfældning som værende af samme art som strukturelle proteiner, der isoleres fra vir ioner. De strukturelle proteiner omfatter et hoved-nucleo-25 capsid-protein (N; molekylvægt ca. 42.000), et nucleocapsid- phosphoprotein (P; molekylvægt ca. 34.000), et stort nucleo-capsid-protein (L; molekylvægt ca. 200.000), et indesluttet matriksprotein (M? molekylvægt ca. 26.000), et matriksglyco-protein (ca. 22.000) og to indesluttede glycoproteiner, 30 fusions-glycoproteinet (F; molekylvægt ca. 68.000 til 70.000) og et andet, methionin-fattigt glycoprotein (G; molekylvægt ca. 84.000 til 90.000). Desuden vides et viralt kodet protein på ca. 9.500 dalton og andre små proteiner at være til stede i inficerede celler, jfr. Collins et al., Identification of 35 a tenth mRNA of HRSV and assignment of polypeptides to the 10 viral genes, J. of Virol. £j), 572-578 (1984) og déri DK 173175 Bl 3 angivne referencer. Yderligere arbejder, der beskriver den molekylære biologi ned hensyn til HSRV, omfatter følgende: (1) Collins et al., Nucleotide Sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial 5 virus, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, £1, 7683-7687 (december 1984), der angiver gensekvensen for F-glycoproteinet, (2) Collins et al., The 1A Protein Gene of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mRNA and a Related Polycistronic Transcript, Virology, 141. 283-291 10 (1985), der angiver gensekvensen for ΙΑ-proteinet, (3) Col lins et al., The Envelope-Associated 22K Protein of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mRNA and a Related Polytranscript, J. of Virol., 54., (nr.

1), 65-71 (april 1985), der angiver gensekvensen for 22K-15 proteinet, (4) Wertz et al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 82., 4075-4079 (juni 1985), der angiver gensekvensen for G-glycoproteinet, og (5) Collins et al.. Correct 20 Sequence for the Major Nucleocapsid Protein mRNA of Respiratory Syncytial Virus, Virology, 146. 69-77 (1985), der angiver gensekvensen for oo -proteinet.

F- og G-glycoproteinerne af HRSV har lignende modstykker i de andre paramyxovira. Ligesom HRSV har andre 25 paramyxovira et F-glycoprotein, der er associeret med fusion af cellemembraner, jfr. P.W. Choppin og A. Scheid, Rev. Infect. Dis. 2, 40-61 (1980) og Merz et al., J. Exp. Med.

151. 275-288 (1980). Det aktive paramyxovirus F-protein består af disulfid-forbundne underenheder, F^ og F2, der 30 dannes ud fra en inaktiv precursor (Fq) ved en specifik indre spaltning med cellulære proteaser, jfr. Scheid og Choppin, Virol. £0, 54-66 (1977). Det andet hoved-glycopro-tein for de fleste paramyxovira betegnes HN-proteinet og er associeret med disse viras hemagglutinin- og neuraminidase-35 aktiviteter. Omend HRSV-G-proteinet ikke har de ovennævnte enzymatiske aktiviteter, er både G- og HN-glycoproteinerne 4 DK 173175 B1 associeret med tilknytningen af virus. Disse glycoproteiner er også strukturelt lignende, idet de har en usædvanlig hydrofob signal-anker-region ved deres amino-terminal, jf.

Wertz et al., PNAS 12, 4075-4079 (1985) og Elango et al., 5 J. Virol. 52, 481-489 (1986).

Der findes ingen tilgængelige effektive vacciner til bekæmpelse af HRSV. Talrige forsøg er blevet gjort på at opnå en virksom vaccine mod HRSV. Friedevald et al.. Journal of the American Medical Association, 204. 690-694 (20. maj 10 1968), beskriver propageringen af respiratorisk syncytial virus i okseembryonisk nyrevævskultur. Virus, der dyrkes ved 34*C eller 28*C, får ikke nedsat infektivitet eller virulens. HRSV, der dyrkes ved 26*C, omend associeret med en nedsættelse af infektivitet for voksne, kan ikke komme i 15 betragtning til anvendelse til prævention af infektion hos voksne, eftersom viruset har begrænset infektivitet og er dårligt immunogent.

Kim et al., Pediatrics, 745-755 (november 1971) angiver, at inaktiveret respiratorisk syncytial virus-vaccine 20 fremstillet ud fra virus, der er dyrket ved 26*C, stimulerer udviklingen af høje niveauer af serum-antistof hos spædbørn og børn fra 6 måneder til 13 år, men hindrer ikke infektion.

McIntosh et al., Pediatric Research, £, 689-696 (1974) diskuterer to eksperimentelle, levende respiratoriske syn-25 cytial virus-vacciner, én fremstillet ud fra virus dyrket ved 26*C, og den anden fremstillet ud fra en temperaturfølsom mutant, der vokser godt ved 32*C og slet ikke ved 37*C eller højere. Den første vaccine er utilfredsstillende, eftersom den ikke beskytter mod infektion, når intervallet 30 mellem vaccination og udsættelse for infektion er større end 4 måneder. Den anden vaccine er også utilfredsstillende derved, at den øjensynligt mister sin temperaturfølsomhed hos nogle vaccinerede individer.

Craighead, Journal of Infectious Diseases, 131. 749-35 753 (juni 1975) diskuterer forsøg udført i 1966, hvor flere 5 grupper af forskere hos spædbørn og mindre børn afprøvede 5 DK 173175 B1 et formaldehyd-behandlet alun-udf*ldet virus dyrket i vævskultur. Ved påfølgende udsættelse for vild virus udviste modtagerne af vaccinen et accentueret mønster af åndedrætssystem! idel ser. Craighead konkluderer, at immunisering med 5 formaldehyd-behandlet virus forøger sygdommens alvor.

Wright et al., Journal of Pediatrics, fifi, 931-936 (juni 1976) beskriver bedømmelsen hos spædbørn af en temperaturfølsom, levende attenueret respiratorisk syncytial vaccine. Omend denne vaccine, når den indgives i et dosis-10 niveau, der er tilstrækkeligt højt til at inficere alle seronegative spædbørn, forårsager mild sygdom i det øvre respiratoriske system, opnås der ved nedsættelse af dosen ikke et acceptabelt niveau med hensyn til infektivitet. Viruset er også genetisk ustabilt, eftersom der er tegn på 15 tab af temperaturf ølsomhed hos én vaccineret person. Der er tegn på potensering af naturlig sygdom med denne vaccine, og gen-infektion forekommer blandt de vaccinerede individer.

I US patentskrifterne nr. 4.122.167 og nr. 4.145.252 beskrives en fremgangsmåde til attenuering af virioner ved 20 seriepassage gennem humane diploide lunge-fibroblaster, og i US patentskrift nr. 4.517.304 beskrives en metode til produktion af imraunogenisk aktive HRSV-proteiner på cellemembranerne af udsatte celler, der dyrkes i kultur. Disse celler injiceres dernæst i en værtsorganisme til fremkaldelse 25 af et immunrespons.

Det rekombinante vaccinia-virus-ekspressionssystem vides særskilt at udtrykke G- og F-glycoproteinerne af HRSV, jfr. Ball et al., Expression of the Major Glycoprotein G of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia 30 Virus Vectors, P.N.A.S., USA, fil, 246-250 (1986) og Olmsted et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individual Contributions of the F and G Glycoproteins to Host Immunity, P.N.A.S., USA, fil, 7462-7466 (1986). Disse 35 to glycoproteiner er også påvist at inducere immunobeskyt-telse hos pattedyr mod en udsættelse for levende HRSV-virus, 6 DK 173175 B1 jfr. Stott et al., Human Respiratory Syncytial Virus Glycoprotein G Expressed from Recombinant Vaccinia Virus Vector Protects Mice Against Live-virus Challenge, Journal of Virology, 61, 607-613 (1986), Walsh et al., Immunization with 5 Glycoprotein Subunits of Respiratory Syncytial Virus to Protect Cotton Rats Against Viral Infection, Journal of Infectious Diseases, 1198-1204 (1987), Wertz et al., Expression of the Fusion Protein of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vectors and Protection 10 of Vaccinated Mice, Journal of Virology, 293-301 (1987), og Elango et al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection Induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1906-1910 (1986).

15 Den foreliggende opfindelse angår et polypeptid, der indeholder en signalsekvens og mindst ét immunogent fragment fra begge humane respiratoriske syncytiale virus-glycopro-teiner F og G. Anvendelsen af dette protein som en vaccine, fremgangsmåder til hindring af HRSV-beslægtet sygdom og 20 fremstilling af dette protein under anvendelse af rekom-binant-teknik omfattes også af den foreliggende opfindelse.

De i det følgende definerede udtryk anvendes i nærværende beskrivelse. Udtrykket "cellekultur" refererer til samlingen af voksende celler afledt fra enten en multicel-25 lulær plante eller et multicellulært dyr, der tillader cellerne at forblive levedygtige uden for den oprindelige plante eller det oprindelige dyr. Udtrykket "i nedadgående retning" identificerer sekvenser, der strækker sig længere i ekspressionsretningen, og kodningsregionen er f.eks. i nedadgående 30 retning fra initieringskodonen. Betegnelsen "mikroorganisme" omfatter både enkelte cellulære prokaryote og eukaryote organismer, f.eks. bakterier, actinomycetes og gærarter. Udtrykket "operon" er en komplet enhed af genekspression og -regulering, herunder strukturelle gener, regulator-gener 35 og kontrol elementer i DNA, der genkendes af regulator-genprodukt. Udtrykket "plasmid" refererer til en autonomt selv- 7 DK 173175 B1 replikerende, extrakromosomal cirkuler DNA og omfatter både ekspressions- og ikke-ekspressionstyperne. Hår en rekombinant mikroorganisme eller cellekultur beskrives som vert for et ekspressionsplasmid, omfatter udtrykket "ekspressicnsplasmid" 5 både extrakromosomal, cirkuler DNA og DNA, der er blevet inkorporeret i vertkromosomet eller -kromosomerne. Når et plasmid opretholdes af en værtcelle, replikeres plasmidet enten stabilt af cellerne under mitose som en autonom struktur eller som en inkorporeret del af vertens genom. Udtrykket 10 "promotor" er en region af DNA, der er involveret i bindingen af RNA-polymerasen til initiering af transkription. Udtrykket "DNA-sekvens" refererer til et enkelt- eller dobbeltstrenget DNA-molekyle, der er sammensat af nucleotidbaser, adenosin, thymidin, cytosin og guanosin. Udtrykket "i det væ-15 sentlige rent” refererer til en sammensætning af protein, der ikke indeholder andet paramyxovirus-protein end det ønskede rekombinante kimære glycoprotein. Skønt de i det væsentlige rene proteiner kan være forurenet med lave niveauer af værtcellebestanddele, er proteinet frit for for-20 urenende strukturelt og ikke-strukturelt viralt protein, der produceres af replikerende paramyxovira. Udtrykket "egnet vært" refererer til en cellekultur eller mikroorganisme, der er kompatibel med et rekombinant plasmid og vil tillade plasmidet at replikere til inkorporering i dets genom eller 25 til at blive udtrykt. Udtrykket "i opadgående retning" identificerer sekvenser, der skrider frem i modsat retning af ekspressionen. Eksempelvis er den bakterielle promotor i opadgående retning fra transkriptionsenheden, medens ini-tierings-kodonen er i opadgående retning fra kodningsre-30 gionen.

Den foreliggende opfindelse omfatter en række molekylære, genetiske manipulationer, der kan opnås på en række forskellige, kendte måder. Manipulationerne kan opsummeres som opnåelse af en cDNA af proteinet, kloningen og replike-„ 35 ringen af cDNA’et i E. coli og ekspressionen af den ønskede cDNA i en egnet vært. De følgende beskrivelser vil i detaljer DK 173175 Bl 8 angive de forskellige metoder, der er tilgængelige til at udtrykket proteinet, og efterfølges af specifikke eksempler på foretrukne metoder. De specifikke sekvens- og basenum-mererings-positioner for et bestemt polypeptid, glycoprotein 5 FG, er angivet i skema 9.

Generelt kan den nomenklatur og de generelle labora-torieprocedurer, der kræves i forbindelse med den foreliggende opfindelse, findes i Haniatis et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 10 Cold Spring Harbor, New York, 1982 (Maniatis).

Alle E. coli-stammer dyrkes på Luria-næringsmedium (LB) med glucose, Difco's Antibiotic Medium nr. 2 og M9-medium suppleret med glucose og syre-hydrolyserede casein-aminosyrer. Stammer med resistens over for antibiotika holdes 15 ved de legemiddelkoncentrationer, der er beskrevet i Maniatis. Transformationer udføres i overensstemmelse med den metode, der er beskrevet af Rowekamp og Firtel, Dev. Biol., 21, 409-418 (1980).

Alle enzymer anvendes i overensstemmelse med fabri-20 kantens instruktioner. Trans formant er analyseres ved koloni-hybridisering som beskrevet i Grunstein og Wallis, Methods in Enzymology, £3, 379-388.

Efter hybridisering fjernes sonderne og opbevares, og filtrene vaskes i 0,1% SDS, 0,2x SSC i i alt 3 timer med 25 5 ændringer på hver 400 ml. Filtrene lufttørres grundigt, monteres og autoradiograferes under anvendelse af Kodak X-OMAT AR-film og Dupont Cronex Lightnening Plus-intensifice-rings-sigter i 16 timer ved -70’C.

Til sekvensbestemmelse af plasmider fremstilles renset 30 plasmid-DNA i overensstemmelse med de metoder, der er beskrevet i Maniatis. Ende-mærkede DNA-fragmenter fremstilles og analyseres ved de kemiske sekvensbestemmmelsesmetoder ifølge Maxam og Gilbert med de modifikationer, der er beskrevet af Collins og Wertz, J. Virol., 51, 65-71 (1985).

35 Nucleotidstørrelser er angivet i enten kilobaser (kb) eller basepar (bp). De pågældende værdier er anslåede 9 DK 173175 B1 værdier, der hidrører fra agarosegel-elektroforese.

Det første trin til opnåelse af ekspression af protein er opnåelse af den DNA-sekvens, der koder for proteinet fra cDNA-kloner. Denne sekvens klones derpå i et ekspressions-5 plasmid, der er i stand til at dirigere transkription af genet og tillade effektiv translation af transkriptionen. Biblioteksnetoden til opnåelse af cDNA-kodende protein er beskrevet generelt i Haniatis og specifikt i Collins og Wertz, cDNA Cloning and Transcriptional Happing of Nine 10 Polyadenylated RNAs Encoded by the Genome of HRSV, Proc.

Natl. Acad. USA 80. 3208-3213 (1983) og de dermed relaterede publikationer N. Elango et al.. Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia virus Ex-15 pressing the RSV G Glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 1906-1910 (1986) og R.A. Olmstead et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individual Contributions of the F and G glycoproteins to Host Immunity, 20 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7462-7466 (1986).

Kloner fremstilles ved indsætning af cDNA i Pstl-spaltet pBR322, til hvilket homopolymere dele af dGTP enzymatisk er blevet tilført ved 3'-enderne ved spaltningsstedet. Homopolymerdele af dCTP sættes enzymatisk til 3'-25 endestillingerne af cDNA-molekylerne i overensstemmelse med de metoder, der er beskrevet af Mainatis. Ideelt set bør der tilføres 10-30 rester af dCTP eller dGTP til maksimering af kloningseffektiviteten. cDNA'en og plasmidet sammenføres og transformeres i E. coli. Klonerne indeholdende cDNA med 30 fuld længde detekteres med sonder af mærket viral cDNA eller oligonucleotider, der er komplementære til dele af gense-kvenserae, efterfulgt af restriktionsenzymanalyse og DNA-sekvensbestemmelse.

Oligonucleotider syntetiseres kemisk i overensstem-„ 35 melse med phosphoramidit-triester-metoden i fast fase, der først er beskrevet af Beaucage og Caruthers, Tetrahedron 10 DK 173175 B1

Letters, 2Z (20), 1859-1862 (1981), under anvendelse af et automatiseret synteseapparat som beskrevet i Needham-Van-Devanter et al.. Nucleic Acids Res., J£, 6159-6168 (1984). Rensning af oligonucleotider sker enten ved nativ acrylamid-5 gelelektroforese eller ved anionbytnings-HPLC som beskrevet af Pearson og Regnier, J. Chrom., 255. 137-149 (1983).

Sekvensen af de syntetiske oligonucleotider kan verificeres ved anvendelse af den kemiske nedbrydningsmetode ifølge Kaxam og Gilbert, Grossman og Moldave, eds., Academic 10 Press, New York, Methods in Enzymology, 65. 499-560 (1980).

Til opnåelse af et højt niveau af ekspression af et klonet gen i et prokaryotisk system er det essentielt at konstruere ekspressionsvektorer, der som et minimum indeholder en kraftig promotor til dirigering af mRNA-transkription, 15 et ribosom-bindingssted til translations-initiering, og en transkriptionsterminator. Eksempler på regulatoriske regioner, der er egnede til dette formål, er promotor- og operator-regionen af E. coli-tryptophan-biosyntesevejen, der er beskrevet af Yanofsky, Kelley og Horn, J. Bacteriol., 158.

20 1018-1024 (1984) og den venstrevendte promotor af phag lambda (PL) som beskrevet af Herskowitz og Hagen, Ann. Rev. Genet., M, 399-445 (1980).

Proteinerne produceret i E. coli vil ikke foldes på korrekt måde på grund af tilstedeværelsen af cystein-rester 25 og på grund af manglen på egnede post-translationelle modifikationer. Under rensning fra E. coli skal de udtrykte proteiner først denatureres og dernæst renatureres. Dette kan udføres ved opløseliggørelse af de E. coli-producerede proteiner i guanidin-HCl og reduktion af alle cystein-rester-30 ne med Ø-mercaptoethanol. Proteinet renatureres derpå enten ved langsom dialyse eller ved gelfiltrering, jfr. US patentskrift nr. 4.511.503.

Detektering af proteiner opnås ved metoder, der er kendte i teknikken, f.eks. radioimmunobestemmelser eller 35 Western blotting-metoder eller immunoudfældning. Rensning fra E. coli kan ske under anvendelse af metoder, der er 11 DK 173175 B1 beskrevet i US patentskrift nr. 4.511.503.

Ekspression af heterologe proteiner i gær er velkendt og beskrevet. Methods in Yeast Genetics, Sherman et al.,

Cold Spring Harbor Laboratory (1982) er et anerkendt værk, 5 der beskriver de forskellige metoder, der anvendes til produktion af proteiner i gær.

Til opnåelse af et højt niveau af ekspression af et gen i gær er det essentielt at forbinde genet til et kraftigt promotor-system som i prokaryoten og også at tilvejebringe 10 effektiv transkriptions-terminerings-/polyadenylerings-se- kvenser fra et gær-gen. Eksempler på egnede promotor-forbindelser omfatter GAL1,10, jfr. Johnston og Davis, Mol. and Cell. Biol., ±, 1440-1448 (1984), ADH2, jfr. Russell et al., J. Biol. Chem. 253l, 2674-2682 (1983), PH05, EMBOJ. £, 15 675-680 (1982) og MFal. Et multikopi-plasmid med en selektiv markør såsom Lue-2, URA-3, Trp-1 eller His-3 er også ønskeligt. MFal-promotoren foretrækkes. MFal-promotoren i en vært af α-associerings-typen er konstitutiv, men mangler diploider eller celler med α-associations-typen. Den kan imidlertid 20 reguleres ved forøgelse eller formindskelse af temperaturen i værter, der har en ts-mutation ved ét af SIR-stederne. Virkningen af en sådan mutation ved 35*C på en celle af a-typen er en aktivering af det normalt "tavse" gen, der koder for α-associerings-typen. Ekspressionen af det "tavse" a-25 associations-type-gen ophæver igen virkningen af MFal-promo-toren. Ved formindskelse af væksttemperaturen til 27*C reverseres hele processen, dvs. at α-associerings-typen fjernes, og MFal aktiveres, jfr. Herskovitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones og 30 Broach, eds., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 181-209 (1982).

Polyadenylerings-sekvenseme tilvejebringes ved 3'-endesekvenserne af ethvert af de højt udtrykte gener, f.eks.

ADHl, MFal eller TPI, jfr. Alber og Kawasaki, J. of Mol.

35 and Appl. Genet. 1, 419-434 (1982).

Et antal gærekspressionsplasmider såsom YEp6, YEpl3 12 DK 173175 B1 og YEp24 kan anvendes som vektorer. Et gen, der har interesse, kan fusioneres til enhver af de ovennævnte promotor-forbindelser og dernæst ligateres til plasmideme til ekspression i forskellige gær-værter. Disse plasmider er fuld-5 stændigt beskrevet i litteraturen, jfr. Botetein et al.,

Gene, £, 17-24 (1979) og Broach et al., Gene, fi, 121-133 (1979).

Der anvendes to metoder ved transformering af gærceller. I ét tilfælde omdannes gærceller først til proto-10 plaster under anvendelse af zymolyase, lyticase eller glusu-lase, efterfulgt af tilsætning af DNA og polyethylenglycol (PEG). De PEG-behandlede protoplaster regenereres derpå i et 3%'s agarmedium under selektive betingelser. Enkeltheder ved denne metode er angivet i offentliggørelserne af Beggs, 15 Nature (London), 275. 104-109 (1978) og Hinnen et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 2£, 1929-1933 (1978). Den anden metode involverer ikke fjernelse af cellevæggen. I stedet behandles cellerne med lithiumchlorid eller -acetat og PEG og anbringes på selektive plader, jfr. Ito et al., J. Bact. 153. 163-168 20 (1983).

cDNA'en kan ligateres til forskellige ekspressionsvektorer til anvendelse ved transformation af vcrtscellekulturer. Vektorerne indeholder alle gensekvenser til initiering af transkription og translation af de proteiner, der er 25 forenelige med den værtscelle, der skal transformeres.

Desuden indeholder vektorerne fortrinsvis en markør til tilvejebringelse af en phenotypisk egenskab til udvælgelse af transformerede værtsceller, f.eks. dihydrofolat-reduk-tase eller metallothionein. Desuden kan en replikationsvektor 30 indeholde en replikon.

Illustrerende eksempler på cellekulturer, der kan anvendes til produktionen af proteiner, er celler af insekteller pattedyroprindelse. Pattedyrs-cellesysteaer vil ofte være i form af monolag af celler, omend der også kan anvendes 35 pattedyrs-cellesuspensioner. Illustrerende eksempler på pattedyrs-cellelinjer omfatter VERO- og HeLa-celler, kine- DK 173175 Bl 13 sisk hamsterovarie-cellelinjer (CHO), WI38, BHK, COS-7 eller MDCK-cellelinjer.

Som angivet ovenfor indeholder den vektor, der anvendes til at transformere værtscellen, fortrinsvis gensekvenser 5 til initiering af transkriptionen og translationen af proteinets gensekvens. Disse sekvenser betegnes som ekspressions-kontrolsekvenser. Når værtscellen er af pattedyr- eller insektoprindelse, opnås illustrerende, anvendelige ekspressions-kontrolsekvenser fra SV-4O-promotoren, jfr. Science, 10 222., 524-527 (1983), CMV I.E.-promotoren, jfr. Proc. Natl.

Acad. Sci. 21, 659-663 (1984), metallothionein-promotoren, jfr. Nature, 296. 39-42 (1982) eller baculovirus-polyhedrin-promotoren (insektceller), jfr. Virol., 131. 561-565 (1983). Plasmidet eller replikerende eller Integrerende DNA-materiale 15 indeholdende ekspressions-kontrolsekvenserne spaltes under anvendelse af restriktionsenzymer og indstilles i størrelse som nødvendigt eller ønskeligt og ligateres med cDNA, der koder for proteiner, under anvendelse af metoder, der er velkendte i teknikken.

2 0 Ligesom i tilfældet med gær skal der, når der anvendes højere dyre-værtsceller, inkorporeres polyadenylerings- eller transkriptions-terminator-sekvenser fra kendte pattedyrsgener i vektoren. Et eksempel på en terminator-sekvens er polyadenylerings-sekvensen fra oksevæksthormon-genet.

25 Yderligere gen-sekvenser til regulering af replikation i værtscellen kan inkorporeres i vektoren, f.eks. sådanne, der findes i okse-papillomavirus-type-vektorer, Saveria-Campo, "Bovine papilloma-virus DNA: a eukaryotic cloning vector", DNA Cloning Vol. II - A practical approach, Glover, 30 ed., IRL Press, Arlington, Virginia, 213-238 (1985).

Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes til at udtrykke proteiner i kinesiske hamsterovarie-celler (CHO), er en overføringsvektor pSVC0W7, der replikerer i både CHO-og E. coli-celler under udnyttelse af ampicillin-resistens, 35 og dihydrofolat-reduktase-gener som markører i henholdsvis E. coli- og CHO-celler. Plasmid pSVC0W7 tilvejebringer også 14 DK 173175 B1 den polyadenylerings-sekvens fra oksevæksthormon, der er nødvendig til ekspression i CHO-celler. Plasmid pSVC0W7 spaltes, og der indsættes en viral promotor og cDNA'er.

Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes ved 5 dannelse af rekombinant baculovirus til ekspression af proteiner i insektceller, er pAc373, jfr. Smith et al.. Hol.

Cell. Biol., 2, 2156-2165 (1983). Plasmidet replikerer i E. coli-celler under udnyttelse af ampicillin-resistens og tilvejebringer det eukaryotiske promotor- og polyadenyle-10 rings-signal fra baculovirus-polyhedrin-genet til ekspression af gener. Plasmid pAc373 spaltes, og en cDNA indsættes stødende op til promotoren. Dette nye plasmid cotransficeres med baculovirus (Autograpa californica keme-polyhedrosis-virus)-DNA i insektceller ved calciumphosphat-fældning.

15 Rekombinant baculovirus, i hvilket pAc373-polyhedrin-genet indeholdende en cDNA er erstattet med det residente virale polyhedrin-gen ved homolog rekombination, detekteres ved "dot blot"-hybridisering under anvendelse af 32P-mærket cDNA som en sonde, jfr. Simmers og Smith, a Manual of Methods 20 for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,

Texas A & M University, College Station, TX, 29-30 (1986). Insektceller inficeret med rekombinant baculovirus kan også differentieres ved hjælp af deres okklusions-negative morfologi, eftersom indsætningen af cDNA'en i polyhedrin-genet 25 hindrer syntesen af dette okklusions-dannende protein.

Den foretrukne ekspressionsvektor, der anvendes i forbindelse med okse-papilloma-virus (BPV) til ekspression af proteiner, er pTFW9 (plasmidet pTWF9 er deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten. Plasmid pTFW9 opret-30 holdes i en E. coli-vært og er deponeret ved Northern Re- -gional Research Center, Peoria, Illinois, USA, den 17. november 1986 og har fået deponeringsnummeret NRRL B-18141). Plasmidet replikerer i E. coli under udnyttelse af ampicil-lin-resistens og tilvejebringer muse-metallothionein-promo-35 toren og sv40-polyadenylerings-signalet til ekspression af gener. Plasmid pTFW9 spaltes, og en cDNA indsættes stødende 15 DK 173175 B1 op til promotoren. Dette nye plasmid epaltes derpå for at tillade indsætning af BPV. Det rekombinante plasmid trans-ficeres i dyreceller ved calciumphosphat-fældning, og foci af transformerede steder udvælges.

5 Værtscellerne er kompetente eller gøres kompetente til transfektion ved forskellige metoder. Der findes flere velkendte metoder til indføring af DNA i dyreceller. Disse omfatter følgende: calciumphosphat-fældning, fusion af de modtagende celler med bakterielle protoplaster indeholdende 10 DNA’en, behandling af de modtagende celler med liposomer indeholdende DNA'en og mikroinjektion af DKA'en direkte i cellerne. De transficerede celler dyrkes ved metoder, der er velkendte i teknikken, jfr. Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, Dowden, Hutchinson og Ross, 15 Inc. (1977). Rekombinante glycoproteiner udtrykt i et af de ovennævnte eukaryotiske ekspressionssystemer isoleres fra cellesuspensioner dannet ved sprængning af værtscellesystemet ved kendte mekaniske eller enzymatiske metoder. Proteiner, der er udformet til at blive udskilt fra cellerne, isoleres 20 fra medierne uden sprængning af cellerne. Til rensning af glycoproteiner er det en hjælp først at påføre den cytoplas-miske fraktion på en lentil-lectin-søjle, der specifikt vil binde glycoproteiner. De eluerede glycoproteiner påføres dernæst på en affinitetssøjle indeholdende antistof.

25 Et typisk glycoprotein kan opdeles i tre regioner.

Ved aminoterminalenden findes der en hydrofob region, der betegnes som signalsekvensen. Denne sekvens af aminosyrer signalerer transporten af glycoproteinet til cellemembranen.

Efter transporten fjernes signalsekvensen ved spaltning. I 30 nedadgående retning fra signalsekvensen findes det extracel-lulære domæne af det modne glycoprotein. Dette er den immunogene del af glycoproteinet, eftersom det er tilgængeligt for antistoffer. Ved carboxy-terminalenden af glycoproteinet findes den hydrofobe anker-region, der bevirker, at glyco-35 proteinet bibeholdes i cellemembranen. HRSV F er et typisk glycoprotein derved, at det indeholder en amino-terminal 16 DK 173175 B1 signalsekvens og carboxy-terminal ankersekvens, jfr. Collins et al., PNAS £1, 7683-7687 (1984). HRSV G-glycoproteinet er imidlertid usædvanligt, eftersom dets aminoterminale ende fungerer både som en signal- og en anker-region, jfr. Wertz 5 et al., PNAS 4075-4079 (1985).

Et glycoprotein kan udformes til at blive udskilt fra celler i de omgivende medier. Dette udføres ved at forårsage en tidlig terminering af glycoproteinet forud for transkription af anker-regionen, jfr. Lasky et al., Biotech-10 nology, 2., 527-532 (1984). Tidlig terminering kan opnås ved indsætning af et universalt translationelt terminator-oligo-nucleotid på et passende sted i genets DNA. Disse oligonu-cleotider er kommercielt tilgængelige. Tidlig terminering kan også opnås ved ændring af aflæsningsrammen, hvorved der 15 dannes en translationel termineringskodon.

Det nedenfor beskrevne kimære glycoprotein består af signal- og extracellulære domæner af HRSV F forbundet til det extracel lulære domæne af HRSV G og vil blive betegnet som FG. Hovedparten af det extracellulære domæne af G glyco-20 proteinet er indeholdt i den kodningsregion, der spændes over af Ddel (nucleotid-stilling 302) og FoKI (nucleotid-stilling 850)-restriktionsenzymstederne. Denne sekvens koder ikke for signal/ankerregionen af glycoproteinet. Hovedparten af det extracel lulære domæne af F-glycoproteinet er indeholdt 25 i kodningsregionen forud for Nsil (nucleotid-stilling 1479)-restriktionsenzymstedet. Denne sekvens koder for signalregionen og hovedparten af den antigene region, men ikke ankerregionen af glycoproteinet.

Til indsætning af G-glycoproteinsekvensen i F-glyco-30 proteinet fordøjes plasmidet G-16 indeholdende HRSV gpG med Ddel og FoKI, og enderne gøres stumpe med Klenov-polymerase.

550 bp-Fragmentet isoleres dernæst ved agarosegel-elektro-forese. Plasmidet pGPF-4 indeholdende HRSV gpF-genet fordøjes med Nsil. Enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase og 35 dephosphoryleres med bakteriel alkalisk phosphatase. 550 bp-Fragmentet fra G-16 ligateres derpå i pGPF-4-plasmidet 17 DK 173175 B1 og transformeres i E. coli HB101. Én af klonerne, pGPFG-1, der Isoleres fra transformationen, verificeres som havende de korrekte forbindelser ved hjælp af Maxim-Gilbert-sekvens-bestemmelse.

5 Når det er korrekt anbragt i en eukaryotisk ekspres sionsvektor, er det ovenfor beskrevne FG-gen udformet til at udtrykke et kim*rt glycoprotein, der vil transporteres til cellens overflade og sekreteres i medierne.

De ovennævnte restriktions-enzymsteder vælges, efter-10 som de tillader ekspressionen af en stor andel af de relevante regioner af F- og G-glycoproteinerne. Andre dele af glycoproteinerne kan imidlertid udtrykkes ved udvælgelse af andre restriktionsenzymsteder i F- og G-kodningssekvenserne til fusion af disse gener. Eksempelvis kan restriktionsen-15 zymerne Alul, Hindi eller HinfI anvendes til spaltning ved 5'-enden af gpG-genet. Restriktionsenzymerne Hphl, MboII eller XhoII kan anvendes til spaltning ved 3’-enden af gpG-genet. Enzymerne kan anvendes i enhver kombination af to, idet ét enzym hidrører fra hver gruppe, til dannelse af 20 immunogene proteinfragmenter. For gpF-genet kan Hinflll, Hindi, Avail, Sspl eller HphI-restriktionsenzymeme anvendes i stedet for Nsil. Linker-oligonucleotider kan tilsættes til korrektion af aflssningsrammen i forbindelsesregionerne.

To oligonucleotider, der vil korrigere de to mulige ram-25 meændringer, er Sall-forbindelsesstykkeme

GGTCGACC og CGGTCGACCG CCAGCTGG GCCAGCTGGC

der er kommercielt tilgængelige. Når der ønskes en ankerregion i glycoproteinet, tilsættes et linker-oligonucleotid 30 også ved den anden forbindelse til at tillade syntese af gpF-ankerregionen. Alternative strategier kan udformes til ekspression af et FG-fusionsprotein ved indsætning eller deletion af forskellige sekvenser. Hovedkriteriet for proteinet er bibeholdelsen af en signalsekvens og de immunolo-35 gisk betydningsfulde regioner af de to glycoproteiner.

Indsætning af FG-gen i CH0-, BPV- eller baculovirus- 18 DK 173175 B1 ekspressionsvektorer er allerede beskrevet.

Det kimære FG-glycoprotein frembyder fordele i forhold til ekspressionen af de individuelle glycoproteiner. Eftersom FG er et enkelt protein, kræver det halvdelen af 5 arbejdet og reagenserne til rensning sammenlignet med de særskilte F- og G-glycoproteiner. Det kimære FG-glycoprotein sekreteres også i medierne til lettelse af rensningen. F-glycoproteinet kan udformes som et sekreteret glycoprotein ved afskæring forud for anker-regionsekvenserne. HRSV βίο glycoproteinet indeholder imidlertid en signal/anker-region ved dets amino-teminale ende. Afskæring af dette glycoprotein vil derfor ikke tilvejebringe en sekreteret form. Sig-nal/anker-regionen kan erstattes med en signalregion fra et fremmed glycoprotein, men herved vil der indføres fremmede 15 proteinsekvenser i den potentielle vaccine.

HRSV F- og G-glycoproteinerne er blevet udtrykt under anvendelse af et vaccinia-virus-ekspressionssystem, og disse rekombinante vira er blevet anvendt som vacciner ved beskyttelse af bomuldsrotter ("cotton rats") mod HRSV-infektion, 20 jfr. Olmsted et al., PNAS fifi, 7462-7466 (1986). Vaccinia-virus, der udtrykker F-glycoproteinet, er signifikant mere immunugent og tilvejebringer bedre beskyttelse end vaccinia-virus, der udtrykker G-glycoproteinet, jfr. Olmsted et al., se ovenfor. Vaccination med begge vira synes ikke at have 25 en additiv effekt i forhold til F alene, jfr. Olmsted et al., se ovenfor. I modsætning hertil synes det sekreterede FG-glycoprotein at være mere immunogent og at tilvejebringe bedre beskyttelse end en sekreteret form af F-glycoproteinet. Vaccination af bomuldsrotter med FG-proteinet giver også en 30 højere procentdel af neutraliserende antistof som defineret ved ELISA til neutralisationsforholdet.

Ét forsøg er udformet til sammenligning af immunoge-niteten af FG og afskåret F (Ft). Eftersom de rekombinante glycoproteiner ikke kan detekteres i ConA (et lectin, der 35 binder glycoproteiner)-rensede ekstrakter ved hjælp af Com-masie-blue-farvning af proteiner, der er elektroforesebe- 19 DK 173175 B1 handlet i SDS-PAGE-geler (formodentlig mindre end 1% af proteinet), anvendes der en indirekte metode til bestemmelse af ækvivalente mængder af glycoproteinerne. Densitometer-aflæsninger af autoradiogrammer indeholdende 35S-methionin-5 mærket protein, der er blevet elektroforesebehandlet på en SDS-PAGE-gel, anvendes til bestemmelse af den relative mængde af FG og Ft i prøverne (FG og Ft indeholder det samme antal methioniner). Disse samme prøver undersøges dernæst ved hjælp af ELISA, og det findes, at ækvivalente mængder af FG 10 reagerer 3 gange bedre end Ft ved den anvendte ELISA-analyse. Mængden af FG eller Ft i prøverne fremstillet til vaccination bestemmes dernæst ved hjælp af ELISA og equaliseres i overensstemmelse med det ovennævnte forhold. Grupperne ved den anvendte undersøgelse er FG, Ft (høj dosis), Ft (lav dosis) 15 og gp50 (negativ kontrol). Bomuldsrotterne vaccineres tre gange i Freund's adjuvans, idet der anvendes 500 μς totalt protein pr. dosis. Mængden af specifikt glycoprotein i FG-gruppen er ækvivalent med lavdosis-Ft-gruppen. Højdosis-Ft-gruppen modtager 3 gange mere specifikt glycoprotein. En 20 sammenfatning af de fra denne undersøgelse opnåede data er angivet i det følgende: LUNGE TITER ELISA-TITER NEUTRAL TITER ELISA/NELJIRAL Gruppe (pfu/gm lunge) (50* ende pt) (50% ende pt) Forhold 25 FG <55 1300 850 1,53

Ft høj 2,0 x 102 1400 285 4,91

Ft lav 6,1 x 103 1000 206 4,85 gp50 2,7 x 105 <100 40 ND (ikke bestemt) 30

Den ovenfor omtalte undersøgelse viser effektiviteten af det kimære FG-glycoprotein under anvendelse af rå præparater af FG i Freunds's adjuvans. Til påvisning af effektiviteten af FG til at inducere høje titere af neutralise-35 rende antistof og beskyttelse af bomuldsrotter mod RSV-på-virkning, foretages der en undersøgelse under anvendelse af DK 173175 Bl 20 mere rensede præparater af FG sammensat i et adjuvans, der er acceptabelt til human anvendelse (alun). FG renses til 50%’s homogenitet under anvendelse af en totrinsmetode, der involverer kationbytning og monoklonale antistof-affinitets-5 søjler. Ft-glycoproteinet renses til 50%'s homogenitet ved lentil-lectin-chromatografi, efterfulgt af monoclonalt an-tistof-affinitetschromatografi. Bomuldsrotter vaccineres to gange med disse glycoproteiner adsorberet i alun (2,5 mg pr. dosis}. Én gruppe rotter vaccineres intranasalt med 10 levende RSV som en positiv kontrol. Én gruppe rotter vaccineres med alun-adjuvanset som en negativ kontrol. Rotter fra hver gruppe afprøves for serum og neutraliserende antistof. Rotterne udsættes for RSV, og lungerne analyseres for viruset.

15

AnCal in· Gennemsnitlig Serum Neut. ficeret lungetiter hos

Gruppe antistof antistof total inficerede rotter 20 25 Mg FG + alun 19500 2834 0/7 5 Mg FG + alun 19200 2027 0/6 1 Mg FG + alun 12000 4096 3/7 3,5 x 102 25 Mg FG + CFA 21500 5029 1/7 1,0 x 102 25 Mg FT + alun 13500 263 2/7 3,0 x 102 25 5 Mg FT + alun 13000 194 4/7 6,7 x 102 alun-indhold <500 10 7/7 9,7 x 10* RSV I.N. 7100 217 1/7 50

Konventioner, der anvendes til at repræsentere plas-30 mider og fragmenter i de følgende skemaer nr. 1-6, skal være synonyme med konventionelle cirkulære fremstillinger af plasmider og deres fragmenter. I modsætning til de cirkulære figurer repræsenterer de enkeltlinjede figurer i skemaerne både cirkulær og lineær dobbeltstrenget DNA med initiering 35 eller transkription forekommende fra venstre til højre (5' til 3'). Stjerner (*) repræsenterer brodannelse af nucleo-tider til fuldstændiggørelse af den cirkulære form af plas- 21 DK 173175 B1 miderne. Fragmenter har ikke nogen stjernemarkeringer, eftersom de er lineære stykker af dobbeltstrenget DNA. Endonu-clease-restriktionssteder er angivet over linjen. Gen-markører er angivet under linjen. Linjestykker angivet under 5 diagrammerne, der repræsenterer plasmidet eller fragmenter, anvendes til at angive antallet af basepar mellem to punkter på DNA1en. Den relative afstand mellem markører angiver ikke faktiske afstande, men skal blot indikere deres relative positioner på den illustrerede DNA-sekvens.

10 Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende udførelseseksempler.

Eksempel.i

Fjernelse af G-C-halerne fra F-glvcoproteln-oenet 15 Til opnåelse af maksimal ekspression af F-glycopro- teinet skal de G-C-nucleotider, der anvendes til at indsætte cDNA'en i plasmidet pBR322, fjernes fra 5'-enden (i forhold til den oprindelige mRNA) af cDNA'en. Til bekvem indsætning af gpFG-cDNA'en i den foretrukne ekspressionsvektor for 20 CHO-celler, pSVC0W7 (beskrevet nedenfor), er det nødvendigt at tilføre et BamHI-sted i opadgående retning fra proteinkodningssekvensen. Til opnåelse af dette indsættes cDNA'en af F-glycoprotein i pUC12 (PL Pharmacia Labs, Piscataway, NJ). Metoder til syntese af cDNA-klonen F5-25, der indeholder 25 hele sekvensen for F-glycoproteinet, er blevet beskrevet, jfr. Collins et al., Nucleotide sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus, jfr. J. Virol., £1, 7683-7687 (december 1984).

30 A. Konstruktion af pGPF2 - Skema 1 cDNA'en af F-glycoproteinet flankeres af Pstl-steder (skema 1) , men der findes imidlertid også indre Pstl-steder. Plasmidet pF5-25 fordøjes derfor partielt med PstI og fragment 1 (1,9 kb) isoleret fra en gel. Fragment 1 ligateres 35 til plasmidet pUC12 (Bethesda Res. Labs., Rockville, MD) , der er blevet fordøjet med PstI. Et plasmid med 5'-enden af 22 DK 173175 B1 gpF-genet stødende op til Xbal-stedet i pUC12 udvælges og betegnes pGPF2 (4,6 kb). Denne orientering verificeres ved spaltning ned Nsil og Hindlll, der danner et fragment på ca. 400 bp.

5 B. Konstruktion af PGPF3 og pCPF4 - Skema 2

Til fjernelse af G-C-nucleotiderne fra 5'-enden af cDNA'en åbnes pGPF2 med Xbal, og enderne behandles med bakteriel alkalisk phosphatase til dannelse af fragment 3.

10 Fragment 3 fordøjes derpå med Sall, der afskærer et lille stykke mellem Xbal- og Pstl-stederne, og behandles med Kle-now-enzym til afglatning af enderne. Efter behandling med Klenow-enzym fordøjes fragment 3 med Lambda-exonuclease, der kræver et 5'-phosphat og efterlader et 3'-overhæng. På 15 grund af fjernelsen af 5'-phosphatet på den ende, der befinder sig i opadgående retning fra gpF, vil exonucleasen fordøje i nedadgående retning mod gpF-sekvensen. Exonucleasen gives tilstrækkelig tid til fjernelse af nucleotider udover G/C-hale-regionen ind i leder-sekvensen. En syntetisk sekvens 20 indeholdende de første 15 baser af ledersekvensen hybridi-seres til fragment 4, og de manglende baser udfyldes med Klenow-enzym, og enderne ligateres med T4-ligase, hvorved der fås pGPF3 (4,6 kb), der transformeres i E. coli, og sekvensen verificeres.

25 Til fjernelse af G-C-nucleotiderne fra 3'-enden af cDNA åbnes pGPf3 med Hindlll og behandles med exonucleasen Bal 31 i et tilstrækkeligt tidsrum til fordøjelse gennem G-C-nucleotiderne. Enderne gøres stumpe med Klenow-enzym, og cDNA-klonen befries for vektor-DNA'en ved digestion med 30 BamHI. cDNA-fragmentet isoleres fra en gel og ligateres til plasmid pUCl2, der er blevet fordøjet med BamHI og Hindi (Hindi er foreneligt med stumpe ender) til dannelse af pGPF4. Plasmidet transformeres i E. coli, og en passende klon, der er tilstrækkeligt fordøjet med Bal31, identificeres 35 ved sekvensbestemmelse. Alternativt kan G-C-nucleotiderne fjernes ved fordøjelse med et restriktionsenzym, der har et 23 DK 173175 B1 unikt sted i opadgående retning fra G-C-nucleotiderne. For gpF vil en sådant enzym være Haell. Eftersom Haelll spalter i opadgående retning fra F-genets normale translations-ter-minations-signal, vil et universelt translations-termina-5 tions-oligonucleotid (New England Biolabs) ligateres på F- cDNA'en efter fordejelse med Haelll. DNA'en vil dernæst fordejes med BamHI og behandles som beskrevet ovenfor til dannelse af pGPF-4.

10 Eksempel 2

Konstruktion af et kimært HRSV-FG-glvcoproteln-gen_T-Skema._3· A. Fremstilling af HRSV--G-glvcoprot eln-genet

Klon G2B-16 indeholdende hele kodningsregionen for HRSV-G-glycoproteinet er blevet beskrevet, jfr. Wertz et 15 al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral membrane protein, PNAS, £2, 4075-4079 (1985). Klon G2B-16 indeholdende G-glycoprotein-cDNA'en fordøjes med Ddel og FoKI, og enderne gøres stumpe med E· coli-DNA-polymerase 20 (Klenow-fragment). DNA'en elektroforesebehandles derpå i en 1,5%'s agarose-gel. 550 bp-fragmentet (fragment 4) indeholdende den relevante region af G-genet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen.

25 IL_Indsætning af G-cDNA-fragmentet i HRSV-F-givcoprotein genet

Plasmidet pGPF4 (Skema 2) fordøjes med Nsil. Enderne gøres stumpe med T4 DNA-polymerase og dephosphoryleres dernæst med bakteriel alkalisk phosphatase. 550 bp-fragmentet 30 af G-cDNA'en ligateres derpå i plasmid pGPF4 til dannelse af det kimære FG-gen (pGPFG-1). Plasmidet transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges for korrekt orientering af G-cDNA'en i F-genet ved fordøjelse med HinfI, der vil danne forbindelsesfragmenter på 875 bp og 186 bp. Den 35 ukorrekte orientering af G-fragmentet vil give forbindelsesfragmenter på 650 bp og 400 bp ved Hinfl-fordøjelse. Forbin- 24 DK 173175 B1 delsesregionerne af en på korrekt måde orienteret klon verificeres derpå som værende korrekt ved Maxam-Gilbert-sekvens-bestemmelse.

Ifølge det ovenstående eksempel vil der dannes et 5 gen, der koder for et kimært glycoprotein indeholdende signal- og immunogen-regionen af F-glycoproteinet forbundet til den immunogene region af G-glycoproteinet. Eftersom den anden forbindelse (G til F) bevirker et rammeskift og trans-lations-termination, vil der ikke være nogen anker-region 10 til stede i glycoproteinet.

Eksempel 3

Anvendelse af DNA-ollqonucleotid-forbindelsesled til regulering af aflæsninasrammen af et kimært HRSV-FG-alvcopro-15 tein - Skema 4 Såfremt restriktionsenzymer, der er forskellige fra de, der er angivet i eksempel 2, anvendes til forbindelse af F- og G-generne, kan der forekomme et rammeskift ved den første forbindelse mellem F og G, hvilket fører til tidlig 20 translationel terminering af glycoproteinet. Dette kan undgås ved anvendelse af oligonucleotid-forbindelsesled, der vil gendanne den korrekte aflæsningsramme.

A. Fremstilling af HKSV-G-alvcoprotein-genet 25 Klon-plasmid G2B-16 indeholdende G-glycoprotein- cDNA'en fordøjes med Hphl, og enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase. Sall-forbindelsesledet

CGGTCGACCG

GCCAGCTGGC

30 (New England Biolabs) ligateres til enderne af DNA'en. DNA’en fordøjes med Sall og elektroforesebehandles i en 1,5%'s agarosegel. 410 bp-fragmentet (fragment 5) indeholdende den relevante region af G-genet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen.

35 25 DK 173175 B1 B. Indsætning af G-cDNA-fracrmentet 1 HRSyrEralvcoproteinr ge^et

Plasmidet pGPF4 fordøjes med Nsil, og enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase. Sall-forbindelsesledet, der 5 er angivet ovenfor, ligateres til enderne af pGPF4-DNA'en. DNA'en fordøjes med Sall og elektroforesebehandles i en 1%'s agarosegel. 4,4 kb-fragmentet udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen. 4,4 kb-pGPF4-DNA-fragmentet og 410 bp-G-fragmentet ligateres sammen til dannelse af pGPFG-10 2 og transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og ud vælges for den korrekte orientering af G-cDNA'en i F-genet ved fordøjelse med HinfI, der vil danne forbindelses-fragmenter på 768 bp og 220 bp. Den ukorrekte orientering af G-fragmentet vil give forbindelsesfragmenter på 555 bp og 430 15 bp ved Hinfl-fordøjelse. Forbindelses-regionerne af denne klon verificeres derpå som korrekte ved Maxara-Gilbert-se-kvensbestemmelse.

Ifølge det ovenstående eksempel vil der dannes et gen, der koder for et kimært FG-glycoprotein svarende til 20 det i eksempel 2 beskrevne. Det kimære glycoprotein, der dannes ifølge dette eksempel, vil indeholde mindre af de immunogene regioner af G-glycoproteinet end det kimære glycoprotein, der dannes ifølge eksempel 2. Kimære glycopro-teiner indeholdende andre regioner af de to glycoproteiner 25 kan dannes som beskrevet i eksempel 2 og 3 under anvendelse af de enzymer, der er opregnet i nærværende beskrivelse.

Eksempel 4

Anvendelse af DNA-oligonucleotlder til dannelse af gener.

30 der koder for kimære FG-alvcoproteiner med forskellig længde - Skema 5

Gener, der koder for kimære FG-glycoproteiner indeholdende forskellige regioner af F- og G-glycoproteiner, kan dannes under anvendelse af en kombination af restrik-35 tionsenzymer og oligonucleotider. Denne procedure tillader F- og G-glycoproteinerne at blive forbundet på ethvert ønsket 26 DK 173175 B1 punkt af deres aminosyre-grundskelet, hvilket tillader inkorporering eller fjernelse af regioner, der kan indeholde epitoper, som vil genkendes af værts-immunsystemet. Individuelle aminosyrer kan også ændres, såfremt dette ønskes.

5 Oligonucleotider syntetiseres svarende til DNA-sekvensen fra punktet af ønsket binding til et bekvemt restriktionsenzym-sted. Glycoprotein-genet fordøjes med dette restriktionsenzym, og oligonucleotidet ligateres til genet ved restriktionsenzym-stedet til dannelse af et DNA-fragment 10 med den ønskede længde. Oligonucleotiderne syntetiseres med ender, der er forenelige med restriktionsenzym-stederne til let ligatering.

A. Fremstilling af HRSyrP-glvcoprotein-oen 15 Plasmidet pGPF4 fordøjes med Ksil og ligateres til enten oligonucleotid 1 (cDNA-nucleotider 1483-1519) eller en blanding af oligonucleotider 1 og 2. Oligonucleotider 1 og 2 (cDNA-nucleotider 1483-1564) vil forlænge glycoprotein-F-DNA'en inkorporeret i det kimære gen til DNA-sekvenserne 20 netop forud for den anker-kodende region af F-glycoproteinet. DNA-sekvenserne i disse to oligonucleotider kan kode for yderligere epitoper, der findes på F-glycoproteinet. Parenteser omgiver nucleotiderne på 3'-enden af oligonucleotid 1, der vil inkluderes, hvis det skal være det terminale 25 oligonucleotid. De angivne nucleotider koder for et Hindlll-restriktionsenzym-sted. Såfremt oligonucleotid 2 også skal omfattes, ekskluderes de angivne nucleotider på oligonucleotid 1 til at tillade ligatering af 3'-enden af oligonucleotid 1 med 5'-enden af oligonucleotid 2. 3'-enden af oligonucleo-30 tid 2 indeholder også et HindiIl-sted.

Efter ligatering af oligonucleotidet eller oligonucleotiderne fordøjes DNA'en med Hindlll (Hindlll-steder i oligonucleotid ved 3'-enden af F-genet og i polyforbindelsesled-regionen af pUC12-plasmidet), og plasmidet religate-35 res. DNA'en transformeres i E. coli BH101, og en klon indeholdende oligonucleotidet eller oligonucleotiderne forbun- 27 DK 173175 B1 det til F-genet isoleres (pGPF5) . Nærværelsen af oligonucleo-tidet eller oligonucleotideme i Klonen kan verificeres ved hybridisering af klonen med 32P~mærket oligonucleotid eller oligonucleot ider.

5 B. Indsætning af glycoprotein. G-cDNA i F-qlvcoprotein-qenet Klon G2B-16 fordøjes med HinfI og XhoII. 277 bp-frag-mentet, der repræsenterer cDNA-regionen fra nucleotid-position 377 til 654, gel-renses. Oligonucleotider, der repræsen-10 terer tilstødende regioner af G-cDNA'en, ligateres derpå til hver ende af G-fragmentet. DNA-sekvenserne i disse oligonucleotider kan kode for yderligere epitoper, der findes på G-glycoproteinet. De individuelle oligonucleotider udformes til inkorporering af regioner, der kan indeholde unikke 15 epitoper. Oligonucleotidet ligateret til 5'-enden af G- cDNA'en kan bestå af enten oligonucleotid 3 (cDNA-nucleotider 297-377) eller oligonucleotid 3 forbundet til oligonucleotid 4 (cDNA-nucleotider 213-377). Oligonucleotidet forbundet til 3'-enden af G-cDNA’en kan bestå af oligonucleotid 5 20 (cDNA-oligonucleotider 654-714), oligonucleotider 5-6 (cDNA- nucleotider 654-774), oligonucleotider 5-6-7 (cDNA-nucleotider 654-843) eller oligonucleotider 5-6-7-8 (cDNA-nucleo-tider 654-912). Parenteser omslutter nucleotider, der kun vil blive inkluderet i det terminale oligonucleotid. Eksem-25 pelvis vil de indesluttede nucleotider ikke inkluderes på oligonucleotid 5, såfremt oligonucleotid 6 tilsættes. Disse indesluttede nucleotider koder for et HindllX-sted, og i tilfælde af oligonucleotider 5, 6, 7 og 8 en translationel terminerings-kodon. De indesluttede nucleotider. er ikke 30 inkluderet, når der skal tilsættes et eller flere yderligere oligonucleotider til at tillade ligatering mellem de forenelige ender af oligonucleotideme. Eksempelvis er 5'-enden af oligonucleotid 3 forenelig med 3'-enden af oligonucleotid 4, når nucleotiderne indesluttet af parenteser ikke er in-35 kluderet i oligonucleotid 3.

Efter ligatering af oligonucleotideme til G-cDNA- 28 DK 173175 B1 fragmentet fordøjes DNA’en med Hindlll, og det forstørrede G-cDNA-fragment (fragment 7) gelrenses. Det nye G-cDNA-fragment ligateres derpå til F-klonen, der fremstilles ifølge afsnit A i dette eksempel (pGPF-5), der er blevet fordøjet 5 med Hindlll. DNA'en transformeres i E. coli HB101, og en klon indeholdende G-genet 1 den korrekte orientering i F-genet isoleres (pGPFG-3). Orientering bestemmes ved fordøjelse med passende restriktionsenzymer. De nyligt syntetiserede regioner af det kimære gen verificeres korrekt ved Maxam-10 Gilbert-sekvensbestemmelse. Klonen kan derpå anbringes i forskellige ekspressionsvektorer som beskrevet i det følgende.

C. Oliqonucleotider 15 1) TCAATATCTCAACTCAACGACAAGATTAACCAGAGC ( CTAGCA AACCTT) ACGTAGTTATAGAGTTCAGTTGCTCTTCTAATTGGTCTCC GATCGT (TTCGAA)

20 2) CTAGCATTTATTCGTAAATCCGATGAATTATTACATAATGTAAATGCTGGTAAATCCAAGCTT

AAATAAGCATTTAGGCTACTTAATAATGTATTACATTTACGACCATTTAGGTTCGAA

3) (AAGCTT)CCTCAG CTTGGAATCAGTCCCTCTAATCCGTCTGAAATTACATCACAATCACCA (TTCGAA GGAGTC)CAACCTTAGTCAGGGAGATTAGGCAGACTTTAATGTACTGTTAGTCGT

25

CCATACTAG CTTCAACAACAC CAGG GGTATGATCGAAGTTGTTGTGGTCCTCA

A) AAGCTTCACAAAGTCACACCAACAACTGCAATCATACAAGATGCAACAAGCCAGATCAAGA 3 q TTCGAAGTGTTTCAGTGTGGTTGTTGACGTTAGTATGTTCTACGTTGTTCGGTCTAGTTCT

ACACAACCCCAACATACCTCACCCAGAAT

TGTGTTGGGGTTGTATCGAGTGCGTCTTACGAGTC

35 29 DK 173175 B1

5) GATCCCAAACCTCAAACCACTAAATCAAAGGAAGTACCCACCACCAAGCCCACA(GAAGAG

ggtttggagtttggtgatttagtttccttcatgggtggtggttcgggtgt cttctc 5 TAGAAGCTT) "" (ATCTTCGAA)

6) GAAGAGCCAACCATCAACACCACCAAAACAAACATCATAACTACACTACTCACCTCCAAC

GGTTGGTAGTTGTGGTGGTTTTGTTTGTAGTATTGATGTGATCAGTGGAGGTTG

10 (ACCACA(TAGAAGCTT) TGGTGT(ATCTTCGAA) 7) ACCACAGGAAATCCAGAACTCACAAGTCAAATGGAAACCTTCCACTCAACTTCCTCCCAA 15

CCTTTAGGTCTTGAGTGTTCAGTTTACCTTTGGAAGGTGAGTTGAAGGAGGCTT

GGCAATCCA(AGCCCT TAGAAGCTT) CCGTTAGGT TCGGCA(ATCTTCGAA) 20

8) AGCCCTTCTCAAGTCTCTACAACATCCGAGTACCCATCACAACCTTCATCTCCACCCAACA

AGAGTTCAGAGATGTTGTAGGCTCATGGGTAGTGTTGGAAGTAGAGGTGGGTTGT

CACCACGCCAGTAGAAGCTT 25 GTGGTG CGGTCATCTTCGAA

30 35 30 DK 173175 B1

Eksempel 5

Konstruktion af et Kimært HRSV-FG-qlV-COProt.ein-qen indeholdende en anker-region - Skema 6

Eksempel 2, 3 og 4 illustrerer syntesen af gener, 5 der koder for kimære FG-glycoproteiner, der ikke indeholder anker-regioner, og som derfor vil sekreteres i mediet af udtrykkende celler. Et gen, der koder for et kimært FG-glyco-protein, der indeholder en anker-region, kan syntetiseres. Anker-regionen vil bevirke retention af det kimære glyco-10 protein i de cellulære membraner på en måde, der svarer til de fleste virale glycoproteiner. Anker-regionen kan være på den carboxy-terminale ende af glycoproteinet, således at de immunogene regioner af det kimære molekyle fra både F- og G-glycoproteinerne vil strække sig ind i den extracellulære 15 væske. Det nedenfor beskrevne gen vil kode for et kimært glycoprotein bestående af den extracellulære region af HRSV-F, den extracellulære region af HRSV-G og ankerregionen af HRSV-F i den ovennævnte rækkefølge fra amino-terminal til carboxy-terminal.

20 A. Indsætning af G-cDNA-fracmentet i HRSV-F-glvcoprotein-oenet

Klonen G2B-16 fordøjes med Ddel og FoKI. De følgende oligonucleotider ligateres derefter til enderne af DNA-frag-25 mentet:

9) ATGCATCACC TACGTAGTGGAGT

3 q 10) CAAGTCGATCCAT

AGCTACGTA

Efter ligatering fordøjes DNA'en med Nsil, og 550 35 bp-fragmentet af G-cDNA'en (fragment 8) gelrenses. 550 bp- fragmentet ligateres derpå i Nsil-fordøjet pGPF4. DNA’en 31 DK 173175 B1 transformeres 1 E. coll HB101. Kloner Isoleres og udvælges for den korrekte orientering som beskrevet i eksempel 2. Forbindelsesregionerne for en korrekt orienteret klon verificeres derefter som korrekte ved Maxam-Gilbert-sekvensbe-5 stemmelse. Denne klon (pGPFG-4) kan anbringes i forskellige ekspressionsvektorer som beskrevet i det følgende.

Eksempel 6

Konstruktion af et kimart HRSV-GF-qlvcoprotein-gen 10 En del af den extracellulsre region af HRSV-F-glyco- proteinet kan anbringes ved den carboxy-terminale ende af G-glycoproteinet. Dette kimære glycoprotein vil bestå af signal/anker-regionen fra amino-terminalen af G, hovedparten af den extracellulære region af G og en del af den extra-15 cellulære region af F i den ovennævnte rækkefølge fra amino-terminal til carboxy-terminal.

A. Fremstilling af HRSV-G-qlvcoprotein-genet - Skema 7

Til fremstilling af klonen G2B-16 til ekspression må 20 G-C-halerne, der anvendes ved cDNA-kloning, fjernes, og kom patible restriktionsenzym-steder må placeres på dens ender.

Klonen G2B-16 fordøjes med Nlalll og FoKI. Nlalll spaltes ved stilling 18 og FoKI ved stilling 846 på cDNA-gensekvensen.

De følgende oligonucleotider ligateres derpå til cDNA-frag-25 mentet:

11) GATCCAAATGCAAACATG GTTTACGTTT

30 12) CAAGTCTCTCTACAG

AGAGAGATGTCAGCT

35 32 DK 173175 B1

Oligonucleotidet 11 vil ligateres til Nlalll-stedet og danne et BamHI-restriktionsenzym-sted på 5'-enden af cDNA-fragmentet. Oligonucleotidet 12 vil ligateres til FoKI-stedet og danne et Sall-restriktionsenzym-sted på 3'-enden 5 af cDNA-fragmentet. DNA'en elektroforesebehandles i en 1,5%·s agarosegel. 850 bp-G-cDNA-fragmentet (fragment 9) udskæres fra gelen, og DNA'en renses fra agarosen. G-cDNA-fragmentet ligateres derpå i pUC12, der er blevet fordøjet med BamHI og Sall til dannelse af pGPG-1. Plasmidet transformeres i 10 E. coli HB101, og plasmid-DNA isoleres.

B. Indsætning _af et F-cDNA-fraament i HRSV-G-qlvcoproteln-genet - Skema 8

Klonen F5-25 fordøjes med XhoII og Nsil. XhoII spaltes 15 ved stilling 446 og Nsil ved stilling 1483 på F-cDNA-gen-sekvensen. De følgende oligonucleotider ligateres derefter til cDNA-fragmentet:

13) TCGAAGGTGGTG

ACCACCACCTAG

20

14) TCAATATCTTAG

ACGTAGTTATAGAATCAGCT

Oligonucleotidet 13 vil ligateres til XhoII-stedet 25 og vil danne et Sall-restriktionsenzym-sted på 5'-enden af cDNA-fragmentet. Oligonucleotidet 14 vil ligateres til Nsilstedet og vil danne et Sall-restriktionsenzym-sted og en translationel afslutningskodon på 3'-enden af cDNA-fragmen-tet. DNA'en fordøjes derpå med Sall, og 960 bp F-cDNA-frag-30 mentet (fragment 10) gelrenses. F-cDNA-fragmentet ligateres derpå i pGPG-l, der er fordøjet med Sall. Plasmidet transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og udvælges—for den korrekte orientering af F-cDNA'en i G-genet ved fordøjelse med BamHI og Nsil, der vil danne et 1,8 kb-fragment.

35 Den ukorrekte orientering vil danne et 850 bp-fragment. Forbindelsesregionerne af en korrekt orienteret klon veri- DK .173175 B1 33 ficeres derefter som værende korrekte ved Maxam-Gilbert-sekvensbestemmelse. Denne klon (PGPGF-1) kan anbringes i forskellige ekspressionsvektorer som beskrevet i det følgende.

5

Eksempel 7

Ekspression af det kimære FG-olvcopratein af HRSV 1 CHO- ssller A. Konstruktion af PSVCOW7 10 Udgangsplasmidet pSV2dhfr (der er tilgængeligt fra

American Type Culture Collection eller fremstillet ifølge metoden beskrevet af S. Subramani et al.f "Expression of the Mouse Dihydrofolate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40", Molecular and Cellular 15 Biology 2, 854-864 (sept. 1981), fordøjes med BamHI og EcoRI til dannelse af fragmentet (5) (5,0 kb) indeholdende ampi-cillin-resistens-genet, SV4O-oprindelsen og dhfr-genet. Den anden del af pSVCOW7 fås fra plasmidet pXGH2R2, som fordøjes med de samme restriktions-endonucleaser, som anvendes til 20 spaltning af pSV2dhfr til opnåelse af fragment 5 (2,1 kp) indeholdende 3'-enden af genomt oksevæksthormon-gen, dvs. BGH-gDNA. Plasmidet pXGH2R2 er almindeligt tilgængeligt fra en E. coli HBlOl-vært, der er deponeret i Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois (NRRL B-15154).

25 Fragmenter (5 og 6) ligateres til dannelse af pSVC0W7 (7,1 kp) .

B. Konstruktionsf pGPFG-IE-PA

Generne konstrueret i eksemplerne 2-6 kan anvendes 30 til ekspression af et kimært glycoprotein i CHO-celler. Plasmidet pGPFG-1 anvendes i det følgende eksempel. De øvrige kimære gener behandles som beskrevet for pGPFG-1, medmindre andet er angivet. Samlingen af pGPFG-IE-PA udføres i to trin. Først indsættes gpFG-cDNA fra pGPFGl i pSVC0W7, hvorved 35 der fås pGPFG-PA, og derpå indsættes den umiddelbart tidlige promotor af cytomegalovirus til initiering af transkription 34 DK 173175 B1 af de HRSV-lignende proteiner, hvorved der fås pGPFG-IEPA.

Trin_l

Plasmidet pSVC0W7 skæres ned EcoRI og PuvII, og frag-5 nent 11 (600 bp) indeholdende polyadenyleringssekvensen af oksevæksthormon, der strækker sig fra PvulI-stedet i den 3'-meste exon af BGH-genet til EcoRI-stedet i nedadgående retning fra 3'-enden, isoleres. En fuldstændig diskussion af BGH-polyadenyleringssekvensen kan findes i følgende referen-10 cer: (1) europæisk patentansøgning nr. 0112012, publiceret den 27. juni 1984, i hvilken identifikationen og karakteriseringen af BGH-genomt DNA er angivet, (2) R.P. Woychik et al., "Requirement for the 3' Flanking Region of the Bovine Growth Hormone Gene for Accurate Polyadenylation", Proc.

15 Hati. Acad. Sci. USA fil, 3944-3948 (juli 1984) og D.R. Higgs et al.. Nature 306. 398-400 (24. november 1983) og deri citerede referencer, hvor det angives, at nucleotid-sekvensen AATAAA karakteriserer polyadenylerings-signalet ved en position 11-30 nucleotider i opadgående retning (mod 5'-enden) 20 fra 3*-enden af BGH-genet.

En anden prøve af pSVC0W7 skæres med EcoRI og BamHI til dannelse af fragmént 12 (5,8 kb). Fragment 12 kan alternativt afledes af EcoRI/BamHI-fragmentet fra grund-piasmidet pSV2dhfr, der er tilgængeligt fra Bethesda Research Labora-25 tories. Fragment 12 indeholder oprindelsen af replikation fra pBR322 og et ampicillin-resistens-gen udtrykt i E. coli, der tillader udvælgelsen af plasmidet i E. coli. Fragmentet indeholder også muse-dihydrofolat-reductase-cDNA'en i en konstruktion, der tillader ekspression i pattedyrceller, 30 jfr. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, 854-864 (1981).

Plasmid pGPFG-1 skæres med Hindlll (pGPFG-3 fordøjes med Hpal), behandles med Klenow-enzym og skæres på ny med BamHI til dannelse af fragment 13 (2,2 kp), der gelisoleres. BamHI-stedet befinder sig netop i opadgående retning fra 35 den cDNA, der koder for de 5'-ikke-translaterede sekvenser af FG-mRNA'en, og Hindlll-stedet er i pUC12-vektoren nogle DK 173175 Bl 35 få basepar udover Pstl-stedet nær ved 3'-enden af gpFG cDNA'en (Hpall-stedet i pGPFG-3 er 95 bp fra 3'-enden af FG cDNA).

Fragmenterne 11, 12 og 13 ligateree til dannelse af 5 pGPFG-PA (8,6 kb), der er en replikat ionsvektor, som er i stand til at bevæge sig mellem E. coli- og CHO-celler. Plas-midet pGPFG-PA transformeres i E. coli.

ZcilL-2 I trin 2 omdannes pGPFG-PA i ekspressionsplasmidet 10 pGPFG-IE-PA ved indsætning af den umiddelbart tidlige genpromotor fra human cytomegalovirus (CMV I.E.-promotor). DMV-I.E.-promotoren fås fra Pstl-fordejelse af CMV-genomet. Restriktions-endonuclease-spaltningskortene for regionen af det humane cytomegalovirus (CMV)-genom, der indeholder det 15 umiddelbare tidlige hovedgen (CMV I.E.) er beskrevet i detaljer af Stinski et al., jfr. J. Virol. ££, 1-14 (1983), Stenberg et al., J. Virol. 42, 190-199 (1984) samt Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA fil, 659-663 (1984).

Stinski- og Thomsen-litteraturstederne beskriver et 20 2,0 kilobase-Pstl-fragment, der indeholder promotoren for det umiddelbart tidlige hovedgen. Når dette 2,0 kb Pstl-fragment isoleres og fordøjes med SauSAI, fås der et 760 basepar-fragment blandt produkterne. Dette 760 basepar-fragment kan skelnes fra de øvrige produkter ved hjælp af dets 25 størrelse og nærværelsen af et Sacl-spaltningssted og et Ball-spaltningssted i fragmentet. På grund af dets bekvemme identifikation foretrækkes anvendelsen af dette Sau3AI-frag-ment som den foretrukne anvendelsesmetode for CMV I.E.-promotoren som beskrevet i nærværende beskrivelse.

30 Plasmidet pGPFG-PA spaltes med BamHI, og et Sau3AI- fragment indeholdende den umiddelbart tidlige CMV-promotor ligateres i det kompatible BamHI-sted. Plasmider indeholdende CMV-promotor-fragmentet i en sådan orientering, at transkrip-tion fra promotoren vil syntetisere en mRNA for et HRSV-35 lignende protein, identificeres ved spaltning af plasmiderne med Sacl. Det resulterende plasmid betegnes pGPFG-IE-PA med DK 173175 Bl 36 CMV-I.E.-promotoren ved 5'-enden af cDNA'en og BGH-polyade-nyleringssignalet ved dens 3'-ende. Plasmidet opretholdes i E. coli, indtil der transficeres i CHO-celler.

5 C, Transfektion og dyrkning af CHO-celler

Plasmid pGPFG-IE-PA transficeres i kinesiske hamster-ovarieceller (CHO), der er def iciente med hensyn til dihydro-folat-reductase (dhfr), under anvendelse af calciumphosphat-metoden til transfektion af DNA i celler, der er beskrevet 10 i enkeltheder af Graham et al., Introduction of Macromole-cules into Viable Mammalian Cells, Alan R. Liss Inc., N.Y., 1980, side 3-25. Den anvendte cellelinje er mutanten DXB-11, der oprindeligt er tilgængelig fra L. Chasin ved Columbia University og er fuldstændigt beskrevet i Proc. Natl. Acad.

15 Sci. USA 22/ 4216-4220 (1980). De ovennævnte metoder til transfektion hviler p& den kendsgerning, at celler, der inkorporerer de transficerede plasmider, ikke længere er dhfr-deficiente og vil vokse i Dulbecco's modificerede Eagle's medium plus prolin.

20 Såfremt det kimære glycoprotein ikke indeholder en anker-region, klares den ovenstående væske fra CHO-celler, der udtrykker sekreteret kimært FG-protein, ved centrifugering ved lav hastighed. Den ovenstående væske påføres en conconavalin A (eller lentil-lectin)-søjle. Glycoproteinet 25 elueres efter ekstensiv vaskning med en lineær gradient af Q-D-methylglucosid (0-0,5 M) i den ovennævnte puffer. Det eluerede glycoprotein dialyseres mod PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 og påføres en affinitetssøjle. Affinitetssøjlen er sammensat af enten polyklonale eller monoklonale anti-30 stoffer rettet mod HRSV bundet til Sepharose 4B-perler (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) ved kendte metoder. Søjlen vaskes i dialysepuffer, og HRSV-FG-glycoproteinet elueres med PBS indeholdende 0,1M glycin (pH * 2,5) og 0,1% Triton X-100. Glycoproteinet dialyseres mod saltopløsning og kon-35 trolleres for renhed ved elektroforese på en SDS-PAGE-gel.

Såfremt det kimære glycoprotein indeholder en anker- * 37 DK 173175 B1 region, vaskes CHO-cellerne, der udtrykker glycoproteinet, i phosphat-pufret saltopløsning (PBS) og lysebehandles derpå i PBS indeholdende 1,0% Triton X-100 og 1,0% natriumdeoxy-cholat. Efter pelletisering af kernen påføres den cytoplas-5 miske ekstrakt på en conconavalin A-søjle og renses som beskrevet ovenfor i forbindelse med sekreterede glycoprotei-ner.

Eksempel 8 10 Ekspression af HRSV-GPFG under anvendelse af oksepapilloma-.

Yirns (BPV) A.. .Konstruktion _af_en kloningsvektor indeholdende en ikke-transkriberbar ekspressionskassette, der er egnet til reoli-kation 1 E. coll 15 Konstruktionerne af pTFW8 og pTFW9 frembyder et be kvemt udgangsmateriale til ekspression af HRSV-proteiner under anvendelse af BPV. Transkriptions-terminatoren af det deponerede plasmid hindrer ekspressionen af HRSV-proteiner og skal fjernes ved en udskæring i et enkelt trin og liga-20 tering.

1. Konstruktion af PTFW8

Plasmidet pdBPV-MMtneo (342-12) er beskrevet i Mol. and Cell Biol., bind 3 (nr. 11) 2110-2115 (1983) og fås fra 25 Peter Howley ved National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA. Plasmidet pdBPV-MMT neo (342-12) består af tre dele: et komplet BPV-l-genom (100%), der er åbnet ved det unikke BamHI-sted, pML2 (et "poison-minus" derivat af pBR322) og en transkriptionel kassette sammensat af den murine metal-30 lothionein I-gen-promotor, neomycin-phosphotransferase li genet af Tn5 og simian-virus 40-tidlig region-transkrip-tionelle behandlingssignaler. Plasmid pdBPV-MMT neo (342- 12) fordøjes først med BamHI til fjernelse af BPV-sekvenser-ne, der isoleres og opbevares til senere indsætning. Det 35 resterende fragment religateres under anvendelse af T4-ligase til dannelse af pMMpro.nptll (6,7 kb). Fjernelse af BPV- 38 DK 173175 B1 genomet letter senere genetiske manipulationer ved frembringelse af unikke restriktionssteder i det resterende plasmid.

Efter at rekombinationerne er fuldstændige, erstattes BPV-genomet.

5 Plasmidet pMMpro.nptll fordøjes med Bglll, og et syntetisk DNA-fragment 14 indeholdende unikke restriktionssteder indsættes og ligateres under anvendelse af T4-ligase, hvorved der fås pTFW8 (6,7 kb). Plasmidet pTFW8 er identisk med pMMpro.nptll, bortset fra indsætningen af unikke restrik-10 tionssteder mellem den murine metallothionein I-genpromotor og neomycin-resistens-genet.

2. Konstruktion af PTWF9

Plasmidet pTWF9 indeholder transkriptions-terminatoren 15 Tj fra phag-lambda indsat mellem metallothionein-I-gen-pro-motoren og neomycin-resistens-genet. Transkriptions-terminatoren kan f&s fra Donald Court ved National Cancer Institute i Bethesda, Maryland, USA. Transkriptions-terminatoren leveres i pKG1800sib3, der er det samme som pUS6 som 20 beskrevet i Gene, 23, 343-350 (1984), bortset fra, at tj bærer sib3-mutationen som beskrevet i Guarneros et al., PNAS, 29, 238-242 (1982). Under den normale infektionsproces af phag-lambda fungerer tj-terminatoren ved inhiberingen af bakteriophag-λ int-genekspression fra PL og ved termineringen 25 af int-gen-transkription stammende fra Pj. Terminatoren udskæres fra pKG1800sib3 under anvendelse af Alul og Pvul som fragment 15 (1,2 kb), der gelisoleres, og Xhol-forbin-delsesstykker anbringes på hver ende af fragmentet. Forbindelsesstykkerne er tilgængelige fra New England Biolabs, 30 Beverly, MA, USA. Terminator-fragmentet bundet ved Xhol- komplementære ender indsættes derpå i pTWF8, der i forvejen er fordøjet med Xhol. Fragmenterne ligateres derefter under anvendelse af T4-DNA-ligase, hvorved der fås pTWF9 (7,9 kb) . Plasmidet pTWF9 er deponeret i overensstemmelse med 35 Budapest-traktaten. Plasmidet pTFW9 opretholdes i en E.

coli-værtsorganisme og er deponeret ved Northern Regional 39 DK 173175 B1

Research Center, Peoria, Illinois, USA, den 17. november 1986 og har fået deponeringsnummer NRRL B-18141.

B. Konstruktionen af pTFW/GPES

5 De gener, der er konstrueret i eksempel 2-6, kan anvendes til ekspression af et kimært glycoprotein under anvendelse af BPV. Plasmidet pGPFG-1 anvendes i dette eksempel. De øvrige kimære gener behandles som beskrevet for pGPFG-1, medmindre andet er angivet. Til konstruktion af 10 pTFW/GPFG fordøjes pGPFG-1 med BamHI og Hindlll (pGPFG-3 fordøjes med BamHI og Hpall). Dets ender gøres stumpe med Klenow-enzym, og syntetiske Bglll-forbindelsesstykker (New England Biolabs) ligateres til enderne af klonen. DNA'en fordøjes med Bglll og betegnes som fragment 16 (2,2 kb).

15 Fragment 16 indeholdende gpFG-genet (2,2 kb) isoleres derpå fra en gel. Det rensede fragment ligateres i pTFW9, der er fordøjet med Bglll til dannelse af pTFW/GPFG (10,1 kb).

C. Omdannelse af pTFW/GPFG i en eukarvotisk ekspressions- 20 vektor

Plasmidet pTFW/GPFG omdannes til en eukaryotisk ekspressionsvektor ved genindsætning af det 100% komplette BPV-l-genom udskåret med BamHI i trin a. i eksempel 8A. Plasmidet pTFW/GPFG skæres med BamHI og det BPV-l-intakte 25 genom, og et 7,9 kb-fragment indsættes til dannelse af pTFW/GPFG/BPV* (18,0 kb), der replikeres i E. coli indtil produktion af glycoprotein-FG ved hjælp af eukaryotiske celler er ønskeligt. 1 0 D, Ekspression af qpFG.^1 murine__C127-celler

Forud for transfektion i murine C127-celler fordøjes pTFW/GPFG/BPV* med Xhol til udskæring af Tj-terminatoren og religateres med T4-DNA-ligase. Det resulterende plasmid pTFW/GPFG/BPV (16,9 kb) vil nu dirigere ekspressionen af 35 høje niveauer af gpFG, der udskilles i kulturmedierne. C127-Cellerne er tilgængelige fra American Type Culture Collection 40 DK 173175 B1 og dyrkes i Dulbecco's modificerede minimale essentielle medium indeholdende 10% kalvefosterserum. Niveauerne af gpFG-proteiner i medierne af C127-celler bestemmes ved Western bl ot-forsøg med anti-RSV-antistof og 125x-mcrket protein 5 A.

KRSV gpFG renses fra kulturmedierne eller cellerne som beskrevet i eksempel 7.

Eksempel 9 10 Ekspression af HRSV-GPFG under anvendelse af Baculovlrus- yiras

Det følgende eksempel angår ekspressionen af glycoprotein FG i insekt-cellekulturer. Alle procedurer er angivet i enkeltheder i M.D. Summers og G.E. Smith, A Manual for 15 Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, udgivet af College of Agriculture, Texas Agricultural Experiment Station, Texas Agricultural Extension Service, College Station, Texas, 1986. Udgangsplasmidet pAc373 (7,1 kb) er en generel baculovirus-ekspressionsvektor med et 20 unikt BamHl-sted umiddelbart i nedadgående retning fra poly-eder-promotoren for Autographa californica-kerne-polyhedro-sis-virus (AcNPV). Polyeder-proteinet er et matriks-protein, der er ikke-essentielt for virusinfektion og replikation in vitro. Plasmidet er tilgængeligt fra Professor Max Summers 25 ved Department of Entomology, Texas A & M University, College Station, Texas 77843 og er fuldstændigt beskrevet i Molecular and Cell. Biology, 2, 12, 2156-2165 (1983).

A. Konstruktion af pAcGPFG

30 De gener, der konstrueres i eksempel 2-6, kan anvendes til ekspression af et kimært glycoprotein under anvendelse af baculovirus. Plasmidet pGPFG-1 anvendes i dette eksempel.

De øvrige kimære gener behandles som beskrevet for pGPFG-1, medmindre andet er angivet. Plasmid pGPFGl fordøjes med 35 Hindlll (pGPFG-3 fordøjes med Hpall), og enderne afstumpes med Klenow-enzym. Syntetiske BamHI-forbindelsesstykker (New 41 DK 173175 B1

England Biolabs) ligateres til enden af DNA1en. DNA'en fordøjes ned BamHI, og fragnent 17 (2,2 kb) indeholdende gpFG-genet isoleres fra en gel. Det rensede fragnent ligateres i pAc373, der er fordøjet ned BanHI.

5 B. Transfektion og dyrkning af s. frugiperda gpFG-cDNA-indsaetningen af pAcGPFG rekonbineres ned nativ AcNPV-DNA ved cotransfektion i S. frugiperda. S. fru-giperda (SF9; ATCC CRL 1711) dyrkes i Grace-nedier (Gibco 10 Lab. Livonia, NI 48150), 10% kalvefosterserum og suppleres ned Difco-lactalbumin-hydrolysat og yeastolate. Cellerne cotransficeres ned AcNPV-DNA og pAcGPFG i nængder på henholdsvis 1 Mg og 2 pg pr. ni. Resulterende viruspartikler fås ved opsanling af nedierne og fjernelse af cellulært 15 nateriale ved centrifugering ved lav hastighed. De virus-holdige nedier anvendes derpå til at inficere S. frugiperda. Påfølgende infektion af S. frugiperda under anvendelse af disse virale partikler, der onfatter både nativ viral DNA og DNA rekonbineret ned cDNA'en, der koder for glycoprotein 20 FG, vil resultere i, at nogle celler udtrykker HRSV-proteinet i stedet for polyeder-proteinet. Rensning af rekombinant virus udføres ved en række begrænsede fortyndingsudplatter Inger i 96-brøndes vævskulturplader indeholdende S. frugi-perda-celler. Brønde, der indeholder rekombinant virus, 25 detekteres ved ”dot blot"-hybridisering under anvendelse af pGPFG-l, der er mærket med 32P-dCTP ved nick-translation som en sonde. Når det først er tilstrækkeligt rent, detekteres det rekombinante virus ved dets unikke okklusions-negative plaque-morfologi. HRSV-protein syntetiseret i re-30 kombinante baculovirus-inficerede celler detekteres ved Western blot-undersøgelser ned anti-RSV-antistof og 125I-mærket protein A (Amersham Corp.).

HRSV-proteinet renses fra kulturmedierne eller cellerne som beskrevet i eksempel 7.

35 42 DK 173175 B1

Eksempel 10

Konstruktionen af pAcGPFS indeholdende en naturlig oolveder-ledersekvens

Plasmidet pAc373, der er beskrevet i eksempel 8, 5 indeholder en BamHI-forbindelsesled-sekvens ved -8-stillingen af polyeder-lederen til at tillade let indsætning af fremmede gener. Denne afbrydelse af polyeder-ledersekvensen kan imidlertid resultere i lavere niveauer af ekspression af det indsatte gen, end det ville være muligt med den naturlige 10 polyeder-leder. I det følgende er der beskrevet en metode til forbindelse af den naturlige polyeder-1edersekvens til initieringskodonen af HRSV-FG-genet. De gener, der er konstrueret i eksemplerne 2-6, kan anvendes i det foreliggende eksempel til ekspression af et kimært glycoprotein. Plasmidet 15 pGPFG-1 anvendes i dette eksempel. De øvrige kimære gener behandles som beskrevet for pGPFG-1.

A. Fremstilling af pAcGPFG-2

Plasmidet pAcGPFG (eksempel 8) fordøjes med EcoRV og 20 PstI. EcoRV spalter polyeder-ledersekvensen ved position -93, medens PstI spalter HRSV-FG-kodningssekvensen ved positionerne +50, +636 og +1701 i FG-kodningssekvensen, og i pUC12-polylinker-regionen stødende op til 3’-enden af FG-genet.

DNA'en elektroforesebehandles i en 1%'s agarosegel, og det 25 store fragment (9,8 kb), der primært indeholder plasmidet pAc373, renses fra gelen.

Et oligonucleotid bestående af polyeder-ledersekvensen fra positionerne -93 (EcoRV-spaltningssted) til -1, forbundet til FG-gensekvensen fra positionerne 0 (nucleotid A i ini-30 tieringskodonet) til +50 (Pstl-spaltningssted) syntetiseres og konstrueres. På grund af længden af denne sekvens syntetiseres DNA'en som flere oligonucleotider, som derpå liga-teres sammen. Det intakte oligonucleotid ligateres til 9,8 kb-fragmentet som fremstillet ovenfor. DNA'en transformeres 35 i E. coli HB101. Kloner, der indeholder det nye plasmid (pAcGPFG-2) isoleres, og den nyligt syntetiserede region 43 DK 173175 B1 verificeres som verende korrekt ved Maxam-Gilbert-sekvens-bestemmelse.

B. Indsætning af FG-genet _i _pAcGPFG-2 5 Plasmidet pGPFG-1 (eksempel 2) fordøjes partielt med

Pstl. PstI spalter ved positionerne +50, +636 og +1701 i FG-kodningssekvensen og i pUC12-polylinker-regionen stødende op til 3 *—enden af FG-genet. DNA'en elektroforesebehandles i en 1,2%·s agarosegel. 2,2 kb-fragmentet svarende til det 10 næsten intakte FG-gen (FG-position +50 til Pstl-stedet i pUC12-polylinkeren) renses fra gelen. 2,2 kb-fragmentet ligateres derefter i plasmidet pAcGPFG-2, der er blevet fordøjet med Pstl. DNA'en transformeres i E. coli HB101.

Kloner isoleres og kontrolleres for den korrekte orientering 15 af FG-genet ved fordøjelse med EcoRV og Sspl, der vil danne et 2,3 kb-fragment. Den ikke-orientering vil danne et 130 bp-fragment. Det ovennævnte gen indsættes i baculovirus-genomet til ekspression af det kimære HRSV-FG-glycoprotein som beskrevet i eksempel 8.

20

Eksempel 11

Fremstilling af en vaccine

Immunogenet kan fremstilles i vaccine-dosisform ved hjælp af velkendte metoder. Vaccinen kan indgives intramus-25 kulært, subcutant eller intranasalt. Til parenteral indgivelse, f.eks. ved intramuskulær injektion, kan immunogenet kombineres med et egnet bærestof, idet det f.eks. kan indgives i vand, saltopløsning eller pufrede medier, med eller uden forskellige tilsætningsstoffer eller immunomodulerende 30 midler, f.eks. aluminiumhydroxid, aluminiumphosphat, alumi-niumkaliumsulfat (alun), berylliumsulfat, silica, kaolin, carbon, vand-i-olie-emulsioner, olie-i-vand-emulsioner, muramyl-dipeptid, bakterie-endotoxin, lipid X, Corynebac-terium parvum (Propionobacterium aenes), Bordetella pertus-35 sis, polyribonucleotider, natriumalginat, lanolin, lysole-cithin, vitamin A, saponin, liposomer, levamisol, DEAE-dex- 44 DK 173175 B1 tran, blokerede copolymere eller andre syntetiske tilsætningsstoffer. Sådanne tilsætningsstoffer er kommercielt tilgængelige fra forskellige kilder, f.eks. Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ).

5 Mængden af immunogen og tilsætningsstof kan varieres over et bredt område, blot begge er til stede i virksomme mængder. Eksempelvis kan aluminiumhydroxid være til stede i en mængde på ca. 0,5% af vaccineblandingen (Al2C>3-basis) .

På en pr. dosis-basis kan koncentrationen af immunogenet 10 variere fra ca. 0,015 μg til ca. 1,5 mg pr. kg pr. patientlegemsvægt. Et foretrukket dosisområde ligger fra ca. 1,5 Atg/kg til ca. 0,15 mg/kg patient-legemsvægt. En passende dosisstørrelse til mennesker ligger fra ca. 0,1-1 ml, fortrinsvis på ca. 0,1 ml. En dosis til intramuskulær injektion 15 kan således eksempelvis omfatte 0,1 ml indeholdende immunogen i blanding med 0,5%'s aluminiuinhydroxid.

Vaccinen kan indgives til gravide kvinder eller til kvinder i fødedygtig alder til stimulering af maternale antistoffer. Kvinden kan også genvaccineres efter behov.

20 Spædbørn kan vaccineres ved en alder på 2-3 måneder efter mangel på maternale antistoffer og revaccineres om nødvendigt, fortrinsvis ved en alder på 6-9 måneder efter modning af immunsystemet. Spædbørn, der er født af ikke-vaccinerede mødre, kan vaccineres ved en alder på 2-3 måneder. Vaccinen 25 kan også anvendes i andre udsatte befolkningsgrupper, f.eks. hos ældre eller sygehusindlagte patienter.

Vaccinen kan også kombineres med andre vacciner mod andre sygdomme til dannelse af multivalente vacciner. Den kan også kombineres med andre lægemidler, f.eks. antibiotika.

30 35 45 DK 173175 B1

Skema 1

Konstruktion af pGPF2 (a) Plasmid pF5-25 skæres med PstI, og fragment 1 (1,9 kb) gelisoleres.

5

Fragment 1 PstZ PstI

J_I

I TTTFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFTTT

(b) Plasmid pUC12 (2,7 kb) skæres med PstI, hvorved 10 der fås fragment 2, der gelisoleres.

Fragment 2 Fsti Hindlll BamHI Xbal Sall PstI

J_1_I_L_L-1

l5 AmpR

(c) Fragmenterne 1 og 2 ligateres til dannelse af pGPF-2 (4,6 kb), der transformeres i E. coli.

20 BamHI Xbal Sall PstI PstI Hindlll * _I_1_I_I_I—_l- *

I TTFFFFFFFTT

AmpR

25 AmpR = Ampicillin-resistens T * Guanosin/cytosin-hale F » Glycoprotein F.

30 35 46 DK 173175 B1 SKEMA 2

Konstruktion af pGPF3 og pGPF4 (a) Plasmid pGPF2 overskæres med Xabl, behandles med bakteriel alkalisk phosphatase, overskcres igen med Sall og 5 behandles med Klenow-enzym til dannelse af fragment 3.

Fragment 3 Sall PstI PstI HindiII fiaoHI Xbal J_I-1-1_I-1 TTTFFFFFFFTTT |

io ^“pR

(b) Fragment 3 fordejes i nedadgående retning fra Sall-stedet under anvendelse af lambda-exonuclease, og den tilbageblevne 3'-hale hybridiseres til det syntetiske oligo- 15 nucleotid, der er komplementært til 5'-delen af ledersekvensen, der har den følgende sekvens af GpF-cDNA.

5'-ende AAATAACAATGGAG ( 20 (c) Den enkeltstrengede del af cDNA-3' i nedadgående retning fra de syntetiske oligonucleotider udfyldes under anvendelse af Klenow-enzym, og enderne ligateres under anvendelse af T4-ligase, hvorved der fås pGPF3 (4,6 kb).

BamHI PstI Hindlll 25 *_I_1_I_ * FFFFFFFFFFFFFFFFFFTTT |

AmpR

30 (d) Plasmid pGPF3 overskæres med Hindlll og behandles med Bal 31 til fordøjelse af G-C-nucleotid-halen ved 3'-enden af gpF-CDNA'en. gpF-cDNA'en overskæres med BamHI·"( 1,T kb), isoleres fra en gel og religateres i en BamHI/HincII-digestion af pUC12 til dannelse af pGPF4 (4,4 kb).

35 47 DK 173175 B1 SKEMA 2 (fortsat)

Konstruktion af pGPF3 og pGPF4

BajoHI Hlndlll 5 * -1_|-- * FFFFFFFF |

AnpR

10 AropR - Ampicillin-resistens T « Guanosin/cytosin-hale F - Glycoprotein F.

15 20 25 30 F . . .r* * 35 48 DK 173175 B1 SKEMA 3

Konstruktion af et kiinært FG-glycoprotein-gen

Plasmid G2B-16

5 Psti Ddel FoKI PstI

*__j-1-1-1- * TTTGGGGGGGGGGGTTT |

TcR

10 (a) Plasmid G2B-16 fordøjes med Ddel og FoKI, og enderne gøres stumpe med Klenow-enzym. DNA'en elektroforese-behandles i en 1,5%'s agarosegel, og fragment 4 (550 bp) renses fra agarosen.

Fragment 4 _

GGGGGGGGGGG

(b) Plasmid pGPF-4 (Skema 3) fordøjes med Nsil. Enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase og dephosphoryleres 20 med bakteriel alkalisk phosphatase. Fragment 4 ligaterés dernæst i plasmidet til dannelse af pGPFG-1 (5,0 kb).

Plasmid GPFG-1

BamHI HindHI

* _1__I * 25 ,- FFFFFFFFFFGGGGGGG FFFF |

I AmpR

Term 30 Ampr = Ampicillin-resistens

TcR « Tetracyclin-resistens T *= Guanosin/cytosin-hale G DNA-sekvenser for G-glycoprotein F — DNA-sekvenser for F-glycoprotein 35 Term - Translationelt terminationssignal.

49 DK 173175 B1 SKEMA 4

Anvendelse af forbindelsesstykker til regulering af aflæsningsrammen af F6 Plasmid C2B-16

5 PstI Hphl Hphl PstI

*_I_I_I-1-* TTTGGGGGGGGGGGGGTTT |

TcR

Sall-forbindel- CGGTCGACCG

10 sesstykke GCCAGCTGGC

(a) Plasmid G2B-16 fordøjes med HpHI, og enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase. Sall-forbindelsesstykket liga-teres til enderne af cDNA'en. DNA'en fordøjes med Sall, og fragment 5 (410 bp) gelrenses.

15 Fragment 5

LGGGGGCGGGGGGGCGGGGL

(b) Plasmid GPF4 (Skema 2) fordøjes med Nsil, og enderne gøres stumpe med T4-DNA-polymerase. Sall-forbindel- 20 sesstykket ligateres til enderne af cDNA'en. DNA'en fordøjes med Sall, og plasmidet (4,4 kb) gelrenses. Fragment 5 ligateres . dernæst til det gelrensede GPF4 til dannelse af pGPFG-2.

Plasmid GPFG-2

25 BamHI HindiII

* _1_1- * FFFFFFFFLGGGGGGLFFFFF |

I AmpR

Term 30 AmpR = Ampicillin-resistens

TcR = Tetracyclin-resistens T = Guanidin/cytosin-hale F = DNA-sekvenser for F-glycoprotein G *= DNA-sekvenser for G-glycoprotein 35 L Sall-forbindelsesstykke

Term = Translationelt terminationssignal 50 DK 173175 B1 SKEMA 5

Anvendelse af oligonucleotider til dannelse af F6-gener ned forskellige længder (a) Oligonucleotid A består af oligonucleotid 1 (36 5 bp) eller oligonucleotider 1 og 2 ligateret samnen (81 bp).

Oligonucleotid B består af oligonucleotid 3 (80 bp) eller oligonucleotider 3 og 4 ligateret sammen (164 bp). Oligonucleotid C består af oligonucleotid 5 (60 bp) eller oligonucleotid 5 og 6 ligateret sammen (120 bp) eller oligonu-10 cleotider 5, 6 og 7 ligateret sammen (189 bp) eller oligonucleotider 5, 6, 7 og 8 ligateret sammen (258 bp). Oligo-nucleotiderne A, B og C gelrenses.

Oligonucleotid A Oligonucleotid B Oligonucleotid C

15 _ _ _ 1111111 333333 5555 11111111222222 3333333444444 55556666 20 555566667777 5555666677778888 (b) Plamid GPF-4 fordøjes med Nsil, og oligonucleotid 25 A ligateres i Nsil-stedet. DNA'en fordøjes med Hindlll, og plasmidet religateres til dannelse af pGPF-5.

Plasmid GPF-5

BamHI Nsil Hindlll 30 *-1---1-1--*

ffffffffffaaaa I

AmpR

(c) Plasmid G2B-16 fordøjes med HinfI og XhoII, og 35 fragment 6 (277 bp) gelrenses.

51 DK 173175 B1 SKEMA 5 (fortsat)

Anvendelse af oligonucleotider til dannelse af F6-gener ned forskellige længder

5 Fragment 6 Hlnfl XhoII

J-1

GGGGGGGGGGG

(d) Oligonucleotider B og C ligateres til fragment 6.

10 DNA'en fordøjes ned Hindlll, og fragment 7 gelrenses (længden af fragment 7 varierer fra 417 bp til 700 bp, afhængigt af oligonucleotider indeholdt i oligonucleotider B og C).

Fragment 7 Hindlll Hinfl XhoII Hindlll 15 J-1_I_l

BBBBGGGGGCCCCC

(e) Plasmid GPF-5 fordøjes ned Hindlll og dephosphory-20 leres med bakterielt alkalisk phosphatase. Fragment 7 ligateres derpå i Hindlll-stedet af pGPF-5 til dannelse af PGPFG73.

Plasmid GPFG-3 Hindlll Hindlll Hindlll Hpall * 1_I__I_l- * 25 FFFFFFFFAAABBGGGGCC |

I AmpR

Term 30 AmpR = Ampicillin-resistens F = DNA-sekvenser for F-glycoprotein G = DNA-sekvenser for G-glycoprotein ....

A = Oligonucleotid A

B « Oligonucleotid B

35 C = Oligonucleotid C

Term = Translationelt terminationssignal 52 DK 173175 B1 SKEMA 6

Konstruktion af et FG-gen indeholdende en anker-region Plasmid G2B-16

5 PstI Ddel FoKI PstI

* _I_I_I_I_* TTTGGGCGCGGGGGGTTT |

TcR

10 (a) Plasmid G2B-16 fordøjes med Ddel og FoKI. Oligo- nucleotider 9 og 10 ligateres til enderne af DNA'en. DNA'en fordøjes med Nsil, og fragment 8 (550 bp) gelrenses.

Fragment 8 Nsil Nsil 15 J-1- 9 GGGGGGGGGG 10 λ » (b) Plasmid GPF-4 fordøjes med Nsil, og fragment 8 ligateres i Nsil-stedet til dannelse af pGPFG-4.

20 Plasmid GPFG-4

BamHI Hindlll * i_I-* FFFFFFFF9GGGGGG10AAAA |

I AmpR

25 Ter"

AmpR = Ampicillin-resistens TcR = Tetracyclin-resistens T = Guanosin/cytosin-hale F = DNA-sekvenser for F-glycoprotein 30 G = DNA-sekvenser for G-glycoprotein 9 = Oligonucleotid 9 10 « Oligonucleotid 10 A *= DNA-sekvenser, der koder for anker-regionen af F-glycoprotein 35 Term = Translationelt terminationssignal 53 DK 173175 B1 SKEMA 7

Fremstilling af G-gen til konstruktion af GF-kim*rt gen

Plasmid C2B-16 j 5 PstI Nlalll FoKI PstI ! *_I_I-1-1-* TTTCGGCGGCGGGGGGTTT |

TcR

(a) Plasmid G2B-16 fordøjes med Nlalll og Foia. Oligo-10 nucleotider 11 og 12 ligateres til enderne af DNA'en, og fragment 9 (850 bp) gelrenses.

Fragment 9 BamHI Sall J-1 15 11GGGGGGGGGG12 (b) Plasmid pUC12 fordøjes med BamHI og Sall og de-phosphoryleres med bakteriel alkalisk phosphatase. Fragment 9 ligateres i plasmidet til dannelse af pGPG-1.

20

Plasmid GPG-1

BamHI Sall *·-J_I_ * 11GGGGGGGGGGGGG12 | 25

AmpR - Ampicillin-resistens TcR = Tetracyclin-resistens T = Guanosin/cytosin-hale G « DNA-sekvenser for G-glycoprotein 30 li *= oligonucleotid 11 12 « oligonucleotid 12 35 DK 173175 B1 54 SKEMA 8

Indsætning af G-cDNA i pTPG-1 Plasmid F5-25 5 PstI XhoII Nsil PsCl *_L_1_1_I_*

TTTFFFFFFFFFFFTTT

(a) Plasmid F5-25 fordøjes med XhoII og Nsil. Oligo-10 nucleotider 13 og 14 ligateres til enderne af DNA'en. DNA'en fordøjes med Sall, og fragment 10 (960 bp) gelrenses.

Fragment 10 Sall Sall J-1 13FFFFFFFFFFFFF14 15 1

Term (b) PGPF-1 fordøjes med Sall og dephosphoryleres med bakteriel alkalisk phosphatase. Fragment 10 ligateres derpå 20 i plasmidet til dannelse af pGPGF-l.

Plasmid GPGF-1

BamHI Sall Sall * _|_I-1- * 11GGGGGGGGGG12 13FFFFF14 |

25 1 AmpR

Term

AmpR = Ampicillin-resistens TcR = Tetracyclin-resistens T = Guanosin/cytosin-hale 30 G — DNA-sekvenser, der koder for G-glycoprotein F = DNA-sekvenser, der koder for F-glycoprotein 11 = Oligonucleotid 11 12 = Oligonucleotid 12 13 = Oligonucleotid 13 35 14 = Oligonucleotid 14

Term * Translationelt terminationssignal 55 DK 173175 B1 SKEMA 9

GLYCOPROTEIN-FG

1 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 5 17 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gin Asn Ile Thr Glu Glu Phe 33 Tyr Gin Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 49 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 65 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys ^ 81 Gin Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gin Leu Leu 97 Met Gin Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 113 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 129 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Gly 145 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 15 161 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 177 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 193 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gin Leu Leu Pro Ile Val Asn 209 Lys Gin Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gin 225 Gin Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Clu Phe Ser Val Asn 241 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Clu 257 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gin Lys Lys 273 Leu Met Ser Asn Asn Val Gin Ile Val Arg Gin Gin Ser Tyr Ser Ile ^ 289 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gin Leu Pro 305 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 321 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 337 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 30 353 Pro Gin Ala Glu Thr Cys Lys Val Gin Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 369 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val 385 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met "Thr Sef'Lys'Thr 401 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Cly Ala Ile Val Ser Cys 35 417 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 433 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp 449 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gin Glu Cly 465 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro DK 173175 B1 56 SKEMA 9 (fortsat)

GLYCOPROTEIN-FG

^ 481 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Gin Leu Gly Ile Ser Pro Ser 497 Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gin Ile Thr Thr Ile Leu Ala Ser Thr 513 Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gin Ser Thr Thr Val Lys Thr Lys 529 Asn Thr Thr Thr Thr Gin Thr Gin Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gin 545 Arg Gin Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu 10 561 Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys 577 Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr f 593 Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr Thr Lys Lys Asp 609 Pro Lys Pro Gin Thr Thr Lys Ser Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro 625 Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys Thr Asn Ile Ile Thr Thr 641 Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro Glu Leu Thr Ser Gin Met 657 Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly Asn Pro Ser Pro Ser Gin 673 Val Asn Ile Ser Ser Gin Arg Glu Asp 20 25 30 35

Claims

1 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 15 3

17 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gin Asn Ile Thr Glu Glu Phe

33 Tyr Gin Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu

49 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile

65 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 20

81 Gin Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gin Leu Leu

97 Met Gin Ser Thr Pro Pro Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro

113 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr

129 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Gly

145 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 25

161 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys

177 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val

193 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gin Leu Leu Pro Ile Val Asn

209 Lys Gin Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gin ^ 225 Gin Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn

241 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu

257 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gin Lys Lys

273 Leu Met Ser Asn Asn Val Gin Ile Val Arg Gin Gin Ser .Tyr Ser Ile *5 289 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gin Leu Pro

305 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro DK 173175 B1

321 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg

337 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe

353 Pro Gin Ala Glu Thr Cys Lys Val Gin Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp

369 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Ile Asn Leu Cys Asn Val 5 385 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr

401 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys

417 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile

433 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Met Asp 10 449 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gin Glu Gly

465 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro

481 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Gin Leu Gly Ile Ser Pro Ser

497 Asn Pro Ser Glu Ile Thr Ser Gin Ile Thr Thr Ile Leu Ala Ser Thr 15 513 Thr Pro Gly Val Lys Ser Thr Leu Gin Ser Thr Thr Val Lys Thr Lys

529 Asn Thr Thr Thr Thr Gin Thr Gin Pro Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gin

545 Arg Gin Asn Lys Pro Pro Ser Lys Pro Asn Asn Asp Phe His Phe Glu

561 Val Phe Asn Phe Val Pro Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys 2 0 577 Trp Ala Ile Cys Lys Arg Ile Pro Asn Lys Lys Pro Gly Lys Lys Thr

593 Thr Thr Lys Pro Thr Lys Lys Pro Thr Leu Lys Thr Thr Lys Lys /sp

609 Pro Lys Pro Gin Thr Thr Lys Ser Lys Glu Val Pro Thr Thr Lys Pro

625 Thr Glu Glu Pro Thr Ile Asn Thr Thr Lys Thr Asn Ile Ile Thr Thr 25 641 Leu Leu Thr Ser Asn Thr Thr Gly Asn Pro Glu Leu Thr Ser Gin Met

657 Glu Thr Phe His Ser Thr Ser Ser Glu Gly Asn Pro Ser Pro Ser Gin

673 Val Asn Ile Ser Ser Gin Arg Glu Asp

1. Polypeptid, kendetegnet ved, at det omfatter mindst ét immunogent fragment fra begge human respiratorisk syncytial virus-glycoproteiner F og G.

2. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter en signalsekvens.

3. Polypeptid ifølge krav 2, kendetegnet ved, at dette polypeptid, begyndende med den N-terminale ende, er s ignal sekvensen fra glycoprotein F, et immunogent 10 fragment af glycoprotein F og et immunogent fragment af glycoprotein G.

4. Polypeptid ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er

5. Human vaccine, kendetegnet ved, at den indeholder et polypeptid ifølge ethvert af de foregående krav.

6. Anvendelse af en vaccine ifølge krav 5 til fremstilling af et lægemiddel til beskyttelse af mennesker mod 35 human respiratorisk syncytial virus.

7. Ekspressionssystem, kendetegnet ved, DK 173175 B1 at det omfatter en egnet vært indeholdende en DNA-sekvens, der er i stand til at udtrykke et polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-4.

8. Ekspressionssystem ifølge krav 7, kendete g-5 net ved, at værten er valgt blandt bakterieceller, gærceller, celler fra pattedyr og insektceller.

9. Ekspressionssystem ifølge krav 8,kendetegnet ved, at værten er valgt blandt E.coli-celler, ovarieceller fra kinesisk hamster, murine C 127-celler og s.frugi- 10 persa-celler.

9 DK 173175 B1

10. Ekspressionssystem ifølge ethvert af kravene 7-9,kendetegnet ved, at værten sekreterer polypep-tidet.

11. Ekspressionssystem ifølge ethvert af kravene 15 7-10, kendetegnet ved, at DKA-sekvensen er inde holdt i et plasmid.

12. Ekspressionssystem ifølge krav li, kendetegnet ved, at plasmidet er under kontrol af en cytome-galovirus-promotor.

13. Ekspressionssystem ifølge krav li, kende tegnet ved, at replikation af plasmidet, medens det befinder sig i en egnet eukaryot vært, er under kontrol af bovine papillomavirus-DNA-sekvenser.

14. Ekspressionssystem ifølge ethvert af kravene 7- 25 10, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen er indeholdt i et rekombinant virus af baculovirus-familien.

15. Ekspressionssystem ifølge krav 14, kendetegnet ved, at viruset er Autographa califomica-keme-polyedervirus. 30 35