DK172285B1 - Deletionsmutant af et herpesvirus og vaccine indeholdende dette virus - Google Patents
Deletionsmutant af et herpesvirus og vaccine indeholdende dette virus Download PDFInfo
- Publication number
- DK172285B1 DK172285B1 DK486684A DK486684A DK172285B1 DK 172285 B1 DK172285 B1 DK 172285B1 DK 486684 A DK486684 A DK 486684A DK 486684 A DK486684 A DK 486684A DK 172285 B1 DK172285 B1 DK 172285B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- virus
- deletion
- pigs
- nia
- prv
- Prior art date
Links
- 238000012217 deletion Methods 0.000 title claims description 52
- 230000037430 deletion Effects 0.000 title claims description 52
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 47
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 13
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 title description 5
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 5
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 3
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 2
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000010451 viral insertion Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241001440741 CHER virus Species 0.000 description 1
- 101100190464 Caenorhabditis elegans pid-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100190466 Caenorhabditis elegans pid-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100243942 Caenorhabditis elegans pid-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100243943 Caenorhabditis elegans pid-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002498 deadly effect Effects 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010753 nasal discharge Diseases 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/815—Viral vaccine for porcine species, e.g. swine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
- Y10S424/822—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving tk- virus
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
i DK 172285 B1
Opfindelsen angår en levende deletionsmutant af et herpesvirus, specielt et virus, der stammer fra Pseudorabi-es-virus (PRV), også betegnet Aujeszky's syge-virus (ADV). Pseudorabies er en sygdom hos alle husdyr, bortset 5 fra hesten, og forårsager betydelige tab specielt blandt svin og kvæg. Svinet er den naturlige vært for herpesvi-ruset fra Aujeszky's syge. Dyrene inficeres via den nasale vej og efter en primær virusopformering i slimhinderne i de øvre luftveje og fordøjelseskanalen, spreder viruset 10 sig til hjernen. Infektionen skrider fremad akut til sub-klinisk, hovedsagelig afhængigt af virusets virulens og svinenes alder. Pseudorabies-virus giver som andre her-pesvira latente infektioner, specielt i nervevævene.
15 Man udfører vaccinationer for i nogen grad at begrænse de økonomiske tab på grund af dødsfald blandt dyrene og hæmning af væksten. Til dette formål forefindes vacciner, der er baseret henholdsvis på svækket levende virus og på inaktiveret virus. Vaccinerne baseret på svækket levende 20 virus er enklere at fremstille og derfor billigere end de vacciner, der er baseret på inaktiveret virus. Yderligere har de vacciner, der indeholder svækket levende virus den fordel, at de også kan anvendes intranasalt. Intranasal podning bevirker en bedre beskyttelse over for sygdommen 25 end parenteral vaccination med svækket levende virus eller med inaktiveret virus.
Svækkede levende virusvacciner, der for øjeblikket anvendes, udviser forskellige ulemper: 30 1) De fremstilles sædvanligvis ved rækkefortyndinger af virulente eller mildt virulente stammer i vævskultur (50-900 passager). Dette frembringer ukonrollerede mutationer i det virale genom.
35 DK 172285 B1 2 2) De fleste præparater af kommercielle vacciner er ikke homogene. Vaccinerne indeholder nemlig et vist antal virusvarianter, hvis virulens eller vaccinationsevne ikke er veldefineret.
5 3) Der er fare for tilbagevenden til virulens.
4) Der er risiko for indførelse af latente infektioner.
10 Genomstrukturen af DNA'en hos Pseudorabies-virus (PRV) er beskrevet i litteraturen (Virology 97 (1979) side 151- 163) . På basis af arrangementet af de gentagne sekvenser hører PRV til gruppen af D-herpesvira. De indeholder et genom på ca. 160 000 nucleotidpar indeholdende to omvend-15 te gentagelser og to unikke sekvenser, betegnet Us og Ui. Viruset forekommer i to isomere former, der begge er in-fektiøse. For at få et indblik i genomets struktur og i variabiliteten mellem de mange forekommende isolater blev DNA'erne fra en række vaccinestammer og fra nogle af de 20 omkring 100 uafhængige PRV-isolater, der er opnået i Holland og andre lande fra dyr, der led af sygdommen, sammenlignet ved hjælp af restriktionskortlægning. Denne analyse, der udførtes med et antal restriktionsenzymer, viste følgende: 25 a) De enkelte isolater udviser en høj grad af sekvensho-mologi, dvs. en nick-translateret sonde fra viruset NIA-3 (Northern Ireland Aujeszky-3) anvendt som reference genkendte under strenge hybridiseringsbetingel- 30 ser alle brudstykker af feltisolaterne.
b) Strukturerne af de forskellige isolater viste en høj gensidig lighed. Almindeligvis er tilsvarende sekvenser lokaliseret i de samme områder.
35 DK 172285 B1 3 c) Visse regioner viser mere variabilitet end andre.
F.eks. viste de overlappende fragmenter af omvendt gentagelse til unik sekvens en stærk heterogenitet.
5 d) Stammerne, der anvendtes i vaccinerne, indeholdt, selv om de mest var heterogene med hensyn til DNA'sammensætningen og dårligt definerbare, en deletion varierende fra 1000 til 4000 nucleotidpar i et tilsvarende restriktionsfragment.
10
Opfindelsens formål er at modificere genomet af PRV på en sådan måde, at der opnås et virus, som er avirulent, ikke frembringer latent infektion, er genetisk stabilt og derfor ikke forøges i virulens efter dyrepassage, og har go-15 de immunogene egenskaber.
For at opnå dette blev genomet fragmenteret ved hjælp af restriktionsenzymer, og fragmenterne blev adskilt under anvendelse af agarosegel-elektrophorese og glycerolha-20 stighedsgradienter. Hefter blev de enkelte fraktioner undersøgt for biologisk aktivitet ved hjælp af transfektion i svinenyreceller. Transfektion med intakt DNA gav anledning til virusproduktion fra 5-10 ng DNA pr. kulturflaske. Transfektion med kombinerede restriktionsfragmenter 25 gav i nogle tilfælde virus på ca. 50 ng pr. kulturflaske. Vira produceret af de inficerede celler blev karakteriseret. Det viste sig, at ved transfektion uden forudgående ligering skete der små deletioner omkring restriktionsstederne for det enzym, hvormed genomet var blevet frag-30 menteret. Som forventet tolereres en deletion kun ved et begrænset antal steder.
Ved hjælp af de ovenfor beskrevne analyser er der blevet defineret to områder af PRV-genomet, som tolererer dele-35 tioner. Vira, hvis genom udviser en eller flere af disse deletioner, viser sig at være væsentlig mindre virulente DK 172285 B1 4 end udgangsviruset. De modificerede vira viser klart forandrede in-vitro vækstegenskåber. Infektionen skrider langsommere frem, og den cytopatologiske virkning er klart forskellig fra virkningen af de oprindelige stam-5 mer. Også in-vivo viser deletionsmutanterne sig at opføre sig helt anderledes. Efter intranasal inoculering viste smågrise kun en lille temperaturforøgelse uden nogen som helst yderligere kliniske fænomener. Under infektionen kunne viruset atter isoleres fra spyttet.
10
Det viste sig yderligere, at tilstedeværelsen af et funktionelt thymidinkinase-gen kan føre til uønsket latens af viruset. Som følge heraf kan deletionsmutanterne ifølge opfindelsen have en deletion i thymidinkinase-genet.
15
Opfindelsen angår en levende deletionsmutant af et herpesvirus opnået ved, at der ved hjælp af rekombinant-DNA-teknikker i genomet af en virulent udgangsstamme, som består af ca. 160 000 nucleotidpar og er karakteriseret ved 20 et restriktionskort, der er typisk for Pseudorabies-virus-DNA, f.eks. ved restriktionskortet i fig. 1, hvori rektanglerne repræsenterer omvendte gentagelser, og de lodrette linier repræsenterer spaltningsstederne for re-striktionsendonucleaserne Hindlll, Kpnl, BamHI og Bglll, 25 og som omfatter en lille unik sekvens Us, som har et restriktionskort, der er typisk for den lille unikke sekvens af Pseudorabies-virus-DNA, f.eks. restriktionskortet afbildet i fig. 2, hvori pilene repræsenterer spaltningsstederne for restriktionsendonucleaserne angivet i 30 fig. 2, er indført en eller flere af følgende deletioner: (a) en deletion i de omvendte gentagelser beliggende mellem spaltningsstederne for Kpnl (mellem henholdsvis fragment E eller fragment H og fragment K + M) og spaltnings-35 stederne for BamHI (mellem BamHI fragmenter 5 og 8); DK 172285 B1 5 (b) en deletion i området, der er skraveret på restriktionskortet over den lille unikke sekvens (fig. 2); (c) en deletion i thymidinkinase-genet.
5
Deletion (a) omfatter fortrinsvis ca. 100 nucleotider, og deletion (c) omfatter fortrinsvis ca. 100-500 nucleotider.
10 I den ovennævnte definition af deletionsmutanterne ifølge opfindelsen er mutanternes genomer defineret som genomer, der adskiller sig fra udgangsstammegenomerne ved tilstedeværelsen af 1, 2 eller 3 deletioner. I betragtning af den kendte variabilitet af udgangs-Pseudorabies-virus-15 stammerne er opfindelsen ikke begrænset til mutanter afledt fra udgangsstammer, der har genomer nøjagtig svarende til restriktionskortet i fig. 1. Restriktionskortene for den lille unikke sekvens Us i udgangsstammerne kan også være forskellige fra restriktionskortet i fig. 2, 20 skønt genomerne af alle udgangsstammerne indeholder en lignende unik sekvens. Imidlertid er alle udgangsstammer Pseudorabies-virus-stammer, der frembringer de kliniske symptomer på Pseudorabies.
25 Opfindelsen omfatter også vacciner indeholdende en levende virusmutant som defineret ovenfor. Vaccinerne fremstilles på sædvanlig måde.
Deletionsmutanter med de ovenfor beskrevne egenskaber op-30 nås ved at indføre deletioner i det virale genom ved hjælp af molekylærbiologiske teknikker på en af følgende måder: a) Nedbrydning af klonede eller uklonede subgenomfrag-35 menter med restriktionsendonucleaser og efterfølgende religering af en del af de således frembragte frag- DK 172285 B1 6 menter med deletion af et eller flere fragmenter i det respektive subgenomfragment, indførsel af et således modificeret fragment, evt. efter ligering med resten af den overlappende eller ikke-overlappende 5 genetiske information fra det virale genom, i følsom me celler til produktion af det modificerede virus.
b) Nedbrydning af klonede eller uklonede subgenomfragmenter med restriktionsendonucleaser og frembringelse 10 af en deletion ved spaltningsstedet ved behandling af fragmenterne med en exonuclease og, evt. efter re-ligering med resten af den overlappende eller ikke-overlappende genetiske information fra det virale genom, indførsel af de modificerede fragmenter i føl-15 somme celler til produktion af det modificerede vi rus .
c) Nedbrydning af klonede eller uklonede subgenom-fragmenter med restriktionsendonucleaser og frembrin- 20 gelse af en deletion ved spaltningsstedet ved trans- fektion af de dannede fragmenter (uden forudgående ligering) sammen med resten af den overlappende eller ikke-overlappende genetiske information fra det virale genom i følsomme celler. Disse celler vil produce-25 re det modificerede virus. Deletionen vil blive frem bragt spontant under transfektionsproceduren.
Følgende eksempler belyser konstruktionen af deletionsmutanterne ifølge opfindelsen samt deres biologiske egen-30 skaber. De hidtil ukendte mutantstammer 2.4N3A og 2.8N3A er deponeret i Phabagen Collection ved Rijksuniversiteit i Utrecht, Vakgroep Moleculaire Celbiologie, Transitorium 3, Padnalaan 8, 3584 CH Utrecht, Holland. Deponeringsnumrene er henholdsvis PCPV2 og PCPV3. Yderligere er disse 35 stammer deponeret i Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.), Institut Pasteur, Paris, DK 172285 B1 7
Frankrig. I denne samling er deponeringsnummeret for stamme 2.4N3A I 351 og deponeringsnummeret for stamme 2.8N3A I 352.
5 EKSEMPEL
Konstruktion af mutanter
Konstruktionen af de forskellige deletionsmutanter af i 10 Pseudorabies-virus (PRV) stamme NIA-3 er skitseret i fig.
3. NIA-3 virion-DNA blev nedbrudt fuldstændigt med re-striktionsendonucleaserne BamHI og Hindlll. Produkterne af nedbrydningerne blev fraktioneret på præparative aga-rosegeler, og fragmenterne blev isoleret ved elektroelue-15 ring. Hindlll B og BamHI 7 fragmenterne blev indsat i plasmidvektoren pBR322 og klonet ifølge etablerede procedurer. Plasmidet pN3B7 (11,1 kbp), der bar BamHI fragmentet, blev anvendt til at indføre deletioner i NIA-3 geno-met. For at udføre dette blev pN3B7 lineariseret ved del-20 vis Ball-nedbrydning (45 min, 37 °C, 0,3 enheder Ball pr. μg DNA). Fuld-længde DNA-molekyler blev isoleret ved aga-rosegelelektrophorese og elektroeluering. Disse molekyler blev nedbrudt med exonucleasen Bal31. Optimale betingelser for nedbrydning (0,18 kbp DNA/min) var 57 nM DNA og 25 20 enheder pr. ml Bal31 exonuclease ved 37 °C. Aliquoter blev udtaget 7, 12,5 og 18,5 minutter efter tilsætning af exonucleasen, og nedbrydningsprodukterne adskiltes efter størrelse på et lavt smeltende agarosegel. DNA-fragmenter af den ønskede længde (8,3 til 9,0 kbp) udvalgtes. DNA-30 molekylerne blev behandlet med T4 polymerase, religeret med T4 DNA ligase og indført i Escherichia coli stamme HB101 ved hjælp af standardmetoder. Fra de Amp-resisten-te/Tet-følsomme kolonier isoleredes plasmid-DNA. Størrelsen og positionen af deletionerne bestemtes ved nedbryd-35 ning med restriktionsendonucleaserne Mlul, Bglll, Sphl og Pvul. Tre rekombinante plasmider med forskellige deletio- DK 172285 B1 8 ner (2,1, 2,4 og 2,8 kbp) udvalgtes til yderligere manipulation. De havde bibeholdt Mlul-stedet ved kortposition 0,886 og Bglll-stedet ved position 0,856, men havde tabt Mlul-stedet ved position 0,876 (fig. 3). MluI-BgIII frag-5 menterne (stiplede linier) af pN3B7-derivaterne med deletioner på 2,1, 2,4 og 2,8 kbp blev isoleret og ligeret til 30 kbp MluI-BgIII fragmentet af plasmid pN3HB. De resulterende plasmider pHB 2.1, pHB 2.4 og pHB 2.8 blev karakteriseret ved restriktionsendonuclease-analyse.
10
Til transfektion blev Hindlll A fragmentet af NIA-3 viri-on-DNA og de virale insertioner af plasmiderne pHB 2.1, pHB 2.4 og pHB 2.8, spaltet med Hindlll, renset ved to på hinanden følgende 5-40% glycerolgradienter (20 mM Tris- 15 hydrochlorid pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA) . Renheden af
Hindlll A fragmentet og af de virale insertioner blev verificeret ved restriktionsendonuclease-spaltning og Southern-aftryksanalyse. Herefter blev et firefolds molært overskud af hver af de virale plasmidinsertioner 20 blandet med Hindlll A fragmentet fra NIA-3 virion-DNA. DNA-blandingerne (500 ng) blev transficeret ind i sekundære svinenyreceller (PK-2) ved hjælp af calciumphosphat-copræcipitationsteknikken (Virology 52 (1973), 456-467).
25 De rekonstituerede vira opnået ud fra positive transfek-tioner blev renset ved tre omganges plak-udtagning, og deres genomer blev karakteriseret ved Southern-aftryks-analyse.
30 Biologisk karakterisering af deletionsmutanter
Udgangsstammen NIA-3, den avirulente stamme NIA-4 og deletionsmutanterne 2.4N3A og 2.8N3A blev undersøgt med hensyn til deres biologiske egenskaber hos mus og svin.
35 DK 172285 B1 9
Gennemsnitstiden til dødsfald (MID) hos mus efter inocu-lering med stammer af PRV anvendtes som en parameter til at gruppere stammer efter virulens (Archives of Virology 63 (1080), 107-114). Sædvanligvis dræber virulent PRV mus 5 hurtigere end svækkede stammer af PRV, skønt man har set undtagelser. Som det fremgår af tabel 1 varierede MID-værdierne for de forskellige stammer betydeligt. Deletionsmutanterne 2.4N3A og 2.8N3A udviste signifikant (Wilcoxon rank test, p<0,05) længere MTD-værdier end NIA-10 3-stammen, hvilket angav, at en markør for virulens hos mus forefindes i Us- og/eller gentagelsesregionen. Også forskellen i MTD mellem mutanterne 2.4N3A og 2.8N3A er signifikant (p<0,05), hvilket tyder på at virulensen for mus er påvirket af positionen og/eller størrelsen af de-15 letionen i Us-området.
Svin af den hollandske landrace "minimal-sygdoms"- besætning fra Central Veterinary Institute, der er frie for Pseudorabies, blev anvendt til at bestemme virulensen 20 af deletionsmutanterne i den naturlige vært. Som vist i tabel 1 havde deletionsmutanterne afledt fra NIA3-stammen en udpræget reduceret virulens for svin. Udgangs-NIA-3-stammen dræbte 2 ud af 5 svin. Hos de overlevende dyr observeredes kraftig depression, anorexi og feber (>40 °C), 25 der begyndte på postinoculationsdag (PID) 2. Fra PID 5 til 7 udviste de fleste svin udflåd fra næsen og åndenød. Yderligere udviklede de milde til kraftige neurologiske tegn. Rekonstitueret NIA-3 uden en deletion i Us-området, men med en lille deletion i gentagelsesenheden ved posi-30 tionen af Hindlll stedet, opførte sig på samme måde som NIA-3, hvilket angav, at deletionen i gentagelsen ikke er af betydning for virulensen hos svin. I modsætning hertil blev svin, som var inoculeret med mutant 2.4N3A, kun svagt nedtrykt og havde en noget reduceret appetit mellem 35 PID 2 og 5. Gennemsnitskropstemperaturerne forblev under 40 °C. Det eneste tegn på sygdom hos svin, der var inocu- DK 172285 B1 10 leret med mutant 2.8N3A, var en stigning i kropstemperaturen: gennemsnittemperaturerne på PID 3, 4 og 5 var henholdsvis 40,3, 40,4 og 40,1. Disse resultater viser klart, at forekomsten af deletioner i Us-regionen af PRV 5 er forbundet med en reduceret virulens hos både mus og svin. Svin inoculeret med NIA-4 stammen viste også en noget reduceret appetit på PID 4. Denne stammes virulens for svin forandrede sig ikke, når dens Hindlll B fragment blev erstattet med det deleterede Hindlll B fragment (Δ 10 2,4) af den virulente NIA-3 stamme. Dette viser, at dele tionen, der findes i Us-regionen af NIA-4, er den afgørende faktor, der bestemmer den reducerede virulens af NIA-4 stammen. Gruppens gennemsnitlige vækststandsningsperiode er en vigtig parameter med hensyn til sygdommens 15 sværhedsgrad. Tabel 1 viser, at der hos svin inoculeret med NIA-3-virus sås en gennemsnitlig vækststandsningsperiode på 9 dage, medens der hos svin inoculeret med en vilkårlig af de andre mutanter ikke blev bemærket nogen vækststandsning.
20
TABEL 1 Biologiske egenskaber af deletionsmutanter af PRV
25
Virus Mus Svin MTD Døds- Vækst- Feber Virus- Antistoffald stands- udskillelse titer 30 ning pos gennem- _% snit_ NIA-3 50 ± 4 2 9 4 90 3,64 2,85 NIA-4 170 ± 29,0 0 0 0 ND ND 1,13 2.4N3A 73 ± 7,0 0 0 0 80 2,65 1,65 35 2.8N3A 60 i 8,5_0_0_3_50 2,20 1,62 DK 172285 B1 11
For at bestemme virulensen over for mus inoculeredes grupper på otte 6-7 uger gamle BALB/c mus med 106 plakdannende enheder (PFU) af PRV. Musene kontrolleredes med 6 timers mellemrum i 10 dage. Gennemsnitstiden til musene 5 døde (MID) er angivet med standardafvigelse.
For at bestemme virulensen hos svin inoculeredes grupper på fem 10 uger gamle svin intranasalt med en dosis på 105 PFU af PRV ved inddrypning af 0,5 ml i hvert næsebor.
10 Vækststandsningsperioden defineredes som det antal dage, der var nødvendige for at genvinde gruppens gennemsnitsvægt på postinoculationsdag (PID) 3. Svin, der døde, var ikke indbefattet i denne beregning.
15 Dages feber: gennemsnitsantallet af dage, hvor krops-temperaturerne var over 40 °C. Virusudskillelse: Prøver af oropharyngealvæske (OPF) blev opsamlet dagligt 10 dage efter vaccination. Udtagningsmetoden og vi-20 rusprøvningen blev foretaget som be skrevet i Veterinary Quarterly A (1982), 49-56.
Pos,%: procent positive OPF-prøver.
Gennemsnitstiter: Gennemsnitlige virustitere er udtrykt 25 som logio PFU/ml OPF.
Antistoftiter: den neutraliserende antistoftiter på PID 21 er udtrykt som log™ af den reciprokke værdi af den slutserumfortyn-ding, der inhiberede cytopatisk virk-30 ning i 50% af kulturerne.
Niveauerne af virusudskillelse efter inoculation, der giver en indikation på virusets evne til at formere sig i de øvre luftveje og/eller fordøjelseskanalen, blev også 35 kontrolleret. Svin inficeret med virulent PRV udskilte betydelig større mængder virus gennem længere tid end 12 DK 172285 B1
svin, der var inoculeret med svækket PRV. Som vist i tabel 1 indeholdt bogstavelig talt alle prøver af oropha-ryngealvæske (OPF) fra svin indgivet NIA-3 stamme virus. Desuden var den gennemsnitlige virustiter i OPF-prøverne 5 den højeste i disse dyr. Virusudskillelsen hos svin indgivet mutanterne 2.4N3A eller 2.8N3A var væsentligt reduceret. De svin, der overlevede infektionen med den virulente NIA-3 stamme, viste mere end tifold højere gennemsnitlige neutraliserende antistoftitere 3 uger efter ino-10 culation, end de fra NIA-3 afledte deletionsmutanter. NIA-4 stammen inducerede den laveste antistoftiter. Imidlertid var svin inoculeret med deletionsmutanterne udmærket beskyttet over for en udfordring med virulent PRV: Intranasal vaccination med deletionsmutanterne forhindre-15 de forekomsten af kliniske tegn efter udfordring med den virulente NIA-3 stamme (tabel 2) . Der blev ikke observeret nogen vækststandsning, og den gennemsnitlige kropstemperatur hos svin inoculeret med 2.4N3A og 2.8N3A forblev under 40 °C. Selv om de var beskyttet mod klinisk 20 sygdom, udskilte svinene virulent virus via OPF. Sammenlignet med kontrolsvin var procenten af virusholdige prøver opsamlet i 10 dage efter udfordringen reduceret i udpræget grad. Desuden var gennemsnitstiterne af PRV i OPF
3-5 log lavere end hos kontrolsvinene (tabel 2).
25 TABEL 2 Bedømmelse af beskyttelse induceret af deletionsmutanter
Virus Antistof- Døds- Vækst- Feber Virus- 30 titer fald stands- udskillelse ning _ pos gennemsnit % 2.4N3A 2.25 0 0 0 20 0,51 2.8N3A 2,04 0 0 0 52 2,00
Kontroller_-_0_20_8_100 5,27_ 35 DK 172285 B1 13
En gruppe bestående af fem sero-negative svin og to grupper svin vaccineret med PRV-deletionsmutanterne 2.4N3A og 2.8N3A (se tabel 1) blev intranasalt udfordret med 105 PFU virulent NIA-3 virus ved en alder på 16 uger. Anti-5 stoftiterne blev kontrolleret på selve udfordringsdagen, 6 uger efter vaccination.
i
Claims (6)
- 2. Virus ifølge krav 1, kendetegnet ved, at 30 deletion (a) omfatter ca. 100 nucleotider.
- 3. Virus ifølge krav 1, kendetegnet ved, at deletion (c) omfatter ca. 100-500 nucleotider. DK 172285 B1
- 4. Levende Pseudorabies-virus-deletionsmutanter ifølge krav 1/ kendetegnet ved, at de er afledt fra NIA-3 stammen af PRV.
- 5. Deletionsmutant 2.4N3A ifølge krav 4, som beskrevet i beskrivelsen og deponeret i Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.), Institut Pasteur, Paris, Frankrig, under deponeringsnummeret I 351.
- 6. Deletionsmutant 2.8N3A ifølge krav 4, som beskrevet i beskrivelsen og deponeret i Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.), Institut Pasteur, Paris, Frankrig, under deponeringsnummeret I 352.
- 7. Vaccine indeholdende en levende virusmutant ifølge et eller flere af de forudgående krav.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8303501 | 1983-10-12 | ||
| NL8303501A NL8303501A (nl) | 1983-10-12 | 1983-10-12 | Deletiemutant van een herpesvirus en vaccin, dat dit virus bevat. |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK486684D0 DK486684D0 (da) | 1984-10-11 |
| DK486684A DK486684A (da) | 1985-04-13 |
| DK172285B1 true DK172285B1 (da) | 1998-02-23 |
Family
ID=19842541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK486684A DK172285B1 (da) | 1983-10-12 | 1984-10-11 | Deletionsmutant af et herpesvirus og vaccine indeholdende dette virus |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4680176A (da) |
| EP (1) | EP0141458B1 (da) |
| JP (1) | JP2519201B2 (da) |
| AU (1) | AU574724B2 (da) |
| DE (1) | DE3483512D1 (da) |
| DK (1) | DK172285B1 (da) |
| ES (1) | ES8505719A1 (da) |
| NL (1) | NL8303501A (da) |
| PT (1) | PT79348B (da) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8303501A (nl) * | 1983-10-12 | 1985-05-01 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Deletiemutant van een herpesvirus en vaccin, dat dit virus bevat. |
| US4514497B1 (en) * | 1983-12-30 | 1998-02-24 | Novagene Inc | Modified live pseudorabies viruses |
| US4859587A (en) * | 1984-06-04 | 1989-08-22 | Institut Merieux | Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods |
| DE3505148A1 (de) * | 1985-02-15 | 1986-10-30 | Boehringer Ingelheim International GmbH, 6507 Ingelheim | Polypeptide des rhinovirusstammes hrv2 sowie die hierfuer codierenden dna-molekuele |
| EP0263207B1 (en) * | 1986-10-08 | 1991-11-27 | The Upjohn Company | Virus vaccine |
| DE3677494D1 (de) * | 1985-07-29 | 1991-03-14 | Upjohn Co | Virus-impfstoff. |
| US5128128A (en) * | 1985-07-29 | 1992-07-07 | The Upjohn Company | Virus vaccine |
| US5275934A (en) * | 1985-07-29 | 1994-01-04 | The Upjohn Company | Method of detecting viral infection in vaccinated animals |
| US5068192A (en) * | 1986-01-27 | 1991-11-26 | Prutech Research And Development Partnership | Attenuated pseudorabies virus which includes foreign DNA encoding an amino acid sequence |
| US5834305A (en) * | 1985-09-06 | 1998-11-10 | Syntro Corporation | Attenuated herpesvirus, herpesvirus which include foreign DNA encoding an amino acid sequence and vaccines containing same |
| US6121043A (en) * | 1985-09-06 | 2000-09-19 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys comprising a foreign DNA inserted into a non-essential region of the herpesvirus of turkeys genome |
| US5223424A (en) * | 1985-09-06 | 1993-06-29 | Prutech Research And Development | Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence |
| US5763269A (en) * | 1985-09-06 | 1998-06-09 | Syntro Corporation | Recombinant infectious bovine rhinotrocheitis virus |
| US4877737A (en) * | 1985-09-06 | 1989-10-31 | Prutech Research And Development Partnership | Attenuated pseudorabies virus which has a deletion in at least a portion of a repeat sequence and vaccine containing same |
| US5352575A (en) * | 1985-10-04 | 1994-10-04 | The Upjohn Company | Pseudorabies virus protein |
| US4703011A (en) * | 1985-11-12 | 1987-10-27 | Novagene, Inc. | Thymidine kinase deletion mutants of bovine herpesvirus-1 |
| WO1987004463A1 (en) * | 1986-01-27 | 1987-07-30 | Syntro Corporation | Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same |
| US5593873A (en) * | 1986-01-27 | 1997-01-14 | Syntro Corporation | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus |
| US4711850A (en) * | 1986-01-28 | 1987-12-08 | Novagene, Inc. | Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same |
| US6172186B1 (en) | 1986-03-26 | 2001-01-09 | Pharmacia & Upjohn Company | Pseudorabies virus protein |
| ZA872532B (en) * | 1986-04-21 | 1987-11-25 | Akzo Nv | Combined vaccine |
| US4999296A (en) * | 1986-04-29 | 1991-03-12 | Novagene, Inc. | Thymidine kinase negative insertion mutants of pseudorabies virus and methods for the production of same |
| FR2601689B1 (fr) * | 1986-07-17 | 1992-10-16 | Syntro Corp | Herpes virus attenues, herpes virus qui renferment de l'adn etranger codant pour une sequence d'amino-acides, et vaccins les contenant |
| US5004693A (en) * | 1986-07-18 | 1991-04-02 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Pseudorabies virus recombinants and their use in the production of proteins |
| US5037742A (en) * | 1986-07-18 | 1991-08-06 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Pseudorabies virus recombinants and their use in the production of proteins |
| WO1989001040A1 (en) * | 1987-07-27 | 1989-02-09 | Syntro Corporation | Attenuated herpes viruses, herpes viruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccines containing same |
| US5672344A (en) * | 1987-12-30 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Viral-mediated gene transfer system |
| US5151267A (en) * | 1988-07-15 | 1992-09-29 | University Of Saskatchewan | Bovine herpesvirus type 1 polypeptides and vaccines |
| US5585264A (en) * | 1988-07-15 | 1996-12-17 | University Of Saskatchewan | Nucleotide sequences encoding recombinant bovine herpesvirus type-1 GI, GIII and GIV polypeptides |
| NL8902087A (nl) * | 1989-08-17 | 1991-03-18 | Stichting Tech Wetenschapp | Niet-natuurlijk voorkomend pseudorabiesvirus en vaccins die dit bevatten. |
| US5695765A (en) * | 1989-08-17 | 1997-12-09 | Stichting Voor De Technische Wetenschappen | Mutant pseudorabies virus, and vaccines containing the same |
| US5240703A (en) * | 1991-03-01 | 1993-08-31 | Syntro Corporation | Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof |
| JP3206767B2 (ja) * | 1992-02-20 | 2001-09-10 | 北海道 | 欠失ｒｎａ遺伝子を用いたｂｎｙｖｖ弱毒ウイルスの作出とその利用 |
| US5352596A (en) * | 1992-09-11 | 1994-10-04 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Pseudorabies virus deletion mutants involving the EPO and LLT genes |
| US6342501B1 (en) | 1994-02-25 | 2002-01-29 | The Regents Of The University Of Michigan | Pyrrolo[2,3-d] pyrimidines as antiviral agents |
| US6455506B1 (en) | 1997-07-30 | 2002-09-24 | Smithkline Beecham Corporation | Lyxofuranosyl benzimidazoles as antiviral agents |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3122669A1 (de) * | 1980-06-12 | 1982-02-11 | Asta-Werke Ag, Chemische Fabrik, 4800 Bielefeld | "verfahren zur herstellung von neuen mutanten von herpes simplex-viren typ 1 und typ 2" |
| EP0074808A3 (en) * | 1981-09-16 | 1984-07-04 | University Patents, Inc. | Recombinant method and materials |
| ZA84467B (en) * | 1983-02-01 | 1984-09-26 | Upjohn Co | Pseudorabies vaccine |
| NL8303501A (nl) * | 1983-10-12 | 1985-05-01 | Centraal Diergeneeskundig Inst | Deletiemutant van een herpesvirus en vaccin, dat dit virus bevat. |
| US4514497B1 (en) * | 1983-12-30 | 1998-02-24 | Novagene Inc | Modified live pseudorabies viruses |
-
1983
- 1983-10-12 NL NL8303501A patent/NL8303501A/nl not_active Application Discontinuation
-
1984
- 1984-10-11 AU AU34141/84A patent/AU574724B2/en not_active Expired
- 1984-10-11 DK DK486684A patent/DK172285B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-10-11 PT PT7934884A patent/PT79348B/pt unknown
- 1984-10-11 ES ES536681A patent/ES8505719A1/es not_active Expired
- 1984-10-12 DE DE8484201474T patent/DE3483512D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-12 US US06/660,097 patent/US4680176A/en not_active Ceased
- 1984-10-12 JP JP21402384A patent/JP2519201B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-12 EP EP19840201474 patent/EP0141458B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-07-28 US US07/078,751 patent/US5028426A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NL8303501A (nl) | 1985-05-01 |
| AU3414184A (en) | 1985-04-18 |
| ES536681A0 (es) | 1985-06-16 |
| EP0141458A1 (en) | 1985-05-15 |
| EP0141458B1 (en) | 1990-10-31 |
| JP2519201B2 (ja) | 1996-07-31 |
| AU574724B2 (en) | 1988-07-14 |
| DK486684D0 (da) | 1984-10-11 |
| DK486684A (da) | 1985-04-13 |
| JPS60221081A (ja) | 1985-11-05 |
| US4680176A (en) | 1987-07-14 |
| DE3483512D1 (de) | 1990-12-06 |
| PT79348A (en) | 1984-11-01 |
| ES8505719A1 (es) | 1985-06-16 |
| PT79348B (en) | 1986-09-08 |
| US5028426A (en) | 1991-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK172285B1 (da) | Deletionsmutant af et herpesvirus og vaccine indeholdende dette virus | |
| CN110093324B (zh) | 基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒及其作为疫苗的应用 | |
| CA2031164C (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof | |
| US10240131B2 (en) | Type II pseudorabies virus attenuated strain, its preparation method and application | |
| EP0654086B1 (en) | Vaccines against aujeszky's disease and other animal diseases containing pseudorabies virus mutants | |
| JP3159476B2 (ja) | 組換えマレック病ウィルス | |
| US7060282B1 (en) | Attenuated equine herpesvirus | |
| EP0486562B1 (en) | Mutant pseudorabies virus, and vaccines containing the same | |
| CN109022373B (zh) | 鸭瘟病毒ul56基因3’端缺失和lorf5基因缺失突变株及其构建方法与应用 | |
| EP0606452B1 (en) | Vector vaccines of recombinant feline herpesvirus | |
| EP0663403A1 (en) | Vector vaccines of bovine herpesvirus I | |
| US5695765A (en) | Mutant pseudorabies virus, and vaccines containing the same | |
| USRE33772E (en) | Deletion mutant of a herpesvirus and vaccine containing said virus | |
| US5874280A (en) | Vector vaccines of bovine herpesvirus I | |
| JP2002512504A (ja) | 機能が不全な７１遺伝子領域を含む組換えウマヘルペスウィルス１型（ｅｈｖ−１）、および、そのワクチンとしての使用 | |
| WO1994008000A1 (en) | Pseudorabies virus vaccine | |
| MXPA01001175A (en) | Attenuated equine herpesvirus | |
| MXPA99005452A (en) | Recombinant equine herpesvirus type 1 (ehv-1) comprising a dysfunctional gene 71 region and use thereof as a vaccine |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |