DK172274B1 - HTLV-III-virusprotein, DNA-sekvens, der koder herfor, fremgangsmåde til fremstilling heraf, fremgangsmåde til detektion af AIDS-virus samt antistoffer mod AIDS-virus - Google Patents

Description

DK 172274 B1

Den foreliggende opfindelse angår et protein med betegnelsen gag/env, hvilket protein omfatter kerneproteinet (gag) og kappeproteinet (env) fra HTLV-III-virus, som er det ætiologiske agens for akvisit immun-defektsyndrom (AIDS). Dette protein fremstilles ved organiske 5 syntesemetoder eller ved anvendelse af rekombinante DNA-teknikker, ved hvilke de relevante gensekvenser indsættes ved hjælp af en hensigtsmæssig DNA-vektor i en kompatibel encellet værtsorganisme.

Opfindelsen angår endvidere isolering og oprensning af gag/env-pro-teinet og fremgangsmåder til detektion af AIDS-antistoffer eller vira 10 i humane sera eller andre biologiske væsker og til immunoprofylaktisk beskyttelse af mennesker mod AIDS baseret på anvendelse af proteinet. Opfindelsen angår endvidere testsæt til bestemmelse af antistoffer mod AIDS-vira eller til bestemmelse af AIDS-virus.

I 1985 blev næsten 8000 mennesker diagnosticeret til at lide af AIDS, 15 og antallet er steget støt. Det forventes, at der vil blive diagnosticeret yderligere 15.000 tilfælde i 1986, og antallet af tilfælde kan meget vel blive fordoblet i 1987 (New York Times Magazine, 2. marts 1986, s. 42). AIDS er blevet karakteriseret ved opståen af alvorlige opportunistiske infektioner, der er sekundære i forhold til 20 indvirkning på kroppens immunsystem (Gottlieb et al., New Eng. J.

Med., 305, 1981, s. 1425). Sygdommen er fundet hos homoseksuelle mænd, patienter, som modtager blodprodukter, sprøjtenarkomaner og personer, som stammer fra Haiti og Centralafrika (Piot et al.,

Lancet, 11, 1984, s. 65).

25 Det kausative agens blev mistænkt for at være af viral oprindelse, fordi det epidemiologiske mønster af AIDS stemte overens med en sygdom, som kunne overføres. Der er isoleret mindst tre retrovira fra dyrkede T-celler fra adskillige patienter med AIDS eller fra hvide blodlegemer hos personer, der risikerer at få sygdommen. Der blev 30 opdaget et hidtil ukendt humant retrovirus, som blev betegnet lymfa-denopatiforbundet virus (LAV), og dets egenskaber var konsistente med en ætiologisk rolle for AIDS. Dette virus blev isoleret fra en patient med lymfadenopati, hvoraf navnet (Montagnier et al., i Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, R.C. Gallo et al., red., Cold Spring 35 Harbor Laboratory, 1984, s. 363-370).

DK 172274 B1 2

Andre humane retrovira, især to undergrupper af human T-celleleu-kæmi/lymfoma/lymfotrop virus type I (Poiesz et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, 77, 1980, s. 7415) og III (Popovic et al., Science, 224, 1984, s. 497) er også blevet isoleret. Endnu et virus, der betegnes 5 AIDS-forbundet retrovirus (ARV), er blevet foreslået som det kausa- tive agens (Levy et al., Science, 225, 1984, s. 840). Både HTLV-III-og ARV-retroviraene udviser biologiske og seroepidemiologiske egenskaber, som svarer til LAV (Levy et al., supra, Popovic et al., supra) . Således er mindst tre retrovira foreslået som det etiologiske 10 agens for AIDS: LAV, ARV og HTLV-III. Til nærværende formål betegnes disse vira kollektivt som AIDS-vira. Da HTLV-III er prototypeviruset for den gruppe, er det underforstået, at udtrykket "antigendeterminant svarende til sekvenserne af et HTLV-III-virusprotein" i virkeligheden betegner sekvenserne af et hvilket som helst af AIDS-15 virusproteinerne.

Én årsag til vanskeligheden ved at bestemme det virkelige ætiologiske agens for AIDS har været forskellige retrovirale antigeners krydsreaktivitet med serumprøver fra AIDS-patienter. Fx har serunprøver fra AIDS-patienter vist sig at reagere med antigener fra både HTLV-I 20 (Essex et al., Science, 220, 1983, s. 859) og HTLV-III (Sarngadharan et al., Science, 224, 1984, s. 506). HTLV-Kappegenprodukter har udvist antigeniciteter, som er krydsreaktive med antistoffer i sera fra voksne T-celleleukæmipatienter (Kiyokawa et al., Proc. Natl.

Acad. Sci., USA, 81, 1984, s. 6202). Voksne T-celleleukæmier (ATL) 25 adskiller sig fra akvisit immundefektsyndrom (AIDS) ved, at HTLV-I forårsager T-celleondartetheder, som er karakteriseret ved en kontrolleret vækst af T-celler. Ved AIDS forekommer der celledød i stedet for cellevækst. Faktisk var denne cytopatiske egenskab ved HTLV-III kritisk for den endelige bestemmelse af sygdommens speci-30 fikke retrovirale oprindelse.

Det ætiologiske agens for AIDS blev isoleret under anvendelse af udødeliggjorte humane neoplastiske T-cellelinjer (HT) inficeret med det cytopatiske retrovirus, der var karakteristisk for AIDS, og som var isoleret fra patienter, der led af AIDS. Seroepidemiologiske as-35 says under anvendelse af dette virus viste en fuldstændig korrelation DK 172274 B1 3 mellem AIDS og tilstedeværelsen af antistoffer mod HTLV-III-virusantigener (Montagnier et al., supra; Sarngadharan et al., supra;

Schupbach et al., Science, 224, 1984, s. 503). Desuden viste næsten 85% af patienter med lymfadenopatisyndrom og et signifikant antal 5 asymptomatiske homoseksuelle mænd i områder, hvor AIDS var endemisk, sig også at bære cirkulerende antistoffer mod HTLV-III. Alt i alt implicerer disse data HTLV-III som det væsentligste ætiologiske agens for AIDS.

Før AIDS-viruset med held var blevet dyrket under anvendelse af H-9-10 cellelinjen, var AIDS-virusets env-AIDS-protein ikke blevet isoleret, karakteriseret eller syntetiseret. Dette skyldtes hovedsagelig, at viruset er cytopatisk, og isolering af viruset var således ikke mulig (Popovic et al., supra). Da først en human T-cellelinje, som var modstandsdygtig over for virusets cytopatiske virkninger var blevet 15 opdaget, kunne den molekylære kloning af proviral AIDS-DNA imidlertid udføres.

Behovet for følsomme og hurtige metoder til diagnose af AIDS i menneskeblod og andre biologiske væsker og for en fremgangsmåde til forebyggelse af sygdommen ved vaccination er meget stort. Stort set 20 alle de for tiden tilgængelige assays og tests er behæftet med fejl. Faktisk har Center for Disease Control (CDC) angivet, at de for tiden tilgængelige tests udelukkende bør anvendes til screening af blodenheder for tilstedeværelsen af antistoffer mod HTLV-III. CDC er endog gået endnu videre ved at angive, at de for tiden tilgængelige 25 enzymbundne immunosorbentassay-(ELISA)-tests ikke bør anvendes til generel screening af højrisikopopulationer eller som diagnostisk test for AIDS (Federal Register, 50 (48), 12. marts 1985, s. 9909).

Fejlene ved de hidtil anvendte AIDS-tests er blevet tilskrevet det forhold, at man ikke har anvendt et specifikt antigenprotein fra det 30 ætiologiske agens for AIDS. De hidtil anvendte proteiner stammer fra et viruslysat. Da lysatet fremstilles ud fra menneskeceller inficeret med viruset, dvs. de celler, der anvendes til at dyrke viruset, ville lysatet indeholde menneskeproteiner tillige med virusproteiner. Fremstillingen af et rent antigen af viralt protein er således meget van-35 skelig. De hidtil anvendte antigener har således frembragt både DK 172274 B1 4 falske positive og falske negative resultater (Budiansky, Nature, 312, 1984, s. 583). De fejl, som er opstået som følge af anvendelsen af sådanne lysatproteiner/peptider, kan undgås ved at anvende en komposition til binding af AIDS-antistoffer, der er i det væsentlige 5 fri for de ikke-AIDS-specifikke proteiner. Kompositioner af i det væsentlige rent AIDS-kappe- og kerne-protein kan anvendes som antigener.

Både kappe- og kemeproteineme fra HTLV-III har bevarede antigendeterminanter, hvilket skulle muliggøre deres anvendelse til screen-10 ing for, diagnose af og/eller beskyttelse ved vaccination mod AIDS-viraene. Desuden kan personer, som er blevet udsat for HTLV-III, og som således risikerer at få AIDS eller som har sygdommen, identificeres ved hjælp af tilstedeværelsen af antistoffer mod det virale kerneprotein (gag) og/eller kappeproteinet (env) i deres blod (Sam-15 gadharan et al., Science, 224, 1984, s. 506).

Tilgængeligheden af en pålidelig test for tilstedeværelsen af selve AIDS-viruset eller partikler derfra i blod eller andre biologiske væsker er også vigtig. Groopman et al., (Blood, 66, 1985, s. 742) har beskrevet, at antistoffer mod AIDS-vira ikke altid findes i AIDS-of-20 renes blod. Groopman et al. har undersøgt én patient med AIDS og en anden med beslægtede lidelser (ARC), fra hvilke der kunne tages blodprøver, som var antistof-negative, men fra hvilke HTLV-III kunne dyrkes.

Rekombinant DNA-teknologi er for nylig blevet anvendt på AIDS-pro-25 blemet. Den molekylære kloning og udtrykkelse af env-genet fra HTLV-III er beskrevet (Crowl et al., Cell, 41, 1985, s. 979; Chang et al., Biotechnology, 3, 1985, s. 905). Dowbenko et al. (Rroc. Natl. Acad.

Sci., USA, 82, 1985, s. 7748) har udtrykt HTLV-III-kerneproteinet i E. coli.

30 Ved anvendelse af sådanne genetiske manipulationsteknikker er opren-sede virusantigener, som er sikre, pålidelige og mindre kostbare at fremstille, blevet tilgængelige. Det ville imidlertid være en endnu større fordel, hvis et viralt protein med antigendeterminanter, som findes på både env- og gag-proteinerne, var tilgængelige. Et sådant DK 172274 B1 5 protein ville være et exceptionelt kraftigt værktøj til detektion af AIDS-antistoffer, og det kunne tjene som grundlag for en række følsomme diagnostiske tests og en mulig vaccine mod AIDS-viruset.

Der er derfor tilvejebragt et hidtil ukendt protein med betegnelsen 5 gag/env, hvilket protein har en aminosyresekvens, som svarer til mindst én antigendeterminant fra et HTLV-III-gag-protein og fra et HTLV-III-env-protein, hvilket protein muliggør screening for, diagnose af og/eller beskyttelse ved vaccination mod AIDS-viruset. Det hidtil ukendte gag/env-protein kan udgøres af hele eller en del af 10 den i fig. 2 viste aminosyresekvens eller en funktionel ækvivalent deraf.

Opfindelsen angår endvidere de relevante DNA-sekvenser, der koder for gag/env-polypeptidet ifølge opfindelsen, rekombinante vektorer, der indeholder sådanne DNA-sekvenser, og encellede organismer, som er 15 nyttige til fremstilling af gag/env-protein ifølge opfindelsen ved rekombinant DNA-teknologi, samt fremgangsmåder til fremstilling af sådanne DNA-sekvenser, rekombinante vektorer og éncellede organismer. Desuden angår opfindelsen metoder til ekspression og isolering af gag/env-proteinet ifølge opfindelsen. Det således fremstillede 20 gag/env-protein kan ifølge opfindelsen anvendes til en række vigtige immunologiske processer.

Ved anvendelse som diagnostisk agens kan gag/env-proteinet anvendes til at detektere tilstedeværelsen af antistoffer mod AIDS-vira i menneskesera eller i andre biologiske væsker såsom tårer, sæd, 25 vaginalsekreter og spyt. Da proteinet kan fremstilles i homogen form, elimineres problemer med uspecifikke reaktioner, som har plaget anvendelsen af diagnostiske reagenser baseret på relativt rå HTLV-III -virusproteinisolater.

Anvendt som immunogen kan gag/env-proteinet anvendes til frembrin-30 gelse af antistoffer i dyr mod de antigene determinanter, som er indeholdt deri. Sådanne antistoffer kern sammen med gag/env-proteinet, der er hensigtsmæssigt mærket, anvendes i et radioimmunoassay (RIA) eller enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) til detektion af tilstedeværelsen af HTLV-III-vira eller partikler derfra i menneske DK 172274 B1 6 serum eller andre biologiske væsker såsom tårer, sæd, vaginalsekreter og spyt. Partikler (eller fragmenter) som kan detekteres ved disse metoder, omfatter selvfølgelig stykker af viruskerne- eller kappeproteinerne .

5 Ved inkorporering i et hensigtsmæssigt vaccinepræparat kan gag/env-proteinet ifølge opfindelsen endvidere anvendes til bekæmpelse af spredningen af AIDS ved profylaktisk immunisering.

Der er vigtige fordele ved anvendelse af gag/env-proteinet ifølge opfindelsen sammenlignet med anvendelse af gag- og env-proteinerae 10 hver for sig. Selve env-proteinet er meget uopløseligt, hvilket gør oprensning vanskelig. Kombination af de to proteiner fører til et produkt, som lettere solubiliseres og derfor lettere kan oprenses. Produktion og oprensning i stor målestok forenkles naturligvis også, da kun en enkelt forbindelse skal isoleres. Endelig muliggør gag/env-15 proteinet udviklingen af et diagnostisk kit, som virker bedre i et antigen-sandwichassay end gag- og env-proteinerae hver for sig.

Selv om gag/env-proteinet stammer fra HTLV-III, er det klart, at de her omhandlede diagnostiske og immunoprofylaktiske metoder også kan anvendes til detektion af et hvilket som helst af de andre virale 20 agentier, som er impliceret i eller forbundet med AIDS såsom lymf-adenopatiforbundet virus (LAV) og AIDS-forbundet retrovirus (ARV).

Dette skyldes, at Crowl et al. (Cell, 41, 1985, s. 979) har påvist, at proteiner fra disse virale agentier er immunologisk beslægtede med proteiner fra HTLV-III og har fælles aminosyresekvenssegmenter.

25 Opfindelsen forklares nærmere under henvisning til den nedenstående detaljerede beskrivelse og tegningen, hvor fig. 1 skematisk viser ekspressionsplasmider, som styrer syntesen af gag-proteiner (øverst) og gag/env-proteiner (nederst). Restriktions-endonucleasesteder, som afgrænser gag- og env-geneme er vist, og det 30 skraverede område betegner env-segmentet i gag/env-fusionsgenet. I begge plasmider kontrolleres transkription af λ-PL-promotoren, og translationsinitieringssignalerne stammer fra plasmidet pEV-vrf2; DK 172274 B1 7 fig. 2 viser gag/env-fusionsgenets nucleinsyresekvens (idet udvalgte positionsnumre og restriktionsendonucleasesteder er vist) og amino-syresekvensen af gag/env-proteinet, som er deduceret på grundlag heraf; og 5 fig. 3 viser resultaterne af SDS-polyacrylamidgelelektroforeseanalyse af det i E. coli dannede gag/env-protein. Billede 1 viser Coomassie-blåfarvede totale celleproteiner fra celler, som indeholder det rekombinante plasmid, der bærer gag/env-fusionsgenet, og fra kontrol -celler. Billede 2 og 3 er Western blots af totalt celleprotein probet 10 med enten kaninantistoffer mod env-peptid 500-511 (billede 2) eller fåreantistoffer mod gag p24 (billede 3). Immuncomplexerne i billede 2 og 3 blev visualiseret med et andet antistof mærket med peberrods-peroxidase. I alle tre billeder betegner g/e gag-env-proteinet, og c betegner en negativ kontrolprøve, som anvendes til at vise specifici-15 tet. Mobiliteterne af molekylvægtstandarder (i kD) er vist, og positionen af gag/env-proteinbåndet i gelerne er angivet med pile.

Fremgangsmåderne ifølge opfindelsen omfatter en række trin, der i logisk rækkefølge omfatter 1) identifikation og isolering af de gener, som indkoder gag- og env-proteinerne eller fragmenter deraf, 20 2) indsætning af disse gener eller genfragmenter i en egnet klonings- vektor til fremstilling af en rekombinant vektor, som indeholder et gag/env-fusionsgen, 3) overførsel af den rekombinante kloningsvektor til en kompatibel encellet værtsorganisme, 4) udvælgelse og vækst af korrekt modificerede værter, som kan replikere og udtrykke de ind-25 satte gensekvenser, 5) identifikation og oprensning af genproduktet, 6) anvendelse af genproduktet til detektion af antistoffer mod HTLV-III eller beslægtede vira eller som immunogen til frembringelse af antistoffer, der kam anvendes til at detektere selve viraene eller fragmenter deraf i menneskesera eller i andre biologiske væsker, og 30 7) anvendelse af gag/env-proteinet i et vaccinepræparat til mulig immunoprofylaktisk beskyttelse mod AIDS.

Isolerede HTLV-III-virioner kunne anvendes som kilde til både gag- og env-generne ifølge opfindelse. Fx har Dowbenko et al. (Proc. Natl.

Acad. Sci., USA, 82, 1985, s. 7748) anvendt et 2,2 kilobaser (kb) 35 langt fragment fra virusgenomets 5'-område som kilde til gag- genet.

DK 172274 B1 8

Alternativt kan genomisk DNA fra celler, i hvilke HTLV-III'b pro-virale genom er blevet integreret, være genkilden (Shaw et al.,

Science, 226, 1984, s. 1165). Crowl et al. (Cell, 41, 1985, s. 979) har anvendt genomisk DNA fra H9-celler inficeret med HTLV-III til 5 isolering af env-genet.

Alternativer til isolering af gag- og env-generne omfatter, men er ikke begrænsede til, kemisk syntese af gensekvenseme og fremstilling af DNA, der er komplementært med messenger RNA'et dannet ud fra generne.

10 Uanset kilden kan DNA, som indkoder gag- og env-proteinerne klones i bakterier, og kloner, der indeholder gag- eller env-generne kan identificeres ved velkendte metoder. Fx kan der til generne fremstilles komplementære DNA-(cDNA)-prober, som kan anvendes til at detektere kloner, der bærer generne, ved hybridiseringsteknikker.

15 I en foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse klones et genombibliotek, som er konstrueret ved Xbal-spaltning af de ovenfor beskrevne HTLV-III-inficerede H9-cellers DNA under anvendelse af en fag X-vektor, og kloner, som bærer det HTLV-III-provirale genom identificeres ved hybridisering med HTLV-III-cDNA. Én sådan klon fik 20 betegnelsen XHXB-3, og et 1700 basepar langt fragment, som indkoder det meste af gag-precursorproteinet, blev isoleret ved Clal/HincII-spaltning af DNA'et fra denne klon.

Den umiddelbare kilde til env-gensekvenser, som anvendes i den foretrukne udførelsesform for opfindelsen, var et derivat af plasmid- 25 et pEV3/env 44-640, i hvilket env-kodoner svarende til aminosyre- resterne 514-524 er slettet. Denne sletning medfører overraskende en signifikant forøgelse i ekspressionen af env-genet. env-Sekvenser, som indeholder kodonerne 467-640 fås ved Bglll/Hindlll-spaltning af plasmidet pEV3/env 44-640.

30 De identificerede og isolerede gag- og env-gener fra HTLV-III indsættes i en hensigtsmæssig ekspressionsvektor, som indeholder de nødvendige elementer for transkription og translation af de indsatte gensekvenser. Nyttige kloningsvektorer kan bestå af segmenter af DK 172274 B1 9 chromosomale, ikke-chromosomale og syntetiske DNA-sekvenser såsom forskellige kendte bakterielle plasmider, fag DNA, kombinationer af plasmider og fag DNA såsom plasmider, som er blevet modificeret til anvendelse af fag DNA- eller andre ekspressionskontrolsekvenser, 5 eller gærplasmider. Specifikke kloningsvektorer, som kan anvendes, omfatter, men er ikke begrænset til pEV-vrf-plasmideme (pEV-vrfl,- 2 og -3), SV40, adenovirus, gær, X-gt-WES-X-B, Charon 4A og 28, X-gt-l-X-B, M13-afledte vektorer såsom pUC8, 9, 18 og 19, pBR313, 322 og 325, pAC105, pVA51, pACY177, pKH47, pACYC184, pUBHO, pMB9, ColEl, 10 pSCIOl, pml21, RSF2124, pCRl eller RP4.

Indsætningen af gag- og env-geneme i en kloningsvektor udføres let, når både generne og den ønskede kloningsvektor er blevet spaltet med det eller de samme restriktionsenzymer, da der derved dannes komplementære DNA-terminaler. Hvis dette ikke kan lade sig gøre, kan det 15 være nødvendigt at modificere de spaltede ender, der dannes, ved nedbrydning af det enkeltstrengede DNA til dannelse af stumpe ender, eller man kan opnå det samme resultat ved at udfylde de enkeltstrengede terminaler med en hensigtsmæssig DNA-polymerase. Herved kan der udføres stumpende li gat i on med et enzym såsom T4 DNA-ligase. Al tema -20 tivt kan et hvilket som helst ønsket sted frembringes ved at ligere nucleotidsekvenser (linkere) til DNA-terminalerne. Sådanne linkere kan omfatte specifikke oligonucleotidsekvenser, som indkoder restriktionssted-genkendelsessekvenser. Den spaltede vektor og gag- og env-genfragmenterne kan også modificeres ved homopolymer haledannelse som 25 beskrevet af Morrow (Methods in Enzymology, 68, 1979, s. 3).

Når enten gag- eller env-genet eller et fragment deraf er blevet indsat i en egnet kloningsvektor, kan det andet gen eller genfragment indføres i vektoren ved skånsom restriktionsendonucleasespaltning til anbringelse af det andet gen eller genfragment ved siden af det 30 første, hvorved der dannes et fusionsgen. Hvis gag- og env-generne syntetiseres kemisk, kan fusionsgenet naturligvis fremstilles direkte og indføres som et enkelt DNA-fragment i kloningsvektoren.

I den foretrukne udførelsesform for opfindelsen blev Cla/HincII-spaltningsfragmentet, som indeholdt det ovenfor beskrevne gag-gen fra 35 XHXB-3, ligeret ind i plasmidet pEV-vrf2, som var spaltet med Clal og DK 172274 B1 10

PuvII, til dannelse af et rekombinant ekspressionsplasmid pEV2/gag 15-512 (fig. 1 øverst), som styrer syntesen af et 56 Kd stort protein, som omfatter gag-resterne 15-512. gag-Sekvenserne neden for et Bglll-sted nær rest 437 blev derefter erstattet med env-sekvenser 5 i et Bglll/Hindlll-fragment fra det ovenfor beskrevne derivat af plasmidet pEV3/env 44-640 (hvori resterne 514-524 er slettet), til dannelse af plasmidet pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 som bærer gag/env-fusionsgenet (fig. 1 nederst).

Denne konstruktion er detaljeret beskrevet nedenfor i eksemplet, især 10 afsnit B-E. Nucleinsyresekvensen af gag/env-genet i den foretrukne udførelsesform (bestemt ved den af Maxam et al., Methods in Enzymo-logy, 65, 1980, s. 499, beskrevne kemiske spaltningsmetode) og den herudfra deducerede aminosyresekvens af gag/env-proteinet er vist i fig. 2.

15 Mange af de kloningsvektorer, der kan anvendes ifølge opfindelsen, indeholder én eller flere markøraktiviteter, der kan anvendes til at selektere for ønskede transformanter, såsom ampicillin- og tetracyc-linresistens i pBR322, ampicillinresistens og j8-galactosidaseaktivi-tet i pUC8 og ampicillinresistens i pEV-vrf2. Selektion af værtscel-20 ler, hvori sådanne vektorer er blevet indsat, er stærkt forenklet, når værtscellerne i øvrigt mangler de aktiviteter, som vektorerne bidrager med.

Det er klart, at nucleotidsekvenserne af gag- og env-genfragmenterne indsat på et bestemt sted i en kloningsvektor kan omfatte nucleotid-25 er, som ikke er en del af de faktiske strukturgener. Alternativt indeholder genfragmenterne eventuelt kun en del de komplette gener.

Alt hvad der kræves er, at de genfragmenter, som indsættes i kloningsvektoren, er i stand til i en hensigtsmæssig værtsorganisme at styre produktionen af et polypeptid eller protein, som har mindst én 30 antigendeterminant svarende til sekvenserne af gag- og env-pro-teinerne.

Udvælgelsen af en hensigtsmæssig værtsorganisme påvirkes af en række kendte faktorer. Disse faktorer omfatter fx kompatibilitet med den valgte vektor, toxicitet med proteiner, som indkodes af det hybride DK 172274 B1 11 plasmid, den lethed, hvormed det ønskede protein isoleres, ekspressionsegenskaber, biosikkerhed og omkostninger. Der skal nås en ligevægt mellem disse faktorer og det er klart, at ikke alle værter er lige effektive til ekspression af et bestemt rekombinant DNA-mole-5 kyle.

Egnede encellede værtsorganismer, der kan anvendes ifølge opfindelsen, omfatter, men er ikke begrænset til, plante-, pattedyr- eller gærceller og bakterier såsom Escherichia coli, Bacillus subtilis,

Bacillus stearothermophilus og Actinomyces. Escherichia coli stamme 10 MC1061, der er beskrevet af Casadaban et al., (J\ Mol. Biol., 138, 1980, s. 179), kan anvendes, hvilket også gælder en hvilken som helst anden stamme af E. coli K-12, der indeholder plasmidet pRK248cIts. Plasmidet pRK24 8cIts til anvendelse i andre E. coli H12-stammer er frit tilgængelige fra American Type Culture Collection (ATCC) og har 15 deponeringsnummeret ATCC 33766. E. coli stamme MC1061 er også deponeret i ATCC (deponeringsnummer ATCC 53338) og er også frit tilgængelig på anmodning.

Overførsel af den rekombinante kloningsvektor til værtscellen kan udføres på mange måder. Afhængig af det bestemte udvalgte vektor/-20 værtscellesystem, kan en sådan overførsel udføres ved transformation, transduktion eller transfektion. Når der er fremstilles en sådan modificeret celle, kan cellen dyrkes og proteinekspressionsproduktet kan isoleres fra kulturen.

Som det dannes i E. coli, er gag/env-proteinet i det store og hele 25 begrænset til cytoplasmiske inklusionslegemer (uopløselige proteinaggregater) i bakterien, hvilket er et forhold, scan i høj grad letter oprensning af proteinet. Til isolering af gag/env-proteinproduktet ifølge opfindelsen, sprænges bakteriecellerne fortrinsvis eller lyseres, og det uopløselige protein isoleres ved centrifugering.

30 Betydelig oprensning kan derefter opnås ved sekventiel vask af bundfaldet med stigende koncentrationer urinstof efterfulgt af anvendelsen af standardproteinoprensningsteknikker.

Til små mængder materiale såsom prøver, der tages til polyacrylamid-gelelektroforeseanalyse, kan cellerne sprænges ved behandling med et DK 172274 B1 12 detergent såsom natriumdodecylsulfat (SDS). Større mængder af proteinet isoleres bedst ved sonikering eller ved andre metoder til mekanisk sprængning såsom ved hjælp af en fransk pressecelle.

Cellesprængning kan også udføres ad kemisk eller enzymatisk vej. Da 5 divalente kationer ofte kræves til cellemembranintegritet, kan behandling med hensigtsmæssige chelateringsmidler såsom EDTA eller EGTA vise sig at have tilstrækkelig stor sprængevne til at lette lækningen af proteinet fra cellerne. Tilsvarende er enzymer såsom lysozym blevet anvendt til at opnå det samme resultat. Dette enzym 10 hydrolyserer cellevæggens peptidoglycanskelet. Anvendelse af alternerende frysning og optøning sammen med lysozymbehandling kan også anvendes.

Når gag/env-proteinet er frigivet fra cellerne, kan det identificeres i blandingen ved en hvilken som helst af de inden for fagområdet 15 kendte metoder. Fx kan der udføres et radioimmunoassay eller et enzymbundet immunosorbentassay under anvendelse af antistoffer mod proteinet. Fortrinsvis identificeres proteinet ved SDS-polyacrylamid-gelelektroforese efterfulgt af Western-blot eller tilsvarende analyse.

20 gag/env-Proteinet ifølge opfindelsen kan koncentreres ved udfældning med salte såsom natrium- eller ammoniumsulfat, ved ultrafiltrering eller ved anvendelse af andre metoder, som er velkendte for fagfolk, yderligere oprensning kan opnås ved konventionelle proteinoprensningsteknikker, herunder, men ikke begrænset til gelfiltrering, 25 ionbytningschromatografi, præparativ pladegel- eller vertikal elektroforese, isoelektrisk fokusering, fraktionering ved lav temperatur i et organisk opløsningsmiddel eller modstrømsdistribution.

Da gag/env-proteinet indeholder antigendeterminanter fra to hoved-30 komponenter i HTLV-III-viruset, og da dette virus er det vigtigste ætiologiske agens for AIDS og er immunologisk beslægtet med de andre virale agentier, som er involveret i eller forbundet med AIDS eller ARC, er proteinet et kraftigt diagnostisk værktøj til detektion af DK 172274 B1 13 antistoffer mod AIDS-vira i humant serum. Fusionen kan anvendes til dette formål på adskillige velkendte måder.

Fx kan gag/env-proteinet mærkes på en hvilken som helst af en række måder, det mærkede protein kan sættes til en menneskeserumprøve, som 5 mistænkes for at indeholde antistoffer mod AIDS-viruser til dannelse af mærkede protein-antistof-fusionscomplexer, og de således dannede complexer kan detekteres på hensigtsmæssig måde. Til yderligere eksemplificering kan proteinet immobiliseres på et fast underlag og derefter bringes i kontakt med en menneskeserumprøve. Antistoffer mod 10 AIDS-virusprøven binder til et immobiliseret protein, og de således dannede complexer kan detekteres under anvendelse af et reagens såsom Staphylococcus aureus protein A (mærket med fx iod 125) eller et andet anti-humant IgG-antistof (fx mærket med en radioisotop eller med peberrods- eller lactoperoxidase) efter at ikke-complexerede 15 proteiner og antistoffer er blevet bortvasket. Mange variationer over dette tema vil være åbenlyse for fagfolk, og nogle af dem er beskrevet nedenfor.

Der kan udformes en række diagnostiske tests for tilstedeværelsen af AIDS-vira eller partikler derfra i menneskeserum eller andre biolo-20 giske væsker ud fra anvendelsen af antistoffer mod gag/env-proteinet. Sådanne antistoffer kan dannes ved injektion af et pattedyr eller en fugl med en tilstrækkelig mængde af et vaccinepræparat, som omfatter proteinet og en kompatibel farmaceutisk bærer, for at fremkalde dannelsen af antistoffer mod proteinet. Den relevante mængde af 25 proteinet, som vil være fornøden, vil være kendt for fagfolk eller kan bestemmes ved rutinemæssige forsøg. I nærværende sammenhæng betegner udtrykket "farmaceutisk bærer", enten standardkompositioner, som egner sig til human administration eller til typiske adjuvanser, som anvendes til dyrevaccinationer.

30 Egnede adjuvanser til vaccination af dyr omfatter, men er ikke begrænset til Freunds komplette eller ukomplette adjuvans (egner sig ikke til brug til mennesker eller husdyr) adjuvans 65 (indeholder jordnøddeolie, mannid-monooleat og aluminiummonostearat) og mineral-geler såsom aluminiumhydroxid, aluminiumphosphat og aluminiumsulfat; 35 overfladeaktive midler såsom hexadecylamin, octadecylamin, lysoleci- DK 172274 B1 14 thin, dimethyldioctadecylammoniumbromid, N^N-dioctadecyl-N'-N-bis(2-hydroxyethyl-propandiamin), methoxyhexadecylglycerol og pluroniske polyoler; polyanioner såsom pyran, dextransulfat, poly-IC, polyacrylsyre, carbopol; peptider såsom muramyldipeptid, dimethyl-5 glycin, tuftsin; og olieemulsioner. gag/env-Proteinet kan også administreres efter inkorporering i liposomer eller andre mikrobærere eller efter konjugation til polysaccharider, proteiner eller andre polymerer.

Den indledende vaccination efterfølges typisk nogle uger senere af én 10 eller flere "booster"-vaccinationer, hvis totale effekt er dannelsen af høje titre af antistoffer mod gag/env-proteinet, hvilke antistoffer kan høstes på den sædvanlige måde.

Der kan naturligvis ved hjælp af almindelig tilgængelig teknologi fremstilles monoklonale antistoffer mod proteinet til opnåelse af det 15 samme resultat. Somatiske celler, som er i stand til at danne antistoffer, såsom B-celler, kan fusioneres med nvyelomacellelinjer til dannelse af hybridomaceller. Disse celler kan dyrkes in vitro eller som ascitestumorer i ubegrænset tid til fremstilling af store mængder specifikke antistoffer. Da hybridomaceller let kan klones, er det 20 muligt hurtigt at fremstille store antal celler, der alle danner de samme specifikke antistofmolekyler rettet mod en fælles antigendeterminant . Denne exceptionelle ensartethed i antistofdannelsen kan være en fordel, når antistofferne skal anvendes i specifikke diagnostiske tests.

25 Lymfeknuder og milte fra dyr, som er primet ved injektion af et antigen, er hensigtsmæssige kilder til B-celler, selv om det ligeledes er muligt at fjerne disse celler fra usensiticerede dyr og prime dem in vitro efter isolering. Muse- og rotte-B-lymfocytter anvendes oftest til hybridomafremstilling, men celler fra kaniner, 30 mennesker, frøer og andre dyr kan anvendes i stedet.

Ud fra lymfocytiske tumorer er der udviklet talrige specialiserede myelomacellelinjer til anvendelse til hybridomafremstilling (Kdhler og Milstein, European J. Immunol., 6, 1976, s. 511; Shulman et al.,

Nature, 276, 1978, s. 269) . Af de mange sådanne cellelinjer, der er DK 172274 B1 15 fremstillet, er P3/X63-Ag 8, P3/NSI/l-Ag 4-1, Sp2/0-Agl4 og S194/5.XXO.BU.l ofte blevet anvendt.

Fusionen af de antistofdannende milt- eller lymfeknudeceller med myelomaceller til dannelse af hybridomaer udføres sædvanligvis med et 5 overskud af splenocytter eller lymfocytter i forhold til myelomaceller, hvilket overskud kan være så højt som 20:1, selv om der typisk anvendes mindre forhold. Fusionen lettes ved anvendelse af et fusionsfremmende middel såsom UV-inaktiverede Sendaivirus eller poly-ethylenglycol (PEG). Gefter et al. (Somatic Cell Genet., 3, 1977, s.

10 231) angiver, at en kombination af dimethylsulfoxid og PEG yderligere forøger cellefusion. Der findes også elektriske indretninger, som kan fusionere celler med en exceptionel høj grad af effektivitet.

Når fusionen er indtruffet, skal hybridomacellerne udvælges fra de ufusionerede forældrecellestammer. Denne selektionsproces kan let 15 udføres ved at dyrke cellerne i et medium, som støtter hybridoma-, men ikke forældrecellevækst. De somatiske B-celler, som anvendes i fusionen har begrænset levetid i kultur og går således tabt, efterhånden som de gennemgår sensecens og død, men forældremyelomaceller-ne, der har en ubestemmelig kulturlevetid, skal elimineres ved 20 specielle udvælgelsesteknikker.

I et almindeligt anvendt system anvendes myelomaceller, som mangler hypoxanthin-phosphoribosyltransferase (HPRT-). Disse celler mangler enzym-vejen til genudnyttelse af hypoxanthin som fri base og kan ikke overleve, hvis en inhibitor såsom aminopterin anvendes til at blokere 25 de novo purin-syntesevejene. Myelomacellerne kan således modselekteres ved dyrkning af fusionsblandingen i hypoxanthin/aminopterin/-thymidin (HAT) -medium, medens hybridomacelleme vil overleve som følge af de antistofdannende fusionsforældrecellers bidrag med HPRT.

Efter en periode med selektionsdyrkning kan de overlevende hybrido-30 maceller klones, der kan opdyrkes standardpopulationer ved standardcel ledyrkningsmetoder, og kloner, som danner ønskede specifikke immunoglobuliner, kan detekteres ved enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) eller ved andre tests baseret på anvendelsen af det antigen, mod hvilket antistofferne er rettet.

DK 172274 B1 16

De her omhandlede anti-gag/env-proteinantistoffer, kan yderligere anvendes til fremstilling af en række diagnostiske tests for AIDS-vira eller partikler derfra. Sådanne diagnostiske systemer kam have form af et radioimmunoassay enten i fri opløsning eller fast til-5 stamd. Alternativt kam der udføres enzymbundne immunosorbentassays tillige med assays baseret på immunoblotanalyse. Disse assays kan være direkte eller indirekte, med anvendelse af et amdet antistof rettet mod amti-gag/env-proteinantistoffer. Til antistofferne kam der kobles adskillige enzymaktiviteter, idet peroxidase, glucoseoxi-10 dase, /?-galactosidase og basisk phosphatase blot er nogle få eksempler herpå.

Det grundlæggende princip, som danner basis for mamge af disse tests er, at en prøve af menneskeserum eller en amden biologisk væske, som mistænkes for at indeholde AIDS-vira eller fragmenter deraf, reageres 15 med en kendt titer af antistoffer mod gag/env-proteinet til dannelse af antigen-antistofcomplexer. De således dannede complexer kan detekteres på hensigtsmæssig måde.

Det er også klart for fagfolk, at der er mamge andre måder, hvorpå anti-gag/env-protein-antiserum kam anvendes til diagnostiske formål 20 såsom i én af flere agglutinationstests. I sådanne agglutinations-assays kan interaktionen af antistoffer og AIDS-vira eller virusfragmenter detekteres under anvendelse af systemer, i hvilke partikler overtrækkes med anti-gag/env-protein-antistofferne. Sådanne partikler kan være latexkugler, liposomer, erythrocytter, polyacryl-25 amidkugler eller en hvilken som helst af en række egnede polymerer.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde til bestemmelse af AIDS-vira eller antistoffer mod AIDS-virus kan udføres i hensigtsmæssige testkits, som i en beholder omfatter gag/env-proteinet ifølge opfindelsen eller antistoffer mod AIDS-virus, som fremkaldes af gag/env-proteinet 30 ifølge opfindelsen.

Crowl et al. (Cell, 41, 1985, s. 979-986) har beskrevet, at serum fra 50 AIDS-patienter, hvilket serum er testet med genetisk manipuleret env-protein, var særdeles reaktivt med proteinet. Dette var DK 172274 B1 17 tilfældet på trods af det forhold, at halvdelen af disse patienter var fra USA's vestkyst og halvdelen fra østkysten. Det forhold, at alle de testede sera var reaktive med env-proteinet, viste, at de vira, som dannede de således reagerede antistoffer, må have haft 5 mindst én fælles eller bevaret antigendeterminant i deres kappeproteiner, selv om de var geografisk adskilte og uden tvivl genetisk noget forskellige.

gag-Kemeproteinet fra AIDS-retrovirus har vist sig at inducere antistofdanneIse i en stor procentdel af personer, som tidligere er 10 blevet udsat for viruset (Montagnier et al., supra; SchCipbach et al., supra; Sarngadharan et al., supra).

Alt i alt tyder de ovennævnte iagttagelser på, at gag/env-proteinet ifølge opfindelsen, som har mindst én antigendeterminant svarende til de sekvenser af gag- og env-proteinerne, som det består af, vil være 15 immunogent i mennesker og kan være nyttigt som en AIDS-vaccine.

Således kan gag/env-proteinet (enten fremstillet som beskrevet i nærværende beskrivelse eller syntetiseret kemisk) anvendes i et vaccinepræparat, som omfatter proteinet og en kompatibel farmaceutisk bærer. Proteinet kan anvendes i oprenset form i sådanne præparater, 20 eller det kan gøres mere immunogent ved hjælp af kendte modifikationer. Fx kan proteinet konverteres til en særdeles immonogen matrix ved reaktion med et tværbindingsmiddel såsom 1,3-dicyclohexylcarbo-diimid. Alternativt kan proteinet være covalent bundet til et særdeles immunogent proteinbæremolekyle, enten direkte eller via et 25 hensigtsmæssigt forbindelsesmolekyle. Anvendelige bæremolekyler omfatter fx limpet-hæmocyanin og forskellige bakterielle toxoider (inaktive toxiner) såsom difteritoxoid. Når gag/env-genet er konjugeret med et bakterielt toxoid, kan der fremstilles et divalent vaccinepræparat, som meddeler beskyttelse mod både AIDS og den 30 bakterie, hvorfra toxoidet stammer.

Administrationsveje, antigendoeis, og antallet af injektioner er alle faktorer, som er kendte inden for teknikken.

DK 172274 B1 18

EKSEMPEL

Følgende eksempel viser de metoder, ved hvilke en rekombinant vektor, som indkoder gag/env-proteinet fra HTLV-III-virus, kan fremstilles. I dette eksempel blev der udført følgende trin, som hver især er 5 beskrevet i detaljer nedenfor: 1) DNA-Sekvensen, som koder for resten af 15-512 (alle undtagen de første 14 aminoterminale rester) af gag-genet, blev skåret ud fra den rekombinante fagklon λΗΧΒ-3 og ligeret ind i E. coli-ekspressionsplasmidet pEV-vrf2 til 10 dannelse af plasmidet pEV2/gag 15-512; 2) DNA-sekvenser svarende til env-aminosyreresterne 319-331 blev slettet fra ekspressionsplasmidet pEV3/env 44-640 ved primer-styret mutagenese til dannelse af plasmidet pEV/env 44-640 Φ 319-331; 15 3) primer-styret mutagenese blev udført på plasmidet pEV/env 44-640 Φ 319-331 til dannelse af en sletning af nucleotid-er, som indkoder aminosyreresterne 514-524 og til dannelse af plasmidet pEV3/env 44-640 Φ 319-331 Δ 514-524; og 4) et restriktionsendonucleasefragment af env-genet fra 20 plasmidet pEV/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 som indkoder env-resterne 467-640 Δ 514-524, blev ligeret ind i det spaltede plasmid pEV2/gag 15-512, hvorved der dannes et fusionsgen, som indkoder gag-resterne 15-436 og env-resterne 467-640 Δ 514-524 i plasmidet pEV2/gag 15-436/env 25 467-640 Δ 514-524.

I hvert konstruktionstrin blev plasmider reproduceret ved transformation ind i E. coli stamme MC1061 (pRK248cIts).

A. Generelle metoder til fremstilling af rekombinante vektorer DNA-Præparation DK 172274 B1 19

Isolering af plasmid-DNA i lille målestok ud fra 1 ml mættede overnatskulturer blev udført i henhold til Bimboim et al. (Nucleic Acids Research, 7, 1979, s. 1513) . Denne procedure muliggør isolering af en lille mængde DNA fra en bakteriekoloni til analyseformål. Større 5 mængder plasmid-DNA blev præpareret under anvendelse af 1-liters kulturer ved at gå frem efter en standard-protokol med cæsiumchlo-ridcentrifugering.

Betingelser for enzymreaktioner

Restriktionsenzymerne og T4 DNA-ligasen, der blev anvendt, var alle 10 fremstillet af New England BioLabs, Beverly, Massachusetts, USA.

Metoderne og betingelserne for anvendelse af disse enzymer var som publiceret af fabrikanten.

For restriktionsendonucleasemes vedkommende defineres én aktivitetsenhed som den mængde enzym, der er nødvendig til at frembringe en 15 fuldstændig spaltning af 1,0 μg DNA på 60 minutter i et samlet reaktionsvolumen på 0,05 ml, hvor spaltningen er udført ved 37°C. Spaltningsblandingerne indeholdt ud over det DNA, der skulle spaltes, 100 μg/ml bovint serumalbumin og følgende bufferkomponenter:

Bglll: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2 og 10 mM

20 2-mercaptoethanol (2-ME)

Clal: 50 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,9) og 6 mM MgCl2

Hindi: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 7 mM MgCl2 og 1 mM

dithiothreitol (DTT)

HindiII: 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 10 mM MgCl2

25 Hpal: 6 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT

PstI: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 10 mM MgCl2

PvuII: 60 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2 og 6 mM 2-

ME

DK 172274 B1 20

Stul: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2 og 6 mM

2-ME.

T4 DNA-Ligation blev udført ved 16°C i en blanding, som indeholdt DNA'et og 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1,0 mM ATP 5 og 50 μg/ml bovint serumalbumin. Én enhed T4 DNA-ligaseaktivitet defineres som den mængde, der er nødvendig til at give 50%'s ligation af Hindlll-fragmenter af X-DNA på 30 minutter ved 16°C i 20 μΐ inkubationsblanding og en 5'-DNA-endekoncentration på 0,12 μΜ (300 μg/ml).

10 Oprensning af DNA-fragmenter i agarose

Efter restriktionsendonucleasespaltning blev DNA-fragmenter til kloning isoleret ved elektroforese i 1% agarose. Efter visualisering med 1 μg/ml ethidiumbromid blev skiver af gelen, som indeholdt de ønskede DNA-fragmenter, ekstruderet gennem en kanyle størrelse 21 ud i 4 ml 15 af en opløsning, som indeholdt 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA og 300 mM NaCl. Denne blanding blev derefter frosset i 3 timer ved -80°C, tøet op i 30 minutter ved 37°C og centrifugeret ved 10.000 x g i 30 minutter. Supernatantvæsken blev filtreret gennem et 0,45 μΜ Millex-filter, koncentreret til 0,25 ml ved hjælp af sek-butanol og 20 ethanol udfældede tre gange med 10 μg E. coli tRNA (transfer RNA) som bærer.

Dyrkningsmedier M9CA-Medium indeholdt 10 g Na2HP04, 3 g KH2P04, 0,5 g NaCl og 1 g NH4C1 pr. liter med 1 mM MgS04, 0,5% glucose og 0,5% casaminosyrer 25 indstillet til pH 7,4.

Luria-væske (LB) indeholdt 5 g bactogærekstrakt, 10 g bactotrypton og 10 g NaCl pr. liter, indstillet til pH 7,5.

Antibiotikaene tetracyclin og ampicillin blev, når dette er angivet, tilsat i slutkoncentrationer på henholdsvis 15 og 50 μg/ml.

DK 172274 B1 21

Transformation og isolering af rekombinanter

Transformation af E. coli stamme MC1061 (pRK248cIts) under anvendelse af en modifikation af den af Kushner (i Genetic Engineering, red.

Boyer et al., Elsevier/North-Holland, Amsterdam, 1978, s. 17) 5 beskrevne protokol, i det væsentlige som følger.

200 ml af bakteriecellerne blev dyrket ved 30°C i LB til en Ο°600 på mellem 0,5 og 1,0, hvorefter cellerne blev indsamlet ved centrifugering ved 6.000 x g i 5 minutter ved 4°C og resuspenderet i 50 ml af en opløsning, som indeholdt 10 mM morpholinopropan-sulfonsyre (MOPS; 10 pH 7,0) og 10 mM RbCl. Cellerne blev på ny indsamlet ved centrifugering og resuspenderet i 30 ml af en opløsning, som indeholdt 10 mM MOPS (pH 6,5), 50 mM CaCl2 og 10 mM RbCl. Efter inkubation ved 0°C i 30 minutter blev cellerne indsamlet, resuspenderet i 6 ml 10 mM MOPS (pH 6,5) indeholdende 50 mM CaCl2, 10 mM RbCl og 15% glycerol, sat 15 portionsvis til 40 Eppendorf-rør (300 μΐ/rør) og frosset ved -80°C.

Transformation blev udført ved optøning af en 100 μΐ alikvot af cellerne og inkubering i 30, 2 og 2 minutter ved henholdsvis 0, 37 og 0°C i nærværelse af en 10 μΐ prøveligationsblanding indeholdende ca.

100 ng DNA og tilsætning af 0,1-0,5 ml LB til røret. Røret blev 20 derefter inkuberet ved 22°C i 60 minutter, hvorefter 200 μΐ af cellesuspensionen blev bredt ud på en LB-plade, som indeholdt ampicillin, og inkuberet ved 30°C i 20 timer.

Cellevækst og induktion af genekspression

Kulturer af E. coli MC1061 indeholdende plasmidet pRK248Its og et 25 ekspressionsplasmid blev dyrket i M9CA-medium til midtlogaritmisk fase ved 30°C og derefter overført til 42°C for at inaktivere X P^-repressoren. Efter 2 timers inkubation ved 42°C blev celler fra 1 ml af den inducerede kultur indsamlet ved centrifugering og resuspenderet i TG-puffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) og 10% glycerol 30 som forberedelse til analyse.

SDS-Polyacrylamidgelelektroforese og Westem-blot-analyse DK 172274 B1 22

Inducerede celler resuspenderet i Tris-glycin (TG)-puffer blev blandet med et lige så stort volumen af 2 gange prøvepuffer (Laemmli,

Nature, 227, 1970, s. 680), inkuberet ved 95°C i 5 minutter og underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese i 12,5% geler som 5 beskrevet af Laemmli. Efter elektroforese blev proteiner fra gelen elektroblottet over på en 0,1 μπι nitrocellulosemembran i 6 timer ved 95 volt i 12,5 mM Tris og 96 mM glycin med 20% methanol og 0,01% SDS ved pH 7,5. Western-blot-analyse blev derefter udført som beskrevet af Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76, 1979, s. 4350) .

10 Primer-styret mutagenese

Primer-styret stedspecifik mutagenese blev udført som beskrevet af Morinaga et al. (Biotechnology, 2, 1984, s. 636). Syntetiske oligo-nucleotider, der blev anvendt til udførelse af mutageneseproceduren, blev fremstillet ved hjælp af phosphitmetodologi (Beaucage et al, 15 Tetrahedron Lett., 22, 1981, s. 1859; Matteucci et al., J. Am. Chem.

Soc., 103, 1981, s. 3185) under anvendelse af et automatiseret synteseapparat og oprenset ved polyacrylamidgelelektroforese som beskrevet af Maxam et al., (Methods in Enzymology, 65, 1980, s. 499).

Kolonihybridiseringer 20 Kolonihybridiseringer blev udført som beskrevet af Grunstein et al.

(Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 72, 1975, s. 3961). Det samme oligonuc-leotid, der blev anvendt til primer-styret stedspecifik mutagenese, blev anvendt som probe for hybridiseringerne efter 5'-endemærkning *5 <y med ^ P- (-ATP) under anvendelse af polynucleotidkinase som beskrevet 25 af Maniatis et al. (Cell, 15, 1978, s. 687).

B. Konstruktion af plasmidet pEV2/GAG 15-512

Som angivet ovenfor blev konstruktionen af et færdigt ekspressions-plasmid, der udtrykker gag/env-fusionsproteinet, indledt med konstruktion af et plasmid (pEV2/gag 15-512), som indeholdt nucleotider, 30 der indkoder alle andre end de første fjorten aminoterminale rester.

Nogle af de nucleotider, som indkoder de carboxyterminale gag-rester, DK 172274 B1 23 blev derefter erstattet med env-sekvenser til dannelse af det færdige fusionsprodukt.

Til fremstilling af plasmidet pEV2/gag 15-512 vandtes DNA-sekvensen, der indkoder resterne 15-512 i gag-proteinet, ud fra 50 μg af den 5 rekombinante X-fagklon XHXB-3, som indeholder det HTLV-IlI-provirale genom, ved spaltning med 50 enheder Clal og 50 enheder Hindi i 120 minutter ved 37°C til dannelse af et 1700 bp langt fragment. Dette DNA-fragment blev isoleret ved præparativ agarosegelelektroforese og resuspenderet i 0,1 x TE-puffer [1 mM Tris-HCl (pH 7,4) med 0,1 mM 10 EDTA] til en slutkoncentration af 0,03 pmol/μΐ.

Til modtagelse af gag DNA-fragmentet blev 2 ^g af E. coli-ekspres-sionsplasmidet pEV-vrf2 spaltet med 5 enheder Clal og 5 enheder PvuII i 60 minutter ved 37°C, og der blev ved elektroforese i en 1% agarosegel isoleret et 1700 langt fragment, som indeholder X-PL-pro-15 motoren, hvilket fragment efter ethanoludfældning blev resuspenderet til en slutkoncentration af 0,03 pmol/μΐ.

Det i denne konstruktion anvendte plasmid pEV-vrf2 er et derivat af det almindeligt tilgængelige plasmid pBR322 (ATCC 31344) . Konstruktionen af plasmidet pEV-vrf2 er beskrevet i detaljer af Crowl et al.

20 (Gene, 38, 1985, s. 31). Den rekombinante X-fagklon XHXB-3, som anvendes i denne konstruktion, er beskrevet af Shaw et al. (Science, 226, 1984, s. 1165). Denne klon blev opnået under anvendelse af standard-rekombinant DNA-teknikker ud fra den ovenfor beskrevne HTLV-III-inficerede H-9-cellelinje. En HTLV-III-inficeret human cellelinje 25 med betegnelsen H9/HTLV-IIIB, der egner sig til anvendelse ifølge opfindelsen, er deponeret i American Type Culture Collection under deponeringsnummeret CRL8543. Efter at Shaw et al. har publiceret HTLV-III-genomet, kan en DNA-probe let konstrueres under anvendelse af disse data, der kan anvendes til at isolere genomet fra H-9 eller 30 fra en hvilken som helst anden cellelinje, der er i stand til at propagere viruset.

Tre hundrededele (0,03) pmol af gag/Clal-Hindi-fragmentet blev blandet med 0,03 pmol af pEV-vrf2/ClaI-PvuII-fragmentet og ligeret med 200 enheder T4-DNA-ligase i 18 timer ved 15°C i et slutvolumen af DK 172274 B1 24 10 μΐ. Ligationsproduktet blev derefter transformeret til E. coli stamme MC1061 (pRK248cIts), og transformanter blev udvalgt ved vækst på LB-agarplader med ampicillin efter inkubation ved 30°C i 18 timer.

De rekombinante plasmid DNA'er blev analyseret for korrekt restrik-5 tionsfragmentstørrelse efter spaltning med Bglll, PstI eller Hindlll. Isolater, der var positive ved DNA-størrelsesanalyse, blev derefter bedømt for syntese af gag-precursorpolypeptidet ved SDS- polyacryl-éimidgelelektroforese og Western-blot-analyse.

Kulturer, som indeholder plasmidet pEV2/gag 15-512 blev induceret ved 10 40°C, og duplikatprøver af de inducerede celler blev præpareret til analyse ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Efter elektroforese blev gelen skåret i to stykker, og halvdelen af gelen blev farvet med Coomassie brilliant blue, medens den anden side af gelen blev underkastet elektroblotting og Western-blot-analyse under anvendelse af 15 anti-gag-antistoffer.

Analysen viste, at de inducerede celler dannede proteiner, som vandrede som to hovedbånd i gelerne med tilnærmede molekylvægte på ca.

56 og 53 Kd. Størrelsen af det komplette gag 15-512-protein er ca. 56 Kd. Begge hovedproteinerne reagerede med anti-gag-antistoffer. Et 2C antal mindre lavmolekylære proteiner, som var reaktive med antistofferne, blev også iagttaget.

C. Konstruktion af plasmidet pEV3/env 44-640 Δ 319-331

De env-sekvenser, der er til stede i slutplasmidet ifølge opfindelsen, blev oparbejdet i to trin (beskrevet i dette afsnit og afsnit D 25 nedenfor), som hver især indebar sletning af specifikke korte nucleotidsekvenser ved primer-styret stedspecifik mutagenese. Den første af disse sletninger (beskrevet i dette afsnit) var nødvendig til fremstilling af plasmidet pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 (afsnit D).

30 Ekspressionsplasmidet pEV3/env 44-640, hvis konstruktion ud fra \HXB-3 og pEV-vrf-plasmiderne er beskrevet af Crowl et al. (Cell, 41, 1985, s. 979), styrer syntesen af et 68 kd stort HTLV-III-env-specifikt protein i E. coli. DNA-sekvenser, der svarer til env-amino- DK 172274 B1 25 syreresterne 319-331, blev slettet ved primer-styret mutagenese under anvendelse af et 18-mert syntetisk oligonucleotid med sekvensen 5' GCA TTT GTT AAC ATT AGT 3'. Dette oligonucleotid blev udformet, således at det komplementerer env-sekvenser, hvorved nucleotider, der 5 indkoder resten 318, blev sammenføjet med nucleotider, der indkoder resten 332. Som følge af sammenføjningen af disse sekvenser, blev der indført et nyt unikt Hpal-sted i plasmid-DNA'et, medens 39 bp blev slettet. Stul og Hindlll-stederne i plasmidet pEV3/env 44-640 blev anvendt til dannelse af "hullet" til det heteroduplexe molekyle.

10 DNA fra isolerede kolonier, der var positive for hybridisering til det med 32P-mærkede syntetiske oligonucleotid under koloniscreening, blev transformeret til MC1061 (pRK248Its) og analyseret for tilstedeværelsen af det nye, unikke Hpal-sted.

D. Konstruktion af plasmidet pEV3/env 44-640 A 319-331 Δ 514-524 15 En anden deletion i de env-kodende sekvenser blev frembragt ved primer-styret mutagenese under anvendelse af et syntetisk oligonucleotid med sekvensen 5' AGA GCA GTG GCA GCA GGA 3'. Dette oligonucleotid anbragte sekvenser, der indkoder resten 513 i env- proteinet, ved siden af sekvenser, som indkoder resten 525, hvorved 20 sletningen af nucleotiderne, som indkoder resterne 514-524, blev lettet. Denne sletning blev frembragt i plasmidet under anvendelse af restriktionsstederne Hpal og Hindlll til frembringelse af et enkelt-strenget hul i env-området.

Efter gentransformation blev DMA fra positive isolater, som var iden-25 tificeret ved hjælp af den 32P-mærkede oligonucleotidprobe, analyseret for 33 bp-deletionen ved hjælp af restriktionsspaltning med Hpal og Hind III efterfulgt af elektroforese i IV agarose. Denne deletion blev også bekræftet ved DNA-sekventering i henhold til Maxam og Gilberts kemiske spaltningsmetode (Methods in Enzymology, 65, 30 1980, s. 499).

Som tidligere angivet forårsager Δ 514-524-sletningen en signifikant forøgelse i ekspressionen af env.

DK 172274 B1 26 E. Konstruktion af plasmidet pEV2/gag 15-436/env 467-640 Δ 514-524 2 μg pEV2/gag 15-512 blev dobbeltspaltet med enten 5 enheder Clal og 4 enheder Bglll til dannelse af et ca. 1300 bp langt fragment, som indkoder gag-resterne 15-436, eller med 10 enheder PstI og 5 enheder 5 Clal til dannelse af et ca. 1 kb langt fragment, som indeholder \-PL-promotoren. 3/10 μg pEV3/env 44-640 Δ 319-331 Δ 514-524 blev spaltet med 10 enheder PstI og 4 enheder Bglll til dannelse af et ca. 4 Kb langt fragment, som indkoder env-resterne 467-640 Δ 514-524. De forskellige således fremstillede DNA-fragmenter blev separeret i 1% 10 agarose og isoleret som beskrevet ovenfor.

3/100 pmol af hver af de isolerede DNA-fragmenter blev blandet og ligeret i 18 timer ved 15°C i nærværelse af 200 enheder T4 DNA-ligase . Produkterne af ligationsblandingen blev derefter transformeret til MC1061 (pRK248cIts), og transformanter blev udvalgt på LB-agar-15 plader indeholdende ampicillin. Plasmid DNA blev præpareret ud fra unikke kolonier og analyseret for den korrekte restriktionsfragmentstørrelse efter spaltning med PvuII.

11 af 12 isolater var positive ved DNA-analyse positive for de forventede 3505 og 2882 bp lange PvuII-fragmenter. 2 positive 20 isolater blev yderligere bedømt for syntese af gag/env-fusionspro-teinet. Disse kulturer blev induceret, og celleprøver blev udtaget til analyse ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese, elektroblotting og Western-blot, idet resultaterne er vist i fig. 3.

Felt 1 i fig. 3 viser Coomassie blue-farvede totale celleproteiner 25 fra celler, som indeholder det rekombinante plasmid, der bærer gag/env- fusionsgenet (g/e) og fra kontrolceller (c). Felt 2 og 3 viser resultaterne af duplikatprøver, der er underkastet Western blot-analyse under anvendelse af kanin-polyklonale antistoffer mod et syntetisk peptid svarende til env-resterne 500-511 (felt 2) eller 30 under anvendelse af fåre-polyklonale antistoffer mod gag-proteinet p24, der er kommercielt tilgængeligt (felt 3; se Dowbenko et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 1985, s. 7748 for en beskrivelse af p24-proteinet) . I fig. 3 blev immuncomplexeme i felt 2 og 3 visualiseret med et andet antistof mærket med peberrodsperoxidase, og DK 172274 B1 27 molekylvægtstandardernes mobilitet (i Kd) er vist. Positionen af gag/env-proteinbåndene i gelerne er vist med pile.

Der kan foretages mange modifikationer og variationer af den foreliggende opfindelse uden derved at afvige fra dens ånd og omfang, 5 hvilket vil være klart for fagfolk. Fx kan der foretages nucleinsy-resubstitutioner i det gen, som koder for gag/env-proteinet ifølge opfindelsen (under anvendelse af de her viste sekvensdata som reference) , og der ville kunne fremstilles et noget anderledes (men funktionelt ækvivalent) fusionsprotein ud fra dette. Et sådant ændret 10 produkt er stadigvæk omfattet af opfindelsen, i det omfang at det indeholder mindst én antigendeterminant svarende til sekvenserne af et gag- og env-protein fra et HTLV-III-virus. Tilsvarende kan selve proteinets aminosyresekvens manipuleres direkte med samme resultat.

Claims (19)

1. Protein, kendetegnet ved, at det har en aminosyresekvens, som svarer til mindst én antigendeterminant fra et HTLV-III-gag-protein 5 og mindst én antigendeterminant fra et HTLV-III-env-protein.

2. Protein ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det har aminosyresekvensen . Met Asn Arg Ile Arg Ile His Arg Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin Ile Leu Gly Gin Leu Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg Ile Glu Ile Lys Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gin Asn Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gin Gin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Ser Gin Val Ser Gin Asn Tyr Pro Ile Val Gin Asn Ile Gin Gly Gin Met Val His Gin Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu Gin Glu Gin Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gin Val Thr Asn Thr Ala Thr Ile Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gin Arg Lys Met Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly DK 172274 B1 29 Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gin Ala Asn Phe Leu Gly Lys Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val Val Gin Arg Glu Lys Arg Ala Val Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gin Ala Arg Gin Leu Leu Ser Gly Ile Val Gin Gin Gin Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gin Gin His Leu Leu Gin Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gin Leu Gin Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gin Gin Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Leu Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gin Ile Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Phe Asn Ala Val Val Tyr His Ser eller en del deraf med samme biologiske egenskaber.

3. Protein ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det er i det væsentlige ren form.

4. DNA-sekvens, 5 kendetegnet ved, at den koder for et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, og at den fx har hele eller en del af nucleinsyresekvensen ATGAATAGAA TTCGGATCCA TCGATGGGAA AAAATTCGGT TAAGGCCAGG GGGAAAGAAA AAATATAAAT TAAAACATAT AGTATGGGCA AGCAGGGAGC TAGAACGATT CGCAGTTAAT CCTGGCCTGT TAGAAACATC AGAAGGCTGT AGACAAATAC TGGGACAGCT ACAACCATCC CTTCAGACAG GATCAGAAGA ACTTAGATCA TTATATAATA CAGTAGCAAC CCTCTATTGT GTGCATCAAA GGATAGAGAT AAAAGACACC AAGGAAGCTT TAGACAAGAT AGAGGAAGAG CAAAACAAAA GTAAGAAAAA AGCACAGCAA GCAGCAGCTG ACACAGGACA CAGCAGTCAG GTCAGCCAAA ATTACCCTAT AGTGCAGAAC ATCCAGGGGG AAATGGTACA TCAGGCCATA TCACCTAGAA CTTTAAATGC ATGGGTAAAA GTAGTAGAAG AGAAGGCTTT CAGCCCAGAA GTAATACCCA TGTTTTCAGC DK 172274 B1 30 ATTATCAGAA GGAGCCACCC CACAAGATTT AAACACCATG CTAAACACAG TGGGGGGACA TCAAGCAGCC ATGCAAATGT TAAAAGAGAC CATCAATGAG GAAGCTGCAG AATGGGATAG AGTACATCCA GTGCATGCAG GGCCTATTGC ACCAGGCCAG ATGAGAGAAC CAAGGGGAAG TGACATAGCA GGAACTACTA GTACCCTTCA GGAACAAATA GGATGGATGA CAAATAATCC ACCTATCCCA GTAGGAGAAA TTTATAAAAG ATGGATAATC CTGGGATTAA ATAAAATAGT AAGAATGTAT AGCCCTACCA GCATTCTGGA CATAAGACAA GGACCAAAAG AACCTTTTAG AGACTATGTA GACCGGTTCT ATAAAACTCT AAGAGCCGAG CAAGCTTCAC AGGAGGTAAA AAATTGGATG ACAGAAACCT TGTTGGTCCA AAATGCGAAC CCAGATTGTA AGACTATTTT AAAAGCATTG GGACCAGCGG CTACACTAGA AGAAATGATG ACAGCATGTC AGGGAGTAGG AGGACCCGGC CATAAGGCAA GAGTTTTGGC TGAAGCAATG AGCCAAGTAA CAAATACAGC TACCATAATG ATGCAGAGAG GCAATTTTAG GAACCAAAGA AAGATGGTTA AGTGTTTCAA TTGTGGCAAA GAAGGGCACA CAGCCAGAAA TTGCAGGGCC CCTAGGAAAA AGGGCTGTTG GAAATGTGGA AAGGAAGGAC ACCAAATGAA AGATTGTACT GAGAGACAGG CTAATTTTTT AGGGAAGATC TTCAGACCTG GAGGAGGAGA TATGAGGGAC AATTGGAGAA GTGAATTATA TAAATATAAA GTAGTAAAAA TTGAACCATT AGGAGTAGCA CCCACCAAGG CAAAGAGAAG AGTGGTGCAG AGAGAAAAAA GAGCAGTGGC AGCAGGAAGC ACTATGGGCG CAGCGTCAAT GACGCTGACG GTACAGGCCA GACAATTATT GTCTGGTATA GTGCAGCAGC AGAACAATTT GCTGAGGGCT ATTGAGGCGC AACAGCATCT GTTGCAACTC ACAGTCTGGG GCATCAAGCA GCTCCAGGCA AGAATCCTGG CTGTGGAAAG ATACCTAAAG GATCAACAGC TCCTGGGGAT TTGGGGTTGC TCTGGAAAAC TACTTTGCAC CACTGCTGTG CCTTGGAATG CTAGTTGGAG TAATAAATCT CTGGAACAGA TTTGGAATCA CACGACGTGG ATGGAGTGGG ACAGAGAAAT TAACAATTAC ACAAGCTTTA ATGCGGTAGT TTATCACAGT TAA S. Rekombinant vektor, kendetegnet ved, at den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 4, og at den er i stand til at styre ekspressionen af DNA-sekvensen i en kompatibel encellet værtsorganisme, idet vektoren fx er 5 plasmidet pEV2/gagl5-436/env 467-640 Δ 514-524. DK 172274 B1 31

6. Encellet organisme, fx en prokaryot eller eukaryot celle, kendetegnet ved, at den indeholder en rekombinant vektor ifølge krav 5.

7. Encellet organisme ifølge krav 6, 5 kendetegnet ved, at den er en Escherichia coli-celle, fx en Escherichia coli MC 1061-celle.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at 10 a) en encellet organisme, fx en E. coli-celle, der indeholder en rekombinant vektor ifølge krav 5, fx plasmidet pEV2/gag-15-436/env 467-640 Δ 514-524, dyrkes under hensigtsmæssige vækstbetingelser, således af proteinet udtrykkes, og b) proteinet isoleres fra kulturen og oprenses om ønsket.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af en encellet organisme ifølge krav 6 eller 7, kendetegnet ved, at en rekombinant vektor ifølge krav 5, indsættes i en encellet organisme, fx ved transformation, trans-duktion eller transfektion.

10. Fremgangsmåde til detektion af tilstedeværelsen af antistoffer mod AIDS-vira i menneskeserum, kendetegnet ved, at a) et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 mærkes, b) det mærkede protein fra trin a) omsættes med en menneskeserum-25 prøve, og mærkede protein/antistofcomplexer lades danne sig i reaktionsblandingen, og c) de mærkede protein/antistofcomplexer fra trin b) bestemmes. DK 172274 B1 32

11. Fremgangsmåde til detektion af tilstedeværelsen af antistoffer mod AIDS-vira i menneskeserum, kendetegnet ved, at a) et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 immobili-5 seres på et fast underlag, b) en menneskeserumprøve bringes i kontakt med det immobiliserede protein fra trin a), og immobiliserede protein/antistofcomplexer lades danne sig, c) ubundet protein og antistoffer vaskes væk fra complexeme fra trin 10 b), og d) sådanne complexer bestemmes ved tilsætning af et reagens valgt blandt mærket Staphylococcus aureus protein A og et mærket anti-humant IgG-antistof.

12. Fremgangsmåde til detektion af tilstedeværelsen af AIDS-vira 15 eller fragmenter deraf i menneskeserum eller en anden biologisk væske, kendeteget ved, at a) en menneskeserum- eller anden biologisk væskeprøve omsættes med en kendt titer af antistoffer, som er dannet mod et protein ifølge et 20 hvilket som helst af kravene 1-3, b) antistoffer og prøven lades reagere til dannelse af antigen/anti-stofcomplexer i reaktionsblandingen, og c) antigen/antistofcomplexeme fra trin b) detekteres.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 14, 25 kendetegnet ved, at antistofferne er enzymmærkede, og at antigen/antistof complexeme, der dannes i reaktionsblandingen, detekteres ved enzymbundet immunosorbentassay, eller at en kendt mængde af et protein ifølge krav 1-3 mærket med en radioaktiv markør sættes til en serum- eller anden biologisk væskeprøve, og at de i reaktions DK 172274 B1 33 blandingen dannede antigen/antistofcomplexer detekteres ved radioimmunoassay.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine, kendetegnet ved, at et protein ifølge et hvilket som helst 5 af kravene 1-3 blandes med en fysiologisk acceptabel bærer.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer mod AIDS-vira, kendetegnet ved, at en tilstrækkelig mængde af et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 injiceres i et pattedyr eller en fugl til fremkaldelse af dannelsen af antistoffer mod dette 10 protein, og antistofferne isoleres fra dyrenes serum.

16. Vaccinepræparat, kendetegnet ved, at det omfatter et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 og en kompatibel farmaceutisk bærer.

17. Antistoffer, 15 kendetegnet ved, at de er dannet mod et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, idet antistofferne fx er mono-klonale antistoffer.

18. Anvendelse af et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3 til fremstilling af en beskyttende immuniserende vaccine, til 20 fremstilling af antistoffer mod AIDS-vira eller til detektion af tilstedeværelsen af antistoffer mod AIDS-vira i menneskeserum.

19. Testkit til bestemmelse af antistoffer mod AIDS-vira, kendetegnet ved, at det i en beholder omfatter et protein ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3.

20. Testkit til bestemmelse af AIDS-virus, kendetegnet ved, at det i en beholder omfatter antistoffer mod AIDS-virus fremkaldt af et protein ifølge et hvilket som helst af kravene l- 3.