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Das
technische Problem, welches der vorliegenden Erfindung zu Grunde
liegt, ist die Bereitstellung von DNA-Sequenzen, die modifizierte
retrovirale p55-gag Polypeptide kodieren, die für die Immunisierung von Säugetieren
gegen retrovirale Krankheiten verwendet werden können. Die Erfindung bezieht sich
insbesondere auf einen neu entwickelten rekombinanten HIV-Untereinheiten-Impfstoff,
der in entsprechenden Expressionssystemen, wie z.B. rekombinante
Bakulo- bzw. Vakziniaviren in Insekten- bzw. Säugerzellen, hergestellt wird.
Die Erfindung basiert auf dem HIV-1-gruppen-spezifischen Antigen p55-gag,
welches die virale Kernstruktur (core) ausbildet und im Falle der
Produktion aus eukaryontischen Zellen für die Ausbildung partikulärer Strukturen
verantwortlich ist. Die Immunogenität dieser unreifen 90–110 nm
großen
p55-core Partikel kann durch den Einbau gut charakterisierter Epitope
aus anderen HIV-1-, HIV-2- oder SIV-Leserahmen (z.B. env, nef, pol) in drei
unterschiedliche Bereiche der gag-kodierenden Sequenz erhöht werden,
wobei die Auswahl dieser Bereiche durch Computer-unterstützte Analysen
der p55-Sekundärstruktur
erfolgte. Um das universale Prinzip, das der stabilen Expression und
der erhöhten
Immunogenität
von rekombinanten p55/gp120-Partikeln zu Grunde liegt, aufzuzeigen, wurden
beispielhaft die gp120-CD4-bindende Region, eine Konsensussequenz
des gp120 hauptneutralisierenden Epitiopes V3 und eine Sequenz aus
gp41 (die „fusogene
Region") in die
kodierende Sequenz des p55-Trägerproteins
inseriert und die resultierenden Konstrukte durch rekombinante Vakzinia-
und Bakuloviren exprimiert. Rekombinante p55/gp120-Vakziniaviren
können
direkt als Lebendimpfstoff verabreicht werden oder direkt als Quelle für das Protein-Antigen
dienen. Rekombinante Bakuloviren können jedoch nur für die effiziente
Produktion und Reinigung der partikulären und chimären p55/gp120-Untereinheit-Impfstoffe
verwendet werden.
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Auf
Grund der Tatsache, daß HIV
in infizierten Zellen latent zu persistieren vermag, kommt der Eliminierung
von freiem Virus durch neutralisierende Antikörper und die Zerstörung infizierter
Zellen durch Antikörper
vermittelte Zellzytolyse („antibody
dependent cell cytolysis" – ADCC)
und zytotoxischer T-Zellen, eine entscheidende Bedeutung beim weiteren Verlauf
der Krankheit zu. Zur Verbesserung des Verständnisses vom Umgang des Immunsystem
mit freiem Virus oder HIV-infizierten Zellen, haben sich viele Arbeitsgruppen
auf die Identifizierung und Charakterisierung von B- und T-Zell
Epitopen, einschließlich aller
Leserahmen konzentriert. Die Rolle der humoralen Immunantwort ist
dabei entscheidend für
den Ausgang einer HIV-Infektion. Mit Ausnahme der finalen AIDS-Stadien
können
im gesamten Verlauf der Erkrankung Antikörper gegen nahezu alle HIV-Proteine
nachgewiesen werden (Vornhagen et al., 1989). Neutralisierende Epitope,
die gegen die äußeren Strukturproteine
gp120 (Goudsmit et al., 1988; Palker et al., 1988) und gp41 (Chan
et al., 1986) sowie gegen die inneren Strukturproteine p17 (Papsidero
et al., 1989) und p24 (Wolf et al. 19990) gerichtet sind, und eine
Rolle bei der Eliminierung von freiem Virus spielen könnten, sind
bereits beschrieben. Die Antikörper-vermittelte
Zellzytolyse (ADCC; Lyverly et al., 1987, 1988) könnte ebenfalls
wichtig für
die Eliminierung von HIV-infizierten
Zellen sein. Eines dieser ADCC-Epitope scheint am C-terminalen Teil
des gp120 lokalisiert zu sein. Gleichwohl können sich diese Antikörper jedoch
negativ auf den Verlauf der Krankheit auswirken (Fc und/oder Komplement
vermittelte Infektionsverstärkung
durch Antikörper;
Takeda et. al., 1989, Homsey et al., 1989, Robinson et al., 1989). Eine
Proliferation von T4 Zellen kann gruppen-spezifisch geschehen und
konnte durch die Verwendung synthetischer Peptide bestimmten Epitopen
aus den env-, gag- und pol-Leserahmen
zugeordnet werden (Schrier et al., 1989). Eine T-Zell Kartierung
durch rekombinante gp120-Vakziniaviren erlaubte zudem die Lokalisierung
von vier T-Helfer-Epitopen
in gp120 (Berzofsky et al., 1988, Krohn et al., 1988). Darüber hinaus
konnten drei p24-spezifische, CD4 positive T-Zellinien etabliert
werden. MHC Klasse I-restringierte CTL-Epitope wurden für env- (Takahashi
et al., 1988, Silciliano et al., 1988), gag- (Nixonet al., 1988) und
pol-Proteine (Walker et al., 1988, 1989) beschrieben. Die CTL -vermittelte
Zellyse ist von überragender
Wichtigkeit bei der Eliminierung von infizierten Zellen. Aus anderen
Virussystemen (Influenza-, Tollwut-, Cytomegalovirus) wußte man,
daß Nichtstrukturproteine
fähig sind,
eine Immunogenität durch
Induktion von zytotoxischen T-Zellen
aufzubauen, und daß dadurch
eine initiale Stimulierung des Immunsystems erreicht werden kann,
welche nach Belastung mit dem infektiösem Agens eine effektivere
Immunantwort, die sogar andere virale Proteine mit einschließt, zur
Folge hat (Milich et al., 1988).
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Eine
Verwendung von vollständigen
HI-Viren oder von intakten HIV-kodierenden Genen kann nach Immunisierung
adverse Effekte nicht ausschließen. Solche
negative Effekte sind unter anderem infektionsverstärkende Antikörper, Autoimmunreaktionen, die
Induktion von Toleranz oder allergene Nebenwirkungen.
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Trotz
anfänglich
vielversprechender in vitro-Ergebnisse scheint eine Immunisierung
mit kompletten gp160 oder Untereinheiten davon nicht ausreichend
zur Induktion einer schützenden
Immunität zu
sein. Die Fähigkeit
der induzierten Immunantwort zur Neutralisation war immer auf das
gleiche, für
die Immunisierung verwendete Isolat beschränkt (Typen-, nicht gruppen-spezifisch;
Nara et al., 1988). Zudem konnte gezeigt werden, daß sich nach
Belastung mit dein infektiösem
Virus, HIV immer noch in den gp160-immunisierten Tieren vermehren konnte (Hu
et al., 1987). Verschiedenste Gründe
können
aufgeführt
werden, um das Ausbleiben einer schützenden Immunität zu erklären:
- 1. Die entscheidenden Epitope von gp120 verändern sich
schneller als das Virus durch Antikörper eliminiert werden kann,
- 2. Die virale Streuung zu Beginn der Infektion geschieht durch
direkte Zell – Zell
Kontakte. Eine humorale Immunantwort ist nicht ausreichend und eine
zelluläre
Immunantwort gegen gp120 ist eventuell nicht ausreichend.
- 3. Infektionsverstärkende
Antikörper
könnten
den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen. Eine Komplement-abhängige sowie
Fc-vermittelte HIV Infektionsverstärkung ist in verschiedenen
in vitro-Studien beschrieben worden (Takeda et al., 1988, Homsey
et al., 1989, Golding et al., 1988, 1989).
- 4. Epitope, die normale zelluläre Genprodukte nachahmen, können eine
Immunantwort auslösen,
die gegen normale, Zellen gerichtet ist (Reiher et al., 1986, Golding
et al., 1988, 1989).
- 5. Die immunsuppressiven Effekte des HIV-Hüllproteins: freies gp120 bindet
hochaffin an das CD4-Rezeptor-Molekül von Zielzellen und markiert
sie somit in vitro für
ADCC-(Lyerly et
a., 1988) und CTL-Attacken (Siliciano et al., 1988, Lancavecchia
et al., 1988). Darüber
hinaus gibt es Befunde, die zeigen; daß die Bindung von gp120 an
das CD4-Molekül mit der
Region interferiert, die für
eine Interaktion mit MHC Klasse II-Molekülen notwendig ist (Weinhold
et al, 1989, Clayton et al., 1989). Ferner ist bekannt, daß bestimmte
Bereiche innerhalb von gp120, die Homologien zu Transmembranglykoproteinen
von humanen Typ C-Retroviren aufweisen und sich suppressiv auf die
Funktion von Makrophagen auswirken, ebenfalls im HIV gp41 vorhanden
sind (Claniciola et. al., 1988).
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Somit
besteht also das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung
zu Grunde liegt, in der Bereitstellung von DNA-Sequenzen, die für ein modifiziertes
retrovirales p55-gag-Polypeptid
kodieren, welches zur Immunisierung von Säugetieren gegen retrovirale
Krankheiten verwendet werden kann.
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Die
Lösung
des oben beschriebenen technischen Problems wird erreicht durch
die Bereitstellung der Ausführungsformen,
die in den Patentansprüchen
näher charakterisiert
werden, Demgemäß bezieht
sich die vorliegende Erfindung auf eine DNA-Sequenz, die wie in
den Patenansprüchen
näher beschrieben
für ein
modifiziertes retrovirales gag-Polypeptid kodiert, wobei das gag-Polypeptid mindestens
eine Aminosäuresequenz
enthält,
die eine nicht-gag-Polypeptid-antigene
Determinante darstellt, wobei die DNA-Sequenz abgeleitet ist vom Retrovirus
HIV-1,
wobei das gag-Polypeptid p55 ist, wobei die Aminosäuresequenz
(einen) Bereiche) des gag-Polypeptids ersetzt, der (die) die eingefügte Aminosäuresequenz
dem Immunsystem präsentieren
kann/können,
so daß eine
Immunantwort hervorgerufen wird und wobei der oben beschriebene
Bereich in den Aminosäurepositionen
99 bis 154, 211 bis 241 oder 436 bis 471 oder jeder Kombination
davon liegt.
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Eine
solche Immunantwort kann entweder humoral oder zellvermittelt sein.
Solche Immunantworten involvieren B-Zell- und/oder T-Zell-Kompartimente.
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Die
Bezeichnung „präsentieren" bezieht sich auf
die Fähigkeit
des Antigens auf Erkennung durch das Immunsystem durch Initiation
einer primären und/oder
wiedererkennenden Immunantwort.
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Die
Auswahl der Regionen, in welche die erwähnten Aminosäuresequenzen
substituiert werden, erfolgt durch nachfolgende Kriterien:
- (a) Hydrophilie
- (b) Flexibilität
und
- (c) Oberflächenwahrscheinlichkeit
der deletierten Region.
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Die
oben beschriebene Aminosäuresequenz ersetzt
gag-Polypeptid-Sequenzpositionen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die DNA-Sequenz, die für die zusätzliche Aminosäuresequenz
kodiert,
durch einen Linker eingefügt. In Übereinstimmung mit konventionellen
Methoden enthalten solche konventionelle Linker verschiedenste Restriktionsenzym-Schnittstellen
zur Inkorporation der DNA-Sequenz, welche für oben genannte Aminosäuresequenzen
kodiert.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die nicht-gag Polypeptid-antigene
Determinante
- (a) mindestens ein Teil der CD4-bindenden
Domäne
von gp120
- (b) mindestens ein Teil des variables Bereichs 3 von gp120;
oder
- (c) mindestens ein Teil des konservierten Bereichs von gp41
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Besonders
bevorzugte Teile der CD4-bindenden Domäne von gp120 leiten sich von
der V3-Region ab
und beinhalten Unterregionen sowie Derivate der bezeichneten V3-Region,
welche detailliert in der Europäischen
Patentanmeldung unter Inanspruchnahme der Priorität von
EP 9010 5313.2 beschrieben
ist.
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Die
oben erwähnten
Teile des Proteins sind ausgewählte
Regionen, die die Induktion einer Immunantwort gegen das natürlich vorkommenden
Virus ermöglicht.
Vorzugsweise sind diese in der Lage, Antikörper, welche mit dein natürlich vorkommenden
Virus reagieren, oder eine zell-vermittelte Immunantwort gegen besagtes
Virus zu induzieren.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung betrifft rekombinante Vektoren, die etwaige DNA-Sequenzen beinhalten,
auf die sich bislang hier bezogen wurde.
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Erwähnte rekombinante
Vektoren beinhalten konventionelle Plasmide, welche für die Klonierung oder
Expression der DNA-Sequenz in einer Wirtszelle verwendet werden
können.
Im Falle der Expressionsplasmide ist die DNA-Sequenz vorzugsweise
mit einer Promotorsequenz kombiniert, die ihre Expression in einer
geeigneten Wirtszelle kontrolliert.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung bezieht sich auf rekombinante Vektoren, die hier beschriebene
DNA-Sequenzen beinhalten. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um
rekombinante Viren, die vom Vacciniavirus abgeleitet wurden.
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Die
Erfindung bezieht sich auch auf Wirtsorganismen, welche durch die
rekombinanten Vektoren oder rekombinante Viren transformiert wurden.
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Darüber hinaus,
bezieht sich die vorliegende Erfindung auf modifizierte retrovirale
gag-Polypeptide,
welche von oben erwähnten
DNA-Sequenzen kodiert werden.
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Die
Erfindung bezieht sich zudem auf Aggregate, welche in Form von Partikeln
vorliegen.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Verfahren zur Produktion
modifizierter retroviraler gag-Polypeptide und wird durch die hier
beschriebenen Methoden charakterisiert, welches die Kultivierung
des Wirtsorganismus unter den oben genannten geeigneten Bedingungen, sowie
die Reinigung des Expressionsprodukts aus dem Kulturmedium einschließen.
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Eine
weitere spezielle Ausführungsform
der Erfindung ist die Produktion der beschriebenen gag-Partikel
in einem Bakulovirus-abhängigen
Expressionssystem in Spodoptera frugiperda-Insektenzellen, sowie unter Verwendung
stabil transfizierter Zelllinien, in Drosophila Schneider-Zellen.
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Letztendlich
bezieht sich die Erfindung auf Impfstoffe, die ein hier beschriebenes
rekombinantes Virus und/oder ein hier beschriebenes partikelausbildendes
Polypeptid beinhalten. In bevorzugten Ausführungsformen enthalten diese
Impfstoffe auch pharmakologisch akzeptable Träger und/oder Verdünnungsmittel.
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Ein
detailliertes Wissen um Antigenität und Variabilität von Strukturen,
die in die Absorption und Penetration des Virus involviert sind,
ist notwendig, um einen rekombinant entworfenen Impfstoff zu entwickeln,
der in der Lage ist eine schützende
Immunität
gegen eine HIV-Infektion aufzubauen. Alternativ gibt es nur wenige
Vorgehensweisen, die auf von HIV abgeleitete depletierte gp120 oder
teilweise depletierte Partikel oder gereinigtem gag-Protein basieren.
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Die
folgenden Überlegungen
bilden die Basis für
die vorliegende Erfindung:
- 1. Auf Grund der
bei HIV zu beobachtenden hohen Variabilität müssen große, immunologisch relevante
Bereiche der viralen Genprodukte Teil der Erfindung sein.
- 2. Epitope von denen bekannt ist, daß sie infektionsverstärkende Antikörper generieren,
oder Epitope, von denen bekannt ist, daß sie zelluläre Proteine
nachahmen, sollten ausgeschlossen sein.
- 3. Regionen, welche eine T-Zell-Immunität induzieren sowie Ziel von
ADCC sind, sollten als Bestandteil des Impfstoffs berücksichtigt
werden.
- 4. Das Impfstoffprodukt sollte als partikuläres Antigen hergestellt werden
und ohne die Verabreichung von zusätzlichen Adjuvantien als Immunogen
stabil wirken können.
- 5. Alternativ können
rekombinante Viren wie Vakzinia-, Herpes simplex oder Adenovirus
eingesetzt werden, um die genannten Komponenten direkt in den infizierten
Zellen zu exprimieren.
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Die
Möglichkeit
zur Produktion der unreifen p55-core Partikel in eukaryontischen
Expressionssystemen ermöglicht
es uns, einen Untereinheiten-Impfstoff zu entwerfen, der den oben
aufgeführten
Ansprüchen
gerecht wird. Autologe p55-core Partikel werden von unserer Gruppe
und von anderen im Vakzinia- und Bakulo-Expressionssystem hergestellt. Wie
schon von anderen Untereinheiten-Impfstoffen her bekannt (z.B. Hep.
B 22 nm Partikel), zeigen partikuläre Strukturen intrinsische
adjuvante Eigenschaften, welche in unserer Erfindung zur Anwendung
kommen.
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Die Produktion der rekombinanten
p55/gp 120 Hybridpartikel entsprechend der Erfindung
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Als
Konsequenz dieser Befunde verwendeten wir p55-core-Partikel als
autologen Träger
für geeignete
Epitope und zwar unabhängig
vom Kontext anderer Leserahmen:
- 1) p55-gag
wurde in einen kommerziellen pUC-Vektor einkloniert und im E. coli-Stamm JM109
exprimiert. Zur Klonierung des authentischen p55-Proteins ohne nichttranslatierte
Sequenzen wurde die PCR („Polymerase
Chain Reaktion" – Polymerase-Kettenreaktion)
angewendet. Die anschließende
Expression in eukaryontischen Systemen wurde mittels rekombinanter Vakzinia-
und Bakuloviren erreicht. Die Ausbildung von p55 Partikel wurde
durch Sacharosedichtegradienten-Zentrifugation und Elektronenmikroskopie
bestätigt.
- 2) Die Identifizierung geeigneter Positionen zur Insertion von
Epitopen aus anderen Leserahmen in das p55-core-Protein wurde mittels
Computer-unterstützter
Analyse der p55-Sekundärstruktur
erreicht (Wolf et al., 1988). Durch diese Vorgehensweise konnten
wir die Oberflächenexposition
von vier Regionen auf dein p55-core-Protein vorhersagen.
- 3) Zur Entwicklung der rekombinanten p55-core/gp120-env-Sequenzen
wurde ein Polylinker synthetisiert. Diese Linkersequenz enthält alle Restriktionsschnittstellen,
welche für
die Entwicklung und anschließende
Expression der drei distinkten p55-Deletionskonstrukte, denen jeweils der
kodierende Bereich für
30–45
Aminosäuren fehlt,
notwendig sind. Diese Kompatibilität aller Deletionskonstrukte
zur Insertion fremder Sequenzen ermöglichte die darauffolgende
Expression in eukaryontischen Vektorsysteme.
- 4) In einem ersten Anlauf wurden für die Insertion in die p55-Deletionskonstrukte
drei Epitope aus dein HIV-1 gp120-env-Leserahmen ausgesucht:
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Die CD4-bindende Region
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Die
Adsorption von freiem Virus und HIV-infizierten Zellen an CD4-Zielzellen
wird dirigiert durch die Bindung des viralen externen Membranproteins gp120
an das zelluläre
Membranprotein CD4. Das CD4-Rezeptormolekül wird hauptsächlich auf T4-Lymphozyten
und Zellen der Monozyten- und Makrophagen-Linie exprimiert. Eine
C-terminale Region des gp120 (AS 413–451), welche für die Interaktion mit
dein CD4 Rezeptor verantwortlich ist, liegt in verschiedensten HIV-Isolaten
hoch-konserviert vor (Kowalski et al., 1987, Lasky et al., 1987).
Obwohl diese CD4-bindende Region im Verlauf der Infektion beim Menschen
nicht immunogen zu sein scheint, konnte gezeigt werden, daß die Insertion
dieser Region in das VP1-Oberflächen-Strukturprotein
von Poliovirus neutralisierende Antikörper in infizierten Tieren
zu induzieren vermag. Zusätzlich
besitzen monoklonale Antikörper,
die gegen diese Sequenz gerichtet sind, neutralisierende Eigenschaften
und verhindern in vitro die Synzytienbildung durch Blockierung der CD4-abhängigen Anheftung
von freiem Virus oder HIV-infizierter Zellen an die Zielzelle (Sun
et al., 1989).
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Die GPGR-V3-Schleife von
gp120
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Die
hypervariable V3-Schleife des gp120 würde von unserer Gruppe als
die einzige hypervariable Region ohne Konsensussequenz für N-Glykosylierungen
beschrieben und hinsichtlich ihrer immunologischen Bedeutung diskutiert
(Modrow et al., 1987). Diese Region konnte als HIV-1 hauptneutralisierendes
Epitop identifiziert werden und würde einer 24 Aminosäuren (AS)
langen Sequenz (AS 302–326) zugeordnet.
Ein 6 AS langes Peptid ist ausreichend zur Induktion von neutralisierenden
Antikörpern.
Diese Sequenz beinhaltet ein 4 AS langes betq-Schleifen-GPGR-Motiv,
welches in verschiedensten Isolaten hochkonserviert vorliegt (Palker
et al., 1988, Goudsmit et al., 1988). Die flankierenden Aminosäuren scheinen
wichtig für
die Generierung von Antikörper
und der Fähigkeit
zur Typ-spezifischen Virusneutralisation zu sein. Eine 14-AS Sequenz
(315–329) konnte
als eine ADCC-Zielregion
identifiziert werden. Überdies
konnte im Mausmodell gezeigt werden, daß MHC Klasse I -restringierte
cytotoxische T-Zellen ein 18 AS-Peptid innerhalb der V3-Region erkennen können (Takahashi
et al., 1988). Wie die anti-V3 neutralisierenden Antikörper in
vitro die Infektion sowie die Synzytienbildung verhindern, ist jedoch
bislang noch unklar. Hinweise geben neuste Befunde, die zeigen,
daß gp120
unter bestimmten Reaktionsbedingungen möglicherweise in 2 Polypeptide
(50 KD, 70 KD) gespalten wird. Die Schnittstelle ließ sich direkt
der konservierten GPGRA-Sequenz innerhalb der V3-Schleife zuordnen. Die prozessierte
Form des gp120 kann zwar immer noch an das CD4-Molekül binden, wird aber nicht mehr
von anti-V3 neutralisierenden Antikörpern erkannt. Trypstatin,
ein neuer Proteaseinhibitor vom Kunitz-Typ, der eine hohe Sequenzhomologie
zur gp120-V3 Region aufweist, inhibiert die beschriebene Proteaseaktivität und unterbindet
die darauffolgende Synzytiumbildung. Diese V3-abhängigen,
Postbindungs- und Prozessierungsereignisse scheinen eine Voraussetzung
für die Membranfusion
der äußeren viralen
Membran bzw. HIV-1 infizierter Zellen mit den CD4-Zielzellen zu
sein (Hattori et al., 1989). Im Wesentlichen könnte dies den inhibitorischen
Effekt der anti-V3-neutralisierenden
Antikörper
erklären.
Kürzlich
bekannt gewordene Ergebnisse zeigen, daß die Deletion dieser Schleife in
einem infektiösen
Klon die Infektösität des Virus zerstört.
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Die konservierte gp41-Region
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Das
gp41-Molekül
vermittelt sowohl die Fusion von membrangebundenem HIV mit der CD4-Zielzelle,
als auch die Ausbildung von Synzytien von infizierten mit nicht-infizierten
Zellen (Kowalski et al., 1987, Mc Clure et al., 1988). Monoklonale
Antikörper gegen
das gp41 gruppen-spezifische Antigen neutralisieren in vitro eine
Reihe von verschiedenen HIV-1-lsolaten.
Die Insertion des gp41-neutralisierenden Epitops in das Poliovirus
VP1 und die Immunisierung von Versuchstieren resultierte in der
Induktion von anti-gp41-neutralisierenden
Antikörpern, welche
eine Synzytienbildung verhindern konnten (Evans et al., 1989).
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Die
CD4-bindende, sowie die fusogene Region in gp41 konnten mittels
PCR vervielfältigt
und in die p55-Deletionskonstrukte subkloniert werden. Die Konsensussequenz
des gp120-hauptneutralisierenden
Epitops V3 wurde chemisch synthetisiert und ebenso in die p55-Deletionsklone integriert.
Um die korrekte Expression der neu gestalteten p55/gp120-Fusionsproteine zu überprüfen, wurden die
rekombinanten Proteine in E. coli produziert und durch Western-Blot-Analyse
verifiziert. Nachdem die endgültigen
rekombinanten p55/gp120-Konstrukte in einen eukaryontischen Transfervektor
subkloniert waren, wurden diese Hybridgene im Vakzinia- und Bakulovirus-
Expressionssystem exprimiert. Die korrekte Expression wurde mittels
Western-Blot-Analyse und Immunfluoreszenz überprüft. Durch Elektronenmikroskopie
konnte die Partikelbildung eingehend studiert werden.
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Kurzbeschreibung
der Figuren
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1:
Schematische Darstellung der Klonierungsstrategie des E. coli-Expressionsklones pUC8p55
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2:
Expression von p55 (v-p55) alleine und p55 in Kombination mit der
HIV-Protease (v-p55prt) mittels rekombinanter Vakziniaviren. CV1-Zellen
wurden mit 10 pfu von p55-rekombinantem
Vacciniavirus infiziert. 36 Stunden nach Infektion (v-p55) sowie
nach unterschiedlichen Zeitintervallen wurden die Zellen geerntet
und in Probenpuffer aufgenommen. Die infizierten Zellen wurden wie
folgt einer konventionellen Western-Blot-Analyse unterzogen:
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Zellysate
wurden in einer 17,5% PAGE aufgetrennt und auf Nylonmembranen (Schleicher
und Schuell) transferiert. Die rekombinanten 55KD- und 41KD-Proteine
wurden durch monoklonale Antikörper
detektiert, welche spezifisch p24 (mAk 13/5) und p17 erkennen. Es
konnte zudem experimentell belegt werden, daß die HIV-1 Protease keinen
Einfluß auf die
Expression von p55 im Vakzinia-Expressionssystem hat. Durch die
Bindung des anti-p17-monoklonalen
Antikörpers
an das verkürzte
41 KD-Produkt konnte gezeigt werden, daß wenigstens Teile des verkürzten Produkts
identisch mit der N-terminalen Sequenz des kompletten 55KD-Proteins
sind.
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3:
Expression von p55 mittels rekombinanter Bakuloviren (b-p55). Spodoptera
frugiperda-Zellen wurden mit 10 PFU des beschriebenen Virus infiziert.
Bis zum 5. Tag nach der Infektion wurden die infizierten Zellen
täglich
geerntet. Zellen von Tag 1 bis 5 und Zellkulturüberstand von Tag 5 wurden in Auftragspuffer
aufgenommen und einer konventionellen Western-Blot-Analyse unterzogen.
Rekombinante Proteine wurden mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen
p24 spezifisch detektiert.
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4:
5 Tage nach Infektion wurden 2 ml Zellkulturüberstand einer Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation
(2,5 Stunden; TST 41.14; 28000 UPM) unterworfen und analysiert.
19 Fraktionen (600μl)
wurden gesammelt und jeweils 20 μl
davon einer konventionellen Western-Blot-Analyse unter Verwendung
monoklonaler p24 spezifischer Antikörper zur Detektion des rekombinanten
Proteins unterzogen. Die unreifen p55-Partikel akkumulierten, wie die
darauffolgende Negativkontrastierung zeigte, in Fraktion 17 bei
einer Saccharosedichte von 45%.
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5:
Mit 10 PFU b-p55 infizierte Spodoptera frugiperda-Zellen wurden
5 Tage nach Infektion in 2% Glutaraldehyd fixiert und auf Partikelbildung
hin an Ultradünnschnitten
im Elektronenmikroskop untersucht. Unreife 90–110 nm p55-Partikel wurden beim
Ausknospen aus der Zytoplasmamembran nachgewiesen.
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6:
Mit Hilfe von Computer-unterstützten Analysen
der p55 Sekundärstruktur
konnte die Oberflächenexposition
von 4 Regionen sowie darin befindlicher Epitope auf dem core-Protein vorhergesagt werden.
Diese Regionen wurden deletiert und durch kleine, für die einfache
Integration von Fremdepitopen ausgesuchte, Polylinker ersetzt.
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7:
Dargestellt sind. die in der PCR-Reaktion verwendeten synthetische
Startersequenzen. Kleine synthetische Linker-Fragmente wurden verwendet,
die die p55-Deletionskonstrukte untereinander kompatibel machen
sollten und zwar unter besonderer Berücksichtigung des Leserahmens
der inserierten Fremdepitope, sowie eines synthetisch hergestellten
HIV-1 gp120-Epitopes.
- a) synthetischer Polylinker
für die
Konstruktion des von pUC8 abgeleiteten plin8-Vektors.
- b) synthetische Startersequenzen, welche für die Vervielfältigung
des 3'-Teils des
p55-Deletionskonstruktes-4 verwendet wurden.
- c) synthetische Startersequenzen, welche für die Vervielfältigung
der HIV-1 abgeleiteten CD4-bindenden Region gp120 notwendig sind.
- d) synthetische Startersequenzen, welche für die Vervielfältigung
der HIV-1 abgeleiteten fusogenen Region gp41 verwendet wurden.
- e) Sequenz einer chemisch synthetisierten Konsensusregion des
HIV-1 hauptneutralisierenden Epitopes V3.
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8:
Klonierungsstrategie für
die Entwicklung des plin8p55 1-Konstruktes
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9:
Klonierungsstrategie für
die Entwicklung des plin8p55 2-Konstruktes
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10:
Klonierungsstrategie für
die Entwicklung des plin8p55 3-Konstruktes
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11:
Klonierungsstrategie für
die Entwicklung des plin8p55 4-Konstruktes
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12a: Expression von drei verschiedenen plin8p55-Deletionskonstrukten
(plin8p55 2, 3, 4) neben den entsprechenden Klonen mit der inserierten Konsensussequenz
des HIV-1-hauptneutralisierenden
Epitopes V3 (plin8p55V3-2,-3-4). Rekombinante Bakterien wurden bis
auf eine optische Dichte von 0,6 kultiviert, dann mit 2mM IPTG für 2 Stunden
induziert, mit Auftragspuffer lysiert und durch konventionelle Western-Blot-Analyse
charakterisiert. Die rekombinanten p55V3-Fusionsproteine wurden
spezifisch durch einen monoklonalen Antikörper gegen das p24 (a) sowie
durch ein humanes Serumgemisch (b) detektiert.
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12b: Expression von vier unterschiedlichen plin8p55-Deletionskonstrukten
(plin8p55 1, 2, 3, 4) neben den entsprechenden Klonen mit der inserierten
CD4-bindenden Region innerhalb von HIV-1 gp 120 C3 (plin8p55CD4-1,-2,-3-4).
Rekombinante Bakterien wurden bis auf eine optische Dichte von 0,6
kultiviert, dann mit 2mM IPTG für
2 Stunden induziert, mit Auftragspuffer lysiert und durch konventionelle
Western-Blot-Analyse charakterisiert. Die rekombinanten p55CD4-Fusionsproteine
wurden spezifisch durch einen monoklonalen Antikörper gegen das p24 detektiert.
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13:
Expression dreier verschiedener p55/V3-Fusionsproteine (p55/V3-2,3,4)
in E. coli, nach Induktion mit 2mM IPTG für 2 Stunden und bei einer O.D
von 0.6. Die rekombinanten p55V3-Fusionsproteine wurden spezifisch
durch einen monoklonalen Antikörper
gegen das p24 (a) sowie gegen das V3-Epitop (c) eines fremden Isolats
(IIIb) nachgewiesen. Ein polyklonales Serum gegen ein die V3-Konsensussequenz
repräsentierendes,
synthetisches Peptid erkannte das p55/V3 sogar besser als der von IIIb-Peptiden
abgeleitete Antikörper.
Die Tatsache, daß weder
der monoklonale Antikörper,
noch das polyklonale V3-spezifische Serum, das p55V3-2-Protein erkennen
konnte, legt nahe, daß der
antigene Kontext der V3-Region
wichtig für
die immunologische Detektion ist.
-
14:
CV-1 Zellen wurden mit 10 PFU v-p55V3-3 infziert, nach 2 Tagen geerntet
und mittels konventioneller Western-Blot-Analyse, unter Verwendung
monoklonaler Antikörper
gegen das p24, sowie der IIIb abgeleiteten V3-Region, charakterisiert.
-
Beispiele zur Veranschaulichung
der Erfindung
-
Beispiel 1: Expression von
p55 in E. coli (Standardverfahren: Sambook et al., 1989)
-
Vor
der Produktion von p55 in eukaryontischen Expressionsystemen war
es notwendig, das Gen in E. coli zu klonieren und zu exprimieren.
Für eine
vorläufige
Expression wurde das pUC-Vektorsystem verwendet. Um die 5'-Sequenz des vollständigen Proteins
exakt und ohne größere nicht-translatierte
Bereiche klonieren zu können,
inserierten wir ein synthetisches 62 bp-Oligonukleotid, welches
die 15 N-terminalen AS von p55 kodiert und im gleichen Leserahmen
wie das lacZ alpha-Fragment liegt, in die BamHI/HindIII-Schnittstellen des
pUC 8-Vektors. Zwei im 3'-Bereich
des Oligonukleotides gelegene Restriktionschnittstellen, ClaI und
SalI, ermöglichten uns
die Insertion eines 1694 bp p55-ClaI/HincII-Fragments
(1). Nach Induktion mit 2 mM IPTG konnte die Expression
des rekombinanten Proteins in E. coli mittels konventioneller Western-Blot-Analyse
unter Verwendung von anti-p24-Antikörpern gezeigt werden.
-
Beispiel 2: Expression von
p55 mittels rekombinanter Vakziniaviren
-
Das
BamHI/SalI-Fragment umfaßt
den vollständigen
p55-Leserahmen und konnte direkt in den pAvB-Transfervektor subkloniert
und in Vakziniaviren einrekombiniert werden. Die Expressionsprodukte wurden
mittels Western-Blot unter Verwendung von anti-p24-Antikörpern analysiert
(2).
-
Beispiel 3: Expression von
p55 mittels rekombinanter Bakuloviren
-
Um
das Protein mit Hilfe rekombinanter Bakuloviren exprimieren zu können, mußte es zweimal subkloniert
werden: Das BamHI/SalI-Fragment mußte zunächst in die BamHI/SalI-Schnittstellen des
pUC 19 inseriert werden. Dann wurde das für p55 kodierende SacI/SalI-Fragment weiter in,
die SacI/SalI-Schnittstellen eines kommerziellen pIC19R-Vektors
einkloniert. Nach dieser Prozedur konnte die p55-kodierende Region
in eine singuläre
Schnittstelle des Bakulotransfervektors pVL941 (Summers et al.,
1988) einkloniert werden. Nach einem Rekombinationsereignis wurde
das core-Protein mit Hilfe p55-rekombinanter Bakuloviren in Spodoptera
frugiperda-Insektenzellen exprimiert. Die Expression wurde mittels
Western-Blot nachgewiesen (3).
-
Beispiel 4: Identifizierung
der unreifen p55 Partikel
-
Die
Erzeugung der p55-Partikel wurde mittels Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation-Analyse und Elektronenmikroskopie
charakterisiert. Saccharosegradienten wurden bei 28000 UPM für 150 Minuten
in einem TST 41.14 Rotor zentrifugiert. 19 Fraktionen wurden durch
Negativ-Kontrastierung und Western-Blot-Analyse auf p55 Partikel untersucht.
Partikel akkumulierten in der Fraktion 17 bei einer Saccharosedichte
von 1,41 (4). Eine Analyse der Spodoptera
frugiperda-Zellen am Ultradünnschnitt
im Elektronenmikroskop zeigte unreife p55-Partikel, im Begriff aus
der Zytoplasmamembran in das Zellkulturmedium zu knospen (5).
-
Beispiel 5: Computeranalyse
der Sekundärstruktur von
p55
-
Um
in einem rationalen Ansatz ausgesuchte Epitope aus anderen Leserahmen
in das p55-Protein zu
inserieren, wurden verschiedenste p55-Deletionskonstrukte auf DNA-Ebene
etabliert, denen Fragmente von 120 bis 180 by Länge fehlen. Basierend auf einer
Computerunterstützten
Analyse der p55-Sekundärstruktur
entschieden wir uns dafür,
vier 30 bis 45 AS kodierende Sequenzen, entsprechend ihrer Exposition
auf der Oberflächen
des p55-Proteins,
zu deletieren. (6). Alle Deletionsmutanten wurden
vom Expressionsklon pUC8p55 abgeleitet.
-
Beispiel 6: Konstruktion
der p55-Deletionskonstrukte
-
sBasis
aller vier p55-Deletionskonstrukte war ein speziell entworfener,
den pUC8 ergänzender Polylinker.
Das neue Linkerfragment beinhaltet alle Rerstriktionsschnittstellen,
die für
die Konstruktion der vier verschiedenen p55-Deletionskonstrukte;
deren direkte Expression in E. coli, sowie deren direkte Subklonierung
in die finalen Transfervektoren für die eukaryontische Genexpression,
notwendig sind. Das resultierende pUC8-Derivat wurde plin8 genannt (7a)
-
Referenz 1: p55 Deletionskonstrukt-1
(plin8p55 1)
-
Die
Entwicklung des p55-Deletionskonstruktes-1 basierend auf dem pUC19p55-Klon
wurde bereits oben beschrieben. Zur Entfernung zweier AccI-Schnittstellen
wurde die p55-kodierende
Region um das 1100 bp 3' PstI-Fragment
verkürzt (pUC19p55BP).
Ein 26 bp-Linkerfragment,
welches zwei zusätzliche
Restriktionsschnittstellen beinhaltet, wurde in die N-terminalen
ClaI/AccI-Schnittstellen der p55-kodierenden Region eingefügt, um die
Kompatibilität
mit den anderen schon beschriebenen p55-Deletionsklonen zu wahren.
Anschließend
würde die
p55-kodierende Sequenz mit dein 3' PstI/SalI-Fragment vervollständigt (pUC19p551).
Das resultierende p55-Deletionsfragment-1 wurde in den plin8-Vektor
subkloniert (plin8p55 1) (8).
-
Beispiel 7: p55-Deletionskonstrukt-2
(plin8p55 2)
-
Das
vom pUC8 stammende 300 bp BamHI/HindIII-Fragment, welches für den N-terminalen. Teil
von p55 kodiert, würde
in die BamHI/HindIII-Schnittstellen von plin8 kloniert (plin8p55BH).
Anschließend
wurde das 1283 bp 3' NsiI/SalI-Fragment in
die PstI/SalI-Schnittstelle
des plin8p55BH inseriert (plin8p55 2) (9).
-
Beispiel 8: Entwicklung
des p55-Deletionskonstrukts-3 (plin8p55 3)
-
Ein
von pUC8p55 abgeleitetes BamHI/SalI-Fragment, welches für das komplette
HIV-1 p55-core-Protein kodiert, wurde in die BamHI/SalI-Schnittstellen
des beschriebenen plin8-Vektors subkloniert
(plin8p55). Um die Kompatibilität
des Konstrukts mit den anderen Deletionsklonen zu wahren, wurde
ein 27 bp XhoI/SacI-Linker-Fragment in die PstI/SpeI-Schnittstelle von
plin8p55 inseriert. Das resultierende p55-Deletionskonstrukt wurde
in plin8p55 3 umbenannt (10).
-
Beispiel 9: Entwicklung
des p55-Deletionskonstrukts-4 (plin8p55 4)
-
Die
komplette von pUC8p55 abgeleitete gag-kodierende Sequenz wurde in
die BamHI/SalI-Schnittstellen
des plin8 einkloniert (plin8p55). Der 3'-Teil der p55-kodierenden Sequenz (welcher
für AS 471–512 kodiert)
wurde mittels PCR, unter Verwendung eines 61 bp 5'-Starters, welcher fünf verschiedene Restriktionsschnittstellen
(BamHI, BglII, XhoI, EcoRI, SacI); und eines 21 bp 3'-Starters, welcher
die HincII-Restriktionsschnittstelle enthält, vervielfältigt (7d).
Das so vervielfältigte
BglII/SalI-Fragment würde
in die BglII/SalI-Schnittstelle
des plin8p55-Konstruktes inseriert (11). Im
finalen plin8p55 -Klon wurde eine 105 bp lange für 35 AS kodierende Sequenz
deletiert.
-
Beispiel 10: Kompatibilität der vier
p55-Deletionskonstrukte
-
Die
entwickelten p55-Deletionskonstrukte sind kompatibel im Hinblick
auf
- 1. die Insertion fremder Sequenzen. Eine
definierte Sequenz kann in jede der vier Kassetten inseriert werden,
ohne dabei den Leserahmen zu verändern.
- 2. die Möglichkeit
zur direkten Subklonierung der kompletten Konstrukte in Vektoren,
die eine eukaryontische Expression erlauben.
-
Beispiel 11: Expression
der p55-Deletionskonstrukte in E. coli
-
Alle
Deletionskonstrukte wurden in E. coli JM109 nach Induktion mit 2
mM IPTG exprimiert. Die Expressionsprodukte würden mittels konventioneller Western-Blot-Analyse
unter Verwendung anti p24-monoklonaler Antikörper bestätigt.
-
Beispiel 12: Insertion von
ausgesuchten Epitopen anderer Leserahmen
-
- 1. Die CD4-bindende Region des HIV-1 gp120 und
die fusogene Region in gp41 wurden mittels PCR vervielfältigt. 5' Starter enthielten
eine XhoI, 3'-Starter
enthielten eine SacI-Schnittstelle, um die Insertion der vervielfältigten
XhoI/SacI-Fragmente in das p55-Deletionskonstrukt zu ermöglichen
(7e).
- 2. Eine neu entworfene Konsensussequenz des gp120-hauptneutralisierenden
V3-Epitopes wurde
chemisch synthetisiert und in die XhoI/SacI-Schnittstelle des p55-Deletionskonstruktes
integriert (7f).
-
Beispiel 13: Expression
des kompletten p55/gp120-Fusionsproteines in E. coli
-
Die
unter Beispiel 15 beschriebenen p55/gp 120-Fusionsprodukte wurden
in E. coli nach Induktion mit 2 mM IPTG exprimert und mittels konventioneller
Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines anti-p24-monoklonalen
Antikörpers
und eines humanen Serengemisches analysiert (12A).
-
Beispiel 14: Verifizierung
der korrekten Expression eines inserierten Epitops
-
Die
Expression des inserierten gp120-hauptneutralisierenden V3-Epitopes
wurde unter Verwendung eines kommerziellen monoklonalen Antikörpers gegen
die V3-Region des HTLVIIIb-Isolats durch konventionelle Western-Blot-Analyse
bestätigt.
Ein polyklonales monospezifisches Serum, welches gegen das synthetische
V3-Konsensus-Peptid hergestellt wurde, erkannte ebenfalls die integrierten
Epitope in der Western-Blot-Analyse.
-
Beispiel 15: Subklonierung
der kompletten p55/gp120-Konstrukte in eukaryontische Expressionsvektoren
-
Die
p55/gp120-Konstrukte würden
(i) in die BglII/SalI-Schnittstellen des Vakzinia-Transfervektors pAvB,
(ii) in die singuläre
BamHI-Schnittstelle des Bakulo-Transfervektors pVL941 und (iii)
in die XbaI/SalI-Schnittstellen des pMD-Vektors für die Expression
der chimären
Proteine in CHO-Zellen einkloniert.
-
Beispiel 16: Expression
der kompletten p55/gp120-Konstrukte in eukaryontische Expressionsvektoren
-
Nach
Transfektion und Rekombination der Hybridgene in die virale DNA
(Vakzinia, Bakulo) wurden die Fusionsproteine von den rekombinanten
Vakziniaviren in CV-1- sowie von den rekombinanten Bakuloviren in
Spodoptera frugiperda-Zellen exprimiert. Die Expressionsprodukte
wurden mittels konventioneller Western-Blot- und Immunfluoreszenz-Analyse unter Verwendung
spezifischer anti-p24 monoklonaler Antikörper bestätigt (14).
-
Beispiel 17: Analyse der
Partikelbildung
-
Die
Ausbildung von Partikeln wurde durch elektronenmikroskopische Analyse
von Ultradünnschnitten
Glutaraldehyd-fixierter Zellen, welche mit p55 gp120-rekombinantem
Vakzinia- bzw. Bakulovirus infiziert waren, überprüft.
-
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