DK171896B1 - Autolog vaccine, anvendelse af celler til fremstilling af en autolog vaccine, metode til fremstilling af en autolog vaccine, fremgangsmåde til fremstilling af et hybridom og en celle, fremgangsmåde til fremstilling af humane monoklonale antistoffer og ved disse fremgangsmåder opnåede produkter. - Google Patents

Description

DK 171896 B1

Den foreliggende opfindelse angår en autolog vaccine, anvendelse af celler til fremstilling af en autolog vaccine, en metode til fremstilling af en autolog vaccine, fremgangsmåde til fremstilling af et hybridom og en cel-5 le, en fremgangsmåde til fremstilling af humane monoklo-nale antistoffer og ved disse fremgangsmåder opnåede produkter. Disse monoklonale antistoffer fremstillet med hy-bridoma eller transformerede B-cellelinier afledt fra B-celler fra cancerpatienter, der aktivt er immuniseret med 10 autologt tumorantigen, kan anvendes i såvel diagnostiske procedurer som terapi for humane cancere. Den foreliggende opfindelse angår således også diagnostiske procedurer og terapeutiske anvendelser under brug af disse monoklonale antistoffer.

15 Den foreliggende opfindelse angår specielt hidtil ukendte humane monoklonale antistoffer, som reagerer specifikt med antigener knyttet til særlige cancere og hybridoma og transformerede B-cellelinier til deres produktion afledt fra perifere B-celler fra blod af aktivt immuniserede pa-20 tienter. Den foreliggende opfindelse angår også metoder med almen anvendelighed mod alle massive cancere til fremstilling af hybridomer og monoklonale antistoffer samt diagnostiske procedurer og cancerterapi under anvendelse af disse monoklonale antistoffer.

25 Vaccine, anvendelse, metode, fremgangsmåder og disses produkter er som defineret i kravene 1, 5, 6, 15, 16, 18, 19, 20, 21 og 22.

For tiden tilgængelige behandlinger for cancer, især bestrålingsterapi og kemoterapi, er baseret på den logiske 30 begrundelse, at cancerceller er relativt mere følsomme over for disse behandlinger end normale celler. Svær toxicitet for normalt væv giver imidlertid store begrænsninger for disse terapier. Modsætningsvis udviser anti- DK 171896 B1 2 stofmolekyler fremragende specificitet for deres antigener. Man har derfor ved forskning forsøgt at isolere antistoffer specifikke for cancerceller som "long-sought magic bullet for cancer theraphy" (Science, 1982, 5 216:283).

Antistoffer er proteinmolekyler, der normalt syntetiseres af B-cellelymfocyterne, der produceres af knoglemarv og føres med blodet. For hvert antigen der transporteres ind i legemet, dvs. for et vilkårligt fremmed molekyle fra et 10 simpelt organisk kemikalie til et komplekst protein, produceres antistoffer, som genkender og angriber den særlige kemiske struktur. Den enestående kemiske struktur på antigenet, hvortil et særligt antistof kan binde, betegnes som en antigen determinant eller epitop. B-cellelym-15 focyter i legemet, der benævnes B-celler, lymfocyter eller leucocyter, eksisterer som hundreder af millioner forskellige genetisk programmerede celler, der hver producerer et antistof specifikt for en forskellig determinant. Et antigen, som stimulerer antistofproduktion, kan 20 have flere determinanter på sin overflade. Ved møde med et antigen vil en B-celle, der på sin overflade bærer et antistof specifikt for en determinant på dette antigen, replikere. Denne klonale ekspansion resulterer i mange datterceller, som udskiller antistoffet i blodstrømmen.

25 På grund af antistoffernes specificitet til at genkende og binde til antigener er det ønsket at fremstille antistoffer i store mængder, som er specifikke for en enkelt determinant, og som således kun binder til antigener eller væv, der har den specielle determinant.

30 B-celler gror ikke i en kontinuerlig kultur, med mindre de er blevet ændret ved hybridisering med en "udødelig" celle eller transformeret med enten viral eller tumor DNA. Kohier og Milstein (Nature, 1975 256:495) viste, at DK 171896 B1 3 hybride celler kunne fremstilles ved somatisk cellefusion mellem lymfocyter og myelomaceller, som gror i kultur og producerer et antistof, der er specifikt for en enkelt determinant. Disse hybrider betegnes "hybridomaceller".

5 Hybridomaceller fremstilles ved at sammensmelte lymfocyter, som er blevet aktiveret til at producere et særligt antistof, med myelomaceller. Når hybridomer dyrkes, producerer de antistoffer, der er specifikke for en enkelt determinant på et særligt antigen. Sådanne antistoffer 10 betegnes "monoklonale antistoffer".

Monoklonale antistoffer kan også produceres af B-lymfo-cytcellelinier, der er blevet spontant transformeret, enten før eller efter anbringelse i kultur. Disse celler har til forskel fra hybridomaceller et normalt diploid 15 antal (46) kromosomer. Den foreliggende opfindelse tillader isolering af både hybridomer og transformerede B-cel-lelinier, der producerer monoklonale antistoffer. For enkeltheds skyld vil begge celletyper blive betegnet som monoklonale antistofproducerende celler i det følgende.

20 Monoklonale antistoffer syntetiseres på ren form af et monoklonalt antistof, der producerer cellekulturer, der er uforurenede med andre immunoglobuliner. Med en sådan cellekultur er det muligt at producere praktisk talt ubegrænsede mængder af et antistof, der er specifikt for en 25 determinant på et særligt antigen.

Man har ment, at hvis antistoffer specifikke for særlige cancerceller var tilgængelige, kunne de anvendes i forskellige metoder til behandling og diagnose. Sådanne antistoffer kunne inaktivere eller dræbe særlige tumor-30 celler blot ved at knytte sig til cellen ved determinanten, for hvilken de er specifikke. Alternativt kan disse antistoffer binde til overfladen af effektorlymfocyter DK 171896 B1 4 eller macrophager, idet de konverteres til tumorantigen-specifikke killerceller.

Monoklonale antistoffer kan også forøge specificiteten af kemoterapeutiske lægemidler, toxiner og radioaktive iso-5 toper, hvorved man således forøger deres effektivitet og samtidig nedsætter deres toxicitet. Et monoklonalt antistof kan være konjugeret med et toxin, et radionuclid eller et kemoterapeutisk lægemiddel; dette konjugerede antistof kan ganske enkelt betragtes som et styret missil 10 med antistoffer som styresystemet og lægemidler som sprænghoved. Desuden kan antistoffer konjugeret med radi-onuclider eller metalliske sporstoffer anvendes til protonemission (PET) og kernemagnetisk resonans (NMR) afbildning for in vivo diagnose og lokalisering af metasta-15 ser. Antistofferne kan også anvendes til detektering af tilstedeværelsen af tumorantigener i blod, som en diagnostisk og/eller prognostisk test for cancer. Monoklonale antistoffer kan endvidere anvendes til at isolere tumorantigenerne til potentiel anvendelse i en standardiseret 20 vaccine.

Eksistensen af antigener forbundet med dyretumorer blev dokumenteret i forrige århundrede, og den antigene karakter af humane cancere er blevet veletableret, primært gennem nylige studier med monoklonale antistoffer. Indtil 25 den forskning, der var knyttet til den foreliggende opfindelse, er imidlertid kun få cancerantigener faktisk blevet karakteriseret molekylært, og kun én gruppe antigene determinanter er blevet forbundet med humane cancere, immunoglobulin idiotyper af B-celletumorer, er blevet 30 beskrevet som værende enestående tumorspecifikke, dvs. forekommende med en høj frekvens på tumorceller og ikke forekommende i nogen væsentlig grad på normalt væv (Oldham og Smalley, Biol. Response Modifiers, bind 1, 1982) .

DK 171896 B1 5

Tidligere forsøg på at aflede monoklonale antistoffer specifikke for humane cancere er gået to veje med hensyn til B-celler: 1) B-celler er blevet ekstraheret fra milte fra mus, der var immuniseret mod humane tumorer, US-5 patentskrift nr. 4 172 124; og 2) humane B-celler er blevet ekstraheret fra enten perifert blod eller fra lym-feknudedrænende tumorer i cancerpatienter. Ingen af tilnærmelserne har givet tilfredsstillende resultater.

Mus immuniseret mod humane tumorer har for bred en reak-10 tivitet. Det vil sige, de fleste musemonoklonale antistoffer, der er dannet, reagerer med humane antigener til stede på normalt væv såvel som på tumorvæv. Et antistof, der kun reagerer med tumorceller, er meget vanskeligt at udvælge fra det store antal forskellige antistoffer, der 15 produceres. For eksempel blev 20.000 hybridomer afledt fra mus immuniseret med human småcellet lungecarcinoma screenet for reaktivitet med tumorceller (Science, 1982, 216:283). I modsætning til en meget lav hyppighed (mindre end 0,4%) iagttaget ved ovennævnte forsøg resulterer den 20 foreliggende opfindelse i op til 16% af hybridomerne afledt fra immuniserede colonpatienter producerende monoklonale antistoffer, der reagerer specifikt med tumorceller. Desuden har monoklonale antistoffer afledt fra muse-B-celler begrænset potentiale for anvendelse i can-25 certerapi. Efter gentagen administrering har de en tendens til at stimulere det humane immunsystem til fremstilling af "anti-muse"-antistoffer, som i kliniske forsøg har vist sig at neutralisere aktiviteten af de musemonoklonale antistoffer. Anvendelsen af de af ansøgeren 30 her tilvejebragte humane monoklonale antistoffer kan overvinde disse vanskeligheder.

En anden synlig forskel mellem humane og musemonoklonale antistoffer er deres mærkningsmønstre. Tidligere studier med museantistoffer har vist, at der ofte er heterogen DK 171896 Bl 6 mærkning af celler i tumorsektioner. Dette reaktivitetsmønster er af nogle forfattere blevet tilskrevet antigen heterogenitet af tumorceller (Hand et al., Cancer Research, 43:728-735, 1983). I modsætning hertil var de hu-5 mane monoklonale antistoffer udviklet efter ansøgernes strategi homogene i henseende til deres reaktivitet mod tumorer, med hvilke de reagerer. En plausibel forklaring på den heterogene farvning af musemonoklonale antistoffer er, at det er en refleksion af den murine immungenkendel-10 se af fase- eller cellecyclusspecifikke differentieringsantigener i rigelig mængde på tumorcellerne frem for formodede tumorassocierede antigener. Det er ikke urimeligt at forvente, at når man immuniserer mus med humane tumorceller, ville der være væsentlig antigen konkurrence re-15 suiterende i mere rigelige og mere overvejende vævstype og differentieringsantigener, der heldigt konkurrerede med forholdsvis mindre tumorassocierede antigener som immunrespons fra værten. Således kan autolog immunisering af mennesket resultere i frembringelsen af antistoffer 20 mod gruppen af antigener, der normalt er ringe immunogene i mus. Denne sandsynlighed antyder, at mennesker og mus kan reagere mod forskellige tumorantigener. I overensstemmelse med denne hypotese har det vist sig, at ingen af de 36 humane monoklonale antistoffer, som ansøgerne 25 fremstillede, syntes at reagere med carcinomaembryonisk antigen (CEA), et antigen, der ofte genkendes af murine monoklonale antistoffer fremstillet mod humane tumorceller .

Størstedelen af tidligere forsøg på at udvikle humane mo-30 noklonale antistoffer har gjort brug af B-celler ekstraheret fra enten perifert blod eller lymfeknuder fra patienter med tumorer. Det mentes, at tilstedeværelsen af den antigene tumor ville forårsage, at et tumorbærende individ ville få et forøget immunrespons mod sin tumor og 35 producere specifikke immune B-celler. Således blev B- • DK 171896 B1 7 celler taget fra lymfeknuder drænende tumorer i cancerpatienter eller fra cirkulerende lymfocyter fundet i perifert blod. Før den foreliggende opfindelse har der imidlertid været begrænset held med at danne tumorspecifikke 5 monoklonale antistoffer.

Hovedproblemet ved dannelse af monoklonale antistoffer specifikke for humane tumorantigener har været den manglende evne til at finde en kilde for specifikt immune B-celler (Science, 1982, 216:285). I mennesker har de ini-10 tiale foci for cancerceller en tendens til at gro over lange tidsrum, fra cirka 1% til cirka 10% af livslængden, før der er nogen håndgribelig klinisk sandsynlighed for sygdommen. På dette tidspunkt er patienter immunologisk hyporesponsive over for deres tumorer eller eventuelt im-15 munologisk tolerante. Før den foreliggende opfindelse kunne humane monoklonale antistoffer, der er reaktive med tumorceller, ikke opnås reproducerbart. Endvidere reagerede meget få af det lille antal humane monoklonale antistoffer, der blev opnået fra cancerpatienter, med deter-20 minanter fundet på overfladen af tumorceller, men snarere med intracellulære determinanter (R.J. Cote et al., PNAS, 1983, 80:2026). Den foreliggende opfindelse tillader udviklingen af monoklonale antistoffer, der er reaktive med overfladeantigener, hvilket er nødvendigt for tumoraf-25 bildning og -terapi.

Det tilsigtes med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe monoklonale antistoffer, der er reaktive med tumorspecifikke antigener, der inducerer et immunrespons i patienter med særlige cancere. En værdifuld in vivo prøve 30 for immunogenitet af tumorspecifikke antigener i tumorimmuniserede patienter er forsinket cutan hypersensitivi-tet. Sådanne antistoffer giver et middel til detektering og diagnosticering af tumorer. Det tilsigtedes også med opfindelsen at opnå monoklonale antistoffer, som kunne DK 171896 B1 8 være effektive ved behandling af patienter med særlige typer cancer.

Der er nu udviklet en hidtil ukendt og mere effektiv metode til opnåelse af monoklonale antistoffer ved anven-5 delse af perifere blod-B-celler fra patienter immuniseret med celler fra deres egne tumorer i specifikke vaccinepræparater. Til opnåelse af aktiv specifik immunoterapi blev patienter immuniseret med autochotone tumorceller, dvs. celler fra deres egne tumorer. Denne metode blev an-10 vendt baseret på ansøgernes teori om, at tumorceller udtrykker tumorspecifikke antigener.

Dyremodelstudier har understøttet den antagelse, at antigener, der ikke findes i normalt voksent væv, ofte findes i tumorer, og at immunogeniteten af disse tumorceller kan 15 udtrykkes og endog forbedres i såvel normale som tumorbærende værter. Disse eksperimentelle resultater underbyggede det logiske ved aktiv specifik immunoterapi i human neoplasia (ændringer i legemet som følge af maligne tumorer) .

20 Mennesker med et måleligt immunrespons mod tumorceller blev specifikt fundet at være en god kilde for aktiverede B-celler. Det perifere blod fra patienter, som var blevet aktivt immuniseret mod deres egne tumorer, blev i klinisk forsøg vist at være en rigelig kilde for sådanne aktive-25 rede B-celler.

Det blev i kliniske studier vist, at et objektivt immunrespons dannes ved behandling af patienter, der har den særlige cancer ved hudprøve, dvs. forsinket cutan hyper-sensitivitet (DCH). Immuniserede patienter udviste for-30 sinket cutan hypersensitivitet mod deres egne colorectale cancere. Desuden reagerede de monoklonale antistoffer, der var udviklet fra de immuniserede patienters B-celler, med tumorer af samme histologiske type i andre patienter.

DK 171896 B1 9

Disse resultater indikerer, at patientens humorale immunrespons, dvs. produktion af antistoffer, er rettet mod colorectal cancer generelt og ikke udelukkende mod den immuniserede patients egen tumor. Dette generelle respons 5 er specielt vigtigt for udviklingen af en standardiseret vaccine.

Behandlingen viste sig også at være yderst gunstig. 42 måneder efter immuniseringen af de første patienter har der været en objektiv og signifikant forbedring i patien-10 terne med hensyn til varigheden af den sygdomsfri periode, der følger kirurgi, og overlevelsesdata er opmuntrende. Kun tre af tyve behandlede patienter havde tilbagefald, og ingen døde. Sammenligningsvis havde ni af tyve patienter i en kontrolgruppe tilbagefald, og fire døde.

15 Dannelsen af B-celler, som producerer antistoffer, der har reaktivitet specifik for tumorcelleantigener, især celleoverfladeantigener, som i størstedelen af tilfælde-ne, er et fordelagtigt resultat, der var spekulativt, i bedste fald, da immuniseringsstudierne blev påbegyndt.

20 Kun immuniseringsbehandlingen blev betragtet og målt under de dyrestudier, på hvilke de humane immuniseringsprocedurer var baseret, ikke fremstilling af tumorspecifikke antistoffer.

Det almene immunrespons fulgt af en forbedring i perso-25 nens tilstand var indikativt for et cellulært respons, hvori macrophager og T-celler blev aktiveret i nærværelse af tumorcelleantigener og ødelæggelse af tumorcellerne. Skønt et antistofrespons kunne forudsiges udløst ved immunisering under de fleste omstændigheder, ville tidsfor-30 løbet for antistofresponset og det cellulære respons i det fleste tilfælde være forskelligt. Endvidere gjorde den kendsgerning, at de patienter, der blev immuniseret med autologe tumorceller, og den erfaring fra tidligere DK 171896 B1 10 forsøg, at ringe eller ingen antistofproduktion udløses af en patients egen tumor, ansøgerens iagttagelse, at B-celler, som producerer tumorspecifikke antistoffer, dannes efter immunisering, til et uventet godt resultat.

5 Nogle cellulære og humorale immunrespons kan forekomme uafhængigt af hinanden. For eksempel er det muligt at opnå et humoralrespons i fravær af påviselig cellulær immunitet. Følgelig kan kraftig cellulær immunitet, specielt forsinket cutan hypersensitivitet (DCH) udvikles trods et 10 minimalt antistofrespons. Det var derfor overraskende, at de, der udviste et positivt respons mod aktiv immunotera-pi, var fremragende kilder for B-celleproducerende tumorspecifikke antistoffer, specielt celleoverfladeantistoffer.

15 Det tilsigtes endvidere med opfindelsen at tilvejebringe en standardiseret vaccine til anvendelse ved detektering og behandling af specifikke cancere i den almene population, som ikke krævede den sædvanlige fremstilling af et nyt immunogen, der er egnet til hver enkelt patient. Uden 20 en standardiseret vaccine kunne kun én vaccine fremstillet for hver enkelt patient ud fra hans eget tumorvæv anvendes til terapi, og kun kendte cancere kunne behandles i begrænset omfang i store institutioner. Det ville ikke have været muligt at fremstille individuelle præparater 25 til behandling af cirka 139.000 tilfælde af colorectal cancer, som opdages i USA hvert år.

Den foreliggende opfindelse angår fremstillingen af vacciner, der kan bruges med held, til aktiv specifik immunisering, procedurer til ekstraktion af immuniserede B-30 celler, fremstillingen af monoklonalt antistofproduceren-de celler og produktionen af monoklonale antistoffer. Maligne tumorer nedbrydes under anvendelse af enzympræparater. De opnåede celler behandles til opnåelse af et ikke- DK 171896 B1 11 turaorigent tumorcellepræparat med den påkrævede cellelevedygtighed, som injiceres som en vaccine i den person, hvorfra tumoren blev opnået. Perifere blod-B-celler opnås fra den inokkulerede person efter et forudbestemt inter-5 val og anvendes til fremstilling af monoklonalt antistofproducerende celler ved sammensmeltning med myelomacel-ler, hvorefter de sammensmeltede celler screenes for syntese af immunoglobulin. Celler, der syntetiserer immunoglobulin, afprøves til fremstilling af antistoffer, som 10 reagerer med antigener, der er karakteristiske for det maligne væv. De udvalgte celler dyrkes til fremstilling af monoklonale antistoffer, der reagerer med den særlige type tumor, som personen er angrebet af.

Musemyelomaceller dyrket i kultur blev anvendt til frem-15 stilling af hybridomer i den forskning, der førte til den foreliggende opfindelse. Da de problemer, der er forbundet med udvikling af humane myeloma-cellelinier, der er lette at dyrke, og som ikke producerer antistoffer i sig selv, er løst, vil humane myeloma-celler imidlertid blive 20 foretrukket til fremstilling af hybridomerne ifølge op findelsen .

Nøgleaspekterne for opfindelsen er: (1) Kriterier for succesrige vacciner til aktiv specifik immunisering: 25 Tumor-celler: Hele celler enzymatisk dissocieret fra væv, cryopreserveret og røntgenbehandlet til non-tumorigenicitet.

Adjuvans: En immunomodulator, der er i stand til at indføre immunogenicitet i tumorcellepræparat.

DK 171896 B1 12

Komponenter og administrering: Skal omfatte forholdet mellem adjuvans og tumorceller, optimale doser af tumorceller og vaccinations forskrift.

Patient: Regionale lymfeknuder drænende 5 vaccinationsstedet må være til stede under de første 21 dage efter vaccinationen.

(2) Procedurer og timing for ekstraktionen af immuniserede B-celler fra patienterne.

(3) Procedurer til fremstilling af hybridomer og transit) formerede lymfocyter og produktion af monoklonale antistoffer.

Ansøgerne har med held nedbrudt massive humane ondartet-heder under anvendelse af forskellige enzympræparater. Tumordissociationerne blev bedømt for udbytte af tumor-15 celler pr. gram væv, udvundne celletyper, cellelevedygtighed, cellestørrelse og sterilitet. Kriterierne for succesfulde vacciner for aktiv specifik terapi er vist i tabel 1.

Tumorvæv blev opnået fra patienter lidende af den særlige 20 massive cancer, mod hvilken monoklonale antistoffer skulle fremstilles. Tumorvævet blev kirurgisk fjernet fra patienten, skilt fra vilkårligt ikke-tumorvæv og skåret i små stykker. Det viste sig, at det var tilfredsstillende at skære tumorvævet i fragmenter på 2 til 3 mm i diame-25 ter. Tumorfragmenterne blev derpå nedbrudt til frie individuelle tumorceller ved inkubering i en enzymopløsning. Efter nedbrydning blev de befriede celler samlet og talt, og cellelevedygtighed blev fastlagt. Trypanblåt-udeluk-kelsestest viste sig at være et acceptabelt mål for cel-30 lelevedygtighed. Tumorcellerne blev derpå cryopreserveret og opbevaret i flydende nitrogen.

DK 171896 B1 13

Vaccinen blev fremstillet for injektion ved hurtig optøning af cryopreserverede celler, fortynding af cellerne, vask med HBSS, gensuspendering, tælling og bedømmelse af levedygtighed.

5 Levedygtige tumorceller blev bestrålet for at gøre dem non-tumorigene. Det viste sig, at bestråling med 4.020 rad/min. til i alt 20.000 rad resulterede i non-tumorigene, men levedygtige celler. Volumenet af cellesuspensionen i HBSS blev indstillet, således at 10^ levedygtige 10 celler blev tilbage i røret. Cellerne blev centrifugeret, den overliggende væske blev fjernet, og 10 levedygtige BCG (Bacilles Calmette Guerin) blev tilsat i et volumen på 0,1 ml. Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) blev tilsat i en tilstrækkelig mængde til at give et slutvolumen 15 på 0,2 ml. En tredje vaccine blev fremstillet på lignende måde under udeladelse af BCG.

Immunisering af patienter

Patienter angrebet af den særlige massive cancer, for hvilken antistoffer skulle dannes, blev immuniseret ved 20 intradermal inokkulering med tumorcellevaccinen. 10 le vedygtige tumorceller blandet med BCG blev anvendt til de første to vaccinationer, og 10 tumorceller alene blev anvendt til den tredje vaccination. Foretagelse af hver vaccination med en uge imellem viste sig at være en suc-25 cesfuld procedure til indføring af antistofproduktion af patientens perifere blodlymfocyter.

Samling af immuniserede B-celler

Veneblod blev samlet fra de immuniserede patienter en uge efter hver vaccination. Perifere blodlymfocyter (PBL) 30 blev skilt fra det samlede blod til anvendelse i hybrido-maproduktion.

DK 171896 B1 14

Adskillelse af lymfocyter fra blodet blev udført under anvendelse af to forskellige metoder. Den første omfattede fortynding med calcium- og magnesiumfri HBSS, anbringelse i lag på lymfocytseparationsmediet, centrifugering 5 og fjernelse af celler ved grænsefladen. Disse celler blev fortyndet med HBSS og pelleteret. Lymfocyterne blev derpå gensuspenderet i serumfri Hepes-pufret Dulbeccos MEM (DMEM), talt og prøvet for levedygtighed (GIBCO Biologies, Grand Island, New York).

10 En alternativ metode, der blev anvendt til udvinding af perifere blodlymfocyter (PBL) beriget med B-celler, omfattede fjernelsen af T-lymfocyter ved rosettering med 2-aminoethylisothiouroniumbromid-hydrobromid (AET)-behandlede fåreerythrocyter. Behandlede erythrocyter blev blan-15 det med perifere blodlymfocyter, pelleteret ved centrifugering, og pellet blev inkuberet på is. Efter gensuspendering, laglæggelse over lymfocytseparationsmedium (LSM, Litton Bionetics) og centrifugering af de rosetterede celler blev de T-celleudtømte PBLer samlet ved grænsefla-20 den, vasket og pelleteret. PBLerne beriget med B-celler blev derpå anvendt til hybridomadannelse efter tælling og levedygtighedsbestemmelse.

Fremstilling af humane hvbridomer til fremstillingen af antitumore monoklonale antistoffer 25 Perifere blodlymfocyter og dyrkede myelomaceller blev sammenblandet, pelleteret og resuspenderet i et serumfrit medium. Polyethylenglycol (PEG) blev tilsat, cellerne blev pelleteret og gensuspenderet i HT-medium (DMEM indeholdende 20% føtal bovinserum, hypoxanthin og thymidin) 30 og fordelt i mikrotiterbrønde. 24 timer senere blev HAT-medium (HT-medium indeholdende aminopterin) sat til hver brønd, idet halvdelen af mediet blev udskiftet hver tredje dag. Efter ophold i HAT-medium i 14 dage blev cellerne DK 171896 B1 15 holdt på HT-medium i yderligere 2 uger, hvorefter cellerne blev dyrket på et DMEM-medium indeholdende 20% føtal bovinserum.

Hybridomerne blev præ-screenet til syntese af human immu-5 noglobulin under anvendelse af standard-enzymimmunoprø-ven. Hybridomer, der syntetiserede human immunoglobulin i tilstrækkelige mængder, blev afprøvet på væv. Særlige vævsprøver blev inkuberet med hybridoma-supernatanter. Supernatanter, som viste reaktivitet med særligt tumor-10 væv, indikerede, at hybridomaceller i de brønde, hvorfra de særlige supernatanter var taget, producerede tumorspecifikke antistoffer. Hvis de samme supernatanter ikke viste reaktion med prøver af normalt væv efter omfattende screeninger, blev hybridomerne i den særlige brønd be-15 tragtet som tumorspecifikke. Disse tumorspecifikke supernatanter blev yderligere afprøvet mod carcinoembryonisk antigen (CEA) for at være sikker på deres snævre specificitet .

Foruden hybridomaceller, som producerede tumorspecifikke 20 antistoffer, blev der også fremstillet transformerede humane B-celler (diploide celler) ved disse procedurer, som også producerede tumorspecifikke antistoffer. De transformerede B-celler blev detekteret på samme måde som tumorspecifikke antistofproducerende hybridomer. Således 25 indeholdt overliggende brøndvæsker afprøvet positivt for reaktioner med tumorvæv og negativt for reaktioner med normalt væv og med CEA enten hybridomer eller transformerede B-celler. De to typer celler blev adskilt ved at observere, at de transformerede B-celler indeholdt 46 huma-30 ne kromosomer, hvorimod hybridomerne indeholdt mange flere kromosomer, af hvilke ikke alle var af den humane type.

DK 171896 B1 16

Mekanismen, ved hvilken B-celler bliver transformeret under de i det foregående beskrevne procedurer, er ikke blevet bestemt præcist.

KORT BESKRIVELSE AF TEGNINGEN

5 Fiaur 1A

Kromosompræparat af en celle med vækstkarakteristika typiske for hybridomer (X1600). LiCo 21B27 blev inkuberet med colcemid (0,05 pg/ml) i to timer og behandlet med hy-pertonisk (0,075 M) KC1 i tre minutter. Cellerne blev 10 fikseret med methanol-eddikesyre (3:1), dryppet på mikroskopplader, lufttørret og farvet med Giemsa. Både humane kromosomer og musekromosomer er til stede.

Fiaur IB

Fasefotomikrografi af et klyngedannende monoklonalt anti-15 stof (LiCo 18-15) producerende cellelinie (X 270). Bemærk aggregeringen og den uregelmæssige facon af cellerne.

Figur 1C

Kromosompræparat med farvning af G-bånd af den cellelinie, der er vist i figur ID (X 1360). Bemærk fraværet af 20 musekromosomer. Cellerne blev inkuberet med colcemid (0,01 ng/ml) natten over. Kromosompræparaterne blev fremstillet som beskrevet i det foregående. Det ufarvede objektglas fik lov at henstå i ti dage. Kromosomerne blev behandlet med trypsin (0,19% i 30 sekunder ved stuetempe-25 ratur), dehydratiseret med ethanol og farvet med Giemsa.

Figur ID

Formalin-fikseret (10%) paraffinindlejret sektion af en coloncarcinoma omsat med det monoklonale antistof LiCo 16-88 (4 μg/ml IgM x 380). Der ses såvel overfladelignen- DK 171896 B1 17 de som cytoplasmisk mærkning. Den deparaffinerede sektion blev blokeret (20 minutter ved stuetemperatur) med phos-phatpufret saltvand (PBS) (pH 7,3) indeholdende 0,75 M L-lysin og 1% bovinserumalbumin og derpå inkuberet med LiCo 5 16-88 natten over ved 4°C. Efter vask med PBS blev sekti onen inkuberet (60 min. ved 37°C) med affinitetsrenset peroxidasemærket gedeantistof mod humane immunoglobuliner (IgG + IgA + IgN), vasket og derpå omsat (15 minutter ved stuetemperatur) med diaminobenzidin (0,5 mg/ml) i PBS (pH 10 7,6) indeholdende 0,1% H2O2· Efter modfarvning med hema toxylin blev sektionen dehydratiseret, klaret og monteret med permount.

Figur 1E

Colontumor som i figur ID reagerede med normal human IgM 15 (4 pg/ml) (x 380). Ingen farvning observeres.

Figur 1F

Cryostatsektion af en colontumor farvet med LiCo 16-88 (x 640). Bemærk den intense mærkning af periferien af tumorcellerne (pile). Sektionen blev lufttørret og opbevaret 20 ved -30°C. Denne sektion blev post-fikseret (20 min. ved 4°C) med PLP i PBS og behandlet som beskrevet under figur ID med undtagelse af, at peroxidase-mærket gedeantistof specifikt mod humane μ-kæder blev anvendt.

Figur 1G

25 Cryostate sektioner af colontumoren vist i figur 1F reagerede med normal human immunoglobulin (x 640). Der ses ingen mærkning af tumorcellerne.

Fiaur IH

Cytospinpræparat af lufttørrede ufikserede SW1463-celler 30 farvet med LiCo 16-88 (4pg/ml) (x 280). Colontumorcelle- DK 171896 B1 18 linien blev høstet med ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (0,02%), vasket og suspenderet i medium indeholdende 1% bovinserumalbumin. Celler (2 x 10^ i 0,1 ml) blev pelleteret på objektglassene i en cytocentrifuge, 5 lufttørret og opbevaret ved -30°C. Celler blev inkuberet med monoklonalt antistof (1 time ved stuetemperatur og derpå natten over ved 4°C), vasket og derpå behandlet som beskrevet i det foregående.

Figur 2 10 Fordeling af antigener i paraffinsektioner af colorectale tumorer. Skygget areal indikerer positiv indirekte immu-noperoxidasefarvning af 15 tumorer med 10 humane monoklo-nale antistoffer.

Figur 3 15 To monoklonale antistoffer reagerer med de fleste colorectale tumorer. Reaktiviteten af to monoklonale antistoffer mod paraffinsektioner af 15 colorectale tumorer og lufttørrede cytospinpræparater af dissocierede tumorer fra 9 patienter sammenlignes. Skyggede arealer indikerer 20 positiv indirekte immunoperoxidasefarvning.

Fiaur 4

Opfølgning af alle kontrolpatienter og immuniserede patienter i aktive specifikke kliniske immunoterapiprøver efter sted og patogisk stadie.

25 Fiaur 5A

Sygdomsfri status for alle patienter.

Figur 5B

Overlevelsesstatus for alle patienter.

DK 171896 B1 19

Figur 6A

Sygdomsfri status for patienter med positive regionale lymfeknuder (Astler-Coller C).

EKSEMPEL I

5 Fremstilling af sensibiliserede B-celler A. Patientudvælgelse

Patienter, der undergår kirurgisk resektion af colon eller rectale cancere, blev valgt til en randomiseret prøve for aktiv-specifik immunoterapi. Randomisering blev fore-10 taget med stratificering efter patologisk stadie, og tumor blev opnået fra alle patienter, som opfyldte de kliniske kriterier. Kandidater til studiet var colorectal-cancerpatienter uden tidligere cancerhistorie, som ikke havde modtaget nogen tidligere kemoterapi eller bestrå-15 lingsterapi, og som var i passende medicinsk tilstand til at kunne tåle den ambulante behandlingsprotokol. Patienter kvalificeret til denne prøve var de, der havde en tumor strækkende sig ud gennem tarmvæggen (Astler-Coller B2), positive lymfeknuder (stadie Cl, C2) eller patienter 20 med metastatisk sygdom (trin D). Inden for disse klassifikationer blev patienter valgt tilfældigt til deltagelse i behandlingen og til grupper uden behandling. Randomise-ringskort blev computerdannet og derefter trukket fra hver kategori postoperativt.

25 B. Tumorerhvervelse

Efter kirurgisk resektion blev tarmprøven overført umiddelbart til hospitalets patologiafdeling og åbnet under sterile betingelser. Tumorvæv blev udskåret, placeret i sterile rør indeholdende Hanks Balanced Salt Solution 30 (HBSS) indeholdende 50 g gentamicin pr. ml og båret umid- DK 171896 B1 20 delbart på is til laboratoriet til behandling og frysning .

C. Dissociation af fast tumor oa colonmucosa Vævs-dissociationsproceduren af Peters et al. (Cancer Re-5 search, 1353-1360, 1979) blev anvendt under anvendel se af steril teknik hele tiden i et stinkskab med laminar strømning. Tumorvæv blev skyllet tre gange i centrifugerøret med HBSS og gentamicin og overført til en petriskål på is. Ved skalpeldissektion fjernede fremmedvæv, og tu-10 moren blev hakket i stykker på cirka 2 til 3 mm i diameter. Vævsfragmenter blev anbragt i en 75 ml kolbe med 20 til 40 ml 0,14%s (200 enheder/ml) Collagenase Type 1

(Sigma C - 0130) og 0,l%s (500 Kunitz enheder/ml) deoxyribonuclease type 1 (Sigma D - 0876) (DNAase 1, Sigma 15 D-0876) forvarmet til 37°C. Kolber blev anbragt i et 37°C

vandbad med neddykkelig magnetiske omrørere ved en hastighed, som forårsagede tumbling, men ikke skumning. Efter 30 minutters inkubering blev frie celler dekanteret gennem tre lag sterilt medium-vådt nylonnet (166t: Martin 20 Supply Co., Baltimore, Maryland) over i et 50 ml centrifugerør. Cellerne blev centrifugeret ved 1200 omdr./min. (250 x g) i en afkølet centrifuge i 10 minutter. Den overliggende væske blev hældt af, og cellerne blev gensuspenderet i 5 - 10 ml DNAase (0,1% i HBSS) og holdt ved 25 37°C i 5 til 10 minutter. Røret blev fyldt med HBSS og holdt på is. Proceduren blev gentaget, indtil der var op nået et tilstrækkeligt antal celler, sædvanligvis tre gange for tumorceller. Celler fra forskellige nedbrydninger blev derpå samlet, talt, og cellelevedygtighed under-30 søgt ved tryptanblåt-eksklusionsprøven. Cellerne blev centrifugeret til yderligere vask før cryopreservering.

DK 171896 B1 21 D. Cryopreservering

Optimal cryopreservering var et primært formål. For vaccinefremstilling blev de dissocierede tumorceller indstillet til 5-8 x 10^/ml i HBSS og tilsat i lige så stort 5 volumen til afkølet 2 x frysemedium indeholdende 15%s dimethylsulfoxid (DMSO) og 4% humant serumalbumin (HSA).

n

Den endelige suspension af 2 til 4 x 10 celler/ml blev anbragt i 1,2 ml Nunc fryseflasker. Til DCH-celleaf-prøvning var proceduren den samme bortset fra, at der ik-10 ke blev anvendt HSA. I begge tilfælde blev Nunc flaskerne til frysning overført på is til en Cryo-Med model 990 Biological Freezer med en model 700 Controller og en model 500 Temperature Recorder for frysning med kontrolleret grad. Der blev draget omsorg for, at temperaturen af 15 de enkelte flasker, herunder monitorflasken, var ensartet ved begyndelsen af frysningsprocessen. Flasker blev afkølet ved en kontrolleret hastighed på -l°C/min. til en sluttemperatur på -80°C. Flaskerne blev overført i flydende nitrogen til opbevaring i flydende nitrogen.

20 E. Klinisk protokol

Patienter med tumorer fra de passende patologiske stadier blev randomiseret til modtagelse af enten den autologe tumorcelle-BCG-vaccine eller til ikke at modtage nogen yderligere terapi. Trin D-patienterne modtog alle 5-25 fluor-uracilkemoterapi, og alle patienter med læsioner under den peritoneale refleksion (rectal-cancer) modtog 5040 rad bækken-røntgenbestråling to uger efter afsluttet immunoterapi. Vaccinerne blev startet 4-5 uger efter tu-morresektion for at give tilstrækkelig tid til genvinding 30 af immunologisk undertrykkelse induceret af anæstesi og kirurgi. 3-4 uger efter resektion blev såvel kontrolpatienter som behandlingspatienter hudprøvet med standardtilbagekaldelsesantigener såvel som graderede doser af DK 171896 B1 22 deres autologe tumorceller. Tilbagekaldelsesantigener som anvendes var: Fåresygehudtestantigen, USP, Eli Lilly, Indianapolis, Indiana; Aplisol, PPD (Tuberculin Purified Protein Derivative), Parke-Davis, Detroit, Michigan; Tri-5 chophyton, fortyndet 1:30, Center Laboratories, Port Washington, New York, og Candida albicans fortyndet 1:100, Center Laboratories, Port Washington, New York, 0,1 ml af hver blev anbragt intradermalt på underarmen og undersøgt for erythema og induration 24 og 48 timer sene-10 re.

Patienter valgt til behandlingsprotokollen modtog tre ugentlige intradermale vaccineinjektioner bestående af 10 bestrålede, autologe tumorceller og 10 BCG i de før- 7 ste to vacciner med 10 tumorceller alene i den sidste.

15 Frisk frossen Tice BCG, leveret af Dr. Ray Crispen, University of Illinois, Medical Center, Chicago, Illinois, blev opbevaret ved -70°C. Den første vaccine blev givet på forsiden af venstre lår ca. 10 cm under lyskefolden, den anden på et tilsvarende sted på det højre lår og den 20 tredje på det højre deltamuskelområde.

F. Fremstilling af vaccine På dagen for den første og anden vaccination blev flaskerne hurtigt optøet i et 37°C vandbad, tumorceller blev fortyndet langsomt til 15 ml i HBSS, vasket en gang ved 25 centrifugering ved 1200 omdr./min. og resuspenderet til 15 ml i HBSS. Celletællinger og levedygtighedsbestemmelser blev foretaget under anvendelse af trypanblåteksklu-sionsprøven. Levedygtighed lå mellem 70 og 90% med en middelværdi på 80%. Cellerne blev vasket en gang ved cen-30 trifugering ved 1200 omdr./min. og gensuspenderet til 15 ml i HBSS. Suspensionen af tumorceller blev anbragt på is og bestrålet ved 4020 rad/min. til i alt 20.000 rad. Volumenet af cellesuspensionen blev indstillet, således at DK 171896 B1 23 7 7 10 levedygtige tumorceller forblev i røret (1,3 x 10 levedygtige celler inkluderes for at tillade celletab i rør og sprøjter og muligheden for omtrent 20%s misidentificering af lymphoide celler). Cellerne blev centrifu- η 5 geret, den overliggende væske blev fjernet, og 10 BCG blev tilsat i et volumen på 0,1 ml. HBSS blev tilsat i tilstrækkelig mængde til et slutvolumen på 0,2 ml. Den tredje vaccine blev fremstillet på lignende måde under udeladelse af BCG.

10 Vaccinesuspensionen blev optaget gennem en kaliber 20 nål i en 1,0 ml tuberkulinsprøjte. Nålen blev anbragt med en mål kaliber 27 til intradermal injektion, og sprøjten blev anbragt på is for transport til klinikken.

Patienterne blev observeret nøje efter hver vaccine for 15 erytherma og induration ved injektionsstedet, feber, lymphadenopati eller andre uheldige reaktioner. De første to vaccinesteder dannede sår efter 2 til 3 ugers forløb, men helede altid i løbet af 10 til 12 uger.

G. Immuniseringsresultater 20 Reaktivitet mod standardtilbaaekaldelsesantiaener

Alle patienter var til at begynde med reaktive mod mindst én af standardtilbagekaldelsesantigenerne. To af de 29 var reaktive mod Candida, 26 af 29 var reaktive mod fåresyge, 16 af 29 var reaktive mod PPD, og 3 af 29 reagerede 25 mod trichophyton. Der var ingen væsentlig ændring i reaktivitet i opfølgningsperioden med undtagelse af, at alle på nær to af de immuniserede patienter gik over til PPD-positivitet.

30 DK 171896 B1 24 H. Forsinket cutan hyoersensibilitet fDCH) mod tumorcel-ler

Den forsinkede cutane hypersensibilitetsreaktion mod 106 autologe tumorceller i 24 immuniserede og 11 ikke-5 immuniserede kontrolpatienter er vist i tabel 2. En 48 timers indurationsmåling på mere end 5 mm blev betragtet som positiv. Fire af 24 patienter (17%) havde en positiv DCH mod 10^ tumorceller før immuniseringsforløbet. Dette var ikke significant forskelligt fra én af 11 patienter 10 (9%) med positiv prøve i den ikke-immuniserede kontrol gruppe. Af significans (p < 0,01) øgede alle de indledningsvis fire med positivt respons og tolv med negativt respons i immuniseringsgruppen til større DCH-reaktivitet efter forløbet af en immunoterapi (67 blev positive). Syv 15 af disse patienter er blevet afprøvet efter et års forløb, hvor de tre forblev med positivt respons. Kun tre af de 16 objektivt immuniserede patienter udviste et positivt DCH-respons mod 10^ tumorceller efter 6 ugers forløb, hvor ingen udviste et respons mod 10^ celler.

20 Eksempel II

Produktion af hvbridomer for humane monoklonale antistoffer A. Fjernelse oa behandling af immuniserede B-celler fra patienter 25 Patienter blev tappet for blod på tidspunktet for den anden immunisering, en uge efter den første immunisering og på tidspunktet for den tredje vaccination, en uge efter den anden immunisering. Veneblod blev samlet aseptisk i nærværelse af konserveringsmiddelfri heparin (ONeill, 30 Jones og Feldman, St. Louis, Missouri) ved en slutkoncen-tration på 17 enheder/ml. Blodet blev holdt ved stuetem DK 171896 B1 25 peratur og transporteret til laboratoriet øjeblikkeligt i løbet af nogle få timer fra opsamlingen.

Blodet blev fortyndet 1:2 med calcium- og magnesiumfri HBSS, lagt i lag (4 ml) over 3 ml lymfocytseparationsme-5 dium (LSM, Litton Bionetics) og centrifugeret i et 15 ml centrifugerør i 30 minutter ved 400 x g. Cellerne ved grænsefladen blev fjernet, fortyndet med tre gange deres volumen HBSS og pelleteret (100 omdr./min. i 10 minutter). De perifere blodlymfocyter (PBL) blev gensuspende-10 ret i 10 ml serumfri Hepes-pufret Dulbeccos (DMEM), talt og levedygtighed bestemt.

En alternativ metode blev også anvendt til udvinding af immuniserede B-celler. T-lymfocyterne blev fjernet ved rosettering med AET-behandlede fåreerythrocyter. Fåreery-15 throcyter (i Alsevers opløsning) blev vasket tre gange med afbalanceret saltopløsning (BSS) og inkuberet ved 37 °C i 20 minutter med 4 gange volumenet af den pakkede celle i form af 0,14 Μ AET (Sigma). De behandlede celler blev derpå vasket tre gange med HBSS og gensuspenderet 20 til en 10%s suspension. De behandlede erythrocyter blev lagt i lag over LSM, centrifugeret ved 2.500 omdr./min., og pellets blev samlet. Efter tre gange vask med HBSS blev fårerthrocyterne gensuspenderet til en 10%s suspension i ufortyndet føtal bovinserum og anvendt inden to 25 uger. PBL (op til 80 mill, celler) blev blandet med 1 ml AET-behandlede fåreerythrocyter og pelleteret ved 1.000 omdr./min. i 10 minutter ved 4 °C. Pellet blev inkuberet på is i 45 minutter, omhyggeligt resuspenderet med en pipette med stor bredde og lagt i lag over 3 ml LSM. De ro-30 setterede celler blev centrifugeret ved 400 x g i 40 minutter ved stuetemperatur. De t-celleudtømte PBLer blev samlet ved grænsefladen, vasket med tre gange volumenet af HBSS og pelleteret. Efter tælling og levedygtighedsbe- DK 171896 Bl 26 stemmelse blev BPLer beriget med B-celler derpå anvendt til hybridomadannelse.

B. Dannelse af humane hybridomer

Musemyeloma-celler (NS-1) blev dyrket i nærværelse af 8-5 azaguanin (20 ng/ml). Tre dage før fusion blev cellerne pelleteret og passeret i medium frit for 8-azaguanin. Cellerne blev igen passeret dagen før fusion for at holde dem i logfasen. Myeloma-cellerne blev vasket en gang med serumfrit medium, talt og levedygtighedsbestemt. PBL- og 10 myeloma-cellerne blev blandet i et forhold på 3:1 og pelleteret sammen ved 1.000 omdr./min. i 10 minutter. Al overliggende væske blev fjernet, og cellepellet blev re-suspenderet i mindre end 100 μΐ serumfrit medium. 1 ml polyethylenglycol (50% efter vægt/vol.) forvarmet til 37 15 °C blev dråbevis sat til cellepellet i løbet af 1 minut med konstant bevægelse af røret. To gange det hidtidige volumen forvarmet serumfrit medium blev sat til cellsus-pensionen i løbet af 1 minut, indtil det 50 ml store rør var fyldt. Cellerne blev pelleteret ved 800 omdr./min. i 20 15 minutter. Cellerne blev forsigtigt gensuspenderet i et HT-medium (DMEM indeholdende 20% føtal bovinserum (13,6 Hg/ml hypoxantin og 3,9 μg/ml tymidin) ved en koncentration på 2,5 x 10® celler/ml (præfusionstælling), og 100 μΐ blev sat til hver mikrotiterbrønd. 24 timer senere 25 blev 100 HAT-medium (HT-medium indeholdende 0,18 ng/ml aminopterin) sat til hver brønd. Halvdelen af mediet blev erstattet hver tredje dag med frisk HAT-medium. Efter ophold i HAT-medium i 14 dage blev cellerne holdt på HT-medium i yderligere to uger, efter hvilket tidsrum cel-30 lerne blev dyrket på et DMEM-medium indeholdende 20 % føtal bovinserum.

Alternativt kan co-dyrkning af PBL med myeloma-celler anvendes til dannelse af transformerede diploide B-celler.

DK 171896 B1 27 PBL og myeloma-celler blev blandet (i et forhold på 3:1)/ pelleteret ved 800 omdr. og selekteret i HAT-medium som beskrevet i det foregående.

C. Screening af hybridomer 5 Hybridomerne blev først kvantitativt bestemt og isotype-bestemt ved en erobringsenzymbundet immunoassay (ELISA) for syntesen af human immunoglobulin (IgA, IgG og IgM). Standart -"BioEnzaBead"-metoden blev anvendt, som er følsom i området 10-300 ng/ml. De hybridomaoverliggende væ-10 sker blev fortyndet 1:30 med et effektivt område på 0,3 -9 pg/ml. Kun hybridomer, der syntetiserede human immunoglobulin i en koncentration større end eller lig med 1 pg/ml blev afprøvet med indirekte immunoperoxidase på væv, efter at isotypen af antistoffet (IgA, IgG og IgM) 15 var bestemt.

Polycarbonat-coatede, metalliske perler ("Bio-EnzaBead", Litton Bionetics) blev inkuberet med gedeantistoffer mod humane immunoglobuliner (IgG + IgA + IgM) natten over ved 4 °C og derpå blokeret (30 minutter ved stuetemperatur) 20 med 2,5%s BSA til undgåelse af ikke-specifik binding. Perlerne blev derpå lufttørret og opbevaret ved 4 °C. ELISA til detektering af immunoglobulin blev foretaget som følger. Overliggende væske fra en kulturplade med 96 brønde blev fortyndet, inkuberet med antistof-erobrings-25 perle i 1 time ved 37 °C, vasket og derpå inkuberet i 1 time ved 37 °C med peroxidase-mærket affinitetsrenset gedeantistof mod humane immunoglobuliner (IgG + IgA + IgM).

De vaskede perler blev derpå inkuberet (10 minutter ved stuetemperatur) med 2,2-azino-di(3-ethyl-benzthiazolin-30 6-sulfonsyre), og absorbansen blev bestemt ved 400 run. Immunoglobulinkoncentrationerne blev interpoleret matematisk fra den lineære del af en standardkurve (30 - 1.000 ng/ml) for human gamma-globulin. Overliggende væsker in- DK 171896 B1 28 deholdende >1 μς/ιηΐ blev derpå isotypebestemt under anvendelse af denne ELISA med peroxidase-mærkede gedeanti-stof fer mod humane γ-, α- og μ-kæder. Efterfølgende kvantitative assays anvendte en immunoglobulinstandard pas-5 sende for den monoklonale antistofisotype. Museglobuliner blev prøvet med Bio-EnzaBeads overtrukket med gedeanti-mus-IgG + IgM (H +L) og peroxidase-konjugeret gedeanti-mus-IgG + IgM (H + L). I andre eksperimenter blev super-natanterne inkuberet med de antihumane Ig-perler og pero-10 xidasekonjugeret gedeantimus-IgG + IgM (H + L).

Cryostat-sektioner fra normalt væv og tumorvæv opbevaret ved -30 ° blev postf ikseret i PLP (0,5% p-formaldehyd, 0,075 M L-lysin, 0,01 M natriumperiodat) i 20 minutter ved 4 °C. Sektionerne blev derpå vasket. Paraffinsektio-15 ner af 10%s formalinf ikseret væv blev deparaf fineret umiddelbart før anvendelse. Cryostat- og paraffinsektionerne blev derpå inkuberet ved stuetemperatur i l%s bo-vinserumalbumin i PBS indeholdende 0,075 M L-lysin i 20 minutter. Sektionerne blev inkuberet natten over ved 4 °C 20 med hybridomaoverliggende væsker. Efter tre gange vask med PBS blev sektionerne derpå inkuberet med det passende antihumane peroxidase-mærkede reagens i 60 minutter ved 37 °C, vasket og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter med diaminobenzidin (0,5 mg/ml, pH 7,6) i PBS inde-25 holdende 0,l%s hydrogenperoxid. Sektionerne blev vasket med PBS, farvet med hematoxylin, dehydratiseret og monteret med permount.

Disse metoder tillod detektering af det bredeste spektrum af vævsreaktive antistoffer (dvs. rettet mod overflade-30 eller cytoplasmiske antigener).

For at isolere bredt reaktive antistoffer blev superna-tanterne screenet mod et panel af tumorsektioner. Cellelinier producerende monoklonale antistoffer blev derpå DK 171896 B1 29 klonet ved begrænsende fortynding. 22 fusioner blev foretaget med perifere blodlymfocyter opnået fra ti patienter, og 2 fusioner blev foretaget med lymfocyter fra patienter før immunisering. Optimale resultater blev opnået 5 med lymfocyter fjernet en uge efter den anden immunisering (tabel 8). Hyppigheden af de immunoglobulin-produce-rende kloner isoleret efter den anden immunisering var næsten dobbelt så stor som efter den første immunisering.

7 af de 36 vævspositive monoklonale antistoffer reagerede 10 med cryostatsektioner, men ikke med paraffinindlejret væv. Dette fund understreger behovet for brede screeningsprocedurer. Mere end to tredjedele af klonerne producerede IgM, mest sandsynligt en følge af lymfocytkilden (perifert blod).

15 En tredjedel af cellelinierne havde morphologi typisk for hybridomer og voksede som dispergerede celler. Karyotyp analyse af seks repræsentative hybrider viste, at de var humane-muse-hetero-hybridomer (Figur 1A) . Modsætningsvis var størstedelen af de monoklonale antistofsyntetiserende 20 cellelinier (24 ud af 36) atypiske i udseende (Figur IB). Disse celler var overvejende uregelmæssige i form og voksede i store aggregater. Disse klyngedannende celler blev isoleret i 7 fusioner foretaget med PBL fra 7 af 10 co-lonpatienter. De synes således at være helt almene. Seks 25 cellelinier repræsenterende 5 fusioner fra 4 patienter blev karyotypebestemt og blev fundet at indeholde 46 kromosomer. Farvning af G-bånd af kromosomerne bekræftede, at de var af human oprindelse (Figur 1C). Baseret på kriteriet cellemorphologi synes det således, at størstedelen 30 af de monoklonale antistofsyntetiserende cellelinier ikke er hybridomer, men snarere er transformerede humane B-celler (diploide celler). Mekanismen ved denne spontane transformation er ikke kendt, men kan være beslægtet med immuniseringsproceduren.

DK 171896 B1 30

Der eksisterer ingen klare forskelle mellem disse celletyper i isotypen af secerneret immunoglobulin eller typen af farvet væv. Mængderne af immunoglobulin (1:60 μg/ml) secerneret af begge celletyper var i alt væsentligt sam-5 menlignelige, idet størstedelen af de humane celler producerede 5-20 pg/ml. Som forventet ses diploide celler at være mere stabile med hensyn til immunoglobulinproduk-tion. Disse celler blev dyrket i kontinuerlig kultur i op til 9 måneder uden nogen indikation af et afsluttet livs-10 forløb for antistofproduktion. Faktisk blev der observeret forøgelser i antistofproduktion under langvarig dyrkning af visse diploide linier. De kloner, som bagefter blev ikke-producerende under ekstensiv cellepassage, havde vækstegenskaber typiske for hybridomer. Imidlertid 15 havde de fleste hybrider tilstrækkelig stabilitet til at tillade produktionen af nyttige mængder antistof. For eksempel blev human-muse-hetero-hybridoma 7a2 passeret i mere end 20 generationer fra en nyligt klonet podemedium-lagerbeholdning på 5 x 10^ celler uden en nedgang i anti-20 stofproduktion. Cellerne kunne således teoretisk ekspan-deres til 7 x 10 celler. Denne hybrid producerede cirka 30 ng/ml/10^ celler og 7 x 1013 celler skulle således kunne producere over 2 kg antistof.

D. Produktion af monoklonale antistoffer 25 Humane monoklonale antistofproducerende celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) suppleret med 10% føtal bovinserum, 3 mM L-glutamin og 5 ng/ml gentamicin. Mediet blev i nogle tilfælde yderligere suppleret med 25% D-glucose (slutkoncen-30 tration 0,25%). Cellerne blev holdt ved 37 °C (35 - 38 °C) under en fugtig atmosfære med 7,5% CO2 i luft. Antistoffet blev høstet fra det højmetaboliserede, brugte medium ved pelettering af mediet fri for celler (f.eks. centrifugering ved 500 omdr./min. i 15 minutter).

DK 171896 B1 31

Eksempel III

Reaktivitet af monoklonale antistoffer med normalt væv oa tumorvæv

De fleste af antistofferne udviste væsentligt reduceret 5 binding til normal colon-mucosa. Antistofferne reaktive med paraffinsektioner blev også afprøvet for reaktivitet med normalvæv fra bryst, lunge, galdeblære og lever og blev fundet negativ.

Reaktivitetsmønstret for ti af de monoklonale antistoffer 10 (MCA) med histologe sektioner af colorectale adonocarci-nomer fra 15 patienter fremgår af Figur 2. Matrix for reaktivitet af de afprøvede antistoffer indikerede, at individuelle antistoffer reagerede med mellem 47 og 80% af de afprøvede tumorprøver. Ingen monoklonale antistoffer 15 reagerede med alle 15 tumorer. I vævssektioner fra individuelle patienter varierede reaktivitetsområdet fra væv reaktivt med alle ti antistoffer til væv reaktivt med så få som et eller to antistoffer. Alle vævsprøverne anvendt til bestemmelse af monoklonal antistofreaktivitet blev 20 taget fra patienter forskellige fra de to donorer af B-celler til de oprindelige fusioner.

Det patologiske stadie for de afprøvede tumorer til den procentvise reaktivitet blev sammenlignet med gruppen af afprøvede monoklonale antistoffer, og det viste sig, at 25 de tumorer, der havde den bredeste reaktivitet, var moderat godt differentierede adenocarcinomer, de mindre almindelige, ringe differentierede adenocarcinomer var generelt ikke reaktive. Antistofferne reagerede typisk med metastaser.

30 Monoklonalt antistof LiCo 16-88 reagerede med et antigen præserveret i paraffinindlejrede sektioner af colorectal carcinoma, som enten ikke fandtes eller kun fandtes i DK 171896 B1 32 nedsat antal i normal colon-mucosa. Foruden cytoplasmisk mærke udviste tumorceller overfladelignende farvning (Figur ID). Denne binding var specifik, som vist ved fravær af farvning af normal human immunoglobulin tilpasset 5 i koncentration og isotype til det monoklonale antistof. Bemærkelsesværdig er også den iagttagelse, at dette antistof reagerede med både primære tumorer og metastaser. Antistof LiCo 16-88 reagerede med cryostatsektioner. Som det fremgår af Figur 1E, blev der iagttaget intens farv-10 ning af periferien af tumorceller med LiCo 16-88, men ikke med normal human immunoglobulin (Figur 1F).

Hovedfordelen ved et humant monoklonalt antistof sammenlignet med et murint er til in vivo diagnose (afbildning) og terapi. Mindre end 1% af humane monoklonale antistof-15 fer isoleret fra tumorbærende patienter blev rapporteret af tidligere forskere som reagerende med celleoverfladeantigener (Cote et al., Proc. Nat. Acad, Sci., 80, :2026-2030, 1983). Disse resultater antydede, at cancerpatien ter kan være tolerante over for tumorcelleoverfladeanti-20 gener. Det er derfor væsentligt, at halvdelen af de vævspositive antistoffer isoleret fra immuniserede patienter senere fandtes at binde til overfladerne af tumorceller (tabel 3, 4 og 8). Som det ses i Figur 1G, reagerer monoklonalt antistof 16-88 med overfladen af SW-1463 cel-25 ler. Mangelen på farvning af nogle af cellerne kan skyldes enten klonale eller cellecykliske variationer i ekspressionen af antigenet eller antigenerne. Den største fordel ved den foreliggende opfindelse, som gør brug af immuniserede patienter som kilde for sensibiliserede B-30 celler, er således den ekstremt høje hyppighed af antistoffer reaktive med producerede celleoverfladeantigener.

De producerede antistoffer ifølge opfindelsen har det største potentiale ved diagnose og behandling af cancer.

DK 171896 B1 33

Protein (PBS og 3,0 M KCl) og lipid (chloroform-methanol) ekstrakter blev fremstillet ud fra HT-29 og SW-1463 celler. Tretten af antistofferne viste sig at reagere med disse ekstrakter. Det mest slående fund var, at alle 5 antistofferne reagerer med proteinekstrakterne, idet be handling af ekstrakterne med protease i alt væsentligt reducerede bindingen. Disse resultater står mærkbart i kontrast til de, der er opnået med murine monoklonale antistoffer, som ofte er rettet mod glycolipidantigener 10 fra colon-tumorer (Morgan et al., Hybridoma, ϋ.:3, side 233, 1984) og Lindholm et al., Int. Arch. Allergy Appl.

Immuno,. 2^*178-181, 1983).

Teknik omfattende fremstillingen af proteinekstrakter og anvendelsen af immunoadsorberende lectiner for immunise-15 ring af mus er påkrævet for at producere monoklonale antistoffer mod proteinantigener afledt fra colon-tumorer. Således udløser autolog immunisering af mennesket antistoffer mod en gruppe antigener, der normalt er ringe immunogene for mus. Det er derfor muligt, at menne-20 ske og mus kan respondere mod forskellige tumorassocierede antigener. I overensstemmelse med denne hypotese er fundet af, at ingen af de 28 undersøgte monoklonale antistoffer reagerede med renset CEA, et antigen, der ofte ses ved murine monoklonale antistoffer fremstillet mod 25 colon-tumorceller (Koprowski et al., Somat. Cell. Genet., 5.:957-972, 1979 og Morgan et al., supra). Det er interessant, at tre af de humane monoklonale antistoffer også genkendte antigener ekstraheret ved chloroform/methanol-behandlingen. Disse antigener kan enten repræsentere pro-30 teiner ikke denatureret ved denne behandling eller alternativt glycolipider, som har en fælles epitop (dvs. kul-hydratdelen) med et glycoprotein.

DK 171896 B1 34

Reaktivitet af humane monoklonale antistoffer med celle-overfladeantiaener af 8 colon-carcinoma-cellelinier 36 humane monoklonale antistoffer blev afprøvet for reaktivitet med tumorcelleoverfladeantigener mod et panel på 5 8 humane colon-cancercellelinier fremstillet som lufttørrede cytocentrifugeprøver. 13 af de 36 antistoffer gen kendte antigener udtrykt på overfladen af mindst to humane colon-carcinomacellelinier (Figur IH, tabel 3). Alle 13 overfladereaktive antistoffer blev isotypebestemt som 10 IgM.

Disse monoklonale antistoffer blev fremstillet af både heterohybridomer og diploide B-cellelinier.

Eksperimenter under brug af murine antistoffer mod strukturelle cytoplasmiske antigener, såsom actin, bekræftede, 15 at cytoplasmiske strukturer ikke kunne detekteres med passende fremstillet lufttørret cytospin cellepræparater uden forudgående permeabilisering af cellemembranen. Overfladelokaliseringen af antigenerne genkendt på cyto-spinfremstillede celler for størstedelen af antistofferne 20 blev bekræftet ved indirekte immunofluorescens af levende celler.

Det viste sig, at der ikke var nogen korrelation mellem reaktiviteten af de monoklonale antistoffer og immunoglo-bulinkoncentrationen af de antistofholdige celle-superna-25 tanter. Alle celle-supernatanter blev afprøvet uden fortynding og uden forsøg på at indstille dem til en konstant immunoglobulinkoncentration. For størstedelens vedkommende udviste de tretten antistoffer reaktive med to eller flere cellelinier mere end sporaktivitet; undtagel-30 serne var 12-42 og 12-53, antistoffer af IgG-isotypen, der reagerede stærkt med kun én cellelinie. Der var nogen variation i ekspression af beslægtede antigener blandt cellelinierne: LS-174*" bandt til 17 monoklonale antistof- DK 171896 B1 35 fer; SW-1463 og HT-29 bandt til 12 og 10 antistoffer, andre cellelinier bandt til 5 til 9 af antistofferne, og 7a2 og 16-52 reagerede med alle 8 cellelinier. Ellers indikerede det monoklonale bindingsmønster en mangfoldighed 5 af genkendte specificiteter.

Reaktivitet af humane monoklonale antistoffer med celle-overfladeantiaener af dissocierede colon-carcinoma-tumor-celler

Celleoverfladeaktiviteten observeret med colon-cellelini-10 erne blev bekræftet i prøver på lufttørrede cytospinpræ-parater af enzymatisk dissocierede colon-tumorceller fra 9 patienter (tabel 4). Sytten af de monoklonale antistoffer reagerede med mindst to af tumorcellepræparaterne.

Der var nogle forskelle mellem celleliniedata og tumor-15 celledata, 16-86, som reagerede med fire ud af 8 cellelinier, gav positive resultater udelukkende med et tumor-cellepræparat, og 16-105 og 12-53, som reagerede med nul ud af otte og en ud af otte colon-cellelinier, reagerede med tre eller flere af tumorcellepræparaterne. Som det 20 ses fra reaktivitetsprøverne med cellelinier, antydede mønstrene for antistofbinding, som reflekterer tilstedeværelsen og graden af antigenekspression af tumorcellerne, at mange forskellige specificiteter genkendes af disse monoklonale antistoffer.

25 Reaktivitet af humane monoklonale antistoffer med paraf-finsektioner af parret colon-tumor oa normal mucosa

Specificiteten af 25 af de humane monoklonale antistoffer reaktive med paraffinsektioner blev afprøvet ved indirekte immunohistokemi med parrede sektioner af colon-tumor 30 og autolog og normal colon-mucosa fra fem patienter (tabel 5). Elleve af de 25 (44%) udviste ingen detekter-bar reaktivitet med normal colon-mucosa i de fem afprøvede patienter, men alle 11 reagerede med tumorprøver.

DK 171896 B1 36

Fjorten af de 25 antistoffer reagerede, skønt reaktive med tumorprøverne, også med normal colon-mucosa. Kvantitativt var i disse tilfælde reaktivitet med normal colon-prøver mindre end med tumorprøver. Individuelle antistof-5 fer reagerede med 1-4 af de normale undersøgte colon- mucosa-prøver. Fem af 14 af disse krydsreaktive antistoffer reagerede kun med den normale colon-mucosa fra én af fem patienter. Den normale colon-mucosa af patient 8 reagerede med 13 af de 23 antistoffer, der reagerede med pa-10 tientens tumor. Om enten den normale colon-mucosa fra denne patient var proximal eller distal til tumoren er ukendt. Hvis patient 8 blev udeladt fra denne analyse, ville kun ni af 24 antistoffer afprøvet have reageret med 1-3 af de normale colon-mucosa-parrede prøver fra fem pa-15 tienter. I de undersøgte totale parrede colorectale tumor- og normal colon-mocosa-prøver udviste i alt ca. 30% krydsreaktivitet med normal colon-mucosa, som det vil ses, skønt den kvantitative reaktivitet var betydeligt mindre end den observerede mod den parrede tumorprøve.

20 Endvidere kan forekomsten af et lavere niveau, men detek-terbar cellereaktivitet, tilskrives genkendelsesterminan-terne forbundet med en afvigelse fra de normale tilstande, som ikke vises som cancer.

Reaktivitet af humane monoklonale antistoffer med parrede 25 humane colon-tumor- og mucosacellecystospinpræparater ved direkte binding af biotin-mærkede antistoffer

Specificiteten af antistoffer for tumorceller mod normale celler er vanskelig at bedømme ved indirekte farvningsmetoder på cytospinpræparater og cryostatsektioner. De pe-30 roxidase-mærkede antihuman Ig-antistoffer anvendt til detektering af de humane antistoffer genkender også endogent humant immunoglobulin til stede på alt humant væv. Normalt væv indeholder større mængder endogent immunoglobulin end tilsvarende tumorvæv. Følgelig er baggrunden DK 171896 B1 37 højere for normalt væv end for tumorvæv. Direkte mærkning af antistofferne løser dette problem og tillader indføjelse af et overskud af irrelevant humant immunoglobulin med de monoklonale antistoffer for at blokere ikke-5 specifik immunoglobulin-binding, et andet problem forbundet med indirekte teknik.

Fem af de overfladereaktive humane antistoffer blev renset fra dyrkningsmedium og mærket med biotin. De fem blev valgt, fordi de havde reageret godt i tidligere prøver og 10 produceret forholdsvis store mængder humant immunoglobulin. Tabel 6 viser resultaterne med de fem biotin-mærkede antistoffer i direkte prøver på lufttørrede cyrospincel-lepræparater af colon-tumorer og nabostillede mucosacel-ler opnået fra syv patienter. Alle fem antistoffer reage-15 rede med tumorcellerne, hvilket bekræftede reaktiviteten observeret i indirekte prøver. Reaktivitet med normale mucosaceller var svag eller ikke-detekterbar.

Direkte binding af biotin-mærkede monoklonale antistoffer til frosne vævssektioner af colon-tumor-mucosa og normal 20 colon-mucosa

Yderligere direkte karakterisering af de fem biotinmærkede antistoffer med hensyn til deres specificitet for tumor mod normale celler blev foretaget med frosne vævssektioner af colon-tumor og nabostillet normal colon-25 mucosa (tabel 7). Absolut specificitet blev observeret med fire af antistofferne, vist ved den kendsgerning, at de reagerede stærkt med mindst to af fem colon-tumorer og ikke reagerede med nogle af de fire tilsvarende normale colon-mucosasektioner. 19b2 reagerede stærkt med fire af 30 fem tumorsektioner og udviste en svag reaktion med en af fire normale colon-mucosasektioner. 19b2 reagerede også i nogen grad med normale colon-mucosacytospincellepræpara- DK 171896 B1 38 ter (tabel 6) og normale colon-mucosaparaffinsektioner (tabel 5).

Frosne vævssektioner fra normalt væv fra bryst, mave ny* re, lever, muskel og hud (tabel 7) viste ingen farvning 5 af biotin-mærkede humane antistoffer med undtagelse af antistof 19b2, som udviste en lav binding til normalt ma-vevæv. En total baggrunds farvning af bindevævskomponenter blev observeret. Denne baggrundsfarvning er ikke-specifik og er blevet observeret af andre under anvendelse af bio-10 tin-mærkede monoklonale antistoffer.

Reaktivitet af monoklonale antistoffer med CEA. erythro-cvt- oa leukocvt-antiaener

Til yderligere etablering af tumorspecificiteten af de monoklonale antistoffer er der foretaget afprøvning for 15 reaktivitet med CEA, humane erythrocyt-antigener og humane leukocyt-antigener på forskellige måder. Der sås ingen tegn på eller reaktivitet mellem disse antistoffer og disse antigener. Anti-CEA-aktivitet blev bestemt ved ELISA med to CEA-præparater. Farvningsmønstrene for de 20 humane monoklonale antistoffer på humane colontumor- paraffinsektioner var forskellige fra de, der blev iagttaget med muse-anti-CEA-antistof. Ingen af de 36 humane antistoffer gav det lysende farvingsmønster, der typisk ses med anti-CEA-antistoffer. Reaktivitet med humane ery-25 throcytantigener blev målt ved indirekte immunofluore-scens og hæmaglutinering mod et erythrocytpanel repræsenterende alle større og de fleste mindre blodgruppesyste-mer. Der sås ingen reaktivitet. ELISA, cytotoxiske prøver og indirekte immunoperoxidasefarvning af humane lymfocy-30 ter viste ikke nogen sandsynlighed for genkendelse af lymfocytantigener af nogen af antistofferne.

DK 171896 B1 39

Funktionalitet af humane monoklonale antistoffer med colorectal cancer

Specificitet er en hovedbetragtning i bestemmelsen af nytten af disse tumorreaktive monoklonale antistoffer.

5 Mangelen på reaktivitet mellem nogle af de monoklonale antistoffer og en vis procentdel af de undersøgte tumorprøver er en anden faktor, som må tages i betragtning.

Det er således usandsynligt, baseret på disse data, at noget enkelt monoklonalt antistof ville have alle de fak-10 torer, der er forbundet dermed, som ville gøre det ideelt til terapeutisk eller diagnostisk anvendelse. Strategien ved anvendelse af immuniserede cancerpatienter har givet et stort antal kloner, fra hvilke visse valg kan foretages med hensyn til reaktivitetsområde såvel som specifi-15 citet. Ved valg af kun to af de nu producerede monoklonale antistoffer, der er baseret på deres egenskaber i en bred in vitro screening, har den største tumorreaktivitet med den mindste reaktivitet med normal colon-mucosa, har det vist sig muligt at foreslå og udvikle cocktails af 20 antistoffer, der sammen lover større effektivitet end noget individuelt monoklonalt antistof. Som vist på fig. 3 giver to monoklonale antistoffer, 6a3-l og 7a2, parret for deres reaktivitetsområde med både vævssektioner og dissocierede tumorceller og valgt ud fra deres relative 25 mangel på krydsreaktivitet med normal colon-mucosa, en antistofcocktail, som vil reagere med 14 af 15 tumorprøver og 9 af 9 dissocierede tumorcelleprøver. Andre cocktails af denne type kan udvikles, men det er klart, at man må have en bred vifte af monoklonale antistoffer at 30 vælge fra og en omfattende in vitro-screening til afprøvning af et stort antal prøver i en række forskellige differentieringsstadier for at gøre brug af humane monoklonale antistoffer til terapeutiske eller diagnostiske formål .

DK 171896 B1 40

Foruden at tilvejebringe monoklonale antistoffer, der er reaktive med tumorcelleoverfladeantigener til in vivo diagnose og immnuoterapi af cancer, tilvejebringer opfindelsen monoklonale antistoffer, der vil være nyttige som 5 prober til isolering og karakterisering af de antigener, der er relevante for human cancerimmunitet. Disse antigener kan ultimativt vise sig nyttige som tumorvaccine. Desuden tilføjer frembringelsen af antistofproducerede diploide celler en dimension i form af genetisk stabili-10 tet til produktionen af humane monoklonale antistoffer, der er reaktive med tumorcelleoverfladeantigener.

Tabel 3 viser vævsreaktiviteten for monoklonale antistoffer fremstillet med de monoklonale antistofcellelinier fremstillet efter disse procedurer.

15 I det foregående beskrives dannelsen af hidtil ukendte monoklonale antistoffer specifikke for visse tumorer, hy-bridomer, og metoder til fremstilling deraf. Teknikken til fremstilling af hidtil ukendte monoklonale antistoffer, hybridomer og diploide celler er blevet beskrevet 20 detaljeret, specielt under henvisning til specifikke udførelsesformer omfattet af eksemplerne. Det vil forstås, at produkterne og teknikkerne i den foreliggende opfindelse er af langtrækkende betydning inden for området cancerdetektering og -behandling. De omfatter en lang 25 række monoklonale antistoffer, der hver især er specifikke for determinanter fundet på en individuel stamme af tumordannende cancer, da den heri omhandlede teknik kan anvendes til dannelse af antistoffer for hvert sådant tilfælde. Det vil yderligere forstås, at der findes mange 30 variationer og modifikationer af den heri omhandlede teknik, som fagmanden på området kan finde i den relevante teknik, og at sådanne variationer og modifikationer er omfattet af opfindelsen.

DK 171896 B1 41

Udførelsesformerne er givet for at illustrere den foreliggende opfindelse og angår carcinoma-tumorer, specielt veldefinerede colorectale adenocarcinomer. Det er imidlertid klart, at opfindelsen angår alle carcinomer, såsom 5 carcinomer i lunge, bryst og andre sygdomsramte steder, som danner samme type embryonisk væv. Endvidere kan de beskrevne procedurer tilpasses, om nødvendigt, af fagmanden på området, så de kan anvendes til andre typer cancer.

DK 171896 B1 42 TADEL 1

Kriterier for nyttige vacciner til aktiv specifik immunoterapi

Adj uvans (a) BCG (Phipps, Tice, Connaught), lyofiliseret, fros-set (dosisafhængighed > 10^ (107-10^)) (b) C. parvum (Wellcome Labs) (dosisafhængighed > 7 pg (70 pg - 700 pg))

Tumorceller (a) Enzymatisk dissociering (1) Collagenase type I (1,5-2,0 U/ml HBSS) (2) DNAase (450 D.U./ml HBSS) (3) 37°C med omrøring (b) Cryopreservering (1) Frysning med kontrolleret hastighed (-l°C/min.) (7,5% DMSO, 5% HSA, HBSS) (2) Levedygtighed 80% (c) Røntgenstråling (1) Gjort ikke-tumorigen ved 12.000 - 20-000 R. Komponenter og administrering5 (a) Forhold mellem adjuvans og tumorceller - 10:1 - 1:1 (optimum) (b) 107 tumorceller (optimum) (c) 2-3 i.d. vaccinationer med ugentlige intervaller.

Tredje vaccination indeholder kun tumorceller.

aIsoniazid chemoprophylaxe af BCG-infektion, eventuelt BCG - Bacillus Calmette Guerin HBSS - Hanks' balanced saline solution DMSO - Dimethyl sulfoxid USA - Human seruraalbumin R - Rad PBS - Phosphatpufferet saltvand EDTA - Ethylendiamintetraeddikesyre DK 171896 B1 43 TAQEL_2 DCH-reaktion mod autologc tumorceller

Antal Præirrtnuniserings- Reaktivitet

Trin patienter reaktivitet9 6 uger og/el]. 6 mor.

Iimiuniserede patienter B2 8 0 4 C1,C2 92 6 D 7 2 6 Ί to tal (%) 24 4 (17%) 16 (67%)

Non- iirmuniserede patienter B2 4 1 0 C1,C2 50 1 D 2 0 0

Total (%) 11 1 (9%) 1 (9%) aReaktioner blev betragtet positive, når 48 timers indurationen (middelværdi af 2 diameter) var mere end 5 mm.

DK 171896 B1 44 ρ O ++ΙΙΙΙΙΙ++ΙΙΙΙΩ+ΙΙΙΙΙ++ΙΙΙΙ + 'P Ho· CO 2 ro o· "3· di 2 p

0) O

C > + + +III++IIIII+Q+ + +1II++IIII + d) 0 o- ro 2 o· o· o· ro tr Ω *p

P >J

C o* c t-r- + + +I + I i i i i 1 + 1+ + + + +1 i i+ + +i i + i <D «Η ^ ro (N rorsj rr rsi Ό — co tf c Ω Ή r— 0-1 P a ro <U *-* Ό I + IIIIIIIIIIIII+++III l + l I I I + > .— o· o· ro ro ro ro O C 2 <1) o co rH ro h a ε <U P o o

O <D O CO I++IIIIIIIIIIII+++III I I ΙΩ+Ι I

•H - θ' O rO Γ0 O' O' Z

•de c 2 0 Ή t- CO É Ή to 0) o Ρω c co OJrH o o· Ι + ΙΙΙΙΙΙΙΙΩΙΙΙΩ+ΙΙΙΙΙΙ + ΙΙΙΙ + *p 0) - oo o· 22 ro

>4-1 o O 2 ro O (C O CO

P E

ΩΜΟ ω -ri c Γ0 CQ -P -P (£> < CO O· + + +IIIIIIIQIIIQ+ + +III++III+ + Ω dj P H O-O· 2 2 CO ΓΟ Γ0 roo· ro tf 2

CL> U CO

Ή c ni o C *—i oo o o ro + + +IIIIIIIIIIII+++IIII + III+ + ΉΟΙΓΝΟ· ΓΟΓΟ Γ0 ro

^ H

0 0 x

C -P

o -o

E O O

o, o >1 s £ S S X U O O O 2 O Σ O S S £ 2 £ S O S £ 2 £ £ O 2 £ C 4J CJ'tJotJ'Cr'Cr'OotT'DotJotioGoCr'tJ'tnCr'Cr'tr'Cr'tJ'tr'tJ'Cr'tT'tT'tJ'Cr'CjitJ'

O O HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHMMHHHHH

E CO

3 H

x: ή xi tf c o

P P

O P

P (TJ

•Η P iHroooror'0,o'incT\irtooi-trocriroo'0'r'LncococricrvcD^HU3ror' > -U H <N H 'fhMHHHH Η Η Ω H Ω H C H ro

P QJ

.* O

dJ C

Q) O

« X

-P «—I

CO tt tt tt ti rom««

O-P O ooror^ro'NO'rocri OMoowrtoHwroooicirKN

-J W « « « O'inroo'O'LnrHrororoo'LninLncor'CoaDooaDrHHHroro XP dl CM O rtj ip I (111 II 1111 III II I I I I || i Ο-p id dj dJHHrororocNincntntnvøcDCDcovococDCDVDVDcDCDoooooo O dj

S

DK 171896 B1 45

4J

u o Q Q) M ^

•H -ri fO

S -h c >,

Μ Ό QJ

Vi cniJ -η μ

Q +IIIIQOQ O (D Φ > fH

~rj o- z Z Z .X r-ι tu m ^ O H f~—{ (Λ u> > >ι tu x o O O Ό O ε O — X to - 4-» > t llllQQQ dJ <U > C -— <3 O t Z Z Z O- Ό ' Φ O Ό

X >, Η ro r-ι c C C

4-> o o ja -η nj φ o X -rr O r-t 4-> in CV S O) V| >, -h o· -Η -Η (Λ C Π3 Vi o~ Ό l-ι o ro t_> «-Ή ++IIIII+ -μ — - m o so a. i «r <n o cH C r~ — to 4j tu oo .-i tu ~ ro c ι-i αι ό ί1 οι ό m — tn (U S U <fl Ό Ό — in Vi to C to tu X ro ro tu O (U >

— o +IIIIQQQ CL, E - · «-4 -C

•—o· Z Z Z <—l Vi co — o iJ jj x> S x o ό a id φ

O to JJ U4 <7> C CQ VI

ra tn S <3 0)

ε C C to x · > X

O O <y n >, E 1) p

c°0 IIIIIQQQ »—I V - Vi 3 4J .X

"S' z z z «-π -u n m m o c

• ° X O LD £ tU 4-> —I

w *- to Μ ε O' to H

f ro X O X - C 4-> > t! ° c in £ a> x tn tu O c co o 10 iH > C ri

^-1 ° *5" +IIIIQDQ X E X O W X

“ ^ ™ X z z o - χ x

° S Ό jai σ\ l> U U

°to 0) qj <m _y rH <u a> ^ g v< i u m υ ή

., U-ι O Η O -U C C

ri ro 4JO X K 1¾ Q to X

U to <U 4-> --- IM O X

0 ^+1111114- d in in vi 0)

f· X O· C4 (T> X V 01 d t>\" X X

t·* S -r-t.u tu x o o nj x

to X C X C X X C <U

d (3 —I X 4-> o U

QJ tU ,—I O Ό X

co g tu »-i tu ai 4-i tu °4 -+-«iiiifi g x v tu χ E ra χ

Iro tons tu O x Z X

E-ι »I C X x o +J - < x o ra c.) ai tOX - E Vi » C it X O φ ¢1 E .

, x O Cn C Vi r-ι O g J d C O -Ί 3 an 3

f1· _ > O X CJ 4-> dX X

>1 SUOOZSSZ Vi ε O MH 3 u^u 4-> 0101(7101131(710101 m x in 3 w t n ni

O ΜΜΜΜΜΜΜΜ 141 Q) d UC_) E

y> tu ό u o e >i M tntu o d tu 3 Vi tn m > E tu η, h qj - _ Ό «. Vi X >,X tM tu •Q -t Μ P rOE-iCUU-i^-l c Xd -PCetUOi o 0<4-l r-( o C W 1-3 nj rj Vi rd 3 r-l ftJ O’ ω ti 01 -X o u c .

|u D,4) « O -r-t r4 Vi T3

Vj tDirtTiOitTioororo OtU E ViCQCl t;t^ —i dO οαιοΐώί —t 5 P OCEVittJM-t JU g r-t -Η·(0^>,Μ-Μ ^ Ε ·Η MV-iE'OU-^T^

^ ·Η -M ,Q<Djj(tiO

o >|-H W V| a> 4-1 ε

u Ml C SZ d IM XJ <U

m o --< tu c nj to . H 3-1 —i · 4-> .—I c - *z 4i 4i tucui-ttuttJdo

‘J ,, , QlttJ C r-ι 0) .|J 141 o U

d n V Ί -H c tu U

5R «« -i 4J (utuc d x 4-1 tu · 04J« Γ- 04 wc · XU -HOC^I-X ro

^ØØ^cN^r-iro ctu r-j tu i x nlOHO

•S t! ;Q<<mco<ctiirf; m u E cqcq ai > r-t ø u

044 OlOOOHlOMt) 4-1 C \ r i—I (U 4-> I Q W

SS rH0404<N04<NtN04 CO 0>« Η H Hl W <fP

2 n μ .X a = æ λ ό ci ή m

-n- m X O VJ

DK 171896 B1 46

<D

C NT I + IQQQQ+IQIQQQI + IIIQIIQQQii <n J2 ZS2 tT Ή 4-) C ro l + llllQIIIIIII + tlllll + IOI| + Π3 ΓΜ 2 2 Φ Ό Φ H IN + I Q I I IQl IDI I IQ+I I I + I I I O Q I || ^ 22 u Φ > Ιο W rH + + + +I I I I + I + I+ + + +I + I I I I I + + + +

Φ E M (Μ Γ0 CM CM (SI

Ή E

Ή 0

Φ C

υ (- O ++I I I I I l + l + l I I + I + I + + + + I + I | + 1 C ΓΜ (Ί <f Ό ~ o - E a. j- L· U (K I++II I IQl 11111++11:11 + 1 + 1+ +

H c- cl r-i -q· cm 2: C\I|-N| m fM

Φ o Ί+ E +-I D

0 - CO I++IIII + II III I+ + +I I !! + , + !+ + ^+11 r-i'+tN n (\ π n rg cm

ιλ ra Q -Η E

W +> o w C c Γ" l + l I I ( I I I I I I I+ + +1 l + l + l | + + +

NOT

f" O

Φ t- i-t o Π) L M2 + + +I I I l + l I I I I I + + + I I I l + l I I + + C c Γ-l TN CM CM ΓΟ Τ' -o 0 0 r—t ·“

.¾ O

O o c O **- Φ

Er: Q,

> SSSSUOOOSOSOSSSSSSOSSSSSOSS

Φ 4J CrtT'tj'tTiCntntJ'O'tT'tntrtT'tr'tntT'tj'CrtT’Cr'Cr'CriCr'tPCritr'Cntr1 C 0 hhhhhhhhhhhhmmhmhhhhhhhhhhh <0 in

E H

o s: "I c Φ o Ή +> + φ φ +1 +1 Γ-ιηΜΡ'^'^ιησιΐηοο—ιησιητ'τΐ'ΐΠΒΦ'τνιοΗΦΝΓ' ’H U rlNrl TM^H + rtH H r—I r+ r+ r+

C fH CM

-Η Φ +· υ ^ c rJ o Φ « o; dl +1 r+ Φ Φ +( C'w «««« n in « «

OO U njlNC'nCMM'CICri C>CM<X>lDCMOr-IUJCOOOin,-|CM

h +· « «te

i/inM' + ifirKNnn’Timni/uoMDffloomHriHNN

X <n o~> r+ cQ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 t 1 1 1 1 1 1 1 ,,

O H Ifl (T) ldH(NCMCMCMininmincOCDMDU)'J3VDir)vi)vDlDlDlO000QCO C4J

0 C

Σ <d DK 171896 B1 47

'd' I Q Q Q Q

in 22ZZ — dl

Ti

•H

n + i i i i O

CM (M rH

Cu

*»H

TI

CM + I | i | . — CM ΓΟ

<D

rH Ό Μ d)0) ω ή + i i i i Λ u £ CM --3- (Od)

1 4J E

3 M

C *—i O

4-> O + i I I I -H dH

—> C cm ro +j cd

• 0) C

-H d) (0

X> 4J CM

M (0 CT\ + I I I I M +J

O Di Η M d) ^ 4J £

~ O O

q to

oo Η- I I ! I TI

'T —I CM OM

. CM O

ri ^ ω ·μ tn

5 Γ" + I I + I

<T *—i (M m to

E-< 0) M

M 0) (0 *—i

'O 4 1 I I I rH <H

-i cm .y d)

M

O M

UH d> xs tn

d) C

Oj -Η Ή

SoSOOOS: TI Cn

-M t n t n t n t n t n C O

OHMMHH H -H

to X! o n J5 M < pj

(0 M

O C £

o CU M

H TI 3 (0 X» CO M i—i

M moim tn O

-t-> ΓΜ rH ,y C tn (0

η O E

U O

c q ti o a> -H ·

X C0 Μ M

rH .Q 0) d) >ι·Η ϋ s « c s »S 5 Si

C *M « Ό q rH

O O « Γ' 0) · t n «Η rH4J CMrOVOr^CM +J rH did) -¾ ω x)ri<CDaff) to g +j u

O -H CTlOOOrH rH ·\ d> I

C-U rH cm CM CM CM -H en rQcq o q na« Σ m en xj u TABEL 5 DK 171896 B1 48

Reaktivitet af humane monoklonale antistoffer på paraffinsektioner ar colorectaltumorer (T) og parret normal co1 on-mucosa (N13

Patientnummer

Monoklonale —---- -7 8 1Q

antistoffer T N T N T N T N T K

6a3 + - ND 2 + - 2+ - 2 +

7^2 — ND 3+ - - ND 4+ — - ND

7a4 - ND - ND - ND 4+ - - ND

11B5 +-3+-3+-4+2+ 3+ + 12-38 - ND --2+-2+-3+- 12-42 - ND - ND 2+-3+-2+-

12-4 7 \ - ND + - 2+ - - ND

12-53 - ND 3+ - - ND + - - ND

15- 24-2 - NO 3+ - 4+ 2+ 3+ + - ND

16- 4 - ND 2+ - +-3++ + -

16 58 — ND 4+ + 4+ — 2+ + — ND

16-66 - ND 4+ - + + 3++ + - 16-8b - ND - ND 2+ - + + - 16-88 + - 2+ +-4++ + - 18-15 3.-2+- + -2++ + - 18-21 — ND 3+ + 2+ + 3+ + + + 18-22 - nd - ND + - - ND +

19b2 - ND - ND 2+ + 4+ 2+ - ND

20A3 + — 4+ + + — 2+ — + — 20A6 3+-2+-2+-2+-2+ + 20B7 3+ + 2+- +-3++ + +

21B27 2+ + 2+ - - ND 3+ + - ND

23A4 - ND 2+ -2+-2+ + 3+- 27B1 2+-4+ + 3+- 4+ 2+ 3+ + 23A32 - ND 4+ - + - ND + -

Tilstedeværelsen og graden af binding er indikeret som forklaret i fodnoterne til tabel 3.

TABEL 6 DK 171896 B1 49

Reaktivitet af biotin-mærkede monoklonale antistoffer mod human colontumor (T) og normal mucosacelle (N) cytospinpraparater3

Monoklonale antistoffer

Patient 6a3 7a2 7a4 18-22 19b2

antal TNT N T N T N T N

18 + - + + + + + + + + 21 3+- + + 2+- + + + 24 2+ - + + 4+ - 2+ - 3+ - 25 + - + + + 2+ 2+ + + 26 ----++--+- 27 2+--- 2+- 2 + + 2+ 2+ 28 + + + - + + + - 2+ + tilstedeværelsen og graden af binding er indikeret som forklaret i fodnoterne til tabel 3.

TABEL 7 50 DK 171896 B1

Reaktivitet af biotin-mærkede monoklonale antistoffer med g frosne sektioner af colon-tumorer (T) og normalt væv (N)

Monoklonale antistoffer 6a3 7a2 7a4 18-22 19b2

Vævskilde TNTN T N T N T N

Kolon +---2+- + -2+ +

Kolon 3+ - 2+ - 3+ - + — 2+ -

Kolon 3+ + - 3+ - 3+ - 3+ -

Kolon 2+ - + - - - - - - -

Bryst -

Bryst - - - -

Bryst - - - - - - - - -

Mave - - - - +

Nyre -

Lever _____

Muskel -

Hud _____

Hud - tilstedeværelsen og graden af binding er indikeret som forklaret i fodnoterne til tabel 3.

DK 171896 B1 51 <u Ί ti la tj ^ ^ 3

P X) <D

s& a § Ιό ^ o Xi -H o c 3 o T? -Η V, r—I CO VD Φ » 2t * ti la 10 fl

O O

Ό Σ tø m φ CT> O oo UD r-π m u 8 ^ O (N w

(D MM -H

s ♦ I

<υ &

0 T) N

υ ^ g _i M-f <*° *0 yj '»»p _ ,_^ Φ 9 iP tfp dP OP Q)

6 > Μ O O ^ O -H

O Φ rf \£> i—I

a ® c ^ ~ ~ ~ ω > rH-PooiDi-H a> •H <U ι-l r-t <\| ΓΜ p u a> \ \ \ i

U. >-t •'f VD O H

—« *—( *—( ·—i s jg fj PC ro

ri, VO

«> w '3 rti '— ‘—- -—- CL —n

, + P cif OP fto tfr to S

Γ; , u) 4, o in cr, o n to

P *Ρ > -P . r-i rH J

cn o wc-' — — -— H p < p > p (ti

t-w pop** —I TJ

—I O to p i—i ® W

7 η ή p > ω

P P P \ \ \ +J

c C c) om-n pra ,,J ri u p CN —I p

effl (H

dl J3 fc ff 1 s i &

9 + 0' P i i? ΐ . c 'U

3 Μ 0) P Γ- O O'-W® p * P <-I <N p C P P 0) O P 5 P P P Ή c S H » p xj « -i 0 p p ^ -n -s· π Sop <d c S® to p p w —i 4J o ^ - d S' 13 ss 117 η ΐ

En, liS S. g ^ <U -Η Φ C O'1 1 '8 S ti s ti · I1 ti u, 3 3 P 3 .ti 1 2 (3 3 ft " a £ 'g a ρ^ ϋ' < 4J Φ4 W Ρ C Ή ra μη tj ^ Η ρ Η <υ φ « I « " δ ® Ε Φ 33 ρ ® ti ο-, \ .¾ ρ ρ w

Ο Ρ § <ν σ, ο η τ! Λ. Jj] § 7a "S

Μ «§ 3 Η ρ f ti υ & ti *· a -8 s g . =ra ρ Ό > .-i -Η c (0 Ρ Q) ri Η ξ & g g Ά 88 I S ^ ti S & ti se I £ ^ m a ^ g & g a

i P p 1 Q

E ffl w E in -π >, s «Ρ Ρβ τΤ αΡ33

Claims (22)

1. Autolog vaccine til behandling af tumorer, kendetegnet ved, at den omfatter levedygtige celler, som er dissocierede fra en autolog human tumor, hvilke celler 5 er blevet gjort non-tumorigene, samt et adjuvans.

2. Autolog vaccine ifølge krav 1 eller 2, kende- 7 tegnet ved, at den indeholder ca. 10 celler pr. dosis.

3. Autolog vaccine ifølge krav 1 eller 2, kende-10 tegnet ved, at den som adjuvans indeholder BCG.

4. Autolog vaccine ifølge krav 3, kendetegnet η ved, at den indeholder BCG i en mængde på ca. 10 celler pr. dosis.

5. Anvendelse af levedygtige celler, som er dissocierede 15 og er gjort non-tumorigene, afledt fra en patienttumor til fremstilling af en autolog anti-tumorvaccine.

6. Metode til fremstilling af en autolog anti-tumor vaccine, kendetegnet ved, at en blanding fremstilles af levedygtige, men non-tumorigene celler afledt 20 fra en human patienttumor, samt et adjuvans.

7. Metode ifølge krav 6, kendetegnet ved, at de levedygtige, men non-tumorigene celler er afledt fra en tumor ved dissociering af tumoren og behandling af tumorcellerne til opnåelse af en levedygtig, men non- 25 tumorigen tilstand.

8. Metode ifølge krav 7, kendetegnet ved, at tumoren dissocieres enzymatisk. DK 171896 B1

9. Metode ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at cellerne opnået efter dissociering af tumoren underkastes nedfrysning.

10. Metode ifølge krav 7-9, kendetegnet ved, 5 at de fra tumoren afledte celler gøres non-tumorigene ved røntgenbestråling.

11. Metode ifølge krav 10, kendetegnet ved, at røntgenbestrålingen udføres ved 12.000-20.000 R.

12. Metode ifølge krav 6-11, kendetegnet ved, 10 at der anvendes ca. 10 levedygtige, men non-tumorigene celler pr. dosis.

13. Metode ifølge krav 6-12, kendetegnet ved, at BCG anvendes som adjuvans.

14. Metode ifølge krav 13, kendetegnet ved, at 7 15 der anvendes BCG i en mængde på ca. 10 pr. dosis.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et hybridom, der danner et humant monoklonalt antistof med specificitet for humane tumorantigener forbundet med humane faste tumorer, ved aktivering af en B-lymfocyt in vivo med auto- 20 loge tumorantigener i en autolog vaccine ifølge et vilkårligt af kravene 1-4 og fusionering af B-lymfocytten med en myelomcelle.

16. Fremgangsmåde til fremstilling af en celle, der danner et humant monoklonalt antistof med specificitet for 25 humane tumorantigener forbundet med humane faste tumorer, ved aktivering af en B-lymfocyt in vivo med autologe tumorantigener i en vaccine ifølge et vilkårligt af kravene 1-4 og transformering af B-lymfocytten. DK 171896 B1

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at B-lymfocytten transformeres under anvendelse af EBV.

18. Hybridomcelle opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 5 15.

19. Transformeret B-lymfocyt opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 16 eller 17.

20 B-lymfocyt og dyrkning af den herved fremkomne transformerede celle, kendetegnet ved, at den humane B-lymfocyt er blevet aktiveret in vivo ved udsættelse for et autologt tumorantigen forbundet med humane faste tumorer, hvilket antigen inkorporeres i en vaccine ifølge et 25 vilkårligt af kravene 1-4.

20. Fremgangsmåde til fremstilling af humane monoklonale antistoffer med specificitet for humane tumorantigener, 10 hvilken fremgangsmåde omfatter fusionering af en myelom-celle med en human B-lymfocyt og dyrkning af den herved fremkomne hybridomcelle, kendetegnet ved, at den humane B-lymfocyt er blevet aktiveret in vivo ved udsættelse for et autologt tumorantigen forbundet med huma-15 ne faste tumorer, hvilket antigen inkorporeres i en vaccine ifølge et vilkårligt af kravene 1-4.

21. Fremgangsmåde til fremstilling af humane monoklonale antistoffer med specificitet for humane tumorantigener, hvilken fremgangsmåde omfatter transformering af en human

22. Monoklonalt antistof fremstillet ved en fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at det har den indre kode 16-88 (deponeret hos ATCC den 30. januar 1984 under nummer HB 8495).