DK162813B - Fremgangsmaade til fremstilling af et praeparat til at haemme vaeksten af neoplastiske celler - Google Patents

Description

i

DK 162813 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et præparat, der kan hæmme væksten af neoplastiske celler, og som kan anvendes ved behandlingen af humane neoplastiske sygdomme. Fremgangsmåden er ejen-5 dommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

Undersøgelser over tilstedeværelsen af fysiologisk og patologisk aktive peptider i urin har været gennemført gennem de sidste 80 år. Biologisk aktive polypeptider er 10 blevet isoleret fra urin, idet polypeptiderne udviser hormonlignende aktivitet eller regulering af biologiske funktioner. Eksempler på sådanne biologiske polypeptid-forbindelser isoleret fra urin omfatter vækstfaktorer, hypofysehormoner og kininer.

15

Den praktisk taget uendelige mængde af forskellige peptider, der kan dannes ved kombination af de 20 almindelige aminosyrer, har ført til, at mange videnskabsmænd har antydet, at peptider kan udgøre et system, der bærer 20 information fra celle til celle og fra organ til organ.

På grund af den regulerende betydning af peptider har videnskabsmænd isoleret urinpeptider, der har indflydelse på blodtryk, adfærden, den cardiovasculære regulering og på den glatte muskulaturs aktivitet.

25

Derfor har mange også antaget, at neoplastisk vækst kan kontrolleres ved hjælp af naturligt forekommende biokemiske forsvarsmekanismer. Det immunologiske system er oftest blevet antaget for at udvise antineoplastisk 30 virkning (se f.eks. Aoki et al., Prog. Exp. Tumor Res., 19:23, 1974). Der er imidlertid også andre mulige mekanismer.

Det er blevet foreslået, at neoplasi er en sygdom i 35 celledifferentieringen. Når man tager det store antal forskellige celler og muligheden for fejl i differentieringsprogrammet i betragtning, kan grupper af unormalt

DK 162813 B

2 voksende celler ofte forekomme under indflydelse af carcinogene faktorer. Uden en sikker mekanisme til "normalisering" af sådanne forkert udviklede celler ville organismen ikke leve længe. En sådan mekanisme skulle 5 være i stand til at korrigere væksten af nyligt udviklede neoplastiske celler og lede dem tilbage i normal differentiering. Det antages, at peptider er ideelle forbindelser til at virke som informationsbærende molekyler, der regulerer celledifferentiering.

10

Inden for de sidste år har man beskrevet en række mellemstore peptider, der stammer fra human urin, der udviser hæmning af DNA-syntesen og mitosen i kulturer af forskellige neoplastiske celler uden signifikant hæmning 15 af den normale cellereplikation [se Burzynski, Physiol.

Chem. Phys., 5:437 (1973); Burzynski et al., Fed. Proc., 32:766 (1973); Burzynski et al., Physiol. Chem. Phys., 8:13 (1976); Burzynski et al., Fed. Proc. 35:623 (1976);

Gross et al., Physiol. Chem. Phys., 8:275 (1976); og 20 Burzynski et al., Physiol. Chem. Phys., 9:485 (1977)].

De aktive forbindelser, men hidtil uidentificerede enkelte forbindelser, fra disse fraktioner er tildelt arbejds-navnet "antineoplastoner". Man· har defineret antineopla-25 stoner som forbindelser, der frembringes af den levende organisme, som beskytter denne mod forekomsten af neoplastisk vækst ved hjælp af en ikke-immunologi sk metode, der ikke på nogen afgørende måde hæmmer væksten af normale væv.

30

De hidtil omtalte antineoplastoner har alle været af mediumstørrelse, dvs. 10-15 aminosyrerester, og deres anvendelighed overfor neoplastiske sygdomme har været forholdsvis begrænset.

Skønt visse polypeptider, der udviser antineoplastiske egenskaber, er syntetiseret (se de Barbieri et al. Boil.

35

DK 162813 B

3

Chim. Farm., 111:216, 1972), menes det ikke, at der tidligere er beskrevet små (mindre end 10 aminosyrer), lavmolekylære polypeptider, der er isoleret og identificeret fra væv eller legemsvæsker, der udviser neoplastisk 5 virkning, der er signifikant større end hæmningen af den normale cellevækst. Peptidet 3-[N-phenylacetylamino-piperidin]-2,6-dion (omhandlet i DK patentansøgning nr. 1434/91) er derfor overraskende, dels ved at dette peptid er betydeligt mindre end de hidtil kendte 10 antineoplastoner, dels ved at peptidet ikke har været tilstede i de hidtil kendte antineoplastoner af mediumstørrelse.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringes 15 lavmolekylære forbindelser (molvægt mindre end 2-5000), der kan anvendes ved behandlingen af humane neoplastiske sygdomme, og som isoleres og koncentreres fra human urin. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man fra urinen fraskiller det materiale, der har en 20 molekylvægt på mere end 5000, urinen syrnes, bundfaldet fraskilles, urinen fraktioneres på en kromatografisøjle, og en peptidfraktion med 2 til 9 aminosyrerester og en molekylvægt under 2000, som udviser antineoplastisk virkning, udvindes, hvilken fraktion indeholder 3-[N-25 phenylacetylaminopiperidin] -2,6-dion.

Ved en trinvis adskillelsesmetode syrnes urinultrafiltra-tet, filtreres atter og underkastes "high performance" væskekromatografi under anvendelse af en silicagel C-18 30 søjle. Den påviste og opsamlede fraktion i form af en refraktiv indextop efter eluering med 450 ml vand omtales som antineoplaston fraktion Al.

Ved en anden trinvis adskillelsesmetode symes urinultra-35 filtratet, filtreres atter og ledes gennem en polymer-harpiksadsorberende søjle. Eluater opsamles fra polymer-harpikssøjlen svarende til 3 gennemvaskninger efter

DK 162813 B

4 hinanden: nemlig vask med vand, med methanol og endelig med vand. De forenede eluater fra disse vaskeopløsninger syrnes og renses atter ved hjælp af C-18 bundet fase silicagelkromatografi. De farvede fraktioner, der frem-5 kommer ved en methanolafvaskning, opsamles og kombineres, hvorved de udgør antineoplastonfraktionen A2.

Ved en tredie trinvis adskillelsesmetode syrnes urin-ultrafiltratet, filtreres atter og adsorberes. på en 10 polymerharpiksadsorbent, hvorefter der elueres fra harpiksen med en alkalisk opløsning. Det alkaliske eluat syrnes til pH 2,5 og oxideres. Den oxiderede fraktion renses yderligere til antineoplastonfraktionen A3 ved adsorptionskromatografi på silicagel C-18.

15

Ved en fjerde trinvis adskillelsesmetode syrnes urinen først, hvorefter den oxideres. Den oxiderede opløsning filtreres og skilles i antineoplastonfraktion A4 ved passage gennem en silicagel C-18 kromatografifase. Den 20 med methanol eluerede farvede fraktion opsamles og betegnes antineoplastonfraktion A4.

Ved en femte trinvis adskillelsesmetode syrnes urin-ultrafiltratet, hvorefter der elueres fra silicagel C-18 25 ved hjælp af en methanoludvaskning. Den farvede del af det methanoliske eluat opsamles og betegnes antineoplastonfraktion A5.

Ifølge en yderligere udførelsesform for opfindelsen iso-30 leredes den almene komponent af hver af antineoplaston-fraktionerne indtil homogenitet under anvendelse af "high performance" væskekromatografi og tyndlagskromatografi. En fælles komponent for hver antineoplastonfraktion Al til A5 er identificeret som 3-[N-phenylacetyl-35 aminopiperidin]-2,6-dion.

DK 162813 B

5

Antineoplastonf rektionerne og 3-[N-phenylacetylamino- piperidin]-2,6-dion er værdifulde ved behandlingen af humane neoplastiske sygdomme.

5 Fig. 1 viser en kromatograf af antineoplastonfraktion Al, fig. 2 viser en kromatograf af antineoplastonfraktion A2, fig. 3 viser en kromatograf af antineoplastonfraktion A3, 10 fig. 4 viser en kromatograf af antineoplastonfraktion A4, fig. 5 viser en kromatograf af antineoplastonfraktion A5.

15 Opfindelsen beskrives nærmere ved foretrukne udførelsesformer, der er den bedste måde til at isolere, rense og fremstille urinantineoplastonfraktioner, der udviser antineoplastisk virkning.

20 Ifølge en foretrukken udførelsesform fås udgangsmaterialet til fremstilling af hver neoplastonfraktion ved at slå urin sammen fra raske individer. Typisk er den nødvendige mængde urin til med held at oparbejde de Ønskede antineoplastonfraktioner A1-A5 på 2000-3000 liter. Gode 25 udbytter ekstraheret fra 2000-3000 liter er af størrelsesordenen 100-800 g tørstof for hver af de respektive antineoplastonfraktioner. De samlede urinprøver kan lyo-filiseres til et tørt pulver, dersom ekstraktion, isolering og oprensning ikke foretages straks. Typisk udføres 30 imidlertid isoleringen og rensningen af de respektive antineoplastonfraktioner straks under anvendelse af frisk indsamlet urin.

Det skal bemærkes, at standardforholdsregler mod bakte-35 riel forurening skal foretages hele tiden, og præparaterne skal undersøges rutinemæssigt for pyrogenicitet, toxi-citet og sterilitet ved almindelige standardforsøgs-

DK 162813 B

6 metoder. Pyrogenfrit sterilt vand anvendes i alle slut-trinnene, og alle metoderne udføres ved stuetemperatur, med mindre andet er angivet.

5 A. Isolering og rensning af antineoplastonfraktion Al fra human urin

Rekonstitueret lyofiliseret urin (genopløst i afioniseret eller destilleret vand) eller frisk indsamlet urin 10 filtreres først fysisk gennem papir-, membran- eller papfiltre med en gennemsnitsporestørrelse på 3 um. Det første filtrat filtreres herefter gennem et andet filter, der har en gennemsnitsporestørrelse på 0,2 um. Disse filtreringer udføres for at fraskille opslæmmede partikler 15 eller bundfald fra urinen.

Herefter ultrafiltreres den forfiltrerede urin. Fortrinsvis udføres ultrafiltreringen gennem et hulfibersystem, fortrinsvis et Amicon- eller Romiconsystem filter, der 20 har en molekylvægtsafskæring på ca. 5000 dalton. For at ultrafiltrere kan en hvilken som helst anden ultrafiltreringsmembran eller et andet hulfiberultrafilter anvendes, der har en passende molekylvægtsafskæring i området på 5000 til 2000. Denne ultrafiltrering tjener til fjernelse 25 af materialer, der har molekylvægte på mere end 2000 til 5000 afhængig af det anvendte filter.

Ultrafiltratet syrnes med koncentreret syre, passende saltsyre eller svovlsyre, der langsomt tilsættes under 30 kraftig omrøring, indtil opløsningens pH er 2-3, fortrinsvis et pH på 2,5. Herefter filtreres det syrnede ul traf iltrat gennem et 0,2 um filter for at fjerne eventuelt udfældet findelt materiale.

35 "High performance" væskekromatografi anvendes for yderligere at rense og koncentrere den ønskede antineoplastonfraktion Al. En prøve, passende 250 ml, (idet mængden

DK 162813 B

7 naturligvis afhænger af systemets kapacitet) af det syrnede ultrafiltrat indføres i en "high performance" væskekromatografisøjle, fortrinsvis et Waters Prep 500 HPLC-system, der anvender en Prep 500 C-18 silicagel 5 søjle (siliciumoxid af bunden type). Systemet er også udstyret med en detektor for det refraktive index. Imidlertid kan en hvilken som helst metode til måling som f.eks. UV-fotometri, iondetektor eller lignende anvendes. Antineoplastonfraktion Al elueres med afioniseret eller 10 destilleret vand og karakteriseres som den peptidfraktionskomponent, der har en refraktiv indextop efter passage af ca. 450 ml vand gennem søjlen. Den fremkomne antineoplastonfraktion Al opsamles og koncentreres ved roterende inddampning under reduceret tryk, hvorefter 15 fraktionen yderligere frysetørres.

Antineoplastonfraktion Al kan anvendes i en hel række farmaceutiske former herunder, men ikke begrænset til, intravenøse, intramuskulære, subcutane, intracavitale og 20 intratumore injektioner, som kapsler og tabletter til peroral administrering, som rektale suppositorier og opløsninger og som sprays til topisk anvendelse.

B. Isolering og rensning af antineoplastonfraktion A2 25 fra human urin

Urin, der var forfiltreret og ultrafiltreret således som angivet under fremstillingen af antineoplastonfraktion Al, syrnes med koncentreret syre, fortrinsvis saltsyre.

30 Syren sattes langsomt til ultrafiltratopløsningen, medens der omrørtes kraftigt, indtil opløsningen nåede en pH-værdi på ca. 1 til 2, fortrinsvis pH 1,5.

Ultrafiltratet fra ovennævnte trin hældes herefter på en 35 kromatografisøjle indeholdende en polymerharpiksadsor-bent, fortrinsvis Amberlite® XAD-8 polymerharpiksadsor-bent, et præparat fra Rohm & Haas Co., Philadelphia

DK 162813 B

8

Pennsylvania. Et hvilket som helst andet materiale med lignende kemisk opbygning eller fysisk-kemiske egenskaber kan anvendes i stedet for Amberlite adsorbenten. De aktive antineoplastiske materialer elueres fra søjlen 5 under anvendelse af en række vaskebehandlinger, der først omfatter vask med afioniseret vand eller vand fremstillet ved omvendt osmose (Wl); en anden udvaskning med en blanding af 8% methanol i vand (rumfang/rumfang) (M); en tredie udvaskning med afioniseret vand eller vand frem-10 stillet ved omvendt osmose (W2); en fjerde udvaskning med 4% vandig natriumhydroxidopløsning (N); og en femte udvaskning med afioniseret vand eller vand fremstillet ved omvendt osmose, indtil eluatets pH er indenfor det neutrale område. Eluaterne Wl, W2 og M opsamles. pH af 15 opløsningerne Wl, W2 og M indstilles til ca. 2,5 ved dråbevis tilsætning af syre f.eks. svovlsyre.

Eluaterne Wl, W2 og M fra det forrige trin ledes gennem en kromatografisk søjle pakket med silicagel C-18 20 (silicagel af bunden fasetype), der fås fra Waters Associates, Whatman eller andre forhandlere. Søjlen vaskes først med afioniseret eller destilleret vand, og herefter elueres der med methanol. Tre brungullige fraktioner fås som bånd betegnet MW1, MW2 og MM. De 25 farvede fraktioner MW1, MW2 og MM opsamles hver for sig, og hver fraktion koncentreres på en roterende inddamper til et rumfang på én liter. Hver fraktion inddampes yderligere til tørhed enten ved roterende inddampning eller ved frysetørring. De tørre fraktioner MW1, MW2 og 30 MM er velegnede til farmaceutiske formål hver for sig eller blandet. Blandingen af disse benævnes antineoplas-tonfraktion A2, og blandingen er velegnet til farmaceutisk administrering i en hel række præparat former og ad en hel række administreringsveje således som beskrevet 35 for antineoplastonfraktion Al.

DK 162813 B

9 C. Isolering og rensning af antineoplastonfraktion A3 fra human urin

Antineoplastonfraktion A3 isoleres fra urin på samme måde 5 som beskrevet for isolering og rensning af antineoplastonfraktion A2. Forfiltrering, ultrafiltrering, syrning, XAD-8 adsorption og eluering er identisk med de behandlinger, der er beskrevet for isoleringen af antineoplastonfraktion A2.

10

Fraktion N elueret fra XAD-8-søjlen med 4% natriumhydroxid indsamles, og pH indstilles til 2,5 med syre, fortrinsvis svovlsyre. Herefter oxideres fraktion N. Oxidationen af fraktion N udføres fortrinsvis med dråbe-15 vis tilsætning af en mættet vandig opløsning af kaliumpermanganat, indtil den violette farve af kalium-permanganaten forsvinder.

Efter oxidationen filtreres fraktion N gennem et 3 um og 20 derefter gennem et 0,2 am filter, og det klare filtrat adskilles yderligere ved hjælp af C-18 kromatografi.

Dette kromatografiske trin gentages på samme måde som beskrevet for isoleringen af antineoplastonfraktionen A2.

Det farvede bånd, der er synlig på søjlen, betegnes MN og 25 elueres med methanol. Det farvede bånd MN opsamles og inddampes til tørhed eller frysetørres. Denne fraktion benæves antineoplastonfraktion A3, og den er velegnet til direkte farmaceutisk anvendelse. Antineoplastonfraktion A3 kan anvendes i samme farmaceutiske præparater og ved 30 samme administreringsmåder som angivet for antineoplastonfraktion Al.

D. Isolering og rensning af antineoplastonfraktion A4 fra human urin 35 pH-værdien af rekonstitueret eller frisk urin indstilles til 2,5 med syre, fortrinsvis svovlsyre. Herefter

DK 162813 B

10 oxideres urinen ved blanding af urinen med en mættet opløsning af kaliumpermanganat i vand, indtil kalium-permanganatens violette farve forsvinder. Efter oxidationen filtreres den behandlede urin, og det klare 5 filtrat adskilles ved C-18 kromatografi udført på samme måde som beskrevet for isolering af antineoplastonfrak-tion A2.

Det farvede bånd der er synligt på søjlen, betegnes 10 fraktion U, og denne fraktion elueres med methanol og inddampes til tørhed eller frysetørres. Fraktionen benævnt antineoplastonfraktion A4 er velegnet til farmaceutisk anvendelse i de samme farmaceutiske præparater og ad samme administrerings veje som beskrevet for anti-15 neoplastonfraktion Al.

E. Isolering og rensning af antineoplastonfraktion A5 fra human urin 20 Forfiltreringen, ultrafiltreringen og syrningen af rekonstitueret eller frisk urin gentages således som beskrevet ovenfor til fremstilling af antineoplastonfraktion Al.

Det syrnede materiale filtreres atter gennem et 0,2 urn filter for at fjerne eventuelt udfældet eller bund-25 fældet materiale. Herefter hældes filtratet på en kromatografisk søjle fyldt med C-18 bunden fasetype silicagel (der kan fås f.eks. fra Waters Associates eller Whatman). Anden silicagel eller pakkematerialer med samme fysisk-kemiske egenskaber kan anvendes i stedet for c-18 30 søjlepakkemateriale.

Søjlen vaskes først med afioniseret, destilleret vand og elueres herefter med methanol. En farvet methanolfraktion opsamles, der inddampes til tørhed eller frysetørres. Den 35 tørre fraktion benævnes antineoplastonfraktion A5. Anti neoplastonfraktion A5 er velegnet til farmaceutisk anvendelse i samme præparatformer og ad samme administrerings-

DK 162813 B

11 veje som beskrevet for antineoplastonfraktion Al.

F. Kromatografisk karakterisering af antineoplaston-fraktionerne A1-A5 5

For at identificere hver af de fremstillede antineoplas-tonfraktioner frembragtes et kromatografisk aftryk af disse. Hver af de opnåede antineoplastonfraktioner fra de ovenfor beskrevne metoder underkastedes high performance 10 væskekromatografi i et Waters Prep 500 HPLC system udstyret med en "Prep" 500 C-18 bunden fasetype silicagelsøjle og en refraktiv indexdétektor. Hver antineoplastonfraktion frembragtes ved samme række vaskeopløsninger. Først hældtes en forudbestemt mængde 15 rekonstitueret antineoplastonfraktion på søjlen. Typisk foretages rekonstitueringen af antineoplastonfraktionen med destilleret vand.

Efter påførsel af antineoplastonfraktionsprøven ledtes 20 først 1000 ml vand gennem søjlen. Denne vandvask efterfulgtes af 1000 ml af en eddikesyreopløsning med pH 2,5.

Til slut ledtes 1000 ml vand gennem søjlen og 600 ml methanol. Efterhånden som eluaterne kom ud af søjlen, målte og nedskrev detektoren det fremkomne refraktive 25 index af de komponenter, der eluerede med det udstrømmende opløsningsmiddel.

På tegningen er vist en karakteristisk kromatograf for hver af antineoplastonf rektionerne. Figurerne viser 30 relative refraktive index svarende til tilstedeværende komponenter i de elua ter, der kommer ud af søjlen ved de relative elueringsrumfang, der svarer til gennemløb af hver af opløsningsmiddelvaskeopløsningerne. For fagmanden kendt med kromatografisk fremkaldelse vil det være klart, 35 at hver kromatograf repræsenterer et mønster af topfordelinger, der er karakteristisk for en speciel blanding. En kromatograf tjener som en karakteristisk

DK 162813 B

12 aftryksanalyse af blandingen eller i dette tilfælde som en karakteristik af antineoplastonfraktionerne. Det er derfor klart, at de respektive fremstillede antineo-plastonfraktioner renset ved fremgangsmåden ifølge opfin-5 delsen vil udvise den karakteristiske kromatograf svarende til de viste figurer, dersom de fremkaldes under de ovenfor beskrevne betingelser. Det vil også være klart for fagmanden indenfor kromatografien, at den relative højde af toppene vil variere med den tilsvarende kompo-10 nentbestanddels koncentration i hver fraktion, men forde lingen af toppene vil imidlertid ikke variere væsentligt fra batch til batch af hver fraktion.

Under henvisning til fig. 1 er her afbildet en kromato-15 graf, hvori antineoplastonfraktion Al udviser en adskilt skarp top i området for første vandgennemløb. Yderligere udviser antineoplastonfraktion Al en bred topfordeling, der omfatter en række moderat definerede toppe koncentreret i området mod slutningen af eddikesyregennemløbet 20 og andet vandgennemløb. Herudover er der skarpt afgrænsede toppe, der forekommer efter 450 ml methanolgennem-løb.

Fig. 2 viser en kromatograf af antineoplastonf rakt ionen 25 A2, hvor en hel række skarpt afgrænsede tope findes i området omkring afslutningen af eddikesyregennemløbet og strækkende sig ind i området for det andet vandgennemløb. Yderligere er der skarpt afgrænsede toppe i methanolgen-nemløbet.

30

Fig. 3 viser kromatograf en af antineoplastonfraktion A3, der viser en lille top ved begyndelsen af vandgennemløbet og et koncentreret bånd af toppe i området omkring afslutningen af eddikesyregennemløbet og strækkende sig 35 ind i det andet vandgennemløb. Herudover er der velafgrænsede toppe i methanolgennemløbet.

DK 162813 B

13

Fig. 4 viser en kromatograf af antineoplastonfraktionen A4, der viser en lille top ved begyndelsen af vandgennem-løbet og en bred top opløst i eddikesyregennemløbet og det andet vandgennemløb. Yderligere er der skarpe toppe i 5 methanolgennemløbet.

Herefter viser fig. 5 en kromatograf af antineoplaston-fraktion A5. Kromatograf en viser en lille top ved begyndelsen af vandgennemløbet og en bred top, der omfatter en 10 hel række afgrænsede toppe ved afslutningen af eddikesyregennemløbet og strækkende sig ind i det andet vandgennemløb. Der er også veldefinerede toppe i methanolgennemløbet.

15 Yderligere forsøg blev foretaget for at isolere og identificere komponentdelene i hver antineoplastonfraktion. Komponentdelene i antineoplastonfrektionerne A1-A5 adskiltes ved hjælp af high performance væskekromatografi på en søjle, der var pakket med sulfoneret polystyren. Et 20 system udviklet af Glenco Scientific Inc. til amino-syreanalyse anvendtes. Elueringen udførtes med 0,2 M citratpuffer ved 3 forskellige pH-værdier nemlig 3,25, 3,80 og 4,10 og ved temperaturer fra 50 °C til 70 °C. Forandringer i puffere og temperatur kontrolleredes hver 25 for sig efter et program fra Glenco Scientific Inc. til aminosyreanalyse.

Eluaterne omsattes efterhånden som de kom ud af søjlen med ninhydrin ved 110 °C, hvorved der blev opnået absorp-30 tionstoppe, der efterhånden måltes og registreredes ved 470 im og 440 tun. For at standardisere metoden adskiltes en blanding af 18 aminosyrer for at finde tilbageholdelsestiderne herfor, der er angivet i tabel 1.

35

DK 162813 B

14 TABEL 1

Standardtilbageholdelsestider for aminosyrer 5 Tilbageholdelsestider

Aminosyrer i minutter

Asparaginsyre 18,0

Threonin 21,5 10 Serin 22,7

Glutaminsyre 26,0

Prolin 30,0

Glucin 38,4

Alanin 38,9 15 Cystein 42,0

Valin 47,0

Methionin 49,0

Isoleucin 52,2

Leucin 53,8 20 Tyrosin 59,2

Phenylalanin 64,0

Lysin 72,0

Ammoniak 78,0

Histidin 80,2 25 Arginin 93,5

Hver af antineoplastonfraktionerne A1-A5 skiltes i adskilte homogene komponenter under de samme betingelser 30 som den standardiserede aminosyreblanding. Tabel 2 opsummerer tilbageholdelsestider for de enkelte komponenter, der udgør hver af de heterogene antineoplastonfraktioner.

35

DK 162813 B

15 TABEL 2

Tilbageholdelsestid for a-aminokomponenter i antineo-plastonfraktionerne A1-A5 5 -

Antineoplastonfraktioner (mM/1 af «-amino-Tilbagehol- nitrogen delsestid ------------------ --------- .. ..

(minutter) Al A2 A3 A4 A5 10 - 10 0,12 1,57 0,24 1,97 0,20 15 0 0,78 0,05 0,82 0 26 0 0,22 0 0,75 0,13 37 2,44 0,25 0 0,59 0,08 15 48 0,12 0,47 0,30 0,77 0,20 53 0 0,12 0,04 0,43 0 63 0 0,23 0 0,63 0,10 71 0 0,17 0,07 0,30 0 76 0,13 0,14 0,45 0,87 0,13 20 79 39,50 9,39 4,44 16,35 14,88 82 0,22 1,01 0,92 1,09 0,21 85 0,07 0,62 0,65 0,45 0,14 101 0 0,01 0 0,10 0 25

Prøver af antineoplastonfraktion Al, A2, A3, A4 og A5 indeholder hverken aminosyrer eller proteiner. Toppene, der er registreret under analysen af antineoplaston-fraktionerne, svarer til de forskellige forbindelser, der 30 reagerer med ninhydrin, nemlig aminosyrederivater og peptider. Som angivet i tabel 2 er den relative koncentration af hver komponentforbindelse i den pågældende antineoplastonfraktion målt i forhold til reaktiviteten mellem ninhydrin og «-aminonitrogenet i komponentforbin-35 delsen. I overensstemmelse med den kromatografiske analyse beskrevet i dette afsnit udviser hver antineoplastonfraktion en signifikant betydende top ved en tilbage-

DK 162813 B

16 holdelsestid svarende til 79 minutter. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstiling af hver antineoplastonfraktion fås den relative koncentration af komponenten svarende til en 79 minutters tilbageholdel-5 sestid i mindst to gange den relative koncentration af andre tilbageblevne komponentforbindelser. Det skal imidlertid bemærkes, at den relative koncentration af hver komponentforbindelse, der udgør en antineoplastonfrak-tion, vil variere afhængig af urinkilden. Afhængig af 10 urinkilden vil faktisk adskillige af komponentforbindelserne i en antineoplastonfraktion ikke kunne ses. Der antydes ikke her, at hver komponentforbindelse i en antineoplastonfraktion er i besiddelse af antineoplastisk virkning, snarere at antineoplastisk virkning er demon- 15 streret for hver antineoplastonfraktion A1-A5 og for den komponentforbindelse, der er karakteriseret ved en 79 minutters tilbageholdelsestid opnået ved den ovenfor beskrevne adskillelsesteknik.

20 Den største fælles aktive komponent af antineoplastonfraktion Al, A2, A3, A4 og A5 begrænses til sidst ved hjælp af high performance væskekromatografi og tyndlagskromatografi. Denne forbindelse benævntes antineoplaston A10. Den kemiske opbygning af forbindelsen bestemtes ved 13 25 hjælp af massespektrometri, C(NMR)-spektroskopi og infrarød spektrometri. Opbygningen er afbildet nedenfor, og forbindelsen betegnes 3-[N-phenylacetyl-aminopiperi-din]-2,6-dion.

30 O A Jnh (§r

DK 162813 B

17

Opløsninger til parenteral administrering fremstilles ved at rekonstituere de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede præparater i form af natriumsalte i pyrogen-frit vand til den ønskede totalkoncentration f.eks. 100 5 mg/ml. Opløsningens pH indstilles til 7,0 med IN NaOH eller IN HC1. Sterilisering af den rekonstituerede opløsning foretages ved hjælp af filtrering således som beskrevet i USA Pharmacopeia. Materialets sterilitet afprøves således som nævnt under regler og forordninger 10 fra Food and Drug Administration, Sektion 610,12. De fremstillede sterile præparater er velegnede til paren-terale injektioner.

G. Farmaceutiske anvendelser for antineoplastonfraktio-15 neme A1-A5 og antineoplaston A10

Opløsninger til parenteral administrering fremstilles ved at rekonstituere hver af de respektive antineoplaston-fraktioner, antineoplaston A10 i pyrogenfrit vand til en 20 ønsket bekvem koncentration f.eks. 100 mg/ml. Opløs ningens pH indstilles til 7,0 med IN HC1 eller IN NaOH.

Sterilisering af den rekonstituerede opløsning foretages ved filtrering således som beskrevet i U.S. Pharmacopeia.

25 Alternativt kan de lyofiliserede pulvere af de respektive antineoplastonfraktioner først gassteriliseres f.eks. med ethylenoxid, og herefter kan pulverne indarbejdes i pyrogenfrit vand, der naturligvis selv er sterilt. Steriliteten af materialet afprøves som krævet i regler 30 og forordninger fra Food and Drug Administration, sektion 610,12. De fremstillede sterile præparater er velegnede til intravenøs, intramuskulær, subcutan, intracavital og intratumoral injektion.

35 Dersom den rekonstituerede lyofiliserede antineoplaston-fraktion ikke straks kan bruges, kan forhindring af mikrobiel forurening opnås ved at sætte forskellige anti-

DK 162813 B

18 bakterielle og antifungale midler til antineoplaston-opløsningerne som f.eks. parabener, chlorbutanol, benzyl-alkohol, phenol, sorbinsyre, thimerosal og lignende. I mange tilfælde er det ønskeligt at sætte isotoniske mid-5 ler til de injicerbare opløsninger f.eks. sukkerarter eller natriumchlorid.

Den antineoplastiske virkning af antineoplastonfraktio-nerne A1-A5 og antineoplaston A10 bedømtes først eksperi-10 mentelt ved at observere de cytostatiske virkninger, præparaterne udviste på en tumorlinie i forhold til den totale toxicitet af præparatet på forsøgsdyr. De præparater, der har den største cytostatiske virkning og den mindste toxicitet overfor dyrene, bedømtes som at have 15 den bedste antineoplastiske virkning eller terapeutiske effektivitet.

Den cytostatiske virkning af antineoplastonfraktion Al afprøvedes overfor en kultur af human carcinom af 20 brystlinien MDA-MB-231 opnået fra M.D. Anderson Cancer Institute, Houston, Texas. MDA-MB-231 er en hurtigt voksende linie af human brystcancer undersøgt af Cailleau et al., J. Natl. Cancer Inst., 53:661 (1974). Den anslåede fordoblingstid af disse celler er 18 timer, der-25 som de vokser i det originale substrat beskrevet af Beall et al., Physiol. Chem. Physics, 8:281 (1976). For kort at opsummere det foretrukne substrat og fremgangsmåden dyrkes cellerne i monolag ved 37 °C i Leibovitz L-15 substrat yderligere tilsat 20% føtal bovint serum, 1,6 30 ug/ml glutathion, 0,25 E/ml insulin, 100 ug/ml dinatrium-carbenicillin og 100 ug/ml gentamycin.

Til bioforsøg opløstes antineoplastonfraktion Al i ovenfor beskrevne substrat i fire forskellige koncentrationer 35 udvalgt tilfældigt indenfor området 0,5 til 50 mg/ml. Monolagskulturerne inkuberedes med det antineoplastonfraktion Al-holdige substrat i 96 timer. Cellerne

DK 162813 B

19 taltes visuelt med 24 timers interval. Kontrolkulturerne dyrkedes i standardsubstratet uden tilsat antineoplaston-fraktion Al.

5 Antineoplastonfraktion Al frembringer i koncentrationer på 5 mg/ml en cytostatisk virkning i sådanne humane brystcarcinomkulturer. Den cytostatiske virkning fastlægges som et stabilt antal celler (inden for grænserne fra 80% til 120%) talt efter 24 timers inkubation, og som 10 overlever i mindst yderligere 48 timer.

Den cytostatiske koncentration af antineoplastonfraktion A2-A5 og antineoplaston A10 bestemtes på samme måde som beskrevet ovenfor. Den cytostatiske koncentration for 15 hver af antineoplastonfraktionerne er følgende:

Antineoplaston Cytostatisk koncentration

Fraktion Al 5 mg/ml 20 Fraktion A2 5 mg/ml

Fraktion A3 5 mg/ml

Fraktion A4 2 mg/ml

Fraktion A5 2 mg/ml A10 2 mg/ml 25

Over disse koncentrationer udviser alle antineoplastonfraktionerne cytotoxisk virkning i humane brystcarcinom kulturer.

30 Akut toxicitetsundersøgelser på forsøgsdyr afslører, at antineoplastonfraktion Al har særdeles lav toxicitet.

F.eks. giver forsøg med 25 HA/ICR schweiziske mus injiceret intraperitonealt med antineoplastonfraktion Al en LD50 på 1,35 g/kg. Ved autopsi og mikroskopiske under-35 søgelser af væv fra dyrene, der døde under forsøget, afsløredes kongestion af leveren og udpræget pulmonært ødem. De dyr, der overlevede, holdtes en uge under nøje

DK 162813 B

20 observation og viste sig at udvise normal adfærd. Efter en uges forløb aflivedes et antal af musene. Ved autopsi og mikroskopiske undersøgelser af vævene fra disse dyr viste disse sig identiske med vævene fra kontroldyrene, 5 der var individer uden indsprøjtet materiale..

Akut toxicitetsundersøgelser over antineoplastonfraktio-neme A2-A5, antineoplaston A10 udførtes på samme måde som beskrevet ovenfor. De respektive LD,_q for mus for 10 hver fraktion var følgende:

Antineoplaston L^50

Fraktion Al 1,35 g/kg 15 Fraktion A2 3,55 g/kg

Fraktion A3 3,55 g/kg

Fraktion A4 5,33 g/kg

Fraktion A5 5,11 g/kg A10 10,33 g/kg 20 H. Klinisk bedømmelse af antineoplaston

Definitionerne på bedring i forbindelse med neoplastiske sygdomme er følgende: fuldstændig bedring er forsvinden 25 af alle kliniske tegn på sygdommen, og delvis bedring er reduktion på mindst 50% af summen af to målte på hinanden vinkelret stående diametre af målte tumorer, der varer mindst fire uger. Patienter betragtes som stabiliserede, dersom der sker målelig tumortilbagegang, selv om den 30 ikke opfylder kriterierne for delvis bedring.

Man behandlede således humane neoplastiske sygdomme med forskellige antineoplastonfraktioner. For hver undersøgt neoplastisk sygdom fandtes hver afprøvet antineoplaston-35 fraktion og antineoplaston A10 virksomme i en vis udstrækning til at hjælpe aftagen af tumorer. Det blev observeret, at visse fraktioner eller præparater udviste

DK 162813 B

21 større effektivitet overfor visse former af neoplasi end andre fraktioner.

Dosis af den valgte antineoplastonfraktion til behandling 5 af den neoplastiske tilstand afhænger af patientens alder, vægt og tilstand, specielt af den neoplastiske sygdom og dens sværhedsgrad og af administreringsvejen.

En dosis på fra ca. 0,5 til ca. 12 g/m /24 timer eller en totaldosis på fra ca. 0,9 til ca. 20 g indgivet i opdelte 10 doser i indtil seks gange om dagen udgør et effektivt behandlingsområde for de fleste neoplastiske sygelige tilstande for en hvilken som helst af antineoplaston-fraktionerne A1-A5 og antineoplaston A10.

15 EKSEMPEL 1

For at undersøge virkningen behandledes 14 patienter med fremadskreden cancer med antineoplastonfraktion A2 og fulgtes indtil et år efter behandlingens påbegyndelse.

20 Den foretrukne administreringsmåde for præparatet var intravenøs injektion indgivet hver 12 timer gennem et kateter indstukket i den subclaviale vene. Direkte intra- pleurale eller intraperitoneale injektioner kan også 2 gives. Gennemsnitsdosis var 0,85 g/m og maksimum var 2,2 2 25 g/m intravenøst hver 12. time. Fuld dosis intravenøs behandling med antineoplastonfraktion A2 indgaves sædvanligvis indtil fuldstændig bedring opnåedes og fortsattes herefter i mindst 6 uger for at udslette eventuel tilbagebleven i mikroskop synlig sygdom. Herefter ophørte 30 de intravenøse injektioner, og der påbegyndtes en vedligeholdelsesbehandling. Vedligeholdelsesbehandlingen bestod af intramuskulære injektioner på 2 til 3 ml 50 mg/ml antineoplastonfraktion A2 til at begynde med indgivet hver anden dag. Dersom der ikke atter dukkede tegn op på 35 cancer, reduceredes hyppigheden af intramuskulære injektioner hver 6.-8. uge, idet behandlingen startede med en injektion hver tredie dag og afsluttedes med en injektion

DK 162813 B

22 en gang om ugen.

Inden for gruppen af de 14 patienter behandlet med anti-neoplastonfraktion Ά2 opnåedes fire tilfælde af fuld-5 stændig bedring. Disse fire tilfælde omfattede udifferen-tieret storcellecarcinom i lungen, stadium III (T3N0M0); dårligt differentieret metastatisk carcinom i leveren med ukendt primær oprindelse; og to tilfælde genopstået over-gangscellecarcinom i blæren, grad II. I et yderligere 10 tilfælde, der bestod af brystadenocarcinom med adskillige knogle- og levermetastaser, trin IV (TONOMIOSS, HEP) opnåedes fuldstændig bedring af de store levermetastaser og stabilisation af knoglemetastaserne. Der var også et yderligere tilfælde af overgangscellecarcinom i blæren, 15 grad II, i hvilket tilfælde der opnåedes fuldstændig bedring ved hjælp af antineoplastonfraktion A2. I dette tilfælde indgaves antineoplastonfraktion A2 som en vedligeholdelsesbehandling, efter at fuldstændig bedring var opnået med antineoplaston A2.

20

Delvis bedring opnåedes i tre tilfælde: peritoneal meso- theliom; brystcarcinom med adskillige knoglemetastaser, stadie IV, TONOMIOSS; og squamøs cellecarcinom i oesophagus med adskillige lungemetastaser, trin III, 25 T3N0M1PUL.

Stabilisering af sygdommen opnåedes i fire tilfælde, der omfattede glioma, trin IV; adenocarcinom af nyren med adskillige lungemetastaser; brystcarcinom med adskillige 30 knoglemetastaser, trin IV TONOMIOSS; og brystcarcinom med lymfeknudekomplikationer, trin IV, T0N3M0.

Det totale respons over for behandlingen med antineoplastonfraktion A2 er 93%, idet kun en patient (7%) viste 35 fortsat fremadskridende sygdom. Behandlingen tåles særde les vel. Der ses få bivirkninger herunder stimulering af epidermisvækst, stimulering af knoglemarv og sjældent

DK 162813 B

23 feber. Stimulering af epidermisvæksten sås efter 3 ugers behandling i form af en hurtigere vækst af neglene og en tykkere hud på håndfladerne. Stimulering af knoglemarv sås som forhøjede hvide blodlegemetal og blodpladetal.

5 Disse bivirkninger er af positiv virkning i de fleste tilfælde, fordi dårlig opheling af huden og myelosuppres-sion er et stort problem hos mange cancerpatienter.

EKSEMPEL 2 10 Følgende sygehistorie illustrerer en positiv metode til behandling under anvendelse af antineoplastonfraktion A3 ved behandlingen af prostatadenocarcinom med knoglemetastaser, trin IV (RONOMIOSS, G3).

15

Behandling af en 72 årig hvid mandlig patient påbegyndtes med antineoplaston A, et mediumstørrelsepeptid (10-15 aminosyrer) med molvægt mellem 1000 og 1500 (se Burzynski et al, Physiol. Chem Phys. 9:485, 1977), i tre måneder.

20 Begyndelsesbehandlingen med antineoplaston A bevirkede stabilisering af sygdommen og en vis ikke sikker nedgang af metastasernes størrelse.

Efter tre måneders forløb blev antineoplaston A behand- 25 lingen afbrudt, og man påbegyndte en behandling af patienten med antineoplastonfraktion A3. Patienten fik først en injektion på 1 ml antineoplastonfraktion A3, 100 mg/ml indgivet gennem et subclavialt kateter efterfulgt af 3 ml normalt saltvand og 250 enheder heparin. Dosen 30 øgedes yderligere til 5 ml af samme præparat, der indgaves intravenøst hver 12. time. En sådan behandling 2 svarer til en dosis på 0,47 g/m /24 timer. Efter ca. 7 måneders forløb nedsattes injektionernes hyppighed til 2 ml antineoplastonfraktion A3, 100 mg/ml indgivet intra-35 muskulært hver tredie dag, og efter 4 måneders forløb nedsattet dosis yderligere til 2 ml præparat administreret intramuskulært en gang om ugen.

DK 162813 B

24

Behandlingen med antineoplastonfraktion A3 bevirkede en fuldstændig bedring af knoglemetastaserne, hvilket kunne ses ved knoglescanning. Behandlingen tåltes særdeles vel uden tilsyneladende bivirkninger.

5

Patienten er stadig i vedligeholdelsesbehandling med antineoplastonfraktion A3, og der har ikke vist sig nogen genopblussen af cancer på nuværende tidspunkt.

10 Brugen af de omhandlede antineoplastonfraktioner A1-A5 og antineoplaston A10 anvendtes med held ved bedringen af tumorer i forbindelse med human oesophaguscancer, brystcancer, blærecancer, coloncancer, storcellet udifferen-tieret carcinom i lunger, mesothelioma, adenocarcinoma og 15 squamøs cellecarcinom i lunger, havrecellecarcinom (et anaplastisk small-cellecarcinom), hjernemetastaser, knoglemetastaser, lungemetastaser, prostatacancer, pancreas-cancer, lymphatisk lymphoma, cancer i cervix uteri og primær malign hjernetumor.

20

Yderligere er hvert af antineoplastonfraktionerne A1-A5 og antineoplaston A10 værdifulde ved behandlingen af andre former for neoplastiske sygdomme herunder myelo-cytisk leukæmi, larynx cancer, uteruscancer, lymphoma og 25 cancer i colon og sigmoidcolon.

30 35

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et præparat til at 5 hæmme væksten af neoplastiske celler i en værtsorganisme, der lider af neoplastisk sygdom, ved hvilken fremgangsmåde der fra urin udvindes en antineoplastisk peptidfraktion, kendetegnet ved, at man fra urinen fraskiller det materiale, der har en molekylvægt på mere 10 end 5000, urinen syrnes, bundfaldet fraskilles, urinen fraktioneres på en kromatografisøjle, og en peptidfraktion med 2 til 9 aminosyrerester og en molekylvægt under 2000, som udviser antineoplastisk virkning, udvindes, hvilken fraktion indeholder 3-[N-phenylacetylaminopiperi-15 din]-2,6-dion.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at urinen syrnes inden fraktioneringen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fraktioneringen udføres ved hjælp af kromatografiske fraktioneringsanordninger.

4, Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at den kromatografiske fraktionering omfatter påfør- sel af urin på en kromatografisk søjle indeholdende polymerharpiks, C-18 bundet fasesilicagel eller sulfoneret polystyren.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at urinen oxideres inden fraktioneringen. 35