-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
1. Gebiet
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen,
die Antineoplastonagentien umfassen.
-
2. Beschreibung des Stands
der Technik
-
Die
Antineoplastonagentien sind eine Familie von natürlich vorkommenden, nicht toxischen
Verbindungen, von denen angenommen wird, daß sie eine Rolle bei Gesundheit
und Krankheit durch Herstellen und Bewahren zellulärer Differenzierung
spielen. Antineoplastonagentien werden gegenwärtig chemisch synthetisiert,
wurden jedoch anfänglich
als natürliche
Bestandteile von Körperfluiden
isoliert und charakterisiert. Unter anderem schließen Mitglieder
der Antineoplastonfamilie 3-Phenylacetyl-amino-2,6-piperidindion (CN)
und Hydrolysederivate von CN: Phenylacetylglutamin (PG) und Iso-Phenylacetylglutamin
(Iso-PG) und Phenylacetat (PN) ein.
-
Die
drei Hauptformen der Antineoplastontherapie, bezeichnet als AS2-1-,
A-10- und CN-Therapien, werden
gegenwärtig
bezüglich
einer antineoplastischen Effizienz in klinischen Untersuchungen
der Phase II in mehreren Zentren eingestuft. AS2-1 enthält ein 8:1-Molverhältnis von
PN und L-PG und kann entweder intravenös oder oral verabreicht werden.
-
Eine
A-10-Therapie enthält
ein Molverhältnis
von PG und Iso-PG von 4:1 und wird intravenös verabreicht. Jede der A-10-Komponenten
ist racemisch und optisch inaktiv. CN-Therapie ist eine Monotherapie, die aus
racemischem (optisch inaktivem) CN besteht, das oral verabreicht
wird.
-
In-vitro-Dosis-Ansprechungsuntersuchungen
für die
einzelnen Komponenten der Antineoplastontherapie zeigen, daß, auf einer
molaren Basis, CN die potenteste antineoplastische Aktivität aufweist.
Ein problematisches Merkmal von CN ist jedoch, daß seine
Löslichkeit
die höchste
testfähige
Konzentration auf ~0,8 mM beschränkt.
Bei dieser Konzentration erzeugt CN lediglich eine 50%ige Unterdrückung des
Zellwachstums. Die anderen, weniger potenten Antineoplastonagentien
weisen eine höhere
Löslichkeit
auf, und dies ermöglicht, daß ihre intrinsisch
geringere Potenz durch höhere
Konzentrationen (z.B. 30 mM) ausgeglichen wird. Als ein Ergebnis
dieser höheren
Konzentrationen erzeugen die weniger aktiven Antineoplastonagentien
(auf einer molaren Basis) eine vollständigere Unterdrückung des
Zellwachstums. Die einzigartigen nicht-toxischen Eigenschaften der
löslichen
Antineoplastone ermöglichen,
daß Plasmagehalte
auf ein Gehalt deutlich oberhalb desjenigen erhöht werden können, das benötigt wird,
um ein in-vitro-Zellwachstum zu unterdrücken. Mit den weniger löslichen
Antineoplastonen, wie CN, kann diese Strategie jedoch nicht eingesetzt
werden, und alternative Verfahren müssen entwickelt werden, um
die CN-Löslichkeit
und die zelluläre
Aufnahme zu erhöhen.
-
WO-A-9116309
offenbart Phenylacetylaminopiperidin-2,6-dion als ein cytostatisches
und antineoplastisches Agens.
-
EP-A-0393575
offenbart eine Kombination von Carbetimer mit einem oder mehreren
antineoplastischen Agentien.
-
WO-A-9324123
offenbart eine Behandlung von Virusinfektionen unter Verwendung
von Phenylacetylglutamin und Phenylacetat.
-
WO-A-9204027
offenbart die Behandlung von Virusinfektionen unter Verwendung von
Phenylacetylglutamin, Phenylacetylamino-piperidin-2,6-dion und Isophenylacetylglutamin.
-
WO-A-9204043
offenbart die Behandlung der Parkinsonkrankheit unter Verwendung
von Phenylacetylpiperidin-2,6-dion.
-
Xiang
et al., J. Pharm. Sci., 84, 1308–1315 (1995) offenbart Phenylessigsäure, eingeschlossen
in liposomalen Vesikeln.
-
Marjan
et al., Biotech Adv., 14, 151–175
(1996) betrifft lang zirkulierende Liposomen.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen,
die ein Antineoplastonagens in liposomaler Formulierung umfassen.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen, die durch die vorliegende Erfindung
bereitgestellt werden, sind Antineoplastontherapien mit beträchtlich
verbesserter antineoplastischer Aktivität. Teilweise resultieren diese
Zunahmen der antineoplastischen Aktivität von größeren Zunahmen der Geschwindigkeit
des Transports der Antineoplastonagentien in die Zellen. Wichtig
und unerwarteter Weise resultieren diese Zunahmen der antineoplastischen
Aktivität
ebenfalls aus der Kapazität
des Arneimittelliefersystems, um intrazellulären Handel von Antineoplaston
auf intrazelluläre
Bindungsstellen unter Beeinflussung der Zelllebensfähigkeit
und der Proliferation zu richten.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt liposomale Formulierungen von Antineoplastonagentien
von 3-Phenylacetyl-amino-2,6-piperidindion (CN) und Hydrolysederivaten
von CN:Phenylacetyl glutamin (PG) und Iso-Phenylacetylglutamin (Iso-PG)
und Phenylacetat (PN) bereit, die eine antineoplastische in-vitro-Aktivität um einen
Faktor von 750 bis 1500 erhöhen.
Zusätzlich
erhöhen
diese liposomalen Formulierungen eine zelluläre Aufnahme von Antineoplastonagentien
vom 30- auf mehr als das 80-fache. Die liposomalen Formulierungen
der vorliegenden Erfindung erhöhen
intrazelluläre
Gehalte des Antineoplastons CN durch Richten von CN auf intrazelluläre Bindungsstellen,
die seine Hydrolyse blockieren und eine Zelllebensfähigkeit
und Proliferation beeinflussen. Unter Bedingungen, wo freies CN
keine antineoplastische Aktivität
aufweist, kann liposomal formuliertes CN eine vollständige und
verhältnismäßig lang
andauernde Blockade des Zellwachstums erzeugen.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Die
folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung
und sind eingeschlossen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung
weiter zu veranschaulichen. Die Erfindung kann durch Bezugnahme
auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der
detaillierten Beschreibung der hierin dargelegten spezifischen Ausführungsformen
besser verstanden werden.
-
1 zeigt
den Zeitverlauf der zellulären
Aufnahme von freiem L-CN in BT-20-Zellen.
-
2 zeigt
den Zeitverlauf der zellulären
Aufnahme von freiem D-CN in BT-20-Zellen.
-
3 zeigt
den Zeitverlauf der zellulären
Aufnahme von freiem PN in BT-20-Zellen.
-
4 zeigt
den Zeitverlauf der zellulären
Aufnahme von freiem L-CN in BT-20-Zellen.
-
5 zeigt
die Konzentrationsabhängigkeit
der zellulären
Aufnahme von freiem L-CN und PN in BT-20-Zellen.
-
6 zeigt
den Zeitverlauf der zellulären
Aufnahme von freiem und liposomalem CN in BT-20-Zellen.
-
7 zeigt
den Zeitverlauf von gebundenen Antineoplastonen in BT-20-Zellen.
-
8 zeigt
den Zeitverlauf von freien Antineoplastonen in BT-20-Zellen.
-
9 zeigt
den Zeitverlauf der BT-20-Zellzahlen nach keiner Behandlung oder
Behandlung mit liposomalem und nicht-liposomalem CN.
-
10 zeigt
den Zeitverlauf von intrazellulär
gebundenem PG, gebundenem CN und BT-20-Zellzahl folgend einer Behandlung
mit liposomalem CN.
-
11 zeigt
die Konzentrationsabhängigkeit
der Zellzahlen von menschlichen Neuroblastom-Zellen folgend einer
Behandlung mit freiem A-10, liposomalem A-10 oder leeren Liposomen.
-
12 zeigt
die Konzentrationsabhängigkeit
von Zellzahlen von menschlichen Glioblastom-Zellen folgend einer
Behandlung mit freiem A-10, liposomalem A-10 oder leeren Liposomen.
-
13 zeigt
die Konzentrationsabhängigkeit
der Zellzahlen folgend einer Behandlung mit freiem oder liposomalem
AS2-1.
-
14 zeigt
die zelluläre
Aufnahme von freiem PN und PG.
-
15 zeigt
die zelluläre
Aufnahme von liposomalem PN und PG.
-
16 zeigt
die antineoplastische Wirkung von freiem PN und PG.
-
17 zeigt
die antineoplastische Wirkung von liposomalem PN und PG.
-
BESCHREIBUNG
VON VERANSCHAULICHENDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen,
die ein Antineoplastonagens in einer liposomalen Formulierung umfassen.
-
Antineoplastone
sind eine Familie von natürlich
vorkommenden, nicht toxischen Verbindungen, von denen angenommen
wird, daß sie
eine Rolle bei Gesundheit und Krankheit durch Erzeugung und Bewahrung von
zellulärer
Differenzierung spielen. Unter anderem schließen Mitglieder der Antineoplastonfamilie
3-Phenylacetyl-amino-2,6-piperidindion (CN):
Hydrolysederivate von CN,
Phenylacetylglutamin (PG):
Iso-Phenylacetylglutamin
(Iso-PG):
und Phenylacetat (PN):
ein.
-
Ebenfalls
als Antineoplastonagentien sind deren pharmazeutisch annehmbare
Salze eingeschlossen. „Pharmazeutisch
annehmbare Salze" bedeutet
Salze mit der biologischen Aktivität der Stammverbindung und unter
Ermangelung ungewöhnlicher
toxischer Aktivität
bei den ausgewählten
Verabreichungsgehalten. Solche Salze schließen ein, sind jedoch nicht
begrenzt auf anorganische Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze, organische
Diethanolamin-, Cyclohexylamin- und Aminosäuresalze.
-
Liposomale
Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können durch irgendein Verfahren
hergestellt werden, das Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, wie
solche, die von Bangham et al. (1965, J. Mol. Biol. 13: 238–252), Papahadjopoulos
und Miller (1967, Biochim, Biophys. Acta. 135: 624–638), Science
267: 1275 (1995) beschrieben werden, und solche, die in den U.S.
5,288,499; 4,766,045; 4,224,179; und 4,235,871 beschrieben werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Liposomenformulierung liegt darin,
ein Phospholipid in einem organischen Lösungsmittel zu suspendieren,
welches dann zur Trockene verdampft wird und einen Rückstand
von Phospholipid an dem Reaktionsbehälter zurücklässt. Eine geeignete Menge einer
wässrigen
Phase wird dann zugegeben, die Mischung kann „aufquellen", und die resultierenden
Liposomen, welche aus multilamellaren Vesikeln (im folgenden bezeichnet
als MLVs) bestehen, werden durch mechanische Mittel dispergiert.
-
Die
Antineoplastonagentien der vorliegenden Erfindung werden zu der
Lipidzusammensetzung vor der Verdampfung zugegeben. Die Antineoplastone
können
in einem heißen
Alkohol (z.B. Methanol) löslich
gemacht werden und zu der Lipidzusammensetzung zugegeben werden.
Die Menge der aktiven Verbindung in dem Liposom wird abhängig von
der lipophilen Natur der aktiven Verbindung(en), der verwendeten
Verbindungen, um das Liposom herzustellen, ebenso wie der Größe und der
Stabilität
des Liposomen variieren. Im allgemeinen wird das Molverhältnis von
Antineoplaston zu Lipid zwischen etwa 1:0,1 und 1:100, bevorzugt
zwischen etwa 1:1 und 1:10 sein. Für PG liegt das bevorzugte Verhältnis bei
etwa 1:3, und für
CN liegt das bevorzugte Verhältnis
bei etwa 1:1. Die optimale Größe der Liposomen
wird abhängig
von dem therapeutischen Ziel variieren, jedoch liegt die bevorzugte
Größe zwischen
0,1 und 100 Mikrometer. Die bevorzugte Größe ist 0,1 bis 0,5 Mikrometer.
-
Liposomen
können
aus irgendeinem oberflächenaktiven
Mittel oder Kombinationen von oberflächenaktiven Mitteln hergestellt
werden, jedoch sollten sie pharmazeutisch annehmbar sein. Das heißt, die
oberflächenaktiven
Mittel sollten keinen schädlichen
Effekt auf den Wirt, auf den sie zu verabreichen sind, aufweisen oder
zeigen. Geeignete oberflächenaktive
Mittel sind beispielsweise ternäre
oder komplexe Lipide, Glyceride, Ceride, Etholide und Steride, nämlich eine
von mehreren Verbindungen, wobei die hydrophile Gruppe Phosphat,
Carboxylat, Sulfat, Amino, Hydroxyl oder Cholin ist; und wobei die
lipophile Gruppe Alkyl oder Alkylenyl, Polyoxyalkylen oder eine
mit wenigstens einer aromatischen oder Cycloalkylgruppe substituierten
Alkylgruppe ist.
-
Bevorzugte
oberflächenaktive
Mittel sind Phospholipid verwandte Materialien, wie Lecithin, Phosphatidylethanolamin,
Lysolecithin, Lysophosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol,
Sphingomyelin, Cephalin, Cardiolipin, Phosphatidsäure, Cerobroside,
Dicetylphosphat, Phosphatidylcholin und Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin.
Zusätzlich
sind nicht Phosphor enthaltende Lipide beispielsweise Stearylamin, Dodecylamin,
Hexadecylamin, Cetylpalmitat, Glycerylrizinoleat, Hexadecylstearat,
Isopropylmyristat, amphotere Acrylpolymere, Triethanolamin-Laurylsulfat,
Alkoyl-arylsulfonate, polyethoxylierte Fettsäureamide und dergleichen.
-
Verschiedene
Additive können
mit dem oberflächenaktiven
Mittel kombiniert werden, um so dessen Permeabilitätseigenschaften
oder die oberflächliche
Ladung der Liposomen zu modifizieren. Veranschaulichende Additive
schließen
langkettige Alkohole und Diole; Sterole, wie Cholesterol; langkettige
Amine und deren quartäre
Ammoniumderivate; Dihydroxyalkylamine; polyoxyethylenierte Fettamine;
Ester von langkettigen Aminoalkoholen, deren Salze und quartäre Ammoniumderivate;
Phosphorester von Fettalkoholen, wie Natriumdicetylphosphat; Alkylsulfate,
wie Natriumcetylsulfät;
bestimmte Polymere, wie Polypeptide; Kohlenhydrate; und Proteine
ein. Das Verhältnis
von Additiv zu Lipid wird mit dem Additiv variieren (z.B. für Cholesteroladditiv liegt
das Gewichtsverhältnis
im allgemeinen zwischen etwa 0,01 bis 20 und liegt bevorzugt zwischen
etwa 0,1 und 2; für
Kohlenhydratadditiv liegt das Gewichtsverhältnis im allgemeinen zwischen
etwa 0,01 bis 1 und ist bevorzugt etwa 0,05 bis 1.).
-
Die
wässrige
Lösung,
die zu der verdampften Lipidzusammensetzung zugegeben wird, ist
im allgemeinen eine Pufferlösung,
wie eine gepufferte Salzlösung.
Die Liposomen werden dann durch mechanische Mittel dispergiert,
wie durch Schütteln
der Lösung
mit Glaskugeln. Die endgültige
Größe der Liposomen
wird durch das Verfahren der Filtration unter Verwendung von Filtern
mit erforderlichen Porendurchmessern hergestellt.
-
Die
aktive Verbindung (z.B. CN, PG, PN, Iso-PG), entweder einzeln oder
Kombination (z.B. A-10 enthaltend geeignete Molverhältnisse
von PG:Iso-PG (z.B. 0,4:1,0 bis 40,0:1,0; bevorzugtes Verhältnis 4:1)
oder AS2-1 enthaltend geeignete Molverhältnisse von PN:PG (z.B. 0,8:1
bis 80,0:1, bevorzugt 8:1), sind in einem pharmazeutisch geeigneten
Träger
(bevorzugter Träger
= multilamellare oder einlamellare oder sterisch stabilisierte Liposomen,
Cremes, Öle
und Gele) in einem Verdünnungsmittel
(bevorzugt solche wie phosphatgepufferte oder isotonische Salzlösungen oder
Gelöle
oder Cremes) in einer Menge eingeschlossen, die ausreichend ist,
um einen inhibitorischen oder therapeutischen Effekt auf Erkrankungen
auszuüben,
wie bösartiges Melanom
oder Krebs des Gehirns, Knochens, Brust, Leber, Prostata, Eierstock,
Cervic, Bauchspeicheldrüse, Niere,
periphere Nerven, Magen-Darm-Trakt,
Kopf, Nacken, Nebenniere, Blase, Hirnhaut, Choroidplexus, Weichgewebe
oder Hodgkinsches oder Nicht-Hodgkinsches Lymphoma, oder Viruserkrankung
(HIV), Autoimmumerkrankung, lymphozytische Erkrankung, neuroendokrine
Erkrankung, profilerative Erkrankung der Haut bei Menschen und Tieren,
oder Störungen
des Gehirndopaminsystems, wie Parkinsonsche Krankheit, Alzheimer
oder Schizophrenie.
-
Die
aktiven Materialien können
in irgendeiner geeigneten Weise verabreicht werden, beispielsweise oral,
parenteral, intrazerebroventrikal, intrathekal, intravenös, intradermal,
subkutan, intraarteriell, intraperitoneal, nasal, rektal, vaginal
oder topisch. Die intravenöse
Weise der Verabreichung ist bevorzugt.
-
Die
Konzentration der aktiven Verbindung(en) in der Arzneimittelzusammensetzung
und ihr Verabreichungsmuster wird von den Absorptions-, Inaktivierungs-
und Ausscheidungsgeschwindigkeiten der aktiven Verbindung und ihres
Trägers
abhängen.
Andere Fachleuten auf dem Gebiet bekannte Faktoren werden ebenfalls
die Konzentration der aktiven Verbindung(en) beeinflussen. Die Arzneimittelzusammensetzung
kann auf einmal oder aufgeteilt in eine Anzahl von kleineren Dosen,
verabreicht zu variierenden Zeitintervallen, verabreicht werden.
Dosisveränderungen
werden verstanden, als daß sie
abhängig
von der Schwere der Bedingungen, individuellen Erfordernisse und
professioneller Beurteilung durch den Arzt verändert werden. Blutgehalte, die
erforderlich sind, um therapeutische Effekte zu erzeugen, werden
erwartet, um zwischen 0,01 und 100 mM zu liegen, wobei der bevorzugte
Blutgehalt zwischen 1 und 50 mM liegt.
-
Die
in den Beispielen unten dargestellten Ergebnisse zeigen klar, daß liposomale
Formulierungen von Antineoplastonen verwendet werden können, um
eine zelluläre
Aufnahme und antineoplastische Aktivität stark zu erhöhen.
-
Die
folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte von Fachleuten auf dem
Gebiet verstanden werden, daß die
in den folgenden Beispielen offenbarten Methoden Methoden darstellen,
die von den Erfindern aufgefunden worden sind, um bei der Praxis der
Erfindung gut zu funktionieren und somit erachtet werden können, um
bevorzugte Vorgehensweisen für ihre
Praxis zu bilden.
-
BEISPIEL 1
-
Herstellung von liposomal
formulierten Antineoplastonen
-
3-Phenylacetyl-amino-2,6-piperidindion
(CN), Phenylactat (PN), Phenylacetylglutamin (PG), Antineoplaston
A-10 (enthaltend PG:Iso-Phenylacetylglutamin (Iso-PG) in einem Molverhältnis von
4:1) oder Antineoplaston AS2-1 (enthaltend PN:PG in einem Molverhältnis von
8:1) wurden in 5–10
ml heißem
Methanol (55°C)(Mallincrodt)
löslich
gemacht und zu einer Mischung enthaltend ein molares Verhältnis von
Eier-L-Lecithin und Cholesterol (Sigma) in einem molaren Verhältnis von
1:1, aufgelöst
in 5 ml einer 2:1 (v/v) Mischung aus Methanol und Chloroform (Aldrich),
zugegeben. Da die vorherigen Optimierungsstudien bestimmt haben, daß ein molare
Verhältnis
von Testagens:Lipid von 1:3 einen Verbindungseinschluß maximiert
und die Bildung von leeren Liposomen minimiert, wurde dieses Verhältnis in
diesen Beispielen verwendet. Frühere
Arbeiten unter Verwendung von menschlichen Neuroblastom (SK-N-MC)
und menschlichen Glioblastom-Zellen (U-118-MG), um die antineoplastische Wirkung
von liposomalem A-10 zu untersuchen, wurden mit Liposomen durchgeführt, die
unter Verwendung eines Verhältnisses
von Arzneimittel:Lipid von 1:30 hergestellt wurden.
-
Die
Testagens-Lecithin-Cholesterol-Mischung wurde zur Trockene in einem
250 ml Rundkolben-Rotationsverdampfer (100 mM hg; 40–45°C; 2 Stunden)
verdampft und wässrige
multilamellare liposomale Vesikel wurden durch Zugabe von 20 ml
einer phosphatgepufferten Salzlösung
(PBS) hergestellt und sorgsam mit Glaskugeln geschüttelt.
-
Die
Gehalte an liposomal eingeschlossener Verbindung wurden durch Reiben
der Liposomen mit Chloroform, Verdampfen des Chloroforms und Resuspendieren
des Testagens in Dimethylformamid (DMF) bestimmt. Der Gehalt an
Testagens, der einem liposomalen Einschluß entwich, wurde durch Waschen
der liposomalen Zubereitung dreimal in PBS (Zentrifugation 15 k × g; 20
Minuten; 4°C)
und Analysieren der Wäsche mit
einem standardisierten und anerkannten HPLC-Verfahren (C-18-Säule und
ein Methanol:HOH:Essigsäure (25:75:1
(v/v)) Lösungsmittelsystem)
bestimmt.
-
Der
Zeitverlauf und die Konzentrationsabhängigkeit der zellulären Aufnahme
von freien und liposomal formulierten Antineoplastonagentien in
den Beispielen 2, 3 und 4 wurden durch überwachende Reduktionen in
Medienkonzentrationen untersucht. Die Aufnahme dieser Antineoplastonagentien
wurde in menschlichen Brustkrebszellen BT-20 überprüft.
-
BEISPIEL 2
-
Zelluläre Aufnahme
von freiem und liposomalen D- und L-CN
-
Eine
zelluläre
Aufnahme von freiem D- und freiem L-CN (3-Phenylacetyl-amino-2,6-piperidindion) wurde
in BT-20-Zellen untersucht. Zellen wurden in 200 μl Medium
(3.000 Zellen/Bohrung, Platten mit 96 Bohrungen) plattiert und 24
oder 96 Stunden später
wurde das Plattierungsmedium mit frischem Medium ersetzt, enthaltend
freies CN mit Endkonzentrationen von 100, 300, 500, 800 μM. Die Gehalte
an CN, die in dem Medium verblieben, wurden folgend 0, 2, 4, 6,
8, 24, 48 und 72 Stunden nach Inkubation bestimmt. Wenn die zelluläre Aufnahme
der liposomalen Antineoplastone bestimmt wurde, waren die Gesamtgehalte
an Liposomen über alle
Gehalte der Testagentien äquivalent.
Einlaminare liposomale Vesikel enthaltend Antineoplastonagentien wurden
innerhalb von 24 Stunden eines Experiments durch Passieren von multilamellaren
Vesikeln durch einen 0,2 μm
Filter für
mehrere Male hergestellt. Die einlaminaren Vesikel wurden dann zum
Medium in der geeigneten Konzentration zugegeben und unter Verwendung
eines 0,2 μm
Filters sterilisiert.
-
Zur
angegebenen Zeit nach der Zugabe der Testverbindung wurde das Medium
geerntet, zentrifugiert (110 × g;
10 min; 4°C)
und die überstehende
Flüssigkeit
bei –70°C gelagert,
bis sie unter Verwendung einer validierten HPLC-Methode analysiert
wurde. Für
jedes Testagens wurden alle Konzentrationen zu allen Zeitpunkten
getestet, und es gab sechs Replizierbohrungen für jeden Zeitpunkt. Medien von
den Replizierbohrungen wurden für
die HPLC-Analyse zusammengegeben. Verbindungsgehalte wurden mit
wenigstens zwei HPLC-Injektionen
bestimmt, und die Varianz zwischen den Injektionen war weniger als
10%.
-
Um
zu verifizieren, daß die
Reduktionen der Mediumtestagenskonzentrationen mit einer zellulären Aufnahme
(und nicht mit dem Abbau des Testagens durch Enzyme, abgegeben von
Zellen) verbunden war, wurden die Testagentien in einem mit BT-20-Zellen
konditionierten Medium für
24 Stunden (37°C)
inkubiert. Es wurde gefunden, daß am Ende einer solchen Inkubation
die Testagentien vollständig
als intakte Verbindung wiedergewonnen wurden. Die konditionierten
Medien für
diese Experimente wurden als ein Aliquot von 20 ml der Medien erhalten,
die für
3 Tage durch 1 × 106 BT-20-Zellen konditioniert worden waren.
-
1 und 2 zeigen,
daß D-
und L-CN schnell und übermäßig von
BT-20-Zellen aufgenommen werden. Durch Vergleich von 1 mit 2 kann
erkannt werden, daß während der
ersten sechs Stunden der Inkubation Zellen freies L-CN effektiver
aufnehmen als freies D-CN. Nach 72 Stunden der Aufnahme sind die
zwei CN-Isomere jedoch etwa äquivalent.
Es kann ebenfalls in 1 erkannt werden, daß die Aufnahme von
CN mit seiner Konzentration im Medium in Beziehung steht.
-
1 zeigt
ebenfalls, daß obwohl
BT-20-Zellen fortfahren, L-CN für
mehrere Tage aufzunehmen, die Aufnahmegeschwindigkeit am zweiten
und dritten Tag der Inkubation vermindert ist. Der Grad dieser Verlangsamung
ist konzentrationsabhängig
mit den Zellen, die höheren
Konzentrationen ausgesetzt waren, welche die größten Reduktionen am Tag 2 zeigen. 2 zeigt,
daß mit
freiem D-CN inkubierte Zellen nicht diese spätstufige Reduktion der CN-Aufnahme
zeigen. Statt dessen nimmt die Aufnahme am zweiten Tag der Inkubation relativ
zu derjenigen, die am ersten Tag beobachtet wurde, zu.
-
BEISPIEL 3
-
Zelluläre Aufnahme von freiem PN
-
Eine
zelluläre
Aufnahme von freiem CN wurde in BT-20-Zellen untersucht. Die Zellen
wurden plattiert und Proben wie in Beispiel 2 hergestellt.
-
3 zeigt
den Zeitverlauf der Aufnahme von freiem PN durch BT-20-Zellen. Zu
Vergleichszwecken zeigt 4 die Aufnahme von L-CN. Es
kann erkannt werden, daß BT-20-Zellen eine konzentrations-
und zeitabhängige
Aufnahme von PN zeigen. Die Dosisabhängigkeit resultierte in einer
Aufnahme von ≈54 pmol/BT-20-Zelle,
wenn die Anfangsmedienkonzentration 30 mM ist. Im Gegensatz resultiert
eine Medienkonzentration von 3,0 mM in einem Transport von ≈14 pmol/BT-20-Zelle.
Das Verfahren, das die zelluläre
Aufnahme von PN vermittelt, zeigt eine Dosisabhängigkeit, die mit der Zeit
wechselwirkt. Das heißt,
bei höheren
Konzentrationen (z.B. 30 mM) ist die Aufnahme innerhalb der ersten
zwei Stunden vollständig.
Bei geringeren Konzentrationen fährt
das Aufnahmeverfahren fort, um über
ein längeres
Intervall zu funktionieren.
-
Ein
Vergleich der Aufnahme von freiem CN und PN ist in 3, 4 und 5 gezeigt.
Es kann in 3 und 4 erkannt
werden, daß die
Aufnahme beider Verbindungen zeit- und dosisabhängig ist. 5 veranschaulicht
die unterschiedliche Dosisabhängigkeit
der Aufnahme von freiem PN und CN durch BT-20-Zellen. Es kann aus
diesen Figuren erkannt werden, daß am Ende einer achtstündigen Inkubation
beide Verbindungen eine zelluläre
Aufnahme zeigen, die linear mit der Medienkonzentration in Beziehung
steht. Jedoch ist die Konzentration, die erforderlich ist, um eine äquivalente
zelluläre
Aufnahme dieser zwei Verbindungen zu beobachten, sehr verschieden.
Bei PN wird beispielsweise eine Aufnahme bei verhältnismäßig hohen Medienkonzentrationen
(z.B. zwischen 3 und 30 mM) erkannt. Im Gegensatz dazu sind Medienkonzentrationen
zwischen 0,1 und 0,8 mM ausreichend, um eine CN-Aufnahme zu beobachten.
Es erscheint wahrscheinlich, daß diese
Unterschiede mit Unterschieden der Lipophilie der zwei Verbindungen
in Beziehung gebracht werden können.
-
Obwohl
die Aufnahme an freiem PN beträchtlich
höhere
Konzentrationen erfordert, damit eine Aufnahme beobachtet werden
kann, sollte darauf hingewiesen werden, daß ausreichende Erhöhungen der
Medienkonzentration Gehalte einer PN-Aufnahme erzeugen kann, die
sehr ähnlich
sind zu denjenigen, die mit CN beobachtet werden. Es ist ebenfalls
interessant darauf hinzuweisen, daß für diese zwei Verbindungen äquivalente
Gehalte an antineoplastischer Aktivität (z.B. CN und PN IC50~0,8 bzw. 15 mM) mit etwa äquivalenten
Gehalten der Aufnahme (z.B. ~30 pmol/Zelle) verbunden sind.
-
BEISPIEL 4
-
Zelluläre Aufnahme von liposomalem
CN
-
Eine
zelluläre
Aufnahme von liposomalem CN wurde in BT-20-Zellen untersucht. Die
Zellen wurden wie in Beispiel 2 plattiert und Medien enthaltend
800 μM racemisches
(optisch inaktives), liposomal formuliertes CN wurden verwendet,
um die Proben herzustellen.
-
Obwohl
freies CN von BT-20-Zellen aufgenommen wird, verbessern liposomale
Formulierungen von CN dieses Verfahren beträchtlich. 6 zeigt
die Ergebnisse eines Experiments, wo freies oder liposomal formuliertes
CN zu sechs Replikatzellen jeweils enthaltend 3.000 BT-20-Zellen
zugegeben wurde. Es kann aus dieser Figur erkannt werden, daß innerhalb
von zwei Stunden nach seiner Zugabe liposomales CN vollständig von
BT-20-Zellen aufgenommen
wird. Nach dieser zweistündigen
Zeit ist die Aufnahme von liposomalem CN 10-fach größer als
diejenige von freiem CN. Die Verarmung im Medium an liposomalen
CN-Gehalten während der
ersten zwei Stunden der Inkubation verhindert offensichtlich eine
weitere Aufnahme während
der verbleibenden 72 Stunden der Inkubation. Die Aufnahme von freiem
CN wird mit einer geringeren Geschwindigkeit und, am Ende der 72-stündigen Inkubationsdauer,
erreicht seine Aufnahme schließlich
ein Niveau, das etwa dasjenige ist, das durch liposomales CN während einer
zweistündigen
Inkubation erzeugt wird.
-
BEISPIEL 5
-
Intrazellulärer Metabolismus
von freiem und liposomalem CN
-
Das
intrazelluläre
Schicksal von freiem und liposomalem CN wurde in menschlichen Brustkrebszellen BT-20
untersucht, die mit 800 μM
racemischem (optisch inaktivem) CN (53 pmol/Zelle) inkubiert wurden.
Nach ausgewählten
Zeitpunkten wurden die Zellen gewaschen (3 × mit PBS), trypsinisiert,
gesammelt und in 200 μl isotonischer
Salzlösung
homogenisiert. Folgend einer Zentrifugation (110 × g; 15
min; 4°C)
wurden die Zellpellets und die überstehende
Flüssigkeit
zur Analyse unter Verwendung einer validierten HPLC-Methode getrennt,
die, zusätzlich
zum Bestimmen von CN, quantitativ die Gehalte an TG und Iso-PG bestimmte.
In dieser Studie wurden Daten von HPLC-Peaks, die PG und Iso-PG
repräsentieren,
gesammelt und als PG/IsoPG bezeichnet. Antineoplastonkomponenten
oder deren Derivate, die in der überstehenden
Flüssigkeit
gefunden wurden, wurden als ungebunden oder „frei" betrachtet, während Antineoplastonagentien
in dem Pellet als „gebunden" an Protein, oder
zelluläre
Strukturen, die leicht durch Schwerkraftzentrifugation pelletisieren,
erachtet werden.
-
Tabelle
1 zeigt, daß während einer
24-stündigen
Inkubation sowohl freies als auch liposomales CN von BT-20-Zellen
extensiv aufgenommen wird. Im Falle von freiem CN wurden am Ende
einer 24-stündigen
Inkubation 43,2 pmol (von den 53 pmol, die zur Zelle zugefügt wurden)
aus dem Medium entfernt. Trotz dieses Aufnahmeniveaus kann intaktes
CN nicht innerhalb der Zellen gefunden werden. Statt dessen wurde
gefunden, daß die
Zellen 36,7 pmol an freiem intrazellulären PG/IsoPG pro Zelle enthielten.
Da PG und IsoPG als Hydrolyseprodukte von CN bekannt sind und diese
Verbindungen nicht in unbehandelten Zellen detektiert werden können, scheint
es, daß die
intrazelluläre
Hydrolyse des CN, aufgenommen von den Zellen, verhältnismäßig langlebiges
intrazelluläres
PG/IsoPG erzeugt. Tabelle
1. Aufnahme und intrazelluläre
Niveaus von freiem und gebundenem CN und PG/Iso-PG.
-
Die
Formulierung von CN in Liposomen ändert sein intrazelluläres Schicksal
beträchtlich.
Tabelle 1 zeigt, daß zum
Ende des Inkubationsintervalls das gesamte liposomale CN, das dem
Medium zugefügt
worden ist, durch Zellen aufgenommen worden ist. Von den 53 pmol,
die in die Zellen aufgenommen worden sind, wurden 70,0 Prozent (37,3
pmol/Zelle) innerhalb der Zellen als freies PG/Iso-PG gefunden.
Weitere 21,0 Prozent des CN (11,2 pmol/Zelle) werden als intrazellulär gebundenes
PG/Iso-PG gefunden. Die verbleibenden 8,1 Prozent des liposomalen
CN, das aufgenommen wird, wird intrazellulär als gebundenes intrazelluläres CN gefunden.
-
Die
Beobachtung, daß freies
und liposomales CN den gleichen Gehalt an freiem intrazellulären PG/Iso-PG
(36,7 bzw. 37,3 pMol/Zelle) erzeugen, jedoch unterschiedliche Gehalte
an gebundenem CN und PG/Iso-PG ist wichtig, da unter diesen Bedingungen lediglich
das liposomale CN antineoplastische Aktivität zeigt (siehe 9).
Dies legt nahe, daß das
gebundene CN und/oder PG, und nicht freies PG/Iso-PG, in Wirkungszusammenhang
mit der Unterdrückung
des Zellwachstums steht.
-
BEISPIEL 6
-
Zeitverlauf
von intrazellulärem
Metabolismus von liposomalem CN
-
Die
in Beispiel 1 dargelegten Daten zeigen an, daß liposomale Zubereitungen
das intrazelluläre Schicksal
von CN ändern.
Um diesen Zeitverlauf des intrazellulären Schicksals von liposomalem
CN besser zu verstehen, wurden BT-20-Zellen, wie in Beispiel 5,
liposomalem CN für
1, 2 und 4 Stunden ausgesetzt. Zu jedem dieser Zeitpunkte wurden
Zellen geerntet und die intrazellulären Gehalten an freiem und
gebundenem CN oder PG/Iso-PG
unter Verwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren bestimmt.
-
Während der
ersten Inkubationsstunde werden alle 52,4 pmol an liposomalem, pro
Zelle zugefügtem CN
aufgenommen. Daher ist es klar, daß nach diesem Zeitpunkt eine
CN-Eingabe zu der
Zelle erleichtert worden ist. 7 und 8 zeigen,
daß von
52,4 pmol an liposomalem CN, die pro Zelle aufgenommen werden, 37,0
Prozent als gebundenes CN gefunden werden, 51,0 Prozent als gebundenes
PG/Iso-PG. Die verbleibenden 8,0 Prozent des aufgenommenen liposomalem
CN werden als freies PG/Iso-PG gefunden.
-
7 und 8 zeigen,
daß während der
zweiten Stunde der Inkubation es eine leichte Abnahme der Gehalte
an gebundenem CN gibt (von 19,7 auf 13,3 pmol/Zelle) und eine gleichzeitige
Zunahme der gebundenen und freien Formen seiner Hydrolyseprodukte,
PG/Iso-PG (d.h.
gebundenes PG/Iso-PG von 26,7 auf 32,0 pmol/Zelle; freies PG/Iso-PG
von 6,0 auf 8,0 pmol/Zelle). Zwischen den zweiten und vierten Inkubationsstunden
nehmen die Gehalte an gebundenem CN PG/Iso-PG auf ungefähr 32,0
Prozent ihrer höchsten
intrazellulären Werte
ab. Diese Abnahme an gebundenem CN und PG/Iso-PG wird durch eine
passende Zunahme an freiem PG/Iso-PG begleitet. Die Gehalte an gebundenem
PG/Iso-PG und CN, die am Ende der vierten Stunden vorhanden sind,
verbleiben bis zum 24 Stunden-Zeitpunkt gleich.
-
BEISPIEL 7
-
Antineoplastische Aktivität von freiem
und liposomalem CN
-
Die
vorangehenden Beispiele zeigten, daß liposomale Formulierungen
von CN intrazelluläre
Gehalte an gebundenem CN und PG/Iso-PG erhöhen. Um zu bestimmen, ob dieser
Effekt zu einer erhöhten
antineoplastischen Aktivität
führt,
wurde die antineoplastische Aktivität von freiem und liposomalem
CN in BT-20-Zellen untersucht. Diese Zellen wurden mit 3000 Zellen
pro Bohrung (96 Bohrungen pro Platte) platiert, und einen Tag später wurde
das Platierungsmedium durch frisches Medium mit oder ohne freiem
oder liposomalem CN (800 uM) ersetzt. Kontrollzellen in dem liposomalem
Zustand erhielten die äquivalenten
Gehalte an Liposomen ohne CN. Folgend einer 24-, 48- oder 72-stündigen Inkubation
wurden Zellen aus sechs Replikatbohrungen gesammelt und die Anzahl
an lebensfähigen
Zellen unter Verwendung von Trypan-Blau und eines Hemocytometers
bestimmt.
-
9 zeigt,
daß, relativ
zu nicht behandelten Zellen, eine einzige Verabreichung von freiem
CN ineffektiv zur Unterdrückung
des Zellwachstums in BT-20 ist. Im Gegensatz dazu blockierte die
gleiche Konzentration an liposomalem CN eine Proliferation von BT-20
vollständig.
Diese Unterdrückung
des Zellwachstums wird innerhalb von 24 Stunden nach Zugabe von
liposomalem CN beobachtet, verbleibt nach 48 Stunden stark und erscheint
sich nach 72 Stunden abzuschwächen.
-
Die
Beispiele oben zeigen ebenfalls, daß liposomale Zubereitungen
eine zelluläre
Aufnahme von CN verbesserten, zu verhältnismäßig langlebigen Zunahmen an
intrazellulären
Gehalten von gebundenem CN und PG/Iso-PG und erhöhter antineoplastischer Aktivität führten. Die
Zellen in diesem Beispiel wurden daher ebenfalls bezüglich intrazellulärer Gehalte
an CN und PG/Iso-PG analysiert, um jegliche Korrelation zwischen der
Clearance von intrazellulär
gebundenem CN und/oder PG/Iso-PG und der Wiederaufnahme an Zellwachstum
zu bestimmen.
-
10 zeigt,
daß Gehalte
an intrazellulär
gebundenem CN und PG/Iso-PG zwischen 24 und 48 Stunden nach der
anfänglichen
Dosierung mit liposomalem CN stabil verbleiben. Während dieses
Intervalls verbleibt das Zellwachstum von BT-20 unterdrückt. Zwischen
48 und 72 Stunden nehmen die Gehalte an gebundenem CN unter detektierbare
Grenzen ab, während
Gehalte an gebundenem PG leicht zunehmen. Korreliert mit der Reduktion
an gebundenem CN ist der Verlust der Inhibierung des BT-20-Zellwachstums.
-
BEISPIEL 8
-
Antineoplastische Effekte
von freiem und liposomalem A-10
-
Der
Effekt an liposomalen Formulierungen auf die antineoplastische Aktivität von A-10
wurde in Neuroblastom-(SK-N-MC) und Glioblastom-(U-118-MG) Zellen
untersucht. Diese Zellen wurden mit 5000 Zellen/Bohrung (Falcon;
96 Bohrungen pro Platte) platiert. 24 Stunden nach der Platierung
wurde das Medium durch frisches Medium mit oder ohne verschiedene
Konzentration an freiem oder liposomalem A-10 oder mit leeren Liposomen
ersetzt. Die Zellen wurden den Testagentien für 5 Tage mit einem Mediumswechsel
am Tag 3 ausgesetzt. Neuroblastomzellen wurden bei 37°C (5% CO2) in Eagle's MEM mit nichtessentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat
und Earle's BBS
mit 10% Fetalrinderserum gehalten. Glioblastomzellen wurden bei
37°C (5%
CO2) in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, mit 10%
Fetalrinderserum, gehalten.
-
Es
kann aus 11 und 12 erkannt
werden, daß bei
den in dieser Studie eingesetzten Konzentrationen freies A-10 zur
Unterdrückung
des Zellwachstums ineffektiv ist. Im Gegensatz dazu unterdrückte liposomal
formuliertes A-10 Zellwachstum und wies einen IC50 nahe
von 30 μM
auf. Obwohl der Teil des vergrößerten antineoplastischen
Effekts, der in dieser Studie erkannt wird, übermäßigen Gehalten an Lipid (Arzneimittel:Lipid-Verhälntnis =
1:30) zugeordnet werden kann, ist klar, daß die liposomale Formulierung
von A-10 ein noch höheres
Niveau an antineoplastischer Aktivität aufweist. Arbeit mit mehreren
anderen Linien zeigt an, daß der
IC50-Wert für die Komponenten von A-10
zwischen 20 und 25 mM liegt. Durch Erstreckung schlägt dies vor,
daß die
liposomale Formulierung von A-10 mehr als 700 mal effektiver ist
als nicht-liposomales A-10.
-
BEISPIEL 9
-
Antineoplastische Wirkungen
von freiem und liposomalem AS2-1, PG und PN
-
Der
Einfluß von
liposomalen Formulierungen auf die antineoplastische Aktivität von AS2-1
oder PG oder PN wurde an menschlichen Glioblastom-zellen (U87) untersucht.
Experimente mit dieser Zellinie platierten 3000 Zellen pro Bohrung
und folgend einem viertägigen
Intervall, um es den Zellen zu ermöglichen, in die Exponentialwachstumsphase
einzutreten, wurden die Testagentien zugegeben. Die Medien wurden
am Tag 3 ausgetauscht und Zellzählungen
wurden am Tag 3 und 7 erhalten. Gehalte an Liposomen waren über die
Gehalte des Testagens äquivalent.
-
13 zeigt,
daß die
antineoplastische Aktivität
von AS2-1 gegenüber
menschlichen U87-Glioblastomzellen
um das 900-fache durch liposomale Formulierungen erhöht wurde.
-
14 und 15 zeigen
die zelluläre
Aufnahme von freiem und liposomalem Phenylacetat (PN) und Phenylacetylglutamin
(PG), während 16 und 17 die
antineoplastische Aktivität
von freiem und liposomalem Phenylacetat (PN) und Phenylacetylglutamin
(PG) zeigen. Diese Verbindungen sind die Hauptkomponenten von Antineoplaston
AS2-1- bzw. A-10-Therapien.
Die in 13 gezeigten Daten sind von
einer 3-tägigen
Inkubation, während ähnliche
Daten nach einer 7-tägigen
Inkubation mit einem Mediumwechsel am Tag 3 beobachtet werden. Es
kann erkannt werden, daß während dieses
dreitägigen
Intervalls die Aufnahme an freiem PN und PG äquivalent und konzentrationsabhängig ist.
Ausgedrückt
auf einer Basis pro Zelle ist die Aufnahme von 30 mM an freiem PN
durch die U87-Zellen 50 pmol. Dieser Wert nähert sich dem ~55 pmol-Wert an,
der für
BT-20 Zellen gefunden wird (siehe 3, 4 und 5).
-
16 zeigt
die antineoplastische Aktivität
von freiem PN und PG auf der U87-Zelle. Es kann erkannt werden,
daß der
IC50-Wert für drei Tage für PN nahe
15 mM (IC50 = die Konzentration, die eine
halbe maximale antineoplastische Wirkung zeigt) ist. Im Gegensatz
dazu ist die antineoplastische Aktivität von PG viel schwächer und
versagt, einen IC50-Wert herzustellen. Es
ist interessant, daß,
obwohl PG ein Aufnahmemuster aufweist, das praktisch identisch zu
PN ist, es in dieser Zelllinie einen viel schwächeren antineoplastischen Effekt aufweist.
Dies gibt an, daß der
Gehalt der Aufnahme per se nicht für eine antineoplastische Aktivität voranzeigend
ist.
-
17 zeigt
die antineoplastische Wirkung an liposomalem PN und PG. Es kann
erkannt werden, daß die
antineoplastische Aktivität
in liposomale Formulierungen beträchtlich erhöht wird. Der IC50-Wert
für liposomales
PN und PG ist ähnlich
und nahe 0,02 mM. Der IC50-Wert für liposomales
PN ist 750-fach kleiner als derjenige von freiem PN. Während die
Erhöhung
der antineoplastischen PG-Aktivität in dieser Zelllinie unbestimmt
ist, folgt aus den obigen Beobachtungen, daß der IC50-Wert
für PG
größer als
30 mM ist und daß die Aktivität beträchtlich
um mehr als das 750-fache erhöht
werden muß.
-
15 zeigt
die Aufnahme von liposomal formuliertem PN und PG. Wie für den Fall
mit der freien Form dieser Antineoplastone sind die Gehalte der
zellulären
Aufnahme für liposomal
formuliertes PN und PG ähnlich.
Eine weitere Ähnlichkeit
zwischen frei und liposomal formuliertem PN und PG ist, daß die Aufnahme konzentrationsabhängig ist.
Es ist offensichtlich von einem Vergleich der 11 und 12,
daß, obwohl
freie und liposomale Antineoplastonagentien gleiche Gehalte an zellulärer Aufnahme
erzeugen, die Konzentrationen an freien Formen, die erforderlich
sind, um diesen Effekt herzustellen, 20-fach höher sind als diejenigen für die liposomale
Formulierung. Ebenfalls sind in Situationen, wo freies und liposomales
PN ähnliche
Gehalte an antineoplastischer Aktivität (z.B. den IC50-Wert) erzeugen, die
Gehalte der Aufnahme für
liposomale Formulierungen um einen Faktor von 30 geringer (liposomale
PG-Gesamtaufnahme bei dem IC50-Wert von
0,02 mM = 0,00147 umol: freie PG-Gesamtaufnahme beim IC50-Wert
von 15 mM = 0,048 uM).
-
Obwohl
die schwache antineoplastische Aktivität von freiem PG in dieser Zelllinie
verhindert, daß der IC50-Wert genau bestimmt wird, erscheint klar,
daß dieser
Wert deutlich oberhalb von 30 mM (siehe 10 untere
linke Anzeige) ist. Dies legt nahe, daß die Absolutaufnahme an liposomalem
PG (0,00227 μmol
beim IC50 von 0,02 mM) wenigstens 80-fach
geringer ist als die 0,192 μmol,
die mit 30 mM freiem PG beobachtet werden.
-
Die
hier dargestellte Arbeit zeigt, daß die antineoplastische Aktivität und zelluläre Aufnahme
von Antineoplastonen beträchtlich
durch Formulieren dieser Verbindungen in Liposome erhöht wird.
Für liposomale Formulierungen
wird ebenfalls gefunden, daß sie
das intrazelluläre
metabolische Schicksal der Antineoplastone ändern. Die Beobachtung, daß liposomales
PN und PG eine erhöhte
antineoplastische Aktivität
mit geringeren Gehalten an zellulärer Aufnahme aufweisen, zeigt
an, daß die
erhöhte
Aktivität
nicht das einfache Resultat einer verbesserten Aufnahme ist. Stattdessen
resultiert die liposomale Formulierung in einer intrazellulären Zielgebung
von Antineoplastonen an intrazelluläre Stellen, die eine Zelllebensfähigkeit
und Proliferation regulieren.
-
Alle
Zusammensetzungen und Verfahren, die hierin offenbart und beansprucht
werden, können
ohne übermäßige Experimentation
im Lichte der vorliegenden Offenbarung durchgeführt und ausgeführt werden. Während die
Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung anhand bevorzugter
Ausführungsformen beschrieben
worden sind, wird Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein,
daß Variationen
der Zusammensetzungen und Verfahren und in den Schritten oder in
der Reihenfolge der Schritte des hierin beschriebenen Verfahrens
angewendet werden können.