DK160742B - Fremgangsmaade til samtidig rensning og desinfektion af kontaktlinser - Google Patents

Description

DK 160742 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til samtidig rensning og desinfektion af kontaktlinser. Mere specielt dækker opfindelsen den samtidige rensning og desinfektion af kontaktlinser ved hjælp af en opløsning indeholdende en blanding 5 af peroxid og peroxidaktive proteolytiske enzymer.

Udviklingen af kontaktlinser af glas til de nuværende linser, der kan bæres i længere tid, og som er baseret på hydrofile polymere materialer, har givet et ændret behov for nye og mere effektive midler til at rense og desinficere sådanne linse-10 materialer for at opretholde optisk klarhed, mulighed for at bære dem og forhindre overføring af infektionsmidler til øjet.

Glas og de tidlige polymerer såsom polymethylmethacrylat (PMMA)-linser kunne let renses manuelt ved anvendelse af detergent på grund af deres stivhed og hydrofobe karakter. Sådanne materialer 15 bliver til en vis grad befugtet af det naturligt forekommende vandige lag på øjet og af tårer, men de er lipofile i en sådan grad, at snavs, muligvis med undtagelse af lipider, let fjernes ved manuel rensning med detergenter. Hydrofile materialer, især polypeptider og enzymer såsom lysozym hænger ikke i betydelig 20 grad ved disse materialer og fjernes let ved rensning med overfladeaktive midler og detergenter.

Kontaktlinser på basis af glas og PMMA desinficeres også let af detergentrensemidler. Mekaniske rensningsprocesser fjerner let vedhængende infektionsmaterialer. Da disse typer materialer 25 endvidere ikke er porøse, kan kemiske desinfektionsmidler inkluderes i lageropløsninger og renseopløsninger uden absorption af desinfektionsmidlet i linsen og udludning af dette desinfektionsmiddel i øjet under brugen. Der er således minimal bekymring om fysisk fjernelse af infektionsmidler og opretholdelse af sterili-30 tet med kemiske midler under lagring og om opretholdelse af steriliteten af rensende, befugtende og lageropløsninger.

Fremskridt i polymerteknologien har givet betydelige forbedringer i bærerens komfort og øjets sundhed, men har resulteret i nye problemer med hensyn til rensning og desinfektion af sådanne

DK 160742 B

2 materialer.

En linse er mest behagelig på øj et,når overfladen kan befugtes med øjenvæsken og tåreopløsningen. I alle kontaktlinsepolymerer, der nu anvendes, med undtagelse af PMMA-linserne, er linseoverfladen naturligt hydrofil eller behandles for at 5 gøre den hydrofil. Dette opnås ved hjæp af multiple negative ladninger, i reglen i form af carboxylat, og neutrale grupper, som tilvejebringer hydrofile omgivelser, der let befugtes af væskelaget, som dækker hornhinden. Sådanne negativt ladede hydrofile overflader findes ikke blot på hydrogellinserne, men også på 10 stivere linser såsom organosiloxan-methacrylatlinserne (Polycon ®) og linser baseret på siliconeelastomer. I denne sidstnævnte kategori, linserne af siliconeelastomer, er den hydrofobe overflade belagt eller på anden måde behandlet for at gøre overfladen hydrofil.

15 Proteinmaterialer adsorberes på den hydrofile linseoverflade under den daglige brug. På alle linser, undtagen PMMA-linser, er adsorptionen så stærk, at selv med linser såsom de stive poly-siloxan/methylmethacrylat copolymerer fjerner manuelle rensningsmetoder med detergent ikke tilstrækkeligt denne ansamling. Så-20 kaldte hydrogellinser, d.v.s. materialer fremstillet af hydroxy-methylmethacrylat, hydroxyethylmethylmethacrylat, vinylpyrroli-don og glycerinmethacrylat monomerer og methacrylsyre eller syreestere, og som absorberer en betydelig mængde vand, d.v.s.

35 - 80% vand, er så skøre, at mekaniske rensningsmetoder ikke 25 er en praktisk måde at fjerne snavs på, især de stærkt absorberede proteinholdige materialer.

Resultatet er, at i tidens løb kan afsætningen af sådanne materialer resultere i ubehageligheder for bæreren og, hvad der er mere betydningsfuldt, genere de optiske egenskaber af linserne, 30 især nedsat lystransmission og forøget lysafbøjning. Afsætning af protein resulterer også i øjenirritation, tab af synsskarphed, linseskade, og i visse tilfælde kan resultatet være en tilstand, der kaldes kraftig papillær konjunktivitis.

DK 160742 B

3

Undersøgelser har vist, at den primære kilde til denne proteinafsætning er lysozym-enzymet. Desuden kan der være lipo-proteiner og mucopolysaccharider adsorberet på linseoverfladen, men proteiner i sig selv, især lysozymmaterialer, er hovedkilden 5 til ansamlingen af protein på linsen. Disse enzymer, sammen med mindre mængder af lignende proteiner, lipoproteiner og mucopolysaccharider , akkumuleres på overfladen af hydrofile linsematerialer .

Det eneste sikre og effektive middel, der hidtil er fundet til 10 fjernelse af denne ansamling, er anvendelse af enzymer, hvis hydrolytiske aktivitet reducerer proteinmaterialerne til små vandopløselige underenheder. Særligt nyttige er proteolytiske enzymer, proteaser, som hydrolyserer amidbindinger og nedbryder proteiner til aminosyrer og meget små polypeptider. Disse 15 proteinfragmenter er i almindelighed vandopløselige og bliver således let opløseliggjort af de omgivende vandige omgivelser. Amerikansk patent nr. 3.910.296 beskriver brugen af proteaser til rensning af kontaktlinser. Se også amerikansk patent nr. 4.285.738. Enzymer med lipolytisk og/eller mucolytisk akti-20 vitet er også anvendelige i små mængder sammen med proteolytiske enzymer til linserensning.

Et andet problem med gaspermeable kontaktlinser, især hydrogel-linserne eller kontaktlinserne med højt vandindhold, fremstillet af HEMA, VP og GMA monomerer, er problemer med desinfektion 25 og opretholdelse af sterilitet af linserne og opløsninger til opbevaring af linsen.

En række fremgangsmåder er blevet udarbejdet til desinfektion af linser, herunder brugen af høj temperatur, sterile saltvandsopløsninger som vaskevæsker og kemikalier, f.eks. antimikrobielle 30 lægemidler eller oxidationsprocesser.

Varme har været effektiv i væsentlig grad, men har den ulempe, at den gør yderligere rensning mere vanskelig, d.v.s. denature-

DK 160742 B

4 ring af protein og størkning af protein og andre aflejringer på linserne.

Sterilt saltvand kan anvendes til at rense og iblødsætte linser. Sådanne opløsninger er dog ikke altid sterile, da visse mikrober 5 kan leve i saltvandsomgivelser, og sporer ikke totalt inaktive-res af sterile saltvandsopløsninger.

Inden for kategorien kemiske midler kan brugen af såkaldte lægemidler, antimikrobielle stoffer på basis af tunge metaller såsom thimerisol og trialkylammoniumhalogenider og forbindelser 10 såsom benzylalkoniumchlorid eller lignende forbindelser give brugeren problemer med ubehag, hvis de anvendes ukorrekt. Egenskaberne hos sådanne lægemidler, der gør dem til gode mikro-biocider, medfører også det mulige fænomen, at øjet kan irriteres. Dette fænomen forefindes især med linsematerialer af 15 hydrogeltypen, idet lægemidlet akkumulerer i linsen og så frigøres på øjet under brugen. Sådanne lægemidler kan forårsage ubehag for øjet hos nogle mennesker tilstrækkeligt til at få dem til at søge alternative midler til sterilisering af linser.

Som reaktion på problemerne med at opretholde sterilitet med 20 lægemidler, varme og saltvand er brugen af oxidanter blevet et område af væsentlig interesse til desinfektion af kontaktlinser. Flere systemer i et og to trin baseret på peroxider er blevet udviklet til at desinficere kontaktlinser. Et system illustreres af US-patent nr. 3.912.451. Et andet er nr. 4.473.550.

25 Det har nu vist sig, at kontaktlinser samtidig kan renses og desinficeres ved i én opløsning at kombinere et peroxid til desinfektion og et peroxidaktivt proteolytisk enzym til rensning. _ Overraskende er der en stig ning i virkningen af hver individuel komponent, når de forelig-30 ger i kombination. Det vil sige, at fjernelse af proteinmateriale forstærkes flere gange af tilstedeværelsen af peroxid, og desinfektionsgraden forstærkes, når det peroxidaktive enzym er

DK 160742B

5 til stede. Det samlede resultat er, at linser nu kan renses og steriliseres i ét trin mere effektivt end ved uafhængig brug af de to komponenter.

Peroxider og proteaser er blevet kombineret i tøjvaskemidler og 5 til rensning af forlorne tænder. For eksempel angår amerikansk patent nr. 3.732.170 et biologisk rensemiddel indeholdende et enzym og en kilde til peroxid, især et alkalimetal-monopersulfat-triplesalt. Kernen i denne opfindelse er en fremgangsmåde til rensning af "proteinagtige" blodpletter fra et materiale, et 10 vasketøjshjælpemiddel. Denne kombination anføres at blive sammensat fortrinsvis med en anionisk detergent.

Et andet eksempel, US-patent nr. 4.155.868, nævner en vandopløselig brusende tandrensetablet indeholdende et enzym og en aktiv oxygenforbindelse. Kernen i denne opfindelse er sammensætningen 15 af en tablet på en sådan måde, at man forhindrer for tidlig inaktivering af enzymet med oxidationsmidlet under lagring.

Natriumperborat og enzymer er kendte komponenter af moderne tøjvaskemidler. En oversigt over denne kendte teknik findes hos O.Oldenroth i den tyske offentliggørelse "Fette Seifen Anstrich-20 mittel" 1970 (72(7)), 582-7. Denne artikel angiver, at fjernelsen af denatureret æggeblomme fra stof bevirkes med bakterielle proteaser, men i nærværelse af perborater blev effektiviteten af proteaserne nedsat.

Ingen af disse offentliggørelser beskriver eller påtænker brug 25 af sådanne midler til rensning og desinfektion af kontaktlinser eller den forøgende virkning, som den ene komponent har på aktiviteten af den anden.

Opfindelsen angår derfor en fremgangsmåde til samtidig rensning og desinfektion af kontaktlinser,

c DK 160742 B

især en, der har en hydrofil overflade, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at linserne bringes i kontakt med en ophthalmisk acceptabel vandig opløsning hovedsagelig omfat-5 tende en desinficerende mængde peroxid og en effektiv mængde peroxidaktivt proteolytisk enzym i en tid tilstrækkelig til at fjerne i hovedsagen alle protinansamlinger og til at desinficere linserne.

10 Ideen at kombinere et enzym og peroxid for at bevirke desinfektion og rensning i ét trin kan anvendes til proteolytiske, lipo-lytiske og mucolytiske enzymer, individuelt eller i kombination.

Et peroxidaktivt enzym er ethvert enzym, der har målelig aktivi-I5 tet ved 3% vægt/voluirien hydrogenperoxid i vandig opløsning ved standardtemperatur og -tryk, bestemt ved sådanne kolorimetriske metoder som Azocoll-metoden, R.M.Tomarelli m.fl., J.Lab.Clin.Med. 34, 428 (1949), eller dimethylcasein-metoden til bestemmelse af proteolytisk aktivitet, beskrevet af Yaun Lin m.fl., J.Biol.Chem.

20 244, (4) 789-793 (1969).

Enzymer kan fås af enhver plantekilde eller dyrisk kilde, herunder mikrobielle kilder og pattedyrskilder. De kan være neutrale, sure eller alkaliske enzymer.

25

Et proteolytisk enzym vil delvis eller helt have evnen til at hydrolysere peptidamidbindinger. Sådanne enzymer kan også have nogen naturlig lipolytisk og/eller amylolytisk aktivitet forbundet med den proteolytiske aktivitet.

30

Foretrukne proteolytiske enzymer er de, der i hovedsagen er fri for sulfhydrylgrupper eller disulfidbindinger, hvis tilstedeværelse kan reagere med det aktive oxygen til skade for aktiviteten af det aktive oxygen, og som kan resultere i utidig 35 inaktivering af enzymet. Metalloproteaser, d.v.s. de enzymer, som indeholder en divalent metalion såsom calcium, magnium eller zink bundet til proteinet, kan også anvendes.

DK 160742 B

7

En mere foretrukket gruppe proteolytiske enzymer er serinprotea-serne, især de, der er afledt af Bacillus- og Streptomyces-bakterier og Aspergillus-svampe. Inden for denne gruppe er de mere foretrukne enzymer de af Bacillus afledte alkaliske prote-5 aser, der generelt kaldes subtilisin-enzymer. Der kan henvises til L.Keay, P.W.Moser & B.S.Wildi, "Proteases of the Genus Bacillus. II. Alkaline Proteases", Biotechnology and Bioengineering, bind XII, side 213-249 (1970) og L.Keay & P.W.Moser, "Differentiation of Alkaline Proteases from Bacillus Species", 10 Biochemical and Biophysical Research Comm., bind 34, nr. 5, side 600-604 (1969) .

Subtilisin-enzymerne opdeles i to underklasser, subtilisin A og subtilisin B. I subtilisin A-gruppen er enzymer afledt af sådanne arter som B.subtilis, B.licheniformis og B.pumilis.

15 Organismer i denne underklasse producerer intet eller kun en ringe mængde neutral protease eller amylase. Subtilisin B_under-klassen udgøres af enzymer fra organismer som B.subtilis, B.subtilis var. amylosacchariticus, B.amyloliquefaciens og B.subtilis NRRL B3411. Disse organismer producerer neutrale proteaser og 20 amylaser i en mængde, der omtrent er sammenlignelig med deres produktion af alkalisk protease.

Desuden er andre foretrukne enzymer f.eks. pancreatin, trypsin, collaginase, keratinase, carboxylase, aminopeptidase, elastase og aspergillo-peptidase A og B, pronase E (fra S.griseus) og 25 dispase (fra Bacillus polymyxa).

Identifikation, adskillelse og rensning af enzymer er en velkendt teknik. Der findes mange teknikker til identifikation og isolering i den almene videnskabelige litteratur om isolering af enzymer, herunder de enzymer, der har proteolytisk og 30 blandet proteolytisk/amylolytisk eller proteolytisk/lipolytisk aktivitet. De peroxidstabile enzymer, der anvendes ifølge opfindelsen, kan let fås ved kendt teknik af plantekilder, dyriske kilder eller mikrobielle kilder.

DK 160742 8

Med fremkomsten af rekombineret DNA-teknik forventes det, at nye kilder og typer af peroxidstabile proteolytiske enzymer vil blive tilgængelige.. Sådanne enzymer skal anses for at falde inden for opfindelsens rammer, når blot de tilfredsetil-5 ler kriterierne for stabilitet og aktivitet, som er angivet ovenfor. Den japanske offentliggjorte ansøgning J6 0030-685 viser et eksempel på fremstilling af proteaser med rekombineret DNA fra Bacillus subtilis.

En effektiv mængde enzym skal anvendes til udførelse af den 10 foreliggende opfindelse. Denne mængde vil være den, der bevirker fjernelse inden for en rimelig tid (f.eks. natten over) af i hovedsagen alle proteinaflejringer fra en linse, der skyldes normal bæren. Denne standard angives under henvisning til kontaktlinsebærere med en historie af et normalt mønster af 15 proteinansamling, ikke den meget lille gruppe, som på et eller andet tidspunkt kan have en betydeligt forøget grad af proteinaflejring, således at rensning anbefales hver anden eller tredje dag.

Den mængde enzym, som kræves til at fremstille en effektiv ren-20 ser, afhænger af flere faktorer, herunder den naturlige aktivitet af enzymet, det fulde omfang af dets synergistiske samvirken med peroxidet, som blandt flere faktorer fremstår som væsentlige.

Som grundlæggende målestok skal arbejdsopløsningen indeholde tilstrækkelig meget enzym til at give mellem 0,0001 og 0,5 25 Anson-enheder af aktivitet pr. ml opløsning, fortrinsvis mellem , 0,0003 og 0,05 Anson-enheder, pr. enkelt linsebehandling. Større eller mindre mængder kan anvendes. Enzymkoncentrationer lavere end de anførte kan dog godt rense linser, men vil kræve så lang tid, at de i praksis ikke er særligt nyttige. Opløsnin-30 ger med større mængder enzym skulle bevirke hurtigere rensning, men kan indebære materialemængder, som er for store til praktiske formål. For subtilisin A foretrækkes det mest at anvende 0,0012 Anson-enheder pr. 10 ml arbejdsopløsning.

DK 160742 B

9

Udtrykt i vægt/rumfang - idet enzympræparater sjældent er rene -forventes det, at enzymkilden vil blive anvendt i mængder mellem 0,003 og 15% af den færdige arbejdsopløsning. Den nøjagtige mængde vil variere med renheden af enzymet og må be-5 stemmes endeligt parti for parti.

Enzymaktivitet er pH-afhængig, således at for et givet enzym vil der være et særligt pH-område, hvori enzymet fungerer bedst. Bestemmelsen af dette interval kan let foretages ved kendt teknik. Det foretrækkes at manipulere arbejdsopløsningen til et 10 optimalt pH-interval for et givet enzym, men dette er ikke et absolut krav.

Peroxidkilden kan være enhver af flere forbindelser, der giver aktiv oxygen i opløsning. Eksempler på sådanne forbindelser indbefatter hydrogenperoxid og dets alkalimetalsalte, perboratsalte, 15 især monohydrater og tetrahydrater, persulfater, salte af carbonatperoxid, diperisophthalsyre, peroxydiphosphatsalte og aluminiumaminohydroperoxidsalte. Hydrogenperoxid og alkalimetalsaltene af perborater og persulfater, især natrium- og kaliumsaltene, er de mest foretrukne.

20 En desinficerende mængde peroxid betyder en sådan mængde, som vil reducere den mikrobielle belastning med én log på 3 timer.

Mere foretrukket vil peroxidkoncentrationen være således, at den mikrobielle belastning reduceres med en log orden på en time.

Mest foretrukket er de peroxidkoncentrationer, som vil reducere 25 den mikrobielle belastning med en log enhed på 10 minutter eller mindre.

En enkelt peroxidkoncentration kan ikke bringes til at gælde for alle peroxider, da procenten af aktiv oxygen varierer væsentligt mellem peroxider.

30 For hydrogenperoxid, på den lavere side, vil en 0,5% vægt/rumfang koncentration tilfredsstille de første kriterier i foregående af-

DK 160742 B

10 snit under de fleste omstændigheder. Det foretrækkes at anvende 1,0% - 2,0% peroxid, hvilke koncentrationer reducerer desinfektions- og rensningstiden sammenlignet med den 0,5%-ige peroxid-opløsning. Det foretrækkes mest at anvende en 3% hydrogen-5 peroxidopløsning, .omend en mængde på 10% kan anvendes. Der er ingen øvre grænse for mængden af hydrogenperoxid, som kan anvendes ifølge opfindelsen, undtagen forsåvidt den er begrænset af kravet om, at enzymet bevarer proteolytisk aktivitet.

Hvad angår andre peroxider er den eneste begrænsning for deres 10 koncentration, at de udviser synergistisk aktivitet i kombination med det peroxidstabile enzym ved en given koncentration med hensyn til rensning og desinfektion. For eksempel har det vist sig, at natriumper bor at i koncentrationer på 0,02% w/v eller større, vil forstærke den enzymatiske fjernelse af protein fra kontaktlinser. 15 De rigtige koncentrationer af et givet peroxid kan let bestemmes ved rutineforsøg.

Forøgelse af pH-værdien af peroxid/enzymopløsninger har vist sig at have en betydelig virkning på desinfektionsevnen af disse opløsninger. Ved pH 5,22 var D-værdien af en 3% hydrogenperoxid-20 opløsning, målt over for A.niger, 8,04 mod 3,57 ved pH 7,32 og 1,79 ved pH 8,22 og 9,23. Det mest foretrukne pH-interval er derfor 6-10 for disse opløsninger, især 7,5 - 9,0. Tilsvarende foretrækkes det at anvende peroxidstabile enzymer, som er aktive ved en neutral eller alkalisk pH-værdi.

25 Yderligere materialer kan sættes til tabletter eller flydende opløsninger af enzymet og/eller peroxidpræparaterne. For eksempel kan der tilsættes tonicitetsmidler, brusemidler, stabiliseringsmidler, bindemidler, stødpudestoffer, enzym-cofaktorer, midler, der reducerer disulfidbinding såsom vandopløselige mer-30 captaner og dithioniter og lignende, midler til at inaktivere resterende peroxid og lignende.

En sammensætning af peroxid og enzym kan kræve stabiliserings-

DK 160742 B

11 midler for at forhindre for tidlig inaktivering af begge komponenter. Til opløsninger kan det være nødvendigt eller passende at tilsætte materialer for at stabilisere peroxidet, især mod metalinduceret katalytisk nedbrydning. Det kan også være hen-5 sigtsmæssigt at tilsætte stødpudestoffer til disse opløsninger for at opretholde pH-værdien inden for et givet interval.

Salte eller andre materialer såsom polyalkoholer eller lignende kan tilsættes for at modificere den toniske værdi af disse opløsninger .

10 I tabletter eller pulvere kan de samme overvejelser gøre sig gældende med hensyn til at tilsætte salte, stødpuder og stabiliseringsmidler, således at når tabletten er opløst, vil der haves den rigtige pH-værdi og toniske værdi. Med tabletter og pulvere kan det også være hensigtsmæssigt at tilsætte bruse-15 midler. Desuden kan bindemidler, smøremidler til tabletteringsformål og andre hjælpemidler, der normalt anvendes til fremstilling af pulvere, tabletter og lignende, inkorporeres i sådanne præparater. Indikatorer, farvende stoffer, som viser tilstedeværelse eller fravær af peroxider, kan også inkorporeres i disse 20 præparater.

Til udførelse af opfindelsen fremstilles en opløsning af peroxid og enzym, og linserne bringes i kontakt med denne opløsning, fortrinsvis ved at blive neddykket i opløsningen. Linserne vil blive efterladt i kontakt med opløsningen tilstrækkeligt 25 længe til, at i hovedsagen alt proteinet fjernes fra linseoverfladerne, og linserne desinficeres.

Fremgangsmåden eller rækkefølgen til at kombinere de væsentlige komponenter til fremstilling af opløsningen, som kommer i kontakt med linserne, vil variere med de fysiske egenskaber af de 30 anvendte komponenter, men tilsætningsrækkefølgen er ikke afgørende for udførelse af opfindelsen. Hvis der f.eks. anvendes hydrogenperoxid, vil det ikke være rimeligt muligt at sammensætte en tablet eller et pulver af alle komponenterne. Når

DK 160742 B

12 hydrogenperoxid er peroxidkilden, vil det således være nødvendigt at blande enzym og andre tørre bestanddele med vandig peroxid.

Det er mest bekvemt at sammensætte enzymet og de andre tørre komponenter som et pulver eller en tablet og at opløse dette 5 materiale i en peroxidopløsning og derefter indføre linserne i denne opløsning. Linserne kunne allerede være i peroxid-opløsningen, når enzymet indføres, men praktiske hensyn gør den første fremgangsmåde til den foretrukne.

Der er ingen særligt foretrukken form for fremstillingen af dis-10 se materialer. De to væsentlige komponenter kan sammensættes som separate komponenter i tør eller vandig form. De kan kombineres i en enkelt tablet eller pulver, eller den ene kan være i tør form, medens den anden fremstilles som en vandig opløsning.

Den endelige form vil afhænge delvis af den type peroxidkilde, 15 der anvendes i præparatet. Det forventes, at pulveret eller tabletten ifølge opfindelsen også kan være i en brusende form for at fremme tablettens opbrydning og fremme opløseligheds-hastigheden af bestanddelene. Hvis der anvendes et kornet peroxid, vil det være muligt at fremstille pulvere og/eller tab-20 letter af flere komponenter ifølge opfindelsen. Hvor peroxidet er i opløsningsform, kan det være nødvendigt at skaffe enzymet fra en anden kilde for at forhindre nedbrydning af enzymet gennem længere tid.

Anden energitilførsel kan anvendes til at forstærke opløsningens 25 rensende og desinficerende virkning. For eksempel vides ultra soniske apparater at forøge den hastighed, hvormed proteaser virker under sådanne omstændigheder som ved rensning af kontaktlinser. Varme, afhængende af mængden og tidspunktet, kan også have en gunstig virkning på rensnings- og desinfektionshastighe-30 derne.

Udførelsen af opfindelsen er ikke begrænset temperaturmæssigt, undtagen af de temperaturekstremer, som væsentligt ville inakti-

DK 160742 B

13 vere den proteolytiske evne af de anvendte enzymer, før der er bevirket nyttig hydrolyse af proteinansamlingerne. Enzymatisk aktivitet er en funktion af temperatur, og nogle enzymer er betydeligt mere labile end andre over for temperaturekstremer, 5 især temperaturstigninger. Andre enzymer er varmestabile og forbliver væsentligt aktive ved en.temperatur på 70°C eller derover. Andre enzymer bevarer væsentlige mængder aktivitet ved eller lige over vandets frysepunkt. Det foretrukne temperaturinter-val til udførelse af opfindelsen er mellem 20 og 37°C, især 10 22 - 25°C, men det kan være muligt at udføre opfindelsen med visse peroxidaktive enzymer i temperaturintervallet mellem 5°C og 100°C.

En udførelsesform ifølge opfindelsen er at fremstille en opløsning ved stuetemperatur af enzym og peroxid og anbringe denne 15 opløsning sammen med kontaktlinsen i et aggregat til varmedesinfektion af kontaktlinser og lade aggregatet gennemgå sin normale varmeperiode. Dette er dog kun et eksempel på de varme-variable aspekter af opfindelsen.

Det ligger også inden for opfindelsens ormråde, at visse komponen-20 ter kan fremstilles separat på en måde, hvor der bevirkes rettidig frigørelse af komponenten eller forhindres reaktion af komponent 1 med komponent 2 under fremstilling af tablet og pulver og påfølgende lagring. I visse tilfælde kan det f.eks. være hensigtsmæssigt separat at fremstille peroxidet og enzymet 25 på en sådan måde, at man forhindrer eller reducerer deres indbyrdes reaktion ved en tabletteringsproces og ved påfølgende lagring .

Desuden kan opløsninger eller pulvere indeholde midler til at afgifte resterende peroxid som en del af den samlede proces til 30 rensning, desinfektion og til sidst fjernelse af resterende peroxid. Enzymer, som katalyserer omdannelsen af peroxider til oxygen og vand, kan inkluderes i disse præparater for at fjerne resterende peroxid forud for indsættelse af linsen på øjet.

DK 160742 B

14

For eksempel kan catalaser, organiske enzymer, som katalyserer nedbrydningen af peroxider, inkorporeres i tabletter og pulvere, især i en form, hvori de frigøres med tiden. Desuden kan metaller såsom de tunge metalovergangsgrundstoffer, der kataly-5 serer omdannelsen·af peroxid til oxygen og vand, inkluderes i et pulver- eller et tabletpræparat, igen fortrinsvis i en form med forhalet frigørelse, for at få en fremgangsmåde til at reducere til et ugiftigt niveau ethvert resterende peroxid, som bliver tilbage i opløsningen efter en given tid. Brugen af over-10 gangsmetalkatalysatorer til dekomponering af peroxider i en desinfektionsopløsning til kontaktlinser er beskrevet i amerikansk patent nr. 3.912.451, og denne teknologi inkorporeres heri gennem denne henvisning.

De følgende eksempler anføres for at illustrere opfindelsen.

15 EKSEMPEL 1.

Sammenlignende rensevirkninger: (S) 20 Hydrocurve ^ II 55% vandlinser (Barnes-Hind, Inc., Sunnyvale, Californien, USA) blev belagt med varmedenatureret lysozym ved 20 at anbringe linserne i en saltopløsning med phosphatstødpude, hvortil der derefter blev sat tilstrækkelig meget lysozym til at give en 0,1 vægt% opløsning. Lysozymet var fra æggehvide.

Der blev opstillet individuelle flasker, som indeholdt 5 ml af lysozymopløsningen og en fuldt hydratiseret linse. Flaskerne 25 blev så opvarmet i ca. 30 minutter til ca. 95°C. Linsen blev så udtaget, og efter at være blevet afkølet blev den skyllet med destilleret vand og undersøgt for at bestemme typen af lysozym-ansamling.

Klassificering af aflejring: Først blev linsen befugtet med 30 normalt saltvand, gnedet mellem tommel- og pegefinger og derpå

DK 160742 B

15 grebet ved kanten med en plastpincet og igen skyllet med saltvand. Forsiden (den konvekse overflade) af linsen blev betragtet under mikroskop ved 100 ganges forstørrelse. En film eller aflejring, påvist under disse betingelser, blev klassificeret efter 5 den procentiske overflade, som var dækket af filmen.

Efter den beskrevne behandling viste alle linserne sig at have 100% af deres forside dækket af tynde aflejringer af proteinfilm.

Linserne blev så behandlet med opløsninger baseret på peroxid 10 og følgende enzympræparater:

Papain-tablet.

Bestanddel % vægt/vol.

Natriumborat, dihydrat 13,03%

Natriumcarbonat 21,25% 15 Polyethylenglycol 3350 2,74%

Papain 6,28%

Vinsyre 13,71% L-cystein HCl 6,86% EDTA 5,04% 20 Natriumchlorid 30,64%

Subtilisin A-tablet.

Bestanddel % vægt/vol.

Sorbit 29,99% N-acetylcystein 22,49% 25 Natriumcarbonat 38,98%

Polyethylenglycol 3350 3,00%

Subtilisin A 0,30%

Vinsyre 5,24%

DK 160742 B

16

Subtilisin A blev fremskaffet fra Novo Industries i Danmark.

Linserne blev delt i 4 grupper på 5. En gruppe blev behandlet med 3% hydrogenperoxid. En anden gruppe blev behandlet med det subtilisin A-holdige præparat (133,4 mg, 0,4 mg subtilisin A) 5 i 10 ml af et i handelen værende saltvandsprodukt (Lensrins ® , fremstillet og forhandlet af Allergan Pharmaceuticals, Inc.).

En tredje gruppe blev behandlet med subtilisin A-tabletten opløst i 10 ml 3% hydrogenperoxid, og den fjerde gruppe blev behandlet med 3% hydrogenperoxid(10 ml) indeholdende én papainenzym-tablet 10 (146,8 mg).

Linserne fik lov at udbløde i 3,5 time. Derefter blev hver gruppe linser behandlet på passende måde for at fjerne forsøgsopløsningen og undersøgt under mikroskop for at bestemme omfanget af proteinfjernelse. Den procentiske overflade, der var renset, var 15 lig med den procentiske overflade, der ikke var dækket med en proteinfilm ved 100 ganges forstørrelse. Resultaterne er vist nedenfor.

X ) 3% hydrogenperoxid.

% overflade Linse renset 20 Al 0 A2 1 A3 .0 A4 0 A5 1 X ) 25 Subtilisin A/saltvand Subtilisin A/3% % overflade % overflade

Linse renset Linse renset

Bl 30 Cl 50 B2 20 C2 60 B3 25 C3 70 30 B4 15 C4 60 B5 30 C5 50

DK 160742 B

17

Papain/3% E^Oj· % overflade Linse renset

El 0 E2 0 5 E3 0 E4 0 E5 0 X) (R)

Oxysept ^ - 3% hydrogenperoxid forhandlet af Allergan Pharmaceuticals, Inc.

10 Medens rensningsaktiviteten af hydrogenperoxid og papain/hydrogen-peroxid var i det væsentlige ikke eksisterende, bevirkede subti-lisin i kombination med 3% hydrogenperoxid rensning af mellem 50 og 70% af kontaktlinsens overfladeareal. Subtilisin A alene uden peroxid rensede mellem 15 og 30% af linseoverfladen, me-15 dens i sammenligning subtilisin A med 3% peroxid rensede mellem 50 og 70% af linseoverfladen. Subtilisin A og peroxid var ca. dobbelt så effektiv i rensevirkningen sammenlignet med subtilisin uden peroxid.

EKSEMPEL 2.

20 Peroxid/enzym-aktivitet: (S) 15 Hydrocurve II ^ linser (Barnes-Hind) blev udsat for lysozym, og tilstedeværelsen af type IV protein-ansamling blev bekræftet som beskrevet i eksempel 1.

5 linser blev hver udblødt i 8 timer i følgende opløsninger: 25 3% hydrogenperoxid (Oxysept 1, fremstillet af Allergan Pharma ceuticals, Inc.), i handelen værende pancreatinholdig enzym-

DK 160742 B

18 tablet (Opti-Zyme ® tab.), Opti-Zyme-tabletter opløst i 10 ml saltvandsopløsning (Boil-'n-Soak ® , en normal saltopløsning fremstillet af Alcon) og en opløsning af pancreatinenzym (Opti-Zyme® ), to tabletter, i 10 ml 3% hydrogenperoxid (Oxy-5 sept ® 1) .

Efter udblødning i 8 timer blev linserne behandlet for at fjerne resterende udblødningsopløsning, og den procentiske proteinfjernelse blev bestemt som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne var som følger: 10 3% hydrogenperoxid.

% overflade Linse renset

Al 0 A2 0 A3 0 15 A4 0 A5 0

Pancreatin/peroxid-opløsning Pancreatin/normalt saltvand % overflade % overflade

Linse renset Linse renset

Bl 90 Cl 0 20 B2 85 C2 0 B3 85 C3 0 B4 90 C4 0 B5 80 C5 0

Kombinationen af den pancreatinholdige enzymtablet og 3% peroxid 25 bevirkede væsentlig rensning, medens peroxidet alene og enzymet alene ikke havde nogen påviselig proteinfjernende virkning ved den 8 timers udblødning, der blev anvendt her.

DK 160742 B

19 EKSEMPEL 3.

Virkning af peroxidkoncentration:

Hydrocurve ^ linser blev belagt med lysozym som i eksempel 1.

Den her anvendte subtilisin-tablet var den samme som i eksempel 1, med undtagelse af at N-acetylcysteinet var fjernet.

5 5 forskellige mængder hydrogenperoxid blev anvendt, begyndende ved en koncentration på 0,5% vægt/rumfang. Kontrollen var tabletten uden peroxid, hvor tonicitetsværdien var indstillet til ca. den af den 0,5%-ige peroxid/enzym-opløsning med natrium-chlorid. pH-værdien blev indstillet til mellem ca. 9,0 og 9,03 10 i hver opløsning med saltsyre. 5 linser blev behandlet i 3 timer ved stuetemperatur med 10 ml opløsning. Omfanget af proteinfjernelse (procent) fra linseoverfladen er anført i tabel I.

TABEL I.

Virkninger af peroxidkoncentration på rensevirkning.

Enzym- % peroxid, % linserensning koncentr. pH Tonicitet vægt/vol.

15 A 0,04 mg/ml 9,025 318 mOsm/kg 0 9,0 (5,5) B 0,04 mg/ml 9,086 330 mOsm/kg 0,5% 44,0 (8,9) C 0,04 mg/ml 9,016 390 mOsm/kg 1,0% 78,0 (2,7) D 0,04 mg/ml 9,022 643 mOsm/kg 1,5% 87,0 (2,7) E 0,04 mg/ml 9,023 796 mOsm/kg 2,0% 94,0 (4,2) 20 F 0,04 mg/ml 9,016 932 mOsm/kg 2,5% 97,0 (2,7) EKSEMPEL 4.

Bedømmelse af antimikrobiel virkning af subtilisin i 3% hydrogenperoxid:

DK 160742 B

20

Virkningen af et tabletteret præparat indeholdende subtilisin A (anført i eksempel 1) på den antimikrobielle aktivitet af hydrogenperoxid,når det er opløst i 3% hydrogenperoxid (Lensan A, Allergan Pharmaceuticals, Inc.) , blev afprøvet over for det 5 panel af mikroorganismer, som kræves af US FDA retningslinier for afprøvning af kontaktlinseopløsninger med henblik på effektivitet af desinfektion. Der blev anvendt standard-kulturmetoder, høst og kvantitativ mikrobiologisk analyse. De anvendte organismer var S.marcescens (ATCC 14756 eller 14041), S.aureus (ATCC 10 6538), P.aeruginosa (ATCC 9027 eller 15442), E.coli (ATCC 8739), C.albicans (ATCC 10231) og A.niger (ATCC 16404). Der blev anvendt en 133,4 mg tablet af subtilisin A-præparatet (0,4 mg sub-tilisin/tablet), der er anført i eksempel 1.

Resultaterne af denne undersøgelse er anført i tabel Γ.

TABEL I.

X) 15 Sammenligning af ekstrapolerede D-værdier i minutter.

Undersøgelse I Undersøgelse n 3% H202 3% H202

Organismer 3% + SU^*A 3% H2°2 + SU^*A

S.marcescens 2,5 1,7 3,5 1,3 S.aureus 4,0 3,0 4,0 2,0 20 P.aeruginosa 0,3 0,5 0,3 0,1 E.coli 2,5 0,9 1,7 0,2 C.albicans 36,5 13,0 15,0 9,0 A.niger 9,5 11,6 6,0 6,0 x) D-værdi er den tid, der kræves til at reducere et mikrobielt 5 25 angreb af 5x10 organismer pr. ml, 90% eller 1 logaritme.

Kontrollen, en enzymtablet i saltvand, viste ingen antimikrobiel virkning i en 24 timers periode.

DK 160742 B

21

En anden undersøgelse blev udformet på lignende måde som den første. Resultaterne er også vist i tabel I.

Tabel II angiver de gennemsnitlige dræbningshastigheder for de i tabel IA viste data.

TABEL II.

5 Gennemsnits-dræbningshastigheder (D-værdier) i minutter ved stuetemperatur.

Organismer 3% H2°2 3% H202/sub.A

S.marcescens 3,0 1,5 E.coli 2,1 0,6 10 P.aeruginosa 0,3 0,3 S.aureus 4,0 2,5 C.albicans 26,0 11,0 A.niger 8,0 9,0

Da den antimikrobielle aktivitet er mere effektiv, jo lavere 15 D-værdien er, viser hver af disse undersøgelser/ at 3% hydrogen-peroxid og subtilisin A tilsammen er et væsentligt mere effektivt desinficerende middel end hver af de to komponenter for sig.

EKSEMPEL 5.

20 Afprøvning af konserverende virkningsgrad: 3 paneler af organismer, et baseret på USP XXI-panelet, et andet blødt kontaktlinsepanel indeholdende repræsentative organismer krævet af FDA til afprøvning af antimikrobiel virkningsgrad af produkter til desinfektion af kontaktlinser og et tredie 25 "isolat"-panel omfattende udvalgte organismer, der almindeligvis

DK 160742 B

22 forekommer som naturlig flora på enten det menneskelige legeme eller omgivelserne, og som kan aflejres på kontaktlinser eller blive podet i kontaktlinseopløsninger, blev anvendt til at afprøve forskellen mellem de ekstrapolerede D-værdier af 3% 5 hydrogenperoxid (Oxysept I, Allergan Pharmaceuticals, Inc.), med og uden subtilisin A. De afprøvede organismer er anført i tabellerne.

Mikroorganismerne blev fremstillet ved standard-mikrobiologisk teknik. Hver prøve blev afprøvet dobbelt. Som et første trin 10 ved prøven blev 10 ml 3% hydrogenperoxid pipetteret i reagensglas med skruehætte. I udvalgte glas blev tilsat en tablet subtilisin A, hvis sammensætning er beskrevet i eksempel 1.

De subtilisinholdige glas blev slynget i ca. 2 minutter for at opløse subtilisintabletten. Smitteorganismen blev straks sat 15 til glasset. Efter en forudbestemt kontakttid blev overlevere kvantificeret i CFU/ml.

En D-værdi blev beregnet ved ekstrapolation fra dræbningskurver under anvendelse af en aerob pladetællingsmetode. Denne metode virkede i det væsentlige som følger: En portion prøveopløsning 20 blev udtaget straks efter den forudbestemte kontakttid, delt i to halvdele og dispergeret i to reagensglas indeholdende neutraliseringsmedier. En 10-dobbelt rækkefortynding af neutraliseringsmedierne blev fremstillet for at kompensere for det forventede restitutionsniveau. For et lavt restitutionsniveau blev 25 en lille portion overført direkte på en agarplade med neutraliseringsmiddel. For de andre tre rækkefortyndingsglas blev et lige så stort rumfang prøve anbragt på agarplader med neutraliseringsmiddel. Alle plader blev inkuberet ved 35 - 37°C i 2 - 7 dage eller længere, hvis det var nødvendigt. Kolonital blev så 30 registreret, og D-værdier blev beregnet som følger: Der blev taget gennemsnit for alle pladetal for hvert tidsinterval. Gennemsnitsdataene blev afsat på et semilogaritmisk papir med antallet af overlevere på ordinaten og kontakttiden på abscissen. Udgangspunktet (podningsniveau) blev forbundet med det første 35 punkt, som giver mindre end 10 organismer pr. ml, med en ret

DK 160742 B

23 linie. Hældningen af denne linie ekstrapoleret til 0 giver D-værdien. Dette omtales iøvrigt som "slutpunktanalyse".

TABEL III.

Ekstrapolerede dræbningshastigheder (D-værdier) af 3% hydrogen-5 peroxid (Oxysept 1) med og uden subtilisin.

Uden Med

Organisme og ID-nr. subtilisin subtilisin (1) USP XXI-panel:

Serratia marcescens, ATCC nr.14756 1,4 min. 1,0 min.

Staphylococcus aureus, 10 ATCC nr.6538 3,4 min. 2,1 min.

3,2 min. 2,6 min.

Pseudomonas aeruginosa, ATCC nr.9027 0,2 min. 0,2 min.

Escherichia coli, i ATCC nr.8739 1,0 min. 0,3 min.

15 Candida albicans, ATCC nr.10231 20,0 min. 13,0 min.

Aspergillus niger, ATCC nr.16404 10,0 min. 8,0 min.

(2) "Blød linse"-panel (FDA): 20 Serratia marcescens, ATCC nr.14041 1,7 min. 1,5 min.

Staphylococcus epidermidis, ATCC nr.17917 0,8 min. 1,5 min.

0,4 min. 1,0 min.

Pseudomonas aeruginosa, 25 ATCC nr.15442 0,6 min. 0,3 min.

Aspergillus fumigatus, ATCC nr.10894 13,5 min. 2,5 min.

Candida albicans, ATCC nr.10231 20,0 min. 13,0 min.

(forts.)

DK 160742 B

24

Uden Med subtilisin subtilisin (3) Forskellige isolater: ---------- ----------

Klebsiella pneumoniae, ATCC nr.13883 1,1 min. 0,6 min.

Pseudomonas cepacia, ATCC nr.17765 0,4 min. 0,2 min.

5 Proteus mirabilis, CSULB/VA 1,2 min. 1,0 min.

1,3 min. 0,9 min.

Proteus vulgaris, ATCC nr.17313 0,4 min. 0,3 min.

Candida parapsilosis, PM 4064 63,0 min. 55,0 min.

10 Penicillium sp.

(AquaTar isolat II) 2,5 min. 2,1 min.

EKSEMPEL 6.

Sammenlignende forstærkning af peroxid med og uden enzym;

Sammenlignende forstærkning af den antimikrobielle dræbnings-15 hastighed af forskellige opløsninger af 3% hydrogenperoxid, der skyldes tilsætning af subtilisinenzymet. Tallene i tabel IV repræsenterer det procentiske fald i D-værdien for en given peroxido pløsning plus subtilisintabletten fra eksempel 1 sammenlignet med den pågældende peroxidopløsning alene. AO-Sept-20 systemet anvendte en tungmetalkatalysator (platinbelagt skive) i flaskerne for at nedbryde peroxid som ifølge US-patent nr. 3.912.451.

DK 160742 B

25 TABEL IV.

£®£san_A Oxysept 1 AO-Segt (data fra (data fra

Organisme tabel II) tabel III)

Serratia marcescens 50% 29% 88%

Escherichia coli 71% 70% 90%

Pseudomonas aeruginosa 0 0 20%

Staphylococcus aureus 38% 28% 60% 5 Candida albicans 58% 35% 33%

Aspergillus niger 0% 20% 32%

Disse tal viser, at hver af de 3%-ige peroxidopløsninger er et meget mere effektivt desinfektionsmiddel, når subtilisin A er til stede. Virkningen er særligt udtalt i AO-Sept-systemet.

EKSEMPEL 7.

10 Virkning af peroxidkoncentration på enzymaktivitet:

Den enzymatiske aktivitet af subtilisin A-tabletten beskrevet i eksempel 1 og trypsin blev bestemt ved forskellige hydrogen-peroxidkoncentrationer under anvendelse af den modificerede Azocoll-metode [Sigma katalog]. Der blev anvendt Baker Chemi-15 cal Company 30% hydrogenperoxid. Passende fortyndinger blev fremstillet med en 0,02 M boratstødpude ved pH ca. 8,4. Azocoll-substrat og trypsin blev fremskaffet fra Sigma Corporation.

Peroxid blev først fortyndet med stødpude til de ønskede koncentrationer. En subtilisinenzym-tablet blev opløst i 10 ml stød-20 pude, hvortil der var sat 50 mg Azocoll-substrat. En ml af denne opløsning blev så sat til hver peroxidkoncentration, idet enzym/substrat-stødpudeopløsningen var kontrollen. Efter blanding blev reaktionen udført ved stuetemperatur i 2 minutter og derpå standset med 2 ml 10%-ig trichloreddikesyre, som ud-

DK 160742 B

26 fældede enzymet. Restfarvemålinger blev foretaget ved 520 nm. Subtilisin-resultater er vist i tabel IV, trypsin-resultater i tabel V.

TABEL IV.

5 Subtilisinaktivitet i hydrogenperoxid.

% H202 OD 520 0 0,27 1 0,39 2 0,57 10 3 0,56 4 0,66 4,5 0,56 5 0,68 6 0,68 15 8 0,90 30 0,91 TABEL V.

v)

Trypsinaktivitet i hydrogenperoxid.

% H202 OD 520 20 03 0,5 30 0,6 X ) 10 mg trypsinpulver blev sat til H202-opløsningen.

Tabel IV viser, at subtilisin A.er aktivt ved Azoco11-prøven gennem et bredt interval af peroxidkoncentrationer. Aktiviteten 25 ved 30% peroxid er ca. den samme som ved 8% koncentration.

Enzymaktivitet for subtilisin A synes at være mættet ved hydrogen-peroxidkoncentrationer mellem 2 og 6%. Tabel V viser, at trypsin

DK 160742 B

27 er aktivt i hydrogenperoxid.

EKSEMPEL 8.

Virkninger af perborat på enzymaktivitet:

Hydrocurve II ® linser blev belagt med varme-denatureret lyso-5 zym ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1. De følgende opløsninger baseret på subtilisin A (Novo Industries, Danmark) og natriumperborat blev fremstillet for at afprøve de kombinerede virkninger af perborat som peroxidkilde på den proteolytiske aktivitet af subtilisin A. Opløsning A: 0,04 mg/ml subtilisin 10 A, bicarbonatstødpude til indstilling af pH til 8,307.

Opløsning B: 0,02% (w/v) natriumperborat, bicarbonatstødpude, pH indstillet til 8,533. Opløsning C: 0,04 mg/ml subtilisin A, 0,02% (w/v) natriumperborat, bicarbonatstødpude, pH indstillet til 8,532. Hver behandling blev udført i et rumfang på 10 ml.

15 5 proteinbelagte linser blev udblødt i hver af disse opløsninger (10 ml) i 3 timer ved stuetemperatur. Alle linser blev så skyllet, og mængden af restprotein blev bestemt. Tabel VI angiver den gennemsnitlige procentmængde renset overflade efter disse behandlinger.

TABEL VI.

20 Sammenlignende rensning af enzym med og uden peroxid.

% renset overflade

Opløsning (gennemsnit) A 9,0 t 5,6 B 0 C 30,0 -12,2

Claims (12)

1. Fremgangsmåde til samtidig rensning og desinfektion af 5 kontaktlinser, kendetegnet ved, at linserne bringes i kontakt med en ophthalmisk acceptabel vandig opløsning hovedsagelig omfattende en desinficerende mængde peroxid og en effektiv mængde percxi dat ivt proteolytisk enzym i en tid tilstrækkelig til at fjerne i hovedsagen alle proteinansamlinger XO og til at desinficere unserne.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at opløsningen er pufret til en pH-værdi mellem 6 og 10.

3. Fremgangsmåde ifolge krav 1-2, kendetegnet ved, at enzymet findes i en mængde mellem 0,0001 og 0,5 Anson-enhe-der pr. ml, og peroxidet er hydrogenperoxid, som findes i en mængde mellem 0,05 og 10% vægt/rumfang.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at det proteolytiske enzym er subtil i sin, pancreatin eller trypsin i en mængde mellem 0,0003 og 0,05 Anson-enhea'er pr. ml.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, 25 at opløsningen omfatter 3% hydrogenperoxid og 0,0012 Anson- enheder pr. ml af subtilisin A.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-2, kendetegnet ved, at peroxidet er saltet af et perborat, persulfat, percarbonat, 30 di per isophthalsyre, peroxydiphosphat eller et al umi niumamino-hydroperoxidsalt.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at enzymet findes i en mængde mellem 0,0001 og 0,5 Anson-enhe- 35 der pr. ml, og peroxidet findes i en mængde på 0,02% vægt/rum-fang eller større. DK 160742 B

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at peroxidet er natr i umperborat, kal i uinpersul f at, natriumper-carbonat, diperisophthalsyre, peroxydiphosphatsal t eller natri umal umi ni umam i no hyd rope roxi d, og enzymet er subt i 1 i si η A i 5 en mængde på 0,0012 Anson-enheder pr. ml.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at opløsningen fremstilles ved at kombinere enzymet og peroxidet på det tidspunkt, hvor linserne bringes i kontakt med op- 10 løsningen.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at opløsningen fremstilles ud fra et tørt peroxid og tort enzym . 15

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at enzymet og peroxidet kombineres i pulverform eller tabletform.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1-11, kendetegnet ved, at den anvendes til kontaktlinser, som har en hydrofil overf1ade, 25 30 35