DK158673B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af cephalosporinforbindelser. - Google Patents

Description

, DK 158673B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte syntetiske cephalosporin-forbindelser, som er værdifulde som antibakterielle midler og kan anvendes ved både oral og parenteral administrering i fjerkræ og. dyr samt mennesker til behandling af infektionssygdomme forårsaget af Gram-positive og Gram-negative bakterier.

Mere specielt angår den foreliggende opfindelse kondensationsprodukterne af aldehyder, som er forskellige fra formaldehyd og acetaldehyd, med 3-thiolerede cephalosporiner, der i 7-stillingen har en α-aminophenylacetamido-substituent, som er substitueret i benzenringen med en para-hydroxygruppe.

2

DK 158673 B

De resulterende kondensationsprodukter i form af deres natrium- eller kaliumsalte udviser ønskværdig opløselighed, stabilitet og absorption. De foretrukne arter hydrolyserer hurtigt og fuldstændigt i legemet under gendannelse af den oprindelige amfotere 3-thiolerede cephalosporin; dette er ikke tilfældet med tilsvarende kondensationsprodukter med acetalde-hyd, formaldehyd eller acetone, hvilke produkter hydrolyserer fuldstændigt, men med en uønskværdig langsommere hastighed.

Derivater af forskellige a-aminocephalosporiner med nitro-substituerede heterocycliske aldehyder er beskrevet i USA patentskrift nr. 3.647.781. Reaktionsprodukter af forskellige a-amino-cephalosporiner med formaldehyd er omtalt i Sydafrikansk patentskrift nr. 72/8475, med acetaldehyd i Sydafrikansk patentskrift nr. 72/8474 og med forskellige aldehyder og ketoner i Sydafrikansk patentskrift nr. 72/8476.

Derivater af cephalosporiner, som i acylaminogruppen i 7-stillingen har en α-aminogruppe, der er blevet omsat med et aldehyd (men begrænset til methyl eller acetoxymethyl i 3-stillingen) er omtalt i USA patentskrift nr. 3.880.842, USA patentskrift nr. 3.887.546 og Farmdoc 49804W.

Reaktionsprodukterne af acetone med forskellige a-aminocephalosporiner er omtalt i patentlitteraturen som følger: 1) med cephaloglycin, i USA patentskrift nr. 3.303.193, 2) med cephalexin, i USA patentskrift nr. 3.714.146 og britisk patentskrift nr. 1.314.758 samt USA patentskrift nr. 3.780.028, 3) med 7-[α-amino-(2'-thienyl)acetamido]cephalosporansyre, i USA patentskrift nr. 3.311.621, 4) med visse ring-substituerede cephaloglyciner, i USA patentskrift nr. 3.464.985, og 5) med visse ring-substituerede cephalexiner og cephaloglyciner, i USA patentskrifterne nr. 3.489.750, 3.489.751 og 3.489.752.

3 DK 158673 B

Fjernere beslægtede forbindelser er mellemprodukterne, som fremstilles, når en cephalosporinkerne, f.eks. 7-ACA eller 7-ADCA, acyleres med et reaktivt derivat af en α-aminosyre, hvori α-aminogruppen er blevet beskyttet ved forudgående omsætning med en β-diketoforbindelse, såsom methyl-acetoacetat, methyl-aceto-acetamid eller acetylacetone; eksempler herpå findes i Farmdoc 22850W og 60669 V.

På penicillinområdet blev penicillinerne, som indeholder en α-aminogruppe i 7-acylamidosubstituenten, f.eks. ampicillin, og er omsat med ketoner og aldehyder, tilsyneladende først omtalt i USA patentskrifterne nr. 3.198.804 og nr. 3.198.788. Lignende reaktionsprodukter, som er fremstillet ud fra forskellige sådanne penicilliner ved omsætning med de samme eller forskellige aldehyder og ketoner, blev senere beskrevet i USA patentskrifterne nr. 3.230.214, 3.316.247 (diketoner), nr. 3.325.479 (diketoner), 3.489.746, 3.549.746, 3.558.602, 3.635.953, 3.641.000, 3.647.781 (som omfatter nogle cephalosporiner), 3.725.389, 3.780.028, 3.784.562 (diketon), 3.886.140, 3.888.848, 3.905.955 og 3.904.604 samt britisk patentskrift nr. 1.267.936.

Den foreliggende opfindelse angår nærmere betegnet en analogifremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med den almene formel: A-— H 0

N 1 W N—I-r I

COOR1 hvori A er hydrogen, hydroxy, methyl eller methoxy, 4

DK 158673 B

R^" er hydrogen, natrium eller kalium, 2 R er 2-furyl, 2“furan-5-suXf.onsyre, phenyl-2-sulfonsyre, 4-methoxyphenyl-3-sulfonsyre, 4-hydroxyphenyl-3-sulfon-syre, 2-carboxymethoxyphenyl, 4-carboxymethoxyphenyl, 3-hydroxy-4-carboxyphenyl, 4-(2'-carboxy)vinylphenyl, carboxyl, 2-carboxyphenyl, 3-carboxyphenyl, methan-sulfonsyre eller methandisulfonsyre, og er l,2,3-triazol-5-yl, tetrazol-5-yl, 1,2,4-thia-diazol-5-yl, l,3,4-thiadiazol-2-yl, 1,3,4-oxadiazol-2-yl eller 1,2,4-triazol-5-yl, hvor enhver af disse grupper er usubstitueret eller substitueret med 1 eller 2 lavalkylgrupper med 1 til 4 carbonatomer.

I de foretrukne udføreIsesformer har det til benzenringen (parastillet i forhold til hydroxylgruppen) forbundne carbon-atom D-configuration.

Forbindelserne I fremstillet ifølge opfindelsen giver vea hydrolyse amfotere cephalosporiner med formel II

A 0

^=\ II

ho-7 3-ch-c-hh—i-r

|h3 J-k^J-ch^-s-r3 II

COOE1 3 hvori A, R og R har de ovennævnte betydninger.

DK 158673 B

5

Forbindelserne I fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse udviser ønskværdig opløselighed, stabilitet og absorption. De foretrukne artef hydrolyserer hurtigt og fuldstændigt i legemet under gendannelse af den oprindelige amfotere cephalosporin med formlen II; dette er ikke tilfældet med tilsvarende derivater, som er fremstillet ud fra formaldehyd, acet-aldehyd eller acetone, idet de hydrolyserer fuldstændigt, men med en ønskværdig lavere hastighed. Forbindelserne ifælge den foreliggende opfindelse løser således problemerne, som skyldes ustabiliteten ved høj pH-værdi og den hyppige relative uopløselighed i zwitterionformen af de amfotere cephalosporiner med formlen II.

Forbindelserne I fremstilles ved at man (1) behandler en vandholdig .suspension af en amfoter cephalosporin med formlen A>>=\ 1 s \ s„p3 ii

W Ah, ^s R

ioOB1 2 3 hvori A, R og R har den ovenfor angivne betydning, eller et 2 solvat eller hydrat deraf med et aldehyd med formlen R CIIO, hvor o R har den ovenfor angivne betydning, og en tilstrækkelig mængde af en vandopløselig natrium- eller kaliumbase til at hæve reaktionsblandingens pH-værdi til 5,5-8 og for i opløsningen at danne det ønskede salt med formel I, og (2) fra opløsningen udvindeif. det ønskede salt med formel (I) .

I de foretrukne udførelsesformer af den foreliggende opfindelse er aldehydet med en syrefunktion i form af 6

DK 158673 B

O

II /°\ H-C—| s—S03Na 5-formyl-2-furansulfonsyrenatriumsalt/

CHO

|^WpS03H

o-benzaldehydsulfonsyre,

CHO

Λ

[^J-SOsH

OCH 2 4-methoxybenzaldehyd-3-sulfonsyre,

X

l'Xso3H

CH

4-hydroxybenzaldehyd-3-sulfonsyre, cho |^W_och2coqh 0 och2cooh o- og p-formylphenoxyeddikesyre,

7 DK 158673 B

COQH

CHO

5-formyl-salicylsyre,

CHO

As.

Ψ

CH=CHC00H

p-formyl-kanelsyre, OCH - COOH glyoxylsyre,

(jHO

aCOOH

phthalaldehydsyre,

CHO

ό

X

p-formyl-benzoesyre, OHC - CH2S03Na 8

DK 158673 B

acetaldehydsulfonsyrenatriumsalt eller OHC - CH(S03Na)2 acetaldehyddisulfonsyrenatriumsalt.

Yderligere foretrukne udførelsesformer af den foreliggende 2 opfindelse er de former med formlen 1/ hvori A er hydrogen, R er afledt fra et af de ovennævnte aldehyder og fortrinsvis især er

Ul ellar R3 “ eller ^ /

H

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse løser problemet i forbindelse med formulering af forholdsvis vand-uopløselige (mindre end 125 mg/ml) amfotere 3-thiolerede cephalosporiner til intravenøs injektion, som kræver sande opløsninger med en koncentration på omkring 250 mg i kun 1 eller 2 ml til bolus-injektion. Tillige kan en sådan doseringsform forsendes som en tør-påfyldningsform (flaske eller blot pulver), som rekonstitueres umiddelbart før brug ved tilsætning af sterilt vand, men på den tid skal stoffet også opløses fuldstændigt i løbet af nogle få minutter for at være praktisk til sådant brug.

Endvidere må forbindelsen ikke miste mere end 10% af sin bioaktivitet i løbet af de 4 til 6 timer, som kræves til infusionen, når den sættes (efter sådan rekonstituering) til et større volumen infusionsfluidum til intravenøs dråbeinfusion for at tilvejebringe en koncentration i området fra 10 til 25 mg/ml.

Amfotere 3-thiolerede cephalosporiner, som i deres zwitterionform har en vandopløselighed på mindre end omkring 125 mg/ml, er tydeligvis ikke velegnede og kan tillige sædvanligvis ikke omdannes til almindelige, opløselige natriumsalte (ulig deres ikke-amfotere modparter, såsom cephalothin etc.), fordi den krævede pH-værdi er så høj, at den forårsager dekom-ponering, og endvidere formodes den ved den pH-værdi eksisterende frie aminogruppe at katalysere dekomponering.

DK 158673 B

9

Forbindelserne med formlen I har et asymmetricenter ved carbonatomet, som er forbundet til 2 nitrogenatomer. Således kan forbindelser med formel I eksistere i form af DL-blandingen eller som de enkelte D- eller L-isomere.

Det i trin 1) i den ovennævnte fremgangsmåde anvendte cephalosporin-udgangsmateriale kan være en hvilken som helst form af den amfotere cephalosporin med formel II, indbefattet den frie sure zwitterion eller et hydrat eller solvat af denne zwitterion.

Koncentrationen af amfoter cephalosporin-udgangsmateriale er ikke kritisk, og gode resultater er blevet opnået med koncentrationer mellem omkring 25 og 300 mg cephalosporin-udgangsmateriale pr. ml opløsningsmiddel. Udgangsmaterialet formales og sigtes fortrinsvis til en findelt tilstand, formales fortrinsvis især til en partikelstørrelse på mindre end 0,127 mm (200 mesh) til forøgelse af overfladearealet og omsætningshastigheden.

Det amfotere cephalosporin-udgangsmateriale opslæmmes i vand til dannelse af en vandig opslæmning.-Et alternativ til anvendelse af en vandig opslæmning i trin 1) ville være at opslæmme cephalosporin-udgangsmaterialet i et organisk opløsningsmiddel, som er 1) et opløsningsmiddel for alkalimetalsalt-slutproduktet, 2) blandbart med aldehydet, 3) kemisk inert overfor cephalo-sporin-udgangsmaterialet og slutproduktet og 4) let fjerneligt fra slutproduktet såsom ved mild tørring. Eksempler på organiske opløsningsmidler, som kunne anvendes, er dimethylsulfoxid og dimethylformamid. På grund af vanskeligheden med fjernelse af resterende organisk opløsningsmiddel fra alkalimetalsalt-slutproduktet tilvejebringes udgangsmaterialet imidlertid fortrinsvis som en vandig opslæmning.

Efter opnåelse af cephalosporin-udgangsmaterialet i opslæmning dannes det ønskede alkalimetalsalt med formel I i opløsning

10 DK 158673B

ved tilsætning af aldehydet og en mængde vandopløselig alkali-metalbase, fortrinsvis en natrium- eller kaliumbase, tilstrækkelig til forøgelse af reaktionsblandingens pH-værdi til mellem omkring 5,5 og 8. Efterhånden som pH-værdien forøges, indtil den ligger inden for dette område, dannes alkalimetalsaltet af reaktionsproduktet af den amfotere cephalosporin og aldehydet og går i opløsning.

Temperaturen, ved hvilken trin a) udføres, er ikke kritisk. Omsætningen kan udføres ved stuetemperatur; men højere eller lavere temperaturer kan anvendes, og temperaturer i området mellem 50 og 60 °C foretrækkes.

Omkring 1 mol aldehyd kræves pr. mol cephalosporin-udgangs-materiale, men aldehydet tilsættes fortrinsvis i noget overskud i forhold til den nødvendige teoretiske mængde til sikring af fuldstændig omsætning, dvs. et lille molært overskud. Det mest foretrukne forhold mellem aldehyd og cephalosporin-udgangsmate-riale er omkring 1,3 til 1,4:1, og ofte foretrækkes 1:1.

Natrium- eller kaliumbasen kan være en hvilken som helst vandopløselig base, som er i stand til 1) tilvejebringelse af natrium-· eller kaliumioner, og 2) forøgelse af reaktionsblandingens pH-værdi til mellem omkring 5,5 og 8, fortrinsvis især omkring 6,2 til 7,2. Foretrukne baser er natriumeller kaliumhydroxid, på grund af deres ønskværdige opløselig- 3 hedsegenskaber. R -S- delen af forbindelse I kan spalte fra ved høj pH-værdi. Af denne grund sættes basen til reaktionsblandingen på en sådan måde, at pH-værdien ikke får lov til at stige over omkring 8. Fortrinsvis anvendes basen i form af en vandig opløsning og tilsættes langsomt til reaktionsblandingen under omrøring, indtil omsætningen viser sig at være fuldstændig ved pH-værdimå Ung og ved dannelse af en opløsning eller næsten en opløsning. Mængden af anvendt base er ikke kritisk, men fortrinsvis anvendes omkring 1 mol base pr. mol cephalosporin-udgangsmateriale.

Til opnåelse af de bedste resultater filtreres den ved af-

n DK 158673 B

slutningen af trin 1) opnåede opløsning til fjernelse af faste urenheder før udvindingstrinet 2), Før filtrering kan opløsningen eventuelt carbon-behandles med aktiveret carbon til hjælp for fjernelse af alle farvede urenheder.

Det ønskede produkt med formel I udvindes derpå fra vandig eller ikke-vandig opløsning, såsom ved udfældning eller lyo-filisering. Udfældning af alkalimetalsaltet kan udføres ved tilsætning af et organisk opløsningsmiddel, hvori det ønskede salt er uopløseligt, dvs. et anti-opløsningsmiddel. Eksempler på sådanne anti-opløsningsmidler er isopropanol, n-propanol, t-butanol og acetonitril.

Opløsningsmidlet til anvendelse i udfældningstrinet bør være et, som let kan fjernes fra slutproduktet under betingelser, som ikke vil resultere i nogen nævneværdig dekomponering af alkalimetalsaltet. Det mest foretrukne anti-opløsningsmiddel er isopropanol. Anti-opløsningsmidlet kan sættes til den fra trin 1) resulterende opløsning, eller, alternativt og fortrinsvis, opløsningen, som indeholder det ønskede alkalimetalsalt, sættes under omrøring til et stort overskud af anti-opløsningsmidlet. Alkalimetalsaltet med formel I udvindes derpå ved filtrering, udvaskes med et passende organisk opløsningsmiddel, f.eks. isopropanol, og tørres ved koventionelle fremgangsmåder, f.eks. vakuum-tørring ved 50 til 56 °C i 24 til 48 timer eller luft-tørring ved 60 °C i 48 timer. Som en alternativ fremgangsmåde til udvinding af slutproduktet ved udfældning kan saltet med formel I også udvindes ved lyofilisering af den i trin 1) fremstillede opløsning.

En alternativ fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne med formel I omfatter: 1) Dannelse af en opslæmning af den amfotere cephalosporin eller et solvat eller hydrat deraf i et velegnet inert organisk opløsningsmiddel, hvor dette opløsningsmiddel er et opløsningsmiddel for triethylaminsaltet af aldehydreaktionsproduktet af 12

DK 158673 B

den amfotere cephalosporin og et ikke-opløsningsmiddel for alkalimetalsaltet med formel I, 2) behandling af opslæmningen med aldehydet og tilstrækkeligt triethylamin til dannelse af triethylaminsaltet af aldehydreaktionsproduktet af den amfotere cephalosporin i opløsning, og 3) udfældning af det ønskede alkalimetalsalt med formel I fra opløsningen ved tilsætning af en opløsningsmiddel-opløselig natrium- eller kaliumbase.

Udgangsmaterialet opslæmmes i et inert organisk opløsningsmiddel, som er et opløsningsmiddel for triethylaminsaltet eller aldehydreaktionsproduktet af den amfotere cephalosporin, men som er et ikke-opløsningsmiddel for det ønskede alkalimetalsalt med formel I. Det for trin 1) valgte opløsningsmiddel bør fortrinsvis være let fjerneligt fra slutproduktet under betingelser, som ikke vil resultere i nogen nævneværdig dekomponer ing af slutproduktet. Passende opløsningsmidler for trin 1) kan bestemmes ved simple forsøg.

Den i trin 1) dannede opslæmning behandles derpå med et aldehyd, fortrinsvis med et molært overskud og især fortrinsvis med fra omkring 1,3 til 1,4 mol aldehyd pr. mol cephalosporin-udgangsmateriale, og tilstrækkelig triethylamin til dannelse af triethylaminsaltet af det cycliske reaktionsprodukt af aldehydet og den amfotere cephalosporin i opløsning. Reaktionsblandingen omrøres fortrinsvis i mindst omkring 30 minutter til sikring af fuldstændig omsætning. Mængden af anvendt triethylamin er ikke kritisk, men fortrinsvis anvendes omkring 1 mol pr. mol cephalosporin-udgangsmateriale. Omsætningen i trin 2) udføres bekvemt ved stuetemperatur, men temperaturer, som er højere eller lavere end denne, kan vælges med den forventede henholdsvis formindskelse eller forøgelse i omsætningstid.

Efter dannelse af en opløsning eller næsten en opløsning i trin 2) carbon-behandles og filtreres reaktionsblandingen

DK 158673 B

13 fortrinsvis, som i den ovenfor beskrevne førstnævnte fremgangsmåde.

Det ønskede alkalimetalsalt med formel I kan dernæst udvindes fra opløsningen i trin 2) ved tilsætning af et opløsningsmiddel-opløseligt natrium- eller kaliumsalt. De foretrukne salte er natrium- eller kaliumsalte af organiske syrer med mellem omkring 2 og 18 carbonatomer, f.eks. opløsningsmiddel-opløselige salte af sådanne syrer som 2-ethylhexansyre, capronsyre, oliesyre, glycolsyre, propionsyre, eddikesyre etc.

Foretrukne salte for methanol-opløsningsmiddelsystemet er natrium- eller kalium-2-ethylhexanoat, fortrinsvis især opløsninger af disse salte i et methanol-blandbart organisk opløsningsmiddel, såsom isopropanol. De mest foretrukne alkalimetalsalte er opløsninger af natrium- eller kalium-2-ethylhexanoat i isopropanol. Alkalimetalsaltet tilsættes, fortrinsvis langsomt og under omrøring, i tilstrækkelig mængde til opnåelse af den maksimale mængde bundfald fra opløsningen. Efter at fuldstændig udfældning har fundet sted, omrøres reaktionsblandingen, fortrinsvis i mindst omkring 1 time, og filtreres derpå. Bundfaldet udvaskes med et passende organisk opløsningsmiddel, f.eks. methanol, og tørres ved konventionelle fremgangsmåder, f.eks. vakuum-tørring ved 50 til 56 °C i 24 til 48 timer eller lufttørring ved 60 °C i 48 timer.

Den anden fremgangsmåde kan også følges uden brug af tri-ethylaminen i trin 2). Ved denne modificerede fremgangsmåde opslæmmes opslæmningen af den amfotere cephalosporin eller solvat eller hydrat deraf, fortrinsvis methanol- eller propylen-glycol-solvatformen eller hydratformen og især fortrinsvis methanolsolvatet, i et inert organisk opløsningsmiddel, som er et ikke-opløsningsmiddel for produktet med formel I, fortrinsvis methanol, og opslæmningen behandles dernæst med aldehydet, fortrinsvis i et molært overskud, og en opløsningsmiddel-opløselig natrium- eller kaliumbase, hvor denne base tilsættes i en mængde 14

DK 158673 B

som er tilstrækkelig til forøgelse af reaktionsblandingens pH-værdi til mellem omkring 5,5 og 8. Det foretrækkes at anvende som baser natrium- eller kaliumsaltene, der er nævnt ovenfor som værende de foretrukne ved den anden fremgangsmåde. Ved den modificerede fremgangsmåde går cephalosporin-udgangsmaterialet i opløsning, og det uopløselige alkalimetalsalt udfældes derpå næsten øjeblikkeligt. Eftersom en opløsning ikke opnås ved fuldførelse af denne omsætning, udføres fortrinsvis omrøring af reaktionsblandingen og opvarmning til omkring 45 til 50 °C i en tidsperiode på op til adskillige timer til sikring af maksimale udbytter af slutprodukt. Det faste produkt fjernes ved filtrering, udvaskes og tørres til opnåelse af det ønskede salt med formel I.

Alkalimetalsaltene ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til tilvejebringelse af farmaceutiske formuleringer af den amfotere cephalosporin, som har acceptabel termisk stabilitet i den faste tilstand, stor opløselighed i vand, tilfredsstillende vandstabilitet, ringe eller ingen muskel- eller veneirritation ved intravenøs eller intramuskulær injektion og udmærket in vivo og in vitro antibakteriel aktivitet mod mange forskellige Gram-positive og Gram-negative bakterier.

Natrium- og kaliumsaltene med formel I kan opløses i vand til dannelse af forholdsvis koncentrerede opløsninger med mindst 250 mg/ml aktivitet. Koncentrationer med 250 mg/ml aktivitet (pH-værdi 5,7 - 6,8) af disse salte har acceptable vandstabili-teter.

I fortyndet vandig opløsning hydrolyserer forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse til den oprindelige amfotere cephalosporin med formel I. I sure vandige opløsninger ved en hvilken som helst koncentration hydrolyserer forbindelserne ifølge opfindelsen hurtigt til den oprindelige cephalosporin. Denne egenskab gør forbindelserne formålstjenlige til rensning af det oprindelige amfotere antibioticum, f.eks. kan de i fast form udvaskes med ikke-vandige opløsningsmidler til fjernelse

DK 158673B

±3 af urenheder, som er opløselige i sådanne opløsningsmidler, og genomdannes efter sådan behandling let til det oprindelige amfo-tere antibioticum.

Aktiviteter af forbindelserne med formel I er i det væsentlige ækvivalente med aktiviteterne af den oprindelige amfotere cephalosporin.

I et andet aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse et farmaceutisk præparat, som ved rekonstituering med vand er velegnet til anvendelse som en parenteralt administrerbar antibiotisk formulering, og som omfatter en forbindelse med formel I og en fast farmaceutisk acceptabel vandopløselig organisk syre, som er til stede i en sådan mængde, at præparatets pH-værdi ved rekonstituering med vand ligger mellem omkring 5,5 og 7,5.

Den tørre blanding af salt med formel I og organisk syre i det ovennævnte præparat kan rekonstitueres med vand til tilvejebringelse af en højkoncentreret (dvs. op til mindst 250 mg/ml) til parenteral administrering velegnet opløsning. Det ifølge opfindelsen tilvejebragte præparat kan også fremstilles ved blanding af en forbindelse, som har formel I, med en tilstrækkelig mængde af en farmaceutisk acceptabel vandopløselig fast organisk syre, således at præparatets pH-værdi ved rekonstituering med vand ligger mellem omkring 5 og 6.

Den i præparatet anvendte organiske syre kan være enhver ikke-toksisk, vandopløselig, fast organisk syre. Eksempler på velegnede syrer er citronsyre, vinsyre, glycinhydrochlorid, ascorbinsyre, ravsyre og lignende. Den mest foretrukne syre til anvendelse i præparatet ifølge den foreliggende opfindelse er citronsyre.

De nøjagtige forhold mellem forbindelse med formel I og fast organisk syre afhænger af de fysiske og kemiske egenskaber af den valgte syre, f.eks. aciditet, opløselighed etc. Sædvanligvis finder man, at det ønskede pH-værdi-område på 5 til 6 ved rekonstituering med vand opnås, når den faste organiske syre

16 DK 158673 B

anvendes i en mængde på omkring 4 til 6 vægtprocent af forbindelsen med formel I.

Forbindelserne med formel I såvel som de ovennævnte præparater er kraftige antibakterielle midler, som er velegnede ved både oral og parenteral administrering i behandling·, af infektionssygdomme hos fjerkræ og dyr samt mennesker, hvilke sygdomme er forårsaget af mange Gram-positive og Gram-negative bakterier.

Saltene og blandingerne af salt-organisk syre ifølge den foreliggende opfindelse kan formuleres som farmaceutiske præparater, der indeholder tillige med den aktive bestanddel en farmaceutisk acceptabel bærer eller fortynder. Forbindelserne kan administreres enten oralt eller parenteralt, men er på grund af deres høje opløselighed i vand især velegnede til parenteral administrering. I behandling af bakterielle infektioner i mennesker kan forbindelserne og præparaterne administreres i en mængde på fra omkring 5 til 20 mg/kg/dag i opdelt dosering, f.eks. 3 eller 4 gange pr. dag. De administreres i doseringsenheder, som f.eks. indeholder 125, 250 eller 500 mg aktiv bestanddel.

I det følgende beskrives fremgangsmåder til fremstilling af udgangsmaterialer til anvendelse ved syntesen af forbindelserne med formlen I.

Fremgangsmåde til fremstilling af 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxypheny1)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre,methanolsolvat.

I en trehalset kolbe, forsynet med en tilbagesvalingskondens a tor, en ovenfor anbragt omrører og et termometer, anbragtes en grundigt blandet blanding af 8,36 g (0,05 mol) D-(-)-p-hydroxyphenylglycin og 3,02 g (0,075 mol) magnesiumoxid i 120 ml 50% vandig dioxan. Blandingen omrørtes i 1 time og behandledes derpå med 10,74 g (0,075 mol) t-butoxycarbonyl-

DK 158673B

17 azid. Blandingen omrørtes og opvarmedes derefter til 45 - 50 °C i 17 timer under N2· Opløsningen fortyndedes med 400 ml H20 og ekstraheredes 2 gange med 300 ml ethylacetat. Den vandige fase gjordes.sur med 10% citronsyreopløsning indtil pH-værdi 4 og mættedes med NaCl. Den vandige blanding ekstraheredes med 3 x 400 ml ethylacetat. Opløsningen tørredes over Na2sO^, og opløsningsmidlet afdampedes. Remanensen tritureredes med "Skellysolve B" til opnåelse af D-a-t-butoxycarbonylamino-a-(p-hydroxyphenyl)eddikesyre som et faststof, der vejede 10,4 g (78,5%).

Til en opslæmning af 7-amino-3-(1,2,3-triazol-5-ylthio-methyl)-3-cephem-4-carboxylsyre (6,0 g, 19,0 mmol) i 100 ml tør methylenchlorid sattes 8,5 ml 1,1,1,3,3,3-hexamethyl-disilazan (40,9 mmol). Blandingen omrørtes og opvarmedes under tilbagesvaling i 4 timer, på hvilket tidspunkt en klar opløsning opnåedes. Opløsningsmidlet afdampedes, og remanens-olien udsattes for høj-vakuum natten over ved stuetemperatur. Den skumagtige remanens opløstes i 85 ml tør THF (tetrahydrofuran) og afkøledes til omkring -15 °C før indføring i den efterfølgende reaktionsblanding.

D-a-t-butoxycarbonylamino-α-(4-hydroxyphenyl)eddikesyre (4,4 g, 16,5 mmol) opløstes i 145 ml tør THF. Opløsningen omrørtes og afkøledes til -20 °C. N-methylmorpholin (1,6 g, 16 mmol) og isobutylchlorformiat (2,3 g, 16,8 mmol) tilsattes i rækkefølge med en sådan hastighed, at blandingens temperatur ikke oversteg omkring -10 °C. Den resulterende blanding omrørtes derpå i 20 minutter ved -12 til -15 °C. Den afkøledes derefter til -20 °C, og THF-opløsningen af silyleret 7-amino-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre tilsattes på én gang. Temperaturen steg til omkring -12 °C. Ydre afkøling afbrødes indtil temperaturen steg til 0 °C. På dette tidspunkt anbragtes et isbad, og blandingen omrørtes i 3 timer ved 2 til 3 °C. Dette efterfulgtes af en periode på 1 time uden ydre afkøling, hvor temperaturen steg til 20 °C.En total mængde på 30 ml methanol tilsattes, og omrøringen fortsattes i 15· minutter ved stuetempe-

DK 158673 B

18 ratur. Efter afdampning af opløsningsmidlerne under reduceret tryk opslæmmedes remanensen i 300 ml ethylscetat. Det opslæmmede faststof frafiltreredes, (11,8 g). Ethylacetatopløsningen ekstra-heredes 3 gange med NaHCO^ (5%) opløsning. De kombinerede natrium-hydrogencarbonatekstrakter afkøledes i et isbad, fase-adskiltes med ethylacetat og gjordes sure til en pH-værdi på 2,5 med 42,5% H^PO^. Faserne omrystedes og adskiltes derefter. Ethylacetatopløsningen tørredes derpå ved at lade den passere gennem natriumsulfat og inddampedes derpå til omkring 15 til 20 ml. Denne opløsning sattes dernæst dråbevis til omrørt/ i en Erlenmeyer kolbe indeholdt, cyclohexan (svarende til 400 ml) . Efter omrøring 1 en halv time samledes det udfældede faststof ved filtrering.

Den samlede faste 7-[D-a-t-butoxycarbonylamino-α-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl-syre luft-tørredes. Den vejede 1,75 g.

7-[D-a-t-butoxycarbonylamino-α-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(l,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, 3,5 g, opløstes i 80 ml HCOOH, 98-100%, og omrørtes i 2 timer ved stuetemperatur. HCOOH afdampedes under reduceret tryk (aspirator-bad-temperatur ikke over 40 °C) og azeotroperedes tilsidst 3 gange med 30 ml toluen. Faststoffet tørredes natten over under højvakuum over P2°5* En total mængde på 3,5 g skum opnåedes. Skummet, 2 g, omrørtes med 300 ml 1^0: CH^OH (8:2). Opløsningsmidlet filtreredes fra noget faststof (0,3 g), trækul-behandledes med 700 mg "Darko KB", filtreredes gennem diatome-jord ("Celite") og frysetørredes til opnåelse af 0,9 g rå 7- [D-ct-amino-α- (p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. Til udkrystallisering anvendtes den følgende fremgangsmåde. En opslæmning af 0,2 g af det rå materiale i 6 ml 99% methanol opvarmedes i et forsøgsrør til kogning. Opvarmningen afbrødes øjeblikkeligt, og smelten tritureredes med korn. Smelten størknede til en krystallinsk masse. På denne måde opnåedes en totalmængde på 0,211 g 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxypheny1)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre fra 0,400 g råt materiale. Materialet 19

DK 158673 B

tørredes ved 56 °C/0,1 mm over ?2°5 * ^0 timer, smeltepunkt > 200 °C, dekomponering. IR og NMR er konsistente med strukturen. NMR viste tilstedeværelsen af 1/3 mol CH^OH.

Analyse beregnet for ,^Ο,Ι/ΒΟΗ^ΟΗ: C 44,83; H 4,38; N 17,10; S 13,09

Fundet: C 43,97; H 4,36; N 15,84; S 6,18.

En total mængde på 6,5 g (11,55 mmol) 7-[D-a-t-butoxy-carbonylamino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre opløstes i 175 ml 98-100% myresyre under vandfri betingelser. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 2,5 timer. En del af opløsningen, 125 ml, inddampedes under reduceret tryk til en ravgul olie. Olien azeotroperedes derpå 3 gange med 70 ml toluen under reduceret tryk. Remanensen opslæmmedes i en 80:20 I^O-CHgOH-opløsning (700 ml) og omrørtes i 0,5 time, indtil det mest faststof opløstes, filtreredes derefter. Filtratet behandledes med 1,5 g ("Darko") trækul i omkring 20 minutter. Trækullet frafiltreredes gennem et "Celite"-lag. Opløsningen frysetørredes dernæst i 9 adskilte 100 ml rundkolber. Det frysetørrede materiale vejede 2,415 g. Det omkrystalliseredes i portioner på 0,200 g som beskrevet ovenfor til opnåelse af en total mængde på 0,923 g 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxy-phenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. NMR var konsistent og viste tilstedeværelsen af 1/3 mol CHgOH.

Analyse beregnet for ci8Hi8N6°5S2,H20, l/3CHgOH: C 44,83; H 4,38; N 17,10; S 13,09

Fundet: C 45,77; 44,36; H 4,44, 4,34; N 16,61, 16,52; S 13,01, 13,01.

Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk methanol- solvat af 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3- (1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

1. 50 g 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3- 20

DK 158673 B

(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre opslæmmes i 250 ml 95% volumen/volumen methanol/vand -(95% methanol)-opløsning ved 22 til 25 °C.

2. Koncentreret saltsyre tilsættes under hurtig omrøring indtil en pH-værdi på 1,3 til 1,5. En opløsning eller næsten en opløsning opnås.

3. pH-værdien indstilles til 1,7 med triethylamin.

4. 7,5 g aktiveret trækul ("Darco G-60") tilsættes, og der opslæmmes i 0,5 time.

5. Trækullet fjernes ved filtrering og udvaskes med 75 ml methanol, som sættes til filtratet. Trin 2, 3 og 4 bør fuldføres inden for 5 timer.

6. Det kombinerede udvaskningsmiddel og filtrat fra trin 5 omrøres hurtigt. Triethylamin tilsættes over en 5 minutters periode, indtil pH-værdi=4,5. Udkrystallisering begynder efter omkring 1 til 3 minutter. Blandingen opslæmmes i 1 time.

7. Krystallerne samles ved filtrering, udvaskes med 100 ml methanol og vakuum-tørres ved 56 °C i 24 timer. Bio-udbytte 75 - 90%; bio-prøve = 850 - 900 Ug/mg; NMR-IR = konsistent for 1 mol methanol; % vand, KF = 2 - 4,0.

Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk 1,2-propylenglycolsolvat af 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem~4-carboxylsyre.

1. 25 g af det ovenfor fremstillede methanolsolvat af 7- [D-ot-amino-α- (p-hydroxyphenyl) acetamido] -3- (l,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre opslæmmes i 150 - 200 ml 75% volumen/volumen propylenglycol-vandopløsning ved 20 - 25 °C.

2. Koncentreret saltsyre tilsættes indtil en pH-værdi på 1 til 1,2 til opnåelse af en opløsning eller næsten en opløsning.

3. Triethylamin (TEA) tilsættes langsomt under hurtig omrøring til opnåelse af en pH-værdi på 1,7 til 1,8.

DK 158673 B

21 4. 5 g "Darco G-60" tilsættes, og blandingen opslæmmes i 0,5 time. Trækullet fjernes ved filtrering (filtrering udføres langsomt, et 18,5 cm SS nr. 576 papir foreslås). Trækul-filterkagen udvaskes med 40 ml 75% volumen/volumen propylenglycol-vandopløsning. Udvaskningsmidlet sættes til filtratet.

Trin 2, 3 og 4 ovenfor bør fuldføres inden for 5 timer.

5. Triethylamin sættes til den hurtigt omrørte filtrat-udvaskningsmiddel-blanding fra trin 4, indtil pH-værdien = 4,5 over en 10 minutters periode. Krystaller dannes efter omkring 1 til 3 minutter. Blandingen opslæmmes i 1 time.

6. Propylenglycolsolvat-krystallerne af 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre samles ved filtrering. Filtrering udføres langsomt (et 12,5 - 15,0 cm SS nr. 604 papir foreslås). Krystallerne udvaskes i rækkefølge med 50 ml 75% propylenglycol, 50 ml methanol og 50 ml acetone og vakuum-tørres ved 56 °C i 24 timer. Biologisk udbytte: 80 - 95%.

Egenskaber af 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]- 3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, propylenglycolsolvat.

a. Bio-prøve = 850-900 yg/mg.

b. IR-NMR = konsistent for en struktur, som indeholder 1,0 - 1,5 mol propylenglycol (14-19% propylenglycol). Øjensynligt intet tab af 3-triazolsidekæden.

c. % vand, K.F. = 1-3,0.

d. Krystalmorfologi = 100% krystallinsk (mikrokrystaller, trekantformede).

e. Smeltepunkt = 182-184 °C (Dekomponering, varmbord).

f. [a](C = 1%; 1N-HC1) = +53°.

g. Vandopløselighed = omkring 10 mg/ml i vand ved 23 °C.

22

DK 158673 B

h. Tab af bioaktivitet ved henstand ved forhøjede temperaturer: 100 °C, 24 timer = <6%; 48 timer = <12%; 56 °C, 1 måned = <10%.

Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk methanolsolvat ud fra krystallinsk propylen-glycolsolvat.

Propylenglycolsolvatet af 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl-syre (50 g) fremstillet som ovenfor opslæmmes i 250 ml 95% (volumen/volumen) methanol-vandopløsning ved 22-25 °C. Koncentreret HC1 tilsættes under hurtig omrøring indtil en pH-værdi på 1,1-1,5, hvorpå en opløsning eller næsten en opløsning opnås. pH-værdien indstilles til 1,7 med triethylamin, og 7,5 g aktiveret trækul tilsættes under opslæmning i 0,5 time. Trækullet fjernes ved filtrering og udvaskes med 75 ml methanol. Udvaskningsopløsningen sættes derefter til filtratet. (Trinnene fra tilsætning af HC1 indtil dette tidspunkt bør fuldføres inden for 5 timer). Det kombinerede udvaskningsmiddel og filtrat omrøres hurtigt, og triethylamin tilsættes over en 5 minutters periode indtil en pH-værdi på 4,5 nås. Udkrystallisation begynder efter omkring 1-3 minutter. Blandingen opslæmmes i 1 time, og krystallerne fjernes ved filtrering, udvaskes med 100 ml methanol og vakuum-tørres ved 56 °C i 24 timer. Bio-udbytte 75 - 90%; bio-prøve = 850-900 Ug/mg; NMR-IR = konsistent for 1 mol methanol; % H20, K.F. = 2-4,0.

Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(l,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre,sesquihydrat.

7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre,methanolsolvat (15 g) opslæmmedes i 60 ml vand. pH-værdien hævedes til 6,5 ved tilsætning af 4N NaOH, og blandingen sendtes gennem en sigte med

DK 158673 B

24

En anden prøve af dihydratet luft-tørredes ved 45 °C i 24 timer til dannelse af det krystallinske sesquihydrat. H20/ K.F. = 5,5.

En prøve af dihydratet luft-tørredes ved 56 °C i 24 timer til dannelse af det krystallinske monohydrat af 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. H20, K.F. = 4,38 (teoretisk % 1^0 for monohydrat = 3,75).

En prøve af dihydratet vakuum-tørredes over Ρ20^. ved stuetemperatur i 24 timer til dannelse af det krystallinske hemi-hydrat af 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(l,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. H^O, K.F. = 2,63 (teoretisk % E^O for hemihydrat = 1,91).

En prøve af dihydratet vakuum-tørredes ved 56 °C i 24 timer til dannelse af det krystallinske hemihydrat. H20, K.F. = 1,6 - 2,0.

D-(-)-2-(31-methyl-41-hvdroxyphenyl)glycylehlorid,hydro-chlorid fremstilles i en høj grad af renhed og højt udbytte ved den følgende fremgangsmåde:

Omkring 0,06 mol D-(-)-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)-glycin opslæmmes i 100 ml dioxan. Opslæmningen omrøres, og COCl^ (phosgen) sendes ind, medens opslæmnings-temperaturen holdes ved 50 - 58 °C. C0C12 sendes ind i en totaltid på 3,5 timer. En gul opløsning opnås. Opløsningen renses med nitrogen til uddrivning af det overskydende COCl2· HCl-gas bobles gennem opløsningen i 2,5 timer. Opløsningen omrøres, og en lille mængde fortyndes med noget ether til opnåelse af nogle krystaller, som sættes til hele portionen som korn. Opløsningen omrøres ved 20 - 25 °C i 16 timer. Den resulterende opslæmning af krystallinsk D-(-)-2- (3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycylchlorid,hydro-chlorid filtreres til samling af produktet. Filterkagen udvaskes med dioxan og methylenchlorid og tørres derefter i en vakuum-ekssikkator over ?2°5 opnåelse af omkring 7 g D-(-)-2-(3'— methyl-41-hydroxyphenyl)glycylchlorid,hydrochlorid.

DK 158673 B

23 maskevidde på 0,127 mm (200 mesh). Reaktionsblandingen opslæm-medes ved stuetemperatur i 2 timer, i hvilken periode pH-værdien opretholdtes ved 6,5. Krystallerne fjernedes ved filtrering, udvaskedes med 20 ml vand og luft-tørredes ved 37 °C i 24 timer til dannelse af 11,5 g af det i titlen nævnte krystallinske produkt. Bio-prøve = 924 μg/mg (middel % H 0, K.F. = 5,26).

NMR og IR var konsistente for den foreslåede struktur og viste, at produktet indeholdt intet methanol, men faktisk indeholdt et spor propylenglycol.

Fremgangsmåde til fremstilling af krystallinsk 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre,sesquihydrat og dannelse af andre krystallinske hydrater.

7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-carboxylsyre,methanolsolvat (0,127 mm (200 mesh); 10,0 g), som i det væsentlige er fri for propylenglycol, opslæmmes i 30 - 40 ml deioniseret vand ved den omgivende stuetemperatur (20 - 25 °C) til dannelse af en vandig opslæmning med pH-værdi=3 - 4. NaOH (40%) tilsættes langsomt under hurtig omrøring til hævning af pH-værdien til 6,3 - 6,7. Blandingen opslæmmes ved pH-værdi 6,3 - 6,7 i 2 timer. Krystallerne fjernes ved filtrering, udvaskes med vand og luft-tørres ved stuetemperatur i 24 timer til dannelse af 75-80 vægtprocent udbytte på 950-1000 μ/mg krystaller af 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre,dihydrat. IR- og NMR-analyser var konsistente for den foreslåede struktur og viste, at produktet indeholdt intet methanol, men faktisk indeholdt et spor af propylenglycol. HgO, K.F. = 6,56.

En prøve af det krystallinske dihydrat luft-tørredes ved 37 °C i 24 timer til dannelse af det krystallinske sesquihydrat af 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. ^0, K.F. = 4,26.

DK 158673B

25 2--(31 -methyl-41 -hydroxyphenyl) glycin.

En opløsning af 59,02 g (0,6 mol) 75% glyoxylsyre i 100 ml vand sattes til en opslæmning af 54,6 g (0,5 mol) 2-methylphenol og 140 ml koncentreret ammoniumhydroxid i 400 ml vand ved stuetemperatur. Blandingens temperatur steg til 37 °C. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 65 timer. Opløsningen, som i begyndelsen havde en pH-værdi = 10.,1, indstilledes til pH-værdi = 6,8 med 6N saltsyre, hvad der forårsagede, at produktet udkrystalliserede. Produktet samledes ved filtrering, udvaskedes med vand og tørredes i vakuum over phosphorpentoxid til dannelse af 31,5 g (34,8%) 2-(3'-methyl-41-hydroxyphenyl)glycin; dekom-ponering 196 - 199 °C. Det infrarøde og det kernemagnetiske resonansspektrum var konsistent for det ønskede produkt. Reference: Belgisk patentskrift nr. 774.029 (Farmdoc 27, 122T), som angiver smeltepunkt 205 - 207 °C.

Analyse beregnet for CgH^NO^: C 59,66; H 6,13; N 7,73.

Fundet: C 57,68; H 6,23; N 7,47; H20, 2,34

Fundet, korrigeret for 2,34% vand: C 59,06; H 6,12; N 7,67.

D,L-N-chloracetyl-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)- glycin.

En opslæmning af 20,2 g (0,112 mol) D,L-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin i 175 ml vand indstilledes til pH-værdi = 10,3 med 20% natriumhydroxid, hvad der resulterede i en opløsning. Opløsningen afkøledes i et isbad. Chloreddikesyreanhydrid (38,2 g, 0,224 mol) tilsattes på §n gang, og pH-værdien af reaktionsblandingen opretholdtes ved pH-værdi 10 ved tilsætning af 20% natriumhydroxid, indtil ingen yderligere pH-værdi ændring registreredes. Reaktionsblandingen omrørtes i yderligere 10 minutter i kulden. Reaktionsblandingen gjordes derpå sur indtil pH-værdi = 2,0 med 6N saltsyre, hvad der forårsagede, at produktet udkrystalliserede. Produktet samledes ved filtrering, 26

DK 158673 B

udvaskedes med vand og luft-tørredes. Omkrystallisation fra 200 ml varmt vand gav 13,7 g (47,4%) D,L-N-chloracetyl-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin. Det infrarøde og det kernemagnetiske resonansspektrum var konsistente for det ønskede produkt.

Analyse beregnet for C11H12N04C1'H20: C 47,92; H 5,118; N 5,081.

Pundet: C 48,11; H 5,16; N 5,15.

D-(-)-N-chloracetyl-2-(31-methyl-41-hydroxyphenyl)- glycin.

D,L-N-chloracetyl-2-(3'“methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin (5,0 g 0,0194 mol) og L-ephenaminacetat (6,1 g, 0,0213 mol) opløstes i 50 ml isopropylalcohol ved opvarmning på et dampbad. Vand (50 ml) tilsattes, og ved afkøling udkrystalliseres L-ephenaminsaltet. Saltet samledes ved filtrering og luft-tørredes.

Saltet opslæmmedes i 30 ml vand og 50 ml methylenchlorid, og blandingen indstilledes til pH-værdi = 10,0 med 20% natriumhydroxid. Faserne adskiltes, og den vandige fase ekstraheredes to gange mere med methylenchlorid.

Den vandige opløsning indstilledes derpå til pH-værdi = 2,0 med 6N saltsyre, hvad der forårsagede, at produktet udkrystalliserede. Produktet samledes ved filtrering og tørredes i vakuum over phosphorpentoxid, hvad der medførte 0,9 g (36,1%) D-(-)-N-chloracetyl-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin; smeltepunkt 170 - 172 °C, [a]^4 = 185,9° (C = 1, 95% EtOH). Det infra røde og det kernemagnetiske resonansspektrum var konsistente for det ønskede produkt.

Analyse beregnet for C 51,27; H 4,696; N 5,436

Fundet: C 51,21; H 4,77; N 5,29.

l,2-diphenyl-2-methylaminoethanol, sædvanligvis kaldt ephenamin (ifølge Federal Register, 7. juni 1951) har strukturen: 27

DK 158673 B

OH NH

ch3

Forbindelsen kaldes også N-methyl-l,2-diphenyl-2-hydroxy-ethylamin eller a,3-diphenyl-3-hydroxy-N-methylethylamin eller I, 2-diphenyl-2-methylamino-l-ethanol.

Denne fremgangsmåde udnytter kun den levo-erythrose isomere. Fremgangsmåder til dens fremstilling og omsætning med penicillin G er beskrevet i USA patentskrifterne nr. 2.645.638 (V.V. Young) og 2.768.081 (F.H. Buckwalter). I det sidste patentskrift gennemgås tidligere litteratur, ligesom det gøres i W.B. Wheatley et al., J. Org. Chem., 18(11), 1564-1571 (1953). Denne forbindelse anvendtes til opspaltning af racemisk phenoxymethylpenicillin af Sheehan et al., J. Am. Chem. Soc., 81, 3089-3094 (1959)? se især p. 3091.

D-(-)-2-(3-methyl-41-hydroxyphenyl)glycin.

D-(-)-N-chloracetyl-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin (11,1 g, 0.0431 mol) kombineredes med 100 ml 2N saltsyre, og blandingen opvarmedes under tilbagesvaling i 1,5 time. Opløsningen afkølede, og pH-værdien indstilledes til 5,0 med 20% natriumhydroxid, hvad der forårsagede, at produktet udkrystalliserede. Produktet samledes ved filtrering, udvaskedes med vand og tørredes i vakuum over phosphorpentoxid til dannelse af 7,4 g (94,7%) D-(-)-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin, dekomponering 205 - 209 °C, [a]p4 = 152,6 0 (C = 1, 1 N HCl). Det infrarøde og det kernemagnetiske resonansspektrum var konsistente for det ønskede produkt.

28

DK 158673 B

Analyse beregnet for CgH^NC^: C 59,66; H 6,13; N 7,73.

Fundet: C 58,62; H 5,49; N 7,78; H20, 1,46.

Fundet, korrigeret for 1,46% vand: C 59,48; H 5,41; N 7,84.

D-(-)-N-t-butoxycarbonyl-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)-glycin.

Til en opslæmning i 200 ml E^O-dioxan (1:1) af 7,2 g (0,0397 mol) D-(-)-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin og 3,2 g (0,08 mol) pulveriseret magnesiumoxid, som blev omrørt ved stuetemperatur, sattes dråbevis 9,7 g (0,068 mol) t-butoxycarbonyl-azid. Reaktionsblandingen opvarmedes derpå til 42 - 45 °C under nitrogenatmosfære i 19 timer. Blandingen fortyndedes derefter med 100 ml isvand. Opløsningen fase-adskiltes med ethylacetat og filtreredes til fjernelse af noget uopløseligt materiale, som var udskilt. Filtratets vandige fase skiltes fra og ekstra-heredes 2 gange mere med ethylacetat. Den vandige opløsning indstilledes derefter til pH-værdi = 5,0 med 42% phosphorsyre og ekstraheredes 5 gange med ethylacetat. De kombinerede organiske ekstrakter udvaskedes 3 gange med vand, tørredes over natriumsulfat, og opløsningsmidlet fjernedes ved reduceret tryk efterladende en olie. Olien tørredes i vakuum over phosphorpentoxid resulterende i 10,6 g (95%) D-(-)-N-t-butoxycarbonyl-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin. Det infrarøde spektrum var konsistent for den ønskede struktur.

7-[D-2-t-butoxycarbonylamino-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl) acetami do] -3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

A. Blandet anhydrid.

En opløsning af 2,8 g (0,01 mol) D-(-)-N-t-butoxycarbonyl-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin i 100 ml tetrahydrofuran

DK 158673 B

29 afkøledes til -15 QC i et is-salt-acetone-bad. N-methylmorpholin (1,01 g, 0,01 mol) tilsattes efterfulgt af 1,37 g (0,01 mol) isobutylchlorformiat, og reaktionsblandingen omrørtes ved -15 til -20 °C i 8 minutter. Et bundfald af N-methylmorpholin,hydro-chlorid udskiltes øjeblikkeligt.

B. Kobling.

T-amino-S-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre (3,1 g, 0,01 mol) opslæmmedes i 100 ml vand, og 1,01 g (0,01 mol) N-methylmorpholin tilsattes. En fuldstændig opløsning opnåedes ikke. Derpå tilsattes 1,1,3,3-tetramethyl-guanidin dråbevis til denne omrørte opslæmning, indtil en klar opløsning opnåedes. Opløsningen afkøledes derefter til 4 °C i et isbad og sattes til blandet anhydrid-opløsningen ved -15 °C. Kølebadet fjernedes, og blandingen omrørtes i 1,5 time. Tetra-hydrofuranen fjernedes derpå ved reduceret tryk, og det vandige koncentrat fase-adskiltes med ethylacetat. Den vandige fase indstilledes til pH-værdi = 2,0 med 42% phosphorsyre, hvad der forårsagede, at uopløseligt materiale udskiltes. Faststoffet fjernedes ved filtrering. Filtratets vandige fase fraskiltes og ekstraheredes 2 gange mere med ethylacetat. De kombinerede organiske ekstrakter udvaskedes 2 gange med vand, tørredes over natriumsulfat, og opløsningsmidlet fjernedes ved reduceret tryk efterladende en viskos olie-remanens. Olien tritureredes med "Skellysolve B", som indeholdt en lille mængde diethylether, under frembringelse af et faststof. Dette faste produkt samledes ved filtrering, udvaskedes med "Skellysolve B" og luft-tørredes.

En TLC (silicagel; opløsningsmiddel, 97:3 acetone-eddikesyre) af produktet viste, at materialet var en blanding af det ønskede produkt og af sidekædesyren. Dette materiale omrørtes derefter med 100 ml vandfri diethylether i 1 time. Det uopløselige faststof samledes ved filtrering og luft-tørredes til dannelse af 0,95 g (16,4%) 7-[D-2-t-butoxycarbonylamino-(3'-methyl-41-hydroxypheny1)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl-syre. En TLC (silicagel; opløsningsmiddel 97:3 acetone-eddikesyre) 30

DK 158673 B

viste, at denne prøve kun indeholdt en spormængde af sidekæde-syren. Det infrarøde spektrum var konsistent for det ønskede produkt.

7-[D-2-t-butocycarbonylamino-(3'-methyl-4'-hydroxy- phenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)- 3-cephem-4-carboxylsyre.

A. Blandet anhydrid.

En opløsning af 14,06 g (0,05 mol) D-(-)-N-t-butoxy-carbony1-2-(3’-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin i 500 ml tetra-hydrofuran afkøledes til -15 °C i et is-salt-acetone-bad. N-methylmorpholin (5,06 g, 0,05 mol) tilsattes efterfulgt af 6,83 g (0,05 mol) isobutylchlorformiat, og reaktionsblandingen omrørtes ved -13 til -17 °C i 10 minutter. Et bundfald af N-methylmorpholin,hydrochlorid udskiltes øjeblikkeligt.

B. Silylester.

En blanding af 8,0 g (0,025 mol) 7-amino-3-(1,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, 7,0 ml (0,05 mol) tri-ethylamin, 6,9 ml (0,0545 mol) N,N-dimethylanilin, 9,5 ml (0,075 mol) chlortrimethylsilan og 650 ml methylenchlorid opvarmedes under tilbagesvaling i 3 timer. Yderligere 1,6 ml chlortrimethylsilan tilsattes efter den første times tilbagesvaling. Den uklare opløsning afkøledes, og methylenchloridet fjernedes ved reduceret tryk. Remanensen optoges i 500 ml tetra-hydrofuran.

C. Kobling.

Silylesteropløsningen afkøledes til 10 - 15 °C i et isbad og sattes på in gang til blandet anhydrid-opløsningen, som holdtes ved -15 °C. Kølebadet fjernedes, og reaktionsblandingen omrørtes i 2 timer. Derpå tilsattes 500 ml vand, og tetrahydro-furanen fjernedes ved reduceret tryk, hvad der forårsagede, at en gummiagtig olie udskiltes. Olien ekstraheredes i ethylacetat, og faserne adskiltes. Den vandige fase (pH-værdi= 3,8) fase-

DK 158673B

31 adskiltes med ethylacetat, hvad der forårsagede, at noget faststof udskiltes. Dette bundfald fjernedes ved filtrering, og filtratets vandige fase fraskiltes. Den vandige opløsning indstilledes til pH-værdi=2,3 med 42% phosphorsyre og ekstraheredes igen med ethylacetat. De kombinerede ethylacetatekstrakter udvaskedes 3 gange med vand, tørredes over natriumsulfat, og opløsningsmidlet fjernedes ved reduceret tryk efterladende en viskos olie. Olien omrørtes med 100 ml vandfri diethylether i 1,5 time til frembringelse af et faststof. Produktet filtreredes, udvaskedes sparsomt med vandfri diethylether og luft-tørredes. En TLC (silicagel; opløsningsmiddel, 99:1 acetone-eddikesyre) af produktet viste, at materialet var en blanding af det ønskede produkt, sidekæde-syren og en tredje uidentificeret bestanddel. Materialet omrørtes igen i 100 ml vandfri diethylether i 1,5 time. Det uopløselige faststof samledes ved filtrering og lufttørredes til opnåelse af 10,7 g (74,4%) 7-[D-2-t-butoxycarbonyl-amino-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. En TLC (silicagel; opløsningsmiddel 99:1 acetone-eddikesyre) viste, at denne prøve kun indeholdt en spormængde af sidekæde-syren og en tredje uidentificeret bestanddel. Det infrarøde spektrum var konsistent for det ønskede produkt.

7-[D-2-t-butoxycarbonylamino-(31-methyl-4'-hydroxyphenyl) acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre.

A. Blandet anhydrid.

En opløsning af 12,2 g (0,0434 mol) D-(-)-N-t-butoxycar-bony1-2-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)glycin i 425 ml tetrahydro-furan afkøledes til -15 °C i i et is-salt-acetone-bad. N-methylmorpholin (4,35 g, 0,0434 mol) tilsattes efterfulgt af 5,87 g (0,0434 mol) isobutylchlorformiat, og reaktionsblandingen omrørtes ved -15 °C i 10 minutter. Et bundfald af N-methyl-morpholin,hydrochlorid udskiltes øjeblikkeligt.

32

DK 158673 B

B. Silylester.

En blanding af 6,8 g (0,0217 mol) 7-amino-3-(1,2,3-triazol- 5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, 6,02 ml (0,043 mol) triethylamin, 6,0 ml (0,0473 mol) N,N-dimethylanilin, 8,26 ml (0,0651 mol) chlortrimethylsilan og 550 ml methylenchlorid holdtes opvarmet under tilbagesvaling i 2 timer. Den uklare opløsning afkøledes, og methylenchloridet fjernedes ved reduceret tryk. Remanensen optoges i 425 ml tetrahydrofuran.

C. Kobling.

Silylesteropløsningen afkøledes til 10 °C i et isbad og sattes på én gang til blandet anhydrid-opløsningen, som holdtes ved -15 °C. Kølebadet fjernedes, og reaktionsblandingen omrørtes i 2 timer. Derpå tilsattes 425 ml vand, og blandingen omrørtes i 5 minutter. Tetrahydrofuranen fjernedes ved reduceret tryk, hvad der forårsagede, at en gummiagtig olie udskiltes. Olien ekstraheredes i ethylacetat, og noget uopløseligt faststof, som udskiltes, fjernedes ved filtrering. Filtratets vandige fase fraskiltes, indstilledes til pH-værdi=2,0 med 42% phosphorsyre og ekstraheredes 2 gange mere med ethylacetat. De kombinerede ethylacetatekstrakter udvaskedes 3 gange med vand, tørredes over natriumsulfat, og opløsningsmidlet fjernedes ved reduceret tryk efterladende en viskos olie. Olien opløstes i 30 ml acetone, og denne opløsning sattes dråbevis til et grundigt omrørt 300 ml volumen vandfri diethylether. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 2,5 timer. Det uopløselige faststof, som udskiltes, samledes ved filtrering og luft-tørredes. En TLC (silicagel; opløsningsmiddel 99:1 acetone-eddikesyre) af produktet viste, at materialet var en blanding af det ønskede produkt, sidekæde-syren og en tredje uidentificeret bestanddel. Faststoffet omrørtes igen i 80 ml vandfri diethylether i 1 time. Det uopløselige materiale samledes ved filtrering, udvaskedes sparsomt med vandfri diethylether og luft-tørredes til dannelse af 5,8 g (46,5%) 7-[D-2-t-butoxycarbonylamino-(31-methyl-4'-hydroxy-phenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. En TLC (silicagel; opløsningsmiddel 99:1 acetone-

DK158673B

33 eddikesyre) viste, at denne prøve kun indeholdt et spor af side-kæde-syren og en tredje uidentificeret bestanddel. Det infrarøde spektrum var konsistent for det ønskede produkt.

7-[D-2-amino-(31-methyl-4'-hydroxyphenyl)acetamido]- 3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl- syre.

7-[D-2-t-butoxycarbonylamino-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre (0,95 g, 0,002 mol) sattes til 15 ml kold trifluor-eddikesyre, og opløsningen omrørtes i 15 minutter. Trifluor-eddikesyreopløsningen hældtes derpå i 200 ml 2:1 "Skellysolve B"-vandfri diethylether, og blandingen afkøledes. Det udfældede trifluoreddikesyresalt af produktet, 7-[D-2-amino-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(l,2,3-triazol-5-ylthiomethvl)-3-cephem-4-carboxylsyre, samledes ved filtrering, udvaskedes med 2:1 "Skellysolve B"-vandfri diethylether og tørredes i vakuum over phosphorpentoxid resulterende i 0,75 g stof.

Saltet (0,75 g) opslæmmedes i 50 ml vand, 25 ml "Amberlite LA-l"-harpiks-acetatform (25% i methylisobutylketon) og 25 ml methylisobutylketon og omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer.

Faserne adskiltes, og methylisobutylketonlaget ekstraheredes én gang med vand. De vandige faser kombineredes og ekstraheredes derefter 8 gange med diethylether. Den vandige fase filtreredes, og opløsningsmidlet fjernedes ved reduceret tryk. Remanensen tritureredes med methylisobutylketon til dannelse af et faststof. Stoffet samledes ved filtrering, udvaskedes med methylisobutylketon og acetone og tørredes ved 65 °C i vakuum over phosphorpentoxid til dannelse af 0,36 g (59,0%) 7-[D-2-amino-(3'-methyl-4'-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre; dekomponering >150 °C.

Det infrarøde og det kernemagnetiske resonansspektrum var konsistente for det ønskede produkt.

DK 158673 B

34 "LA-1”-harpiks er en blanding af sekundære aminer, hvori hver enkelt sekundær amin har den almene formel: f1 CH_ (CH.J inCH_NHC - R2 3 2 10 2 i R3 12 3 hvori enhver af R , R og R er et monovalent aliphatisk carbon- 12 3 hydridradikal, hvori R , R og R tilsammen indeholder fra 11 til 14 carbonatomer. Denne særlige blanding af sekundære aminer, som der undertiden heri henvises til som "Flydende aminblanding nr. II", er en klar ravgul væske med de følgende fysiske egenskaber: Viskocitet ved 25 °C på 70 centipoise; massefylde ved 20 °C på 0,826 g/cm3; brydningsindeks ved 25 °C på 1,4554; destillationsinterval ved 10 mm Hg, op til 170 °C - 0,5%, 170-220 °C - 3%, 220-230 °C - 90% og over 230 °C - 6,5%.

7-[D-2-amino-(3'-methyl-41-hydroxypheny1)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre kaldes også BL-S638.

2-(31-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycin.

En opløsning af 59,2 g (0,6 mol) 75% glyoxylsyre i 100 ml vand sattes til en opslæmning af 62,07 g (0,5 mol) 2-methoxy-phenol og 140 ml koncentreret ammoniumhydroxid i 400 ml vand ved stuetemperatur. Blandingens temperatur steg til 35 °C. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur i 65 timer. Produktet, som udkrystalliserede, samledes ved filtrering, udvaskedes med vand, derpå acetone og tørredes i vakuum over phosphorpentoxid til dannelse af 57,4 g (58,2%) 2-(3'-methoxy-4'-hydroxypheny1)-glycin; dekomponering 218-220 °C (litteratur 240 °C). Det infrarøde og det kernemagnetiske resonansspektrum var konsistente for det ønskede produkt.

Analyse beregnet for CgH^^NO^: C 54,82; H 5,62; N 7,10

DK 158673 B

35

Fundet: C 53,77; H 5,91; N 6,97. H^O, 1,13

Fundet, korrigeret for 1,13% ^O: C 54,38; H 5,85; N 7,05.

Reference: B. Block, Z. Physiol. Chem., 98, 226 (1917).

Opspaltning af 2- (3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycin.

A. Methyl-2-(31-methoxy-41-hydroxyphenyl)glycinat♦

En afkølet opslæmning af 94 g (0,476 mol) 2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycin i 500 ml absolut methanol gennemstrømmedes med stor hastighed med HCl-damp i 20 minutter. Først opnåedes en klar opløsning, og derpå udskiltes krystallinsk produkt i større mængde. Efter 20 timers forløb filtreredes methylester-hydrochloridet, hvorpå det udvaskedes sparsomt med methanol; 99,6 g efter luft-tørring. En afkølet opløsning af hydrochloridet i 800 ml vand indstilledes til pH-værdi=8 (NaOH) resulterende i et krystallinsk bundfald af esteren som fri base; 81,3 g. IR- og NMR-spektrene var konsistente.

Analyse beregnet for C]_øh;l3N04: C 56,86; H 6,20; N 6,63.

Fundet: C 56,46; H 6,28; N 6,55; H20 0,59.

B. D-(-)-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycin.

En blanding af 50 g (0,237 mol) methyl-2-(3,-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycinat, 19 ml (0,333 mol) eddikesyre og 1 liter i-PrOH (isopropylalcohol) opvarmedes til kogning resulterende i en delvis opløsning. Dibenzoyl-d-vinsyre,monohydrat (89,2 g, 0,237 mol) tilsattes under god omrøring, og derpå opvarmedes blandingen under tilbagesvaling. Snart begyndte saltet at udkrystallisere. Varmen afbrødes, og kolben henstod til langsom afkøling til stuetemperatur. Efter afkøling i et isbad samledes bundfaldet ved filtrering. Filtratet koncentreredes til omkring 1/3 af dets oprindelige volumen, resulterende i en lille anden

DK 158673B

36 portion salt? total udbytte af begge portioner 54,1 g efter luft-tørring (fast A, se herunder).

Filtratet koncentreredes til fjernelse af opløsningsmiddel. Den viskose remanens kombineredes med 300 ml IN HCl, og blandingen ekstraheredes med 400 ml CHCl^. CHCl^-fasen ekstraheredes 2 gange med 100 ml portioner af IN HCl. De kombinerede HC1-ekstrakter koncentreredes kortvarigt til fjernelse af rest-CHClg og opvarmedes under tilbagesvaling i 1 time. Opløsningen koncentreredes til et lille volumen/ hvad der forårsagede, at amino-syre-HCl-saltet udkrystalliserede. Produktet samledes ved filtrering og omkrystalliseredes fra 50 ml IN HCl. En opløsning af produktet i 200 ml vand indstilledes til pH-værdi 4,5 (NaOH). Blandingen opvarmedes omtrent til kogning og henstod til afkøling til udfældning af D-(-)-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycin som fnugagtige nålelignende krystaller. Efter afkøling natten over samledes produktet ved filtrering, udvaskedes sparsomt o 240 med vand og methanol og tørredes ved 40 C; 8,7 g, [a] = -136,5° (C = 1, IN HCl). IR- og NMR-spektrene var fuldt konsistente.

Analyse beregnet for CgH^NO^^O: C 50,23; H 6,09; N 6,51; H20, 8,37.

Fundet: C 50,43; H 6,23; N 6,51; H20, 8,95.

C. L-(+)-2-(3 r-methoxy-41-hydroxyphenyl)glycin.

Fast A (se ovenfor) (54,1 g) opslæmmedes i 300 ml IN HCl og 500 ml CHCl^ under god omrystning. Saltet opløstes ikke straks i dette system, derfor fraskiltes CHCl^ så godt som muligt, og 300 ml MIBK tilsattes under god omrystning. MIBK-fasen ekstraheredes med yderligere 200 ml IN HCl i 3 portioner. De kombinerede og filtrerede HCl-ekstrakter koncentreredes kortvarigt til fjernelse af rest-opløsningsmidler og opvarmedes under tilbagesvaling i 1 time til hydrolysering af esteren. Reaktionsblandingen koncentreredes til et lille volumen. Efter afkøling i et isbad

DK 158673 B

37 samledes det krystallinske aminosyre-HCl-salt ved filtrering. Saltet omkrystalliseredes fra 75 ml IN HC1 og opløstes i 500 ml vand under opvarmning, opløsningen blankfiltreredes og indstilledes til pH-værdi^^ (NaOH), hvad der forårsagede, at zwitter-ionen udkrystalliserede. Blandingen opvarmedes til kogning, filtreredes og henstod i kulden til udfældning af det krystallinske produkt, L-(+)-2-(31-methoxy-41-hydroxyphenyl)glycin.

Produktet samledes ved filtrering, udvaskedes sparsomt med vand o 24° o og methanol og tørredes ved 40 C; 9,6 g|'[a] D = +127,2 (C=l, IN HC1). IR- og NMR-spektrene var konsistente.

Analyse beregnet for CgH^^N04,H20: C 50,23; H 6,09; N 6,51; H20, 8,37. Fundet: C 50,53; H 6,06; N 6,62; H20, 7,46.

Natrium-D-N-(2-methoxycarbonyl-l-methy1vinyl-a-amino-a-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)acetat.

Til en omrørt opløsning af 3,02 g (0,078 mol) NaOH i 320 ml methanol sættes 0,08 mol D-(-)-2-(31-methoxy-4'-hydroxyphenyl)-glycin, og den resulterende blanding opvarmes under tilbagesvaling, medens en opløsning af 9,6 ml (0,088 mol) methyl-aceto-acetat i 80 ml methanol tilsættes i løbet af en 30 minutters periode. Efter yderligere 30 minutters tilbagesvaling afdestilleres methanolen, medens toluen tilsættes med samme hastighed, således at næsten det samme indholdsvolumen opretholdes. Når indholdstemperaturen når 100 °C afkøles opslæmningen i isvand i 4 timer, filtreres, udvaskes godt med toluen, luft-tørres og vakuum-tørres over ?2°5 til konstant vægt til dannelse af fast natrium-D-N-(2-methoxycarbonyl-l-methylvinyl)-a-amino-a-(3'-methoxy-41-hydroxyphenyl)acetat.

D-(-)-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycylchlorid, hydrochlorid fremstilles i en høj grad af renhed og højt udbytte ved den følgende fremgangsmåde: 38

DK 158673 B

Omkring 0,06 mol D-(-)-2-(3'-methoxy-4'-hydroxypheny1)-glycin opslæmmes i 100 ml dioxan. Opslæmningen omrøres, og COC^ (phosgen) sendes ind, medens opslæmningstemperaturen holdes ved 50 - 58 °C. COCI2 sendes ind i en totaltid på 3,5 timer. En gul opløsning opnås. Opløsningen renses med nitrogen til uddrivning af det overskydende COC^. HCl-gas bobles gennem opløsningen i 2,5 timer. Opløsningen omrøres, og en lille mængde fortyndes med noget ether til opnåelse af nogle krystaller, som sættes til hele portionen som korn. Opløsningen omrøres ved 20 - 25 °C i 16 timer. Den resulterende opslæmning af krystallinsk D-(-)-2-(3'-methoxy-41-hydroxyphenyl)glycylchlorid,hydrochlorid filtreres til samling af produktet. Filterkagen udvaskes med dioxan og methylenchlorid, og tørres derefter i en vakuum-exsiccator over ?2°5 *-il ^annelse af omkring 7 g D-(-)-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycylchlorid,hydrochlorid.

D-(-)-N-(t-butoxycarbonyl)-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl )glycin.

En blanding af 8,6 g (0,04 mol) D-(-)-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)glycin, 3,2 g (0,08 mol) magnesiumoxid, 9,7 g (0,068 mol) t-butoxycarbonylazid og 240 ml 1:1 dioxan-vand omrørtes og holdtes opvarmet ve 45-50 °C i 20 timer under en nitrogen-atmosfære. Den afkølede reaktionsblanding fortyndedes med 240 ml isvand, filtreredes og ekstraheredes én gang med ethylacetat. Den surgjorte (pH-værdi=2) vandige fase ekstraheredes 5 gange med ethylacetat. De kombinerede og tørrede (Na2S0^) ethylacetatekstrakter koncentreredes til fjernelse af opløsningsmiddel ved reduceret tryk resulterende i produktet som en viskos olie; 6,3 g.

Opspaltning af 2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin.

A. (-)-2- (3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin,d-10- camphorsulfonat.

En blanding af 5,0 g 2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin,

DK 158673 B

39 50 ml iseddikesyre, 6,5 g d-10-camphorsulfonsyre og 2,5 ml H2O opvarmedes til dannelse af en opløsning. Den varme opløsning blankfiltreredes og henstod ved stuetemperatur i 18 timer til udkrystallisering resulterende i 1,78 g af saltet. Omkrystallisation fra 15 ml eddikesyre efterfulgt af tørring ved 40°C gav 1,54 g (-)-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-glycin, d-10-camphorsulfonat; delvis dekomponering 164-170°C, derpå o 24° o dekomponering 175-180 C, [α]β = -35,3 (c=l, H20) .

De kombinerede eddikesyrefiltrater koncentreredes til et lille volumen ved reduceret tryk. Det krystallinske faststof frafiltreredes og omkrystalliseredes fra 15 ml eddikesyre resulterende i, efter tørring ved 40 °C,en anden portion produkt; 2,48 g, dekomponering 164 - 170 °C, ta]2^ = -32,2° (C=1,H20).

B. (-)-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin.

En 1,2 g portion af den første portion (-)-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin,d-10-camphorsulfonat opløstes i 12 ml vand, og opløsningen indstilledes til pH-værdi=4,5 med fortyndet vandig NH^OH. Blandingen opvarmedes til dannelse af en opløsning. Opløsningen henstod til afkøling først ved stuetemperatur, derpå ved 5 °C til udkrystallisering af aminosyren. Produktet frafiltreredes, udvaskedes sparsomt med nogle få dråber vand og methanol og tørredes ved 40 °C resulterende i 0,37 g (-)-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin) dekomponering 210 - 212 °C, [a]2^ = -137,6° (C=l, IN HC1).

Analyse beregnet for CgH^NO^: C 54,82; H 5,62; N 7,10

Fundet: C 54,37; H 5,90; N 7,21; H20, 0,71.

C. (-)-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin.

En blanding af 200 g 2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-glycin, hydrat, 260 g d-10-camphorsulfonsyre, 2 1 iseddikesyre og 100 ml vand opvarmedes til dannelse af en opløsning og blankfiltreredes.

DK 158673 B

40

Opløsningen podedes med krystalkorn og henstod ved stuetemperatur i 3 dage til udkrystallisering af saltet; 76 g. Saltet omkrystalliseredes fra 400 ml eddikesyre; 71,0 g.

Filtratet fra den første portion salt koncentreredes til omkring halvdelen af dets oprindelige volumen, og produktet henstod til udkrystallisering; 118,5 g. Produktet omkrystalliseredes fra 500 ml eddikesyre resulterende i, efter luft-tørring,105,2 g (-)-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin,d-10-camphorsulfonat.

Koncentreret NH^OH sattes dråbevis under god omrøring til en opløsning af 71,0 g af camphorsulfonatsaltet i 150 ml vand plus 150 ml methanol. Blandingen, som snart blev meget tyktflydende, opvarmedes til 50 °C, og den dråbevise tilsætning af NH^OH fortsattes til pH-værdi=4,5. Efter isafkøling frafiltreredes produktet, udvaskedes sparsomt med kold 1:1 MeOH-vand og kold methanol resulterende i, efter tørring i en vakuumovn ved 40 °ς,34,5 g (-)-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)glycin; dekomponering 204 - 206 °C, [a]22° = -132,4° (0=1, IN HC1).

Analyse beregnet for CgHi:LN04,H20: C 50,23; H 6,09; N 6,51.

Fundet: C 49,96; H 6,12; N 6,61.

(-)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)glycin.

En blanding af 9,2 g (-)-2-(3-methoxy-4-hydroxyphenyl)-glycin og 50 ml 48% hydrogenbromidsyre opvarmedes under tilbage-svaling i 4 timer. Opløsningen afkøledes i is resulterende i et krystallinsk bundfald, som samledes ved filtrering og tørredes ved 40 °C; udbytte 1,8 g, smeltepunkt 248 - 250 °C dekomponering med forudgående mørkfarvning over ca. 200 °C, [a]22 = “42,1° (0=1, h2o).

Analyse beregnet for CgHgN04,HBr,l/2 H20: C 35,18; H 4,06; N 5,13; H20, 3,30

Fundet: C 35,26; H 4,01, N 5,32; H20, 3,20.

DK 158673 B

41

Det konkluderedes, at dette stof var en 3:1 sammensætning af (-)- og (+)-isomere af 2-(3,4-dihydroxyphenyl)glycin,HBr.

Filtratet koncentreredes til et lille volumen. Den krystallinske masse, som udskiltes, samledes ved filtrering (filtratet tilbageholdtes). Råproduktet omkrystalliseredes fra 20 ml eddikesyre. Produktet udvaskedes på filteret med methylisobutylketon og vandfri ether til dannelse af 3,0 g hvidt krystallinsk (-)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)glycin,hydrobromid; smeltepunkt 106 - 109 °C, [a]22° = -85,0° (C=1,H20).

Analyse beregnet for CgH^NO^,HBr,H20: C 34,06; H 4,29; N 4,97; H20, 6,37.

Fundet: C 43,07; H 4,17; N 4,99; H20, 6,80.

Eddikesyre-filtratet koncentreredes til fjernelse af opløsningsmiddel. Til den olieagtige remanens sattes 75 ml methyl-isobutylketon, og produktet henstod til udkrystallisering først ved stuetemperatur og derpå i et isbad. Produktet frafiltreredes, udvaskedes med methylisobutylketon og vandfri ether til dannelse af yderligere 1,5 g hvidt krystallinsk (-)-2-(3,4-dihydroxyphenyl ) glycin,hydrobromid; smeltepunkt 106 - 108 °C, [a]22° = -84,5° (C=1,H20).

Analyse beregnet for CgHgNC>4,HBr,H20: C 34,06; G 4,29; N 4,97; H20, 6,39.

Fundet: C 33,79; H 4,31; N 4,94; H20, 7,08.

Filtratet fra det rå HBr-salt koncentreredes til fjernelse af opløsningsmiddel. Den krystallinske remanens opløstes i 8 ml vand, og opløsningen indstilledes til pH-værdi=4,5 med koncentreret vandig NH^OH, hvad der forårsagede, at zwitterionen udkrystalliserede. Blandingen fortyndedes med en lige mængde methanol og afkøledes i is i 1 1/2 time. Produktet, (-)-2-(3,4-dihydro-phenyl)glycin, frafiltreredes, udvaskedes sparsomt med 1:1

DK 158673 B

42

MeOH-^O og MeOH, og tørredes i 2 timer ved 40 °C; udbytte 0,536 g, utydelig dekomponering 234 - 238 °C med forudgående n ??o n mørkfarvning over ca. 220 C, [a] = -158,2 (C=l, IN HCl).

Analyse beregnet for CgH^NO^: C 52,46; H 4,95; N 7,65

Fundet: C 51,82; H 5,03; N 7,75.

7-[D-a-amino-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl)acetamido]- 3-(1,2,3-triazol-4-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl- syre.

En blanding af 4,27 g (0,01365 mol) 7-amino-3-(1,2,3-triazol-4-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, 6,64 g (0,041 mol) 1,1,1,3,3,3-hexamethyldisilazan og 200 ml methylen-chlorid opvarmedes under tilbagesvaling i 4 timer til dannelse af en klar opløsning. Efter henstand natten over ved stuetemperatur fjernedes opløsningsmidlet ved reduceret tryk. Remanensen opløstes i 150 ml tetrahydrofuran, opløsningen afkøledes til 0 til 5 °C før anvendelse.

N-methylmorpholin (3,06 ml, 0,0273 mol) og 3,48 ml (0,0273 mol) isobutylchlorformiat sattes til en opløsning af 8,1 g (0,0273 mol) D-(-)-N-(t-butoxycarbonyl)-2-(3'-methoxy-4'-hydroxyphenyl) glycin i 300 ml tetrahydrofuran ved -15 °C. Blandingen omrørtes ved -15 °C i 6 minutter til dannelse af det blandede anhydrid.

Tetrahydrofuranopløsningen af silylesteren ved 0 til 5 °C sattes til det blandede anhydrid ved -15 °C. Efter 10 minutters forløb fjernedes kølebadet, og blandingen omrørtes endnu 2,5 timer. Vand (250 ml) sattes til reaktionsblandingen, og blandingen koncentreredes ved reduceret tryk til fjernelse af det meste af tetrahydrofuranen. Det vandige koncentrat gjordes sur med 42% phosphorsyre og ekstraheredes 3 gange med ethylacetat. Blandingen filtreredes i løbet af den første ekstraktion til fjernelse af en lille mængde uopløselig stof. De kombinerede

DK 158673 B

43 ethylacetatekstrakter udvaskedes én gang med vand, tørredes (Na2S0^) og koncentreredes til tørhed. Remanensen tritureredes med vandfri ether til dannelse af 2,8 g faststof.

En opløsning af faststoffet (2,8 g) og 50 ml 97% myresyre omrørtes ved stuetemperatur i 2 timer. Myresyren afdestilleredes ved reduceret tryk. Remanensen azeotroperedes med toluen til fuldstændig fjernelse af myresyre. Remanensen triturededes med vådt ethylacetat resulterende i (efter tørring i 2 timer i vakuum ved 65 °C over phosphorpentoxid) 1,42 g 7-[D-a-amino-(3'-methoxy-4' -hydroxyphenyl) acetamido] -3- (1,2,3-triazo3L-4-ylthio-methyl)-3-cephem-4-carboxylsyre; dekomponering gradvist over omkring 165 °C. IR- og NMR-spektrene var konsistente. 7-[D-a-amino- (3' -methoxy-4' -hydroxyphenyl) acetamido] -3- (1.,2,3-triazol- 4-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre kaldes også BL-S689.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles 2 ved omsætning af et aldehyd, som har strukturen R -CH0 (hvori 2 R har den tidligere anførte betydning) med en cephalosporin, som har den almene formel: "ΟΙ 0 COOR1 3 hvori A, R og R har de tidligere anførte betydninger. I de foretrukne udførelsesformer har carbonatomet, som ier forbundet til α-aminogruppen, D-configuration. De sidstnævnte forbindelser med formel II fremstilles ved de sædvanlige, og ofte specifikke, fremgangsmåder, som er anført i de følgende patentskrifter: USA patentskrift nr. 3.641.021, USA patentskrift nr. 3.899.394 44

DK 158673 B

USA patentskrift nr. 3.855.213/ USA patentskrift nr. 3.867.380,

Sydafrikansk patentskrift nr. 73/4055,

Belgisk patentskrift nr. 776.222 (Farmdoc 38983T),

Belgisk patentskrift nr. 810.477 (Farmdoc 57268V) ,

Vesttysk patentskrift nr. 2.364.192 (Farmdoc 49048V), Vesttysk patentskrift nr. 2.500.386 (Farmdoc 49692W) , Belgisk patentskrift nr. 814.727 (Farmdoc 82562V),

Vesttysk patentskrift nr. 2.404.592 (Farmdoc 57268V) .

En alternativ fremgangsmåde til fremstilling af de som udgangsmaterialer heri anvendte amfotere cephalosporiner består i anvendelse af den passende p-hydroxy-2-phenylglycin (som kan indeholde en yderligere substituent, og hvori a-aminogruppen er passende beskyttet gennem acylering på en konventionel måde) i stedet for sidekasde-syren, f.eks. 2-phenylglycin eller tetrazol-eddikesyre, som hidtil er blevet anvendt som i USA patentskrifterne nr. 3.813.388, 3.759.904 og 3.850.916 til fremstilling af enten 3-thiolerede cephalosporiner eller 7-substituerede cephalosporansyrer, i hvilke 3-acetoxygruppen derpå erstattes af den ønskede thiol. Se f.eks. USA patentskrifterne nr. 3.757.012 og 3.757.015.

Reference herunder til BL-S640 henviser til 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, som også kaldes cefatrizin. Reference til propylenglycolatet deraf henviser til det ovenfor beskrevne 1,2-propylenglycolsolvat. Reference til BL-S643 henviser til 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido] -3-( 2-methyl-l,3,4-thiadiazol-5-yl-thiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre, som også kendes som cefaparol.

De følgende eksempler er anført til belysning af dén foreliggende opfindelse, idet de foretrukne udførelsesformer er beskrevet.

Eksempel 1.

45

DK 158673 B

*^>Π s » DL ->^0— H i ^ i y-\s- / h=\ 6/ i n/ £ C02Na ^

Til 0,34 ml furfural (2-furfuraldehyd), opløst i 10 ml vand, sattes under omrøring 2 g (1 ækvivalent)) af methanolsol-vatet af 7-[D-α-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre. 4N natriumhydroxid tilsattes under hurtig omrøring til opretholdelse af pH-værdien på 6,2 til 6,5. Den dannede opløsning henstod ved stuetemperatur i 1 time og lyofiliseredes til dannelse af produktets natriumsalt som et faststof.

Stoffets egenskaber: IR-NMR konsistent for produkt.

β-lactam intakt.

Triazol intakt.

Eksempel 2.

Fremgangsmåden i Eksempel 1 gentages med den undtagelse, at det deri anvendte methanolsolvat-udgangsmatteriale erstattes med en ækvimolær mængde 7-[D-a-amino-α-(p-hydaroxyphenyl) acetamido]-3-cephem-4-carboxylsyre,sesquihydrat. !Der fremstilles natriumsalt, som er identisk med det i Eksempel 1 opnåede.

Eksempel 3.

DK 158673B

46

Fremstilling af BL-S1052, natriumsaltet af reaktionsproduktet af 2-furfuraldehyd og BL-S640.

Formel, BL-S1052

H01 I /S. I-N

HN N—-r j h20 D,L—>\cX 1-N\^~CH2S \

HX 0/ T Y

COONa

=J

Fremgangsmåde: 1) 2 7/10 ml (3,13 g, 1,1 ækvivalent) 2-furfuraldehyd opløses i 50 ml vand ved 20 til 30 °C under hurtig omrøring.

2) 15 g BL-S640-methanoladdukt tilsættes over et 10 minutters interval med samtidig tilsætning af 40% natriumhydroxid indtil pH-værdi=5,5 til 6,0 (pH-værdien må ikke stige over 6,5). En lysorange farvet opløsning eller næsten opløsning opnås.

3) Opløsningen filtreres gennem passende filtre til fjernelse af partikler, pyrogener og bakterier. Trinnene 1 og 2 tilsammen bør fuldføres inden for 2 timer.

4) Der lyofiliseres i 48 timer, hvorpå faststofferne henstår under vakuum ved 50 til 56 °C i 24 timer. Det resulterende faststof er BL-S1052 (BL-S-1052 kan også opnås fra opløsningen i trin 3 ved udfældning fra 15 til 20 volumina steril iso-propanol).

47

DK 158673 B

Egenskaber af BL-S1052: 1) Bio-prøve = 775-800 ygjmg.

2) IR-NMR = a) Veldefineret, konsistent.

b) Ved omtrent 60 mg/ml i D2O fremtræder 2 produkter, 40% cyclisk addukt, 60% ikke-cyclisk addukt.

c) 3-lactam og 3-triaz©l er intakte.

3) Opløselighed = større end 400 mg/ml..

4) Papirstrimmel-chroma tograf i = en erikelt zone ved Rf for BL-S640. (Koncentration = 0,2 mg/ml).

5) Væske-chromatografi (koncentration = 1 mg/ml).

Tid i % fri BL-S640 timer; tilstede:_ 0 69,2 1 74,2 2 94,5.

6) Analytiske data;

Fundet På tør Joasis Teoretisk .% H20 KF 5,35 % C 47,45 50,2 49,2 % H 3,72 3,4 3,39 % N 14,45 15,2® 14,95 % S 10,34 10,92 11/4 % Aske som Na 2,18 2,SIL 4,1

DK 158673 B

48

iH

1— VO ΓΛ ΓΛ in K\ cm o o h cm H in in in r φ 9\ C* ooo'ocvjooj^toHCJOHoajinininocv] η k\ w oj w m

CO Η Η H

i A A A

w m r4 Μ.

& . P-____ -Μ I w

(0 I

U I r,

4J I R

co i S

Λ i s P i co i co i c ! o vo m m in in I ^oohcvj cm in in in in 2 toooocMo^f-cooocMOHOCMinininocv)

Si i m cm cm cm m

I R Η Η H

•H i FQ A A A

S i

P I

U I

-P i rM 1

Φ I

Oj I

CO I - — ...................... " 1 .........

CO I

•Η I

•P I

O I

•Η l Λ i t> as o m -a; ch •hi ιη^^ΝίοιοσίΗΗΐη^ίΛΟίηίΛΗΐοΝσΝ +i i coomK\oooK\HD-ts-HOH^-OLninin 5! inio ininvovo inininvo. criinoiinco οιολοιο < i nnnnn^HChHainHOirincMncnm * *.

* * m m ·=ι- -=i- m cm -=1--=3-.=1-.3-

I l I I I I I I I I I I l l I I I I I

ooooooooooooooooooo Η Η Η H HHHHHHHHHHi—IHHHH

s w W

CO

G ^ co 3 ?« Φ bD cd in m Ρί co ^ xi ra m m i -H co

O^^-PVDVDXJO ti C

φΐο-Η^,ΗΗ-ΡτΙ CDCDco to<D

(30)βΟΧΚ0)·ΡΗ ct3ctS-H-HOO<DCD<U -HCiCOinpQmS-Hx: -Η -Η Η -H C co Cl3 ctf ctf

CJCD + P fid-Hd-HCUCJOO

ObDcocototococDh) oonrobDon5ci3o5

ÉO?3!33i-P SiqcijhOP^OOO

p f>> <D Φ <D <I> (D Cj-H-H p P £h ?h fs nSHHH

(Dft^^^^^CUi-lHCDCDHOCDSOOO C ppppp O O β C S g < Piidnltiltitil »ocjAPi ....

54 H »»»Pi-P-P-P

.+3 · · · · · ct3 · · «É-tincocDCIPS

COCOCOCOCOCOCOCOWWWWf^P^fcWØtxIW

49

DK 158673 B

* 45% AAB + 5% serum + 50% substrat, anført ovenfor.

Fortynding af substratkulturen efter henstand natten over.

1) Justeret for 79,5% indhold af BL-S640. Med andre ord er de numeriske værdier sænkede, dvs. forbedrede. Denne justering gjordes også i de nedenfor anførte testforsøg, eller som alternativ anvendtes en større vægtmængde til tilvejebringelse af ækvivalent dosering.

Museblod-koncentrationer efter IM-acfanini-strering af lo mg/kg legemsvægt._ blod-koncentrationer (yapnl) antal timer efter administrering:

Forbindelse mus 0,25 0,5 1_1,5 BL-S1052 16 15,1 15,1 11,5 7,8 BL-S640 32 15,7 13,2 9,5 6,8

Forbindelserne fremstilledes i 0,01¾ phosphat-puffer. BL-S640 anvendtes som standard for alle forbindelser.

Museblod-koncentrationer efter PO-admini-strering af 100 mg/kg legemsvægt._ blod-koncentrationer (pg/ml) antal timer efter administrering:

Forbindelse mus 0,5 1_2_3,5_ BL-S1052 16 45,2 48,1 31,9 34,4 BL-S640 32 53,4 45,4 27,2 1.0,7

Forbindelserne fremstilledes i Tweem-CMC. BL-S640 anvendtes som standard for alle forbindelser.

50

DK 158673 B

Urinær udvinding efter IM-admini-strering af 50 og 10 mg/kg til rotter.

Procentdel af administreret dosis udvundet dosis antal timer efter administrering:

Forbindelse (mg/kg) rotter 0-6 6-24 0-24_ BL-S1052 50 4 40,3 2,1 42,4 10 3 21,7 2,4 24,1 BL-S640 50 7 44,5 2,7 47,2 10 7 24,3 1,4 25,7

Forbindelserne fremstilledes i 0,01% phosphatpuffer.

BL-S640 anvendtes som standard for alle forbindelser.

Papirchromatogrammer opnåedes ved chromatografering på rotteurin, som var samlet mellem 0 og 2 og mellem 2 og 4 timer efter IM-administrering af BL-S1052 og BL-S640, til påvisning abtibiotisk aktive metaboliter, idet der anvendtes "faldende" chromatografi med "system nr. 9" (butylacetat:n-butanolsiseddikesyre : vand = 80:15:40:24). 2 identisk beliggende pletter observeredes i alle tilfælde, undtagen i tilfældet med standarden (som ikke var blevet administreret til rotten og gav en enkelt identisk plet for hver af BL-S640 og BL-S1052). Dette indicerede fuldstændig hydrolyse af derivatet til den oprindelige forbindelse BL-S640 og dens formodede metabolit.

Eksempel 4.

51

DK 158673 B

Reaktionsprodukt af BL-S640 og 5-formyl-2-furansulfonsyre-natriumsalt (BL-S1027).

Formel, BL-S1027: /-v H 0

ΗΟ-ΖΛ-έ-/ Η H

\===Zh-N N--_N

H LJhsOjNa COONa ^

Fremgangsmåde til fremstilling: 1) 9,0 g 5-formyl-2-furansulfonsyre-naihriumsalt (HG,/0^ SO.Na) y T 3 opslæmmes i 75 ml vand ved 60 °C.

2) 20 g (1 ækvivalent) BL-S640-l,2-prqpylenglycoladdukt drys ses i under hurtig omrøring over en 10 miLnutters periode med samtidig justering af pH-værdien til 6 til 7„t0. En opløsning eller næsten opløsning dannes.

3) Opløsningen omrøres ved 55 - 60 °C, pH-værdi = 6 til 7,C i 10 minutter og afkøles derefter til 4-8 ®vC. En lille mængde bundfald dannes.

4) Blandingen omrøres i 15 minutter veffl 4 - 8 °C og filtreres derefter.

DK 158673B

52 5) Filtratet sættes over et 5 minutters interval til 1 liter isopropanol under hurtig omrøring. Et tungt bundfald dannes. Blandingen opslæmmes i 5 minutter.

6) Faststofferne fjernes ved filtrering, udvaskes med 200 ml isopropanol og vakuum-tørres ved 56 °C i 24 timer.

7) Faststofferne opløses i 60 ml 4 til 6 °C vand (en lille mængde uopløselige stoffer fjernes ved filtrering). Filtratet lyofiliseres i 24 timer.

Udbytte: 23 g, bio-udbytte = 89%.

Egenskaber af BL-S1027.

1) Bio-prøve som BL-S640 = 724 Vgjmg (teoretisk = 750 Ug/ml) · 2) Opløselighed = >500 mg/ml.

3) IR-NMR: Konsistent for struktur. Ved 70 mg/ml eksisterer forbindelsen som 80% cyclisk, 20% ikke-cyclisk derivat.

4) Papirstrimmel- og væske-chromatografi indicerer, at produktet ved 0,2 og 1,0 mg/ml vandopløsning eksisterer som fri BL-S640.

5) MIC-bakterielt spektrum er lig med spektret af BL-S640.

6) Orale og intramuskulære rotteblod-koncentrationer er lig med koncentrationen af BL-S640.

7) En opløsning af dette produkt i vand ved en koncentration på 25.000 ygtol var stabil (opretholdt fuld bioaktivitet) i mindst 3 dage ved stuetemperatur og i 14 dage ved 6 °C (køleskab) , hvilket således tilvejebragte en opløsning, som er velegnet for oral brug.

DK 158673 B

53

Analytiske data.

Fundet På tør basis Teoretisk % H20 5/14 C 40/15 42/1 43/0 H 3,10 2,9 2,96 N 12,39 13,05 13,1 S 13,6 14,35 14,95

Aske som Na 5,86 6,16 6,8 for di-Na.

54

DK 158673 B

Antibiotisk aktivitet i næringssubstrat.

MIC (yg/ral)

Natriumsalt © © Cepha- _ . forb. f. Eks.7 BL-S640 lotin

Organisme___ _

Str. pneumoniae* (10-¾ ** A9585 0,03 0,13 0,03

Str. pyogenes (10-¾ ** - A9604 °>°6 0.°^ S. aureus Smith (10-^) A9537 0,27 0,5 0,13 S. aureus (10“4) + 50% serum A9537 2 4 0,5 S. aureus (10"^) BX1633 A9606 0,5 0,5 0,13 _2 S. aureus (10 ) BX1633 A9606 4 4 0,25 S. aureus (10"^)

Meth-Res A15097 4“8 8“15 1-16

Sal. enteritidis (10“4) A9531 ^»25 0.23 0,25 E. coli Juhl (10“4) A15119 1 1 16 E. coli (10~4) A9675 4 4 32 K. pneumoniae (10“4) A9977 °/5 °>5 1 K. pneumoniae (10“4) ^ A15130 ^

Pr. mirabilis (10~4) · - , A9900 °’5 °'5 1

Pr. morganii (10“^) A15153 32 63 >125

Ps. aeruginosa (10“4) A9843A >125 >125 >125

Ser. marcescens (10~4) >125 >125 >125 A20019

DK 158673 B

55 MIC (yUg/ml) © ~ _ Natriumsalt- (2) Cepha-

Organisme forb.f.Eks.7 BL-S640 lotin -k

Ent. cloacae (10 ) >125 >125 >125 Α9β5β ^

Ent. cloacae (10 ) 1 18 Α9β57

Ent. cloacae (10~^) 52 65 >125 Α9β59 X 45% ΆΑΒ +5% serum + 50% substrat, anført ovenfor.

XX Fortynding af substratkulturen efter henstand natten over.

(!) Disse angivelser omregnedes på basiias af, at der kun var 65% BL-S640 i prøven; med andre ord sænkedes de numeriske værdier, dvs. forbedrede.

(2) BL-S640 = 7-[D-a-amino-(x-(p-hydrox5iphenyl)acetamido]- 3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl) -3-<eephem-4-carboxyl-syre.

Museblod-koncentrationer efter oral admini strering af 100 mg/kg legemsvægt.

56

DK 158673 B

Blod-koncentration ( .ug/ml)

Forbindelse Timer efter administrering: _ 0/5 1 2_3/5_

Forbindelse fra Eks. 7 45 36,6 20,4 10,4 BL-S640® 50,5 39 24,5 9,6

Forbindelse fra Eks. 7 54,6 53,5 27,6 8,2 B1-S640® 57,4 47 29,5 10,9

Forbindelserne fremstilledes i Tween - carboxymethylcellulose, og 8 mus anvendtes til hver forbindelse.

Φ BL-S640, 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]- 3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl-syre anvendtes som en standard.

BL-S1027 er det vandopløselige derivat, som dannes når BL-S640 omsættes med furfural-natriumsulfonat. Bio-styrken er 724 yUg/mg af BL-S640-aktivitet.

Vandige opløsninger, som indeholder 250, 25 og 10 mg BL-S640-aktivitet/ml som BL-S1027 kan opbevares under afkøling (4 °C) eller ved stuetemperatur i mindst 24 timer uden noget betydningsfuldt tab i aktivitet.

Museblod-koncentrationer efter intramuskulær admini strering af 10 mg/kg legemsvægt.

57

DK 158673 B

Timer efter administrering:

Forbindelse n n c i -ικ _ 0/25 0/5 1_1,/5_

Forbindelse fra

Eks. 7 16,1 14/8 11,9 <8 14/6 15/4 11/7 3,3 BL-S640 ® 16/3 13,5 9,4 t6,3 ® BL-S640, 7-[D-a-amino-a-(p-hydroxyphenyl)acetamido]- 3-(1,2/3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-aephem-4-carboxyl-syre anvendtes som en standard.

Forbindelserne opløstes i 0,01% phosphatpuffer.

Eksempel 5.

Reaktionsprodukt af BL-S640 og o-formyllphenoxy-eddikesyre. (BL-S1048).

H0^-C

i u ^COONa ' rf ^OCH COONa lij 3

Fremgangsmåde til fremstilling: 1) 375 mg o-formylphenoxyeddikesyre 58

CHO

DK 158673 B

—OCH-COOH

5 ^ opslæmmes i 10 ml vand og 4N NaOH tilsættes under hurtig omrøring indtil pH-værdi=7,0. En opløsning opnås.

2) 2 g (1 ækvivalent) BL-S640, methanoladdukt tilsættes under hurtig omrøring over et 10 minutters interval med samtidig tilsætning af 4N NaOH indtil en pH-værdi på 6 til 6,5. En opløsning eller næsten opløsning opnås.

3) Opløsningen filtreres og henstilles ved omgivende stuetemperatur i 0,5 time.

4) Opløsningen lyofiliseres i 24 timer til dannelse af produktet som et faststof.

Egenskaber af faststof-produkt.

1) IR-NMR (70 mg/ml) konsistent for struktur, triazol og β-lactam intakt.

2) Papirstrimmel- og væske-chromatografi ved 0,2 og 1 mg/ml viser, at BL-S640 er fuldstændig fri for aldehydet.

Analytiske data.

Fundet På tør basis Teoretisk % vand 4,06 C 47,15 49,2 50,1 H 3,79 3,5 3,86 N 11,44 11,93 13,0 S 8,87 9,27 9,91 aske som Na 5,55 5,78 6,47 3) Opløselighed i vand = >400 mg/ml.

DK 158673 B

59 ni 06 V£> JO JO LO tO ir.

^-oohcvj η io to to lo h o' o o W O W ^ O O W O H O W L(1 if) in o w

rn JO OJ CVJ OJ JO

. Η Η H

i_q A Λ Λ

FP

+J

rd M · s

P H

tfl

o λ IS ff\ KN ΙΠ LO

3 H OJ O O OJ IO OJ LO LO

W 1. H ooooicT^^i-OH^t-. ohowoiolohcj h-1 t? CO [M CVJ C\J CvJ ρΛ

rj p I I-H H H

-5 A A

s ~ « β Η θ a---- 2 S-) -μ 0) ft Ο VO ΓΛ JO US LO _ ω .=j- Ο Ο Η OJ OJ ΙΟ to to 10 vn «. ·> s. » * * » * M CO oooojo^-cooowohoojololoooj

Μ I JO OJ OJ OJ JO

•Ho ril H . H

+> Ξ A A A

O W

•H

Λ

•H

•P

β__—-—---

C

IS- OS O JO < os _

LfS =J- c— I>~- SO SO OS Η H LO tS- JO O ΙΟ JO H VO IS- OS

000 ro to o o o joh ssHOH^oususin irs vo tn in vo vo in us tn so os lo os 10 os osovov^ OS OS OS OS OS OS H OS H OS OS rj OS rj © w os os os * * * * ro to -=t- =1- to 01 -=1-

1 I I I l I I I I I I I I I i I 1 I

0000 000 00000 00 oqqgo HHHHHHHHHHHHH

S .

ω g C δ w cd 0) <1) bD M JO JO K to ?h Λ ro ro 1 -H w o**-p^.vovoxJO ® c <D tø ·Η Ο Η Η -P ·Η O 0) w S μ λ\ ΛΙ cdO SlOWXO-PH Φα5·Η·Η.ΘυΦΦΦ HCjW+ftlfflSTJjl .Η·ΗΗ·Η3θω«5π5ο3 £j Φ ^ ? G G -H g ~h φ o o o

ObOMMcowmcuh) 2 oq m M p 5 5 ; 8ΟΡ0Ρί0·Ρ β§Φ60τ3ξ|ΟΟΟ 3>5<ϋΦΦΦΦβ·ΗτΗρρ^ί-)??ΗωΗ ·ΗΓ-Ι ΦΡιίπίιί-ιί-ιίΗΦΗΗΦΦ'ΗΟ-ΦβΟϋΟ· £ 3 £ 3'2 3 O O 2 £ fi S ·Φ a . cd ci di ni δ · o o (¾ 1¾ · · · ·

£_i H · · ·· ίπ -P -P -P

.4J · · · · *cd · · · «ΡιίΗ'ΚΐΦβββ

COCOWWCOWWMW IxJWWftcfti'PuLPWWW

DK 158673 B

eo * 45% AAB + 5% serum + 50% substrat, anført ovenfor.

£* Fortynding af substratkulturen efter henstand natten over.

1) Justeret for 68% indhold af BL-S640.

2) Justeret for 67% indhold af BL-S640

Med andre ord er de numeriske værdier sænkede, dvs. forbedrede. Denne justering gjordes også i de nedenfor anførte testforsøg, eller som alternativ anvendtes en større vægtmængde til tilvejebringelse af ækvivalent dosering.

Museblod-koncentrationer efter IM-admini-strering af 10 mg/kg legemsvægt.

blod-koncentrationer ( ,ug/ml) antal timer efter administrering:

Forbindelse mus 0,25 0,5 1_1,5_ BL-S1027 16 15,4 15,1 11,8 8,2 BL-S1048 16 14,8 14,1 10,3 7 BL-S640 32 15,7 13,2 9,5 6,8

Forbindelserne fremstilledes i 0,01% phosphat-puffer. BL-S640 anvendtes som standard for alle forbindelser.

Museblod-koncentrationer efter PO-admini- strering af 100 mg/kg legemsvægt.

61

DK 158673 B

blod-koncentrationer ( /Ug/ml) antal timer efter administrering: Forbindelse mus 0,5 1 2_3,5_ BL-S1027 16 49,8 45,1 24 9,3 BL-S1048 16 46,5 44,6 28,1 12,8 BL-S640 32 53,4 45,4 27,2 U),7

Forbindelserne fremstilledes i Tween-CMC. BL-S640 anvendtes som standard for alle forbindelser.

Urinær udvinding efter IM-administrering af 50 og 10 mg/kg til rotter.

Procentdel af administreret dasis udvundet dosis antal timer efter administrering: Forbindelse (mg/kg) rotter 0-6_(6-24_0-24_ BL-S1027 50 4 39,6 '2,6 42,2 10 4 30,1 i,7 31,8 BL-S1048 50 4 32,3 .2,4 34,7 10 4 21,7 .2 23,7 BL-S640 50 7 44,5 .2,7 47,2 10 7 24,3 1,4 25,7

Forbindelserne fremstilledes i 0,01% phosphatpuffer.

BL-S640 anvendtes som standard for alle fforbindelser.

Papirchromatogrammer. opnåedes efter chromatografering på rotteurin, som var samlet mellem 0 og 2 og mellem 2 og 4 timer efter IM administrering (ved 10 mg/kg og ved 50 mg/kg) af BL-S1027, 1048 og 640 til påvisningen af antibiotisk aktive metaboliter, idet der anvendtes "faldende" cbromatografi med

DK 158673 B

62 system nr. 9 (butylacetatm-butanol:iseddikesyre:1^0=80:15:40:24). To identiske pletter observeredes i alle tilfælde undtagen tilfældet med standarden(ikke fra dyret), som viste en enkelt identisk plet. Dette indicerer fuldstændig hydrolyse af de 2 derivater til den oprindelige forbindelse (BL-S640).

Eksempel

Reaktionsprodukt af BL-S640 og o-benzaldehyd-sulfonsyre.

H 0 O I |l

i H ? /H

^ H--[pH c—f

,^>_S0,Na 0 I H

h jp 3 COONa

Fremgangsmåde til fremstilling.

1) 870 mg o-benzaldehyd-sulfonsyre-natriumsalt opløstes i 10 ml vand.

2) 2 g BL-S640-methanoladdukt (1 ækvivalent) tilsattes under hurtig omrøring over et 10 minutters interval med den samtidige tilsætning af 4N NaOH indtil en pH-værdi på 6,5. En opløsning opnåedes.

3) Opløsningen filtreredes, henstod ved stuetemperatur i 1 time og lyofiliseredes i 24 timer til dannelse af det ønskede produkt som et faststof.

Egenskaber af produkt.

1) IR-NMR = veldefineret, konsistent for struktur.

2) Opløselighed i vand = >400 mg/ml.

DK 158673 B

63 3) Analytiske data.

Fundet På tør basis Teoretisk % vand 3,49 C 41,88 43,4 43,3 H 3,41 3,3 3,25 N 11,53 12,1 12,35 S 13,74 14,25 14,24 aske som Na 5,45 5,63 6,77 4) Bio-prøve = 700 ^ug/mg.

5) IR - NMR = a) Intakt β-lactam- og triazol-del.

b) Forbindelse fremtræder ikke som om det er et cyclisk addukt.

6) Papirstrimmel-chromatografi; Der forekommer at være en dobbeltzone ved R^ for BL-S640.

7) Væske-chromatografi

Tid i timer %fri BL-S640 0 64,0 1 70,5 2 88,0.

8) Opløselighed i vand = større end 4003 mg/ml.

9) Nummer, dette produkt kaldes BL-S10S5.

64

DK 158673 B

O K\ K\ ΓΛ ΓΛ ΓΛ -3- O O Η H HLnmin ΙΛ W o' O* O Ol o' W Cll O* o' W O H O \D 1Λ ^ ΙΛ O 1Λ

I H Ol VD VO 'O

|d| H

H W A

ε tjl . 3 +J J'*

fO

U -----

m H

Λ S,

P

to to &1 —s S H vo h —' vo h k\ m

^ A O O H LA K\ mm (A

ftJ ». ». » * ·. ·► *

β oooooJoaj^-oH^t-OHOCJiAiAinorA

Η 1Λ CM (M CVJ \D

-r^ CO Η Η H

1 * Λ

P FQ

+)

<D

a to to

H

+J

O

n t- Ch O ΚΛ <; (A _ ri Π COO K\ ΚΛ O O O A H S S Η O H -=t- O A A LPi

T> ΑΆ A A VO VO A A A VO ON A (7\ A CO O lO

i? cr\Ch(^(7>cr\Wrio\Hcn^Hcnrima)C^^O} * * * * Λ-s

ΙΛ ίΛ -Ϊ ^t· fACVJ ^-=^-=^-=^^-=3--=^.=3--=^-=^-=^-=^-=1-I I I I I I I I I I I I I I I I I I i ooooooooooooooooooo r-( r-(HHiHr—(r-Jr-fHHr-iHrHHrHHr-HH

S

CO S

•Η P

ΰ k to 3 α> ω bD o K\ ΙΛ Pi ra · Λ ΓΛ Κ\ I ·Η ω

ο* * -Ρ \R V£) VO .Ρ Ό Cå G

<D to -Η O Η Η -P ·Η <U(DW W <D

Jiil)SinXXill-PH 3η5·Η·ΗΟϋ<1)<1}5 •H C CQ + (H P5 s -Η ί *d 'd H *d ΰ ω ^

d<U P Cd-Hd-HØOOO

ObDtocntatatoa)·^ oOfløMUti®® soppppp-p

p>s<D<D<D<D<DC!*H>HPP?-i?-)F-idHHH

<DPiiHiHF-if-t?-i(DHHa)<D-HO<USOOO

C ppppp O O -CJ S S S 3 ft.3aJ333«OOftft .···,*

Sh H » · · $H -P -P -p

• -p · · · · · n3 · · · · ?h in to fl) d C

CQtQMcQCQCOCQCQHHM^PHPtfeMHWW

65

DK 158673 B

45% AAB + 5% serum + 50% substrat, anført ovenfor.

** Fortynding af substratkulturen efter henstand natten over.

1) Justeret for 65% indhold af BL-640.

Med andre ord er de numeriske værdier sænkede, dvs. forbedrede. Denne justering gjordes også i de nedenfor anførte testforsøg, eller som alternativ anvendtes en større vægtmængde til tilvejebringelse af ækvivalent dosering.

Museblod-koncentrationer efter IM-admini-strering af lo mg/kg legemsvægt.

blod-koncentrationer ( ,ug/ml) timer efter administrerings Forbindelse__0,25_0,5_1_1,5 BL-S1055® 10,3 9,9 7,6 6,5 BL-S640 12,7 11,5 8 5,7

Forbindelserne fremstilledes i 0,01% phosphat-puffer.

Værdier er middeltallet af 3 eksperimenter.

0 BL-S640 anvendtes som standard.

Museblod-koncentrationer efter PO-admini-strering af 100 mg/kg legemsvægt.

blod-koncentrationer ( ,ug/ml) timer efter administrering:

Forbindelse__0,5 1 2_3,5_ BL-S1055® 38,2 35,7 22,0 11,3 BL-S640 48,7 42,4 24,0 10,1

Forbindelserne fremstilledes i Tween-CMC.

Værdier er middeltallet af 2 eksperimenter.

0 BL-S640 anvendtes som standard.

DK 158673 B

66

Urinær udvinding efter IM-administrering af 50 mg/kg til rotter.

Procentdel af administreret dosis udvundet antal timer efter administrering:

Forbindelse rotter__0-6_6-24_0-24 BL-S1055® 3 36,6 2,4 39 BL-S640 4 44,2 3,3 47,5

Forbindelserne fremstilledes i 0,01% phosphatpuffer.

(l) BL-S640 anvendtes som standard.

Papirchromatogrammer opnåedes ved chromatografering på rotteurin, som samledes mellem 0 og 2 og mellem 2 og 4 timer efter IM administrering af BL-S1055 og 640 til påvisningen af antibiotisk aktive metaboliter, idet der anvendtes "faldende" chromatografi med system nr. 9 (butylacetat:n-butanol:iseddike-syre:H20 = 80:15:40:24). En enkelt identisk plet observeredes i alle tilfælde. Dette indicerer fuldstændig hydrolyse af derivatet til den oprindelige forbindelse (BL-S640).

67

DK 158673 B

Komparative orale PD^Q-værdier af BL-S640-derivater i mus.

PDj-q (mg/kg/behandling) * BL-S BL-S BL-S BL-S cepha-Org.ani.sme 640 1027 1048 1055 lexin E. coli 1,4 — 3,1 1,8 13 A15119 4,1 — 1,6 1,6 13 P. mirabilis 7,2 6,3 4,7 8,2 66 A9900 9.6 2,7 3,6 8,2 55 P. mirabilis 2,4 1,8 .2,4 1 50 A9 707 K. pneumoniae 1,6 — 0,7 1,6 43 A9977 S. pyogenes 0,4 — 0,2 0,4 11 A9604 * Mus behandledes ved 1 og 3,5 timer eBter påvirkning.

Komparative IM PD^^-værdier af BL-iS640-derivater i mus.

PD,-ø (mg/kg/behandliirg) y BL-S BL-S BL-S BIHS cepha-

Organisme 640 1027 1048 105.5 lexin P. mirabilis — — — — A9900 1.6 1,6 1,6 1„(6 5 0

DK 158673B

68

Eksempel 7.

BL-S1027, reaktionsproduktet af BL-S640 og 5-formyl-2-furansulfonsyre.

Struktur: BL-S1027

-C S

-r—f > [j-]? (D,L)---y? o^N\^--CH2S“^n/N ; H2° COONa l SO,Na

P

Fremstilling af BL-S1027 1) 9 g 5-formyl-2-furansulfonsyre-natriumsalt (-JjL*.) omrøres hurtigt i 75 ml vand ved 60 - 65 °C. Det meste af faststofferne opløses.

2) 20 g BL-S640-propylenglycoladdukt drysses i under hurtig omrøring over et 10 minutters interval med samtidig justering af pH-værdien til 6f5 - 7,0 med 40% NaOH (pH-værdien må ikke stige over 7,2). En opløsning eller næsten opløsning dannes.

3) Opløsningen med pH-værdi 6,5 - 7,0 omrøres ved 55 - 60 °C i 15 minutter og afkøles til 4 - 8 °C. Der omrøres ved 4 - 8 °C i 10 minutter.

4) Der filtreres til fjernelse af en lille mængde uopløselige stoffer.

DK 158673 B

69 5) Filtratet + (se note 1) sættes under hurtig omrøring til 1 liter isopropanol. Et amorft bundfald dannes.

Der omrøres i 5 minutter.

6) Faststofferne fjernes ved filtrering, udvaskes med 100 ml isopropanol og vakuum-tørres ved 50 - 56 ° C i 18 timer.

7) Faststofferne opløses i 60 ml vand og afkøles til 4 - 6 °C. En meget lille mængde bundfald kan dannes og fjernes ved grovfiltrering.

8) Filtratet filtreres ved omgivelsestemperatur gennem passende filtre til fjernelse af partikler, pyrogener og bakterier.

Trinnene 7 og 8 bør fuldføres inden for 4 timer.

9) Der lyofiliseres sterilt i 48 timer og derpå opvarmes ved 50 - 56 °C under vakuum i 18 - 24 timer. Udbytte af BL-S1027 er omtrent 22 - 44 g.

+ Note 1, trin 5: Hvis 18,7 g BL-S640-methamaladdukt anvendes i stedet for de 20 g BL-S6^D-propylenglycol-addukt, kan filtratet afkøles til 4 - 6 °C, grov-filtreres og lyofiliseres direkte som beskrevet i trin 8 til 9.

Egenskaber af BL-S1027.

1) Bio-prøve = 724 ^ug/mg.

2) Bio-udbytte = 85 - 95% 3) IR - NMR = a) Konsistent for struktur, b) omtrent 80% cyclisk, 20% SJkke-cyclisk i D2O ved 70 mg/πϋΐ,, c) omtrent 0,05 mol isopropanol.

4) Papirstrimmel-chromatografi (0,2 mg/ml) = 100% BL-S640, intet tegn på derivat.

5) Væske-chroma tograf i (1 mg/ml i phosphatpuSifer med pH-værdi= 7) = 0 time = 85% fri BL-S640 0,5 time = 94% fri BL-S640 1,0 time =100% fri BL-S640.

70

DK 158673 B

6) Vandopløselighed = >400 mg/ml.

7) Analytiske datai

Fundet På tør basis Teoretisk % H20 KF 5/14 % C 40,15 42,1 43,0 % H 3,10 2,9 2,96 % N 12,39 13,05 13,1 % S 13/6 14,33 14,95 % aske som Na 5,86 6,16 6,5.

8) Museblod-koncentrationer = orale og intramuskulære koncentrationer omtrent lig med koncentrationerne for BL-S640-propylenglycoladdukt. BL-S640 fremkom i urin med intet tegn på derivatet.

9) a) Stabilitet af faststoffer = mindre end 10% tab i 1 måned ved 56 °C.

b) Stabilitet af opløsninger: mindre end 10% tab ved 250, 25 og 10 mg/ml af BL-S640-aktivitet i mindst 24 timer ved stuetemperatur.

Eksempel 8.

«ν -!χ> ” »* ®2 y cq2h i cl8Hl8N6°5S2' JBol'væ9t = 462'50 fj Π + KEH -> OHC “A oSO^Na 71

DK 158673 B

O

II

HO —(C))-CH H—i—S "Ί H—Π |N

^^Λ—TPyL CH2-S--y k

Π C02K

Γ SO,Na 5

C25H17N6°8s3WaK

Materialer: 1 g (0/00217 mol) BL-S640 429 mg (0,00217 mol) 5-furfural-sulfonæyre-Na-salt 217 mg (0,00434 mol) triethylamin 1,2 g (0,00659 mol) kalium-2-ethylhexairoat (KEH) .

Fremgangsmåde:

Til en opslæmning af 1 g BL-S640 i 8 ml metrhsanol sattes 217 mg triethylamin (TEA) og 429 mg 5-furfural-sulfossyre. Blandingen opvarmedes til tilbagesvaling og snart opløstes alle faststoffer. Opløsningen opvarmedes i 3 minutter, og 1,2 g IKEH tilsattes.

Et gult salt udskiltes og samledes og vaskedes med methanol. Saltet tørredes over P2°5 1 en exsiccator. Udbytte 800 mg.

Analyse beregnet for C23Hi7N6°8^3NaK/ 41^0:: C 37,54; H 3,41; N 11,42 Fundet: C 37,30; H 3,31; N 10,18

Smeltepunkt >140 °C dekomponering.

Den samme omsætning udførtes som ovenfor mad undtagelse af, at natrium-2-ethylhexanoat anvendtes i stedet tfor KEH. Saltet udfældedes ikke af methanol, hvorfor opløsningen filtreredes, 72

DK 158673 B

og filtratet fortyndedes med isopropylalcohol. Det faste bundfald samledes og udvaskedes med isopropylalcohol. Saltet var hygroskopisk, hvorfor det tørredes i vakuum over ·

Udbytte: 800 mg, smeltepunkt >140 °C dekomponering.

Analyse beregnet for C23H27N6°8S3Na2: C 42,65; H 2,78; N 13,65

Fundet: C 41,03; H 3,94; N 10,54.

Prøven var opløselig i vand. Opløsningen viste en pH-værdi på 6,5.

Papirstrimmel-prøve i puffer og menneskeserum udførtes. Prøven viste sig at udvise kun én plet svarende til BL-S640.

Begge prøver udviste en opløselighed på >100 mg/ml ved pH-værdi på 6,5.

Papirstrimmel-chromatografi viste, at ovennævnte forbindelse hydrolyseredes fuldstændigt til BL-S640 i blandet menneskeserum ved pH-værdi=7 og 0,1M phosphatpuffer ved pH-værdi=7. Papir-strimmel-bioautografer opnåedes på følgende måde. Prøver opløstes i en koncentration på 500 γ/ml i 0,1 M phosphatpuffer med pH-værdi=7 og i en koncentration på 500 γ/ml i blandet menneskeserum ved pH-værdi=7. En 10 yUl prøve af BL-S640 og af det ovennævnte produkt påførtes pletvis på en 12,7 mm (1/2 inch) strimmel "What nr. l"-papir og udvikledes ved 27 °C i 16 timer i et system af butylacetat:N-butanol:eddikesyre:vand (80:15:40:24). Strimlerne lufttørredes og anbragtes på en agarplade, som var podet med B. subtilis A.T.C.C. 6633. Med intervaller på 30 minutter, 1 time, 3 timer og 6 timer påvistes en enkelt zone med R^-værdi=0,3 for alle prøver.

Højtryks-væskechromatografi ved en koncentration på 1 mg/ml viste fuldstændig hydrolyse til det oprindelige BL-S640 efter 1/2 time. Prøver chromatograferedes på en "yU Bondapak C18 (Waters Associates)"-søjle, idet der anvendtes en 0,01M natriumacetat pH-værdi=4/methanol 8/2 bevægelig fase ved en strømningshastighed på 0,52 ml/minut. Påvisning foregik ved hjælp af UV

73

DK 158673 B

ved 354 ^u. Prøver opløstes i koncentration på 1 mg/ml i den bevægelige fase, 2 ^,ul indsprøjtedes, og BL-S640 elueredes ved 18 minutter og aldehydet ved 6 minutter. Mængdebestemmelsen af BL-S640 og 5-formylfuransulfonsyre udførtes under anvendelse af p-toluensulfonsyre som en indre standard™

Eksempel 9.

Fremstilling af BL-S1057, natriumsaltet af reaktionsproduktet BL-S643 og 2-furaldehyd.

Formel, BL-S1057 -Ot—5 s f— hn i-[-{ ''j I I ,2H20 ) o COONa

DK 158673B

74

Fremgangsmåde.

1. 1 g BL-S643,3H20 opslæmmes i 10 ml vand ved 40 - 45 °C.

2. 0f25 g (1/25 ækvivalenter) 2-furaldehyd tilsættes.

3. IN natriumhydroxid tilsættes under hurtig omrøring indtil pH-værdi=7 - 7/5. En opløsning eller næsten opløsning opnås i løbet af mindre end 5 minutter.

4. Opløsningen afkøles til 22 - 24 °C og filtreres på passende måde til fjernelse af partikler/ bakterier og pyrogener.

5. Der lyofiliseres under sterile betingelser i 48 timer til opnåelse af BL-S1057-pulver (BL-S1057 kan også opnås ved udfældning fra den sterile opløsning i trin 4 med 15 til 20 volumina steril isopropanol).

Egenskaber af BL-S1057.

1) Bio-prøve (anvendelse af cefatrizin som standarden) = 759 yug/mg.

2) IR = intakt β-lactam; veldefineret.

3) NMR = a) veldefineret; konsistent b) omtrent 75% cyclisk addukt (60 mg/ml i D2O)· 4) Opløselighed = >400 mg/ml i vand.

5) Papirstrimmel-chromatografi = hovedsageligt 1 zone ved R^-værdi for BL-S643 ved 37 °C ved 0 og 1 time (koncentration - 0,2 mg/ml).

6. Væske-chromatografi = 100% hydrolyseret i puffer med pH-værdi=6/l inden for 1 time ved stuetemperatur (koncentration = 1 mg/ml).

7. Smeltepunkt = 180 °C (indskrumpning) - 200 °C/ dekomponering.

75

DK 158673 B

Analytiske data.

Fundet På tør basis Teoretisk % H20 KF 5/18 % C 45/91 48,4 48,4 % H 4,05 3,7 3,37 % N 10,81 11,4 11,8 % S 14,92 15,73 16,48 % aske som Na 3,84 4,03 3,88.

Eksempel 10.

BL-S1058, reaktionsproduktet af BL-S643 og natrium-5-formyl-2-furansulfonsyre.

Formel, BL-S1058.

^~T~C 'Ί η-H

*/C\lo ^ Y“CH2S ' 5ES° a C00Ka SO^Na

Fremstilling af BL-S1058.

1. 0,45 g 5-formyl-2-furansulfonsyre-iEatriumsalt ( H-C —{ } — SO,Na ) . 8 0

DK 158673B

76 opslæmmes i 10 ml vand ved 40 - 45 °C. En opløsning eller næsten opløsning opnås.

2. 1 g 131/--5643,31120 drysses i over en 10 minutters periode under hurtig omrøring og samtidig tilsætning af IN natriumhydroxid indtil en pH-værdi = 7 - 7,5. En opløsning eller næsten opløsning opnås inden for 5 minutter.

3. Der afkøles til 20 - 23 °C, og opløsningen filtreres gennem passende filtre til fjernelse af partikler, bakterier og pyrogener.

4. Der lyofiliseres i 48 timer. Det resulterende pulver er BL-S1058 (steril BL-S1058 kan også opnås fra opløsningen i trin 3 ved udfældning fra 15 - 20 volumina steril iso-propanol).

Egenskaber af BL-S1058.

1) Bio-prøve (anvendelse af cefatrizin som standarden) = 685 yug/mg.

2) IR - NMR = a) veldefineret? konsistent b) β-lactam og 3-sidekæde intakt c) 90% cyclisk addukt (ved omtrent 60 mg/ml i D2O).

3) Papirstrimmel-chromatografi = hovedsageligt 1 zone ved R^-værdi for BL-S643 ved 0 og 1 time ved 37 °C (koncentration er 0,2 mg/ml). Der er tegn på en anden zone.

4) Væske-chromatografi (1 mg/ml i puffer med pH-værdi = 6.

Tid i timer I hydrolyseret 0 25,4 1 46,5 2 59,0.

77

DK 158673 B

Analytiske data.

Fundet På tør basis Teoretisk % H20 KF 10/17 % C 36/5 40/5 41/6 % H · 2/89 2/4 2/74 % N 8/52 9/49 10,01 % S 17,09 18,98 18,6 % Aske som Na 7,04 7,93 6,63.

78

DK 158673 B

+3 V£> nJ tn m H in 5-i ·=*· o o in cvi in in .p VO «* v ·» «· · * 01 cOOOOOOH^Jd-OH^-OJtOVOin

X! I H OJ

£ i—1 H

oi pq Λ 01 tn £ _ Η ——— I...... ' -" " ~ 5-1 «3

C

•H

OJ

M ---

^ _ 00 KO CO

ti h m h o in m £ gooooi in h min r V. Γ—I·,«·. » «ν ». Λ •rj -gs raooocoo-=nojoHCJOojO'vom

s 5 A H S

^ pq A

« S · vo ^

CO

Hl __ m---—- Ή Cp a ^2, c s io co g m h o m p o o o in οι mm t; COOOOCOH^tOJOH^-O^tOiXim © Λ ·-» 2}

a H

οι w Λ Λί 01 __ •Η , I ——* "

-P

o

•H

Λ -η c- <a o m < -p m 4- s h vo ίο o η h mt>-mo mm £ ooommooomHo-t-HOH^-

<; mvommvD'sommmi£>crvmcr\maD

cn m cn cr\ m h g\ η οι u\ h cah ολ * * * * κ\ m =! =* m οι rn^t--=d--^-=J--=i--=n^--=i· I I I I I I I I I I 1 I I I l ooooooooooooooo

HHHHHr—1HHHHHHHHH

’S ^ ^ ^ 'Τ’

oi S

•rt 3 £ μ 03 3 o © to to m m Ρί οι £ ,£ m m i ·η 0**-P'fc&COMD.£ra «3 οιο3·ηοηη·ρ·η <υωο3 ω a ©sm}x{' μ ©-pH a a -η ·η o •Η £ CO + pq pq S *H .£ ·Η ·η η ·η £ £ CD Ρη£ £ £ Ή £ ·Η

ObD03 03 03 03 C0©l-0 Ο Ο XI a bO

|θ£3£££·Ρ t Sga bDp 3>ϊ©©©·©©£·Η·ΗΡΡ?η?ηΜ

<ϋ fli Ρη Ρ-ι ^-4 fn in <U f—I r—) (ϋ C1J *γΗ Ο QJ

£ £ £ 3 £ £ 00££SSa ft . a a a a a · o o a ft !h H · .· ·

• 4J · · · · · Cj · · · · Η H CO

79

DK 158673 B

<D

tf ____________ tn

tn G

^ cu fy +> ό e G fC\ ^ £ tn U o S1 -P vr) -n ft! P CO ΙΠ m -=t- CM &'> s iS3 " g g- £ m λ 9 .5 £ -P is—l Ρ -Θ.

td —\ tu -p P V, -*-1 ® tn _/ 3 c Λ cd S—[ ·π φ tn _ ^ I tu tn tn Cp O co G ®

tn m i G -P

•H 'P K Q G

P g ΙΟ I ft (D

« \ O in r=\ ° cd · >

G tn Η *> V \ E Q) G

M ft. CO in in O V£> O _ ft 10 S

H ^ I CM CM H / /^Λ. o O

H ^ H * ^ « V8 ΐ i

(DO 1 \ / <D -P

•p H i — \w Λ G

.Cd S Ψ p G

•h ------- —-L <8 <d s °^_Pb · 5 Ό ^ ^f— ~ tf « 10 ro Η V £ g s ^ B__A * s cn m _ κ ft 01 i o lt\ rn\ w ti p pi h ·· V o) φ &»

PQ CO in in O ID o (CS 71 Μ H G

I CM CM H / CIH -H

Ή PI H rrl —/ I I W (D P

<d PQ A I cn ^ tu g I P tn o 3 O 0)St) p W -H tn

p tf P -P

M ______POG

(D II **► (B M-l <D

ft ro vo > 4J r-H

tn ns P5 ·*·"«· tn td H VO N ^ ® ® S «j > -ft o m in in - “ f -ft ** ’d CO r\ i/-» in Μ I »I W i? •Η οι σ\ σ\ σ\ ti pi hG ·η o> ,¾

•ρ ^^^^Ρ PQ as ρ -Ρ W

•Η tntD Ρ g Ό. Ρ X! dp cd od 3 μ-i cd

•Η ^ 3 Ρ C G

-Ρ JT' tn Ρ ρ t)TE) (d<D

G I , I i Η (ϋ Η P (Dtn

C U U U 'n o\° 3 > O D tf Ρ H

o o O O ° ^ ° X! .*G 00 tf iD ρ p tn

s w ^ ^ (d G G « (DSC

• S + p QJ ·Η ·ηΗ <D ·Η CO ' 4J «Ρ φ τφ j_j •H g tO -P do :d° p (U X)

G 3 D rd O G <D

ro p 3 G oo .tn ·π

M a) tn QJ QJ <D

Ρω tnPt) pfp Pt)>

OG o PS OD tJ P

Q) o\Pin (d 3 P >P ft -Η -H

O CD D D i in G P (d P

cn cd cd cd ; tDtptn -P-iP otd (Dooo!+>cg tu (qj d tn h

o Cd cd cd o -P <D P ^P (D ft> -H

POOO fQrftÆ O ® SO-P

cd Η Η H <! χ) c +J Ψ g o o o , t< ρ >i ρ tn :tn • S. -P CD 3 13 • · · · o\°CHP-P b b

P-P4J-P in ft o ‘H ω G G G P’tdfttD

CO w w w —

_____I X? * H RJ

*

DK 158673B

80

Papirchromatogrammer opnåedes efter chromatografering på rotteurin, som var samlet mellem 0 og 2 og mellem 2 og 4 timer efter IM administrering af BL-S1057, 1058 og 643 til påvisningen af antibiotisk- aktive metaboliter, idet der anvendtes "faldende" chromatografi med system nr. 9 (butylacetat:n-butanol:iseddike-syre:H20=80:15:40:24). En enkelt identisk plet observeredes i alle tilfælde. Dette indicerer fuldstændig hydrolyse af de 2 derivater til den oprindelige forbindelse (BL-S643).

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af en cephalo-sporinforbindelse med den almene formel: H 0 ί0>Λ4_ V=/ I I ^ ! HN N—- \ / \ o C-H I-Nv^L_CH2-B-R3 V I r2 COOR·1· hvori A er hydrogen, hydroxy, methyl eller methoxy, er hydrogen, natrium eller kalium, 2 R er 2-furyl, 2-furan-5-sulfonsyre, phenyl-2-sulfonsyre, 4-methoxyphenyl-3-sulfonsyre, 4-hydroxyphenyl-3-sulfonsyre, 2-carboxymethoxyphenyl, 4-carboxymethoxyphenyl, 3-hydroxy--4-carboxylphenyl, 4-(21-carboxy)vinylphenyl, carboxyl, 2-carboxyphenyl, 3-carboxyphenyl, methansulfonsyre eller methandisulfonsyre, 3 R-' er l,2,3-triazol-5-yl, tetrazol-5-yl, U,2,4-thiadiazol--5-yl, l,3,4-thiadiazol-2-yl, 1,3,4-oxadxazol-2-yl eller 1,2,4-triazol-5-yl, hvor enhver af disse grupper er usub-stitueret eller substitueret med 1 eller 2 alkylgrupper med 1 til 4 carbonatomer, DK 158673B kendetegnet ved, at man a) behandler en vandig opslæmning af en amphoter cephalosporin, som har den almene formel: H0~^ CH-C-NH-- 1¾ CH2-S-R3 11 o I i COOR 1 3 hvori A, R og R har den ovenfor anførte betydning, eller et solvat eller et hydrat deraf med et aldehyd, som har den almene formel: R2 - CHO 2 hvori R har den ovenfor anførte betydning, og en tilstrækkelig mængde vandopløselig natrium- eller kaliumbase til at forøge reaktionsblandingens pH-værdi til mellem 5,5 og 8 og til dannelse af det ønskede salt med formlen I i opløsning, og b) udvinder det ønskede salt med formlen I fra opløsningen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til fremstilling af en forbindelse, som har den almene formel: Η0-/Λ-Ι-^ \=/ I I /S H IV H-N N--C > I I—n^J-ch2-sJ\ n L_^ ck T 'tj/ </ COOR1 I \J H DK 158673B hvori R^" er natrium eller kalium, kendetegnet ved, at man: 1. danner en opslæmning af 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)-acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxyl-syre eller et solvat eller hydrat deraf i et egnet inert organisk opløsningsmiddel, hvor dette opløsningsmiddel er et opløsningsmiddel for triethylaminsaltet af furfuralreaktionsproduktet af 7-[D-a-amino-α-(p-hydroxyphenyl)acetamido]-3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl)-3-cephem-4-carboxylsyre og et ikke-opløsningsmiddel for alkalimetalsaltet med formel iv, og 2. behandler opslæmningen med furfural og :en tilstrækkelig mængde triethylamin til dannelse af triethylaminsaltet af furfural-reaktionsprdduktet af 7- [D-a-amini-α- (»p-hydroxyphenyl) -acetamido] -3-(1,2,3-triazol-5-ylthiomethyl) -3-c.ephem-4-carboxyl-syre i opløsning, og c) udfælder det ønskede alkalimetalsalt med formel I fra opløsningen ved tilsætning af en opløsningsmiddel-opløselig natrium- eller kaliumbase.