DK154327B - Fremgangsmaade til isolering og rensning af immunologisk aktivt polyribosylribitolphosphat - Google Patents

Description

DK 154327 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering og rensning af immunologisk aktivt polyribosylribitolphos-phat (PRP), kapselpolysaccharidet i Haemophilus influenzae type b, ved hvilken stammer af organismen Haemophilus influenzae type b dyrkes under kendte betingelser, PRP isoleres ved ethanolfæld-ning, og PRP isoleres yderligere som et hexadecyltrimethylammonium-bromidkompleks.

Den her omhandlede fremgangsmåde er ejendommelig ved, at PRP renses yderligere ved hjælp af hydroxylapatit enten a) ved tilsætning af hydroxylapatit [3*Ca2(PO^)2Ca(OH)2J i en 20 mM natriumphosphatpuffer ved en pH-værdi på fra 6,5 til 7,0,

2 DK 154327B

af den ovenstående væske og gentagelse af den beskrevne fremgangsmåde mindst to gange, filtrering af den ovenstående væske gennem egnede filtre, dialysering mod pyrogenfrit, destilleret vand og derpå lyofilisering eller b) ved søjlechromatografi i en 0,02 M natriumphosphatpuffer ved en pH-værdi på ca. 5,8 gennem hydroxylapatit [3’Ca^(PO^)2*Ca(0H)21, eluering med en trinvis gradient af 0,02 M og 0,05 M natriumphosphatpuf fer ved en pH-værdi på ca. 5,8, isolering af fraktionerne ved hjælp af analyse for PRP, dialysering af fraktionerne mod pyrogenfrit, destilleret vand og derpå lyofilisering.

Således fremstillet PRP er effektivt i en kombineret vaccine indeholdende PRP- og B. pertussis-antigener samt ved anvendelse i forbindelse med andre ikke-patogene bakteriestammer, såsom E. coli, B. subtilis, S. aureus, B. punilus og L. plantarum, til udløsning af en antistofreaktion i varmblodede dyr.

Det rensede polyribosylribitolphosphat (PRP) fra Haemophilus influenzae type b er tidligere blevet undersøgt som beskyttelses immunogen. Der har imidlertid ikke været opnået en aktiv antigenreaktion i unge dyr og småbørn. Ved den kendte rensningsmetode anvendes ethanol og "Cetavlon" ® (hexadecyltrimethylam-moniumbromid). Urenhederne, endotoxiner og pyrogene stoffer fjernes ved anvendelse af kold phenol eller chloroform og tert.-butanol, hvilket kan resultere i tab af dette polysaccharids antigene natur.

Den her omhandlede fremgangsmåde til isolering og rensning af immunologisk aktivt PRP fra Haemophilus influenzae type b har tydelige fordele frem for de kendte metoder derved, at alle urenheder (nucleinsyrer, proteiner og endotoxiner) fjernes til den mindst mulige mængde ved behandling med hydroxylapatit.

Det ved den her omhandlede fremgangsmåde fremstillede PRP giver et polysaccharid med højere molekylvægt end de hidtil kendte.

Af endnu større betydning er det, at det ved den her omhandlede fremgangsmåde fremstillede PRP er yderst immunogent i varmblodede dyr i modsætning til det ved de kendte fremgangsmåder fremstillede PRP.

Hydroxylapatit har tidligere været anvendt til fjernelse af endotoxinurenheder fra Meningococcus-gruppe A og gruppe C--polysaccharider, jfr. US-patentskrift nr. 3.978.209. Det er imidlertid en ulempe ved denne kendte metode, at også det ønskede

3 DK 154327 B

polysaccharid adsorberes sammen med urenhederne, således at et efterfølgende, selektivt desorptionstrin er nødvendigt til adskillelse af polysaccharid og urenheder. I modsætning hertil opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, at PRP ikke adsorberes på hydroxylapatiten, men forbliver i opløsning, således at et desorptionstrin er overflødigt.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen muliggør, at der kan fremstilles en kombineret PRP- og pertussisvaccine, som er yderst immunogen i unge dyr.

(I) Isolering af rensning af polyribosylribitolphosphat, kapselpolysaccharidet i Haemophilus influenzae type b.

Organismer, dyrkningssubstrat og kultur.

Der anvendes to stammer af Haemophilus influenzae type b. Rab-stammen fås fra Grace Leidy, Babies Hospital, Columbia University, New York City, New York. CK-stammen er isoleret fra en patient på Waterbury Hospital, Waterbury, Connecticut. Organismerne dyrkes flere gange på mus til sikring af deres virulens. Organismerne isoleres ved autopsi fra musenes hjernevæv, dyrkes derpå i subkultur på enten 3,7% hjerne-hjerte-infusionssubstrat (BHI) (Difco Lab., Detroit, Michigan) eller på 5% BHI-agar suppleret med 0,01% nicotinamidadenindinucleotid (NAD) (P-L Bio-chemicals, Milwaukee, Wisconsin) og 1% (r/r) defibrineret hesteblod (Animal Blood Center, Syracuse, N.Y.) og fordeles derpå i 1 ml portioner i ampuller, lyofiliseres og henstilles ved -70°C.

Det til dyrkning af organismerne anvendte basalsubstrat er 3,7% (BHI). Basalsubstratet suppleres med 10 mg NAD og 20 mg hemin (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) pr. liter. Der tilsættes 1% (r/r) defibrineret hesteblod pr. 50 ml podekultur. De tilsatte materialer er frisk fremstillet og filtreres gennem et 0,45^um "Nalgene"® -filter (Nalge Sybron Corp., Rochester, N.Y.) før anvendelse. Til dyrkning af organismerne i en 14 liter fermenteringsbeholder tilsættes substratet yderligere 0,5% glucose.

Til fremstilling af en kolbe med podeorganismer optøes 1 ml frossen stamkultur og overføres til 50 ml af det berigede BHI substrat, som er tilsat defibrineret hesteblod og NAD. Kulturen dyrkes i 8 timer ved 37°C på et rystebord ved 150 rpm. Organismerne tilsættes som 1%'s inokulum til 500 ml portioner af det berigede BHI-substrat i 2 liter kolber, som derpå inkuberes ved 37°C under moderat rystning på et rystebord i 8 timer (til isolering af PRP) eller i 14 timer (som podekulturer).

4

DK 154327 B

Dyrkningen af hver batch i en 14 liter fermenteringsbeholder initieres ved aseptisk overføring af 700 ml af podekulturen til 7 liter af det berigede BHI-substrat tilsat hemin i stedet for defibrineret hesteblod. Kulturen holdes kontinuert ved en temperatur på 37 - 1°C. Beholderen omrøres med en hastighed på 150 omdr./min., og der opretholdes en luftstrøm på 0,25 liter luft pr. liter mask pr. minut· Under dyrkningen tilsættes om nødvendigt 0,001% af en siliconskum-dæmper ("FD-82", Hodag Chemical Corp.). Kulturerne dyrkes til den 9 sene log fase (8-10 x 10 levedygtige celler/ml), sædvanligvis ca.

8 timer, og derpå afbrydes dyrkningen ved tilsætning af 0,4% formaldehyd og henstand natten over ved 4°C.

Isolering af polyribosylribitolphosphat (PRP)

Dyrkningssubstrat fremstillet som beskrevet ovenfor centrifugeres ved 27.000 x g i 30 minutter ved 4°C. Den cellefri ovenstående væske isoleres og behandles på følgende måde:

Trin 1) Ethanolfældning

Til den fracentrifugerede væske sættes natriumacetat (slutkoncentration 4%). Opløsningen indstilles på pH 6,0-6,2, og der tilsættes langsomt 44 liter ethanol under kraftig omrøring ved 4°C. Blandingen indstilles på pH 6,8 med iseddike og henstilles derpå i 12 timer ved 3°C. Det dannede bundfald isoleres ved dekantering og centrifugeres derpå, hvorved fås råt PRP.

Trin 2) "Cetavion" ® (hexadecyltrimethylammoniumbromid)-behandling

Det i trin 1) dannede bundfald opløses i pyrogenfrit, destilleret vand og centrifugeres til fjernelse af remanensen. Den klare, brune opløsning sættes derpå langsomt til 100 ml af en 10%'s vandig opløsning af "Cetavlon" ® under blanding (slutkoncentration 0,5%). Blandingen omrøres i 1 time og centrifugeres derpå. Bundfaldet af nucleinsyrer og PRP-"Cetavlon"® kompleks blandes med 2 liter 0,3 M natriumchlorid. Den uklare opløsning centrifugeres til eliminering af uopløselige materialer såsom nuclein-”Cetavlon" ® salt.

Den ovenstående væske fortyndes med et tilsvarende rumfang vand, hvorved PRP-"Cetavlon"® saltet fælder ud. Blandingen omrøres i 1 time, bundfaldet isoleres ved centrifugering og opløses derpå i 2 liter 0,3 M natriumchlorid.

Trin 3) Ethanolfældning "Cetavlon"® og urenhederne af nucleinsyrer og proteiner fjernes yderligere ved ethanolfældning (mindst 2 gange). PRP fældes som beskrevet i trin 1) , mens "Cetavlon" ® opløses i den alkoholiske op-

5 DK 154327 B

løsning. PRP isoleres ved centrifugering, opløses i 2 liter pyro-genfrit, destilleret vand og fældes derpå igen som beskrevet oven for. Det endelige PRP bundfald opløseliggøres i 20 mmol natrium-phosphat, pH 6,8.

Trin 4) Hydroxylapatitbehandling

Urenheder (f.eks. nucleinsyrer, proteiner og endotoxiner) i de delvis rensede PRP-materialer fjernes selektivt ved adsorption på hydroxylapatit [3·Ca^(PO^)2 *Ca(OH)0].

Den foreliggende opfindelse beror på den erkendelse, at poly-saccharidet PRP ikke adsorberes af det calciumphosphatholdige ad-sorptionsmiddel indeholdende 20 mmol phosphatpuffer med en pH-værdi på 6,7-6,9 eller 50 mmol phosphatpuffer med en pH-værdi på ca.

5,8. Urenhederne (såsom nucleinsyrer, proteiner og endotoxiner) adsorberes imidlertid under disse betingelser. Den her omhandlede fremgangsmåde kan gennemføres batchvis eller ved søjledrift. Ved batch fremgangsmåden sættes hydroxylapatit til det delvis rensede PRP materiale (i 20 mmol phosphat, pH 6,9). Blandingen blandes grundigt og centrifugeres til fjernelse af ikke ønskede faste 'Stoffer (adsorptionsmiddel og de af adsorptionsmidlet adsorberede urenheder). Den ovenstående væske behandles med hydroxylapatit som beskrevet ovenfor, mindst 2 gange mere. Den fremkomne opløsning filtreres gennem milliporefiltre, dialyseres mod pyrogenfrit, destilleret vand og lyofiliseres.

Ved søjledrift sættes det delvis rensede PRP i 20 mmol phosphatpuf fer (pH mindst 5,8) til en søjle indeholdende adsorptionsmidlet hydroxylapatit, som er ækvilibreret med 20 mmol phosphatpuf fer, pH 5,8, og elueres med en trinvis gradient af natrium-phosphatpuffer (pH 5,8) fra 20 mmol til 100 mmol. Fraktioner isoleres og analyseres for pentose (for polyribosylribitolphosphat). Fraktioner med en positiv pentosereaktion dialyseres mod pyrogenfrit, destilleret vand og lyofiliseres.

Eksempel 1 2,5 g hydroxylapatit (f.eks. "Biogel ® HTP", Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien) sættes til 250 ml delvis renset PRP-materiale (efter "Cetavlon" ®- og ethanolbehandling) (indeholdende ca. 1,0 mg PRP/ml) i 20 mmol natriumphosphatpuf-fer, pH 6,9, og blandes på et iskoldt vandbad (1-4°C) 1 1 time. Blandingen centrifugeres i en "Sorvall RC2-B"-centrifuge i 30

6 DK 154327 B

minutter ved 16.000 x g. Den ovenstående væske ledes derpå gennem et 0,65 μιη milliporefilter og underkastes den ovenfor beskrevne behandling (behandles hver gang med 2,5 g hydroxylapatit) yderligere 2 gange. Den dannede opløsning filtreres gennem 0,65 pm og 0,45 μπι milliporefiltre, dialyseres mod pyrogenfrit, destilleret vand og lyofiliseres. Det lyofiliserede produkt udviser stærk immunogen virkning (jfr. de efterfølgende dyreforsøg med kombineret vaccine) og indeholder meget små mængder urenheder (såsom nucleinsyrer, proteiner og endotoxiner), jfr. den efterfølgende tabel I. Der fås ca. 170 mg lyofiliseret PRP. Udbyttet af PRP ved denne fremgangsmåde udgør ca. 70% af udgangspolysaccharidet.

PRP bør opbevares under egnede betingelser, såsom ved 4°C i en ekssikator over phosphorpentoxid og silicagel.

Eksempel 2

Et delvis renset PRP (300 mg PRP) opløses i 100 ml 20 mmol natriumphosphatpuffer, pH 5,8 (dvs. 3 mg PRP/ml) Denne opløsning sættes til en 5,0 x 45 cm søjle af hydroxylapatit (ca. 250 ml massevolumen) , som er ækvilibreret med 20 mmol natriumphosphatpuffer, pH 5,8, og elueres med en trinvis gradient af 20 mmol, 50 mmol og 100 mmol natriumphosphatpuffer, pH 5,8. De individuelle fraktioner (200 ml) elueret med 20 mmol og 50 mmol natriumphosphatpuffer (pH 5,8) med positiv pentosereaktion (pentosebedømmelse ved orcinolmetoden) isoleres, dialyseres mod pyrogenfrit, destilleret vand og lyofiliseres. Der fås ca. 206 mg af det lyofiliserede produkt PRP.

Polysaccharidet PRP's renhed undersøges ved at beregne, i hvilken grad det er forurenet med nucleinsyrer, proteiner og endotoxiner. Proteinkoncentrationen bestemmes ved metoden ifølge Lowry et al., jf. "J. Biol. Chem." 193:265 (1951) med kvægserum-albumin som standard. Nucleinsyreindholdet måles ved absorption af PRP-opløsningen ved 260 nm. Absorptionen af 50 pg nucleinsyre i 1 ml vand i en celle, hvor lyset passerer en lagtykkelse på 1 cm, antages at svare til 1,0. Molekylstørrelsen beregnes ved hjælp af "Sepharose" ® 4B"- eller -2B"-gelfiltrering på en 1,5 x 90 cm søjle (Pharmacia-Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey). Fordelingskoefficientværdierne (Kd) (jfr. Gel Filtration, Theory and Practice, Pharmacia Fine Chemicals, (1979) side 31-33 beregnes ud fra elueringsmønsteret fremkaldt ved orcinolreaktionen (jfr. Herbert et al., "Methods in Microbiology", bind 5B, 285-291).

DK 154327 B

7 μ td CQ —

>1 O

HO O O

tn +) O O

0 CQ ^ H ' H 0) \ \

0 B Η H

s ε •Η Ή o . -μ o ø Ό . (U g : cr> td w o μυ o o H >i+J -

-μ &tn o O

tn ci tu h h

•Η Η B

U 0 (D td _ •μ w M 2 m 1-1 U G .. . Φ

(d H >S nJ

Μ Φ . N

r»· r" cm fi Q) O o\° “ ·· A Ί3 J) n >

,¾ O O ,. £ O -H

tn cm ti iS η h g g » M ,¾ Ϊ g, °

H CU (U

Λί U Η Λ fl) 4J (D H

Ht >i >ι ω ε tn ω ω .o o)^ tn λ *w S o ^ g . · Λ ω G ® , « fi h © o) 3 td η h — oo m η μ tn -Η -η o h

B CQ (D o\° *> - o (DX^IHNO

> h— o o e τΐ-Ηο & ci u

tu O H 4J o · <D

0 “ tti'-'OgHO» tn s = ^ 'S ^ ^ H * - (U W ε ε C td M-l Qi &. tn ">< p >o> m h c tn

Di >i <U w, ^ Γη·ΗΟ

cm h tn o oo σ> ch Μ· ω !U

ttiO'-' - * ° ρμ o · tn cj+j0\ovDfo P H Æ μ 3 tn <j βw mm m S’ CHQ)

<D N Λ 3: dl ·Η ‘H

cp\ 'H ^ η β υ ^ ^ (£) _ - o 5 μΒ&)(β

- ε OH (UB O CQ

(UCQ O H t? ^ g tn^tn^o td Std _ £(£) m ftr 2 tn μ tt! h X3 (d +* K -H C 4-1 ί* x! (D &i ft ffl (u t n t n ^ CM tn tø tn tu o »d

Ό <tJ - (UO>HM-l(i)oaji;iH

W o O co μ tn td o m w s5Sw,rHm tue: ^ tu S β td i) ft & cd >ομ^4

'OtDtDHØ-H^S

•g M d 'S 3 μ^^ε £ = 5 ^ M S d o h >, cq tn o M in ΗΗΰ-μ= (utntn «< td td td μ n c » -W o Ό (U ci co tu μ (Dtu^^aJH^tTiQ).

>0 G tn tn Φ ε SojSD

g. aJW'xp&'Qjlwtdk tn tn ΌΌΛμΗο<5φ+>Λ! tPJ4 cJCPiCftH g Ij > m m

fi <D H CM

G >>^^2ωΪ^^ΛΙ>ι

Btn <!<!^PHHQ)ritnDis 8 DK 154327 Β

For at undersøge virkningen af en vaccine, som indeholder PRP fra Haemophilus influenzae, er der fremstillet en kombinationsvaccine med B. pertussis-antigener.

A. Der fremshilles en kombinationsvaccine indeholdende PRP fra Haemophilus influenzae type b og B. pertussis antigener på følgende måde. 140 mg PRP (fremstillet som beskrevet i eksempel 2) opløses i 350 ml steril, phosphatpufret saltopløsning (PBS) (0,113 g kalxumdiphosphat, 0,83 g dinatriumphosphat og 8,5 g natriumchlorid pr. liter, pH 7,0, indeholdende 0,01% thimerosal) og filtreres gennem et 0,45 Mm milliporefilter. Denne koncentrerede PRP opløsning t (400 ^ig/mll anvendes til fremstilling af en kombinationsvaccine, som består af PRP og B. pertussis antigener.

Til 150 ml af den koncentrerede PRP-opløsning (400 jig/ml) sættes 150 ml frisk B. pertussis(stamme 138)cellesuspension i PBS, pH 7,0 (indeholdende 149 opacitetscelleenheder pr. ml) til fremstilling af stamopløsningen af den kombinerede vaccine. Denne stam-opløsning (300 ml) holdes ved 4°C, indtil endotoxinmængden i pertussis er formindsket (mindst 90 dage). Stamopløsningens sterilitet testes ved hjælp af thioglycollatsubstrat ved 32-33°C. Stamopløsningens pH-=-værdi efter 90 dages inkubation måles og indstilles på 7,0 ί 1. Slutproduktet (vaccine), som anvendes til dyreforsøg, fremstilles ved fortynding af den kombinerede stamopløsning med PBS, og den indeholder 10 PRP og 3,5 pertussis-opacitetscelle-enheder/Q,5 ml (dosis).

Resultaterne af antistofreaktion på denne kombinerede vaccine i unge rotter er vist i fig. 1 og 2 på tegningen.

B. Der fremstilles en stamopløsning af PRP (400 jig/ml) ved opløsning af 30 mg PRP (fremstillet som beskrevet i eksempel 1) i 75 ml steril, phosphatpufret saltopløsning (PBS), og der filtreres gennem et 0,45 Mm milliporefilter. Til 25 ml af dette koncentrerede PRP sættes et tilsvarende rumfang (dvs. 25 ml) frisk B. pertussis(stamme 138)cellesuspension i PBS, pH 7,0 (indeholdende 149 opacitetscelleenheder pr. ml) til fremstilling af stamopløsningen af den kombinerede vaccine. Denne stamopløsning (50 ml) opbevares ved 4°C i mindst 90 dage. Denne stamopløsnings sterilitet testes som beskrevet ovenfor med thioglycollatsubstrat. Stamopløsningens pH-værdi er 7,0 - 1. Slutproduktet (vaccine), som anvendes til dyreforsøg,

9 DK 154327 B

fremstilles ved fortynding af stamopløsningen medIPBS, og den indeholder 10 ^ig PRP og 3,,7 pertussis-opacitetscelleeaiheder/0,5 ml (dosis).

C- Der fremstilles esn PRP stamopløsning (200 jig#ml i PBS, pH 7,0) som beskrevet under B. Pertussis-stamopløsningen ((indeholdende 75 opacitetsenheder/mi}) fremstilles ved fortynding? af 25 ml frisk Β» pertussis cellesuspension (149 opacitetsenhedar pr. ml) med et tilsvarende rumfang PBS. Begge s tamopløsninger iilkuberes separat ved 4°C i 90 dage eller lidt længere. Den kombinerede vaccine fremstilles ved at tage 14 ml af PRP-stamopløsningen ((200 jig/ml) plus 14 ml (detoksificeret) stamopløsning af pertussisantigener (75 opacitetsenheder/ml) og fortynde dette med 112 ml PBS (slutvolumen 140 ml). Den fremkomne vaccine, som anvendes til (dyreforsøg, indeholder 10 pg PRP og 3,7 pertussis-opacitetsenhedar/0,5 ml (dosis).

Resultaterne af antistofreaktion på denne kombinerede vaccine i unge rotter fremgår af figur 3 på tegningen sanfit af tabel II.

DK 154327B

10 Μ 0) Η—' 0) G Η Ο -Ρ .

ιΗ ·Η *—* d 4-> Ό tn

44 H G

Ο CD Ο Η m ·π U Ρ

\ G Ρ CD

+j ·η ο ta· <ϋ ι Η Η νο η μ ιο ηοο Ό-P G ».**>.».**

G CO "HG HH ΗΗΓ-' HH

GOS HH

(0 Λ 0,0)5 Ρ mh

(D (¾ tO H fU

Ρ PS <D 0) P

P gu t n t n a O I G ·& PEP' —

η · O H

φ n <p —' dj tn S ^ a g a ·η G o -p

' ’ pH

H ‘G

-P / λ s

to ti) oo σ cn Η O O H

χ -P Gn in η η h r- ^ H Sil Q) H O HH i—li—It H^f Η > Η Η H LO g P. H 4J *· *-

S -P 44 O

0 44 Ο '"'Τ' X G ·γί t^· r' oo n cm w η p

hi h G<n oh *< n O n in w (D

H tO O H HH Hi—ΙΟ H 1-- HG

•H -P I H tO O

H tD t0 -P OH

* QJ tO H tO Ό -P

Λ G -P O \ 44 G -P G a VO CO IOOLD to H P 0)

Fh p G h ho nnn ^ in 0) ·π

O) I HHHHHHHtJG

a a oh 1 Ph il) 4h -- a a tn Gd) S i D o p a h o to o

•P O σι n o co Η no-PH

Η β σιΗΗΟΟσιΗΟΗ G<! HHHH H-P^"

+J O <D

CD S S’ -p p ad

HQ) O

g 3 'm n ~ O ω Λ Ό OT tn ri S3 +) ^ -s —. ^ OTO S1 ,* G H~ 22 S w S coSG ,’Sm

g tOCDO ^ ^ WWW ww 4J.UH0J

g Η ^ P pnoto1« H to G tD 9J n Ή II c

OtDH ata-Pllfi

Q Win H O

n > p w S

- OT "" η Ό O 00 m η h g .

~ p o o p

• o (D ,G P Η V

P G H G 0 -P ,-P

Ό to h h cd h 44 4-1

4J S HG O) Λ 0)(D

Q) t n Λ CD ω U -Ρ ·π

Pjh , n toG a I H G g HH ^ ,· -- S > « G -P °

GG .P U -P^ ft p ίο H

a to ω μ 'S ot p (DS-p-P

+)¾. H x S H ® JJ) Λ tn -P <D H -¾ <D GH 10 M 10 G a · a to G tD ® G Eja OT S n+t|)H p o G 44 'Τ' H ao G ^ 3 P + ’S O O CD G £

OOT-P4J -P 2 ^ Η fl ΰ H H

o oh p a a p 5? a

u DK 154327 B

Sammenligningsforsøg.

I nedenstående tabel III er det vist, ait PRP fremstillet læd fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan kombineres med B. per-taiss is-celler, og at den resulterende kombinationsvaccine fremkalder en betydelig sitørre antistof reaktion hos rtnge individer, end det er tilfældet med vacciner indeholdende ®RP fremstillet ved en phenolekstraktionsmetode.

Tabel III

Sammenligning af antistofreaktion fremkaldt med vacciner indeholdende på forskellig måde fremstillet PRP.

Vaccine Individ nr. PRP-antiistof ^g/ml) PRP fremstillet ved 16 0„46 fremgangsmåden 17 ^ 0,,54 ifølge opfindelsen 18 JD„27 + B. pertussis- 19 0,,48 -ce Iler 20 0,,31

Phenolekstraheret 1 <3),/02 PRP + B. pertus- 2 < 0,/02 sis-celler 3 <0,/02 4 <0,/02 5 0,/06 6 0,/05 7 <0„i02 8 0,,(04 9 < 0,/02 10 < 0,/02

Et antistofspejl på > 0,15 Mg/ml anses Sor at være beskyttende.

Claims (1)

12 DK 154327 B Fremgangsmåde til isolering og rensning af immunologisk aktivt polyribosylribitolphosphat (PRP), kapselpolysaccharidet i Haemophilus influenzae type b, ved hvilken stammer af organismen Haemophilus influenzae type b dyrkes under kendte betingelser, PRP isoleres ved ethanolfældning, og PRP isoleres yderligere som et hexadecyltrimethylammoniumbromidkompleks, kendetegnet ved, at PRP renses yderligere ved hjælp af hydroxylapatit enten a) ved tilsætning af hydroxylapatit [3 ‘Ca^ (PO^) (OH) 2] i en 20 mM natriumphosphatpuffer ved en pH-værdi på fra 6,5 til 7,0, blanding ved en temperatur på 2-10°C, centrifugering, fjernelse af den ovenstående væske og gentagelse af den beskrevne fremgangsmåde mindst to gange, filtrering af den ovenstående væske gennem egnede filtre, dialysering mod pyrogenfrit, destilleret vand og derpå lyofilisering eller b) ved søjlechromatografi i en 0,02 M natriumphosphatpuffer ved en pH-værdi på ca. 5,8 gennem hydroxylapatit [S'Ca^(PO^)2’Ca(OH)/ eluering med en trinvis gradient af 0,02 M og 0,05 M natriumphosphatpuffer ved en pH-værdi på ca. 5,8, isolering af fraktionerne ved hjælp af analyse for PRP, dialysering af fraktionerne mod pyrogenfrit, destilleret vand og derpå lyofilisering.