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Einrichtung zur mikroskopischen Abbildung nicht selbstleuchtender
Objekte, deren Einzelheiten keine oder zu geringe Helligkeitsunterschiede hervorrufen,
durch Phasenkontrast Es ist bekannt, daß bei der mikroskopischen Abbildung jede
Inhomogenität in der Objektebene, hervorgerufen durch von der Umgebung abweichende
Absorption, abweichenden Brechungsindex oder abweichende Dicke, in j eder der Aperturblendenebene
konjugierten Ebene eine Beugungsfigur der Aperturblende erzeugt. Bei hinreichend
kleinem Objekt ist diese weit auseinandergezogen, während die von hinreichend großem
Gesichtsfeld erzeugte Beugungsfigur sich auf das geometrische Bild der Aperturblende
zusammenzieht. Letzteres entspricht also dem direkten, vom Objekt nicht beeinflußten
Licht.
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Mit dem in der deutschen Patentschrift 636 168 angegebenen Phasenkontrastverfahren
wurde von Zernike durch Anwendung der Abbeschen Lehre von der Bildentstehung im
Mikroskop auf nicht absorbierende, also im normalen Hellfeldbild unsichtbare Objekte
gezeigt, daß man diese durch geeignete Phasenänderung und Schwächung des direkten
Lichtes allein oder des vom Objekt abgebeugten Lichtes allein im Bilde sichtbar
machen kann.
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Beim Köhlerschen Beleuchtungsprinzip dient die Aperturblende in der
vorderen Kondensorbrennebene als Ersatzlichtquelle. Zur Durchführung des Verfahrens
wird im geometrischen Bild der Aperturblende ein Phasenplättchen passender Absorption
und Phasendrehung angebracht. Als günstigste Blendenform hat sich der Kreisring
erwiesen.
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Dies läßt sich theoretisch und experimentell bestätigen. Das strenge
Zernikeverfahren liefert bekanntlich ein objekttreues Phasenkontrastbild; für die
Beobachtung im durchfallenden Licht ist das ein solchen, bei
dem
ein Objekt mit überall gleichem, aber höherem Brechungsindex oder überall gleicher,
aber größerer Dicke als die Umgebung gleichmäßig dunkel auf hellem Grund erscheint
(positiver Kontrast).
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Da aber der Phasenring eine endliche Ausdehnung haben muß, wird stets
auch ein Teil des durch das Objekt abgebeugten Lichtes vom Phasenring beeinflußt.
Das Zernikeverfahren ist also nicht in aller Strenge durchführbar. Hierdurch kommen
Strukturen in das Bild, die im Objekt nicht vorhanden sind. Das Phasenkontrastbild
ist also objektunähnlich, was sich in Form einer dunklen Berandung innerhalb des
Objektes und einem hellen Hof um das Objekt äußert. Der dunkle Rand und helle Hof
breiten sich mit schmaler werdendem Ring und kleinerem Objekt mehr und mehr aus,
das Bild wird also immer objektähnlicher. Diese Zusammenhänge sind bereits in der
Literatur eingehend erörtert worden.
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Hierbei wurde als Maß der Objektähnlichkeit der wellenoptisch mit
Hilfe der Kirchhoffschen Beugungsformel berechnete Parameterwert erkannt. In ihm
sind
= Wellenzahl pro 2 n cm, f = Brennweite des Objektivs, 2 B = Durchmesser des Phasenobjekts
und d R = Breite des Phasenringes.
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Diese Verhältnisse sind in der Abb. i in Kurvenform nochmals dargestellt,
und es bedeutet zusätzlich 99 = die durch das Objekt hervorgerufene Phasenänderung
im Bogenmaß, 2 B" = Durchmesser des von einem kreisförmigen Objekt erzeugten Bildes,
Abstand irgendeines Bildpunktes von der optischen Achse und I15" =Intensität im
Punkt p". hach der Darstellung entspricht das objekttreue Bild dem 1'-Wert Null.
Für verschiedene I'-Werte wurde die Intensitätsverteilung in der Darstellung beispielsweise
für den Achromaten 6 mit f = 2,35 cm und für grünes Licht der Wellenlänge A, = 5,46
- io 5 cm berechnet und Übereinstimmung mit der Helligkeitsverteilung im Bilde einiger
künstlicher, der Rechnung angepaßter Phasenobjekte erzielt. Bei photographischen
Aufnahmen wurden sowohl Ringbreite als auch Objektgröße variiert und so der allmähliche
Übergang zum objekttreuen Phasenkontrastbild dargestellt. Man kommt so zu dem Schluß,
daß die bisher übliche, normale Phasenkontrasteinrichtung nur sehr kleine Objekte
objekttreu wiedergibt, während größere entsprechend dem dunklen Rand und hellen
Hof Strukturen zeigen, die im Objekt nicht vorhanden sind. Mit zunehmender Objektähnlichkeit
der Phasenobjekte werden die absorbierenden Objekte in Übereinstimmung mit der Theorie
immer objektunähnlicher, um schließlich fast vollständig zu verschwinden. Die .phasenkontrastmikroskopische
Untersuchung natürlicher Objekte, deren Struktur nicht genau bekannt ist, kann deshalb
zu Trugschlüssen Anlaß geben.
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in einigen bisher bekanntgewordenen. Arbeiten über das Phasenkontrastverfahren
sind Vorschläge zur kontinuierlichen Veränderung des Kontrastes durch Variation
der Phasendrehung und Durchlässigkeit des Phasenringes gemacht worden. Auf diese
Weise kann man den Phasenring dem Objekt anpassen und so für die gegebene Ringbreite
optimalen Kontrast erzielen. An dem Grad der Objekttreue wird hierdurch jedoch nichts
geändert.
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Auf Grund der der Erfindung zugrunde liegenden Überlegung erscheint
es noch wichtiger, den Kontrast durch Veränderung der Ringbreite zu variieren, denn
nur so kann mit Sicherheit die wahre Struktur irgendeines phasendrehende und absorbierende
Objekte enthaltenden natürlichen Präparates ermittelt werden.
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Die kontinuierliche Änderung der Breite des Phasenringes ist dabei
nicht unbedingt notwendig. Verwendet man neben dem bisher üblichen noch einen leicht
auswechselbaren sehr schmalen Phasenring, so sind nacheinander die drei wichtigsten
Fälle zu beobachten. Im Hellfeld werden die absorbierenden Obj ekte objekttreu abgebildet.
Im an sich bekannten normalen Phasenkontrastbild sind die absorbierenden und phasendrehenden
Objekte gleichzeitig, doch je nach Größe mehr oder weniger objektunähnlich sichtbar,
während der sehr schmale Phasenring eine nahezu objekttreue Abbildung der Phasenobjekte
liefert. Mit Hilfe dieser drei Bilder kann man also verhältnismäßig sichere Aussagen
über die wahre Struktur eines beliebigen Präparates machen.
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Die Erfindung bezieht sich demnach auf eine Einrichtung zur mikroskopischen
Abbildung nicht selbstleuchtender Objekte, deren Einzelheiten keine oder zu geringe
Helligkeitsunterschiede hervorrufen, durch Phasenkontrast mit in irgendeinem Bilde
der Aperturblende angeordneten Phasenringen und einer den Phasenringen entsprechend
ausgebildeten Aperturblende, deren Bild sich mit den Phasenringen deckt, und sie
besteht darin, daß wenigstens zwei Phasenringe unterschiedlicher Breite sowie Mittel
zum schnellen, nacheinander erfolgenden Einstellen auf die verschiedenen Phasenringe
vorgesehen sind.
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Wie sich das erwähnte Auswechseln der Phasenringe ohne Unterbrechung
der mikrFoopischen Beobachtung in einfacher Weise durchf'ü'Iren läßt, soll im folgenden
beschrieben werden, doch ist hierzu noch eine Vorbemerkung notwendig.
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Durch die an sich bekannte Aufspaltung des normalen Phasenrings in
zwei schmale konzentrische Ringe gleicher Breite z. B. wird der Grad der Objektähnlichkeit
erhöht. Hierbei sollen die beiden Ringe einen solchen Abstand haben, daß die zu
einem Ring gehörende Beugungsfigur vom zweiten nicht wesentlich beeinflußt wird.
Wird hier für verschiedene Objektgrößen 2 B entsprechend dem schon erwähnten Parameterwert
1' und verschiedenen Ringabständen Z -R der Parameter-wert
eingeführt, so ergibt sich aus einer Ableitung, daß mit
für j' > 5 der Ringabstand obige Bedingung erfüllt. Bringt man nun innerhalb des
normalen Phasenringes in entsprechendem Abstand einen zweiten, sehr schmalen Phasenring
und in der zugehörigen
Aperturblende einen zweiten entsprechenden
Ring an, so liefern beide Ringe zusammen das dem normalen Phasenring entsprechende
Phasenkontrastbild, da die Störung durch den schmalen Ring vernachlässigbar klein
ist. Zieht man jetzt die Kondensoririsblende so weit zu, daß der normale äußere
Ring der Aperturblende ganz verdeckt ist, so sieht man für j' > 5 das dem schmalen
Ring entsprechende Phasenkontrastbild, da in diesem Fall entsprechend dem passend
gewählten Abstand die Beugungsfigur von dem normalen Ring nur sehr wenig beeinflußt
wird.
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Zur Verdeutlichung des Erfindungsgedankens sind die Verhältnisse nochmals
in der Abb. 2 schematisch . dargestellt. Es bedeuten: i die Kondensoririsblende,
2 die Aperturblende, 3 den Kondensor, q. das Objektiv, 5 die Objektebene und 6 die
in der hinteren Brennebene liegende Phasenringblende. Weiterhin stellt 7 den an
sich bekannten Phasenring normaler Breite und 8 nach der Erfindung einen zweiten,
wesentlich schmaleren Phasenring dar.
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Entsprechend sind auf der Aperturblendenseite 9 der dem normalen Phasenring
entsprechende und io der dem schmalen Phasenring entsprechende Aperturblendenring.
Nach einer Weiterbildung der Erfindung ist außer den beiden den Phasenringen entsprechenden
Aperturblendenringen ein dritter, breiter, aber in der Objektivbrennebene keinem
Phasenring entsprechender Aperturblendenring vorgesehen. Dies wird in der Abb.3
verdeutlicht, in welcher zu den schon erwähnten Phasenringen 7 und 8 und den Aperturblendenringen
9 und io noch ein weiterer, aber breiter Aperturblendenring ii hinzukommt. Dadurch
ist es möglich, mit der Irisblende nacheinander die Aperturblendenringe ii und 9
abzudecken. Dies entspricht einer nacheinander durchgeführten Beobachtung im Hellfeld
des normalen Phasenkontrastbildes und schließlich einer dem schmalen Phasenring
9 entsprechenden nahezu objekttreuen Abbildung der Phasenobjekte.
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Dieser zusätzliche Aperturblendenring bringt in Verbindung mit der
erwähnten Irisblende auch für die bisher verwendete Phasenkontrasteinrichtung mit
einem Phasenring wesentliche Vorteile. Man kann, ohne die mikroskopische Beobachtung
unterbrechen zu müssen, durch Betätigen der Irisblende allmählich von der Hellfeld-
zur Phasenkontrastbeobachtung übergehen. Das ist wesentlich, wenn das Präparat außer
Phasenobjekten auch Amplitudenobjekte enthält.
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Eine andere Möglichkeit zum Auswechseln der Phasenringe läßt sich
mit Hilfe einer Zwischenabbildung schaffen.
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Das vom Kondensor + Objektiv erzeugte Bild der Aperturblende liegt
stets entweder kurz hinter dem Objektiv oder, besonders bei den stärkeren Systemen,
im Objektiv selbst, so daß diese Ebene zum Auswechseln der Phasenringe nicht zugänglich
ist. Um diesen Schwierigkeiten zu entgehen, ist schon eine Zwischenabbildung der
hinteren Brennebene in eine günstigere Stelle vorgeschlagen worden.
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Man verwendet dann ein Objektiv ohne Phasenplättchen und bringt letzteres
an den Ort der Zwischenabbildung, wo es leicht gegen ein anderes ausgetauscht werden
kann. Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung sind für verschiedene Objektive
verschiedene konzentrische Phasenringe auf einer Revolverscheibe angebracht und
eine zweite in der Aperturblendenebene angeordnete Revolverscheibe mit den Phasenringen
entsprechenden Aperturblenden vorgesehen. Dieses Ausführungsbeispiel wird nach der
schematischen Darstellung in Abb. q. näher erläutert. Es bedeutet ia die hintere
Brennebene, 13 das Zwischenabbildungssystem und 1q. bzw. 15 die in der Phasenringebene
bzw. in der Aperturblendenebene angeordneten Revolverscheiben.
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Es liegt auch im Sinne der Erfindung, daß die beiden Revolverscheiben
nicht mit konzentrischen Phasenringpaaren bzw. Aperturblendenringpaaren, sondern
mit für verschiedene Objektive verschiedenen, aber einzelnen Phasenringen bzw. Aperturblendenringen
unterschiedlichen Breiten versehen sind, doch so, daß jedem Objektiv zwei oder mehr
Phasenringe unterschiedlicher Breite zugehören, so daß unter Verzicht der Irisblende
allein durch Bedienung der Revolverscheiben der durch unterschiedliche Ringbreiten
der Phasen- bzw. Aperturblendenringe hervorgerufene Phasenkontrast erzielt wird.
Es läßt sich zeigen, daß die Einrichtung nach der Erfindung auch für r < 5 brauchbar
ist. In den Formeln
ist für jedes Objektiv f konstant. K, d RR sowie d R kann man
nur in verhältnismäßig engen Grenzen verändern. Es war in dem erwähnten Beispiel
und für den normalen Phasenring d R = o,o6i cm. J -R kann man kaum größer
als o,i cm machen. Einsetzen dieser Werte in P und I' ergibt j' = 5 - io3
B; T normal = 3 - io3 B Für Objekte mit j' < 5 wird 1' normal < 3.
Das heißt aber, daß man bei sehr kleinen Objekten auf die Wirkung des schmalen Ringes
verzichten kann, da, wie aus der Darstellung der berechneten Intensitätsverteilung
(Abb. i) und photographischen Aufnahmen ersichtlich ist, schon der normale Phasenring
ein obj ekttreues Bild liefert.
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Die hier speziell für die Beobachtung im durchfallenden Licht beschriebene
Einrichtung läßt sich selbstverständlich auch für die Beobachtung im reflektierten
Licht verwenden.