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Verfahren zur Herstellung einer Polwomyelitis-Vaccine
Die Erfindung
bezieht sich auf ein Verfahren zu der Herstellung von Vaccinen gegen Poliomyelitis.
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Es ist bekannt, daß Poliomyelitis eine Virus krankheit ist, die tödlich
sein kann oder zu weitreichenden Verkrüpplungen führt. Wegen der Natur dieser Krankheit
liegt der einzige brauchbare Zugang zu diesem Problem in einer Prophylaxis, d. h.
in einer Entwicklung von Mitteln, die das Auftreten der Krankheit verhindern. Kürzlich
wurde eine Vaccine aus abgetöteter Poliomyelitis entwickelt, die aus abgetöteten,
aber antigenen Poliomyelitisvirusarten der Typen I, 2 und 3 zusammengesetzt ist,
und diese wurden einer erschöpfenden klinischen Prüfung unterworfen. Diese Poliomyelitis-Vaccine
stellt gleich vielen anderen Vaccinen eine wäßrige Zubereitung dar, die durch Injektion
verabreicht wird. Deswegen ist es notwendig, daß die Vaccine steril ist, d. h. frei
von schädlichen Bakterien und Schimmelpilzen, nicht nur während der Herstellungs-
und Verpackungszeit, sondern auch zur Zeit der Verabreichung. Wenngleich es vielleicht,
theoretisch wenigstens, möglich ist, die Vaccine unter aseptischen Bedingungen herzustellen
und zu verpacken, können solche Vaccinen zur Zeit der Verabreichung durchaus verunreinigt
sein, insbesondere wenn die Verpackung, wie allgemein im Handel bekannt ist, eine
Mehrfach-Dosen-Packung darstellt. Darüber hinaus ist die Herstellung unter vollständig
aseptischen Bedingungen
vom Standpunkt der Kosten aus nicht angängig
und gänzlich undurchführbar. Bei einem Versuch, sicher zustellen, daß die Vaccine
des Poliomyelitis-Virus frei von verunreinigenden Bakterien, Schimmelpilzen und
Pilzen ist und dieses sicher bleibt, wurde vorgeschlagen, eine Quecksilberbindung,
insbesondere Thiomerosal (Natriumäthylquecksilberthiosalicylat), als Schutzmittel
zuzugeben. Wenngleich dieser Versuch eine Lösung für das Problem der Verunreinigung
ergeben hat, hat er ein anderes und vielleicht noch ernsthafteres aufsteigen lassen.
Das Thiomerosal verursacht nämlich, daß die Poliomyelitis-Vaccine ihre Wirksamkeit
verlieren. Deswegen müssen Poliomyelitis-Vaccine-Produkte, die Thiomerosal als Schutzmittel
enthalten, bald nach ihrer Ilerstellung verabreicht werden. Dies ist natürlich höchst
unerwünscht, da die Vaccine schwierig und kostspielig herzustellen ist und unter
solchen Umständen die Herstellung auf bekannte kurze Zeiträume des Bedarfs beschränkt
werden muß. Im Hinblick hierauf und weil die Vaccine mehrere Monate für die Herstellung
erfordert, ist es undurchführbar, hinreichend Vaccine herzustellen, um einem unerwarteten
Notbedarf zu entsprechen. Es ist daher ein dringender Bedarf für eine Poliomyelitis-Vaccine
vorhanden, die nicht nur sicher frei von verunreinigenden Bakterien und Schimmelpilzen
zur Zeit der Verabreichung ist, sondern die auch ihre Wirkung, d. h. ihre antigene
Wirkung über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen Bedingungen einer Lagerung
behält.
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Es ist Ziel der Erfindung, eine Poliomyelitis-Vaccine zu schaffen,
die sicher frei von verunreinigenden Bakterien, Pilzen und Scliimmelpilzen ist und
es über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen Bedingungen einer Lagerung und
der Verwendung bleibt.
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Es ist weiter ein Ziel der Erfindung, eine Poliomyelitis-Vaccine
zu schaffen, die ihre antigene Wirkung über eine beträchtliche Zeitdauer unter normalen
Lagerungsbedingungen beibehält.
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Überraschenderweise werden diese Ziele sowie auch andere Ziele, die
hernach ersichtlich werden, erreicht und die vorgenannten Schwierigkeiten bei Poliomyelitis-Vaccinen
überwunden gemäß der Erfindung, indem man in eine abgetötete-Poliomyelitis-Vaccine,
d. h. in eine wäßrige Lösung, die einen nichtinfektiösen, sondern antigenen Poliomyelitis-Virus
enthält, eine Substanz einverleibt, die zur Klasse der Verbindungen gehört, die
als Eiweißfällung und Denaturungsmittel bekannt ist. Insbesondere umfaßt die vorliegende
Erfindung das Einverleiben von Benzäthoniumchlorid in eine wäßrige abgetötete Poliomyelitis-Vaccine
in einer Konzentration (Gramm auf Kubikzentimeter) im Bereich von etwa 1 : 20 000
bis 1: 50 000. Das Benzäthoniumchlorid wird der Vaccine vorzugsweise durch langsame
Zugabe einer verdünnten wäßrigen Lösung von Benzäthoniumchlorid einverleibt. Es
ist bekannt als Benzyldimethyl [2-(2-(p-I, I, 3, 3-Tetramethylbutyl-phenoxy)-äthoxy)-äthyl]
-ammoniumchlorid-Monohydrat und besitzt die Formel
Die bevorzugten Produkte sind solche, die Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration
im Bereich von I : 20 000 bis I : 40 000 enthalten.
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Die bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung verwendeten
wäßrigen abgetöteten Poliomyelitis-Vaccine können irgendeinen oder alle verschiedenen
Typen des Poliomyelitis-Virus enthalten.
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Die bevorzugten Vaccinen sind solche, die die Typen I, 2, 3 des Poliomyelitis-Virus
enthalten. Besonders geeignete Vaccine sind solche, die einen relativ niedrigen
Eiweißgehalt aufweisen, vorzugsweise solche, die weniger als I8 bis 20 y Eiweißstickstoff
je cm3 aufweisen. Solche Vaccinen können auf mehreren verschiedenen Wegen hergestellt
werden, zum Beispiel kann ein zerkleinertes GelF. ebe aus Affennieren mit Trypsin
behandelt werden, um fremde Gewebe zu entfernen. Die restlichen Zellen läßt man
sich vervielfältigen, das Medium wird mit Poliomyelitis-Virus beimpft, das Gemisch
dann entwickelt, die Flüssigkeit gesammelt und der lebende Virus durch Esehandlung
mit Formaldehyd, Ultraviolettbestrahlmg oder andere geeignete Mittel inaktiviert.
Gegebenenfalls können auch Vaccinen verwendet werden, die unter Fortlassung der
Trypsinbehandlungsstufe hergestellt wurden, aber in diesem Fall kann der Eiweißgehalt
der Vaccine übermäßig hoch sein und sollte daher vor der Verwendung bestimmt werden.
Bei der Herstellung von gemischten Vaccinen, d. h. von Vaccinen, die mehr als eine
Art von Poliomyelitis-Virus enthalten, ist es üblich, die gesammelten Flüssigkeiten,
die die verschiedenen Arten enthalten, nach der Inaktivierungsstufezusammen zuzugeben
oder zu vermischen, obgleich gegebenenfalls dies auch vorher geschehen kann. Bei
Verwendung von mit Formaldehyd inaktivierten Vaccinen werden die besten Ergebnisse
gemäß vorliegender Erfindung erzielt durch Verwendung von Vaccinen, denen kein Natriumbisultit
zugesetzt war, um den Formaldehydgehalt zu reduzieren.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert: Beispiel
I Für die Entwicklung von Poliomyelitis-Virus werden Zellen hergestellt nach dem
Verfahren von Dulbecco, Journal of Experimental Medicine, Bd. 99, S. I67,
(1952).
In Kürze besteht dieses Verfahren darin, daß man zunächst eine Suspension der Epithel-Zellen
von Nieren von Affen herstellt (s. Dulbecco, Proc. Nat.
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Acad. Sci., Bd. 38, S. 747, [I954]) durch Behandlung von mazeriertem
Nierengewebe von gesunden Cynomalgus- oder Rhesus-Affen mit Trypsin zur Entfernung
von Fremdstoffen und zum Herauslösen der einzelnen Zellen. Diese Zellen läßt man
sich auf einer Glasfläche in einem-beliebigen Gewebskulturmedium vervielfältigen.
Die so erhaltene Schicht von entwickelten Nierenzellen wird dann mit einer Impfkultur
von Poliomyelitis-Virus, Type I (Mahoney), beimpft und das Gemisch bei 36 bis 37°
entwickelt, bis die Zerstörung der Zellen vollständig ist und große Mengen von neuem
Virus freigesetzt wurden. Die Flüssigkeit, die den Virus enthält, wird dann gesammelt
und durch eine ultrafeine gefrittete Glaskerze filtriert. Das Filtrat, das den lebenden
Poliomyelitis-Virus, Type I, enthält, wird auf den Virusgehalt, die Bakteriensterilität
und die Stammeinheit untersucht.
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Ein Filtrat, das den lebenden Poliomyelitis-Virus, Type 2 (MEF-I-Stamm),
enthält, wird nach dem oben für die Herstellung des Filtrats mit Poliomyelitis-Virus,
Type 1, beschriebenen Verfahren hergestellt.
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Ein Filtrat mit einem lebenden Poliomyelitis-Virus, Type 3 (Saukett-Stamm),
wird nach dem gleichen Verfahren hergestellt.
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Die lebenden Virusarten, die in den einzelnen Filtraten enthalten
sind, werden durch Zugabe von Formaldehyd und durch Entwicklung der erhaltenen getrennten
Mischungen gemäß der Arbeitsweise, die im einzelnen in der Verbesserung mit zu den
mindesten Erfordernissen für Poliomyelitis-Vaccine beschrieben ist, veröffentlicht
am 20. Mai I954 durch das United States Department of Health, Education and Welfare,
inaktiviert. Es wird kein Natriumbisulfat zugegeben, um das überschüssige Formaldehyd
zu neutralisieren.
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Etwa gleiche Mengen. der Typen I, 2 und 3 der abgetöteten Poliomyelitis-Virus-Vaccine
werden vereinigt, und die erhaltenen vereinigten Vaccine werden in aliquote Teile
zerlegt, die bei der Herstellung von Produkten nach der Erfindung verwendet werden.
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Ein aliquoter Teil wird in unveränderter Form für die Verwendung als
Kontrollprobe zurückbehalten.
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0,75 cm3 einer Holzigen Lösung von, Benzäthoniumchlorid werden langsam
unter mäßigem, aber wirksamem Rühren zu I50 cm3 kalter wäßriger abgetöteter Poliomyelitis-Vaccine,
die wie oben angegeben hergestellt war, zugegeben. Das anfallende Produkt wird in
Ampullen in geeigneten Mengen bei der Verwendung bei der Immunisierung abgefüllt.
Diese Poliomyelitis-Vaccine, die Benzäthonium in einer Konzentration von 1 : 20
000 enthält, behält seine Wirksamkeit unter den normalen Bedingungen einer Lagerung
(Eisschranktemperatur) über mindestens 8 Monate. Sie bleibt auch frei von verunreinigenden
Bakterien und Schimmelpilzen unter normalen Bedingungen der Verwendung und Lagerung.
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Die Bestimmungen der Wirksamkeit der Kontrollprobe des Vaccine-Produkts
nach der Erfindung sind in Tabelle I unten angegeben. Diese Wirksamkeiten werden
bestimmt durch das Verfahren der Serum-Neutralisation, beschrieben von Salk, Younger
und Ward, American Journal of Hygiene, Bd. 60, S. 214, (1954). Die Ergebnisse sind
angegeben in Werten eines geometrischen mittleren Titers. Kurz gesagt besteht das
Untersuchungsverfahren darin, daß man Affen mit dreimal I-cm3-Dosen der Vaccineinwöchentlichen
Intervallen impft, die Tiere am Ende der Behandlungsperiode zur Ader läßt, aus dem
gesammelten Blut ein Serum gewinnt und die Zahl der im Serum vorhandenen Antikörper
bestimmt. Diese Bestimmung wird durch serienmäßige Verdünnung des Serums mit Salzlösung
und Vermischung der verdünnten aliquoten Teile mit einer Standardlösung vorgenommen,
die eine bekannt Anzahl von Infektionseinheiten einer gegebenen Art von Poliomyelitis-Virus
enthält, z. B. wenn man die Analyse auf Wirksamkeit des Typs I durchführt, verwendet
man eine Standardlösung, die eine bekannte Anzahl von Infektionseinheiten des Typs
I des Poliomyelitis-Virus enthält.
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Für die Analyse auf Wirksamkeit des Typs 2 und des Iyps 3 verwendet
man Standardlösungen des infektiösen Virus Typ 2 und Typ 3. Der Endpunkt der Titration
ist die Verdünnung, bei der das Serum hinreichend Antikörper enthält, um eine genaue
Neutralisation zu ergeben, d. h. sich mit der bekannten Anzahl von infektiösen Einheiten
des Virus in der Standardlösung zu verbinden oder diese nicht infektiös zu machen.
Eine Anzahl von Affen wird bei der Analyse der Wirksamkeit für jede Typenart von
Poliomyelitis-Virus verwendet. Die so erhaltenen Ergebnisse werden für einen guten
Vergleich und statistische Auswertung in eine geeignete Form gebracht, indem man
den Logarithmus der Basis 2 der Endpunktverdünnung für das Serum für jeden Fall
nimmt, diese Zahlenmittel und dann den Gegenwert des so erhaltenen Mittels verwendet.
Dieser Gegenwert wird der geometrische Mitteltiter der Vaccine genannt und ist natürlich
für jede Virusart, die in der Vaccine vorhanden ist, verschieden. Da der geometrische
Mittelwert abhängig ist von der Wirksamkeit der Standardlösung des beim Versuch
verwendeten infektiösen Poliomyelitis-Virus, ist es notwendig, die Zahl der infektiösen
Einheiten des in der Standardlösung vorhandenen Poliomyelitis-Virus zu spezifizieren,
um die richtige Kennzeichnung des geometrischen mittleren Titers wiederzugeben.
Das Verfahren der Berechnung des geometrisch mittleren Titers ist im einzelnen dargelegt
in der obenerwähnten Abänderung Nr. 2 der Mindesterfordernisse für Poliomyelitis
Vaccine.
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Um die Stabilität der antigenen Eigenschaften des Vaccine-Produktes
nach der Erfindung bei der Lagerung zu bestimmen, wird die Vaccine eine Woche auf
37° erwärmt und dann 8 Wochen bei 4" gelagert.
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Die Wirksamkeit jeder Virusart wird dann, wie oben beschrieben, bestimmt.
Da ein Erwärmen auf 37° während einer Woche den gleichen Effekt auf die Wirksamkeit
einer Vaccine hervorruft wie ein Lagern während 6 Monaten bei 4", entspricht die
Aufbewahrung der Vaccine während des Versuchs einer Lagerung von 8 Monaten bei 4°.
Das Kontrollmuster wurde 9 Wochen bei 4" gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit
jedes Stammes des Virus bestimmt, wie oben beschrieben wurde.
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Tabelle I
| Nummer der |
| Zahl der neutralisierten |
| Geometrischer |
| Untersuchungsmuster Virusart verwendeten Einheiten |
| mittlerer Titer |
| Affen von infektiösem |
| Virus*) |
| Kontrolle 1 8 101,6 256 |
| 2 8 101,5 650 |
| 3 8 12,8 41 |
| Vaccine-Produkt, enthaltend 1 12 101,6 204 |
| Benzäthoniumchlorid 2 12 101,5 540 |
| (c = 1:20 000) 3 12 102,8 47 |
*) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.
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Wie aus den obigen Ergebnissen ersichtlich ist, behält die Vaccine
nach der Erfindung ihre Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten über eine
Lager zeit, die einer Lagerzeit bei 4° während 8 Monaten äquivalent ist. Im Gegensatz
hierzu hatten Vaccine-Proben, denen Thiomerosal als Schutzstoff zugegeben war, ihre
Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten unter den gleichen Bedingungen
der Lagerung vollständig verloren. Dies wird durch die folgenden Versuche gezeigt:
Eine mit Formaldehyd inaktivierte, Vaccine mit Poliomyelitis-Virus der Typen I,
2 und 3 wird, wie oben beschrieben, hergestellt und in aliquote Teile unterteilt.
Ein aliquoter Teil wird als Kontrolle zurückgehalten, und zu einem anderen wurden
hinreichend Thiomerosal zugegeben, um die Thiomerosalkonzentration aufl: 100000
zu bringen. Die Kontrollporobe und das Muster mit Thiomerosal wurden 1 Woche auf
37° erwärmt und 1 Woche bei 4° gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit jeder Virusart
nach dem oben beschriebenen Verfahren bestimmt.
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Das Erwärmen und Lagern dieser Muster entsprach einer Lagerung von
6 Monaten bei 4°. Die Ergebnisse der Bestimmung der Wirksamkeit sind in der Tabelle
2 wiedergegeben.
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Tabelle 2
| Nummer der |
| Zahl der neutralisierten Geometrischer |
| Geometrischer |
| Untersuchungsmuster Virusart verwendeten- Einheiten |
| mittlerer Titer |
| Affen von infektiösem |
| Virus*) |
| Kontrolle I II I01,5 284 |
| 2 II 101,5 809 |
| 3 II 100,8 773 |
| Vaccine-Produkt, enthaltend I 12 101,5 <4 |
| Thiomerosal 2 12 101,5 26 |
| (C = 1: I00 000) 3 I2 100,8 9 |
*) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.
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Beispiel 2 Eine mit Formaldehyd inaktivierte Vaccine mit Poliomyelitis-Virus,
Type I, 2 und 3, wurde hergestellt wie im Beispiel I und in aliquote Teile unterteilt.
Ein aliquoter Teil wurde in unveränderter Form für die Verwendung als Kontrollmuster
zurückbehalten.
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Ein anderer aliquote Teil der Vaccine wurde in eine Vaccine nach
der Erfindung bei tropfenweiser Zugabe von 5 cm3 einer Lösung von Benzäthoniumchlorid
1:200 im Verlauf von etwa 2 Minuten unter wirksamem Rühren in der Kälte zu je rl
Vaccine hergestellt. Die anfallende Lösung mit Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration
von I : 40 ooo stellt die Vaccine nach der Erfindung dar.
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Um die Stabilität der antigenen Eigenscbaften der Vaccine nach der
Erfindung bei der Lagerung zu bestimmen, wurde die Vaccine 4 Wochen bei 4° gelagert.
Die Wirksamkeit jeder Virusart wurde dann, wie oben beschrieben, bestimmt. Die Kontrollprobe
wurde gleichfalls 4 Wochen bei 4° gelagert, und dann wurde die Wirksamkeit jeder
Virusart wie oben bestimmt. Die Ergebnisse dieser Wirksamkeitsversuche sind in Tabelle
3 wiedergegeben.
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Tabelle 3
| Nummer der |
| Zahl der neutralisierten Geometrischer |
| Geometrischer |
| Untersuchungsmuster Virusart verwendeten Einheiten |
| mittlerer Titer |
| Affen von infektiösem |
| Virus*) |
| Kontrolle 1 12 101,36 178 |
| 2 12 101,5 316 |
| 3 12 101,86 107 |
| Vaccine-Produkt, enthaltend I 10 101,36 I52 |
| Benzäthoniumchlorid 2 10 101,5 490 |
| (c = I 40 ooo) 3 10 101,86 60 |
*) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.
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Für Vergleichszwecke sind die Ergebnisse von Wirksamkeitsbestimmungen
eines anderen Kontrollmusters und einer anderen Vaccine nach der Erfindung, die
nach dem oben beschriebenen Verfahren, jedoch mit einer anderen mit Formaldehyd
inaktivierten Vaccine, die die Typen I, 2 und 3 des Poliomyelitis-Virus enthielt,
hergestellt wurden, in der Tabelle 4 wiedergegeben.
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Tabelle 4
| Nummer der |
| Zahl der neutralisierten Geometrischer |
| Geometrischer |
| Untersuchungsmuster Virusart verwendeten Einheiten |
| mittlerer Titer |
| Affen von infektiösem |
| Virus*) |
| Kontrolle 1 II 101,36 68 |
| 2 II 101,5 I4I |
| 3 II 101,86 76 |
| Vaccine-Produkt, enthaltend 1 12 101,36 7I |
| Benzäthoniumchlorid 2 12 I01,5 71 |
| (c = I 40 ooo) 3 I2 101,86 76 |
*) Wirksamkeit der Standardlösung, die bei den Versuchen verwendet wurde.
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Wie aus den Ergebnissen der Tabellen 3 und 4 ersichtlich ist, behielten
Vaccinen nach der Erfindung, die Benzäthoniumchlorid in einer Konzentration 1:40
ooo enthielten, ihre Wirksamkeit im Hinblick auf alle drei Virusarten bei einer
Lagerung während 4 Wochen bei 4° bei. Die Kontrollproben behielten ihre Wirksamkeit
unter den gleichen Bedingungen der Lagerung, aber waren empfindlich gegen eine Vergiftung
durch Pilze und Schimmelpilze. Es ist auch ersichtlich, daß kein merklicher Unterschied
zwischen der Wirksamkeit der Vaccinen, die Benzäthoniumchlorid enthielten, und der
Wirksamkeit der Kontrollproben vorhanden war.