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Verfahren zur Reinigung von Präparaten, die den antiperniciosa-anämischen
Faktor enthalten
Die vorliegende Erfindung -hetrifft ein Verfahren zur Herstellung
von Präpa.raten, welche Substanzen mit antiperniciosa-anämischer Wirksamkeit enthalten.
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Von dem antiperniciosa-anämischen Faktor wird angenommen, daß er
zwei oder möglicherweise mehr getrennte und unterschiedliche wirksame Bestandteile.
von denn einer kürzlich unter dem Samen Vitamin B12 bekanntgeworden ist, enthält.
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I)er hier benutzte Ausdruck aktives Material bedeutet irgendeine Substanz
oder ein Gemisch von zwei oder mehr getrennten und unterschiedlichen Substanzen
mit antiperniciosa-anämischer Wirksainkeit, wie sie durch klinische Prüfungen bestimmt
wird, unabhängig von der Zahl der Substanzen und von der Herkunft des Materials.
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Das aktive Material kann aus Leber erhalten werden, und es sind verschiedene
Methoden zur Erzielung von an aktivem Material reichen Extrakten aus Leber bekannt.
Neuerdings wurde ermittelt, daß das aktive Material in einem geeigneten Kulturmedium
von gewissen Mikroorganismen, wie z. B. Streptomyces Griseus, erzeugt wird, Wenn
die antiperniciosa-anämischen Faktoren auf mikrobiologischem Wege erzeugt werden,
so sind sie in dem Kulturmedium nicht immer in einer Form vorbanden, die antipeniiciosa-anämische
Wirksamkeit zeigt und die für die weitere Reinigung geeignet ist.
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In solchen Fällen kann es notwendig sein, eines oder mehrere Verfahren,
wie sie in der britischen Patentschrift 665 485 beschrieben sind, anzuwenden, um
aktives Material zu erhalten. Die letztgenannte Patentschrift beschreibt åuch,'wier
die Mikroorganismen, welche die antiperniciosa-anämischen Faktoren erzeugen,'erkannt
werden können.
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Entfernung von Verunreinigungen
aus den Extrakten, welche das obengenannte aktive Material enthalten.
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Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung soll erwähnt werden,
daß die Frage, ob ein gegebenes Material antiperniciosa-anämische Eigenschaften
besitzt oder nicht, nur durch klinische Prüfungen bestimmt werden kann. A:ndererseits
gibt eine Prüfung seiner mikrobiologischen Wirksamkeit durch den sogenannten Becher-Plattenver-
-such, wobei Lactobacillus' laXtis jDorner' oder Lactokacillus Leichmanii und reines
kVitamin -B12 als Standardpräparat verwendet werden (vgl.
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Cuthbertson, Biochem. J. I949, Proc. V.), einen Hinweis auf die antiperniåosa-anäomische
Wirksamkeit, welcher im allgemeinen. zuverlässig ist. Der im nachfolgenden benutzte
Ausdruck VitamineBl2-Wirksamkeit bedeutet die Wirksamkeit eines gegebenen Materials,
die mikrohiologisch wie beschrieben gemessen wird und von der durch klinische $r'üfungen
- bestimmten Wirksamkeit verschieden ist.
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Das aus Leber oder Mikroorganismen stammende aktive Material ist
gewöhnlich von Ver'unreiniguu= gen begleitet - wie Aminosäuren -oder Peptiden, welche,
da sie amphoter sind, schwer abzutrennen sind. Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist ein Verfahren,' wobei die rohen Extrakte des aktiven Ma.terials von diesen Verunreinigungen
befreit werden, ohne daß sie ihre antiperniciosa-anämische Wirksamkeit verlieren.
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Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das -aktive Material seine
antiperniciosa-anämische Wirksamkeit nicht verliert, wenn man es mit salpetriger
Säure behandelt. Es wurde weiter gefunden, daß, wenn man einen- Extrakt, der das
aktive Material und Verunreinigungen, bestehend aus Aminosäuren und Peptiden, enthält,
mit salpetriger Säure behandelt, die genannten Verunreinigungen in Oxysäuren umgewandelt
werden, die wesentlich - leichter aus dem aktiven Material abgetrennt werden können.
Dies erfolgt entweder durch Entfernen der Säuren aus den Mischungen oder durch -
Anwendung eines Lösungsmittels, welches - das aktive Material selbst' extrahiert.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird also ein Verfahren zur Entfernung
von Verunreinigungen aus einem Extrakt, der das oben- beschriebene Material enthält,
vorgesehen, wobei derggenannte Extrakt mit salpetriger Säure behandek wird. Die
entstehende Lösung kann- dann weiterhin so behandelt werden, daß eine Trennung des
aktiven Materials und der in der Lösung vorhandenen sauren Verunreinigungen erzielt
wird.
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Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung werden die sauren Verunreinigungen
nach dem BeW handeln mit salpetriger Säure von -der Lösung abgetrennt.
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Schließlich wird gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung die Lösung
nach der Behandlung mit salpetriger Säure neutral oder alkalisch gemacht und das
darin enthaltene aktive Material aus der :Lösung mit einem geeigneten Lösungsmittel,
wie es. unten beschrieben wird, extrahiert.
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Die wäßrigen Extrakte, welche als Ausgangsmaterial des erfindungsgemäßen
Verfahrens benutzt werden, können jeden beliebigen Grad von Reinheit oder Konzentration
besitzen, vorausgesetzt, daß sie antiperniciosa-anämische Wirksamkeit zeigen. So
kann man z. B. einen rohen wäßrigen Leberextrakt oder einen rohen Extrakt aus Mikro
Organismen benutzen, der z. B. nach der in der britischen Patentschrift 665 485
beschriebenen Metb,ode berges, teilt wurde, oder man kann alternativ eine oder mehrere
Reinigungsbehandlungen anwenden. Beispielsweise kann man eine Adsorption an Alüivkohle,
Lösungsmittelextraktion u. dgl. annvenden) bevor man von dem erfindungsgemäßen Verfahren
Gebrauch macht.
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Die Behandlung mit salpetriger Säure kann nach einer geeigneten Methode
erfolgen; so kann man vz. B. den wäßrigen Extrakt des aktiven Materials ansäuern
und ein Nitrit, wie z. B. Natriumnitrit, zufügen. Alternativ kann der Extrakt beispielsweise
mit nitrosen Dämpfen oder salpetriger Säure behandelt werden, welche man aus Alkylnitrit
wie -Ainy-lnitrft hergestellt hat.
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Da-das aktive Material unter stark sauren B dingungen zerstört werden
kann, so muB man be; achten, daß die Behandlung mit salpetriger Säure unter solchen
Bedingungen vor sich geht, daß das aktive Material nicht zerstört wird. Es wurde
gefunden, daß eine Behandlung in einem pH-Bereich -von-I bis 5 im allgemeinen befriedigende
Ergebnisse zeigt.
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In der Praxis wird der wäßrige Extrakt vorzugsweise bis zu einem
pH von 4 mit einer organischein Säure, wie z. B. Essigsäure, oder einer Mineralsäure,
wie z. B. Salzsäure, angesäuert und die erhaltene Lösung mit Natrium- oder Kaliumnitrit
behandelt, wobei nötigenfalls weitere Anteile an Säure zugefügt werden können, um
einen pH-Wert von ungefähr 4 aufrechtzuerhalten. Indessen kann man auch eine andere
Methode zur Behandlung mit salpetriger Säure anwenden, vorausgesetzt, daß stark
saure Bedingungen, welche das aktive Matenal zerstören könnten, vermieden werden.
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Die salpetrige Säure wird vorzugsweise im Uberschuß angewendet, und
damit dies geschehen kann, müssen die Aminogruppen in dem Ausgangsmaterial bestimmt
werden, z. B. nach der bekannten Methode von van Sly k e. Wenn die Menge der für
die Reaktion benötigten salpetrigen Säure bekannt ist, so werden die Mengen der
Reagenzien so stimmt, daß man einen Überschuß an salpetriger Säure erhält, z. B.
wenn Natriumnitrit angewendet wird, durch Verwendung eines Überschusses an Natriumnitrit.
Wenn die Reaktion beendet ist, kann -der Überschuß an salpetriger Säure gewünschten-
falls
zerstört werden, z. B. durch Zugabe von Harnstoff.
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Die J3elandlung mit salpetriger Säure kann bei ltaumtemperatur erfolgen,
jedoch wird im allgemeinden ein gelindes Erwärmen der Reaktionsmischung bevorzugt.
Es ist indessen zu beachten, daß eine zu holäe Reaktionstemperatur eine Zerstörung
des aktiven Materials verursachen kann.
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Wie bereits oben erwähnt wurde, können die behandelte Verunreinigungen
von dem aktiven Material auf zwei Arten abgetrennt werden; so können die Verunreinigungen
aus der nach dem Behandeln mit salpetriger Säure erhaltenen Lösung extrahiert werden,
oder alternativ kann das aktive Material selbst aus dieser Lösung extrahiert werden.
Selbstverständlich können beide Methoden in Kombination angewandt werden.
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Wenn man die sauren Verunreinigungen aus der Lösung extrahieren will,
so verwendet man die Mehoden zur Extraktion von Oxysäuren aus den sie enthaltenden
wäßrigen Lösungen. So kann die nach der Behandlung mit salpetriger Säure erhaltene
Lösung unter sauren Bedingungen mit einem organischen Lösungsmittel, das Oxysäuren
zu lösen vermag, extrahiert werden. Für diesen Zweck können viele organische Lösungsmittel
verwendet werden, es wurde jedoch gefunden, daß die folgenden Lösungsmittel besonders
geeignet sind: Ather, Chloroform, niedrigermolekulare aliphatische Ester, Butyl-
und Amylalkohole. Gewisse Lösungsmittel, besonders Butyl- und Amylalkohole, können
auch einen Teil des aktiven Materials extrahieren, und es ist daher zweckmäßig,
daß man den Losungsniittelextrakt anschließend mit Wasser extrahiert, um jede Spur
von aktivem Material, das mit dem Lösungsmittel extrahiert worden sein könnte, zurückzugewinnen.
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Die Extraktion wird vorzugsweise in einem pll-Bereich von I bis 5
durchgeführt. Die Lösungsmittelextraktiou der Säuren soll nicht unter zu stark sauren
Bedingungen erfolgen, wodurch das aktive Material zerstört werden könnte.
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Andere Extraktionsmethoden für Säuren, die angewendet werden können,
schließen die Verwendung ron anionaustauscheuden Harzen, die z. B. hunter der Beæeichnung
Deacidit- oder Amberlitharze IRA 400 und IR-B B im Handel sind, ferner die Ausfällung
mit Metallsalzen u. dgl. ein.
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Wenn man das aktive Material aus der nach der Behandlung mit salpetriger
Säure erhaltenen Lösung extrahieren will, so muß diese neutral oder alkalisch gemacht
werden und die erhaltene Lösung mit einem geeigneten, wie oben definierten Lösungsmittel
extrahiert werden.
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Der Ausdruck geeignetes Lösungsmittel bedeutet hierbei einen bei
gewöhnlicher Temperatur im Ausmaß von 3 bis 25 Volumprozent in Wasser löslichen
Alkohol oder ein Gemisch solcher Alkohole oder NIischungen von Phenol undXoder einem
oder mehreren Kresolen mit einem dieser Alkohole oder Mischungen voll Phenol und/oder
einem oder mehreren Kresolen mit nicht mehr als der dreifachen Menge ihres Gewichts
an in Wasser bei gewöhnlicher Temperatur bis zum Ausmaß von 3 bis 25 Volumprozent
löslichem Keton oder Ester oder Misellullgen von Phenol und/oder einem oder mehreren
Kresolen mit nicht mehr als der dreifachen Menge ihres Gewichts an Diäthyläther,
DiisGpropyläther, Benzol, Toluol undloder Xylol oder Alischungen von Phenol und/oder
einem oder mehreren Kresole, welche mit so viel Wasser vermischt sind, daß sie verflüssigt
werden, mit Propyl-oder Iscpropylalkohol, der 5 bis 25 Voluinprozent Wasser enthält.
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Wenn wäßrige Propyl- und Isopropylalkohole als Lösungsmittel verwendet
werden, so soll die wäß rige Lösung genügend Aussalzmittel enthalten. um eine vollständige
Mischbarkeit zu verhindern.
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Vorzugsweise wird als das geeignete Lösungsmittel Phenol oder eine
Mischung aus Phenol und Butanol angewendet. Das Reaktionsgemisch kann durch Verwendung
eines geeigneten Reagens neutral oder alkalisch gemacht werden. Vorzugsweise wird
Natrium- oder Raliumhydroxyd oder -carbonat verwendet. Es sei indessen erwähnt,
daß stark alkalische Bedingungen leicht die Zersetzung des aktiven Materials verursachen
können und daß demzufolge vorzugsweise der p-Wert der Lösung während dieser Extraktion
den Wert g nicht überschreiten soll.
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Anschließend an die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können
gewünschtenfalls geeignet, an sich bchanute Reinigungsmaßnahmen e-rgriffen werden.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne
sie zu beschränken.
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Beispiel I 50 ml einer teilweise gereinigten wäßrigen Lösung von
aktivem Material, hergestellt aus dem bei der Züchtung vcn Streptomyces Griseus
erhaltenen Nährboden nach der in der britischen Patentschrift 665 485 beschriebenen
Methode, an die eine teilweise Reinigung durch Adsorption an Aktivkohle, eine Elution
mit I0°/o Wasser enthaltendem Phenol und eine Entfernung des Phenols durch Behandlung
mit Äther und Wasser angeschlossen war, wurden mit Eisessig auf einen pE-Wert von
4 angesäuert und 5 inl einer gesättigten Lösung von Natriumnitrit zugegeben. -Die
Mischung wurde 5 Minuten lang auf ungefähr 800 erwärmt und dann 20 Minuten lang
gekühlt.
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Die gekühlte Lösung wurde dreimal mit dem gleichen Volumen Chloroform
und dann zweimal mit dem gleichen Volumen Butanol extrahiert. Die Butanollösungen
wurden mit wenig Wasser nachgewaschen und die Waschwässer zu der wäßrigen Hauptlösung
gegeben. Dieser wäßrige Extrakt wurde nun mit festem~Natriumbicarbonat auf ein PH
von 7,5 eingestellt und dreimal mit einem Butanol-Phenol-Gemisch (Volumenverhältnis
3 : t) extrahiert.
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Das in dem Butanol-Phenol-Extrakt enthaltene aktive Material wurde
in eine wäßrige Lösung durch Zugabe von 5 Volumina Diäthyläther und Waschen der
Phenol-Ather-Schicht mit Wasser
übergeführt. Durch weiteres Waschen
mit Äther wurde das ganze Phenol aus der wäßrigen Lösung entfernt, und die das aktive
Material enthaltende Endlösung hatte eine leicht braune Farbe. Der größte Teil der
gefärbten Verunreinigungen war durch die vorhergehenden Extraktionen. entfernt worden.
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Vor der Behandlung mit salpetriger Säure enthielt der Extrakt 665
y an wirksamem Vitamin B12 und 2,43 g feste Stoffe; nach der Behandlung enthielt
er 650y wirksames Vitamin B12 und 0,35 g feste Stoffe. Die Vitamin-Bl2-Wirksamkeit
wurde mit Lactobacillus lactis Dorn;er bestimmt.
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Beispiel 2 25 ml einer Lösung des aktiven Materials, welches man
durch teilweise Reinigung des durch Züchtung von Streptomyces Griseus gewonnenen
Nährbodens erhalten hatte, wurden mit Eisessig auf ein pE von 4 angesäuert und 3
ml gesättigte Natriumnitritlösung zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten lang
bei gewöhnlicher Temperatur stehengelassen und dann dreimal mit den gleichen Volumen
Butanol extrahiert, wobei das Butanol wieder mit etwas Wasser nachgewaschen wurde,
um einen Verlust an aktivem Material zu vermeiden. Die wäßrige Lösung wurde dann
mittels festem Natriumcarbonat auf ein pH von 7,3 gebracht und dreimal mit B«utanol-Phenol
(Volumenveshältnis 3 :I) extrahiert. Die phenolische Schicht wurde mit 5 Volumen
Diäthyläther verdünnt und die -Mischung mit kleinen Mengen von Wasser extrahiert.
- Schließlich wurde die vereinigte wäßrige Schicht mit Diäthyläther extrahiert,
um die letzten Spuren von Phenol zu entfernen.
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Vor der Extraktion enthielt die Lösung 48q y wirksames Vitamin B12
und 1,22 g feste Stoffe; nach der Behandlung mit salpetriger Säure und Extraktion
mit Butanol-Phenol enthielt die Lösung 450 y wirksames Vitamin B,2 und o,76 g feste
Stoffe. Die Vitamin-Bk,-Wirksamkeit wurde mit Lactobacillus lactis Dornes bestimmt.
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Beispiel 3 IOO ml eines wäßrigen Leberextrakts, welcher 20,3 g feste
Stoffe und Sooo;' wirksames Vitamin B12 enthielt, wurde mit 4 g Natriumnitrit und
konzentrierter Salzsäure bei einem PE von 4 behandelt und I Stunde lang gelinde
erwärmt. Die Lösung wurde weiter bis zu einem pE von 3 angesäuert und mit vier gleichen
Volumen n-Butanol extrahiert.
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Die Extrakte wurden mit kleinen Mengen Wasser nachgewaschen, die zu
der Hauptmenge der wäßrigen Lösung zugegeben wurden, Es wurde nun - neutralisiert
und dreimal mit 11/2 Volumen Phenol-ButanelÄ,fischung (i :) extrahiert. Die Extrakte
wurden mit mehreren Volumen Ather verdünnt und das aktive Material durch Extraktion
mit kleinen Mengen Wasser wieder zurückgewonnen.
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Das Produkt enthielt nur I,77 g feste Stoffe und 4000;' wirksames
Vitamin B12.
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Beispiel 4 25 ml einer Lösung von aktivem Material, welche durch
teilweise Reinigung des durch Züchtung von Streptomyces Griseus gewonnenen Nährbodens
erhalten wurde, wurde mit Eisessig auf ein pH von 4 angesäuert und 3 ml gesättigte
Natriumnitritlösung zugegeben. Die Mischung wurde 15 Minuten lang hei gewöhnlicher
Temperatur stehengelassen und der pH-Wert dann mit festem Natriumbicarbonat auf
7,3 eingestellt. Diese Lösung wurde hierauf dreimal mit Butanol-Phenol (Volumenverhältnis
3: I) extrahiert und die phenolische Schicht mit 5 Volumen Diäthyläther verdünnt,
wobei diese Mischung mit kleinen Mengen von Wasser extrahiert wurde.
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Schließlich wurde die vereinigte wäßrige Schicht mit Diäthyläther
extrahiert, um die letzten Spuren von Phenol zu entfernen.
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Vor der Extraktion enthielt die Lösung 487 r wirksames Vitamin B12
und I,22 g feste Stoffe; nach dem Behandeln mit salpetriger Säure und der Extraktion
mit Butanol-Phenol enthielt die Lösung 437 y wirksames Vitamin B12 und o,8g g feste
Stoffe. Die Vitamin-B12-Wirksamkeit wurde mit Lactobacillus lactis Dorner bestimmt.
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Beispiel 5 so ml einer Lösung von aktivem Material, welche durch
teilweise Reinigung eines durch Züchtung von Streptomyces Griseus gewonnenen Nährbodens
erhalten wurde, wurden mit Eisessig auf ein pB von 4 angesäuert und I,S g Natriumnitrit
in Form einer gesättigten Lösung zugegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang auf
8d° erwärmt und dann 20 Minuten lang gekühlt. Der p-Wert wurde mit festem Natriumbicarbonat
auf 7,3 eingestellt und die Lösung dreimal mit Butanol-Phenol (Volumenverhältnis
3 : 1) extrahiert. Die phenolische Schicht wurde mit 5 Volumen Diäthyläther verdünnt
und die Mischung mehrmals mit kleinen Mengen von Wasser extrahiert. Schließlich
wurde die vereinigte wäßrige Schicht mit Diäthyläther extrahiert, um die letzten
Spuren von Phenol zu entfernen.
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Die ursprüngliche Lösung enthielt vor der Behandlung mit salpetriger
Säure und Butanol-Phenol 500;' wirksames Vitamin B12 und 5,6 g feste Stoffe.
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Nach der Reinigung enthielt die Lösung 450 r wirksames Vitamin B12
und 1,47 g feste Stoffe. Die Vitamin-Bj2-Wirksamkeit wurde mit Lactobacillus lactis
Dorner bestimmt.
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Beispiel 6 300 ccm Rohflüssigkeit aus der Kultur von Streptomyces
Griseus, die 23,5 g feste Stoffe und ungefähr 24 r wirksames Vitamin Bt2 enthielt,
wurden auf 700 bei einem Po von 4 in Gegenwart von 1-2 g Natriumnitrit erwärmt,
5 Minuten lang bei 7a0 belassen und dann gekühlt. Die Lösung wurde auf ein PE von
7,5 eingestellt und mit drei gleichen Volumen einer Mischung von Phenol und Benzol
(I :3) extrahiert. Zu den vereinigten organi-
schen Schichten wurden
2 Volumen Benzol gegeben und die Mischung erschöpfend mit mehreren Portionen Wasser
extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte enthielten insgesamt 5,I5 g feste
Stoffe, das ist ungefähr 220/o des Ursprünglichen, und 20,1 y wirksames Vitamin
B1-, das ist ungefähr Sg O/o des Ursprünglichen.
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Be!ispiel 7 300 ccm Rohflüssigkeit aus einer Kultur von Streptomyces
Griseus, die 23,5 g feste Stoffe und ungefähr 24 y wirksames Vitamin B12 enthielt.
wurden mit 2.4 g Natriumnitrit bei einem pH von 4 20 Minuten lang bei gewöhnlicher
Temperatur stehengelassen. Die Lösung wurde dann, wie in Beispiel 6 angegeben, behandelt.
Die Gesamtmenge an festen Stoffen der wäßrigen Endextrakte war g, g, das ist I4,4°/o
der ursprünglichen festen Stoffe; die Gesamtmenge an wirksamem Vitamin B12 in den
Extrakten entsprach 83 0/o der ursprünglichen Gesamtmenge.