DE69929467T2

DE69929467T2 - Modifizierte antikörper und antikörper-fragmente mit verlängerter aktivitätsdauer

Info

Publication number: DE69929467T2
Application number: DE69929467T
Authority: DE
Inventors: A. George Malvern HEAVNER; W. Robert Downingtown WEBER
Original assignee: Centocor Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 1998-11-03
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2019-11-03
Also published as: DE69929467D1; AU1907800A; EP1144452B1; PT1144452E; WO2000026256A3; EP1144452A3; CY1105333T1; CN1406138A; AU768295B2; DK1144452T3; MXPA01005562A; CA2353082A1; EP1144452A2; ES2257094T3; ATE315410T1; WO2000026256A2; WO2000026256A9; NZ512055A

Description

Thrombozyten spielen durch Binden an Verletzungsstellen und nach Aktivierung, Initiieren der biochemischen Ereignisse, die zur Bildung eines Gerinnsels führen, eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Hämostase. Unter bestimmten Bedingungen können die Thrombozyten jedoch pathophysiologische Zustände, wie beispielsweise einer Herz-Kreislauf- bzw. kardiovaskulären Erkrankung und Tumormetastasierung verschlimmern. Unter normalen Bedingungen können beispielsweise Thrombozyten an einer Stelle einer Blutgefäßverletzung durch die Wechselwirkung von Rezeptoren mit der subepithelialen Schicht adhärieren, die auf der Plasmamembran der Thrombozyten exprimiert werden, wodurch die Thrombozyten aktiviert werden. Die Thrombozyten können durch zahlreiche andere Stimuli einschließlich Thrombin, Adenosindiphosphat (ADP), Kontakt mit künstlichen Oberflächen und einigen Immunkomplexen aktiviert werden. Sobald sie aktiviert sind decken die Thrombozyten die Fibrinogen-Bindungsstellen auf der Plasmamembran des Glycoproteins GPIIb/IIIa auf und eine Thrombozytenaggregation findet über Fibrinogenüberbrückung statt. Eine Aggregation von Thrombozyten kann eine Degranulation zytoplasmatischer Vesikel auslösen, die Proteine und chemische Mediatoren in den örtlichen extrazellulären Raum freisetzen, was zu einer weiteren Thrombozytenadhäsion, Aktivierung und Aggregation führen kann, um ein Gerinnsel zu erzeugen, das ein Ausströmen von Blutzellen aus dem Gefäß verhindert. Unter bestimmten Bedingungen jedoch kann eine Thrombozytenaggregation ein Blutgefäß verstopfen, was zu Ischämie und Zellnekrose führt. Eine Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung an einem abgerissenen atherosklerotischen Plaque in einer Koronaraterie kann beispielsweise zu einer Angina oder einem akuten Myokardinfarkt führen. Weiterhin kann eine Thrombozytenaggregation und Gerinnselbildung in Blutgefäßen an Stellen einer Endothelzellverletzung oder Denudation bzw. Abtragung, wie sie anschließend an eine Angioplastie vorgefunden werden kann, zu einem unvermittelten Verschluss des Gefäßes führen, was einen Notfalleingriff, wie beispielsweise eine Bypass-Operation, notwendig macht.
Die blutstillenden und pathophysiologischen Funktionen von Thrombozyten, die eine Adhäsion und Aggregation der Zellen erfordern, werden durch die Wechselwirkung von Plasmamembranrezeptoren von Thrombozyten mit Liganden vermittelt. Diese Rezeptoren (bspw. GPIIb/IIIa) sind Mitglieder der Integrin-Familie von Rezeptoren, die im Allgemeinen an Matrixproteine (bspw. Kollagen, Fibronektin, Fibrinogen, Laminin, Vitronektin und von Willebrand-Faktor) binden und zusätzlich zu der Thrombozytenfunktion mit Immunfunktion und Tumormetastasierung in Beziehung stehen. Somit gelten Antagonisten bestimmter Integrine (bspw. GPIIb/IIIa) als viel versprechende therapeutische Mittel.
Es wurden einige Antagonisten von GPIIb/IIIa, einschließlich Schlangengiftproteinen, kleinen Peptiden, Peptidmimetika, Nicht-Peptide Verbindungen und Antikörpern (Cook, N. S., et al., Drugs of Future, 19(1994), 135–159; Cox, D., et al., Medicinal Research Reviews, 14 (1994), 195–228; Coller, B. S., et al., Thrombosis and Haemostasis, 74 (1) (1995), 302–308) entwickelt. Ein Fragment eines humanisierten chimären Antikörpers, c7E3 Fab (ebenfalls bekannt als "abcixmab" oder ReoPro^®) das GPIIb/IIIa (spezifisch auf Thrombozyten exprimiert), α_vβ₃ (exprimiert auf Thrombozyten, Endothelzellen und möglicherweise glatten Muskelzellen (Felding-Habermann, B. and Cheresh, D.A. Current Opinion in Cell Biology, 5 (1993), 864–868)) und Mac-1 (ebenfalls als CR3, CD11b/CD 18, α_Mβ₂ bezeichnet, der auf aktivierten Leukozyten, wie beispielsweise Monozyten und Granulozyten (Altieri, D.C. and Edgington, T.S., Journal of Immunology 141 (1988), 2656–2660) exprimiert wird) bindet, wurde verwendet, um den plötzlichen Verschluss von Koronararterien zu verhindern und ischämische Komplikationen anschließend an eine Eingriffsmaßnahme in Koronaraterien zu vermindern. Eine Therapie, um bestimmte andere pathophysiologische Ereignisse zu lindern oder zu verhindern, kann jedoch eine häufige Verabreichung eines Therapeutikum über einen verlängerten Zeitraum erfordern. Die Wirksamkeit dieses Typs eines Therapieregimen kann aufgrund von Sacherverhalten bezüglich einer Patienteneinwilligung unbefriedigend ausfallen. Zusätzlich kann die häufige Verabreichung von Therapeutika (bspw. Proteine oder Peptide) die Herstellung von Antikörpern, die das Mittel binden, hervorrufen. Somit kann der Patient eine Immunkomplex vermittelte Resistenz und/oder Allergie auf ein bestimmtes Therapeutikum entwickeln.
Die WO 98/25971 betrifft monovalente Antikörperfragmente. Das Dokument offenbart Antikörperfragmente, die ein oder mehrere Polymermoleküle aufweisen, die durch ein Schwefelatom eines außerhalb der variablen Regiondomäne des Antikörpers angeordneten Cysteinrestes ortsspezifisch angebracht bzw. angeheftet sind. Die Polymere umfassen synthetische oder natürlich vorkommende Polymere, wie beispielsweise Polyalkylene, Polyalkenylene, Polyoxyalkylene oder Polysaccharide. Jedes Fragment kann an ein oder mehrere Effektor- oder Rezeptormoleküle angebracht werden.
Die WO 98/36778 betrifft eine Zusammensetzung zur nachhaltigen Arzneimittelzufuhr. Konjugate des chimären 7E3 Antikörpers oder Fab-Fragmenten davon, werden u.a. in einer Kombination mit einem Therapeutikum offenbart. Das Therapeutikum kann ein Phospholipid oder Heparin (ein Heteropolysaccharid) sein.
Die WO 90/06133 betrifft hetero-bifunktionelle Antikörper, die eine Spezifität für Thrombozyten und thrombolytische Mittel aufweisen. Das Dokument offenbart ein Verfahren einer thrombolytischen Therapie umfassend, Verabreichen an einen Patienten mit einem Thrombus oder mit einem Thrombusbildungsrisiko eines hetero-bifunktionellen Antikörpers, der zwei chemisch vernetzte Fab'-Antikörperfragmente aufweist, wobei das erste Fab'-Fragment ist spezifisch für den Glycoprotein-IIb/IIIa Rezeptor von Thrombozyten und das zweite Fab'-Fragment für den Gewebeplasminogenaktivator spezifisch ist.
Die WO 90/11783 betrifft Thrombozyten spezifische Immunkonjugate. In diesem Dokument wird ein Immunkonjugat offenbart, das ein thrombolytisches Mittel und 7E3 umfasst.
Die WO 96/40250 betrifft ein Thrombozyten spezifisches chimäres Immunglobulin. Das Dokument stellt einen umfassenden Überblick des Potentials von 7E3, chimärem 7E3 und entsprechenden Fab-Fragmenten, u.a. zur Hemmung einer Thrombose oder Stenose in verschiedenen Situationen bereit (bspw. anschließend an eine vaskuläre Eingriffsmaßnahme).
Die WO 98/32466 betrifft ein Pegylierungsverfahren. Das Dokument offenbart allgemeine Prinzipien einer Pegylierung von Antikörpern und legt eine Verwendung dieses Verfahrens zur Erhöhung deren Halbwertszeit nahe.
Der 9. Int. Kongress der Immunologie, 1995, S. 885, Zusammenfassung 5247 offenbart, dass die Immunogenität eines Anti-ICAM-1 monoklonalen Antikörpers der Maus durch die Zugabe von PEG 10-fach verringert wurde und dass die Bindungsaffinität des PEGylierten Antikörpers für ICAM-1 abgenommen hatte.
Es liegt eine fortwährende Notwendigkeit für einen Integrinrezeptorantagonisten mit einer verlängerten Wirkungsdauer und vorzugsweise geringer Immunogenität vor.
Die Erfindung betrifft modifizierte therapeutische Antikörper. Die Modifikation dient zur Verbesserung von pharmakokinetischen Eigenschaften (bspw. erhöhter in vivo Serum-Hablbwertszeit) ohne wesentlich die Antigenbindungseigenschaften (bspw. Affinität) der Antikörper zu beeinflussen.
Diesbezüglich stellt die Erfindung einen modifizierten Antikörper oder ein modifiziertes Antikörperbindungsfragment bereit, der/das an ein oder mehrere Antigene bindt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und Mac-1, worin der Antikörper oder das Antigenbindungsfragment ein bis sechs organische Reste umfasst, die kovalent an den Antikörper oder das Antigenbindungsfragment gebunden sind, und welche jeweils unabhängig eine substituierte, hydrophile polymere Gruppe darstellen, die mit einem Lipid oder Phospholipid substituiert sind. In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung modifizierte Antigenbindungsfragmente von Antikörpern (bspw. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂) bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform binden die modifizierten Antikörper an GPIIb/IIIa und/oder α_vβ₃ und antagonisieren die Bindung von Fibrinogen an GPIIb/IIIa und die Thrombozytenaggregation. In zusätzlichen Ausführungsformen wird die Bindung des modifizierten Antikörpers der Erfindung an GPIIb/IIIa und/oder α_vβ₃ durch 7E3 vollständig gehemmt. Vorzugsweise ist der modifizierte Antikörper der Erfindung 7E3 oder ein humanisierter 7E3. Ein bevorzugter humanisierter 7E3 ist c7E3.
In bestimmten Ausführungsformen kann die hydrophile polymere Gruppe ein Molekulargewicht von ungefähr 800 bis ungefähr 120.000 Dalton aufweisen und kann ein Polyalkanglycol (bspw. Polyethylenglycol (PEG), Polypropylenglycol (PPG)), Kohlenhydratpolymer, Aminosäurepolymer oder Polyvinylpyrrolidon sein.
Die organischen Reste sind an einen Carboxy-Terminus des Antikörpers und/oder an das Schwefelatom eines Cysteinrestes des Antikörpers kovalent gebunden. Die Erfindung stellt somit Antikörper bereit, die ortsspezifische Modifikationen umfassen. Ein modifiziertes Fab eines IgG kann beispielsweise einen PEG-Rest umfassen, der an den Carboxy-Terminus der schweren Kette gebunden ist.
In einer besonderen Ausführungsform umfasst ein modifiziertes c7E3 Fab' zwei PEG-Reste, die jeweils an das Schwefelatom von einem der Cysteinreste gebunden sind, die in der Gelenkregion der schweren Kette (die Cysteinreste in der Gelenkregion, die Zwischenketten-Disulfidbindungen in dem entsprechenden IgG oder F(ab')₂ bilden) beinhaltet sind.
In einer anderen besonderen Ausführungsform umfasst ein modifiziertes c7E3 Fab, das durch die Wirkung von Achromopeptidase erzeugt wurde einen PEG-Rest, der an den Carboxy-Terminus der schweren Kette gebunden ist.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung der vorstehend erwähnten Produkte in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Krankheiten und/oder Störungen bereit, bei denen Zellen, die GPIIb/IIIa, αvβ3 und/oder Mac-1 (bspw.-Thrombozyten, Endothelzellen und Leukozyten) exprimieren, eine pathophysiologische Rolle spielen. Derartige Krankheiten oder Störungen umfassen Thromboembolie-Störungen einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen (bspw. Atherosklerose, Angina, Koronararterien-Erkrankung), Schlaganfall, Ischämie und Tumorvaskularisierung, Tumormetastasierung und entzündliche Zustände. Eine wirksame Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung kann bei Bedarf davon einem Menschen verabreicht werden. Ein Antikörper der Erfindung kann alleine oder in Kombination mit einer wirksamen Menge von einem oder mehreren zusätzlichen aktiven Mitteln verabreicht werden.
Der modifizierte Antikörper der Erfindung kann in einem Verfahren zum Hemmen einer Thrombozyten vermittelten Metastasierung in einem Menschen verwendet werden, umfassend Verabreichen einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung an den Menschen.
In zusätzlichen Ausführungsformen stellt die Erfindung ein in vitro Verfahren zum Hemmen eines Prozesses (d.h. eines oder mehrerer) bereit, der durch die Bindung eines Liganden an GPIIb/IIIa, αvβ3 oder Mac-1 vermittelt wird, die auf der Plasmamembran einer Zelle exprimiert werden, umfassend Kontaktieren der Zelle mit einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers oder Antigenbindungsfragments der Erfindung. GPIIb/IIIa wird spezifisch auf Thrombozyten exprimiert und bindet einige Liganden (bspw. Fibrinogen, Fibronektin, von Willebrand-Faktor, Thrombospondin, Vitronektin). Der αvβ3 Vitronektin-Rezeptor wird auf Zellen exprimiert, wie beispielsweise Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen und zu einem geringeren Maß auf Thrombozyten und vermittelt die Adhäsion an zahlreiche extrazelluläre Matrixproteine (bspw. Vitronektin, Fibronektin, von Willebrand-Faktor, Fibrinogen, Osteopontin, Thrombospondin, Kollagen, Perlecan). Mac-1 wird auf aktivierten Leukozyten, wie beispielsweise Monozyten und Granulozyten exprimiert und bindet an zahlreiche Liganden (bspw. C3bi, Faktor X, Fibrinogen).
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen modifizierten Antikörper oder ein modifiziertes Fragment, wie hierin beschrieben, zur Verwendung in der Therapie (einschließlich Prophylaxe) oder Diagnose, und, wie hierin beschrieben, zur Verwendung eines derartig modifizierten Antikörpers oder Fragments zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer bestimmten Krankheit oder eines Zustands (bspw. Thromboemboliestörung, eine Krankheit oder Störung, in der die Zellen, die GPIIb/IIIa und/oder α_vβ₃ exprimieren, eine pathophysiologische Rolle spielen).
1 ist eine graphische Darstellung, die eine dosisabhängige Hemmung einer ADP induzierten (15 μM ADP) Thrombozytenaggregation (234.000/μl) durch c7E3 Fab und c7E3 Fab' (PEG₅₀₀₀)₂ zeigt.
2 ist eine graphische Darstellung, die eine dosisabhängige Hemmung einer ADP induzierten (20 μM ADP) Thrombozytenaggregation (250.000/μl) durch c7E3 und c7E3 Fab' (PEG_20.000)₂ zeigt.
3 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass ¹²⁵I-c7E3 Fab die Bindung eines c7E3 Fab und c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ an GPIIb/IIIa auf GPIIb/IIIa beschichteten Platten kompetitiv hemmt.
4 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass ¹²⁵I-c7E3 Fab die Bindung von c7E3 Fab und c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ an α_vβ₃ auf α_vβ₃ beschichteten Platten kompetitiv hemmt.
5 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass ¹²⁵I-c7E3 Fab die Bindung von c7E3 Fab und c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ an α_vβ₃ auf α_vβ₃ beschichteten Platten kompetitiv hemmt.
6 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass ¹²⁵I-c7E3 Fab die Bindung von c7E3 Fab und c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ an GPIIb/IIIa auf GPIIb/IIIa beschichteten Platten kompetitiv hemmt.
7 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass ¹²⁵I-c7E3 Fab die Bindung von c7E3 Fab und c7E3 Fab-PEG_5.000 an GPIIb/IIIa auf GPIIb/IIIa beschichteten Platten kompetitiv hemmt.
8 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass ¹²⁵I-c7E3 Fab die Bindung von c7E3 Fab und c7E3 Fab-PEG_5.000 an α_vβ₃ auf α_vβ₃ beschichteten Platten kompetitiv hemmt.
9 ist eine graphische Darstellung, die die Abbaugeschwindigkeit bzw. Clearance-Rate von c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ und c7E3 Fab'(NEM)₂ aus dem Serum von Mäusen zeigt.
10 ist eine graphische Darstellung, die die Abbaugeschwindigkeit von c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ aus dem Serum von Mäusen zeigt.
11 ist eine graphische Darstellung, die die Abbaugeschwindigkeit von c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ und c7E3 Fab aus dem Serum der Ratten zeigt.
12 ist ein Balkendiagramm, das den Titer spezifischer IgG Antikörper (anti-c7E3 Fab) zeigt, die durch mit c7E3 Fab oder c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ immunisierten Mäusen hergestellt wurden.
13 ist eine graphische Darstellung, die eine dosisabhängige Hemmung einer Thrombozytenaggregation durch c7E3 Fab, c7E3 Fab'(PEG_2.000)₂ oder c7E3 Fab'((PEG_5.000)₂)₂ zeigt.
14 ist eine graphische Darstellung, die eine dosisabhängige Hemmung einer Thrombozytenaggregation durch c7E3 Fab oder c7E3 Fab'((PEG_2.000)₄)₂ zeigt.
15 ist eine graphische Darstellung, die eine dosisabhängige Hemmung einer Thrombozytenaggregation durch c7E3 Fab oder c7E3 Fab'((PEG_2.000)₂)₂ zeigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen modifizierten Antikörper oder ein modifiziertes Antigenbindungsfragment, das spezifisch an ein oder mehrere Antigene, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und Mac-1 bindet, worin der modifizierte Antikörper oder das Antigenbindungsfragment ein oder mehrere organische Reste umfasst, welche an den Antikörper oder das Antigenbindungsfragment kovalent gebunden sind, und jeweils unabhängig eine substituierte hydrophile polymere Gruppe darstellen, die mit einem Lipid oder Phospholipid substituiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet der modifizierte Antikörper an GPIIb/IIIa spezifisch, das auf der Plasmamembran von Thrombozyten exprimiert wird, wodurch die Bindung von Fibrinogen an GPIIb/IIIa und eine Thrombozytenaggregation verhindert wird. Der Antikörper, der GPIIb/IIIa bindet, bindet vorzugsweise weiterhin den menschlichen bzw. humanen Integrin-Rezeptor α_vβ₃ spezifisch.
Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und der Begriff "Antikörper" beabsichtig sowohl polyklonale und monoklonale Antikörper zu umfassen. Die Begriffe polyklonal und monoklonal beziehen sich den Einheitlichkeits- bzw. Homogenitätsgrad einer Antikörperpräparation und sind nicht vorgesehen bestimmte Herstellungsverfahren zu beschränken. Der wie hierin verwendete Begriff "Antikörper" umfasst ebenfalls funktionelle Fragmente von Antikörpern, einschließlich Fragmente chimärer, humanisierter, primatisierter, furnierter oder Einzelkettenantikörper. Funktionelle Fragmente umfassen Antigenbindungsfragmente, die an ein Intergin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und Mac-1 binden. Antikörperfragmente, die beispielsweise an GPIIb/IIIa und α_vβ₃ oder Abschnitte davon binden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Fv, Fab, Fab' und F(ab')₂ Fragmente, die durch die Erfindung umfasst sind. Derartige Fragmente können durch enzymatische Spaltung, beispielsweise Papain- oder Pepsin-Spaltung, die jeweils Fab oder F(ab')2-Fragmente erzeugen können, oder durch rekombinante Verfahren hergestellt werden. Andere Proteasen mit der erforderlichen Substratspezifität können ebenfalls verwendet werden, um Fab oder F(ab')2 Fragmente zu erzeugen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Fab-Fragmente durch Achromopeptidasespaltung hergestellt. Antikörper können ebenfalls in einer Vielzahl verkürzter Formen unter Verwendung von Antikörpergenen hergestellt werden, in denen ein oder mehrere Stopp-Codons stromaufwärts der natürlichen Stopp-Stelle eingefügt werden. Beispielsweise kann ein chimäres Gen, das ein F(ab')₂ schwere Kettenabschnitt kodiert so gestaltet werden, das es DNA-Sequenzen umfasst, die die CH₁-Domäne und die Gelenkregion der schweren Kette kodiert. Einzelketten-Antikörper und chimäre, humanisierte oder primatisierte (CDR-gepropft) oder furnierte Antikörper, als auch chimäre, CDR-gepropfte oder furnierte Einzelkettenantikörper, die Abschnitte umfassen, die von unterschiedlichen Spezies stammen, und der gleichen werden durch die vorliegende Erfindung und den Begriff "Antikörper" umfasst. Die unterschiedlichen Abschnitte dieser Antikörper können durch herkömmliche Verfahren chemisch verbunden werden oder können unter Verwendung gentechnischer Verfahren als ein zusammenhängendes Protein hergestellt werden. Nukleinsäuren, die eine vhimäre oder humanisierte Kette kodieren, können beispielsweise so exprimiert werden, dass sie ein zusammenhängendes Protein erzeugen.
Siehe bspw. Cabilly et al., US-P-4,816,567; Cabilly et al., EP 0 125 023 B1 ; Boss et al., US-P-4,816,397; Boss et al, EP 0 120 694 B1 ; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., EP 0 194 276 B1 ; Winter, US-P-5,225,539; Winter, EP 0 239 400 B 1; Queen et al., EP 0 451 216 B1 ; und Padlan, E. A. et al., EP 0 519 596 A1 . Siehe ebenso, Newman, R. et al., BioTechnology, 10 : 1455–1460 (1992), hinsichtlich primatisierter Antikörper und Ladner et al., US-P-4,946,778 und Bird, R. E. et al., Science, 242 (1988), 423–hinsichtlich Einzelketten-Antikörper.
Der wie hier verwendete Begriff "humanisierter Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper oder ein Antigenbindungsfragment davon, das Abschnitte von Immunglobulinen unterschiedlichen Ursprungs umfasst, wobei mindestens ein Abschnitt menschlichen Ursprungs ist. Ein humanisierter Antikörper kann beispielsweise eine Antigenbindungsregion nicht menschlichen Ursprungs (bspw. Nager) umfassen und eine konstante Region menschlichen Ursprungs (bspw. eine menschliche Gerüstregion, eine menschliche konstante Region (bspw. C_L, C_H1, Gelenk; C_H2, C_H3, C_H4). Die Antigenbindungsregion kann von einem Immunglobulin menschlichen Ursprungs mit der erforderlichen Spezifität stammen.
In einer Ausführungsform umfasst der humanisierte Antikörper eine oder mehrere Immunglobulin-Ketten, die ein CDR nicht menschlichen Ursprungs (bspw. ein oder mehrere CDRs, die von einem Antikörper nicht menschlichen Ursprungs stammen) umfassen und eine Gerüstregion, die von einer leichten oder schweren Kette menschlichen Ursprungs (bspw. CDR-gepropfte Antikörper mit oder ohne Gerüständerungen, einschließlich Einzelketten-Antikörpern) stammt. In einer anderen Ausführungsform umfasst der humanisierte Antikörper (a) mindestens eine humanisierte leichte Kette, die eine Antigenbindungsregion umfasst, die von der leichten Kette eines nicht menschlichen Immunglobulins der erforderlichen Spezifität stammt und ein humanes leichte Kette konstante Region, und (b) mindestens eine humanisierte schwere Kette, die eine Antigenbindungsregion umfasst, die von der schweren Kette des nicht menschlichen Immunglobulins stammt und eine menschliche schwere Kette der konstanten Region. In einem Aspekt dieser Ausführungsform ist der humanisierte Antikörper ein chimärer Antikörper, der eine leichte Kette der variablen Region und eine schwere Kette der variablen Region eines Antikörpers nicht menschlichen Ursprungs und eine menschliche konstante Region umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der humanisierte Antikörper mit den 7E3 monoklonalen Antikörper der Maus oder dem chimären 7E3 oder einem Antigenbindungsfragment davon um die Bindung an menschliches GPIIb/IIIa oder menschliches α_vβ₃ konkurrieren. Die Antigenbindungsregion des humanisierten Antikörpers kann beispielsweise vom 7E3 monoklonalen Antikörper stammen. In einem Aspekt dieser Ausführungsform umfasst das humanisierte Immunglobulin die leichte und schwere Kette der variablen Regionen des 7E3 Maus-Antikörpers und eine menschliche konstante Region. In einem anderen Aspekt umfasst das humanisierte Immunglobulin CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Kette und CDR1, CDR2 und CDR3 der schweren Kette des 7E3 Maus-Antikörpers und eine menschliche konstante Region.
Der wie hier verwendete Begriff "chimärer Antikörper" bezieht sich ebenfalls auf einen Antikörper oder ein Antigenbindungsfragment davon, das Abschnitte von Immunglobulinen unterschiedlichen Ursprungs umfasst. Keiner der Immunglobulinabschnitte, die einen chimären Antikörper umfassen, müssen menschlichen Ursprungs sein. Ein chimärer Antikörper kann beispielsweise eine Antigenbindungsregion nicht menschlichen Ursprungs (bspw. Nager) und eine konstante Region eines nicht menschlichen Primatenursprungs (bspw. eine Gerüstregion des Schimpansen, eine konstante Region des Schimpansen (bspw. C_L, C_H1, Gelenk, C_H2, C_H3, C_H4)) umfassen.
Ein humanisierter oder chimärer Antikörper kann eine leichte Kette der konstanten Region (bspw. CK, C1) und eine schwere Kette der konstanten Region (bspw. C_H1, Gelenk, C_H2, C_H3, C_H4) eines erwünschten Isotyps umfassen, beispielsweise IgG (bspw. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA, (bspw. IgA2, IgA2), IgM, IgE, IgD. In einer besonderen Ausführungsform kann ein humanisierter Antikörper oder chimärer Antikörper eine schwere Kette der konstanten Region eines gemischten Isotyps (bspw. C_H1 und Gelenk eines IgG-Ursprungs und C_H2 und C_H3 eines IgA-Ursprungs) umfassen. Vorzugsweise umfasst ein humanisierter oder chimärer Antikörper eine IgG schwere Kette der konstanten Region. Am meisten bevorzugt umfasst ein humanisierter oder chimärer Antikörper eine IgG1 schwere Kette der konstanten Region.
Humanisierte Antikörper können unter Verwendung synthetischer DNA Verfahren, die Standardverfahren oder andere geeignete Verfahren verwenden, hergestellt werden. Nukleinsäure (bspw. cDNA)-sequenzen, die für humanisierte variable Regionen kodieren, können ebenfalls unter Verwendung von PCR Mutageneseverfahren gestaltet werden, um DNA-Sequenzen zu ändern, die eine menschliche oder humanisierte Kette, wie beispielsweise eine DNA-Matrix von einer vorher humanisierten variablen Region, kodieren (siehe bspw., Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17 (1989), 5404; Sato, K., et al., Cancer Research, 53 (1993), 851–856; Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19 (9) (1991), 2471–2476; und Lewis, A. P. and J. S. Crowe, Gene, 101 (1991), 297–302). Unter Verwendung dieser und anderer geeignetere Verfahren können ebenfalls leicht Varianten hergestellt werden. In einer Ausführungsform können geklonte variable Regionen mutagenisiert werden, und Sequenzen, die die Varianten mit der gewünschten Spezifität kodieren, können (bspw. aus einer Phagenbibliothek; siehe bspw. Krebber et al., US-P-5,514,548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, veröffentlicht am 1. April 1993) selektioniert werden.
Antikörper, die spezifisch für menschliches GPIIb/IIIa, α_vβ₃ oder Mac-1 sind, können gegen ein entsprechendes Immunogen, wie beispielsweise isoliertes und/oder rekombinantes GPIIb/IIIa, α_vβ₃ oder Mac-1 oder Abschnitte davon (einschließlich synthetischer Moleküle, wie beispielsweise synthetische Peptide) gezüchtet werden. Antikörper können ebenfalls gezüchtet werden, in dem ein geeigneter Wirt (bspw. Maus) mit Zellen immunisiert wird, die GPIIb/IIIa exprimieren, wie beispielsweise Thrombozyten (siehe bspw. Coller, US-P-5,440,020) oder Zellen die α_vβ₃ oder Mac-1 exprimieren. Zusätzlich können Zellen die rekombinantes GPIIb/IIIa, α_vβ₃ oder Mac-1 exprimieren, wie beispielsweise transfizierte Zellen, als Immunogene oder als ein SCRENN/eine Durchmusterung für Antikörper verwendet werden, die Rezeptor (Siehe bspw. Chuntharapai et al., J. Immunol. 152 (1994), 1783–1789; Chuntharapai et al., US-P-5,440,021) binden.
Eine Herstellung immunisierenden Antigens und eine Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper, kann unter Verwendung geeigneter Verfahren ausgeführt werden. Es wurde eine Anzahl von Verfahren beschrieben (siehe bspw., Kohler et al., Nature, 256 (1975), 495–497 and Eur. J. Immunol. 6 (1976), 511–519; Milstein et al., Nature 266 (1977), 550–552; Koprowski et al., US-P-4,172,124; Harlow, E. and D. Lane, 1988, Antibodies : A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Supplement 27, Summer'94), Ausubel, F. M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: New York, NY), Chapter 11, (1991)). Im Allgemeinen wird ein Hybridom durch Fusionieren einer geeigneten immortalisierten Zelllinie (bspw. einer Myelomzelllinie, wie beispielsweise SP2/0 oder P3X63Ag8.653) mit einer Antikörper bildenden bzw. produzierenden Zelle hergestellt. Die Antikörper produzierenden Zellen, vorzugsweise solche der Milz oder der Lymphknoten, können aus Tieren erhalten werden, die mit den Antigen von Interesse immunisiert wurden. Die fusionierten Zellen (Hybridome) können unter selektiven Kulturbedingungen isoliert, und durch Grenzwert-Verdünnung kloniert werden. Zellen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität herstellen, können durch einen geeigneten Test (bspw. ELISA) ausgewählt werden.
Es können andere geeignete Verfahren zur Herstellung oder Isolierung von Antikörpern der erforderlichen Spezifität verwendet werden, einschließlich beispielsweise Verfahren, die rekombinante Antikörper aus einer Bibliothek auswählen (bspw. eine Phagendisplaybibliothek), oder die auf eine Immunisierung transgener Tiere (bspw. Mäuse) angewiesen sind, die ein Repertoire menschlicher Antikörper ((siehe bspw., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993), 2551–2555; Jakobovits et al., Nature, 362 (1993), 255–258; Lonberg et al., US-P-5,545,806; Surani et al., US-P-5,545,807; Lonberg et al., WO 97/13852).) herstellen können.
Der wie hier verwendete Begriff "spezifischer Antikörper" oder "spezifisch" wird verwendet, wenn er sich auf eine Antikörper-Antigen-Wechselwirkung bezieht, um anzuzeigen, dass der Antikörper ein bestimmtes Antigen mit hoher Affinität (bspw. K_D geringer als ungefähr 10^–5 M) bindet, als im Gegenteil anzuzeigen dass der Antikörper lediglich ein Antigen bindet.
Ein Antikörper, der an GPIIb/IIIa α_vβ₃ und/oder Mac-1 bindet und vorzugsweise die Bindung von Fibronektin an GPIIb/IIIa hemmt und die Thrombozytenaggregation hemmt, kann, wie hierin beschrieben, modifiziert sein. In einer Ausführungsform ist, wie hierin beschrieben, der 7E3 (ein IgG1 der Maus, K) oder ein humanisierter 7E3 modifiziert. Ein bevorzugter humanisierter 7E3 ist c7E3, der die Antigenbindungsregionen der schweren und leichten Ketten des Maus 7E3 und die menschlichen γ1 und konstanten K Regionen (Knight, D.M. et al., Molecular Immunology, 32 (16) 1995), 1271–1281) umfasst. Andere humanisierte 7E3 Antikörper, die andere konstante Regionen menschlichen Ursprungs und/oder menschlicher Gerüstregionen umfassen können, können ebenfalls, wie hierin beschrieben, modifiziert sein. In bevorzugten Ausführungsformen werden funktionelle Fragmente (bspw. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂) von 7E3 oder ein humanisierter 7E3 modifiziert. Andere Antikörper können modifiziert sein, die eine Epitopspezifität ähnlich zu der von 7E3 oder c7E3 für GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder Mac-1 aufweisen, einschließlich Antikörpern die an die gleiche oder ein funktionell äquivalentes Epitop von auf GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder Mac-1 binden, wie es durch c7E3 oder 7E3 gebunden wird. Antikörper mit einer Epitopspezifität, die zu der von c7E3 oder 7E3 gleich oder ähnlich ist, umfassen Antikörpern, die die Bindung des c7E3 oder 7E3 oder eines geeigneten Antigenbindungsfragments davon (bspw. c7E3 Fab, 7E3 Fab) an GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder Mac-1 oder blockieren können. In einer Ausführungsform hemmte der Antikörper 7E3 (Maushybridom 7E3 wurde am 30. Mai 1985 bei der American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA hinterlegt und ist unter der Zugangsnummer HB 8832 erhältlich) kompetitiv die Bindung des modifizierten Antikörpers der Erfindung an GPIIb/IIIa und/oder α_vβ₃.
Die Modifikation der hierin beschriebenen Antikörper verbessert die pharmakokinetischen Eigenschaften des Antikörpers. Spezifischerweise sind die modifizierten Antikörper der Erfindung durch eine erhöhte in vivo Serums-Halbwertszeit gekennzeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die modifizierten Antikörper im Vergleich zu dem nicht modifizierten Antikörper weiterhin durch eine verringerte Immunogenität gekennzeichnet. Beurteilungen bzw. Erfassungen der Serum-Halbwertszeit und Immunogenität der Proteine und Peptide (bspw. Antikörper, modifizierte Antikörper) können unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens ausgeführt werden. Beispielsweise kann ein Protein einem Tier (bspw. durch Injektion) verabreicht werden, und Serum kann von dem Tier zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Verabreichung (bspw. einer Minute, Stunde, Tag, Woche, Monat, etc.) erhalten werden. Das Serum kann auf die Anwesenheit des modifizierten Proteins oder auf Antikörper, die an das modifizierte Protein (bspw. durch EILSA) binden, getestet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform, beeinflusst die Modifikation die Antigenbindungseigenschaften des Antikörpers nicht wesentlich. Die Antigenbindungseigenschaften eines Antikörpers können als die Antigen-Antikörper Assoziations-Geschwindigkeitskonstante (k_a), die Antigen-Antikörper Dissoziations-Geschwindigkeitskonstante (k_d) und die Affinität (K_D) ausgedrückt werden. Die Parameter können unter Verwendung einer beliebig geeigneten Verfahrens experimentell erfasst werden. (Siehe beispielsweise, Berzofsky, et al., "Antobody-Antigen Interactions", in Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed. Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY (1992), und das hierin beschriebene Verfahren.) Eine Modifikation, die die Antigenbindungseigenschaften eines Antikörpers nicht wesentlich beeinflusst, wird die Affinität des Antikörpers um nicht mehr als einen Faktor von ungefähr 100 ändern (bspw. erhöhen oder erniedrigen). Derartig modifizierte Antikörper binden an Antigen mit einer Affinität, die der Affinität des entsprechenden nicht modifizierten Antikörpers im wesentlichen gleicht. Beispielsweise kann ein Antikörper eine Affinität von 2 × 10^–9 M aufweisen und der modifizierte Antikörper kann eine Affinität zwischen ungefähr 2 × 10^–11 M und ungefähr 2 × 10^–7 M aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Modifikation die Affinität des Antikörpers nicht mehr als einen Faktor von ungefähr 10 ändern. Die erfasste Affinität einer bestimmten Antikörper-Antigen Wechselwirkung kann, wenn sie unter unterschiedlichen Bedingungen (bspw. Salzkonzentration, pH) erfasst wird, verschieden ausfallen. Folglich werden Erfassungen von Antigen-Antikörper-Parametern (bspw., k_a, k_d, K_D) mit standardisierten Antikörper- und Antigenlösungen und einem standardisierten Puffer, wie beispielsweise dem hierin beschriebenen Puffer, ausgeführt.
Die modifizierten Antikörper der Erfindung umfassen einen bis sechs organische Reste, die direkt oder indirekt an den Antikörper kovalent gebunden sind, wodurch die in vivo Serum-Halbwertszeit des Antikörpers erhöht, und vorzugsweise die Immunogenität verglichen mit dem nicht modifizierten Antikörper verringert wird. Der, wie hier verwendete, Begriff "organischer Rest" bezieht sich auf eine lineare oder verzweigte hydrophile polymere Gruppe, die mit einer Lipidgruppe (bspw. Diacylglycerolgruppe, Sphinglipidgruppe (bspw. Ceramidyl)) oder einer Phospholipidgruppe (bspw. Phosphatidylethanolamingruppe) substituiert ist. Bevorzugte Lipid- und Phospholipidgruppen werden durch die Strukturformeln I beziehungsweise II dargestellt. -O-CH₂-CH(R)-CH₂-R' (I) -NH-CH₂-CH₂-O-P(O^–)(O)-O-CH₂-CH(R)-CH₂-R' (II)
In den Strukturformeln I und II sind R und R' jeweils unabhängig, -OH oder eine Gruppe, die durch -X-Y, dargestellt wird, worin -X- ist -O-C(O)-, -S-, -O-S(O)2-O-, -NH-C(O)- oder -O-CH=CH, und Y ist eine Kohlenwasserstoffgruppe, die ungefähr 6 bis ungefähr 40 Kohlenstoffatome umfasst, die gesättigt vorliegen oder die ein oder mehrere ungesättigte Einheiten (bspw. Alkyl, Alkenyl, Alkynyl) aufweisen, vorausgesetzt, das sowohl R als auch R' nicht -OH sind. Vorzugsweise liegt -X- als -O-C(O)- vor. Folglich umfassen geeignete Lipid- und Phospholipidgruppen beispielsweise Diacylglycerole, Etherphospholipide, Thioetherphospholipide, Lysophospholipide und Plasmalogene.
Jede organische Gruppe, die an einen Antikörper der Erfindung gebunden ist kann unabhängig eine hydrophile polymere Gruppe sein, die mit einer Lipidgruppe oder einer Phospholipidgruppe substituiert ist. Der, wie hierin verwendete, Begriff "Fettsäure" umfasst Monocarboxylsäuren und Dicarboxylsäuren.
Der, wie hierin verwendete, Begriff "hydrophile polymere Gruppe" bezieht sich auf ein organisches Polymer, das in Wasser besser löslich ist als in Oktan. Beispielsweise ist Polylysin in Wasser besser löslich als in Oktan. Somit wird ein Antikörper, der durch die kovalente Anfügung von mit einem Lipid oder einem Phospholipid substituierten Polylysin modifiziert ist, durch die Erfindung umfasst. Zum Modifizieren erfindungs gemäßer Antikörper geeignete hydrophile Polymere können linear oder verzweigt sein und umfassen beispielsweise Polyalkanglycole (bspw. PEG, Monomethoxypolyethylenglycol (mPEG), PEG-Diamin, PPG und dergleichen), Kohlenhydrate (bspw. Dextran, Cellulose, Oligosaccharide, Polysaccharide und dergleichen), Polymere hydrophiler Aminosäuren (bspw., Polylysin, Polyarginin, Polyaspartat und dergleichen), Polyalkanoxide (bspw., Polyethylenoxide, Polypropylenoxide und dergleichen) und Polyvinylpyrrolidon. Das hydrophile Polymer, das den Antikörper der Erfindung modifiziert, kann als eine einzelne Moleküleinheit ein Molekulargewicht von ungefähr 800 bis ungefähr 150.000 Dalton aufweisen. Vorzugsweise weist der organische Rest als eine einzelne Moleküleinheit ein Molekulargewicht von ungefähr 2.000 Dalton oder mehr auf. Beispielsweise sind PEG_5.000 and PEG_20.000 bevorzugte hydrophile Polymere, worin der Index das durchschnittliche Molekulargewicht des Polymers in Dalton angibt. Ebenfalls bevorzugt sind PEG_2.000, PEG_3.400, PEG_10.000, PEG_30.000 und PEG_40.000, die linear oder verzweigt sein können. Verzweigte PEGs (bspw. (PEG_2.000)₂, (PEG_2.000)₄, (PEG_5.000)₂) können beispielsweise wie durch Harr et al., US-P-5,932,462 beschrieben, hergestellt werden.
Die hydrophile polymere Gruppe ist mit einer Lipid- oder Phospholipidgruppe (wie hierin beschrieben, bspw. Formeln I und II) substituiert. Die substituierte hydrophile polymere Gruppe ist vorzugsweise ein lineares oder verzweigtes PEG. Die substituierte hydrophile polymere Gruppe ist noch bevorzugter ein lineares PEG (bspw. PEG-Diamin), das mit einer Lipid- oder Phospholipidgruppe endständig substituiert ist. Hydrophile Polymere, die mit einer Lipid- oder Phospholipidgruppe substituiert sind, können unter Verwendung geeigneter Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann, wie hierin beschrieben (Beispiele XIV und XV), ein modifizierendes Mittel durch Umsetzen von einfach geschütztem PEG-Diamin mit einer aktivierten Fettsäure (bspw., Palmitoylchlorid) hergestellt werden. Das sich ergebende Produkt kann entschützt, eine geeignete aktivierende Gruppe (bspw., Maleimido) kann eingeführt und das sich ergebende modifizierende Mittel kann verwendet werden, um ein modifiziertes Fab' zu erzeugen, das ein mit einer Fettsäuregruppe endständig substituiertes PEG umfasst. Es können eine Vielzahl anderer geeigneter synthetischer Schemata verwendet werden, wobei beispielsweise ein Polymer, das eine Amingruppe umfasst, wie hierin beschrieben, an ein Carboxylat der Fettsäure oder des Fettsäureesters gekoppelt wird, und ein aktiviertes Carboxylat (bspw., aktiviert mit N,N'-Carbonyldiimidazol) an einer Fettsäure oder einem Fettsäureester kann an eine Hydroxylgruppe eines Polymers gekoppelt werden.
Fettsäuren und Fettsäureester, die zum Modifizieren von Antikörpern der Erfindung geeignet sind, können gesättigt oder können eine oder mehrere ungesättigte Einheiten umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Fettsäuren und Fettsäureester von ungefähr sechs bis ungefähr vierzig Kohlenstoffatome oder ungefähr acht bis ungefähr vierzig Kohlenstoffatome. Zum Modifizieren von Antikörpern der Erfindung geeignete Fettsäuren umfassen beispielsweise n-Dodecanoat (C₁₂, Laurat), n-Tetradecanoat (C₁₄, Myristat), n-Hexadecanoat (C₁₆, Palmitat), n-Octadecanoat (C₁₈, Stearat), n-Eicosanoat (C₂₀, Arachidat), n-Docosanoat (C₂₂, Behenat), n-Triacontanoat (C₃₀), n-Tetracontanoat (C₄₀), cis-Δ⁹-Octadecanoat (C₁₈, Oleat), alle cis-Δ^5,8,11,14 Eicosatetraenoat (C₂₀, Arachidonat), Octanedioic acid (Korksäure), Tetradecanedioic acid (Tetradecandisäure), Octadecanedioic acid (Octadecandisäure), Docosanedioic acid (Docosandisäure) und dergleichen. Geeignete Fettsäureester umfassen Monoester von Dicarbonsäuren, die eine lineare oder verzweigte Niederalkylgruppe umfassen. Die Niederalkylgruppe kann von einem bis zwölf, vorzugsweise einem bis sechs Kohlenstoffatome umfassen. Geeignete Fettsäureester zum Modifizieren von Antikörpern der Erfindung umfassen beispielsweise Methyloctadecanoat, Ethyloctadecanoat, Propyloctadecanoat, Butyldodecanoat, sec-Butyl-dodecanoat, tert-Butyldocecanoat, Neopentyl-Tetradecanoat, Hexyl-Tetradecanoat, Methyl cis-Δ⁹-Octadecanoat und dergleichen.
Die nachfolgend beschriebene Modifizierung von Antikörpern wird vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer modifizierender Mittel ausgeführt. Der wir hier verwendete Begriff "modifizierendes Mittel" bezieht sich auf ein Derivat eines hydrophilen Polymers, eines Lipids oder Phospholipids, das eine aktivierende Gruppe umfasst. Eine "aktivierende Gruppe" ist ein chemischer Rest oder eine funktionelle Gruppe, die unter geeigneten Bedingungen mit einer zweiten chemischen Gruppe reagieren kann, wodurch eine kovalente Bindung zwischen dem modifizierenden Mittel und der zweiten chemischen Gruppe ausgebildet wird. Beispielsweise umfassen Amin-reaktive aktivierende Gruppen elektrophile Gruppen, wie beispielsweise Tosylat, Mesylat, Halogen (Chlor, Brom, Flur, Jod), N-Hydroxysuccinimidylester (NHS), Acylhalogene und dergleichen. Aktivierende Gruppen, die mit Thiolen reagieren können, umfassen beispielsweise Maleimid, Jodacetyl, Acrylolyl, Pyridyldisulfide, 5-Thiol-2-nitrobenzoesäurethiol (TNB-Thiol) und dergleichen. Eine funktionelle Aldehydgruppe kann an Amin- oder Hydrazid enthaltende Moleküle gekoppelt werden u d eine Azidgruppe kann mit einer trivalenten Phosphorgruppe reagieren, um Phosphoramidat- oder Phosphorimidverbindungen zu bilden. Es sind im Stand der Technik (siehe beispielsweise, Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)) geeignete Verfahren zum Einfügen aktivierender Gruppen in Moleküle bekannt. Eine aktivierende Gruppe kann direkt an das hydrophile Polymer, Lipid oder ein Phospholipid oder durch einen Verbindungsrest, beispielsweise eine C₁-C₁₂ Hydrocarbonylgruppe (Kohlenwasserstoffgruppe) gebunden sein. Wie hierin verwendet bezieht sich "Kohlenwasserstoffgruppe" auf eine Kohlenwasserstoffkette, worin ein oder mehrere Kohlenstoffatome durch ein Heteroatom, wie beispielsweise Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel, wahlweise ersetzt ist/sind. Geeignete Verbindungsreste umfassen beispielsweise Tetraethylenglycol, -(CH₂)₃-, -NH-(CH₂)₆-NH-, -(CH₂)₂-NH- und CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-NH-.
Modifizierende Mittel, die einen Verbindungsrest umfassen, können beispielsweise durch Reaktion eines mono-Boc-Alkyldiamins (bspw. mono-Boc-Ethylendiamin, mono-Boc-Diaminhexan) mit einer Fettsäure in der Gegenwart von 1 Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) hergestellt werden, um eine Amidbindung zwischen dem freien Amin und dem Fettsäurecarboxylat zu bilden. Die schützende Boc-Gruppe kann durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) aus dem Produkt entfernt werden, um ein primäres Amin bloßzulegen, das, wie beschrieben, an ein anderes Carboxylat gekoppelt oder mit Maleinsäureanhydrid umgesetzt werden kann, wobei das sich ergebende Produkt zyklisiert ist, um ein aktiviertes Maleimido-Derivat der Fettsäure zu erzeugen. (Siehe beispielsweise, Thompson, et al., WO 92/16221)
Die modifizierten Antikörper der Erfindung können durch Umsetzen eines geeigneten Antikörpers (d.h. Antikörper oder geeignetes Antikörper-Fragment, wie beispielsweise Fab') mit einem modifizierenden Mittel, wie hierin beschrieben, hergestellt werden. In einer Ausführungsform können die organischen Reste in einer nicht ortsspezifischen Weise, durch ein Amin-reaktives modifizierendes Mittel, beispielsweise einen NHS-Ester von PEG, an den Antikörper gebunden werden. In einem spezifischen Beispiel wurde c7E3 Fab durch Reaktion mit NHS-PEG_5.000 in einer nicht ortsspezifischen Weise modifiziert. Dieser Typus einer Modifikation verringert, wie hierin gezeigt, wesentlich die Bindungsaffinität des Fab für GPIIb/IIIa (Beispiel XXII, Tabelle 6, vergleiche c7E3 Fab und c7E3 Fab Zufall (PEG_5.000)). In bevorzugten Ausführungsformen, können somit die Antikörper durch Umsetzen eines geeigneten Antikörpers mit einem oder mehreren modifizierenden Mitteln hergestellt werden, um einen modifizierten Antikörper herzustellen, der einen bis ungefähr sechs organische Reste umfasst, die an speziellen Stellen an dem Antikörper, beispielsweise einem (d.h. einem oder mehreren) Carboxyl-Terminus und/oder dem Seitenketten-Schwefelatom eines (d.h. einem oder mehreren) Cysteinrestes, gebunden sind. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann der modifizierte Antikörper einen oder zwei lineare PEG-Reste von größer als 2.000 Dalton umfassen, die an spezifischen Stellen (bspw., Cysteinrest, der eine Interketten-Disulfidbindung bildet, Carboxyl-Terminus der schweren Kette) an dem Antikörper gebunden sind.
In Ausführungsformen, worin der modifizierte Antikörper einen organischen Rest umfasst, der an einen Cysteinrest gebunden ist, wird bevorzugt, dass der organische Rest an einen Cysteinrest in der Gelenkregion der schweren Kette gebunden ist, die in dem genau/richtig gefalteten (d.h. nativen) Antikörper eine Interketten-Disulfidbindung ausbildet. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Interketten-Disulfidbindung" auf eine Disulfidbindung, die zwei schwere Ketten in einem richtig gefalteten (d.h. nativen) Antikörper verbindet.
Modifizierte Antikörper dieses Typs können durch Reduzieren der Interketten-Disulfidbindungen hergestellt werden, wodurch monovalente Antikörper, die eine schwere Kette und eine leichte Kette umfassen, erzeugt werden. Geeignete reduzierende Mittel umfassen beispielsweise 2-Mercaptoethanol (2-ME), Dithiothreitol (DTT), 2-Mercaptoethylamin (2-MEA) und Cystein. Derartige monovalente Antikörper können durch geeignete Verfahren (bspw. Säulenchromatographie) isoliert und gereinigt werden und der gereinigte Antikörper kann mit einem Thiol-reaktiven modifizierenden Mittel, beispielsweise O-(2-Maleimidethyl)-O'-methylpolyethylenglycol 5000, umgesetzt werden, um den erfindungs gemäßen Antikörper zu erzeugen. In einem Beispiel umfasst der modifizierte Antikörper einen (bspw. einen oder mehrere) PEG-Rest, der an das Seitenkettenschwefelatom von mindestens einem der Cysteinreste gebunden ist, die in der Gelenkregion der schweren Kette, die eine Interketten-Disulfidbindung bildet, beinhaltet sind.
In einem anderen Beispiel ist der modifizierte Antikörper ein Fab', das einen organischen Rest umfasst, der an das Seitenkettenschwefelatom von mindestens einem der Cysteinreste der Gelenkregion gebunden ist, die eine Interketten-Disulfidbindung bildet.
In einem anderen Beispiel ist der modifizierte Antikörper ein Fab, das einen organischen Rest umfasst, der an den Carboxy-terminus der schweren Kette kovalent gebunden ist. Modifizierte Antikörper dieses Typs können durch Umsetzen eines durch Papainspaltung eines IgG erzeugten Fab, beispielsweise mit einem PEG hergestellt werden, das eine Amin aktivierende Gruppe in der Gegenwart von EDC umfasst. Das Amin aktivierte PEG kann mit ALL Carboxylgruppen an dem Antikörper umgesetzt werden, was jedoch eine Reinigung des Antikörpers erschwert, der ein PEG umfasst, das spezifisch an den Carboxyl-Terminus der schweren Kette gebunden ist.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des modifizierten Antikörpers besteht darin durch reverse Proteolyse eine einzigartige aktivierende Gruppe an dem Carboxyl-Terminus der schweren Kette einzufügen. Der Begriff "reverse Proteolyse" kommt aus dem Stand der Technik und bezieht sich auf die Tatsache, dass unter bestimmten Bedingungen bestimmte Proteasen die Bildung von Peptid (Amid)-bindungen katalysieren können. Beispielsweise kann ein gereinigtes Fab, das durch die Aktivität einer Protease erzeugt wurde, mit der Protease und Carbohydrazid unter für eine reverse Proteolyse geeigneten Bedingungen (bspw. 250-facher molarer Überschuss des Carbohydrazids relativ zu dem Fab) vermischt werden, um ein Fab herzustellen, das an dem Carboxyl-Terminus der schweren Kette eine einzigartige Hydrazidfunktion aufweist.
Das Hydrazid beinhaltende/umfassende Fab kann durch Umsetzung mit einem geeigneten modifizierenden Mittel modifiziert werden. Ein Fab kann beispielsweise mit einem modifizierenden Mittel umgesetzt werden, das eine funktionelle Aldehydgruppe umfasst, um einen modifizierten Antikörper herzustellen, der einen organischen Rest umfasst, der durch eine Hydrazon-Verbindung an dem Carboxyl-Terminus der schweren Kette spezifisch angebracht ist. Das Hydrazon kann durch Umsetzung mit einem geeigneten Reduktionsmittel (bspw. Natriumcyanoborohydrid) weiterhin stabilisiert werden.
Um durch reverse Proteolyse eine Hydrazidfunktion einzufügen, können verschiedene Enzyme verwendet werden, die, um ein gewünschtes Fragment zu erzeugen einen Antikörper spalten können. Die Bedingungen für eine reverse Proteolyse sind dem Fachmann bekannt und umfassen einen großen (bspw. 250-fachen) molaren Überschuss von Carbohydrazid und eine verlängerte Reaktionszeit. Zusätzlich kann die Reaktion der reversen Proteolyse vorzugsweise bei einem pH-Wert ablaufen, der von dem optimalen pH-Wert für eine Proteolyse (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3 (1992), 147–153; Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5 (1994), 411–417, Kumaran et al., Protein Sci. 6 (10) (1997), 2233–2241; Itoh et al., Bioorg. Chem., 24 (19) (1996), 59–68; Capellas et al., Biotechnol. Bioeng. 56(4) 1997), 456–463) verschieden ist. Der optimale pH-Wert für eine reverse Proteolyse kann unter Verwendung von Standardverfahren empirisch bestimmt werden. Ein bevorzugtes Enzym für die Modifikation eines Carboxyl-Terminus ist Achromopeptidase.
Der Carboxyl-Terminus einer leichten Kette kann durch die Einfügung einer Hydrazidgruppe durch reverse Proteolyse modifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine Protease ausgewählt, die die leichte Kette spalten kann ohne die Antigen-bindenden Eigenschaften des Antikörpers wesentlich zu beeinflussen, wobei die leichte Kette wie beschrieben modifiziert wird.
In einer anderen Ausführungsform können eine Achromopeptidase oder andere proteolytische Spaltstellen in die leichte Kette eines klonierten Antikörpers durch Anwenden von DNS-Rekombinationsverfahren eingefügt werden. Dieser Antikörpertyp kann durch Achromopeptidase oder ein geeignetes Enzym gespalten werden, um ein Fab zu erzeugen, in das durch reverse Proteolyse eine Hydrazidgruppe an dem Carboxyl-Terminus von sowohl der schweren Kette als auch der leichten Kette eingefügt werden kann.
In zusätzlichen Ausführungsformen können DNS-Rekombinationsverfahren verwendet werden, um Achromopeptidase- oder andere Spaltstellen in/aus die/der schwere/n Kette eines klonierten Antikörpers (bspw. durch Mutagenese) einzufügen oder zu entfernen. Die natürlich vorkommende Achromopeptidasespaltstelle kann beispielsweise entfernt werden, wobei an einer unterschiedlichen Position eine neue Spaltstelle eingefügt wird. Somit können Achromopeptidase und andere geeignete Enzyme verwendet werden, um eine Anzahl modifizierter Antikörper der Erfindung herzustellen. Beispielsweise können Fv, Fab, F(ab')₂ oder Fab' Fragmente hergestellt werden, die einen organischen Rest umfassen, der an dem Carboxyl-Terminus der schweren Kette und/oder dem Carboxyl-Terminus der leichten Kette gebunden vorliegt. Derartige Fragmente können weiterhin einen oder mehrere zusätzliche organische Reste umfassen, die an die Seitenkettenschwefelatome von Cysteinresten gebunden sind.
In einer besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', das zwei PEG_5.000-Gruppen umfasst, worin jede PEG_5.000-Gruppe an dem Seitenketteschwefelatom eines Cysteinrestes gebunden vorliegt, der ein Interketten-Disulfidbindung ausbildet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', das zwei PEG_20.000-Gruppen umfasst, worin jede PEG_20.000-Gruppe an das Seitenketteschwefelatom eines Cysteinrestes gebunden vorliegt, das eine Interketten-Disulfidbindung bildet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', das eine PEG_5.000-Gruppe umfasst, die an dem Carboxyl-Terminus der schwere Kette gebunden vorliegt. In einem bevorzugten Aspekt wird das Fab durch Achromopeptidasespaltung erzeugt.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist er modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab, der eine PEG_20.000-Gruppe umfasst, die an dem Carboxyl-Terminus der schweren Kette gebunden vorliegt. In einem bevorzugten Aspekt wird das Fab durch Achromopeptidasespaltung erzeugt.
In einer anderen besonderen Ausführungsform liegt der modifizierte Antikörper als c7E3 Fab' vor, der eine PEG_5.000-Gruppe und eine C₂₂ Fettsäuregruppe umfasst, die jeweils unabhängig an das Seitenkettenschwefelatom eines Cysteinrestes gebunden vorliegen, der eine Interketten-Disulfidbindung bildet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab, der eine PEG_5.000-GruPPe umfasst, die an den Carboxyl-Terminus der schweren Kette gebunden vorliegt, wobei das PEG_5.000 einen C₂₂ Fettsäuresubstituenten trägt.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', der eine (d.h. eine oder mehrere) PEG_2.000-GruPPe umfasst, die an das Seitenketteschwefelatom eines Cysteinrestes gebunden vorliegt, die eine Interketten-Disulfidbindung in der Gelenkregion ausbildet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', der eine (d.h. eine oder mehrere) PEG_10.000-Gruppe umfasst, die an das Seitenkettenschwefelatom eines Cysteinrestes gebunden vorliegt, das eine Interketten-Disulfidbindung in der Gelenkregion ausbildet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', der eine (d.h. eine oder mehrere) (PEG_2.000)₂-Gruppe umfasst, die an das Seitenketteschwefelatom gebunden vorliegt, das eine Interketten-Disulfidbindung in der Gelenkregion ausbildet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', der eine (d.h. eine oder mehrere) (PEG_2.000)₄-Gruppe umfasst, die an das Seitenketteschwefelatom gebunden vorliegt, das eine Interketten-Disulfidbindung in der Gelenkregion ausbildet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', der eine (d.h. eine oder mehrere) (PEG_5.000)₂-Gruppe umfasst, die an das Seitenkette schwefelatom gebunden vorliegt, das eine Interketten-Disulfidbindung in der Gelenkregion ausbildet.
In einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab', der eine (d.h. eine oder mehrere) endständig substituierte PEG_3.400-Gruppe umfasst, die an das Seitenkettenschwefelatom gebunden vorliegt, das eine Interketten-Disulfidbindung in der Gelenkregion ausbildet, wobei der endständige Substituent als eine Palmitoylgruppe vorliegt.
In noch einer anderen besonderen Ausführungsform ist der modifizierte Antikörper ein c7E3 Fab, der eine C₂₂ Fettsäuregruppe umfasst, die an dem Carboxyl-Terminus der schweren Kette gebunden vorliegt.
In einer zusätzlichen Ausführungsform wird ein Antikörper modifiziert, der einen gentechnisch hergestellten Cysteinrest (bspw. ein Cysteinrest, der durch DNS-Rekombinationsverfahren eingefügt wurde) umfasst. Antikörper dieses Typs, einschließlich beispielsweise Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ Fragmente, können einfach durch solche oder gewöhnliche fachliche Geschicklichkeit herstellt werden. Der Antikörper, der einen gentechnisch hergestellten Cysteinrest umfasst, kann mit einem Thiol reaktiven modifizierenden Mittel umgesetzt werden, um den modifizierten Antikörper der Erfindung herzustellen. Der Antikörper, der einen gentechnisch hergestellten Cysteinrest umfasst, kann weiterhin eine Achromopeptidase- oder andere Spaltstelle umfassen und an dieser Stelle, wie beschrieben, modifiziert werden.
Die, wie hierin beschriebene, ortsspezifische Modifikation (bspw. Carboxyl-terminale PEGylierung) von Antikörpern stellt einige Vorteile, einschließlich einer erhöhten Wirkungsdauer bereit. Weiterhin können die Antikörper, die ortsspezifische Modifikationen umfassen, unerwarteter Weise weniger immunogen sein als die entsprechenden nicht modifizierten Antikörper. Eine ortsspezifische Modifikation von Fab-Fragmenten mit einen oder zwei organischen Resten (bspw. PEG₅₀₀₀) geringen Molekulargewichts erzeugen beispielsweise ein modifiziertes Fab mit einer erhöhten Serum-Halbwertszeit und signifikant verminderter Immunogenität, das an GPIIb/IIIa oder α_vβ₃ mit einer Affinität bindet, die im Wesentlichen der des nicht modifizierten Antikörpers (siehe Beispiele IX, XI und XII) gleicht. Der unerwartete Vorteil einer bemerkenswerten Abnahme bei der Immunogenität als Ergebnis einer begrenzten Modifikation liegt wahrscheinlich in der ortsspezifischen Beschaffenheit der hierin beschriebenen Modifikation.
Die modifizierten Antikörper der Erfindung können durch Anwenden von dem Fachmann bekannten Verfahren gereinigt werden. Geeignete Aufreinigungsverfahren umfassen beispielsweise Säulenchromatographie (bspw. Ionenaustausch, Gel-Filtration, hydrophobe Wechselwirkung, Affinität), präparative native Elektrophorese, Präzipitation und Ultrafiltration. Die modifizierten Antikörper werden, wie hierin beschrieben, vorzugsweise durch hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie gereinigt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "rein" oder "gereinigt" auf eine Präparation, bei der der modifizierte Antikörper der Erfindung ungefähr 75% der in der Präparation befindlichen Makromoleküle beträgt. Vorzugsweise beträgt der modifizierte Antikörper ungefähr 90% oder 95% der in der Präparation befindlichen Makromoleküle. Am meisten bevorzugt ist, dass der modifizierte Antikörper ungefähr 99% oder im Wesentlichen alle in der Präparation befindlichen Makromoleküle umfasst.
Der modifizierte Antikörper der Erfindung kann zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung (bspw. Verringerung der Schwere von oder Verhinderung) einer Krankheit oder Störung eingesetzt werden, bei der Zellen, die GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder Mac-1 (bspw. Thrombozyten, Endothelzellen, Leukozyten) exprimieren, eine pathophysiologische Rolle in einem Menschen spielen. Derartige Störungen umfassen beispielsweise Thromboembolie-Störungen, wie beispielsweise Kreislauferkrankung (bspw. Atherosklerose, Koronararterienerkrankung, Angina, Myokardinfarkt), tiefe Beinvenenthrombose, Schlaganfall, Ischämie, Tumorvaskularisierung (bspw. α_vβ₃ vermittelte Angiogenese), Tumormetastasierung (bspw. Thrombozyten vermittelte Metastasierung). Zellen, die GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder Mac-1 (bspw. Thrombozyten, Endothelzellen, Leukozyten) exprimieren, spielen ebenfalls bei entzündlichen Erkrankungen und Zuständen eine pathophysiologische Rolle, die beispielsweise Autoimmunerkrankungen umfassen, posttraumatische Lungeninsuffizienz, Allo-Transplantatabstoßung, Sepsis, Reperfusionsverletzung (bspw. Transplantation assoziierte Reperfusionsverletzung, Verletzung durch Reperfusion bei Schlaganfall- oder Myokardinfarktpatienten), Myokardinfarkt, Angioplastie und Operation bzw. Chirurgie.
Die modifizierten Antikörper der Erfindung können ebenfalls bei der Herstellung eines Medikaments zur vorteilhaften Hemmung einer Thrombose, Stenose, Restenose und/oder eines Prozesses verwendet werden, der durch die Bindung eines Liganden an GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder Mac-1 (bspw. Adhäsion, Aggregation, Sekretion (bspw. Degranulation), Proliferation, Bildung von Sauerstoffradikalen) in einem Menschen vermittelt wird. Der modifizierte Antikörper findet beispielsweise in einer Situation Verwendung, in der eine Thrombusbildung oder erneute Bildung oder Stenose und/oder Restenose, beispielsweise während oder folgend auf eine Gefäß-Eingriffsmaßnahme, beispielsweise Angiographie, Angioplastie (bspw. ausgeführt durch Ballon, Atherektomie, Laser-Angioplastie oder andere geeignete Verfahren (mit oder ohne), Bypass-Operation der Koronararterien, Stentsetzung (bspw. Koronarstent), und/oder andere Gefäß-Eingriffsmaßnahmen (bspw. Gefäßchirurgie, Gefäßtransplantat, Auslieferung eines peripheren Stents, Einfügen eines prothetischen Ventils oder Gefäßes (bspw. bei autologer, nicht-autologer oder synthetischer Gefäßtransplantation)). Insbesondere, kann das Verfahren verwendet werden, um eine Thrombose, während oder folgend auf eine Koronararterieneingriffsmaßnahme, wie beispielsweise einer perkutanen transluminalen Koronarangioplastie (PTCA), vorteilhaft zu hemmen.
Der modifizierte Antikörper der Erfindung kann bei der Herstellung eines Medikaments für einen Menschen verwendet werden, um die Schwere einer Erkrankung und/oder Störung zu verhindern oder verringern, bei der Thrombozyten eine pathophysiologische Rolle spielen, oder um eine Thrombose, Stenose, Restenose und/oder einen Prozesse zu hemmen (vermindern oder verhindern), der durch die Bindung eines Liganden an GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder Mac-1 vermittelt wird. Beispielsweise kann der modifizierte Antikörper einem Menschen vor, während und/oder nach einer Gefäßeingriffsmaßnahme (bspw. Angioplastie) verabreicht werden, um einen abrupten Verschluss des Gefäßes (erneuter Verschluss) zu verhindern und um eine akute Ischämie zu verhindern oder zu vermindern.
Wie hierin verwendet, stellt der Begriff "wirksame Menge" eine Menge dar, die ausreichend ist, um eine wünschenswerte therapeutische Wirkung (bspw. eine Thrombusbildung zu hemmen, einen erneuten Gefäßverschluss zu verhindern, eine Stenose und/oder Restenose zu hemmen, eine Entzündung zu hemmen, eine α_vβ₃ vermittelte Angiogenese zu hemmen) zu erzielen.
Der modifizierte Antikörper der Erfindung kann in einem Verfahren eines Hemmens einer Thrombose in einem Menschen verwendet werden, umfassend, Verabreichen einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung an den Menschen.
Alternativ kann der modifizierte Antikörper der Erfindung in einem Verfahren eines Hemmens einer Stenose und/oder Restenose folgend auf eine Gefäßeingriffsmaßnahme (bspw. Koronararterieneingriffsmaßnahme wie beispielsweise PTCA) in einem Menschen verwendet werden, umfassend, Verabreichen einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung an den Menschen.
Alternativ kann der modifizierte Antikörper der Erfindung in einem Verfahren eines Verringerns oder Verhinderns einer Ischämie in einem Menschen verwendet werden, umfassend, Verabreichen einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung an den Menschen.
Alternativ kann der modifizierte Antikörper der Erfindung in einem Verfahren eines Hemmens des Wachstums und/oder Metastasierung eines Tumors in einem Menschen verwendet werden, umfassend, Verabreichen einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung an den Menschen.
Alternativ kann der modifizierte Antikörper der Erfindung in einem Verfahren eines Hemmens einer α_vβ₃ vermittelten Angiogenese in einem Menschen verwendet werden, umfassend, Verabreichen einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung an den Menschen.
Alternativ kann der modifizierte Antikörper der Erfindung in einem Verfahren eines Hemmens eines Prozesses verwendet werden, der durch die Bindung eines Liganden an GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder Mac-1 in einem Menschen vermittelt wird, umfassend, Verabreichen einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung an den Menschen.
Es können ein oder mehrere modifizierte Antikörper der Erfindung alleine oder in Kombination mit einer wirksamen Menge eines oder mehrerer zusätzlicher aktiver Mittel verwendet werden, beispielsweise eines fibrinolytischen Mittels (bspw. Retavase), eines thrombolytischen Mittels, wie beispielsweise eines Plasminogenaktivators (bspw. Gewebeplasminogenaktivator, Urokinase, Streptokinase, rekombinanter Plasminogenaktivator), Anti-Koagulierungsmittel (bspw. Heparin, Hirulog, Hirudin, Aspirin) oder eine Coumarin-Anti-Koagulierungsmittel (bspw. Warfarin, Ethyledindicoumarol). Der modifizierte Antikörper der Erfindung kann ebenfalls mit einem β-adrenergen Blocker bzw. Adrenolytikum (bspw. Alprenolol, Acebutolol, Propanolol) verabreicht werden, einem Calcium-Kanalblocker (bspw. Nifedipin, Diltiazem, Cinnarizin, Bencyclan) oder einem Vasodilatator (bspw. Nitroglycerin, Amotriphen, Erythritol, Prenylamin). Der modifizierte Antikörper der Erfindung kann ebenfalls in Kombination mit einem Mittel verabreicht werden, das die Bildung von Stickoxid (siehe beispielsweise, Singh et al., US-P-5,811,432) stimuliert.
Es sind verschiedene Verabreichungsrouten möglich. Der modifizierte Antikörper der Erfindung kann beispielsweise in der gleichen Weise wie für andere therapeutische Antikörper (Faanes et al., US-P-5,695,760; Coller et al., WO 95/12412) hergestellt und verabreicht werden. Eine wirksame Menge eines modifizierten Antikörpers der Erfindung kann parenteral (bspw. intravenös, intraarteriell, intramuskulär, subkutan), verabreicht werden, beispielsweise durch Injektion in ein Blutgefäß, Muskel oder Hohlraum (bspw. Bauchhöhle, Brusthöhle). Der modifizierte Antikörper kann ebenfalls oral, topisch durch Inhalation (bspw. intrabronchial, intranasal, orale Inhalation oder intranasale tropfen) oder rektal verabreicht werden. Vorzugsweise werden die modifizierten Antikörper intravenös verabreicht. Die modifizierten Antikörper können in einer Einzeldosis, Dauerinfusion, oder in mehreren Dosen und/oder Infusionen (bspw. einer Bolusdosis gefolgt durch Dauerinfusion) verabreicht werden.
Eine Formulierung eines zu verabreichenden Antikörpers wird gemäß der Verabreichungsroute ausgewählt (bspw. Lösung, Emulsion, Kapsel). Die modifizierten Antikörper der Erfindung können als neutrale Proteine oder als physiologisch verträgliche Salze verabreicht werden. Der Begriff "Salz" bedeutet, dass die geladenen Gruppen an dem Protein (bspw. protonierte Amine, Kohlenhydrate) mit einem austauschbaren Ion entgegengesetzter Ladung assoziiert sind. Beispielsweise können positiv geladene Aminogruppen (bspw. protonierte Amine) mit einer anorganischen Säure (bspw. Salzsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure und dergleichen) oder organischen Säuren (bspw. Essigsäure, Milchsäure, Zitronensäure und dergleichen) ein saures Hilfssalz bzw. Additionssalz bilden, wobei sie ein Gegenion, wie beispielsweise Cl^–, CH₃SO₃ ^–, Acetat, Lactat, Citrat und dergleichen enthalten. Salze von Carboxylaten können durch Reaktion mit einer geeigneten Base, wie beispielsweise einer Hydroxidbase (bspw. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid) gebildet werden, wobei sie ein Gegenion wie beispielsweise Na⁺, K⁺ und dergleichen enthalten.
Der modifizierte Antikörper kann als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, die einen modifizierten Antikörper und ein/einen pharmazeutisch verträgliches/n Vehikel oder Träger umfasst. Geeignete pharmazeutische Träger können inerte Bestandteile umfassen, die nicht mit dem modifizierten Antikörper wechselwirken. Es können standardisierte pharmazeutische Formulierungsverfahren angewendet werden, wie beispielsweise solche, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA., beschrieben sind. Geeignete pharmazeutische Träger für eine parenterale Verabreichung umfassen beispielsweise steriles Wasser, physiologische Salzlösung, bakteriostatische Salzlösung (Salzlösung, die ungefähr 0,9% mg/ml Benzylalkohol enthält), Phosphat gepufferte Salzlösung, Hank's-Lösung, Ringers-Lactat und dergleichen. Die Antikörperformulierung kann zusätzlich Additive, wie beispielsweise einen Stabilisator (bspw. Polysorbat 80, USP/NP) enthalten. Im Stand der Technik sind Verfahren zum Verkapseln von Zusammensetzungen (wie beispielsweise bei einer Beschichtung harter Gelatine oder Cyclodextran) bekannt (Baker, et al., Controlled Release of Biological Active Agents, John Wiley and Sons, (1986)).
Die an einen Menschen zu verabreichende Menge Antikörper kann von dem Typ und der Schwere der Erkrankung und den Eigenschaften des Menschen, wie beispielsweise einer allgemeinen Gesundheit, Alter, Geschlecht und Körpergewicht und der Toleranz gegenüber Arzneimitteln, abhängig sein. Sie kann ebenfalls von dem Grad, der Schwere und dem Typ einer Erkrankung abhängig sein. Der Fachmann wird geeignete Dosierungen abhängig von diesen und anderen Faktoren bestimmen können. Gewöhnlich liegt eine therapeutisch wirksame Menge des modifizierten Antikörpers in einem Bereich von ungefähr 0,01 mg/kg bis ungefähr 100 mg/kg für einen Bolus und ungefähr 0,001 mg/Min. bis ungefähr 1. mg/Min. für eine Dauerinfusion, obwohl größere oder kleinere Mengen verwendet werden können.
Beispiele
Beispiel I Synthese von c7E3Fab' (PEG_5.000)₂
18 ml von c7E3 F(ab')₂ (6 mg/ml in Phosphat gepufferter Salzlösung, die durch Pepsinverdau von c7E3 IgG hergestellt wurde) wurden mit 1,8 ml Dithiothreitol (16 mg/ml) behandelt, wobei sie für eine Stunde bei Raumtemperatur standen. Es wurden 1,6 g Ammoniumsulfat in der Lösung gelöst, und die Fab'-Lösung wurde auf eine TosoHaas Phenyl-5PW Säule (21,5 mm × 15 cm, 13 μm) aufgebracht, die mit 0,1 M Natriumphosphat pH-Wert 7.5, beinhaltend 0,6 M Ammoniumsulfat, äquilibriert wurde. Das Fab' wurde durch Verminderung der Ammoniumsulfatkonzentration auf 0 über 65 Minuten mit einer Flussrate von 6 ml/Min. eluiert. Fraktionen, die das Fab' beinhalteten wurden gesammelt und in einer gerührten Amicon Zelle zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml konzentriert. Es wurden insgesamt 74 mg des Fab' erhalten. Das Fab' wurde dann mit 2 ml einer wässrigen Lösung von O-(2-Maleimidoethyl)-O'-methylpolyethylenglycol 5000 (66,5 mg/ml; 20 eq. Gesamt) (Shearwater Polymers, Huntsville, Al) behandelt. Nach zwei Stunden wurden 3,2 g Ammoniumsulfat zugegeben und in der Fab'-Lösung gelöst, und die Lösung wurde auf die mit 0,1 M Natriumphosphat pH-Wert 7.5, beinhaltend 0,6 M Ammoniumsulfat äquilibrierte Phenylsäule aufgebracht. Das PEGylierte Produkt wurde in einem 30 bis 80% Gradienten von 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 über 65 Minuten mit einer Flussrate von 6 ml/Min. eluiert. Reine Fraktionen wurden kombiniert, um 45 mg Produkt zu erhalten. Das durchschnittliche Molekulargewicht wurde durch Massenspektrometrie (MALDI-TOF) auf 59665 Dalton bestimmt.
Beispiel II Synthese von c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂
7 ml von c7E3 F(ab')₂ (5,2 mg/ml in Phosphat gepufferter Salzlösung) wurden mit 0,7 ml Dithiothreitol (16 mg/ml) behandelt, wobei sie für eine Stunde bei Raumtemperatur stehen konnten. Es wurden 0,63 g Ammoniumsulfat in der Lösung gelöst und die Fab'-Lösung wurde auf eine TosoHaas Phenyl-5PW Säule (21,5 mm × 15 cm, 13 μm) aufgebracht, die mit 0,1 M Natriumphosphat pH-Wert 7.5, beinhaltend 0,6 M Ammoniumsulfat, äquilibriert wurde. Das fab' wurde durch Verminderung der Ammoniumsulfatkonzentration auf 0 über 65 Minuten mit einer Flussrate von 6 ml/Min. eluiert. Es wurden Fraktionen gesammelt, die das Fab' beinhalteten, und in einer Amicon gerührten Zelle bis zu einer Endkonzentration von 2,2 mg/ml konzentriert. Ingesamt wurden 22 mg des Fab' erhalten. Das Fab' wurde dann mit 2 ml einer wässrigen Lösung von O-(2-Maleimidoethyl)-O'-methylpolyethylenglycol 20000 (57 mg/ml, 13 eq. Gesamt) (Shearwater Polymers, Huntsville, Al) behandelt. Nach zwei Stunden wurden 0,95 g Ammoniumsulfat in der Lösung gelöst und die Lösung wurde auf die mit 0,1 M Natriumphosphat pH-Wert 7.5, beinhaltend 0,6 M Ammoniumsulfat äquilibrierte Phenylsäule, aufgebracht. Das PEGylierte Produkt wurde unter Verwendung eines 50 bis 100% Gradienten von 0,1 M Natriumphosphat pH-Wert 7.5 über 65 Minuten mit einer Flussrate von 6 ml/Min. eluiert. Reine Fraktionen wurden kombiniert um 13 mg Produkt zu erhalten. Das durchschnittliche Molekulargewicht wurde durch Massenspektrometrie (MALDI-TOF) auf 91078 Dalton bestimmt.
Beispiel III Synthese von c7E3 Fab-PEG_5.000
Zu 5 ml von 7E3 Fab (7,3 ml), das durch die Wirkung von Achromopeptidase auf c7E3 IgG hergestellt wurde, wurden 1,0 g Carbohydrazid zugegeben. Der pH-Wert wurde durch die Zugabe von 300 μl Eisessigsäure auf 4.95 eingestellt. Es wurden 10.000 Einheiten Achromopeptidase zugegeben und die sich ergebende Lösung wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde in 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 4.5 dialysiert. Es wurden 0,875 mg mono Methoxypolyethylenglycolaldehyd (PEG_5.000 Aldehyd, MG = 5.000) (Shearwater Polymers, Huntsville, Al) zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 0,3 mg Natriumcyanoborhydrid. Die Reaktion konnte bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Es wurde Ammoniumsulfat zugegeben, um die Endlösung auf 0,6 M Ammoniumsulfat einzustellen. Es wurde eine Tosohaas TSK 5PW Phenylsäule (21,5 mm × 15 cm) mit 100 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7.5, enthaltend 0,6 M Ammoniumsulfat (Puffer A) äquilibriert. Das Reaktionsgemisch wurde auf die Phenylsäule injiziert und mit einem 60 Minuten Lineargradienten von Puffers A bis zu 100 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 (Puffer B) mit einer Flussrate von 6 ml/Min. eluiert. Die bei ungefähr 58 Minuten eluierende Spitze (PEAK) wurde gesammelt, durch Ultrazentrifugation bei 40 psi mit einer Membran, die einen Molekulargewichtsausschluss von 10.000 Dalton aufweist, auf 5 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) dialysiert. Eine kleine Probe wurde auf einer PD-10 Säule entsalzt, die mit Wasser eluiert wurde. Die Massenspektrometrieanalyse ergab ein Cluster von Spitzen (aufgrund der Molekulargewichtsverteilung des PEG_5.000 Aldehyds), die bei 52.846 Dalton mittelten (centered), was dem erwarteten Molekulargewicht des c7E3 Fab nach der Addition von Carbohydrazid und PEG_5.000 Aldehyd entsprach.
Beispiel IV Hemmung einer Thrombozytenaggregation durch c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ und c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂
Herstellung eines Thrombozyten reichen Plasmas (PRP) und Einstellen der Thrombozytenzahl
Alle Untersuchungen wurden unter Verwendung von Thrombozyten ausgeführt, die aus normalen, nicht mit Medikamenten behandelten menschlichen Spendern erhalten wurden. Es wurde von jedem Spender über eine Venenpunktion Blut in einer 60 ml Spritze erhalten, die eine 1/100 Endverdünnung einer 40% Trinatriumcitratlösung beinhaltete. PRP wurde durch Zentrifugation bei 600 g für 4 Minuten bei Raumtemperatur hergestellt. Das PRP wurde vorsichtig entfernt und das Thrombozyten arme Plasma (PPP) wurde durch Zentrifugation des übrigen Bluts bei 2500 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur hergestellt. Das PRP konnte vor dem Zählen bei Raumtemperatur für 20 Minuten ruhen. PRP Thrombozytenzahlen wurden unter Verwendung eines Coulter T-890 bestimmt. Die Thrombozytenzahlen wurden unter Verwendung des PPP auf 200.000–250.000 Thrombozyten pro μl eingestellt.
Thrombozytenaggregation
Thrombozytenaggregationstests wurden unter Verwendung eines PAP-4D Thrombozytenaggregometers ausgeführt. Für jeden Test wurden 450 μl PRP einer Aggregometerküvette zugegeben, die einen Rührstab enthielt. Es wurden serielle Verdünnungen von c7E3 Fab (ReoPro^®, Centocor, Inc., Malvern, PA), c7E3, c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ und c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ beginnend bei 20 μg/ml (Endkonzentration) oder Salzlösung (50 μl) zu jeder Küvette zugegeben und bei 37°C für 10 Minuten vor den Start des Laufs inkubiert. Die Küvetten wurden anschließend zu den Aggregometerkanälen überführt und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 1200 Upm eingestellt. Es wurden Grundlinienaggregationen für eine halbe bis zu einer Minute vor der Zugabe von 15–20 μm Adenosindiphosphat (ADP) überwacht. Die Aggregationen wurden für 4 Minuten nach der Zugabe des Agonisten überwacht, eine Kontrollprobe, die lediglich mit einer Salzlösung behandelt wurde, wurde in jeden Lauf einbezogen, um eine durch den Agonisten induzierte maximale Thrombozytenaggregation zu bestimmen.
Hemmung der Aggregation
Die Hemmung einer Aggregation wird ausgedrückt als eine prozentuale Angabe einer maximalen Aggregation von durch einen Agonisten stimulierte Thrombozyten in der Abwesenheit von c7E3 Fab, c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ oder c7E3 Fab'(PEG20.000)₂. Das Ausmaß einer Aggregationshemmung für jede Antikörperkonzentration wurde, wie folgt berechnet: % Hemmung = (1 – (% Lichttransmission Antikörper /% Lichttransmission Salzlösungskontrolle)) × 100
Die c7E3 Fab, c7E3·Fab'(PEG_5.000)₂ und c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ Endkonzentrationen wurden mathematisch zu molaren Konzentrationen umgerechnet und gegen die 5 Hemmung einer Aggregation graphisch aufgetragen. Die c7E3 Fab, c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ und c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ Proben zeigten eine ähnliche Fähigkeit die ADP vermittelte Thrombozytenaggregation innerhalb einer zweifach molaren IC50 Konzentration zu hemmen.
Die 1 und 2 zeigen, dass die c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ und c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ in deren Fähigkeit die Thrombozytenaggregation zu hemmen ähnlich zu c7E3 Fab sind, und dass die chemischen Modifikationen, um die Halbwertszeit zu erhöhen, die Aktivität nicht beeinflussen.
Beispiel V Kompetitionsbindung von c7E3 Fab'-(PEG_20.000)₂ mit ¹²⁵I-c7E3 Fab an gereinigten Integrinen
Gereinigtes α_vβ₃ (Smith et al., J. Biol. Chem. 263 (35) (1988), 18726–18731) oder GPIIb/IIIa (Pytela et al., Science 231 (4745) (1986), 1559–1562) wurde in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), enthaltend 2 mM Calciumchlorid (TBS/Ca), zu einer Konzentration von 0,5 μg/ml (α_vβ₃) oder 1,5 μg/ml (GPIIb/IIIa) verdünnt. Es wurden 96-Loch Polystyren Immulon Removawell-Platten (Dynex Technologies, Chantilly, VA) mit α_vβ₃ oder GPIIb/IIIa beschichtet, indem 50 μl der geeigneten Proteinlösung in jedes Loch aliquotiert und die Platte bei Raumtemperatur für 2,5 Stunden inkubiert wurde. Die Platten wurden gewaschen und mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TBS/Ca für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. c7E3 Fab (Reopro^®, Centocor, Inc., Malvern, PA) wurde unter Verwendung von Iodobeads^® (Pierce Chemicals, Rockford, IL) auf ungefähr 2 μCi/μg iodiert. Es wurden Verdünnungsreihen unmarkierten c7E3 Fab'-(PEG_20.000)₂ und unmarkierten c7E3 Fab in TBS/BSA/Ca bei 2X Endkonzentration hergestellt. Die Verdünnungen von c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ oder c7E3 Fab (beginnend bei 20 μg/ml Endkonzentration) wurden 1:1 mit 2x ¹²⁵I-c7E3 Fab (1 μg/ml Endkonzentration) vermischt und zu den Platten gegeben. Die Platten wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, die Löcher wurden in Röhrchen aufgeteilt und die gebundene Radioaktivität wurde in einem Gammazählgerät gezählt/erfasst. Die Daten wurden als Prozent von in Abwesenheit von c7E3 Fab'-(PEG_20.000)z oder c7E3 Fab maximal gebundenem ¹²⁵I-c7E3 Fab dargestellt, und eine nichtlineare Regressionsanalyse wurde unter Verwendung von GraphPad Prism ausgeführt.
3 und 4 zeigen die Daten, die für sowohl c7E3 Fab als auch c7E3 Fab'-(PEG_20.000)₂ mit GPIIb/IIIa beziehungsweise α_vβ₃ erhalten wurden, und zeigen an, dass die zum Erzeugen von c7E3 Fab'-(PEG_20.000)₂ verwendeten Derivatisierungsverfahren keine signifikante Wirkung auf dessen Bindung aufweisen.
Beispiel VI Kompetitionsbindung von c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ mit ¹²⁵I-c7E3 Fab an gereinigten Integrinen
Gereinigtes α_vβ₃ (Smith et al., J. Biol. Chem. 263 (35) (1988), 18726–18731) oder GPIIb/IIIa (Pytela et al., Science 231 (4745) (1986), 1559–1562) wurde in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), enthaltend 2 mM Calciumchlorid (TBS/Ca), zu einer Konzentration von 0,5 μg/ml (α_vβ₃) oder 1,5 μg/ml (GPIIb/IIIa) verdünnt. Es wurden 96-Loch Polystyren Immulon Removawell-Platten (Dynex Technologies, Chantilly, VA) mit α_vβ₃ oder GPIIb/IIIa beschichtet, indem 60 μl der geeigneten Proteinlösung in jedes Loch aliquotiert wurde und die Platten bei Raumtemperatur über Nacht bei 4°C inkubiert wurden. Die Platten wurden gewaschen und mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TBS/Ca für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Chimäres 7E3 Fab (c7E3 Fab) (Reopro^®, Centocor, Inc., Malvern, PA) wurde unter Verwendung von Iodobeads^® (Pierce Chemicals, Rockford, IL) auf ungefähr 2 μCi/μg iodiert. Es wurden Verdünnungsreihen unmarkierten c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ und unmarkierten c7E3 Fab in TBS/Ca bei 2X Endkonzentration hergestellt. Die Verdünnungen von c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ oder c7E3 Fab (beginnend bei 20 μg/ml Endkonzentration) wurden 1:1 mit 2x ¹²⁵I-c7E3 Fab (1 μg/ml Endkonzentration) vermischt und zu den Platten gegeben. Die Platten wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, die Löcher wurden in Röhrchen aufgeteilt und die gebundene Radioaktivität wurde in einem Gammazählgerät erfasst. Die Daten wurden als Prozent von in Abwesenheit von c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ oder c7E3 Fab maximal gebundenem ¹²⁵I-c7E3 Fab dargestellt, und eine nichtlineare Regressionsanalyse wurde unter Verwendung von GraphPad Prism ausgeführt. 5 und 6 zeigen die Daten, die für sowohl c7E3 Fab als auch c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ mit α_vβ₃ beziehungsweise GPIIb/IIIa erhalten wurden und zeigen an, dass die zum Erzeugen von c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ verwendeten Derivatisierungsverfahren, keine nachteilige Wirkung auf dessen Bindung aufweisen.
Beispiel VII Kompetitionsbindung von c7E3 Fab'-PEG_5.000 mit ¹²⁵I-c7E3 Fab an gereinigten Integrinen
Gereinigtes α_vβ₃ (Smith et al., J. Biol. Chem. 263 (35) (1988), 18726–18731) oder GPIIb/IIIa (Pytela et al., Science 231 (4745) (1986), 1559–1562) wurde in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS), enthaltend 2 mM Calciumchlorid (TBS/Ca), zu 0,5 μg/ml (α_vβ₃) oder 1,5 μg/ml (GPIIb/IIIa) verdünnt. Es wurden 96-Loch Polystyren Immulon Removawell-Platten (Dynex Technologies, Chantilly, VA) mit α_vβ₃ oder GPIIb/IIIa beschichtet, indem 60 μl der geeigneten Proteinlösung in jedes Loch aliquotiert wurde und die Platten bei Raumtemperatur über Nacht bei 4°C inkubiert wurden. Die Platten wurden gewaschen und mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in TBS/Ca für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Chimäres 7E3 Fab (c7E3 Fab, Reopro^®, Centocor, Inc., Malvern, PA) wurde unter Verwendung von Iodobeads^® (Pierce Chemicals, Rockford, IL) auf ungefähr 2 μCi/μg iodiert. Es wurden Verdünnungsreihen unmarkierten c7E3 Fab'-PEG_5.000 und unmarkierten c7E3 Fab in TBS/Ca bei 2X Endkonzentration hergestellt. Die Verdünnungen von c7E3 Fab'-PEG_5.000 oder c7E3 Fab (beginnend bei 20 μg/ml Endkonzentration) wurden 1:1 mit 2x ¹²⁵I-c7E3 Fab (1 μg/ml Endkonzentration) vermischt und zu den Platten gegeben. Die Platten wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, die Löcher wurden in Röhrchen aufgeteilt und die gebundene Radioaktivität wurde in einem Gammazählgerät erfasst. Die Daten wurden als Prozent von in der Abwesenheit von c7E3 Fab'-PEG_5.000 oder c7E3 Fab maximal gebundenem ¹²⁵I-c7E3 Fab dargestellt, und eine nichtlineare Regressionsanalyse wurde unter Verwendung von GraphPad Prism ausgeführt.
7 und 8 zeigen die Daten, die für sowohl c7E3 Fab als auch c7E3 Fab'-PEG_5.000 für GPIIb/IIIa beziehungsweise α_vβ₃ erhalten wurden und zeigen an, dass die zum Erzeugen von c7E3 Fab'-PEG_5.000 verwendeten Derivatisierungsverfahren, keine nachteilige Wirkung auf dessen Bindung aufweisen.
Beispiel VIII GPIIb/IIIa Rezeptorblockierung (Fibrinogen-Kügelchen-Test)
Die GPIIb/III-Komplexe auf aktivierten Thrombozyten sind Rezeptoren für Fibrinogen. Der Mechanismus einer Ligandenbindung ist ein hauptsächlich durch Arg-Gly-Asp (RGD) abhängiger Prozess, wobei die die RGD-Sequenz enthaltenden Peptide eine Thrombozytenaggregation blockieren, wobei sie die Bindung von Fibrinogen hemmen. Es wurde durch Coller et al. beobachtet, dass Thrombozyten Fibrinogen beschichtete Kügelchen über die GPIIb/IIIa-Fibrinogen Wechselwirkung agglutinieren werden. Monoklonale Antikörper, die den GPIIb/IIIa-Rezeptor blockieren, können die Wechselwirkung des Rezeptors und Liganden verhindern, wobei somit die Agglutination der Fibrinogen beschichteten Kügelchen verhindert wird.
Kovalente Kopplung von Fibrinogen an Kügelchen (carboxylierte Polystyren-Mikropartikel)
Fibrinogen (Enzyme Research, South Bend, IN) wurde auf 37°C vorgewärmt und in warmem Wasser rekonstituiert. Partikel wurden durch Zentrifugation bei 13.000–14.000 g für 7 Minuten entfernt. Der Überstand wurde entfernt und dessen Extinktion wurde bei OD₂₈₀, E = 1,5 erfasst. Bis zum Verwendungsbeginn wurde die Fibrinogenlösung wurde bei Raumtemperatur gehalten. Die Kügelchen (blaue carboxylierte Polystyren-Mikropartikel 3 μm Durchmesser, 2,5% Feststoff) wurden wie beschrieben (Coller et al., Circulation 95(4) (1997), 860–867) hergestellt. Kurz, die Kügelchen wurden auf Raumtemperatur gebracht und stark gewirbelt. Die Kügelchen (5 ml) wurden in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 0,1 M Carbonatpuffer, pH-Wert 9.6 angeordnet und für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Pellet wurde einmal mit Carbonatpuffer gewaschen, zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 0,02 M Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 4.5 resuspendiert, stark geschüttelt, und für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde zweimal zusätzlich in Phosphatpuffer gewaschen. Die Aktivierung der Kügelchen wurde durch Resuspendieren des Pellets in 6,25 ml eines Phosphatpuffers und langsames Zugeben von 6,25 ml einer frisch hergestellten Carbodiimidlösung vollbracht. Die Kügelchen/Carbodiimidlösung wurde für 3 Stunden auf einer Schüttelplattform bei Raumtemperatur gemischt und anschließend für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde dreimal in Phosphatpuffer gewaschen, um jegliches nicht umgesetztes Carbodiimid zu entfernen. Sobald die Entfernung nicht umgesetzten Carbodiimids beendet war wurde der Überstand entfernt. Zu diesem Zeitpunkt betrug das Pellet ungefähr 250 μl. Das Pellet wurde in Boratpuffer resuspendiert, um eine 2% Aufschlämmung zu erzeugen. Die 2% Kügelchenaufschlämmung wurde in einem Eisbad gekühlt, wobei zwischenzeitlicher Entfernung gevortext wurde, um eine monodisperse Verteilung zu erreichen. Es wurde das Volumen einer Fibrinogen-Stammlösung berechnet, die benötigt wurde um 0,8 mg Fibrinogen pro ml von der ursprünglichen 2,5% Aufschlämmung zuzugeben. Die aktivierten Kügelchen wurden mit Boratpuffer auf eine Konzentration verdünnt, die eine finale Reaktionsdichte von 1% Feststoffaufschlämmung nach Zugabe von Fibrinogen ergab. Die Kügelchen wurden mit Fibrinogen über Nacht bei sanftem Schütteln bei Raumtemperatur beschichtet. Am nächsten Tag wurde 0,1 ml einer 0,25 M Ethanolaminlösung pro ml einer ursprünglichen 2,5% Kügelchenaufschlämmung zugegeben. Die Lösung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur schonend gemischt, um nicht umgesetzte Stellen auf den Kügelchen zu blockieren. Die Kügelchenlösung wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde für eine Proteinbestimmung sichergestellt. Um zu bestimmen wie gut die Kügelchen beschichtet waren, wurde die ursprünglich zugegebene Fibrinogenmenge von der in dem Überstand vorhandenen Menge abgezogen. Das Kügelchenpellet wurde mit 10 mg/ml BSA in Boratpuffer zu einer 1% Aufschlämmung resuspendiert. Die monodisperse Verteilung wurde erneut bestätigt. Die Kügelchen/BSA-Lösung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln gemischt, um irgendwelche verbliebenen unspezifischen Proteinbindungsstellen zu blockieren und schwach gebundenes Fibrinogen auszuwaschen. Die Kügelchen/BSA-Lösung wurde für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die BSA-Blockierungs- und die Zentrifugationsschritte wurden wiederholt. Das Pellet wurde mit dem Aufbewahrungspuffer (PBS/1% BSA/0,1% Natriumazid/5% Glycerol) zu einer 2,5% Aufschlämmung resuspendiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Kügelchen bei 4°C aufbewahrt oder in einem Fibrinogen-Kügelchen-Test verwendet.
Testaufbau
70 μl Blut (1/100 Natriumcitrat von einem menschlichen Spender, der für 7 Tage keine Medikamente erhalten hatte) und 50 μl Antikörper mit unterschiedlichen Konzentrationen (verdünnt bei Raumtemperatur in 10 mM TRIS/0,1% BSA) wurden vermischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Blut/Antikörper-Gemisch wurde einem Teströhrchen aus Glas 12 × 75 mm zugegeben, das 20 μl Fibrinogen beschichtete Arbeitskügelchen, 105 μl 10 mM HEPES-Puffer und 20 μM Thrombinrezeptor aktivierendes Peptid (Coller et al., Circulation 95(4) (1997), 860–867) enthielt. Das Röhrchen wurde verschlossen und auf einer Schüttelplattform mit der Geschwindigkeit 8 für 4 Minuten angeordnet. Eine Agglutination von Kügelchen erschien als blaue Klumpen mittlerer Größe in dem Blut. Wie vorstehend erwähnt, bedeutet Agglutination, dass die GPIIb/IIIa-Rezeptoren durch die getesteten Antikörper nicht blockiert sind.
Fibrinogen-Kügelchen-Test mit c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ verglichen zu c7E3 Fab
Die Antikörper wurden, gemäß des wie vorstehenden beschriebenen Testaufbaus, in 2-fachen Verdünnungen, beginnend bei 50 μg/ml bis zu 0,5 μg/ml getestet. c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ blockierte bei Konzentrationen von 108–868 nM eine Kügelchenagglutination, während c7E3 Fab (ReoPro^®, Centocor, Inc.„ Malvern, PA) von 131–1050 nM blockierte.
Fibrinogen-Kügelchen-Test mit c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ verglichen zu c7E3 Fab
Die Antikörper wurden, gemäß des wie vorstehenden beschriebenen Testaufbaus, in 2-fachen Verdünnungen (von 50 μg/ml bis zu 0,5 μg/ml) getestet. c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ blockierte GPIIb/IIIa-Rezeptoren von 143–571 nM, während c7E3 Fab (ReoPro^®, Centocor, Inc., Malvern, PA) von 263–1050 nM blockierte.
Beispiel IX Pharmakokinetik von c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ in Mäusen
An Tag 0 wurden die Versuchstiere (weibliche CD-1 Mäuse, die 25–30 g wogen), wie in Tabelle 1 gezeigt, zu einer der vier Behandlungsgruppen zugeordnet.
Tabelle 1
Alle Tiere wurden zu den bezeichneten Zeitpunkten geblutet. Bei allen Gruppen wurden 250 μl Blut für alle Probenzeitpunkte (ausgenommen die letzte Probe) durch retroorbitales Sinusbluten gesammelt und die letzte Probe wurde durch Herzpunktion aufgenommen. Das Blut konnte für 30–60 Minuten bei Raumtemperatur stehen, wurde bei 2500 Upm für 15 Minuten zentrifugiert und das Serum wurde abgetrennt und bei –70°C aufbewahrt bis die pharmakokinetischen Tests ausgeführt wurden.
Antikörpertest in Mausserum
C295A (ein Centocor monoklonaler Anti-7E3-idiotypischer Antikörper der Maus) wurde in PBS auf 5 μg/ml verdünnt und unter Verwendung von 50 μl/Loch auf Platten (sterile 96-Loch ELISA-Platten, Corning Katalog #25805-96) beschichtet, und wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platten wurden anschließend 3-mal mit Waschpuffer (0,9% Natriumchlorid, 0,02% Tween-20) unter Verwendung von ungefähr 200 μl/Loch pro Waschvorgang, gewaschen. Die Platten wurden mit einem Block-Puffer/Probenverdünner (1% BSA in PBS mit 0,1% 2-Chloracetamid) für eine Stunde blockiert, anschließend verschlossen bei 4°C gelagert und vor Gebrauch auf Raumtemperatur gewärmt. Standards wurden aus 50 μg/ml Stammlösungen hergestellt, die aus den eigentlichen Testgegenständen (entweder c7E3 Fab'-NEM₂ oder c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂) hergestellt wurden, wobei der Gegenstand verwendet wird, der direkt dem entspricht der in der Tiertestgruppe (NEM=N-Ethylmaleimid) verwendet wurde. Die Standardkurven reichten von 1000 ng/ml bis zu 0,95 ng/ml (in 1:2 seriellen Verdünnungen). Die Standards wurden in Blockpuffer/Probenverdünner verdünnt. Die Serumproben der Tiere wurden ebenfalls in Blockpuffer/Probenverdünner verdünnt. Fünf 1:2 serielle Verdünnungen jeder Probe wurden hergestellt, wobei die Startverdünnung durch eine auf Dosis und Zeitpunkt basierenden Abschätzung bestimmt wurde. Es wurde ein Plattenleerwert von Blockpuffer/-Probenverdünner zu jeder Platte in Triplikaten mit 50 μl/Loch zugegeben. Es wurden die Standards und Proben auf die Platten in Triplikaten mit 50 μl/Loch aufgetragen und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Platten wurden wie vorstehend erwähnt gewaschen. Der Testgegenstand, der aus den Standards/Proben durch den plattierten C295A monoklonalen Antikörper abgefangen wurde, wurde anschließend durch Zugabe von 50 μl/Loch des in Blockpuffer/Probenverdünner verdünnten biotinylierten C281A monoklonalen Antikörpers (eine Centocor monoklonaler Anti-7E3 idiotypischer Mausantikörper, der nicht mit C295A konkurriert) ermittelt. Die Platten wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und anschließend, wie vorstehend erwähnt, gewaschen. Streptavidin markierte Meettettich-Peroxidase (Amersham, Katalog #RPN.1051) wurde in Blockpuffer/-Probenverdünner verdünnt und den Platten mit 50 μl/Loch zugegeben und die Platten wurden bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Zehn Minuten vor dem Ende des Inkubationsschritts, wurden OPD (o-Phenylendiamin)-tabletten (Sigma, Katalog #P-8412) in OPD-Verdünner (Citrat/Phosphatpuffer mit 0,3% Wasserstoffperoxid und 1,2% 2-Chloracetamid) auf 1 mg/ml aufgelöst. Die Platten wurden dann wie vorstehend gewaschen und das OPD-Substrat wurde mit 200 μl/Loch zugegeben und konnte sich im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten entwickeln. Die Entwicklung wurde durch Zugabe von 4 N H₂SO₄ mit 50 μl/Loch abgestoppt. Die OD₄₉₀ wurde für jede Platte abgelesen und die Proben wurden unter einer Vier-Parameter-Anpassung der Standards ausgewertet, wobei der Plattenleerwert von allen Löchern abgezogen wurde. Die zwei Verdünnungen, die dem Mittelpunkt der Standardkurve am nächsten kamen, wurden für jeden Probenverdünnungssatz gemittelt. Proben, die nicht ausverdünnt waren, wurden, soweit erforderlich unter Verwendung einer höheren oder niedrigeren anfänglichen Verdünnung, wiederholt.
Andere Anti-7E3 idiotypische Antikörper, die für eine Verwendung in dem beschriebenen Test geeignet sind, können durch bekannte Mittel hergestellt werden. Ein geeignetes Wirtstier (bspw. Maus) kann beispielsweise mit 7E3 immunisiert werden, wobei Hybridome erzeugt und durch ein beliebiges geeignetes Verfahren, wie beispielsweise solchen hierin beschrieben, durchmustert werden können.
9 zeigt die Serumspiegel gegen die Zeit des Testgegenstand und stellt die signifikant erhöhte Halbwertszeit des c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ gegenüber dem NEM blockiertem Fab' dar.
Beispiel X Pharmakokinetik von c7E3 Fab'-(PEG_20.000)₂ in Mäusen
An Tag 0 wurden die Versuchstiere (weibliche CD-1 Mäuse, die 25–30 g wogen) einer der zwei Behandlungsgruppen, wie in Tabelle 2 gezeigt, zugeordnet.
Tabelle 2
Alle Versuchstiere wurden zu den bezeichneten Zeitpunkten geblutet. Für alle Gruppen wurden 250 μl Blut für alle Probenzeitpunkte (ausgenommen die letzte Probe) durch den retro-orbitalen Sinus gesammelt und die letzten Proben wurden durch Herzpunktion gewonnen. Das Blut konnte bei Raumtemperatur für 30–40 Minuten stehen, wurde bei 2.500 Upm für 15 Minuten zentrifugiert und das Serum wurde abgetrennt und bei –70°C bis die pharmakokinetischen Tests ausgeführt wurden, gelagert. Ein Test für Serumspiegel von c7E3 Fab'-(PEG_20.000)₂ wurde wie in Beispiel IX ausgeführt.
10 zeigt die erhöhte Fortdauer von c7E3 Fab'-(PEG_20.000)₂ im Serum.
Beispiel XI Pharmakokinetik von c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ in Ratten
Männliche CD1 Ratten, die ungefähr 350 g wogen, wurden zu einem der vier Behandlungen, wie in Tabelle 3 gezeigt, zugeordnet.
Tabelle 3
Die Tiere wurden einzeln gewogen und die Testgegenstanddosierung berechnet.
Intravenöse Dauerkatheter wurden in die laterale Schwanzvene eingefügt und an Ort und Stelle festgeklebt. Die Tiere wurden vor der Vordosis-Blutprobe mit Natriumpentobarbital betäubt und blieben durch den gesamten Verlauf der Blutentnahme betäubt. Die Blutproben wurden gemäß des Schemas der vorstehenden Tabelle durch Herzpunktion unter Verwendung von 3 ml Spritzen gesammelt, die 16 μl einer 40% Natriumcitratlösung enthielten. Die Blutproben wurden von den Spritzen auf 1,5 ml Mikroröhrchen übertragen und bei 10.000 Upm kurz (4–5 Sekunden) in einer Mikrozentrifuge abgeschleudert. Das Thrombozyten reiche Plasma (PRP) wurde von der Oberseite entfernt und der Rest des Blutprobe wurde bei 10.000 Upm für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge abgeschleudert, um Thrombozyten armes Plasma (PPP) zu erhalten. Thrombozytenzahlen der PRP-Proben wurden bestimmt und die Thrombozytenzahlen wurden mit autologem PPP unter Verwendung eines Coulter Counter ZM auf zwischen 200.000 und 300.000 Thrombozyten/μl eingestellt. Das restliche PPP wurde zur Bestimmung der freien Fab oder 7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ Konzentration eingefroren.
Die Thrombozytenaggregation wurde an einem Vier-Kanal Bio/Data PAP4C Aggregometer ausgeführt, wodurch eine Auswertung der Aggregationsantworten 10 Minuten vor der Dosis und 60 Minuten nach der Dosis von PRP-Proben für jedes Tier gleichzeitig ausgeführt werden kann. Für jede Probe wurden 250 μl PRP auf eine silikonisierte Aggregometerküvette übertragen und ohne Rühren bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Die Grundlinienaggregationssignal wurde für 1 Minute überwacht. ADP (10 μM) wurde zu jeder Küvette zugegeben und die Aggregationsantwort wurde für zusätzliche 4 Minuten überwacht. Es wurde die maximale Antwort (% Lichtdurchlässigkeit) für jede PRP-Probe aufgezeichnet. Die prozentuale Hemmung der Aggregation der Nach-Dosis PRP-Proben wurde relativ zu den Vor-Dosis PRP-Proben unter Verwendung der folgenden Gleichung bestimmt: C = (A – B)/A × 100worin

C: = % Hemmung einer Aggregation der Nach-Dosis PRP-Probe
A: = % Lichtdurchlässigkeit der Nach-Dosis PRP-Probe
B: = % Lichtdurchlässigkeit der Nach-Dosis PRP-Probe

Die Serumspiegel von Fab oder 7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ wurden, wie in Beispiel VIII ausgeführt, bestimmt.
11 zeigt, dass die Serumspiegel von 7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ beständiger sind als die entsprechenden Fab, was die verlängerte Halbwertszeit des 7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ schlüssig zeigt.
Dass die verlängerte Beständigkeit von 7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ im Serum in einer erhöhten Aktivitätsdauer widergespiegelt wird, wird durch die ex-vivo Aggregationsdaten in der folgenden Tabelle gezeigt. Eine Aggregation bei 6 Stunden mit c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ ähnelt einer Aggregation bei 60 Minuten mit c7E3 Fab.
Tabelle 4
Beispiel XII Bestimmung der Bindungskinetik von c7E3 Fab, c7E3 Fab', c7E3 F(ab')₂ und deren Analoge
Ein Ziege (Fab')₂ Anti-Human (Fab')₂ (Jackson Labs) wurde unter Verwendung von NHS/EDC (N-Hydroxysuccinimid/N-Ethyl-N'(dimethylaminopropyl)Carbodiimid) kovalent an einen BIAcore CM-5 (Carboxymethyl) Chip immobilisiert. Der Chip wurde mit 40 μl eines 1:1 Gemischs der Kopplungsreagenzien aktiviert, die von BIAcore erhalten wurden und gemäß der Anweisungen des Herstellers mit 10 μl/Min. hergestellt wurden. Eine 20 μg/ml Lösung des (Fab')₂ in 10 mM Natriumacetat, pH-Wert 4.8 wurde mit 10 μl/Min. über den Chip geströmt bis 2,500 RU abgefangen wurden. Unbehandelte aktivierte Carboxylgruppen wurden mit einer 40 ml Injektion von 1 M Ethanolamin bedeckt (capped). Unter Verwendung eines Laufpuffers von 10 mM Tris gepufferter Salzlösung, p-Wert 7.5, enthaltend 2 mM Calciumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid, 0,01 % Tween-100 und 25 μg/ml BSA, wurden c7E3 Fab, c7E3 Fab' oder c7E3 (Fab')₂ über den immobilisierten Anti-Human F(ab')₂ überströmt, um 500–700 RU abzufangen. Es überströmten 250 μl einer Lösung von GPIIb/IIIa oder α_vβ₃ (von 2–10 μg/ml) die Capture-Antikörperfragmente mit 30 μl/Min. gefolgt durch eine ununterbrochene Dissoziationsdauer von 800 Sekunden. Der Chip wurde mit sequentielle 15 μl Injektionen von 100 mM Phosphorsäure, enthaltend 0,05 %CHAPS regeneriert. Die Assoziations- und Dissoziationsphasen wurden unter Verwendung einer BIAauswertung 3.0 (BIAcore) für allgemeinen Assoziations- (k_a) und Dissoziations- (k_d) konstanten analysiert. K_D wurde durch Dividieren von k_a durch k_d berechnet. Die, in Tabelle 5 gezeigte, Bindungskonstante zeigt an, dass die verwendeten Derivatisierungsverfahren, um das c7E3 Fab-PEG_5.000, c7E3 Fab'-(PEG_5.000)₂ und c7E3 Fab'-(PEG_20.000)₂ zu erzeugen, die Bindung nicht nachteilhaft beeinflussen.
Tabelle 5
Beispiel XIII Immunogenität von c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ verglichen zu c7E3 Fab Tiere und Reagenzien
Zwei Gruppen sechs Wochen alter Balb/c Mäuse von Charles River Laboratories (acht Tiere pro Gruppe) wurden durch intraperitoneale (IP) Injektion mit 100 μg c7E3 Fab (ReoPro^®, Centocor, Inc., Malvern, PA) oder c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ verdünnt in physiologischer Salzlösung (Baxter) und emulgiert in einem gleiche Volumen kompletten Freund's Adjuvans immunisiert. Eine nachfolgende IP Injektion mit 100 μg c7E3 Fab (ReoPro^®, Centocor, Inc., Malvern, PA) oder c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ emulgiert in nicht komplettem Freund's Adjuvans wurde 14 Tage später gegeben. Die Mäuse wurden ohne Anti-Gerinnungsmittel an Tag 20 durch retro-orbitale Punktion geblutet. Das Blut konnte bei Raumtemperatur für eine Stunde verklumpen und das Serum wurde gesammelt.
Die Immunogenität von c7E3 Fab oder c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ wurde durch Erfassen der Immunantwort über eine Festphasen Enzym gekoppelten Immuntest (EIA) ausgewertet. c7E3 Fab wurde auf 96-Loch EIA-Platten mit flachem Boden mit 10 μg/ml in 10 mM Carbonatpuffer, pH-Wert 9.6, mit 50 μl/Loch über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach dem Waschen in 0,15 M Salzlösung und 0,02% (v/v) Tween 20, wurden die Löcher mit 200 μl/Loch mit 1% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) für 1 Stunde bei RT blockiert. Die Platten wurden sofort verwendet oder bei –20°C für zukünftige Verwendung eingefroren.
Alle Seren wurden 1:50 in PBS verdünnt und bei 4°C gelagert bis sie getestet wurden. Zweifache Verdünnungen von Immunseren wurden auf die Immunogen beschichteten Platten mit 50 μl/Loch bei Raumtemperatur (RT) für 1 Stunde inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und anschließend mit 50 μl/Loch Fc spezifischem Ziege Anti-Maus IgG, Meerrettich-Peroxidase markiertem Konjugat, das 1:20.000 in 1% BSA verdünnt war, für 1 Stunde bei RT untersucht bzw. getestet. Die Platten wurden erneut gewaschen und 100 μl/Loch der Citrat-Phosphatsubstratlösung [0,1 M Zitronensäure und 0,2 M Natriumphosphat, 0,01% H₂O₂ (Sigma) und 1 mg/ml Phenylendiamindihydrochlorid] wurde für 15 Minuten bei RT zugegeben. Es wurden dann 25 μl/Loch Stopplösung (4 M Schwefelsäure) zugegeben und die optische Dichte wurde bei 490 nm auf einem automatischen Plattenspektrophotometer, Dynatech MR 5000, abgelesen.
12 zeigt das inverse geometrische Mittel der Titer. C7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ zeigt eine signifikant geringere Immunogenität als c7E3 Fab.
Beispiel XIV Synthese von N-Maleimidoacetyl-N'-palmitoyl-PEG_3.400
Schritt 1
Palmitoylchlorid (80,8 mg, 0,2942 mM) wurde in 2 ml Aceton gelöst und tropfenweise zu einer Lösung von N-tert-Butoxycarbonyl-PEG_3.400diamin in 5 ml Pyridin zugegeben (Shearwater Polymers, Inc.)(500 mg, 0,1471 mM) und das sich ergebende Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss drei Stunden gekühlt. Das Pyridin wurde unter vermindertem Druck verdampft und das sich ergebende Öl wurde mit 40 ml Ethylether behandelt, um ein weißes Präzipitat zu erhalten, das durch Filtration entfernt, mit Ether gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet wurde, um 554 mg eines weißen Feststoffs zu erhalten. Das Rohmaterial wurde unter Verwendung einer Kieselgel-Säulenchromatographie (Baker Silica Gel, 40 μm, Flash Chromatographiepackung, Glassäule, 2 × 30 cm) gereinigt, mit Chloroform : Methanol (9:1, v/v) eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, zur Trockenheit verdampft und mit Ethylether pulverisiert: Ein weißes Präzipitat wurde durch Filtration zurückgewonnen, mit Ether gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet, um 266 mg von N-tert-Butoxycarbonyl-N'-palmitoyl-PEG_3.400 (MH⁺ 3770,15 (Cluster)) zu erhalten.
Schritt 2
N-tert-Butoxycarbonyl-N'-palmitoyl-PEG_3.400 (227 mg) wurden mit 25 ml Trifluoressigsäure : Dichlormethan (1:1, v/v) für 15 Minuten bei Raumtemperatur verrührt. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck verdampft und Ethylether (100 ml) wurde zu dem Rest zugegeben. Das sich ergebende weiße Präzipitat wurde durch Filtration zurückgewonnen, mit Ether gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, um 141 mg N-Palmitoyl-PEG_3.400amintriflouracetat zu erhalten.
Schritt 3
N-Palmitoyl-PEG_3.400amintriflouracetat (350 mg, 0,0925 mM) wurde in 3,5 ml Tetrahydrofuran gelöst und Diisopropylethylamin (40 ml) wurde zugegeben, um den pH-Wert auf ungefähr 8.0 (wie durch ein feuchtes Indikatorpapier erfasst) einzustellen. Nach ungefähr 10 Minuten Rühren wurde MaleimidessigsäureN-hydroxysuccinamidester (48 mg, 0,185 mM) (Molecular Biosciences, Lot 11158) zugegeben und das Gemisch wurde für ungefähr zusätzliche vier Stunden gerührt. Die Zugabe von Diethylether (90 ml) führte zu der Präzipitation eines weißen Feststoffs, der isoliert und unter vermindertem Druck getrocknet wurde, um 330 mg von N-Maleimidacetyl-N'-palmitoyl-PEG_3.400 (MH⁺ 3806,89 (Cluster)) zu erhalten.
Beispiel XV Synthese von c7E3 Fab'(Palmitoyl-PEG_3.400)₂
C7E3 F(ab)'2 (43,6 mg in 9 ml PBS) wurden in ein Wasser (37°C gestellt. Es wurden 135 μl 1,0 M L-Cystein (Sigma, St. Louis) in Wasser zugegeben und das Reaktionsgemisch stand für 30 Minuten bei 30°C. Ammoniumsulfat (714 mg) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl SPW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradienten (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 zu 0,1 M Natriumphosphat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu c7E3 Fab' entsprechende Spitze wurde gesammelt. Dazu wurden 28 mg N-Maleimidacetyl-N'-palmitoyl-PEG_3.400 zugegeben und die Reaktion wurde für ungefähr 30 Minuten sanft gerührt, um die betitelte Verbindung (MH⁺ 56.362,4 (Cluster)) zu erhalten.
Beispiel XVI Synthese von 7E3 Fab'(PEG_10.000)₂
C7E3 F(ab)'2 (28,8 mg in 95 ml PBS) wurden in ein Wasserbad (37°C) gestellt. Es wurden 182 μl 1,0 M L-Cystein (Sigma, St. Louis9 in Wasser zugegeben und das Reaktionsgemisch stand für 30 Minuten bei 37°C. Ammoniumsulfat (761 mg) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl SPW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 zu 0,1 M Natriumphosphat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu c7E3Fab' entsprechende Spitze wurde gesammelt. Es wurde Methoxy-PEG3.400-maleimid (Shearwater Polmers, Inc.) (46,5 mg) zu der Fab'-Lösung zugegeben und für 15 Stunden bei Raumtemperatur sanft gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 10 ml konzentriert und auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt, konzentriert und erneut auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (50–70%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt und konzentriert, um 9 mg eines Produkts (MH⁺ 69.832 (Cluster)) zu erhalten.
Beispiel XVII Synthese von c7E3 Fab'(PEG_2.000)₄)₂
C7E3 F(ab)'2 (40,1 mg in 9,5 ml PBS) wurde in ein Wasserbad (37°C) gestellt. Es wurden 163 μl 1,0 M L-Cystein (Sigma, St. Louis) in Wasser zugegeben und das Reaktionsgemisch stand für 30 Minuten bei 37°C. Es wurde Ammoniumsulfat (777 mg) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 zu 0,1 M Natriumphosphat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu c7E3 Fab' entsprechende Spitze wurde gesammelt. Es wurde (PEG_2.000)₄-Maleimid (Shearwater Polymers, Inc.) (50,2 mg) zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur sanft gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 9,8 ml konzentriert und auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt, konzentriert und erneut auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (50–70%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt und konzentriert, um 13,5 mg eines Produkts (MH⁺ 65.942 (Cluster)) zu erhalten.
Beispiel XVIII Synthese von c7E3 Fab'((PEG_2.000)₂)₂
C7E3 F(ab)'2 (54,3 mg in 10 ml PBS) wurde in ein Wasserbad (37°C) gestellt. Es wurden 342 μl 1,0 M L-Cystein (Sigma, St. Louis) in Wasser zugegeben und das Reaktionsgemisch stand für 30 Minuten bei 37°C. Es wurde Ammoniumsulfat (756 mg) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 zu 0,1 M Natriumphosphat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5, mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu c7E3 Fab' entsprechende Spitze wurde gesammelt. Es wurde (PEG_2.000)₂-Maleimid (Shearwater Polymers, Inc.) (39,3 mg) zu der Fab'-Lösung zugegeben und für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur sanft gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 9,8 ml konzentriert und auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt, konzentriert und erneut auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (50–70%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt und konzentriert, um 15,6 mg eines Produkts (MH⁺ 57.313,5 (Cluster)) zu erhalten.
Beispiel XIX Synthese von c7E3 Fab'((PEG_5.000)₂)₂
C7E3 F(ab)'2 (54,3 mg in 10 ml PBS) wurde in ein Wasserbad (37°C) gestellt. Es wurden 342 μl 1,0 M L-Cystein (Sigma, St. Louis) in Wasser zugegeben und das Reaktionsgemisch stand für 30 Minuten bei 37°C. Es wurde Ammoniumsulfat (756 mg) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 zu 0,1 M Natriumphosphat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5, mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu c7E3 Fab' entsprechende Spitze wurde gesammelt. Es wurde (PEG_5.000)₂-Maleimid (Shearwater Polymers, Inc.) (104 mg) zu der Fab'-Lösung zugegeben und für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur sanft gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 9,8 ml konzentriert und auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt, konzentriert und erneut auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (50–70%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt und konzentriert, um 14,2 mg eines Produkts (MH⁺ 71.194 (Cluster)) zu erhalten.
Beispiel XX Synthese von c7E3 Fab'(PEG_2.000)₂
C7E3 F(ab)'2 (40,1 mg in 9,5 ml PBS) wurde in ein Wasserbad (37°C) gestellt. Es wurden 163 μl 1,0 M L-Cystein (Sigma, St. Louis) in Wasser zugegeben und das Reaktionsgemisch stand für 30 Minuten bei 37°C. Es wurde Ammoniumsulfat (777 mg) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 x 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5 zu 0,1 M Natriumphosphat/0,05% EDTA, pH-Wert 6.5, mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu c7E3 Fab' entsprechende Spitze wurde gesammelt. Es wurde PEG_2.000-Maleimid (Shearwater Polymers, Inc.) (20 mg) zu der Fab'-Lösung zugegeben und für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur sanft gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 9,8 ml konzentriert und auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (0–100%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt, konzentriert und erneut auf eine HPLC-Säule (Tosohaas, Phenyl 5PW, 10 μm, 0,75 × 7,5 cm) geladen und mit einem 60 Minuten Lineargradient (50–70%) von 0,1 M Natriumphosphat/0,6 M Ammoniumsulfat, pH-Wert 7.5 zu 0,1 M Natriumphosphat, pH-Wert 7.5 mit einer Flussrate von 6 ml pro Minute eluiert. Die zu der betitelten Verbindung entsprechende Spitze wurde gesammelt und konzentriert, um 10,4 mg eines Produkts (MH⁺ 52,817 (Cluster)) zu erhalten.
Beispiel XXI Hemmung einer Thrombozytenaggregation
Es wurden c7E3, c7E3 Fab'(PEG_2.000)₂, c7E3 Fab'((PEG_2.000)₂)₂, c7E3 Fab'((PEG_2.000)₄)₂ und c7E3 Fab'((PEG_5.000)₂)₂, wie in Beispiel IV beschrieben, auf eine Hemmungsaktivität der Thrombozytenaggregation getestet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind graphisch in 13–15 dargestellt und zeigen weiterhin, dass eine chemische Modifikation, um die Halbwertszeit von c7E3 zu erhöhen, die Aktivität nicht beeinflusst.
Beispiel XXII Bestimmung der Bindungskinetik modifizierter Antikörper
Die Bindungskinetik wurde erfasst und die Geschwindigkeitskonstanten und die Affini täten zum Binden an GPIIb/IIIa wurden, wie in Beispiel XII beschrieben, berechnet. Die in den Tabellen 5 (Beispiel XII) und 6 angezeigten Geschwindigkeitskonstanten und Affinitäten stellen den Mittelwert von mindestens zwei und bis zu ungefähr sieben unabhängigen Bestimmungen dar. Die zum Berechnen der, in Tabelle 5 angezeigten, Geschwindigkeitskonstanten und Affinitäten, verwendeten Daten, wurden mit zusätzlichen Daten in die Berechnung der, in Tabelle 6 angezeigten, Geschwindigkeitskonstanten und Affinitäten aufgenommen. Die in Tabelle 6 angezeigten Geschwindigkeitskonstanten und Affinitäten veranschaulichen weiterhin, dass die ortsspezifische Modifikation von c7E3 ohne die Bindung nachteilhaft zu beeinflussen erreicht werden kann, während eine Zufallsmodifikation die Affinität drastisch verringert.
Tabelle 6 Bindungskonstanten
Beispiel XXIII Pharmakokinetik in Mäusen
Es wurde eine Pharmakokinetik unter Verwendung eines Protokolls in Mäusen ausgeführt, das ähnlich zu dem in Beispielen IX und X beschriebenen war. Mäuse wurde ein intravenöser Bolus des Testgegenstands gegeben, Blut wurde zu bestimmten Zeitpunkten entnommen und die Serumkonzentration des Testgegenstands wurde bestimmt. Sieben unabhängige Untersuchungen unter Verwendung von 3–5 Mäusen wurden durchgeführt. Es wurde für jede Untersuchung ein unterschiedlicher Testgegenstand, wie folgt, verabreicht: Studie 1, c7E3 Fab wurde mit einer Dosis von 20 mg/kg verabreicht; Studie 2, c7E3 Fab(PEG_5.000) wurde mit einer Dosis von 20 mg/kg verabreicht; Studie 3, c7E3 Fab'((PEG_2.000)₂)₂ wurde mit einer Dosis von 0,6 mg/kg verabreicht; Studie 4, c7E3 Fab'PEG_20.000 wurde mit einer Dosis von 0,65 mg/kg verabreicht; Studie 5, c7E3 Fab'((PEG_2.000)₂ wurde mit einer Dosis von 0,56 mg/kg verabreicht; Studie 6, c7E3 Fab'((PEG_5.000)₂)₂ wurde mit einer Dosis von 0,75 mg/kg verabreicht; Studie 7, c7E3 Fab'(PEG_10.000)₂ wurde mit einer Dosis von 0,74 mg/kg verabreicht. Die Ergebnisse jeder Untersuchung sind in Tabelle 7 dargestellt und veranschaulichen, dass c7E3 Fab PEG_5.000, c7E3 Fab'((PEG_2.000)₂)₂, c7E3 Fab'PEG_20.000, c7E3 Fab'PEG((_5.000)₂)₂ und c7E3 Fab'PEG(_10.000)₂ nach intravenöser Verabreichung in dem Serum länger fortdauern als nicht modifiziertes c7E3 Fab. Diese Untersuchungen zeigen ebenfalls, dass c7E3 Fab'(PEG_2.000)₂ ungefähr so lange im Serum verweilt wie nicht modifiziertes c7E3 Fab.
Beispiel XXIV Pharmakodynamik in cynomologus Affen (Marcaca fascicularis)
Es wurden sieben unabhängige Untersuchungen unter Verwendung von 2–4 Cynomologus Affen durchgeführt. Jedes Tier wurde mit einem Gefäßzugangsanschluss (VAPs) ausgerüstet, um Blutproben zu erhalten. Eine ursprüngliche Blutprobe wurde erworben und die Thrombozytenaggregation wurde ab dem Zeitpunkt einer VAP-Anordnung erfasst. Jedem Tier wurde durch intravenöse Injektion ein Einzelbolus des Testgegenstands verabreicht. Für jede Untersuchung wurde, wie folgt, ein unterschiedlicher Testgegenstand verabreicht: Studie 1, c7E3 Fab wurde mit einer Dosis von 0,4 mg/kg verabreicht; Studie 2, c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂ wurde mit einer Dosis von 1,05 mg/kg verabreicht; Studie 3, c7E3 Fab'(PEG_10.000)₂ wurde mit einer Dosis von 0,6 mg/kg verabreicht; Studie 4, c7E3 Fab'(PEG_5.000)₂)₂ wurde mit einer Dosis von 0,6 mg/kg verabreicht; Studie 5, c7E3 Fab'(PEG_20.000)₂ wurde mit einer Dosis von 1,4 mg/kg verabreicht; Studie 6, c7E3 Fab'(PEG_2.000)₂ wurde mit einer Dosis von 0,45 mg/kg verabreicht. Es wurde Blut vor Verabreichung des Testgegenstandes und zu bestimmten Zeitpunkten zur Beurteilung der Thrombozytenfunktion, Hämatologie und Pharmakokinetik gesammelt. Die Thrombozytenaggregation wurde wie in Beispiel IV beschrieben erfasst. Serumspiegel des Testgegenstands wurde wie in Beispiel VIII beschrieben ausgewertet. Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabellen 8a und 8b dargestellt.
Die Untersuchungen ergaben, dass die Thrombozytenaggregation eine Stunde nach Verabreichung von c7E3 Fab zu 96% gehemmt war, wobei jedoch die Hemmung danach rasch abfiel. Die in dem Serum erfasste Menge von c7E3 fiel ebenfalls nach einer Stunde rasch ab, was der Hemmung der Thrombozytenaggregation parallel verlief. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn c7E3 Fab'(PEG_2.000)₂ verabreicht wurde, was veranschaulicht, dass eine Modifikation mit zwei linearen PEG-Ketten eines Molekulargewichts von 2.000 die Serumbeständigkeit im Vergleich mit dem nicht modifizierten Fab nicht erhöht. Dagegen führt die Verabreichung von Fab'-Fragmenten, die mit PEG-Ketten eines Molekulargewicht von größer als 2.000 modifiziert waren, zu einer verlängerten Hemmung der Thrombozytenaggregation und einem verlangsamten Abfall bei der Hemmaktivität. In ähnlicher Weise war die Menge von mit PEG-Ketten eines Molekulargewichts größer als 2.000 modifizierten Fab'-Fragmente, die eine Stunde nach Verabreichung im Serum erfasst wurden größer als für nicht modifiziertes Fab' und die Serumspiegel fielen mit einer langsameren Geschwindigkeit ab.
Tabelle 8a Pharmakodynamik in Affen

Nd, nicht bestimmt

Tabelle 8b Pharmakodynamik in Affen

Nd, nicht bestimmt

Beispiel XXV c7E3 Fab-PEG20.000
Die betitelte Verbindung wurde, wie in Beispiel III beschrieben, hergestellt, ausgenommen, dass PEG_20.000Aldehyd für PEG_5.000Aldehyd substituiert wurde.

Claims

Modifizierter Antikörper oder modifiziertes, Antigen-bindendes Fragment, das spezifisch an ein oder mehrere Antigene bindet ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und Mac-1, worin der modifizierte Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ein bis sechs organische Reste umfasst, die an den Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment kovalent gebunden sind und die jeweils unabhängig eine substituierte, hydrophile, polymere Gruppe sind, welche mit einem Lipid oder einem Phospholipid substituiert ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin ein organischer Rest an mindestens einem Carboxyl-Terminus des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments kovalent gebunden ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der modifizierte Antikörper oder das modifizierte Antigen-bindende Fragment ein modifiziertes Antigen-bindendes Fragment ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem modifizierten Fab'-Fragment und einem modifizierten Fab-Fragment.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 3, worin der modifizierte Antikörper oder das modifizierte Antigen-bindende Fragment ein modifiziertes, Antigen-bindendes Fragment ist, das ein Achromopeptidase-Fragment ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin ein organischer Rest an den Carboxyl-Terminus der schweren Kette gebunden ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin ein organischer Rest kovalent an das Seitenketten-Schwefelatom eines Cysteinyl-Restes des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments gebunden ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 6, worin die schwere Kette den Cysteinyl-Rest umfasst.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 7, worin der modifizierte Antikörper oder das modifizierte Antigen-bindende Fragment ein Fab'-Fragment ist und worin der organische Rest an ein Schwefelatom eines Cysteinyl-Restes einer schweren Kette gebunden ist, der eine Inter-Ketten-Disulfidbrücke bildet.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche welcher/welches spezifisch an GPIIb/IIIa bindet; Bindung von Fibrinogen an GPII/IIIa inhibiert; und wahlweise weiter spezifisch α_vβ₃ bindet.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 9, worin die Bindung des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments an GPIIb/IIIa und/oder α_vβ₃ durch den 7E3 Antikörper kompetitiv inhibiert wird, welcher von der mit der ATCC Hinterlegungsnummer HB 8832 hinterlegten Hybridomzelllinie hergestellt wird.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment gekennzeichnet ist durch eine verglichen mit dem entsprechenden nicht-modifizierten Antikörper oder dem nicht-modifizierten Antigen-bindenden Fragment erhöhte in vivo Serum-Halbwertzeit.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment GPIIb/IIIa und/oder α_vβ₃ mit im wesentlichen der gleichen Affinität bindet, wie der entsprechende nicht-modifizierte Antikörper oder das nicht-modifizierte Antigen-bindende Fragment.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment gekennzeichnet ist durch eine verglichen mit dem entsprechenden nicht-modifizierten Antikörper oder dem nicht-modifizierten Antigen-bindenden Fragment verringerten Immunogenizität.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindende Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem 7E3 Antikörper, einem humanisierten 7E3 Antikörper, einem chimären 7E3 Antikörper und einem Antigenbindenden Fragment von einem der Vorstehenden, worin der 7E3 Antikörper der Antikörper ist, der von der mit der ATCC Hinterlegungsnummer HB 8832 hinterlegten Hybridomzelllinie produziert wird.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die substituierte hydrophile polymere Gruppe eine substituierte lineare oder verzweigte Polyalkanglykol-Kette mit einem Molekulargewicht von über 2000 Dalton ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die substituierte hydrophile polymere Gruppe eine lineare oder verzweigte substituierte Polyethylenglykol Kette ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment c7E3 oder ein Antigen-bindendes Fragment davon ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die substituierte hydrophile polymere Gruppe eine lineare oder verzweigte substituierte Polyethylenglykol-Kette ist, die substituiert oder mit einer Phospholipid-Gruppe terminal substituiert ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 18, worin die Phospholipidgruppe die folgende Strukturform aufweist: -NH-CH₂-CH₂-O-P(O^–)(O)-O-CH₂-CH(R)-CH₂-R'; worin R und R' jeweils unabhängig sind, -OH oder eine durch -X-Y dargestellte Gruppe, worin -X- ist, -O-, -O-C(O)-, -S-, -O-S(O)₂-O-, -NH-C(O)- oder -O-CH=CH-, und worin Y eine gesättigte oder ungesättigte C₆-C₄₀-Kohlenwasserstoffgruppe ist, und worin R und R' nicht beide -OH sind.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 19, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment c7E3 oder ein Antigen-bindendes Fragment von c7E3 ist; und worin die substituierte hydrophile polymere Gruppe eine lineare oder verzweigte Polyethylenglycol-Kette mit 3400 Dalton ist, welche mit einem Phospholipid terminal substituiert ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach einem der Ansprüche 18–20, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ein Antigen-bindendes Fragment ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Fab'-Fragment und einem Fab-Fragment.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 21, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ein Fab'-Fragment ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindende Fragment nach Anspruch 14, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ein humanisierter 7E3 Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon ist, umfassend: eine menschliche konstante Region oder ein Teil davon; CDR1, CDR2 und CDR3 der leichten Kette des 7E3 Antikörper; und CDR1, CDR2 und CDR3 der schweren Kette des 7E3 Antikörpers, worin der 7E3 Antikörper der von der mit der ATCC Hinterlegungsnummer HB 8832 hinterlegten Hybridomzelllinie produzierte Antikörper ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 14, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ein humanisierter 7E3 Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon ist.
Modifizierter Antikörper oder modifiziertes Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 14, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ein chimärer 7E3 Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon ist.
Verwendung eines modifizierten Antikörpers oder modifizierten Antigen-bindenden Fragments nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Thrombose in einem Patienten, oder zur Inhibierung von Stenose und/oder Restenose nach einer Gefäßbehandlung, oder zur Verhinderung oder Reduzierung von Ischämie, oder zur Inhibierung des Wachstums und/oder Metastasierung eines Tumors.
Verwendung Anspruch 26, wobei der modifizierte Antikörper oder das modifizierte Antigen-bindende Fragment Platelet vermittelte Metastase inhibiert.
Verwendung eines modifizierten Antikörpers oder modifizierten Antigen-bindenden Fragments nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung von α_vβ₃ vermittelter Angiogenese in einem Menschen, worin der modifizierte Antikörper oder das modifizierte Antigen-bindende Fragment spezifisch an α_vβ₃ bindet.
In vitro Verfahren zur Inhibierung eines durch die Bindung eines Liganden an GPIIb/IIIa, α_vβ₃ und/oder MAC-1, exprimiert auf der Plasma-Membran einer Zelle, vermittelten Ablaufs, umfassend, Inkontaktbringen der Zelle mit einer wirksamen Menge eines modifizierten Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 25.