DE69925894T2

DE69925894T2 - Verwendung von equiner-Herpes-Virus-typ-4-Thymidin-Kinase und einen Nucleosidanalog ausgewählt von Ganciclovir und Acyclovir zur Tötung von proliferativen Humanzellen

Info

Publication number: DE69925894T2
Application number: DE69925894T
Authority: DE
Inventors: David Klatzmann; Laurence Loubiere
Original assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Current assignee: Universite Pierre et Marie Curie Paris 6
Priority date: 1999-04-20
Filing date: 1999-04-20
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2019-04-21
Also published as: JP2001031587A; CA2306355A1; EP1046400A1; EP1046400B1; DE69925894D1; ATE298245T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Abtöten menschlicher proliferierender Zellen in vitro, ex vivo oder in vivo. Genauer gesagt, diese Erfindung stellt verbesserte Möglichkeiten zur Verfügung, um menschliche Zellen gegenüber Nukleosidanaloga zu sensitivieren. Die Erfindung betrifft insbesondere die Entdeckung vorteilhafter Eigenschaften bestimmter Polypeptide und Nukleinsäuren als konditionale Selbstmord-Wirkstoffe, insbesondere vom Thymidinkinase Typ. Die Erfindung kann in verschiedenen technischen Gebieten angewendet werden, z.B. in der experimentellen Biologie, Therapie, Prophylaxe, Durchmusterungsverfahren, etc.
Zellen von Säugetieren, die ein konditionales Selbstmord-Gen exprimieren, werden selektiv abgetötet oder zerstört durch Aktivierung eines Vorläufer-Wirkstoffs zu einem toxischen Metabolit. Das Herpes-Simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase-Gen (HSV1-TK) ist das am häufigsten verwendete Selbstmord-Gen, sowohl in experimentellen Ansätzen als auch in klinischen Studien¹. Die Expression des HSVI-TK-Gens sensitiviert Tumorzellen gegenüber antiviralen Wirkstoffe wie Acyclovir (ACV), Ganciclovir (GCV) und Bromvinyl-Desoxyuridin (BVDU). Diese Nukleosidanaloga werden durch HSV1-TK effizient in ihre Monophosphatform umgewandelt und werden dann durch zelluläre Kinasen des Wirts in Triphosphatverbindungen umgewandelt.^2-4 Der Einbau dieser Metabolite in elongierende DNS blockiert die Elongation, was zum Zelltod führt.^5-8 Das HSV1-TK/GCV-System hat sich als effizient erwiesen, sowohl die Regression von transplantierten Tumoren in verschiedenen Tier-Modellen,^9-11 als auch von mittels Karzinogenen induzierten Tumoren zu bewirken.¹² Basierend auf diesen positiven Ergebnissen werden mehrere klinische Gentherapie-Studien durchgeführt mit dem Ziel, die Sicherheit und Effizienz dieses Verfahrens bei der Behandlung von malignen Erkrankungen¹³ oder weiteren proliferativen Erkrankungen, wie der Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung (Graft versus Host disease), festzustellen, und vorläufige Ergebnisse sind jetzt veröffentlicht worden.^14-17
Trotz der Effektivität des HSV1-TK/GCV-Systems beim Abtöten proliferierender Zellen (z.B. Tumorzellen), ist es wichtig zu versuchen, das System zu verbessern mit dem Ziel, die therapeutische Wirksamkeit zu maximieren und/oder die Behandlungsbedingungen zu erleichtern. Zum Beispiel hat GCV den Nachteil, dass es über langsame intravenöse Perfusion verabreicht wird, was eines Krankenhausaufenthalts des Patienten bedarf. Es wäre deshalb interessant, ein Nukleosidanalogon für die orale Verabreichung zu finden, das dieselbe Wirksamkeit wie der GCV-Vorläufer-Wirkstoff hat. Es wäre auch eine signifikante Leistung, wenn man Wege finden würde, um die Wirksamkeit des Abtöt-Effekts, den man mit einer Thymidinkinase beobachtet, verbessert. In dieser Hinsicht ist die Verwendung stärkerer Promotorregionen vom Stand der Technik nahe gelegt worden, um die zellulären Mengen an Thymidinkinase zu steigern. Es ist ebenfalls vorgeschlagen worden, eine Kombination verschiedener Enzyme zu verwenden, um die Phosphorylierungseffizienz zu steigern. Ferner wurde vorgeschlagen, Mutanten oder Derivate von HSV1-TK zu produzieren oder nach Ihnen systematisch zu suchen, die eine erhöhte Affinität oder Aktivität gegenüber Nukleosidanaloga aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt nun alternative Möglichkeiten zur Verfügung, die die oben dargelegten Aufgaben behandeln und die insbesondere eine verbesserte Sensitivität humaner Zellen gegenüber Nukleosidanaloga bereitstellen. Insbesondere haben die Anmelder nun unerwarteterweise zeigen können, dass eine erhöhte Sensitivität gegenüber Nukleosidanaloga, die aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählt werden, in humanen Zellen mit einem besonderen Typ von Thymidinkinase erreicht werden kann, das heißt mit einem Thymdinkinase-Polypeptid oder -Nukleinsäure des Pferdeherpesvirus Typ 4. Insbesondere haben die Anmelder gezeigt, dass, unter Verwendung von Wildtyp Pferdeherpesvirus Typ 4 Thymidinkinase (wtEHV4-TK) oder Varianten davon, menschliche Zellen 3- bis 12-fach sensitiver gegenüber Ganciclovir oder Acyclovir werden als mit HSV-1TK. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass EHV4-TK ein sehr interessantes, alternatives Selbstmord-Gen gegenüber HSVI-TK-Gen für viele Verwendungen darstellt, einschließlich experimenteller, biologischer, Durchmusterungs- oder therapeutischer Anwendungen.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung; liegt deshalb in der Verwendung eines Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) Thymidinkinase-Polypeptids oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung einer Zusammensetzung, die humane Zellen gegenüber einem Nukleosidanalogon, das aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählt wird, in vitro, ex vivo oder in vivo sensitiviert.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck Pferdeherpesvirus Typ 4 Thymidinkinase-Polypeptid („EHV4-TK") entweder Wildtyp EHV4-TK oder jegliches biologisch aktive Fragment oder Variante davon. Wildtyp EHV4-TK wurde isoliert, charakterisiert und seine Aminosäuresequenz wurde im Stand der Technik publiziert.¹⁸ Dieses Polypeptid kann über jedes bekannte konventionelle Verfahren nach dem Stand der Technik gewonnen werden, z.B. über rekombinante Produktion, künstliche Synthese oder Reinigung aus EHV4-infizierten Zellen. Ein biologisch aktives Fragment oder eine Variante von Wildtyp EHV4-TK bezeichnet unter anderem ein Polypeptid, das die Fähigkeit besitzt, ein Nukleosidanalogon wie unten definiert zu phosphorylieren, z.B. GCV, ACV oder BVDU.
Fragmente von EHV4-TK können über jedes konventionelle Verfahren zubereitet werden, wie chemische oder enzymatische Spaltung gefolgt von Auftrennung der Fragmente, rekombinante Herstellung über verkürzte Nukleinsäuren, künstliche Polypeptidsynthese, etc. Das Fragment kann ein internes Fragment oder ein C-terminales oder ein N-terminales Fragment von Wildtyp EHV4-TK oder eine Kombination davon sein. Vorzugsweise sollte ein Fragment nach der vorliegenden Erfindung mindestens 40%, noch mehr bevorzugt mindestens 50% der gesamten Aminosäuresequenz von Wildtyp EHV4-TK beibehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Fragment mindestens 75% der gesamten Aminosäuresequenz von Wildtyp EHV4-TK, oder noch mehr bevorzugt mindestens 85% davon. Varianten von Wildtyp EHV4-TK umfassen alle biologisch aktiven Polypeptide, die vom Wildtyp EHV4-TK ableitet sind durch jedwede Mutation(en), Substitution(en), Additionen) und/oder andere Modifikation(en) der Primär- oder Sekundärstruktur. Varianten beinhalten sowohl alle natürlichen Varianten resultierend aus Mutationen oder Polymorphismus von EHV4, als auch beispielsweise Hybrid-Polypeptide, welche die EHV4-TK als Fusion an eine heterologe Aminosäuresequenzen umfassen. Der Ausdruck heterolog bezeichnet jede Aminosäuresequenz umfassend eine oder mehrere Aminosäurereste, die einen anderen Ursprung haben als EHV4. Solch eine heterologe Aminosäuresequenz kann jede künstlich hergestellte Sequenz sein, die zum Beispiel eine erhöhte Stabilität, oder eine Sekretion des Polypeptids oder eine Markierung des Polypeptids zur Verfügung stellt. Diesbezüglich offenbart die vorliegende Erfindung auch Fusionspolypeptide umfassend einen EHV4-TK-Anteil fusioniert an ein Marker Protein, z.B. verstärktes grünes Fluoreszenzprotein (E-GFP), Luciferase, β-Gal, Thy-1-Protein, Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT), und Zellproteine, die Antibiotikaresistenz bewirken. Die Fusion wird normalerweise zubereitet durch die genetische Kopplung eines Nukleinsäurebereichs kodierend für EHV4-TK-Polypeptid, und eines Nukleinsäurebereichs kodierend für eine heterologe Aminosäuresequenz, z.B. der Markeranteil. Die Nukleinsäuren werden im Leseraster fusioniert, so dass die beiden Bereiche gleichzeitig exprimiert werden und ein chimäres Polypeptid ergeben.
Mutations- oder Substitutionsvarianten können über bekannte Techniken zubereitet werden, z.B. spezifische Mutagenese, Amplifikation mit spezifischen Primern und dergleichen. Deletionen können ebenfalls über konventionelle Techniken eingeführt werden, z.B. durch die Verwendung von Restriktionsenzymen. Bevorzugt behalten die Varianten mindestens 80% der Primärstruktur von wtEHV4-TK bei. Bevorzugtere Varianten enthalten maximal 5 modifizierte Aminosäurereste im Vergleich zu wtEHV4-TK.
Andere Varianten können unnatürliche Glykosylierung oder posttranslationale Modifikationen umfassen.
Wie angedeutet, können die Varianten von EHV4-TK nur eine oder mehrere Modifikationen, wie oben beschrieben (Deletion(en), Mutation(en), Addition(en), etc.), umfassen.
Die biologische Aktivität der oben genannten Fragmente oder Varianten von Wildtyp EHV4-TK kann über konventionelle Techniken festgestellt werden. Insbesondere die Fähigkeit der Polypeptide, Nukleosidanaloga zu phosphorylieren, kann gemessen werden durch das in Kontakt bringen der Polypeptide mit einem Nukleosidanalogon, z.B. Acyclovir oder Ganciclovir, und nachweisen der Anwesenheit von phosphatiertem Acyclovir oder Ganciclovir. Bevorzugt wird der Test durchgeführt durch (i) einführen eines Nukleinsäurekonstrukts, kodierend für das Polypeptid, in eine Zelle, unter Bedingungen, die eine Expression des Polypeptids in der Zelle erlauben, (ii) inkubieren der Zelle mit einem Nukleosidanalogon wie Acyclovir oder Ganciclovir, und (iii) feststellen der Toxizität des Nukleosidanalogons in der Zelle. Das Niveau der beobachteten Toxizität kann gegebenenfalls verglichen werden mit einem Standard-Toxizitätsniveau, das in einem ähnlichen Experiment mit einer für Wildtyp EHV4-TK kodierenden Nukleinsäuresequenz beobachtet wird. Zum Beispiel kann der Test mit jeder sich teilenden Zelle, wie Fibroblasten, durchgeführt werden. Bevorzugte biologisch aktive Fragmente oder Varianten behalten mindestens 75% der Toxizität von Wildtyp EHV4-TK in einem Test, wie oben offenbart, bei.
Wie oben angegeben, kann die vorliegende Erfindung durchgeführt werden unter Verwendung eines Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) Thymidinkinase-Polypeptids oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure. Die Verwendung einer Nukleinsäure stellt eine bevorzugte Ausführungsform dar. Nukleinsäuren dieser Erfindung können DNS oder RNS sein, vorzugsweise cDNS oder eine künstliche DNS umfassend synthetische Bereiche. Die Nukleinsäure, kodierend für Wildtyp EHV4-TK, ist kloniert und sequenziert worden.¹⁸ Eine Nukleinsäure, kodierend für ein EHV4-TK-Polypeptid dieser Erfindung, kann über konventionelle Techniken wie das Durchmustern einer Bibliothek, artifizielle Synthese, Klonierung von genomischer DNS, etc., erhalten werden. Eine besondere Nukleinsäure kodierend für EHV4-TK-Polypeptid dieser Erfindung, ist jede Nukleinsäure, die mit der für Wildtyp EHV4-TK kodierenden Nukleinsäure hybridisiert und für ein biologisch aktives EHV4-TK-Polypeptid wie oben definiert kodiert. Hybridisierung erfolgt bevorzugt unter stringenten Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind (Sambrook et al.), z.B. 40°C; 50% Formamid, 5 × SSC; 1 × Denhardt, mit Waschschritten zwischen 55 und 65°C. Eine weitere besondere Nukleinsäure dieser Erfindung ist eine Nukleinsäure kodierend für Wildtyp EHV4-TK, die modifiziert wird, um die Expressionsbedingungen zu verbessern. Insbesondere wird eine bevorzugte Nukleinsäure dieser Erfindung modifiziert, so dass jeder darin enthaltene kryptische Promotor inaktiviert wird. Es ist in der Tat beobachtet worden, dass die Gene von Thymidinkinasen kryptische Promotoren enthalten, welche ihre Expression in Säugetierzellen stören. Die Anwesenheit von kryptischen Promotoren führt insbesondere zur Expression von verkürzten Versionen an Thymidinkinase mit niedrigerer oder gar keiner biologischen Aktivität und potentiellen Nebenwirkungen (siehe in diesem Zusammenhang Referenzen 19–20). Eine bevorzugte Nukleinsäure dieser Erfindung ist eine Nukleinsäure, die ein EHV4-TK-Polypeptid kodiert, wobei die Nukleinsäure keinen kryptischen Promotor aufweist. Solch eine Nukleinsäure kann zubereitet werden durch (i) identifizieren des kryptischen Promotors in der Nukleinsäuresequenz und (ii) modifizieren der Nukleinsäuresequenz, z.B. mittels translational neutraler Modifikationen und/oder mittels Deletion(en). Die resultierende Nukleinsäure kann auf eine verbesserte Expression in Säugetierzellen, besonders in menschlichen Zellen, getestet werden, wie in den Beispielen offenbart. Ein besondere Nukleinsäure dieser Erfindung umfasst eine Deletion im 5' Bereich eines EHV4-TK-Gens, wobei die Deletion eine erhöhte Expression in Säugetierzellen zur Verfügung stellt.
Vorzugsweise ist die Nukleinrsäure, die ein EHV4-TK Polypeptid dieser Erfindung kodiert, in einem Nukleinsäurekonstrukt beinhaltet, das zum Beispiel eine Promotorregion 5' und ein Terminationssignal 3' der kodierenden Sequenz umfasst. Solch ein Nukleinsäurekonstrukt kann Teil eines Vektors sein, z.B. eines Plasmid Vektors, eines viralen Vektors (das heißt eines rekombinanten Virus), eines artifiziellen Chromosoms, eines Episoms, etc.
In einer bevorzugten Ausführungsform verwendet diese Erfindung einen Vektor umfassend eine Nukleinsäure kodierend für ein EHV4-TK-Polypeptid wie oben definiert. Sogar noch bevorzugter ist solch ein Vektor ein Plasmid oder ein viraler Vektor, z.B. ein retroviraler Vektor, ein adenoviraler Vektor, ein AAV, ein Herpesvirusvektor oder ein Vacciniavirusvektor. Diesbezüglich verwendet eine besondere Ausführungsform dieser Erfindung einen Kulturüberstand, umfassend ein rekombinantes Virus, das eine Nukleinsäure beinhaltet, die ein EHV4-TK-Polypeptid kodiert. Eine weitere besondere Art eine Nukleinsäure dieser Erfindung zur Verfügung zu stellen, umfasst die Verwendung von Zellen, die rekombinantes Virus produzieren, beinhaltend eine Nukleinsäure, die EHV4-TK Polypeptid kodiert. Diesbezüglich kann jede Zusammensetzung, die Virus-verpackende Zellen umfasst, verwendet werden, insbesondere Retrovirus- und Adenovirus-verpackende Zellen. Die Verwendung eines viralen Überstands oder einer Virus-verpackenden Zelle stellt einen bevorzugten Weg dar, diese vorliegende Erfindung auszuführen.
Wie oben angegeben, besteht diese Erfindung darin, humane Zellen gegenüber einem aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählten Nukleosidanalogon zu sensitivieren. Der Ausdruck Nukleosidanalogon bezeichnet jede Verbindung, die, wenn sie phosphoryliert ist, in eine elongierende DNS-Kette eingebaut werden kann, um DNS-Replikation und/oder Transkription zu blockieren. Ein Nukleosidanalogon dieser Erfindung ist eine Verbindung, die durch Thymidinkinase, insbesondere durch HSV-1TK, in ein monophosphoryliertes Nukleosidanalogon umgewandelt werden kann. Beispiele für Nukleosidanaloga schließen z.B. Ganciclovir (GCV), Acyclovir (ACV) und Bromvinyl-Desoxyuridin (BVDU) ein. Diese Nukleosidanaloga werden effizient in ihre monophosphatierte Form durch HSV-1TK konvertiert, und werden dann durch zelluläre Kinasen des Wirts in triphosphorylierte Verbindungen umgesetzt. Einbau dieser Verbindungen in elongierende DNS blockiert die Elongation, was zu einem apoptotischen Zelltod führt (Balzarini, 1989; Furman, 1980; St Clair, 1987). Weitere Beispiele für Nukleosidanaloga sind alle Verbindungen, die von Pyrimidin- oder Purinnukleosiden abgeleitet sind, die durch EHV4-TK phosphoryliert werden können (bekannte antivirale Wirkstoffe oder synthetische Produkte).
Die Erfindung stellt also alternative Mittel zur Verfügung, Zellen gegenüber aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählten Nukleosidanaloga zu sensitivieren. Sensitivität bedeutet, dass in Gegenwart der Nukleosidanaloga die behandelten Zellen zerstört oder abgetötet werden, im Allgemeinen durch Apoptose. Die Erfindung stellt deshalb auch ein verbessertes Verfahren zur Zerstörung von Zielzellen zur Verfügung. Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der unerwartet hohen erzielbaren Sensitivität der Behandlung. Tatsächlich haben die Erfinder nun gezeigt, dass wenn Polypeptide oder Nukleinsäurekonstrukte der vorliegenden Erfindung mit humanen Zellen in Kontakt gebracht werden, in der Gegenwart eines Nukleosidanalogons eine sehr effiziente Zerstörung der Zellen erreicht werden kann. Die in den Beispielen gezeigten Ergebnisse zeigen insbesondere, dass menschliche Zellen, die EHV4-TK-Polypeptid exprimieren, 3- bis 12-fach sensitiver sind gegenüber Nukleosidanaloga wie GCV, als humane Zellen, die HSV-1TK exprimieren. In anderen Worten: die Erfindung erlaubt eine signifikante Reduzierung der Dosen an Nukleosidanaloga, z.B. GCV, die verwendet werden, um die Zielzellen zu zerstören.
Diesbezüglich besteht ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung in der Verwendung eines EHV4-TK-Polypeptids oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure für die Herstellung einer Zusammensetzung zur Zerstörung (z.B. Abtötung) von humanen Zellen (in vitro, ex vivo oder in vivo). Die Erfindung besteht auch in einem Verfahren des Abtötens humaner Zellen, das das in Kontakt bringen der humanen Zellen in vitro oder ex vivo mit EHV4-TK-Polypeptid oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz und ferner in Kontakt bringen der Zellen oder deren Nachkommen mit Nukleosidanaloga umfasst.
Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden in vitro, in vivo oder ex vivo. Sie kann verwendet werden um bestimmte Zellen abzutöten, entweder zu Selektions- oder Depletionszwecken, für experimentelle Verwendungen oder therapeutische Anwendungen.
Die vorliegende Erfindung kann durchgeführt werden mit verschiedenen Typen von humanen Zellen, einschließlich sich natürlich, pathologisch und induziert teilender Zellen. Natürlich sich teilende Zellen sind Zellen, die sich regelmäßig im Laufe ihres Lebenszyklus teilen. Induziert sich teilende Zellen sind Zellen, die sich nicht natürlicherweise teilen würden, aber zur Teilung angeregt werden können. Eine bevorzugte therapeutische Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von proliferierenden humanen Zellen, noch bevorzugter, von anormal proliferierenden humanen Zellen. Eine besondere Veranschaulichung ist die Behandlung (das heißt die Zerstörung und/oder Abtötung) von humanen Tumorzellen. Diesbezüglich können Zellen verschiedener solider Tumore erwähnt werden, beispielsweise von Kopf- und Nackenkrebs, Lungenkrebs (insbesondere der nicht-kleinzellige Lungenkrebs), Glioblastom, Melanom, Brustkrebs, Leberkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Gehirntumoren und dergleichen. Ein weiteres Beispiel für humane Zellen, die behandelt werden können gemäß dieser Erfindung, wird repräsentiert durch spezifische Klone von T-Lymphozyten, die anormal proliferieren, beispielsweise Klone von T-Lymphozyten, die an Autoimmunerkrankungen oder der Transplantat-gegen-Empfänger-Erkrankung (Graft versus Host disease) beteiligt sind.
Dementsprechend besteht in einer bestimmten Ausführungsform die Erfindung in der Verwendung eines Thyimdinkinase-Polypeptids des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Abtöten humaner Tumorzellen in vitro, ex vivo oder in vivo. Die vorliegende Erfindung besteht auch in einem Verfahren, eine humane Tumorzelle abzutöten, das das in Kontakt bringen der humanen Tumorzelle in vitro oder ex vivo mit einem Thyimdinkinase-Polypeptid des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure, und ferner das in Kontakt bringen der Zellen oder deren Nachkommen mit einem Nukleosidanalogon umfasst.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform besteht die Erfindung in der Verwendung eines Thyimdinkinase-Polypeptids des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Abtöten humaner T-Lymphozyten in vitro, ex vivo und in vivo. Ein Verfahren zum Abtöten humaner T-Lymphozyten, das das in Kontakt bringen der humanen T-Lymphozyten in vitro oder ex vivo mit einem Thymidinkinase-Polypeptid des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure und ferner das in Kontakt bringen der Zellen oder deren Nachkommen mit einem Nukleosidanalogon umfasst, ist ebenfalls Teil der Erfindung.
Wie oben erklärt, kann die vorliegende Erfindung in vitro, in vivo und ex vivo verwendet werden. Für in vitro oder ex vivo Verwendungen kann die Erfindung gemäß der folgenden Vorgehensweise ausgeführt werden.
Eine Zellpopulation, die behandelt werden soll (das heißt die gegenüber einem Nukleosidanalogon sensitiviert werden), wird bereitgestellt. Die Zellen können in jeder geeigneten Vorrichtung (z.B. eine Platte, eine Schale, ein Kolben, eine Flasche, etc.), vorzugsweise unter sterilen Bedingungen, in jedem konventionellen Kulturmedium (RPMI, DMEM, etc.) in Kultur gehalten werden. Die Zellen werden dann mit dem EHV4-TK-Polypeptid oder einer Nukleinsäure wie oben definiert in Kontakt gebracht. Diesbezüglich werden die Zellen durch direkte Inkubation der Zellen mit EHV4-TK-Polypeptid oder Nukleinsäure in Kontakt gebracht. Diese Inkubation erlaubt die Aufnahme des EHV4-TK-Polypeptids oder der Nukleinsäure durch die Zellen, oder zumindest durch einen Teil der Zellen. Diese Inkubation kann durchgeführt werden in der Gegenwart von unterstützenden Agenzien oder Bedingungen, die die Aufnahme des EHV4-TK-Polypeptids oder der Nukleinsäure durch die Zelle erhöhen. Solche Agenzien sind zum Beispiel jedes kationische Lipid, Polymer, Liposom, Kalziumphosphatpräzipitat, etc. Die Inkubation kann auch physikalische Maßnahmen umfassen, z.B. elektrische Felder, Gen-Kanone und dergleichen. In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung wird eine EHV4-TK-Nukleinsäure verwendet, die in einem Vektor enthalten ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die Nukleinsäure in einem viralen Vektor (oder einem davon hergestellten rekombinanten Virus) enthalten. Die Verwendung eines rekombinanten Virus ist besonders vorteilhaft aufgrund der natürlichen Infektionsstärke dieser Partikel. Bevorzugte rekombinante Viren schließen z.B. rekombinante Retroviren, Adenoviren, AAV oder Herpesviren ein. Verfahren zur Herstellung dieser Vektoren sind dem Fachmann bekannt.
In einer besonderen Ausführungsform werden die Zellen deshalb gegenüber einem Nukleosidanalogon sensitiviert durch das in Kontakt bringen der Zellen mit einem Vektor, umfassend eine EHV4-TK-Nukleinsäure, bevorzugter mit einem rekombinanten Virus, umfassend eine EHV4-TK-Nukleinsäure.
Diesbezüglich bezieht sich die Erfindung ganz besonders auf ein Verfahren humane Zellen gegenüber einem Nukleosidanalogon, das aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählt wird, in vitro, ex vivo oder in vivo zu sensitivieren durch das in Kontakt bringen der humanen Zelle mit einem Vektor umfassend eine EHV4-TK Nukleinsäure, bevorzugter mit einem rekombinanten Virus umfassend eine EHV4-TK Nukleinsäure. Zellen, die nach Inkubation die EHV4-TK-Nukleinsäure eingebaut haben, sind sensitiv gegenüber einem Nukleosidanalogon, ebenso wie weitere Zellen in der Umgebung aufgrund des „Bystander"-Effekts der TK.
Das in Kontakt bringen der Zellen mit rekombinantem Virus, wie oben offenbart, kann erreicht werden durch Inkubation der Zellen mit einem Kulturüberstand oder einer angereicherten Lösung oder Suspension, z.B. einer gereinigten Lösung umfassend das rekombinante Virus, oder durch Co-Kultivierung mit Hersteller-Zellen, die rekombinantes Virus herstellen.
Der Schritt des In-Kontakt-Bringens kann Zeitspannen von bis zu 72 Stunden oder mehr umfassen, je nach den Inkubationsbedingungen. Die Zellen können dann gemäß allen bekannten Verfahren wiedergewonnen werden. Sie können, falls gewünscht, einem Selektionsschritt unterworfen werden, um eine Zellpopulation zu erhalten, die im Wesentlichen Zellen umfasst, die wirklich das EHV4-TK-Polypeptid oder -Nukleinsäure enthalten. Diesbezüglich kann der Prozentsatz an transfizierten Zellen vor jeglichem Selektionsschritt, je nach Inkubationsbedingungen und Zellpopulation, zwischen 5 und beinahe 99% schwanken. Die wiedergewonnenen Zellen können gewaschen und in frisches Medium gesetzt werden, oder unter allen geeigneten Bedingungen gelagert werden (Einfrieren, Lyophilisieren, etc.).
Um die behandelten Zellen abzutöten, werden die Zellen ferner mit einem Nukleosidanalogon, das aus Ganciclovir und Acyclovir gewählt wird, in Kontakt gebracht, das heißt einer Verbindung, die durch die behandelten Zellen in ein toxisches Molekül umgewandelt wird (durch Einbau in elongierende DNS). Für in vitro Verwendung können die Zellen mit jeder geeigneten Dosierung des Nukleosidanalogons in jeder angemessenen Vorrichtung in Kontakt gebracht werden. Die Behandlung kann durchgeführt werden, um eine Durchmusterung nach proliferierenden Zellen durchzuführen, spezifische Zellpopulationen zu eliminieren (das heißt zu depletieren), die Aktivität einer Promotorregion zu bestimmen, etc. Für ex vivo Indikationen kann die Nukleosidanalogabehandlung auch durchgeführt werden, nachdem die behandelten Zellen in das Subjekt injiziert worden sind. In dieser Ausführungsform sind die Dosierungen im Prinzip wie unten für in vivo Anwendungen diskutiert.
Um die Erfindung in vivo durchzuführen, müssen die Zellen mit EHV4-TK-Polypeptid oder -Nukleinsäure in Kontakt gebracht werden durch direkte Verabreichung an ein Subjekt, das dessen bedarf. Die Verabreichung kann durchgeführt werden über jeden geeigneten Weg (intraarteriell, intravenös, intramuskulär, intratumoral, kutan, etc.). Für die Behandlung proliferierender Zellen, vor allem von Tumorzellen, wird das EHV4-TK-Polypeptid, oder vorzugsweise die Nukleinsäure, vorzugsweise über intravenöse, intraarterielle oder intratumorale Injektionen verabreicht, bevorzugter über intratumorale Injektion gemäß bekannter Techniken. Die Dosierung an EHV4-TK-Nukleinsäure kann angepasst werden durch den Fachmann, basierend auf der Lehre aus früheren klinischen Studien mit dem HSVI-TK-Gen, die im Stand der Technik bereits ausgeführt sind.
In dieser Hinsicht können Nukleinsäuren z.B. von 0,1 bis 1000 μg/Dosis injiziert werden. Bezüglich rekombinantem Virus können pro Dosis 10³–10⁹ pfu injiziert werden. Wenn Verpackungszellen verwendet werden, werden vorzugsweise 10⁴–10⁹ Zellen injiziert.
Sobald die Zielzellen sensitiv gegenüber einem Nukleosidanalogon geworden sind, können sie abgetötet werden durch weiteren Kontakt mit einem Nukleosidanalogon.
Diesbezüglich kann das Nukleosidanalogon dem Subjekt verabreicht werden gemäß verschiedener Protokolle und unterschiedlicher Zeitrahmen. Im Allgemeinen wird das Nukleosidanalogon verabreicht über Perfusion oder auf intraarteriellen, intravenösen oder kutanen Verabreichungswegen. Konventionelle Dosierung für Nukleosidanaloga liegt zwischen 1 und 50 mg/kg pro Tag, insbesondere bei etwa 10 mg/kg, zweimal pro Tag. Das Nukleosidanalogon kann GCV oder ACV sein. Orale Verabreichung ist auch vorgesehen. Zur Behandlung von Tumorzellen wird z.B. das Nukleosidanalogon normalerweise kurz nach dem EHV4-TK-Polypeptid oder -Nukleinsäure verabreicht, und für einen Zeitraum, der zwischen 1 und 15 Tagen umfasst. Für weitere Zellen, wie T-Zellklone, soll das Nukleosidanalogon nur verabreicht werden, wenn diese speziell anvisierten T-Zellklone z.B. proliferieren (das heißt bei GVHD, Autoimmunerkrankungen, etc.).
Die Erfindung bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung zellproliferativer Erkrankungen des Menschen umfassend ein Pferdeherpesvirus Typ-4 (EHV4) Thymidinkinase-Polypeptid oder eine dafür kodierende Nukleinsäure und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipient. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen Vektor umfassend die oben genannte Nukleinsäure, beispielsweise einen viralen Vektor wie oben definiert. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung eine Zelle, die rekombinantes Virus produziert, zum Beispiel eine Retroviren-produzierende Zelle.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung außerdem ein Nukleosidanalogon, das aus Ganciclovir und Acyclovir ausgewählt wird, zur simultanen oder separaten Verabreichung.
Ebenfalls beschrieben ist eine Zusammensetzung umfassend humane Zellen, die eine EHV4-TK-Nukleinsäure wie oben definiert enthalten.
Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in dem sich anschließenden experimentellen Abschnitt präsentiert, der als erläuternd und nicht den Umfang der Erfindung einschränkend verstanden werden soll.
1: Karte der Expressionsvektoren.

(A) Plasmide, wie beschrieben in Cazaux et al., beinhalten die cDNS kodierend für eine Herpesvirus Thymidinkinase (HSV1, EHV4, EBV oder VZV) im Leseraster fusioniert mit dem She ble-Gen, das Resistenz gegenüber Zeozin bewirkt.
(B) Karte des Vektors kodierend für das Fusionsprotein EHV4-TK/E-GFP. Unterstrichene Sequenzen korrespondieren mit dem 5' nach 3' Arm zwischen der Thymidinkinase und dem Zeozinresistenzprotein oder dem E-GFP.

2: Analyse der TK/ZEO-Fusionsproteinexpression in transfizierten Zellen.
(A) Western Blot Analyse, die die HSV1- und EHV4-TK-Proteinmengen in stabilen Klonen von tk(–) 3T3 zeigt. (B) Dot Blot-Analyse der TK-Expression in transfizierten und untransfizierten tk(–) 143B Zellen. Fusionsproteine wurden nachgewiesen mittels gereinigtem polyklonalem Kaninchen anti-Sh Antikörper.
3: Zytotoxische Aktivität von ACV, GCV und BVDU gegenüber humanen tk(–) 143B Zellen transfiziert mit HSV1- oder EHV4-TK. Toxizität ist dargestellt als Durchschnitt der IC50-Werte ± SD. Der Durchschnitt, bestimmt aus 3 unabhängigen Experimenten, ist oberhalb jedes Histogramms angezeigt.
4: Thymidin- und GCV-Phosphorylierung in transfizierten und untransfizierten tk(–) 143B Zellen.
Zellen wurden mit radioaktiv-markiertem Thymidin oder GCV inkubiert, und die unterschiedlichen Phosphorylierungsfarmen wurden durch FPLC-Analyse aufgetrennt. Der Prozentsatz an thy-MP, thy-DP und thy-TP war 29.3, 27.5 und 39.2% in HSV1-TK-exprimierenden Zellen bzw. 36.8, 27.5 und 28.8% in EHV4-TK-exprimierenden Zellen. Der Prozentsatz an GCV-MP, GCV-DP und GCV-TP war 15.5, 36.5 und 45% in HSV1-TK-exprimierenden Zellen bzw. 23.9, 29.3 und 45% in EHV4-TK-exprimierenden Zellen.
5: Analyse der dualen Funktionalität des EHV4-TK/E-GFP-Fusionsproteins.
(A) E-GFP-Expression in tk(–) 3T3 transfizierten und untransfizierten Zellen. EHV4-TK-Gen fusioniert mit E-GFP-Gen (1-B) wurde in tk(–) 3T3 Zellen transfiziert, und E-GFP positive Zellen wurden per FACS-Analyse nachgewiesen. Die Expression von E-GFP wurde bestimmt eine Woche nach Transfektion (1) und nach 2 Monaten Kultivierung in HAT-Medium (2). (B) GCV-Toxizität in transfizierten und untransfizierten Zellen. Die Ergebnisse wurden dargestellt als % der lebensfähigen Zellen im Vergleich zu Zellen, die ohne GCV kultiviert wurden.
Chemikalien
Acyclovir (ACV, [9-(2-Hydroxyethoxymethyl)guanin] Zovirax^®), Ganciclovir (GCV, [9-(1,3-Dihydroxy-2-propoxymethyl)guanin] Cymevan^®), Bromvinyldesoxyuridin (BVDU (E)-5-(2-Bromvinyl)-2'-desoxyuridin), wurden erworben von Wellcome (Issy les-Moulineaux, Frankreich), Syntex (Palo Alto, CA, USA) bzw. Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).
Zelllinien und Plasmide
NIH 3T3 Mauszellen, denen eine endogene TK-Aktivität (tk(–) 3T3) fehlt, wurden bezogen von der "American Type Culture Collection" (Rockville, MD, USA), ebenso wie humane tk(–) 143B-(ATCC CRL 8303) und HCT116-(ATCC CCL 247)Zellen; die Bauchspeicheldrüsenkrebs-Mauszelllinie PANC-O2 war eine Geschenk von Rhone-Poulenc (Frankreich). Alle Zellen wurden kultiviert in „Dulbecco's modified Eagle's medium" (DMEM), ergänzt durch 1% L-Glutamin (GibcoBRL), 1% einer Mischung aus Penizillin, Streptomyzin und Neomyzin (GibcoBRL) und 10% Serum von neugeborenen Kälbern (GibcoBRL) im Falle von NIH 3T3 Zellen oder 10% fötalem Kälberserum (GibcoBRL) für die anderen Zelllinien.
Expressionsvektoren beinhaltend die cDNS, die für Herpesvirus Thymidinkinase (HSV1, EHV4, EBV oder VZV) kodiert, und im Leseraster mit dem Zeozin-Resistenz-vermittelnden Sh Ble-Gen fusioniert ist, sind bereits früher von Cazaux et al.²¹ beschrieben worden. Die fusionierten Gene stehen unter der transkriptionellen Kontrolle des viralen HSV1-TK-Promotors und des viralen Polyoma pYF441-Enhancers (1-A).
Plasmide, die ein HSV1-TK-Gen im Leseraster fusioniert mit dem E-GFP-Gen enthalten (1-B), wurden vom beschriebenen Plasmid durch -Austausch des Sh Ble-Gens via PCR gegen die E-GFP-Sequenz (Clontech, Palo Alto, CA, USA) hergestellt.
DNS-Transfektion:
Zellen wurden transfiziert mit den verschiedenen Plasmiden durch Verwendung des Kalziumphosphatpräzipitationskit (GibcoBRL). Nach 48 h phänotypischer Expression wurden die Zellen in Selektionsmedium mit Zeozin (Cayla, Toulouse, Frankreich) kultiviert: 25 μg/ml (3T3-Zellen), 50 μg/ml (143 B-Zellen) oder 100 μg/ml (PANC-O2- und HCT 116-Zellen).
Die Transfektion wurde durchgeführt in 2 Petri-Schalen (Ø 100 mm). Unabhängige Klone wurden gepickt und individuell vermehrt, oder in Kultur behalten um eine Bulk-Kultur zu bekommen.
Zytotoxizitäts-Assay:
ACV, GCV und BVDU-Toxizität wurde quantitativ bestimmt durch Messung der Inhibition zellulärer Proliferation. 2.5 × 10³ Zellen wurden pro Loch in 24-Loch-Platten ausgesät. 24 h später wurden sie dann für 7 Tage in Wirkstoff-haltigem Medium kultiviert. Die Wirkstoffkonzentrationen, die im Bereich von 0.001 nM bis 100 μM lagen, wurden in dreifacher Ausführung getestet. Das Medium wurde jeden zweiten Tag gegen frisches DMEM ausgetauscht. An Tag 6 wurden 1.5 μCI von [Methyl-³H]-Thymidin (Amersham, UK) zu jedem Loch zugesetzt. Nach Waschschritten mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS pH 7.3), wurde die eingebaute Radioaktivität mit einem Micro-Beta Plus Zähler (EG&G Instruments and Wallac, Turku, Finnland) bestimmt. Zytotoxizitätsdosen wurden angegeben als IC50-Werte (benötigte Wirkstoffkonzentration zur Reduktion der Inkorporierung von [Methyl-³H]-Thymidin um 50%) und die Selektivitätsindizes wurden als IC50-Verhältnisse der parentalen Zellen gegenüber den transfizierten Zellen berechnet.
Lebensfähigkeits-Assay:
Parentale und virale TK-exprimierende Zellen wurden zu 5 × 10³ Zellen pro Loch in 6-Lochplatten ausplattiert. Nach 24 h wurden die Wirkstoffe in verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 0.01 bis 100 μM dem Medium zugesetzt. Wirkstoff-haltiges Medium wurde alle 2 Tage ausgewechselt. Nach 7 Tagen in Kultur wurde die Zelllebensfähigkeit analysiert durch das Zählen lebensfähiger Zellen mittels Trypan Blau Ausschluss nach 7 Tagen in Kultur mit GCV.
Western Blot-Analyse:
Zellen wurden dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und 10⁶ transfizierte Zellen wurden in Lysis-Puffer³⁷ inkubiert. Für die SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden Lysate von 1 × 10⁵ Zellen pro Spur auf ein 10–12% Tricin-Polyacrylamidgel geladen (Novex, San Diego, CA, USA), und aufgetrennte Proteine mittels Elektroblotting auf eine Nitrozellulosemembran transferiert (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland). Um eine gleichmäßige Proteinbeladung jeder Spur und einen korrekte Übertragung sicherzustellen, wurden die Banden durch Färbung mit 0.3% Ponceau Rot-Farbstoff visualisiert. Zeo-Fusionsproteine wurden nachgewiesen mit gereinigten polyklonalen Kaninchen anti-Zeo Antikörpern (Cayla, Toulouse, Frankreich), gefolgt von Inkubation mit Antikörper gegen Kaninchen IgG, der mit Meerrettichperoxidase gekoppelt ist. Die Reaktion wurde visualisiert über die BM Chemilumineszenz-Nachweisverfahren (Boehringer Mannheim, Frankreich SA).
Dot Blot-Analyse:
Sukzessive Verdünnungen von zellulären Extrakten wurden auf eine Nitrozellulosemembran getropft. Zeo-Fusionsproteine wurden nachgewiesen mit Kaninchen anti-Zeo polyklonalen Antikörpern (Cayla, Toulouse, Frankreich) gefolgt von einer Inkubation mit Antikörper gegen Kaninchen IgG, der mit Meerrettichperoxidase (Boehringer Mannheim, Frankreich SA) gekoppelt ist. Die Reaktion wurde wie in unter Western Blot-Analyse beschrieben visualisiert.
Nukleotidanalyse mittels schneller Protein-Flüssigchromatographie (FPLC):
3 × 10⁶ Zellen wurden für 7 h mit 1 μM [8-³H] GCV (3 Ci/mmol, Isotopchim, Frankreich) oder [Methyl-³H]-Thymidin (5 Ci/mmol, Amersham, UK) in einem finalen Volumen von 5 ml Medium inkubiert. Zellen wurden mittels Trypsin-Behandlung abgelöst und zweimal mit PBS gewaschen. Die Nukleotide wurden mit 1 ml eiskaltem Methanol 60% über Nacht bei –20°C extrahiert. Die Proben wurden mittels schneller Flüssigchromatographie (FPLC, Pharmacia-LKB Instruments, Schweden) auf einer Anionen-Austauschersäule analysiert.^38,39 Radioaktivität wurde am Säulenausgang mit einem Radiamatic Flo-one Beta A-500 Apparat (Packard, Meridan, CT) gemessen, und die Peaks wurden mit Flo-one/Data Software analysiert.
Durchflusszytometrische Analyse
tk(–) 3T3-Zellen wurden mit dem Plasmid kodierend für das EHV4-TK/E-GFP-Fusionsprotein, transfiziert und in HAT-Medium selektioniert. Nach einer Woche in Kultur wurde die Fluoreszenz der transfizierten Zellen analysiert. Die Fluoreszenz-Analyse wurde 2 Monate nach der Selektion wiederholt. Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und die Intensität der Fluoreszenz wurde direkt auf einem FACSCalibur (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) mit einem 525 nm Filter bestimmt und mit CellQuest Software analysiert.
Nukleosidanalogatoxizität auf Bulk-Zellkulturen, die verschiedene Herpesvirus-Thymidinkinasen exprimieren
Wir haben Expressionsvektoren für Herpesvirus Thymidinkinasen, die im Leseraster mit dem Zeozin-Resistenz-vermittelnden Sh Ble-Gen fusioniert sind, verwendet (pUT-TKx) (1A).²¹ Die Verwendung solcher Vektoren erleichtert die Selektion von transduzierten Zellen und den Nachweis von chimären Proteinen durch Immunnachweis mittels anti-Sh polyklonalen Antikörpern. Die Funktionalität der von diesen Vektoren exprimierten viralen TK ist bereits in Bakterien und Hefen, denen endogene TK oder Thymidylatkinase Aktivität fehlt, gezeigt worden.²¹ Wir haben zunächst diese Gene in Maus-Fibroblasten mit zellulärer TK-Defizienz (tk(–) 3T3 Zellen) exprimiert und selektionierten die stabil transfizierten Zellen über ihre Resistenz gegenüber Zeozin. Die Funktionalität der viralen TK in Zellen wurde dann überprüft durch Analyse des Zellwachstums in selektivem HAT-Medium und durch [Methyl-³H]-Thymidin (³HT)-Einbau-Assays. Wie erwartet, während alle untransfizierten Zellen in HAT starben, überlebten alle Transfektanten und bauten ³HT (Daten nicht gezeigt) ein.
Selektionierte Bulk-Populationen wurden dann auf ihre in vitro Sensitivität gegenüber Nukleosidanaloga durch Messung der Inhibition der Zellproliferation im Vergleich zu parentalen NIH 3T3-Zellen (Tabelle 1) untersucht. ACV IC50-Werte waren ungefähr 15-fach niedriger in HSV1-, EHV4- und VZV-TK-exprimierenden Zellen als im Vergleich zu den parentalen NIH-3T3-Zellen, und nur 4-fach niedriger für EBV-TK exprimierende Zellen. HSV1- und EHV4-TK exprimierende Zellen waren 350- und 700-fach sensitiver gegenüber GCV als NIH-3T3 Zellen, im Vergleich zu nur 7-fach für VZV- oder EBV-TK-exprimierende Zellen. Im Gegensatz zu ACV und GCV waren die IC50-Werte für BVDU im selben Bereich für alle Herpesvirus-TK-exprimierende Bulk-Zellen, zwischen 1300- und 3600-fach niedriger als für NIH-3T3 Zellen.
Diese Beobachtungen wurden ausgeweitet durch Verwendung einer zusätzlichen Tumor-Mauszelllinie, den Bauchspeicheldrüsentumorzellen PANC-O2. Erneut wurde festgestellt, dass die IC50-Werte 3-fach niedriger für EHV4-TK- als für HSV1-TK-exprimierende Bulk-Zellen waren, 0.55 ± 0.07 bzw. 1.7 ± 0.5 μM (Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten, Daten nicht gezeigt).
Tabelle 1: Zytotoxizität von ACV, GCV und BVDU auf bulk-transfizierte und untransfizierte tk(–) 3T3 Mauszellen. Die Wirkstofftoxizität wurde festgestellt durch Messung der Inhibition der Zellproliferation. Zellen wurden kultiviert in Wirkstoff-haltigem Medium für 7 Tage. [Methyl-³H]-Thymidin wurde am Tag 6 zugesetzt und die eingebaute Radioaktivität wurde gemessen. Zytotoxische Dosen wurden angegeben als durchschnittliche IC50-Werte (50% inhibierende Konzentration benötigt um den [Methyl-³H]-Thymidin-Einbau um 50% zu reduzieren) von 2 oder 3 Experimenten und die Selektivitätsindizes wurden berechnet als IC50-Verhältnisse der parentalen zu den transfizierten Zellen.
Toxizität der Nukleosidanaloga auf HSV1-TK- und EHV4-TK-exprimierende Zellklone.
Innerhalb der vier auf ihre Fähigkeit, Zellen gegenüber der Toxizität von Nukleosidanaloga zu sensitivieren, getesteten Herpesvirus TK, zeigten HSV1- und EHV4-TK die interessanteren Selektivitätsindizes. Weil Bulk-Zellen ein Gemisch an Klonen verschiedener Sensibilitäten darstellen, analysierten wir als nächstes die Wirkstoffzytotoxizität auf individuellen Klonen, die eine der zwei TK exprimieren.
Als erstes analysierten wir das Herpesvirus-TK-Proteinexpressionsniveau in mehreren Klonen mittels Western-Blot unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen Sh-Protein. Zellextrakte von 10⁵ Zellen wurden für die Elektrophorese geladen. Banden, die mit EHV4-TK/ZEO (53 KDa) und HSV1-TK/ZEO (55 KDa) korrespondieren, konnten mit gleicher Intensität in den getesteten vier EHV4-TK+ und vier HSV1-TK+ Klonen beobachtet werden (2-A). Es gab keine nachweisbare Bande in diesen Zellextrakten, die mit Sh-Protein alleine (20 KDa) korrespondieren würde (Daten nicht gezeigt). Eine schwächere Bande von niedrigerem PM konnte ebenfalls in allen Extrakten von HSV1-TK(+)-Zellen beobachtet werden. Diese Bande korrespondiert mit einer Transkriptionsinitiation an einem bekannten kryptischen, internen Promotor, die zur Translation eines verkürzten, aber funktionellen Proteins führt.^19-20,22
Wir analysierten dann die Toxizität von ACV, GCV und BVDU an diesen acht Klonen (Tabelle 2). Für ACV und GCV war die Sensitivität von EHV4-TK-exprimierenden Zellen statistisch wichtiger als die von HSV1-TK-exprimierenden Zellen (p < 0.05 bzw. 0.01). HSV1- oder EHV4-TK-exprimierende Klone zeigten die gleiche BVDU-Sensitivität.
Tabelle 2: Zytotoxizität von ACV, GCV und BVDU auf HSV1-TK- und EHV4-TK-exprimierende murine tk(–) 3T3-Klone. Die Sensitivität von TK-exprimierenden Klonen gegenüber den Wirkstoffen wurde wie in Tabelle 1 beschrieben getestet. Zytotoxischen Dosen wurden ausgedrückt als durchschnittliche IC50-Werte aus 3 Experimenten.
Nukleosidanalogatoxizität auf humane Bulk-Zellen, die HSV1-TK oder EHV4-TK exprimieren.
Da der Metabolismus eines Nukleosidanalogons in den Zellen verschiedener Spezies unterschiedlich sein könnte,^23-25 analysierten wir deshalb die Effizienz des Systems beim Abtöten humaner Zellen.
Folglich wurden humane tk(–) Osteosarkoma 143B-Bulk-Zellen, die HSV1- oder EHV4-TK exprimieren, hergestellt. Wir analysierten zunächst das Herpesvirus-TK-Proteinexpressionsniveau für jede Bulk-Kultur über einen Dot-Blot unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen Sh-Protein (2-B). Es gab keine nachweisbare Bande korrespondierend mit dem fusionierten Protein in tk(–) 143B-Zellextrakten. Die gleiche Expression des fusionierten Proteins wurde in HSV1- oder EHV4-TK-exprimierenden Zellen beobachtet.
Wir untersuchten dann die Zellsensitivität gegenüber ACV, GCV und BVDU (3). Die Toxizität von ACV war ähnlich in HSV1- und EHV4-TK-exprimierenden Zellen. Bemerkenswerterweise waren EHV4-TK-exprimierende Zellen ungefähr 12-fach sensitiver gegenüber GCV als HSV1-TK-exprimierende Zellen. Im Gegensatz dazu war die Toxizität von BVDU größer in HSV1-TK als in EHV4-TK-exprimierenden Zellen (3).
Diese Beobachtungen wurden ausweitet auf eine zusätzliche Tumorzelllinie, nämlich humane Kolonkarzinom HCT116-Zellen. Die IC50-Werte für GCV waren 3-fach niedriger für EHV4-TK- als für HSV1-TK-exprimierende Zellen, 0.11 ± 0.02 bzw. 0.32 ± 0.08 μM (Durchschnittswerte ± SD für 3 unabhängige Experimente). EHV4- und HSV1-TK-exprimierende Zellen waren 485- und 170-fach sensitiver gegenüber GCV als HCT116-Zellen (der Durchschnitt der IC50-Werte für GCV war 53.4 ± 15 μM).
GCV-Phosphorylierung in humanen Zellen, die HSV1-TK oder EHV4-TK exprimieren.
Um zu verstehen, warum GCV in EHV4-TK-exprimierenden Zellen toxischer ist als im Vergleich dazu in HSVI-TK-exprimierenden Zellen, analysierten wir die GCV-Phosphorylierung in tk(–) 143B und HSV1- oder EHV4-TK-exprimierenden Zeilen. Nach 7-stündiger Inkubation mit radioaktiv-markiertem GCV oder Thymidin, wurden die Nukleotide extrahiert und mittels FPLC analysiert.
Während in den tk(–) 143B-Zellen keine Phosphorylierung von Thymidin nachweisbar war (Daten nicht gezeigt), wurde Thymidin in beiden TK-exprimierenden Zellen in ähnlicher Weise phosphoryliert (4). Für GCV waren die Verhältnisse der verschiedenen Phosphorylierungsformen in beiden TK-Zellen gleich, während die Gesamtmenge an intrazellulärem GCV 5-fach höher in EHV4-TK-exprimierenden Zellen war als in HSV1-TK-exprimierenden Zellen.
Funktionalität eines EHV4-TK/E-GFP-Fusionsproteins.
Um den Nachweis des Transgens in transfizierten Zellen oder Geweben zu erleichtern, wurde das E-GFP-Gen im Leseraster an das 3' Ende des EHV4-TK-Gens fusioniert und in einen Expressionsvektor kloniert (1-B). Diese Konstruktion wurde dann in tk(–) 3T3-Zellen transfiziert, gefolgt von einer FACS-Analyse von E-GFP positiven Zellen. Eine Bulk-Zellkultur mit 95% E-GFP-exprimierenden Zellen wurde erhalten. Die stabile Expression und die duale Funktionalität des Transgens konnte gezeigt werden über die Fluoreszenzanalyse und das Überleben in Gegenwart von HAT-Medium im Verlaufe 2-monatiger Zellkultur (5-A). Expression des EHV4-TK/E-GFP-Fusionsproteins sensitivierte effizient diese Zellen gegenüber GCV, für das der IC50-Wert 0.6 μM war, im Vergleich zu 30 μM für tk(–) 3T3-Zellen (5-B).
Wir beabsichtigten die Wirksamkeit der momentanen, von Herpesviren abgeleiteten TK-Systeme zur Zerstörung von Zellen zu verbessern. Zu diesem Zweck wählten wir den Weg, die Wirksamkeit alternativer TK-Gene in humanen Zellen festzustellen. Da wir die Expressionsniveaus dieser Gene überwachen mussten, wurden sie an sh ble fusioniert, das für ein Protein kodiert, das Resistenz gegenüber Zeozin vermittelt und das im Western Blot mittels verfügbarer polyklonaler Antikörper nachgewiesen werden kann.
Wir verifizierten zunächst die duale Funktionalität der verschiedenen TK-ZEO-Fusionen in eukaryotischen Zellen durch Transfektion von murinen oder humanen Zellen mit fehlender endogener Thymidinkinaseaktivität. Selektion mit Zeozin führte immer zu resistenten Klonen, die alle überlebten, wenn sie später in Gegenwart von HAT-Medium kultiviert wurden. Deshalb schlussfolgerten wir, dass selbst wenn die Peptidfusionen in den Zellen nicht gespalten würden, alle Fusionsproteine bi-funktional wären. Das stimmt mit früheren Experimenten überein, die gezeigt hatten, dass HSV1-TK seine Funktionalität nach einer Amino- oder Carboxy-terminalen Fusion an verschiedene Proteine beibehält.^21,24,26-28
Signifikante Unterschiede in der Aktivität der verschiedenen Herpes-TK wurden beobachtet. Diese Unterschiede wurden sowohl in der Analyse von Bulk-Zellkulturen als auch von unabhängigen Klonen gefunden. Die Bulk-Kulturen stellen eine bessere Abschätzung der gesamten Enzymaktivität in einer polyklonalen Population zur Verfügung, die eine in situ transfizierte Population in der prä-klinischen und klinischen Situation imitiert, während die Klone eine Analyse der Aktivität in individuellen Zellen in Bezug auf das Expressionsniveau des Transgens erlauben. Wir untersuchten die Toxizität von ACV, GCV und BVDU.
VZV- und EBV-TK zeigten gar keine Vorteile gegenüber HSV1-TK, welches Nukleosidanalogon auch immer verwendet wurde. Zwei aktuelle Studien zeigten das Potenzial von VZV-TK als Selbstmord-Gen in humanen Brustkrebszellen²⁹ und humanen Osteosarkomzellen.³⁰ In diesen Artikeln lagen die Selektivitätsindizes und IC50-Werte für BVDU im Bereich von 0.06 bis 0.6 μM auf recht ähnlichem Niveau wie unsere Werte, aber es wurde kein Vergleich zwischen VZV und HSV1-TK gezeigt.
Bemerkenswerterweise waren EHV4-TK-exprimierende Zellen immer sensitiver gegenüber GCV als HSVI-TK-exprimierende, egal ob Bulk-Kulturen oder Klone. Diese verstärkte Toxizität war nicht auf einen Unterschied in den TK-Expressionsniveaus zurückzuführen, wie mittels Western Blot festgestellt wurde. Das wird ferner auch von der Beobachtung eines entgegengesetzten Effekts mit BVDU angedeutet, der für HSV1-TK-exprimierende Zellen toxischer ist, was zeigt, dass es eher einen qualitativen als einen quantitativen Unterschied zwischen den Aktivitäten dieser Enzyme gibt.
Um den möglichen Mechanismus, der die verbesserte Sensitivität gegenüber GCV in EHV4-TK-exprimierenden Zellen im Vergleich zu HSVI-TK-exprimierenden Zellen erklärt, zu untersuchen, analysierten wir die GCV-Phosphorylierung mittels FPLC. Die Gesamtmenge an intrazellulärem GCV war 5-fach höher in EHV4-TK- als in HSVI-TK-exprimierenden Zellen, während die Anteile der verschiedenen Phosphorylierungsformen in beiden TK-Zellen ähnlich waren. Derartige Unterschiede könnten erklärt werden mit der Aufnahme von Nukleosiden und deren Analoga, die, wie berichtet worden ist, mit der TK-Expression korreliert. Tatsächlich, die Aufnahme von Thymidin in tk(–) Escherichia coli ist proportional zur Menge an vom heterologen HSVI-TK-Gen exprimierter TK-Aktivität.³¹ Ferner zeigten Säugetier HSV1-TK-exprimierende Zellen eine höhere GCV-Aufnahme und Phosphorylierung als Kontrolzellen.³² Da wir ähnliche TK-Expression in beiden TK(+)-Zellen (2-B) nachgewiesen haben, konnte die größere Menge an intrazellulärem GCV in EHV4-TK-exprimierenden Zellen mit einer größeren EHV4-TK-Aktivität gegenüber GCV im Vergleich zu HSV1-TK-Aktivität korreliert werden.
Der Nachweis einer Genübertragung könnte erheblich erleichtert werden durch Marker, die einen schnellen und effizienten Nachweis von erfolgreich transduzierten Zellen erlauben. Das trifft vor allem auf zytoplasmatische Proteine zu. Es sind jedoch keine geeigneten monoklonalen oder polyklonalen anti-EHV4-TK-Antikörper erhältlich. Deshalb verwendeten wir das verstärkte grüne Fluoreszenzprotein (E-GFP)-Gen, um ein EHV4-TK/E- GFP-Fusionsprotein herzustellen. Die Expression von EGFP bleibt stabil über Monate in transfizierten Zellen und kann einfach über Durchflusszytometrie überwacht werden. Transfektion des Fusionsplasmid in Säugetierzellen erbrachte, dass das Konstrukt funktional ist, dass die Zellen sowohl fluoreszieren (95%) als auch sensitiv gegenüber GCV sind. Dieses Ergebnis stimmt überein mit einer aktuellen Studie von Liomas et al, die von einer dualen Funktionalität eines HSV1-TK-Grünes Fluoreszenzprotein-Fusionsgens berichteten.²⁸ Diese chimären Selbstmord-/Marker-Gene sollten den Nachweis von transduzierten Zellen dramatisch erleichtern. Das wäre von besonderer Bedeutung in experimentellen Modellen. Diesbezüglich werden Selbstmord-Gene häufig in transgenen Mäusen verwendet, um Modelle für die konditionale Ablation spezifischer Zellpopulationen herzustellen.
Abhängig von den Zelllinien war EHV4-TK3- bis 12-fach stärker als HSV1-TK. Solch ein Unterschied erscheint signifikant, wenn man den klinischen Einsatz von Selbstmord-Genen erwägt, da die Behandlung von experimentellen Tumoren in Mäusen und Ratten zeigt, dass die GCV-Dosierung oft kritisch für das Erreichen der Wirksamkeit ist. Wenn es mit 10 mg/kg 2-mal pro Tag verabreicht wird, was die übliche Dosierung in Menschen ist, dann liegt die plasmatische GCV-Konzentration im Bereich zwischen 0.44 und 2.2 μg/ml,³³ und die Konzentrationen in der Gehirn und Rückenmarksflüssigkeit (Cerebrospinal Fluid; CSF) sind ungefähr 3-fach niedriger.^34,35 Es ist deshalb möglich, dass die CSF/GCV-Konzentrationen suboptimal sind für die Behandlung von Gehirntumoren, die mit HSV1-TK transduziert sind. Auf jedem Fall sollte eine verbesserte Effizienz des Enzyms zu einer besseren Behandlungseffizienz und/oder Abnahme der verwendeten GCV-Dosis führen. Letzterer Punkt ist auch signifikant, weil GCV-Toxizität im Menschen anscheinend kumulativ ist, abhängig von der verabreichten Gesamtmenge (Cytovene^® Produkt-Monographie).³⁶
Zusammenfassend unterstreichen diese Experimente die potenziellen Vorteile von EHV4-TK als Selbstmordgen, sowohl für experimentelle wie für therapeutische Ansätze, in vitro, ex vivo und in vivo.
Literaturverzeichnis

1. Anonymous. Department of Health and Human Services National Institutes of Health. Recombinant DNA Advisory Committee. Minutes of Meeting. March 6–7, 1997. Hum Gene Ther 1997; 8: 1955–2004.
2. Fyfe, J. A., Keller, P. M., Furman, P. A., Miller, R. L., and Elion, G. B. Thymidine kinase from herpes simplex virus phosphorylates the new antiviral compound, 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine. J Biol Chem 1978; 253: 8721–8727.
3. Cheng, Y. C., Dutschman, G., De Clercq, E., Jones, A. S., Rahim, S. G., Verhelst, G., and Walker, R. T. Differential affinities of 5-(2-halogenovinyl)-2'-deoxyuridines for deoxythymidine kinases of various origins. Mol Pharmacol 1981; 20: 230–233.
4. Field, A. K., Davies, M. E., DeWitt, C., Perry, H. C., Liou, R., Garmershausen, J., Karkas, J. D., Ashton, W. T., Johnston, D. B., and Tolman, R. L. 9-([2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethexy]methyl)guanine: a selective inhibitor of herpes group virus replication. Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80: 4139–4143.
5. Furman, P. A., McGuirt, P. V., Keller, P. M., Fyfe, J. A., and Elion, G. B. Inhibition by acyclovir of cell growth and DNA synthesis of cells biochemically transformed with herpesvirus genetic information. Virology 1980; 102: 420–430.
6. St Clair, M. H., Lambre, C. U., and Furman, P. A. Inhibition by ganciclovir of cell growth and DAN synthesis of cells biochemically transformed with herpesvirus genetic information. Antimicrob. Agents and Chemother. 1987; 31: 844–849.
7. Balzarini, J., and De Clercq, E. Inhibitory effects of (E)-5-(2-bromovinyl)-2'-deoxyuridine (BVDU) and related compounds on herpes simplex virus (HSV)-infected cells and NSV thymidine kinase gene-transformed cells. Methods Find Exp Clin Pharmacol 1989; 11: 379–389.
8. Bouayadi, K., Hoffmann, J. S., Fons, P., Tiraby, M., Reynes, J. P., and Cazaux, C. Overexpression of DNA polymerase beta sensitizes mammalian cells to 2',3'-deoxycytidine and 3'-azido-3'-deoxythymidine. Cancer Res 1997; 57: 110–116.
9. Culver, K. W., Ram, Z., Wallbridge, S., Ishii, H., Oldfield, E. H., and Blaese, R. M. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 1992; Using Smart Source Parsing; 256: 1550–1552.
10. Vile, R. G., and Hart, I. R. Use of tissue-specific expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene to inhibit growth of established murine melanomas following direct intratumoral injection of DNA. Cancer Res 1993; Using Smart Source Parsing, 53: 3860–3864.
11. Caruso, M., Panis, Y., Gagandeep, S., Houssin, D., Salzmann, J. L., and Klatzmann, D. Regression of established macroscopic liver metastases after in siut transduction of a suicide gene. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90; 7024–7028.
12. Wei, M. X., Bougnoux, P., Sacre-Salern, B., Peyrat, M. B., Lhuillery, C., Salzmann, J. L., and Klatzmann, D. Suicide gene therapy of chemically induced mammary tumor in rat: efficacy and distant bystander effect. Cancer Res 1993; 58: 3529–3532.
13. ORDA, R. Human Gene Transfer Protocols. Office of Recombinant DNA Actvities, NIH, Bethesda, Maryland 1998;.
14. Ram, Z., Culver, K. W., Oshiro, E. M., Viola, J. J., DeVroom, H. L., Otto, E., Long, Z., Chiang, Y., McGarrity, G. J., Muul, L. M., Katz, D., Blaese, R. M., and Oldfield, E. H. Therapy of malignant brain tumors by intratumoral implantation of retroviral vector-producing cells [see comments]. Nat Med 1997; 3: 1354–1361.
15. Bonini, C., Ferrari, G., Verzeletti, S., Servida, P., Zappone, E. Ruggieri, L., Ponzoni, M., Rossini, S., Mavilio, F., Traversari, C., and Bordignon, C. HSV-TK gene transfer into donor lymphocytes for control of allogeneic graft-versus-leukemia [see comments]. Science 1997; 276: 1719–1724.
16. Klatzmann, D., Chérin, P., Bensimon, G., Boyer, O., Coutelier, A., Charlotte, F., Boccaccio, C., Salzmann, J. L., and Herson, S. A phase-I/II dose-escalation study of herpes simplex virus type 1 thymidine kinase "suicide" gene therapy for metastatic melanoma. Human Gene Therapy 1998; 9 (17): 2585–2594.
17. Klatzmann, D., Valéry, C. A., Bensimon, G., Marro, B., Boyer, O., Mokhtari, B., Diquet, B., Salzmann, J. L., and Philoppon, J. A phase I/II study of herpes simplex type 1 thymidine kinase "suicide" gene therapy for recurrent glioblastoma. Human Gene Therapy 1998; 9 (17): 2595–2604.
18. Nicolson L., Cullinane A, and Onions, D. The nucleoside sequence of the equine herpes virus 4 Thymidine Kinase Gene, J. General Virology, 1990, 71, 1801–1805.
19. Al-Shawi, R., Burke, J., Wallace, H., Jones, C., Harison, S., Buxton, D., Maley, S., Chandley, A., and Bishop, J. O. The herpes simplex virus type 1 thymidine kinase is expressed in the testes of transgenic mice under the control of a cryptic promoter. Mol Cell Biol 1991; 11: 4207–4216.
20. Salomon, B., Maury, S., Loubiere, L., Caruso, M., Onclercq, R., and Klatzmann, D. A truncated herpes simplex virus thymidine kinase phosphorylates thymidine and nucleoside analogs and does not cause sterility in transgenic mice. Mol Cell Biol 1995; 15: 5322–5328.
21. Cazaux, C., Tiraby, M., Loubiere, L., Haren, L., Klatzmann, D., and Tiraby, G. Phosphorylation and cytotoxicity of therapeutic nucleoside analogues: a comparison of alpha and gamma herpesvirus thymidine kinase suicide genes [in Process Citation]. Cancer Gene Ther 1998; 5: 83–91.
22. Ellison, A. R., and Bishop, J. O. Initiation of herpes simplex virus thymidine kinase polypeptides. Nucleic Acids Res 1996; 24: 2073–2079.
23. Balzarini, J., Pauwels, R., Baba, M., Herdewijn, P., De Clercq, E., Broder, S., and Johns, D. G. The in vitro and in vivo anti-retrovirus activity, and intracellular metabolism of 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine and 2',3'-dideoxycytidine are highly dependent on the cell species. Biochemical Pharmacology 1988; 37: 897–903.
24. Beck, C., Cayeux, S., Lupton, S. D., Dorken, B., and Blankenstein, T. The thymidine kinase/ganciclovir-mediated "suicide" effect is variable in different tumor cells. Hum Gene Ther 1995; 6: 1525–1530.
25. Zhang, L., Winkenheiser, K. A., and Whitsett, A. Limitations of retrovirus-mediatad HSV-tk gene transfer to pulmonary adenocarcinoma cells in vitro and in vivo. Human Gene Therapy 1997; 8: 563–574.
26. Schwartz, F., Maeda, N., Smithies, O., Hickey, R., Edelmann, W., Skoultchi, A., and Kucherlapati, R. A dominant positive and negative selectable gene for use in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: 1041–10420.
27. Marini, F. r., Cannon, J. P., Belmont, J. W., Shillitoe, E. J., and Lapeyre, J. N. In vivo marking of spontaneous or vaccine-induced fibrosarcomas in the domestic house cat, using an adenoviral vector containing a bifunctional fusion protein, GAL-TEK. Hum Gene Ther 1995; 6: 1215–1223.
28. Loimas, S., Wahlfors, J., and Janne, J. Herpes simplex virus thymidine kinase-green fluorescent protein fusion gene: new tool for gene transfer studies and gene therapy. Biotechniques 1998; 24: 614–618.
29. Grignet-Debrus, C., and Calberg-Bacq, C. M. Potential of Varicella zoster virus thymidine kinase as a suicide gene in breast cancer cells. Gene Ther 1997; 4: 560–569.
30. Degreve, B., Andrei, G., Izquierdo, M., Piette, J., Morin, K., Knaus, E. E., Wiebe, L. I., Basrah, I., Walker, R. T., De Clerq, E., and Balzarini, J. Varicella-zoster virus thymidine kinase gene and antiherpetic pyrimidine nucleoside analogues in a combined gene/chemotherapy treatment for cancer. Gene Ther 1997; 4: 1107–1114.
31. Dube, D. K., Horwitz, M. S., and Loeb, L. A. The association of thymidine kinase activity and thymidine transport in Escherichia coli. Gene 1991; 99: 25–29.
32. Haberkorn, U., Khazaie, K., Morr, I., Altmann, A., Muller, M., and van Kaick, G. Ganciclovir uptake in human mammary carcinoma cells expressing herpes simplex virus thymidine kinase. Nucl Med Biol 1998; 25: 367–373.
33. Oldfield, E. H., Ram, Z., Culver, K. W., Blaese, R. M., DeVroom, H. L., and Anderson, W. F. Gene therapy for the treatment of brain tumors using intra-tumoral transduction with the thymidine kinase gene and intravenous ganciclovir. Hum Gene Ther 1993; 4: 39–89.
34. Fletcher, C., Sawchuk, R., Chinnock, B., de Miranda, P., and Balfour, H. H., Jr. Human pharmacokinetics of the antiviral drug DHPG. Clin Pharmacol. Ther 1986; 40: 281–286.
35. Faulds, D., and Heel, R. C. Ganciclovir. A review of its antiviral activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy in cytomegalovirus infections. Drugs 1990; 39: 597–638.
36. Buhles, W. C. Clinical safety of intravenous ganciclovir. In: Dekker, M. (ed). Ganciclovir therapy for cytomagelovirus infection. New York, 1991, pp 31–69.
37. Morozov, V. A., Noguiez-Hellin, P., Laune, S., Tamboise, E., Salzmann, J. L., and Klatzmann, D. Plasmovirus: replication cycle of a novel nonviral/viral vector for gene transfer. Cancer Gene Ther 1997; 4: 286–293.
38. Kremmer, T., Paulik, E., Boldizsar, M., and Holenyi, I. Application of the fast protein liquid chromatographic system and MonoQ HR 5/5 anion exchanger to the separation of nucleosides. Journal of Chromatography 1989; 493: 45–52.
39. Guettari, N., Loubiere, L., Brisson, E., and Klatzmann, D. Use of herpes simplex virus thymidine kinase to improve the antiviral activity of zidovudine. Virology 1997; 235: 398–405.

Claims

Die Verwendung eines Thymidinkinase-Polypetids des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür codierenden Nukleinsäure und eines aus GCV (Ganciclovir) und ACV (Acyclovir) ausgewählten Nukleosidanalogs zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Abtötung menschlicher proliferierender Zellen, insbesondere menschlicher Tumorzellen, in vitro, ex vivo oder in vivo.
Die Verwendung eines EHV4-TK-Polypetids oder einer dafür codierenden Nukleinsäure und eines aus GCV (Ganciclovir) und ACV (Acyclovir) ausgewählten Nukleosidanalogs zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Abtötung menschlicher T-Lymphocyten in vitro, ex vivo oder in vivo.
Die Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur gleichzeitigen oder getrennten Verabreichung des Thymidinkinase-Polypeptids des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder der Nukleinsäure und des Nukleosidanalogs.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung zellproliferativer Erkrankungen des Menschen, umfassend ein Thymidinkinase-Polypeptid des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder eine dafür codierende Nukleinsäure und ein aus GCV (Ganciclovir) und ACV (Acyclovir) ausgewähltes Nukleosidanalog zur gleichzeitigen oder getrennten Verabreichung.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Nukleosidanalog GCV ist.
Die Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Thymidinkinase-Polypeptid des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) Wildtyp EHV4-TK oder ein biologisch aktives Fragment oder eine Variante desselben umfasst.
Die Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die ein Thymidinkinase-Polypeptid des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) codierende Nukleinsäure eine Wildtyp EHV4-TK codierende Nukleinsäure oder eine damit hybridisierende Nukleinsäure, die ein biologisch aktives EHV4-TK Polypeptid codiert, umfasst.
Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2, 6 und 7, wobei die Nukleinsäure in einem Vektor enthalten ist.
Die Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Vektor ein rekombinantes Virus ist.
Ein Verfahren zur Sensitivierung einer menschlichen Zelle gegenüber einem Nukleosidanalog ausgewählt aus GCV (Ganciclovir) und ACV (Acyclovir), umfassend das in Kontakt bringen der menschlichen Zelle in vitro oder ex vivo mit einem Thymidinkinase-Polypetid des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür codierenden Nukleinsäure.
Ein Verfahren zur Abtötung einer menschlichen Zelle, umfassend das in Kontakt bringen der menschlichen Zelle in vitro oder ex vivo mit einem Thymidinkinase-Polypetid des Pferdeherpesvirus Typ 4 (EHV4) oder einer dafür codierenden Nukleinsäure und weiterhin das in Kontakt bringen der Zelle oder ihrer Nachkommen mit einem Nukleosidanalog ausgewählt aus GCV (Ganciclovir) und ACV (Acyclovir).