DE60133104T2

DE60133104T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur behandlung von neoplastischen erkrankungen mittels chemotherapie und strahlungssensibilisatoren

Info

Publication number: DE60133104T2
Application number: DE60133104T
Authority: DE
Inventors: Bin Emeryville WU; Todd W. Emeryville SEELEY; Lewis T. Emeryville Williams
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2001-05-30
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2021-05-31
Also published as: EP1292289B1; EP1292289A2; AU2001269726A1; CA2410516A1; WO2001091739A2; DE60133104D1; US20050282766A1; WO2001091739A3; PT1292289E; ES2299493T3; ATE387909T1; JP2003534786A; US6974867B2; US20020049180A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die Regulation des Zellzyklus und des Zelltods nach Behandlung mit Mitteln, die eine Schädigung der DNA verursachen. Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere Zusammensetzungen und Verfahren zur Inhibierung der Genexpression und/oder der biologischen Aktivität von KIAA0175 bereit, sowie Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder der Aktivierung von p53, p21 oder verwandten Proteinen. Solche Zusammensetzungen und Verfahren sind nützlich bei der Chemotherapie und als Bestrahlungssensitivierungsmittel und finden somit Anwendung bei der Behandlung einer neoplastischen Erkrankung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die herkömmliche Chemo- und Bestrahlungstherapie zur Behandlung von Tumoren ist hinsichtlich ihrer Verwendbarkeit durch das Fehlen einer Zielspezifität eingeschränkt. Es wurden Methoden eingesetzt, die eine zielgerichtete Strahlungstherapie verwenden, bei denen Radioisotope an tumorsuchende Mittel konjugiert sind, um die biologische Spezifität zu verbessern. Leider sind jedoch sehr wenige selektive Mittel für die zahlreichen Tumortypen verfügbar, und wenn es selektive Mittel gibt, so war der therapeutische Erfolg minimal. Kürzlich entwickelte Methoden zur Behandlung von neoplastischen Erkrankungen versuchen die Spezifität zu verbessern, indem eine Klasse von Molekülen eingesetzt wird, die "Sensitivierungsmittel" (sensitizer) genannt werden, und die die Sensitivität von behandelten Zellen, z. B. für eine Chemotherapie und für eine γ-Bestrahlung, erhöhen. Beispielsweise ist versucht worden, die zelluläre Bestrahlungssensitivität zu erhöhen, indem Wirkstoffen wie Fluoruracil und Wortmannin verabreicht wurden. Aufgrund der nicht-spezifischen Art dieser und anderer gegenwär tig verfügbarer "Sensitivierungsmittel" zeigen jedoch normale, nicht-neoplastische Zellen eine erhöhte Sensitivität gegenüber Chemotherapie und Bestrahlung, die zu einer starken zellulären Toxizität führen. Es werden dringend Sensitivierungsmittel für Chemotherapie und Bestrahlung benötigt, die eine verbesserte Spezifität aufweisen und eine bevorzugte Sensitivität von neoplastischen Zellen im Vergleich zu normalen Zellen ermöglichen. Die KIAA0175-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung erfüllen diese und andere damit in Verbindung stehende Erfordernisse.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform Inhibitoren von KIAA0175 bereit. Die erfindungsgemäßen Inhbitoren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Antisense-Moleküle, Ribozyme, Antikörper oder Antikörperfragmente, Proteine oder Polypeptide sowie kleine Moleküle. Beispielhafte Antisense-Moleküle umfassen mindestens 16, 17, 20 oder 25 aufeinanderfolgende Nukleotide der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 9, oder sie hybridisieren unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure von SEQ ID NO: 9. Insbesondere bevorzugt sind Antisense-Moleküle, die mindestens 25 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz von SEQ ID NO: 9 aufweisen oder unter stringenten Bedingungen an die Sequenz von SEQ ID NO: 9 hybridisieren. Beispielhafte Antisense-Moleküle werden vorliegend als SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5 aufgeführt.
In weiteren Ausführungsformen werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die einen oder mehrere KIAA0175-Inhibitoren in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
Zusätzliche Ausführungsformen stellen Verfahren zur Verringerung der Genexpression oder der biologischen Aktivität von KIAA0175 bereit.
Noch weitere Ausführungsformen stellen Verfahren zur Verringerung der Expression von p53 und Verfahren zur Verringerung der Expression von p21 bereit.
Weitere Ausführungsformen stellen Verfahren zur Erhöhung der Chemo- und/oder Bestrahlungssensitität einer Säugetierzelle bereit, Verfahren zur Verringerung der Nebenwirkungen einer Krebstherapie und anderer Arten von Stress, die mit einer p53-Induktion assoziiert sind, sowie Verfahren zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung.
Jedes der Verfahren der vorliegenden Erfindung weist als gemeinsames Merkmal die Verabreichung eines oder mehrerer erfindungsgemäßer KIAA0175-Inhibitoren an eine Säugetierzelle auf.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist eine Darstellung von verschiedenen KIAA0175-Zwei-Hybrid-Bait-Konstrukten im LexA-Plasmidvektor pBTM116 und im Gal4BD-Plasmidvektor pAS2-1.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben aufgeführt betrifft die vorliegende Erfindung allgemein die Regulation des Zellzyklus und des Zelltods nach Behandlung mit Mitteln, die eine DNA-Schädigung verursachen. Insbesondere stellt die vorliegend offenbarte Erfindung Inhibitoren von KIAA0175 bereit, einschließlich Antisense-Polynukleotide und Ribozyme, Proteine oder Polypeptide, Anti körper oder Fragmente davon und kleine Moleküle; Zusammensetzungen, die KIAA0175-Inhibitoren umfassen; Verfahren zur Verringerung der Aktivierung und/oder der Genexpression von p53 und/oder p21; Verfahren zur Erhöhung der Chemo- und/oder Bestrahlungssensitivität einer Säugetierzelle, Verfahren zur Verringerung der Nebenwirkungen einer Krebstherapie sowie Verfahren zur Behandlung einer neoplastischen Erkrankung. Jedes dieser Verfahren weist als gemeinsames Merkmal die Verabreichung eines oder mehrerer KIAA0175-Inhibitoren an eine Säugetierzelle auf.
Der p53-Tumorsuppressor ist das am häufigsten mutierte Gen bei humanem Krebs. In normalen Zellen wird p53 unter physiologischen Bedingungen in geringen Mengen mit einer kurzen Halbwertszeit exprimiert. Wenn die Zellen einem beliebigen Stimulus von einer Vielzahl von Stress-induzierenden Stimuli, wie beispielsweise DNA-Schädigung, Hypoxie, Nukleotidmangel, Virusinfektion, Onkogenaktivierung oder Faktoren, die ein Anhalten des Zellzyklus sowie den Zelltod induzieren, ausgesetzt werden, wird p53 stabilisiert und aktiviert. Unter solchen Bedingungen funktioniert p53 als der "Wächter des Genoms", indem es genomische Stabilität herstellt, die durch Einstellen des zellulären Wachstums und der Teilung an einer Vielzahl von Kontrollpunkten des Zellzyklus erreicht wird.
Eukaryonten von der Hefe bis zum Menschen haben Überwachungsmechanismen entwickelt, die auf eine Zell-Schädigung reagieren. In Säugetieren umfasst dieser Überwachungsmechanismus einen Kontrollpunkt, der die Gene von "Ataxia telangiectasia mutated (ATM)", p53 und p21 betrifft und die Zellen in der G1-Phase anhält. Wenn Zellen beispielsweise einer γ-Bestrahlung ausgesetzt werden, wird p53 zu einem aktiven Transkriptionsfaktor, der an der Expression verschiedener Gene teilnimmt (einschließlich p21), die wichtig für die Regulation des Zellzyklus am Kontrollpunkt von der G1 in die S-Phase sind.
El-Deiry, W. S. Cancer Biology 8: 345–357 (1998); Cox, L. S. et al., Bioessays 17: 501 (1995); Sherr, C. J., Science 274: 1672 (1996).
Ataxia telangiectasia (A–T) ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die durch fortschreitende cerebellare Ataxie, neuronale Degeneration, Hypersensitivität gegenüber ionisierender Strahlung (IR) und ein hohes Risiko für Krebs gekennzeichnet ist. Individuen, die von A–T betroffen sind, zeigen eine akute Sensitivität gegenüber ionisierender Bestrahlung und radiomimetischen Chemikalien, und ihre Zellzyklus-Kontrollpunkte werden nach der Behandlung mit diesen Mitteln nicht aktiviert. Sadvitsky, K. et al., Science 268: 1749 (1995). Wenn somit beispielsweise das Überleben der Zellen als ein Endpunkt verwendet wird, sind A–T-Fibroblasten und A–T-Lymphoblasten im Vergleich zu Wildtypkontrollen 3–4 mal empfindlicher gegenüber ionisierender Bestrahlung. Chen, P. C. et al., Nature 274: 484–486 (1978) und Lehman, A. R. et al., in: "Ataxia-Telangiectasia – A Cellular and Molecular Link Between Cancer, Neurophathology and Immune Deficiency," S. 347–353. (Hrsg. Bridges, B. A. und Harnden, D. G., Wiley, N. Y., 1982). Gleichermaßen sind A–T-Zellen auch hypersensitiv gegenüber radiomimetischen Mitteln, wie beispielsweise Neocarcinostatin und Bleomycin.
A–T wird durch einen Defekt im ATM-Gen verursacht, dessen Produkt sowohl mit der post-translationalen Aktivierung als auch mit der erhöhten Expression von P53 in Zusammenhang gebracht wurde. Banin, et al., Science 281: 1674–1677 (1998); Canman, et al., Science 281: 1677–1679 (1998). ATM weist eine mit der Phosphoinositid-3-Kinase verwandte Domäne und eine Wortmanninsensitive Proteinkinaseaktivität auf, Keith, CT. et al., Science 270: 50 (1995) und phosphoryliert p53 in Reaktion auf eine γ-Bestrahlung an einem einzelnen Aminosäurerest, Serin-15. Zellen von Patienten, die von A–T betroffen sind, welche aus dem Fehlen von ATM resultiert, zeigen eine verringerte und verzö gerte Aktivierung von p53 in Reaktion auf eine DNA-Schädigung, wie durch eine verringerte p53-Phosphorylierung angezeigt wird. Kastan, M. B. et al., Cell 71: 587 (1992); Lu, X. et al., Cell 75: 765 (1993); Siliciano, J. D. et al., Genes Dev. 11: 3471 (1997) und Shieh, S.-Y. et al., Cell 91: 325 (1997). Die Mutation von p53 am Serin-15 verringert die Fähigkeit von p53, das Zellwachstum anzuhalten. Fiscella, M. et al., Oncogene 8: 1519 (1993).
In seiner normalen unphosphorylierten Form ist p53 mit dem MDM2-Protein assoziiert, das als negativer Regulator der p53-Stabilität fungiert, indem es dieses der Proteolyse zuführt. Kubbutat, H. H. G. et al., Nature 387: 299–303 (1997); Haupt, Y. et al., Nature 387: 296–299 (1997); und Kubbutat, M. H. G. et al., Mol Cell. Biol. 18: 5690–5698 (1998). Die MDM2-Bindung verdeckt auch die Transaktivierungsdomäne von p53, wodurch p53-abhängige Wirkungen bei der Zellzyklusinhibierung und der Apoptose blockiert werden. Unter Bedingungen von zellulärem Stress, wie beispielsweise bei Anlegen einer γ-Bestrahlung, verringert die Phosphorylierung von Serin-15 die p53-Bindungsaktivität von MDM2, was die MDM2-vermittelte Inhibierung der p53-spezifischen Transkription sowie den Proteosomvermittelte Abbau von p53 verhindert. Aus diesem Grunde ist vorgeschlagen worden, dass die Phosphorylierung von p53 am Serin-15 wichtig für die genomische Stabilität ist. Momand, J. et al., Cell 69: 1237 (1992); Oliner, J. D., et al., Nature 362: 857 (1993); Haupt, Y. et al., Nature 387: 286 (1997); und Kubbutat, M. H. G. et al., Nature 387: 299 (1997).
Das Anhalten des Zellzyklus in der G1-Stufe tritt teilweise durch die Transkriptionsaktivität von p21 auf, einem fest bindenden Inhibitor von Cdks, der den Eintritt in die S-Phase kontrolliert. Elledge, J. et al., Trends Cell Biol. 6: 388 (1996). Es ist gezeigt worden, dass das Fehlen der p21-Aktivität die zelluläre Sensitivität gegenüber ionisieren der Bestrahlung erhöht und den Beginn von Lymphomen in ATM-defizienten Mäusen verzögert. Wang, Y. A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 94: 14590–14595 (1997).
Die Signaltransduktion am Kontrollpunkt wurde ursprünglich in der Hefe Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Weinert, T. A., et al., Science 241: 317 (1988). Zwei Gene, MEC1 und RAD53, sind bei der Kontrolle des Kontrollpunkts in der Hefe wichtig. Mec1 ist ein Mitglied der Phsophatidylinositolkinase-Superfamilie, von dem angenommen wird, dass es als Proteinkinase dient. Rad53 ist eine Proteinkinase, die in Reaktion auf eine DNA-Schädigung phosphoryliert und aktiviert wird. Die Phosphorylierung von Rad53 hängt unter anderem von Mec1 ab, was darauf verweist, dass Rad53 stromabwärts von Mec1 funktioniert, um das Signal der DNA-Schädigung zu transduzieren.
Als eigentliches Säugetier-Homolog zu Rad53 aus Saccharomyces cerevisiae ist die den Zellzyklus regulierende Protein-Chk2-Kinase identifiziert worden. Matsuoka, S. et al., Science 282: 1893–1897 (1998). Als Teil der vorliegenden Erfindung ist herausgefunden worden, dass Rad53 darüber hinaus homolog zu einer cDNA-Sequenz ist, die als erstes von Nagase, T. et al. identifiziert worden ist, und die als KIAA0175 bezeichnet wird. DNA Research 3: 17–24 (1996). Diese Autoren haben beobachtet, dass KIAA0175 eine Region enthält, die eine Homologie zu der Familie von Serin-Threonin-Proteinkinasen aufweist, insbesondere zu der p69Eg3-Proteinkinase von Xenopus laevis.
Vorliegend wird gezeigt, dass das KIAA0175-Gen in einer Vielzahl von Geweben exprimiert wird, einschließlich im Hoden, Thymus, Kolon, Plazenta und Milz. KIAA0175 wird darüber hinaus in mehreren Krebszelllinien exprimiert, wie beispielsweise in MOLT-4-, HeLa-, S3-, K562-, SW480-, HL-60- und Raji-Zellen. Siehe Beispiel 1 und 1A–C.
Die vorliegende Erfindung offenbart ferner, dass das Proteinprodukt des KIAA0175-Gens eine Autophosphorylierungsaktivität aufweist, deren Aktivität unter anderem von einem Lysinrest an der Aminosäureposition 40 abhängt. Somit exprimieren beispielsweise COS7-Zellen, die mit einem Plasmidkonstrukt transfiziert sind, welches einen KIAA0175-Wildtyp mit HA-Anhang oder mit einer Substitution an Position 40 von Lysin zu Alanin (d. h. K40A) aufweisen, das KIAA0175-Protein, wobei jedoch lediglich das Wildtypprotein die Autophosphorylierungsaktivität beibehält, wie durch Einbau von ³²P festgestellt wurde, wenn immunpräzipitiertes Protein in Gegenwart von γ-³²P-ATP inkubiert wird. Siehe Beispiel 2, 2A-B. Es wird ferner beobachtet, dass nach einer Behandlung der Zellen entweder mit γ-Bestrahlung oder mit Hydroxyharnstoff die Mengen sowohl des endogen exprimierten als auch des rekombinanten KIAA0175-Proteins ansteigen. Siehe 3 und 4.
Bestrahlungssensitivierungsmittel
Zellen, die defizient in Bezug auf ATM sowie in Bezug auf andere Mitglieder der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Familie sind, und die an der Regulation von Zellzyklus-Kontrollpunkten beteiligt sind, welche von einer DNA-Schädigung abhängen, wie beispielsweise ART und DNA-PK, zeigen eine Hypersensitivität gegenüber ionisierender Bestrahlung und anderen DNA-schädigenden Mitteln. Es ist vorgeschlagen worden, dass Inhibitoren von einer oder mehrerer dieser Kinasen die zytotoxischen Wirkungen von ionisierender Bestrahlung oder von DNA-schädigenden Krebs-Chemotherapie-Mitteln durch Sensitivierung der Zellen gegen diese Mittel verstärken könnten. Sarkaria, J. N. et al., Cancer Res. 58: 4375–4382 (1998) und Hosoi, Y. et al., Int. J. Cancer 78: 642–647 (1998). Dieser Vorschlag wird durch die Beobachtung gestützt, dass der Sterol-ähnliche fungale Metabolit Wortmannin ein wirksames Bestrahlungssensi tivierungsmittel ist. Chernikova, S. B. et al., Rad. Res. 151: 159–166 (1999); Boulton, S. et al., Carcinogenesis (Lond.) 17: 2285–2290 (1996); Price, B. D. et al., Cancer Res. 56: 246–250 (1996); und Rosenzweig, K. E. et al., Clin. Cancer Res. 3: 1149–1156 (1997). Wortmannin inhibiert irreversibel die Lipidkinaseaktivitäten von Säugetier-PI-3Ks durch kovalente Modifikation eines entscheidenden Lysinrests in deren Phosphotransferasedomänen. Powis, G. et al., Cancer Res. 54: 2419–2423 (1994) und Wymann, M. P. et el., Mol. Cell. Biol. 16: 1722–1733 (1996).
Herkömmlichere Bestrahlungssensitivierungsmittel, wie beispielsweise 5-Fluoruracil verstärken entweder das Ausmaß der anfänglichen DNA-Schädigung, die durch die Bestrahlung verursacht wird, oder sie behindern die Reparatur von strahlungsinduzierten DNA-Läsionen, indem sie Enzyme inhibieren, die am DNA-Metabolismus, an der DNA-Synthese und an der DNA-Reparatur beteiligt sind. Sarkaria, et al., siehe oben. Die innewohnende Zytotoxizität, die mit der Verabreichung solcher Mittel assoziiert ist, schränkt ihre klinische Verwertbarkeit als Sensitivierungsmittel für die Bestrahlung und Chemotherapie ein. Gleichermaßen könnten die Risiken, die mit herkömmlichen Bestrahlungssensitivierungsmitteln und Chemotherapiesensitivierungsmitteln assoziiert sind, auch auf die Verwendung von Wortmannin zutreffen, weil Wortmannin nicht-spezifisch durch Inhibierung eines breiten Bereichs von PI3K-verwandten Proteinen funktioniert. Benötigt werden in hohem Maße spezifische Inhibitoren eines Proteins, das mit dem Signalweg einer DNA-Schädigung assoziiert ist und an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Erfordernis, indem spezifische Inhibitoren der Genexpression und/oder der biologischen Aktivität von KIAA0175 bereitgestellt werden. Solche Inhibitoren verhindern das Anhalten des Zellzyklus und vermeiden die notwendige DNA-Reparatur, wodurch die Zellen für die Zytotoxizität von DNA-schädigenden Mitteln, wie beispielsweise ionisierender Bestrahlung, verletzlich bleiben.
Inhibitoren von KIAA0175 sind wirksam bei der Verringerung der Genexpression von KIAA0175, p53 und p21
Die vorliegende Erfindung stellt Inhibitoren von KIAA0175 bereit. Die erfindungsgemäßen Inhibitoren umfassen Antisense-Moleküle und Ribozyme, Proteine oder Polypeptide, Antikörper oder Fragmente davon sowie kleine Moleküle. Alle diese KIAA0175-Inhibitoren weisen als gemeinsames Merkmal auf, dass sie die Expression und/oder die biologische Aktivität von KIAA0175 verringern und demgemäß die Expression und/oder Aktivierung von p53 und/oder p21 vermindern. Neben den vorliegend offenbarten, beispielhaften KIAA0175-Inhibitoren können alternative Inhibitoren durch Routineexperimente erhalten werden, bei denen Methoden eingesetzt werden, die entweder vorliegend spezifisch beschrieben werden oder auf andere Weise für den Fachmann problemlos verfügbar sind und im Bereich seines Könnens liegen.
Antisense-Moleküle und Ribozyme
Wie oben diskutiert ist, umfassen die KIAA0175-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung Antisense-Moleküle, die – wenn sie in Säugetierzellen verabreicht werden – wirksam bei der Verringerung, z. B. der intrazellulären Proteinmengen von p53 und/oder p21 sind. Antisense-Moleküle binden in sequenzspezifischer Weise an Nukleinsäuren, wie beispielsweise mRNA oder DNA. Wenn Antisense-Moleküle an mRNA gebunden haben, die komplementäre Sequenzen aufweist, verhindern sie die Translation der mRNA (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,168,053 von Altman et al.; US-Patent Nr. 5,190,931 von Inouye, US-Patent Nr. 5,135,917 von Burch; US-Patent Nr. 5,087,617 von Smith, und Clusel et al. Nucl. Acids Res. 21: 3405–3411 (1993), die hantelförmige Antisense-Oligonukleotide beschreiben).
Die Antisense-Technologie kann verwendet werden, um die Genexpression durch Triple-Helixbildung zu kontrollieren, die die Fähigkeit der Doppelhelix fördert, sich in genügendem Maße für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen zu öffnen. Siehe Gee et al., in Huber and Carr, "Molecular and Immunologie Approaches", Futura Publishing Co. (Mt. Kisco, NY; 1994). Alternativ dazu kann ein Antisense-Molekül so gestaltet sein, dass es mit einer Kontrollregion aus dem KIAA0175-Gen, z. B. mit einem Promotor, Enhancer oder mit einer Transkriptionsinitiationsstelle, hybridisiert und die Transkription des Gens blockiert; oder die Translation blockiert, indem die Bindung eines Transkripts an die Ribosomen inhibiert wird. Siehe im Allgemeinen Hirashima et al. in Molecular Biology of RNA: New Perspectives (M. Inouye und B. S. Dudock, Hrsg., 1987 Academic Press, San Diego, S. 401); Oligonucleotides: Anti-sense Inhibitors of Gene Expression (J. S. Cohen, Hrsg., 1989 MacMillan Press, London); Stein und Cheng, Science 261: 1004–1012 (1993); WO 95/10607 ; US-Patent Nr. 5,359,051 ; WO 92/06693 und EP-A2-612 844 , von dem jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist.
Derartige Moleküle werden so konstruiert, dass sie zu einer Region der transkribierten KIAA0175-mRNA-Sequenz komplementär sind und somit in der Lage sind, mit dieser Watson-Crick-Basenpaare auszubilden. Die resultierende doppelsträngige Nukleinsäure stört die weitere Prozessierung der mRNA, wodurch die Proteinsynthese verhindert wird.
Im Allgemeinen kann ein Teil einer Sequenz, die komplementär zu der kodierenden Region von KIAA0175 ist, verwendet werden, um die Genexpression zu modulieren. Die Nukleinsäuresequenz der humanen cDNA von KIAA0175 wird in Nagase, T. et al., DNA Research 3: 17–24 (1996) beschrieben, das vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist, und sie wird darüber hinaus vorliegend als SEQ ID NO: 9 gezeigt. Alternativ dazu können DNA-Konstrukte, die in Antisense-RNA transkribiert werden können, in Zellen oder Gewebe eingebracht werden, um die Herstellung von Antisense-RNA zu ermöglichen. Somit umfasst der Begriff "Antisense-Moleküle" wie vorliegend verwendet im weiten Sinne Antisense-Oligonukleotide, die entweder als DNA- oder RNA-Moleküle synthetisiert wurden, sowie alle Plasmidkonstrukte, die bei Einbringung in eine Säugetierzelle die Produktion von Antisense-RNA-Molekülen fördern. Ein Antisense-Molekül kann wie vorliegend beschrieben verwendet werden, um die Expression des KIAA0175-, p53- oder p21-Gens zu inhibieren, sowie die von anderen Genen, welche KIAA0175 für ihre Expression benötigen.
Antisense-Moleküle zur vorliegend beschriebenen Verwendung können durch beliebige, dem Fachmann bekannte Verfahren synthetisiert werden, einschließlich chemische Synthese, z. B. chemische Festphasen-Synthese mit Phosphoramidit. Siehe beispielsweise WO 93/01286 ; US-Patent Nr. 6,043,090 ; US-Patent Nr. 5,218,088 ; US-Patent Nr. 5,175,269 und US-Patent Nr. 5,109,124 , von denen jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist. Alternativ dazu können RNA-Molekül durch in vitro- oder in vivo-Transkription von DNA-Sequenzen erzeugt werden, welche für die cDNA von KIAA0175 oder für einen Teil davon kodieren, vorausgesetzt, dass die DNA stromabwärts von einem geeigneten RNA-Polymerasepromotor (wie beispielsweise T3, T7 oder SP6) in einen Vektor eingebaut wird. Große Mengen von Antisense-RNA können hergestellt werden, indem markierte Nukleotide mit einem linearisierten KIAA0175-cDNA-Fragment stromabwärts von einem solchen Promotor in Gegenwart der geeigneten RNA-Polymerase inkubiert werden. Solche Antisense-Moleküle sind vorzugsweise mindestens 16, 18 oder 20 Nukleotide lang, oder weisen eine Länge auf, die zwischen diesen Werten liegt. Stärker bevorzugt ist es, dass die Antisense- Moleküle mindestens 25 Nukleotide lang sind. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt Antisense-Moleküle bereit, die mindestens 30, 40, 50 oder 75 Nukleotide lang sind, sowie solche mit einer Länge, die zwischen den genannten Werten liegt. In einigen Ausführungsformen wird das Antisense-Molekül der vorliegenden Erfindung eine Sequenz umfassen, die einzigartig für die KIAA0175-cDNA-Sequenz von SEQ ID NO: 9 ist, oder die unter Bedingungen hoher Stringenz an die cDNA von SEQ ID NO: 9 hybridisieren kann. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet hohe Stringenz Standardhybridisierungsbedingungen, wie beispielsweise 5 × SSPE, 0,5% SDS bei 65°C oder das Äquivalent davon. Siehe Sambrook et al., siehe oben, und Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, siehe oben, die vorliegend durch Verweis eingeschlossen sind.
Antisense-Oligonukleotide werden üblicherweise so erstellt, dass sie einem Abbau durch endogene nukleolytische Enzymen widerstehen können, wobei Bindungen wie die folgenden verwendet werden: Phosphorthioat, Methylphosphonat, Sulfon, Sulfat, Ketyl, Phosphordithioat, Phosphoramidat, Phosphatestern und andere derartige Bindungen, siehe beispielsweise Agrwal et al., Tetrahedron Lett. 28: 3539–3542 (1987); Miller et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 6657–6665 (1971); Stec et al., Tetrahedron Lett. 26: 2191–2194 (1985); Moody et al., Nucl. Acids Res. 12: 4769–4782 (1989); Uznanski et al., Nucl. Acids Res. 17(12): 4863–4871 (1989); Letsinger et al., Tetrahedron 40: 137–143 (1984); Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 54: 367–402 (1985); Eckstein, Trends Biol. Sci. 14: 97–100 (1989); Stein, in: Oligodeoxynucleotides. Anti-sense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Hrsg., Macmillan Press, London, S. 97–117 (1989); Jager et al., Biochemistry 27: 7237–7246 (1988)). Mögliche zusätzliche oder alternative Modifikationen umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) das Zufügen von flankierenden Sequenzen am 5'-Ende und/oder 3'-Ende und/oder das Einbeziehen von nicht herkömmlichen Basen, wie beispielsweise Inosin, Queosin und Wybutosin, sowie auch von Acetyl-, Methyl-, Thio- und anderen modifizierten Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin.
Gemäß anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die KIAA0175-Inhibitoren Ribozyme sein. Ein Ribozym ist ein RNA-Molekül, das spezifisch RNA-Substrate, wie beispielsweise mRNA spaltet, was zur spezifischen Inhibierung oder Störung der zellulären Genexpression führt. Wie vorliegend verwendet umfasst der Begriff "Ribozyme" RNA-Moleküle, die Antisense-Sequenzen für die spezifische Erkennung und eine RNA-spaltende Enzymaktivität umfassen. Der katalytische Strang spaltet eine spezifische Stelle der Ziel-RNA bei einer Konzentration, die größer ist als die stöchiometrische Konzentration.
Eine große Vielzahl von Ribozymen kann im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich z. B. das Hammerkopf-Ribozym (wie beispielsweise von Forster und Symons, Cell 48: 211–220 (1987); Haseloff und Gerlach, Nature 328: 596–600 (1988); Walbot und Bruening, Nature 334: 196 (1988); Haseloff und Gerlach, Nature 334: 585 (1988) beschrieben); das Haarnadelschleifen-Ribozym (wie beispielsweise von Haseloff et al., US-Patent Nr. 5,254,678 , beschrieben, das am 19. Oktober 1993 erteilt wurde, und von Hempel et al., Europäische Patentveröffentlichung 0 360 57 , die am 26 März 1990 veröffentlicht wurde); sowie Ribozyme, die auf ribosomaler RNA von Tetrahymena basieren (siehe Cech et al., US-Patent Nr. 4,987,071 ). Die Ribozyme der vorliegenden Erfindung bestehen üblicherweise aus RNA, sie können jedoch aus DNA, Nukleinsäureanalogen (z. B. Phosphorthioaten) oder Chimären davon (z. B. DNA/RNA/RNA) zusammengesetzt sein.
Ribozyme können auf ein beliebiges RNA-Transkript abzielen, und sie können solche Transkripte katalytisch spalten (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,272,262 ; US-Patent Nr. 5,144,019 ; und US-Patent Nrn. 5,168,053 , 5,180,818 , 5,116,742 und 5,093,246 von Cech et al.). Nach bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann ein beliebiges für KIAA0175-mRNA spezifisches Ribozym oder eine Nukleinsäure, die für ein solches Ribozym kodiert, an eine Wirtszelle bereitgestellt werden um die Inhibierung der KIAA0175-Genexpression zu bewirken. Ribozyme und ähnliche Moleküle können daher mittels DNA, die für das Ribozym kodiert und an einen eukaryontischen Promotor geknüpft ist, wie beispielsweise an einen eukaryontischen Viruspromotor, an die Wirtszellen bereitgestellt werden, so dass bei Einbringung in den Kern das Ribozym direkt transkribiert wird.
Proteine und Polypeptide
Neben den Antisense-Molekülen und den Ribozymen, die vorliegend oben offenbart werden, umfassen die KIAA0175-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung ferner Proteine und Polypeptide, die entweder bei der Verringerung der KIAA0175-Genexpression oder bei der Verringerung einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten von KIAA0175 wirksam sind. Eine Vielzahl von Verfahren, mit denen der Fachmann durch Routineexperimente solche KIAA0175-Inhibitoren schnell identifizieren kann, sind problemlos im Stand der Technik verfügbar. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die nachfolgenden exemplarischen Methoden beschränkt.
Wie oben diskutiert wurde, ist KIAA0175 eine aktive Proteinkinase, die eine Autophosphorylierungsaktivität besitzt. Die Inhibitoren der biologischen Aktivität von KIAA0175 umfassen solche Proteine und/oder Polypeptide, die mit der Kinaseaktivität von KIAA0175 interferieren. Eine solche Interferenz kann durch direkte Interaktion mit der Kinasedomäne von KIAA0175 auftreten oder indirekt durch nicht-kompetitive oder unkompetitive Inhibierung, wie beispielsweise durch Bindung an eine allosterische Stelle. Demgemäß können verfügbare Verfahren zur Identifizierung von Proteinen und/oder Polypeptiden, die an KIAA0175 binden, eingesetzt werden, um Leitverbindungen zu identifizieren, welche mittels der vorliegend beschriebenen Verfahren (siehe nachstehend) hinsichtlich ihrer inhibitorischen Aktivität für KIAA0175 und/oder hinsichtlich ihrer Wirksamkeit als Bestrahlungssensitivierungsmittel charakterisiert werden können.
Es ist für den Fachmann umfassende Literatur verfügbar, die Verfahren zum Nachweis und zur Analyse von Protein-Protein-Interaktionen beschreibt. Zusammengefasst in Phizicky, E. M. et al., Microbiological Reviews 59: 94–123 (1995), das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Solche Verfahren umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) physikalische Verfahren, wie beispielsweise Proteinaffinitätschromatographie, Affinitätsblot, Immunpräzipitation und Quervernetzung sowie Verfahren, die auf einer Bibliothek basieren, wie beispielsweise Protein-Probing, Phagendisplay und Zwei-Hybrid-Screening. Andere Verfahren, die eingesetzt werden können, um Protein-Protein-Interaktionen zu identifizieren, umfassen genetische Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung von extragenischen Suppressoren, synthetischen letalen Wirkungen und unverknüpfter Nicht-Komplementierung. Beispielhafte Verfahren werden nachfolgend ausführlicher beschrieben.
Erfindungsgemäße KIAA0175-Inhibitoren können durch biologische Screeningassays identifiziert werden, die auf einer direkten Interaktion zwischen dem KIAA0175-Protein und einer Gruppe oder einer Bibliothek von potentiellen Inhibitorproteinen basieren. Biologische Screeningverfahren, einschließlich der verschiedenen "n-Hybrid-Methoden" werden beispielsweise in Vi dal, M. et al., Nucl. Acids Res. 27(4): 919–929 (1999); Frederickson, R. M., Curr. Opin. Biotechnol. 9(1): 90–6 (1998); Brachmann, R. K. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8(5): 561–568 (1997); und White, M. A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 10001–10003 (1996) beschrieben, von denen jedes durch Bezugnahme vorliegend eingeschlossen ist.
Das Zwei-Hybrid-Screeningverfahren kann eingesetzt werden, um neue oder existierende Ziel-cDNA-Bibliotheken nach KIAA0175-bindenden Proteine zu durchsuchen, die inhibitorische Eigenschaften aufweisen. Das Zwei-Hybrid-System ist ein genetisches Verfahren, das Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Erhöhung der Transkription von Reportergenen nachweist. Das System basiert auf der Tatsache, dass ortsspezifische Transkriptionsaktivatoren eine DNA-bindende Domäne und eine Transkriptionsaktivierungsdomäne aufweisen. Die DNA-bindende Domäne bringt die Aktivierungsdomäne gezielt zu den spezifisch zu exprimierenden Genen. Aufgrund der modularen Art der Transkriptionsaktivatoren kann die DNA-bindende Domäne kovalent von der Transkriptionsaktivierungsdomäne getrennt sein, ohne dass es zu einem Verlust der Aktivität bei einer der Domänen kommt. Darüber hinaus können diese zwei Domänen durch Protein-Protein-Kontakte zwischen zwei Proteinen, die nicht mit der Transkriptionsmaschinerie verwandt sind, nebeneinander angeordnet werden. Somit werden zwei Hybride konstruiert, um ein funktionierendes System zu erzeugen. Das erste Hybrid, d. h. das Bait, besteht aus einer DNA-bindenden Domäne eines Transkriptionsaktivators, die an ein Protein von Interesse fusioniert ist. Das zweite Hybrid, das Ziel, wird durch Fusion einer Transkriptionsaktivierungsdomäne mit einer Bibliothek aus Proteinen oder Polypeptiden erzeugt. Die Interaktion zwischen dem Bait-Protein und einem Mitglied der Zielbibliothek führt zur Anordnung der DNA-bindenden Domäne und der Transkriptionsaktivierungsdomäne nebeneinander und somit zur Hochregulierung der Reportergenexpression.
Eine Vielzahl von Systemen, die auf zwei Hybriden basieren, sind für den Fachmann verfügbar, und sie werden üblicherweise entweder die Hefe-Gal4- oder die E. coli-LexA-DNA-Bindungsdomäne (BD) und die Hefe-Gal4- oder die Herpes simplex-Virus VP16-Transkriptionsaktivierungsdomäne umfassen. Chien, C.-T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9578–9582 (1991); Dalton, S. et al., Cell 68: 597–612 (1992); Durfee, T. K. et al., Genes Dev. 7: 555–569 (1993); Vojtek, A. B. et al., Cell 74: 205–214 (1993); und Zervos, A. S. et al., Cell 72: 223–232 (1993). Herkömmlich verwendete Reportergene umfassen das E. coli-lacZ-Gen sowie selektierbare Hefegene, wie beispielsweise HIS3 und LEU2. Fields, S. et al., Nature (London) 340: 245–246 (1989); Durfee, T. K., oben; und Zervos, A. S., oben. Eine große Vielzahl von Aktivierungsdomänen-Bibliotheken sind im Stand der Technik problemlos verfügbar, so dass das Screening nach interagierenden Proteinen durch Routineexperimente erzielt werden kann.
Geeignete Bait-Proteine für die Identifizierung von Proteinen, die mit KIAA0175 interagieren, können auf Basis der cDNA-Sequenz von KIAA0175, die vorliegende als SEQ ID NO: 9 gezeigt ist, erstellt werden. Solche Bait-Proteine umfassen entweder das KIAA0175-Protein vollständiger Länge oder Fragmente davon. Beispielsweise könnte es beim Screening nach Inhibitoren, die die Autophosphorylierungsaktivität von KIAA0175 blockieren, vorteilhaft sein, Bait-Proteine zu konstruieren, die Lysin-40 umfassen und Aminosäuren, die diesen Rest flankieren und die Kinase-Domäne des Proteins umfassen. Beispielhafte KIAA0175-Bait-Proteine, die entweder als LexA oder als Gal4BD exprimiert werden, sind in 10 gezeigt. Repräsentative Bait-Konstrukte umfassen die für die Kinase-Domäne von KIAA0175 kodierende Region (z. B. die LexA-Konstrukte 1, 8 und 61 sowie die Gal4BD-Konstrukte 24, 29 und 37). Darüber hinaus enthalten die LexA-Konstrukte 44 und 54 sowie die Gal4BD-Konstrukte 27 und 33 jeweils die einzelne Aminosäuresubstitution innerhalb der Kinase-Domäne bei K40A. 10 zeigt ferner alternative Bait-Konstrukte, die für KIAA0175-Polypeptidfragmente außerhalb der Kinase-Domäne kodieren (z. B. die LexA-Konstrukte 14 und 19 sowie die Gal4BD-Konstrukte 36 und 42).
Plasmidvektoren, wie beispielsweise pBTM116 und pAS2-1, für die Herstellung von KIAA0175-Bait-Konstrukten und Zielbibliotheken sind für den Fachmann problemlos verfügbar und können durch kommerzielle Bezugsquellen, wie beispielsweise von Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen (Carlsbad, CA) und Stratagene (La Jolla, CA), erhalten werden. Diese Plasmidvektoren erlauben die Fusion von cDNAs in einem Leserahmen mit den DNA-Bindungsdomänen wie LexA bzw. Gal4BD.
Die KIAA0175-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung können alternativ durch eines der physikalischen oder biochemischen Verfahren identifiziert werden, die im Stand der Technik zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen verfügbar sind.
Leitverbindungen, die als potentielle KIAA0175-Inhibitoren getestet werden sollen, können durch Proteinaffinitätschromatographieverfahren anhand ihrer spezifischen Retention an KIAA0175 identifiziert werden, wenn sie entweder kovalent oder nicht-kovalent an eine feste Matrix gekoppelt werden, wie beispielsweise an Sepharose-Beads. Die Herstellung von Protein-Affinitätssäulen wird beispielsweise in Beeckmans, S. et el., Eur. J. Biochem. 117: 527–535 (1981) und in Formosa, T. et al., Methods Enzymol 208: 24–45 (1991) beschrieben. Zelllysate, die die vollständige Anzahl an zellulären Proteinen enthalten, können durch die KIAA0175-Affinitätssäule geleitet werden. Proteine mit einer hohen Affinität für KIAA0175 werden spezifisch unter Niedrigsalzbedingungen zurückgehalten werden, wohingegen der Hauptteil der zellulären Proteine durch die Säule fließen wird. Solche Proteine mit hoher Affinität können von dem immobilisierten KIAA0175 unter Bedingungen hoher Salzkonzentration, mit chaotropischen Lösungsmitteln oder mit Natriumdodecylsulfat (SDS) eluiert werden. In einigen Ausführungsformen könnte es bevorzugt sein, die Zellen vor der Herstellung des Lysats radioaktiv zu markieren, um bei der Identifizierung von spezifisch an KIAA0175 bindenden Proteinen behilflich zu sein. Verfahren zur radioaktiven Markierung von Säugetierzellen sind im Stand der Technik bekannt und werden beispielsweise in Sopta, M. et al., J. Biol. Chem. 260: 10353–10360 (1985) beschrieben.
Geeignete KIAA0175-Proteine für die Affinitätschromatographie können an ein Protein oder an ein Polypeptid fusioniert werden, um eine schnelle Aufreinigung auf einer geeigneten Affinitätssäule zu ermöglichen. Beispielsweise kann die cDNA von KIAA0175 an die für eine Glutathion-S-Transferase (GST) kodierende Region fusioniert werden, was die Adsorption von Fusionsproteinen an Glutathion-Agarosesäulen ermöglicht. Smith et al., Gene 67: 31–40 (1988). Alternativ dazu können Fusionsproteine Protein A umfassen, das auf Säulen gereinigt werden kann, die Immunglobulin G umfassen; Oligohistidin-enthaltende Peptide, die auf Säulen gereinigt werden können, welche Nickel²⁺ enthalten; das Maltose-bindende Protein, das auf Säulen gereinigt werden kann, die Amylose enthalten; und die Dihydrofolatreduktase, das auf Methotrexat-Säulen gereinigt werden. Ein beispielhafter Anhang (tag) für die Herstellung von KIAA0175-Fusionsproteinen, der vorliegend beschrieben wird, ist das Epitop für das Influenzavirus-Hämagglutinin (HA), gegen das problemlos monoklonale Antikörper verfügbar sind, wobei mit diesen Antikörpern eine Affinitätssäule erstellt werden kann.
In denjenigen Fällen, in denen Kandidaten-KIAA0175-Inhibitoren gegen die Kinase-Domäne von KIAA0175 gerichtet sind, könnte es vorteilhaft sein, das KIAA0175-Protein vor Herstellung der Af finitätssäule zu phosphorylieren. Wie in Beispiel 2 gezeigt wird, kann KIAA0175 phosphoryliert werden, wenn es auf einer festen Oberfläche immobilisiert ist. Geeignete Phosphorylierungsbedingungen umfassen 10 μM ATP, 1 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂ und 50 mM Tris, pH 7,5.
Proteine, die spezifisch auf einer KIAA0175-Affinitätssäule zurückgehalten werden, können identifiziert werden, nachdem diese einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) unterworfen wurden. Wenn die Zellen vor Herstellung der Zelllysate und Durchleiten durch die KIAA0175-Affinitätssäule radioaktiv markiert werden, können Proteine mit hoher Affinität für KIAA0175 somit autoradiographisch nachgewiesen werden. Die Identität von KIAA0175-spezifischen Bindungsproteinen kann durch Proteinsequenzierungsmethoden, die für den Fachmann verfügbar sind, bestimmt werden, siehe beispielsweise Mathews, C. K. et al., Biochemistry, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. S. 166–170 (1990).
Antikörper und Antikörperfragmente
Die KIAA0175-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung umfassen Antikörper und/oder Antikörperfragmente, die bei der Verringerung der Genexpression und/oder der biologischen Aktivität von KIAA0175 wirksam sind. Geeignete Antikörper können monoklonale, polyklonale oder humanisierte monoklonale Antikörper sein. Antikörper können durch herkömmliche, auf Hybridomen basierende Verfahren erhalten werden, ausgehend von Antiseren, die von Tieren erhalten wurden, welche mit KIAA0175 inokuliert wurden, oder sie können durch rekombinante DNA-Verfahren erhalten werden. Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperfragmente in vitro durch Verwendung einer oder mehrerer problemlos verfügbarer Phagendisplay-Bibliotheken identifiziert werden. Beispielhafte Verfahren werden vorliegend offenbart.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die KIAA0175-Inhibitoren monoklonale Antikörper, die wie folgt erzeugt werden können. Ein KIAA0175-Protein kann beispielsweise durch Expression von KIAA0175-cDNA in einem System exprimiert, das auf einem Baculovirus basiert. Durch dieses Verfahren wird eine KIAA0175-cDNA oder ein Fragment davon in einen geeigneten Plasmidvektor ligiert, der nachfolgend dazu verwendet wird, Sf9-Zellen zu transfizieren, um eine Proteinproduktion zu ermöglichen. Darüber hinaus könnte es vorteilhaft sein, einen Epitop-Anhang (epitope tag) oder einen anderen Rest einzubauen, um eine Affinitätsaufreinigung des KIAA0175-Proteins zu ermöglichen. Klone von Sf9-Zellen, die KIAA0175 exprimieren, werden beispielsweise durch Enzym-gebundenen Immunabsorbant-Assay (ELISA) identifiziert, es werden Lysate hergestellt, und das KIAA0175-Protein wird durch Affinitätschromatographie gereinigt, und das gereinigte Protein wird intraperitoneal in BALB/c-Mäuse injiziert, um eine Antikörperproduktion zu induzieren. Es könnte vorteilhaft sein, ein Adjuvans wie beispielsweise Freund-Adjuvans zuzufügen, um die resultierende Immunantwort zu verstärken.
Serum wird im Hinblick auf die Produktion spezifischer Antikörper untersucht, und Milzzellen von Tieren mit einem positiven, spezifischen Antikörpertiter werden für Zellfusionen mit Myelomzellen verwendet, um Hybridom-Klone zu erzeugen. Überstände, die von Hybridom-Klonen erhalten wurden, werden auf das Vorhandensein von monoklonalen Antikörpern untersucht, die eine Spezifität gegen KIAA0175 aufweisen. Für eine allgemeine Beschreibung von Verfahren mit monoklonalen Antikörpern, siehe beispielsweise Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).
Neben dem Baculovirus-Expressionsystem können andere geeignete Bakterien- und Hefe-Expressionssysteme für die Expression von KIAA0175-Protein oder Polypeptiden davon verwendet werden. Wie beim Baculovirussystem kann es vorteilhaft sein, ein oder mehrere verfügbare Affinitätsanhänge (affinity tags) zu verwenden, um die Reinigung vor Inokulierung der Tiere zu ermöglichen. Folglich kann die cDNA von KIAA0175 oder ein Fragment davon isoliert werden (beispielsweise durch Agarosegelaufreinigung) und in einen Leserahmen mit einem geeigneten Anhang-Protein (tag protein), wie beispielsweise mit 6-His, Glutathion-S-Transferase (GST) oder mit einem anderen problemlos verfügbaren Affinitäts-Anhang, ligiert werden. Siehe beispielsweise Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press S. 160–161 (Hrsg. Glick, B. R. und Pasternak, JJ. 1998).
In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die KIAA0175-Inhibitoren humanisierte, monoklonale Anti-KIAA0175-Antikörper. Der Begriff "humanisierter Antikörper" bezeichnet einen Antikörper, der von einem nicht-humanen Antikörper abgeleitet ist, üblicherweise von einem monoklonalen Antikörper der Maus. Alternativ dazu kann ein humanisierter Antikörper von einem Chimären Antikörper abgeleitet sein, der die Antigen-bindenden Eigenschaften des parentalen, nicht-humanen Antikörpers beibehält oder im Wesentlichen beibehält, jedoch bei Verabreichung an Menschen eine verringerte Immunogenität im Vergleich zum parentalen Antikörper zeigt. Der Begriff "chimärer Antikörper" bezeichnet wie vorliegend verwendet einen Antikörper, der Sequenzen enthält, die von zwei verschiedenen Antikörpern abgeleitet sind (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4,816,567 ), welche üblicherweise von verschiedenen Spezies stammen. Üblicherweise umfassen chimäre Antikörper humane und murine Antikörperfragmente, im Allgemeinen humane konstante Regionen und variable Regionen der Maus.
Da humanisierte Antikörper in Menschen sehr viel weniger immunogen sind als die parentalen monoklonalen Antikörper der Maus, können sie bei der Behandlung von Menschen mit einem sehr viel geringeren Risiko für eine Anaphylaxie eingesetzt werden. Somit können diese Antikörper für therapeutische Anwendungen bevorzugt werden, die eine in vivo-Verabreichung an einen Menschen umfassen, wie beispielsweise die Verwendung als Bestrahlungssensitivierungsmittel für die Behandlung einer neoplastischen Erkrankung oder zur Verwendung in Verfahren zur Verringerung von Nebenwirkungen, z. B. der Krebstherapie.
Humanisierte Antikörper können durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden, beispielsweise: (1) "Grafting" der nicht-humanen komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) auf eine humanes Gerüstregion und konstante Region (ein Verfahren das im Stand der Technik als "Humanisieren" bezeichnet wird), oder alternativ dazu (2) Transplantieren der gesamten nicht-humanen variablen Domänen, wobei diese jedoch mit einer humanähnlichen Oberfläche "verhüllt" werden, indem die Reste der Oberfläche ausgetauscht werden (ein Verfahren, das im Stand der Technik als "Veneering" bezeichnet wird). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden humanisierte Antikörper sowohl "humanisierte" als auch "durch Veneering hergestellte" Antikörper umfassen. Diese Verfahren sind beispielsweise in Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A., 81: 6851–6855 (1984); Morrison und Oi, Adv. Immunol., 44: 65–92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239: 1534–1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28: 489–498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3): 169–217 (1994); und Kettleborough, CA. et al., Protein Eng. 4(7): 773–83 (1991) offenbart, von denen jedes vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist.
Der Begriff "komplementaritätsbestimmende Region" bezeichnet Aminosäuresequenzen, die gemeinsam die Bindungsaffinität und Bindungsspezifität der natürlichen Fv-Region einer nativen Immunglobulinbindungsstelle definieren. Siehe beispielsweise Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901–917 (1987); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services NIH Publication Nr. 91-3242 (1991). Der Begriff "konstante Region" bezeichnet den Teil des Antikörpermoleküls, der die Effektorfunktionen verleiht. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die konstanten Regionen der Maus durch die konstanten Regionen des Menschen ausgetauscht. Die konstanten Regionen der vorliegenden humanisierten Antikörper werden von humanen Immunglobulinen abgeleitet. Die konstante Region der schweren Kette kann ausgewählt sein aus einem beliebigen der fünf Isotypen: alpha, delta, epsilon, gamma oder mu.
Ein Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern umfasst das Alignment von nicht-humanen Sequenzen der schweren und leichten Kette mit humanen Sequenzen der schweren und leichten Kette, Auswählen und Ersetzen des nicht-humanen Gerüsts gegen ein humanes Gerüst auf Basis dieses Alignments, molekulares Modeling, um die Konformation der humanisierten Sequenz vorauszusagen, und Vergleich mit der Konformation des parentalen Antikörpers. Diesem Verfahren folgen wiederholte Rückmutationen von Resten in der CDR-Region, welche die Struktur der CDRs stören, bis die vorhergesagte Konformation des humanisierten Sequenzmodells möglichst genau der Konformation der nicht-humanen CDRs auf dem parentalen nicht-humanen Antikörper entspricht. Solche humanisierten Antikörper können ferner derivatisiert werden, um die Aufnahme und die Ausscheidung zu ermöglichen, beispielsweise mittels Ashwell-Rezeptoren. Siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 5,530,101 und 5,585,089 , wobei die Patente vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Es wird verständlich sein, dass alternative KIAA0175-Inhibitor-Antikörper problemlos durch andere Verfahren, die im Stand der Technik hinreichend bekannt sind, erhalten werden können. Eine exemplarische Methode zur Identifizierung von Antikörpern mit einer hohen Spezifität für KIAA0175 ist die Phagendisplay-Methode.
Phagendisplay-Bibliotheken zur Herstellung von hochaffinen Antikörpern werden beispielsweise in Hoogenboom, H. R. et al., Immunotechnology 4(1): 1–20 (1998); Hoogenboom, H. R., Trends Biotechnol. 15: 62–70 (1997) und McGuinness, B. et al., Nature Bio. Technol. 14: 1149–1154 (1996) beschrieben, von denen jedes vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Ein Vorteil der Phagendisplay-Technologie ist die Fähigkeit, Antikörper humanen Ursprungs zu isolieren, die mittels herkömmlicher Hybridom-Methoden anderweitig nicht leicht zu isolieren sind. Ferner können Phagendisplay-Antikörper in vitro isoliert werden, ohne auf das Immunsystem eines Tieres angewiesen zu sein.
Antikörper-Phagendisplay-Bibliotheken können beispielsweise durch das Verfahren von McCafferty et al., Nature 348: 552–554 (1990) erstellt werden, das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Kurz gesagt wird die kodierende Sequenz der variablen Region des Antikörpers mit dem Aminoterminus eines kleinen Phagenhüllproteins (pIII) fusioniert. Die Expression des Fusionskonstrukts aus der variablen Region des Antikörpers und pIII führt zu einem "Display" des Antikörpers auf der Phagenoberfläche, wobei das entsprechende genetische Material innerhalb des Phagenpartikels eingeschlossen ist.
Das KIAA0175-Protein, das für das Screening einer Phagenbibliothek geeignet ist, kann beispielsweise wie oben beschrieben durch Expression in Baculovirus-Sf9-Zellen erhalten werden. Alternativ dazu kann die für KIAA0175 kodierende Region mittels PCR amplifiziert werden, wobei Primer verwendet werden, die spezifisch für die gewünschte Region des KIA0175-Proteins sind. Wenn beispielsweise der Inhibitor gegen die Kinasedomäne von KIAA0175 gerichtet ist, können Fragmente amplifiziert werden, die für die Aminosäuresequenz kodieren, die das Lysin 40 am Aktivitätszentrum flankiert. Beispielhafte PCR-Primer für die Amplifikation von KIAA0175 umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) diejenigen, die in den SEQ ID NOs: 7 und 8 gezeigt sind. Wie oben diskutiert ist, kann das KIAA0175-Protein als Fusion mit einem der kommerziell verfügbaren Affinitäts-Anhänge in E. coli oder in der Hefe exprimiert werden.
Das resultierende Fusionsprotein kann dann auf eine feste Matrix adsorbiert werden, beispielsweise auf eine Gewebekulturplatte oder auf einen Bead. Phagen, die Antikörper mit den gewünschten Anti-KIAA0175-Bindungseigenschaften exprimieren, können anschließend im Fall einer festen Matrix durch fortlaufendes Panning isoliert werden oder durch Affinitätsadsorption auf einer KIAA0175-Antigen-Säule. Ein Phage mit der gewünschten inhibitorischen Aktivität gegenüber KIAA0175 kann durch Infektion erneut in ein Bakterium eingebracht werden und unter Verwendung von Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, vermehrt werden. Siehe Hoogenboom, H. R., Trends Biotechnol, siehe oben, für einen Review bezüglich Verfahren zum Screening nach einem positiven Antikörper-pIII-Phagen.
Kleine Moleküle
Die vorliegende Erfindung stellt ferner kleine Moleküle (small molecules) als Inhibitoren gegen KIAA0175 bereit, die problemlos durch Routineanwendung von Screeningverfahren mit hohem Durchsatz (high-throughput screening, HTS) identifiziert werden. Zusammengefasst von Persidis, A., Nature Biotechnology 16: 488–489 (1998). HTS-Verfahren beziehen sich im Allgemeinen auf diejenigen Methoden, die das schnelle Testen von Leitverbindungen, wie beispielsweise kleinen Molekülen, auf ihr therapeutisches Potential erlauben. HTS-Verfahren verwenden eine robotergestützte Bearbeitung von Testmaterialien, eine Detektion von positiven Signalen und eine Interpretation der Daten. Solche Methoden umfassen beispielsweise robotergestützte Screeningverfahren unter Verwendung von löslichen Markern so wie auf Zellen basierende Systeme, wie beispielsweise das Zwei-Hybrid-System, das oben ausführlich beschrieben wurde.
Eine Vielzahl von auf Zellen basierenden HTS-Verfahren ist verfügbar, die von der Leichtigkeit der Manipulation und der klinischen Relevanz von Interaktionen profitieren, die im Rahmen eines zellulären Zusammenhangs auftreten und nicht in Lösung. Leitverbindungen können über den Einbau von Radioaktivität oder durch optische Assays, die auf Absorption, Fluoreszenz oder Lumineszenz zum Zwecke der Auslesung beruhen, identifiziert werden. Siehe beispielsweise Gonzalez, J. E. et al., Curr. Opin. Biotechnol. 9(6): 624–631 (1998), das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
HTS-Verfahren können beispielsweise verwendet werden, um nach Leitverbindungen zu suchen, die eine der biologischen Aktivitäten von KIAA0175 blockieren, wie beispielsweise seine Autophosphorylierungsaktivität. Durch dieses Verfahren kann das KIAA0175-Protein aus Zellen, die das Protein exprimieren, immunpräzipitiert und in Vertiefungen einer Assayplatte, die für ein robotergestütztes Screening geeignet ist, eingebracht werden. Einzelne Testverbindungen können dann mit dem immunpräzipitierten Protein in Kontakt gebracht werden, und die Wirkung jeder Testverbindung auf die KIAA0175-Kinaseaktivität kann festgestellt werden, beispielsweise durch Inkubieren in Gegenwart von γ-³²P-ATP in einem geeigneten Puffersystem (siehe Beispiel 2) und Messung des Einbaus von ³²P.
Verfahren zur Feststellung der Wirksamkeit von KIAA0175-Inhibitoren
Leitmoleküle oder Verbindungen (entweder Antisense-Moleküle oder Ribozyme, Proteine und/oder Peptide, Antikörper und/oder Antikörperfragmente oder kleine Moleküle), die entweder durch eines der vorliegend beschriebenen Verfahren oder mittels Me thoden identifiziert werden, die anderweitig im Stand der Technik verfügbar sind, können durch eine Vielzahl von in vitro-, ex vivo- und in vivo-Tiermodellassaysystemen weiter auf ihre Fähigkeit zur Inhibierung der Genexpression oder der biologischen Aktivität von KIAA0175 untersucht werden. Wie in den nachstehenden bereitgestellten Beispielen ausführlich diskutiert wird, sind die KIAA0175-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung nicht nur bei der Verringerung der KIAA0175-Genexpressionsmengen wirksam, sondern unter anderem auch (1) bei der Verringerung der intrazellulären p53- und/oder p21-Proteinmengen in der Säugetierzielzelle; (2) bei der Verringerung der Zellzyklusphasenübergänge; und (3) bei der Verstärkung von Zellen gegen Chemotherapie- und/oder Bestrahlungssensitivierungsmittel. Somit offenbart die vorliegende Erfindung ferner Verfahren, die es dem Fachmann ermöglichen, die Wirkung von Kandidaten-Inhibitoren auf jeden dieser drei Parameter festzustellen.
Wie oben erwähnt und in den nachstehend bereitgestellten Beispielen gezeigt wird, können Kandidaten-KIAA0175-Inhibitoren durch Verabreichung an Zellen getestet werden, die entweder endogenes KIAA0175 exprimieren oder die hergestellt wurden, um KIAA0175 durch Transfektion einer Säugetierzelle mit einem rekombinanten KIAA0175-Plasmidkonstrukt zu exprimieren. Geeignete Zelllinien für diesen Zweck umfassen beispielsweise die HT1080-Zelllinie und die HCT116-Zelllinie, von denen beide relativ hohe Mengen von endogenem KIAA0175 exprimieren. Während die Brauchbarkeit dieser Zelllinien vorliegend spezifisch offenbart ist, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass weitere Zelllinien gemäß der vorliegend offenbarten Verfahren verwendet werden können, wobei die Auswahl der Zelllinie beispielsweise von der spezifischen vorgeschlagenen Verwendung abhängen wird.
Wirksame KIAA0175-Inhibitormoleküle werden bei der Verringerung der Mengen an KIAA0175-mRNA wirksam sein, wie beispielsweise durch Northern-Blot-Analyse oder durch RT-PCR-Analyse festgestellt wird. Siehe Beispiel 4; für eine allgemeine Beschreibung dieser Verfahren, siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press (1989) und Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press (Hrsg. Glick, B. R. und Pasternak, J. J. 1998), die vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Wirksamkeit eines bestimmten Kandidaten-Antisense-Moleküls kann durch Vergleich mit einem Kontroll-"Antisense"-Molekül festgestellt werden, von dem man weiß, dass es keine wesentliche Wirkung auf die KIAA0175-Expression hat, wenn es an eine Säugetierzelle verabreicht wird. Beispielhafte Kontrollmoleküle umfassen die AKT- und FITC-Primer, die in Beispiel 4 offenbart sind.
Die vermeintlichen KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküle können darüber hinaus hinsichtlich ihrer Wirkung auf die p53- und p21-Proteinmenge charakterisiert werden, wenn sie an eine Säugetierzelle verabreicht werden. Somit können solche Kandidatenmoleküle beispielsweise an HT1080- oder HCT116-Zellen verabreicht werden. Nach einem geeigneten Zeitraum der Kulturvierung können die transfizierten Zellen darüber hinaus einer γ-Bestrahlung ausgesetzt werden. Die zellulären Proteinmengen von p53 und p21 können entweder vor der Bestrahlung oder an verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung festgestellt werden, beispielsweise durch Western-Analyse unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität gegen jedes dieser Proteine. Siehe Beispiele 5 und 6 sowie beispielsweise Sambrook et al., siehe oben. Die Mengen eines geeigneten negativen Kontrollproteins, wie beispielsweise Erk2 können analysiert werden, um die Spezifität jedes Kandidaten-Inhibitor-Antisense-Moleküls gegen KIAA0175 zu verifizieren. Wirksame KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküle können eine Verringerung der Proteinmenge von p53 oder eine Verringerung der Proteinmenge von p21 oder beides bewirken. Darüber hinaus werden KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküle, die als Strahlungssensitivierungsmittel verwendet werden (siehe unten), auch die durch γ-Bestrahlung induzierte Steigerung der p53- und/oder p21-Proteinmenge verringern.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Wirkung der KIAA0175-Inhibitoren auf die DNA-Syntheserate nach Anwendung einer Bestrahlung oder eines chemotherapeutischen Mittels festgestellt werden, beispielsweise durch das Verfahren von Young und Painter, Hum. Genet. 82: 113–117 (1989). Kurz gesagt können Kulturzellen in Gegenwart von ¹⁴C-Thymidin inkubiert werden, bevor sie Röntgenstrahlen ausgesetzt werden. Unmittelbar nach der Bestrahlung werden die Zellen für einen kurzen Zeitraum vor der Zugabe des ³H-Thymidins inkubiert. Die Zellen werden gewaschen, mit Perchlorsäure behandelt und filtriert (Whatman GF/C). Die Filter werden mit Perchlorsäure, mit 70% Alkohol und anschließend mit 100% Ethanol gespült; die Radioaktivität wird gemessen und die resultierenden Verhältnisse von ³H/¹⁴C werden verwendet, um die DNA-Syntheseraten zu bestimmen.
KIAA0175-Inhibitoren, die durch ein oder mehrere der oben diskutierten Verfahren wirksam bei der Verringerung der KIAA0175-Genexpression und/oder bei der Verringerung der p21- oder p53-Proteinmenge sind, können ferner in vivo auf ihre Wirksamkeit in einem der problemlos verfügbaren Tiermodellsysteme getestet werden. Die verschiedenen Tiermodellsysteme zur Untersuchung von Krebs und von Genen, die mit einer genetischen Instabilität assoziiert sind, waren kürzlich Thema eines Veröffentlichung; Donehower, L. A. Cancer Surveys 29: 329–352 (1997), die vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
In noch weiteren Ausführungsformen können KIAA0175-Inhibitoren identifiziert werden, indem die Wirkung der Kandidaten-Inhibitoren auf das Anhalten des Zellzyklus in Reaktion auf γ-Bestrahlung festgestellt wird, wie es nachstehend in Beispiel 7 beschrieben wird.
KIAA0175-Inhibitoren als Sensitivierungsmittel bei Chemotherapie und Bestrahlung
Wie oben diskutiert wird, stellt die vorliegende Erfindung KIAA0175-Inhibitoren sowie Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die KIAA0175-Inhibitoren verwenden, welche nützlich als Sensitivierungsmittel bei Chemotherapie und Bestrahlung sind, beispielsweise für die Behandlung einer neoplastischen Erkrankung. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Sensitivierungsmittel" im Allgemeinen die Eigenschaft eines Moleküls oder einer Zusammensetzung, in einer Zelle eine Hypersensitivität in Bezug auf einen chemotherapeutischen Wirkstoff, ionisierende Strahlung und/oder andere DNA-schädigende Mittel zu induzieren. Beispielhafte Verfahren umfassen Genverabreichungsmethoden (die nachstehend ausführlicher beschrieben werden) für die Bereitstellung von KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekülen an Zielzellen. Siehe auch Beispiel 8.
Die vorliegend bereitgestellten Verfahren weisen als gemeinsames Merkmal auf, dass eine Hypersensitivierung durch Verabreichung eines oder mehrerer KIAA0175-Inhibitoren erreicht wird. Im Rahmen einiger Ausführungsformen wird die Hypersensitivität in Bezug auf Chemotherapie und/oder Bestrahlung durch Verabreichung eines Antisense-Moleküls erreicht. In bestimmten anderen Ausführungsformen können Antisense-Moleküle, die für eine Chemotherapie und/oder Bestrahlung sensitivieren, mit einem durch Bestrahlung induzierbaren Promotor verknüpft sein, um die Expression durch externe Bestrahlungsstrahlen zu lokalisieren. Siehe beispielsweise McBride, W. H. et al., Nat. Med. 1: 1215–1217 (1995) und Weichselbaum, R. R. et al., Cancer Res. 54: 4266–4269 (1994) (die die Kombination von Genverabreichung und Bestrahlung als Basis für eine Bestrahlungstherapie beschreiben). In anderen Ausführungsformen kann die Expression des KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküls durch Verwendung eines Gewebe-spezifischen Promotors oder eines Zellzyklus-spezifischen Promotors eingeschränkt werden. Vile, R. G. et al., Cancer Res. 53: 962–967 (1993) und Vile, R. G., Semin. Cancer Biol. 5: 437–443 (1994) (die eine gezielte Tumorspezifische Genexpression beschreiben). Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden trophische Viren, die auf bestimmte Organe oder Strukturen beschränkt sind. Jedes dieser beispielhaften Verfahren ist vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen.
Durch die vorliegenden Verfahren werden trotz geringer Transfektionseffizienz und/oder transienter Genexpression nützliche Verbesserungen der Chemotherapie und/oder Bestrahlungstherapie erreicht werden. Dies wird insbesondere der Fall sein, wenn das Gen-Verabreichungsverfahren während des Verlaufs der Behandlung wiederholt wird. Es wird erwartet, dass die Transfektionseffizienzen im Bereich von 10% bis 70% liegen.
Verwendung von KIAA0175-Inhibitoren zur Verringerung der Schwere der Nebenwirkungen einer Krebstherapie
Herkömmliche Behandlungsprotokolle einer Krebstherapie, die sowohl eine Chemotherapie als auch eine Bestrahlungstherapie einschließen, haben oftmals schwere Nebenwirkungen, welche ihre Wirksamkeit beeinträchtigen. Diese Nebenwirkungen resultieren teilweise aus der p53-vermittelten Apoptose von behandelten Zellen. Es ist daher vorgeschlagen worden, dass die Suppression der p53-Aktivität bei der Verringerung der Apoptose wirksam sein könnte und daher die ungünstigen Nebenwirkungen, die mit einer Krebstherapie assoziiert sind, verringert. Komarov, P. G. et al., Science 285: 1733–1737 (1999), das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Hohe Mengen von p53 sind in einer Vielzahl von normalen Geweben nachgewiesen worden, einschließlich in lymphoiden und hämatopoetischen Organen, intestinalen Epithelien und Hoden, die durch eine Anti-Krebs-Behandlungen beschädigt werden. Rogel, A. et al., Mol Cell. Biol. 5: 2851 (1985); Schmidt, P. et al., Development 113: 857 (1991); Schwartz, D. et al., Oncogene 8: 1487 (1993) und Komarova, E. A. et al., EMBO J. 16: 1391 (1997). Darüber hinaus tritt in diesen sensitiven Geweben kurz nach der γ-Bestrahlung eine p53-abhängige Apoptose auf. Komarova, id; Hendry, J. H. et al., Int. J. Radial Biol 70: 677 (1996); und Tron, V. A. et al., Am. J. Pathol. 153: 579 (1998). Es ist daher vorgeschlagen worden, dass p53 ein geeignetes Ziel für die therapeutische Suppression sein könnte, um dadurch den Schaden für normale Zellen zu verringern. Komarova, E. A. et al., Semin. Cancer Biol. 8: 389 (1998).
Es ist als Teil dieser Erfindung entdeckt worden, dass KIAA0175-Inhibitoren wirksam bei der Verringerung der intrazellulären Mengen des p53-Proteins sind. Demgemäß können KIAA0175-Inhibitoren als Wirkstoffe zur Verringerung von Nebenwirkungen einer Krebstherapie und bei anderen Arten von Stress, die mit einer Induktion von p53 assoziiert sind, wirksam sein.
Leitverbindungen, die bei Verabreichung an eine Säugetierzelle wirksam bei der Verringerung der Mengen von p53-Protein sind, können durch die vorliegend beschriebenen Verfahren oder durch andere geeignete Verfahren, die im Stand der Technik verfügbar sind, beschrieben werden. Beispielsweise können KIAA0175-Inhibitoren wie es in Beispiel 5 beschrieben wird an HT1080-Zellen oder an HCT116-Zellen verabreicht werden, und die resultierenden Mengen an p53 können durch Westernanalyse unter Verwendung von p53-spezifischen Antikörpern überprüft werden. KIAA0175-Inhibitoren, die bei der Verringerung der p53-Expressionsniveaus wirksam sind, können durch die Verfahren von Komarov, P. G. et al., siehe oben, in einem herkömmlichen Modell für die p53-abhängige Apoptose, wie beispielsweise in der Maus-Zelllinie C8, weiter untersucht werden. Lowe, S. W. et al., Cell 74: 957 (1993), das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist (und die C8-Zelllinie als einen Mausembryo-Fibroblasten beschreibt, der mit Ela + ras transformiert ist, und in Reaktion auf eine Vielzahl von Behandlungen eine schnelle p53-abhängige Apoptose durchläuft).
Die in vivo-Wirksamkeit von KIAA0175-Inhibitoren, von denen herausgefunden wurde, dass sie bei der Verringerung der p53-vermittelten zellulären Apoptose aktiv sind, kann in einem geeigneten Tiermodellsystem weiter charakterisiert werden. Beispielsweise können zwei verschiedene Maus-Stämme, d. h. C57BL oder Balb/c, nach Verabreichung eines oder mehrerer KIAA0175-Inhibitoren mit lethalen und sublethalen Dosen einer Ganzkörper-γ-Bestrahlung behandelt werden. Siehe Komarov, P. G. et al., siehe oben.
Verabreichung von KIAA0175-Inhibitoren und Zusammensetzungen derselben
Die vorliegende Erfindung stellt KIAA0175-Inhibitoren und Zusammensetzungen bereit, die einen oder mehrere KIAA0175-Inhibitoren umfassen, sowie Verfahren, die diese erfindungsgemäßen Inhibitoren im Rahmen von in vivo-, ex vivo- und in vitro-Anwendungen einsetzen, bei denen es vorteilhaft ist, die Expression und Aktivität von KIAA0175 oder eines funktionell stromabwärts gelagerten Moleküls, wie beispielsweise p53 oder p21, zu verringern oder auszuschalten. Zusammensetzungen, die auf einem KIAA0175-Inhibitor basieren, werden wie oben erwähnt Anwendung bei der Behandlung einer neoplastischen Erkrankung und bei der Behandlung von verwandten Zuständen finden, bei denen Behandlungsprotokolle durch eine Hypersensitivität von Tumorzellen in Bezug auf eine Bestrahlung verbessert werden. Alternativ dazu können KIAA0175-Inhibitoren als Wirkstoffe bei der Verringerung von Nebenwirkungen Anwendung finden, z. B. bei Nebenwirkungen von Krebstherapeutika und anderen Mitteln, die einen p53-vermittelten Zellstress und eine Apoptose verursachen.
Die Zusammensetzungen können parenteral, topisch, oral oder lokal für eine therapeutische Behandlung verabreicht werden. Vorzugsweise werden die Zusammensetzungen oral oder parenteral verabreicht, d. h. intravenös, intraperitoneal, intradermal oder intramuskulär.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden einen oder mehrere KIAA0175-Inhibitoren umfassen, und sie können ferner einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Hilfsstoff umfassen. Eine Vielzahl von wässrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin und Ähnliches, und diese können weitere Proteine für eine verbesserte Stabilität umfassen, wie beispielsweise Albumin, Lipoprotein, Globulin usw., die milden chemischen Modifikationen oder Ähnlichem unterworfen werden.
Die Inhibitoren der vorliegenden Erfindung können mit zusätzlichen oder alternativen Inhibitoren kombiniert werden, z. B. mit ATM, DNA-PK oder ATR, um ein noch größeres Ausmaß an Hypersensitivität in Bezug auf eine Bestrahlung zu erzielen. Siehe beispielsweise Westpahl et al., Nat. Genet. 16: 397 (1997), das vorliegend durch Verweis eingeschlossen ist.
KIAA0175-Inhibitoren, die als Bestrahlungssensitivierungsmittel nützlich sind, oder die anderweitig bei der Behandlung einer Erkrankung in Säugetieren nützlich sind, werden oftmals im Wesentlichen frei von anderen natürlich vorkommenden Immunglobulinen oder anderen biologischen Molekülen hergestellt. Bevorzugte KIAA0175-Inhibitoren werden ferner bei Verabreichung an ein Säugetier eine minimale Toxizität aufweisen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können durch herkömmliche, hinreichend bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden. Die resultierenden Lösungen können zur Verwendung abgepackt oder unter aseptischen Bedingungen filtriert und lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung mit einer sterilen Lösung vor der Verabreichung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen umfassen, soweit dies erforderlich ist, um annähernd physiologische Bedingungen herzustellen, wie beispielsweise durch pH-Anpassung und Puffermittel, Mittel zur Anpassung der Tonizität und Ähnliches, beispielsweise Natriumacetat, Natriumlaktat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid und Stabilisierungsmittel (z. B. 1 bis 20% Maltose, usw.).
Die Auswahl des geeigneten Verfahrens zur Verabreichung von KIAA0175-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung wird von der Art der beabsichtigten Anwendung sowie von der Art des KIAA0175-Inhibitors abhängen. Somit wird beispielsweise das genaue Verfahren zur Verabreichung eines KIAA0175-Inhibitors davon abhängen, ob es ein Antisense-Molekül, ein Protein und/oder ein Peptid, ein Antikörper oder ein Antikörperfragment oder ein kleines Molekül ist. Andere Erwägungen umfassen beispielsweise, ob der KIAA0175-Inhibitor dazu verwendet werden wird, die Hypersensitivität in Bezug auf eine Bestrahlung zu erhöhen, oder, um die Nebenwirkungen von Krebsmitteln zu verringern.
Eine Vielzahl von Verfahren ist im Stand der Technik zur Verabreichung von Antisense-Molekülen verfügbar. Beispielhafte Verfahren umfassen Genverabreichungsmethoden, die sowohl auf viralen als auch auf nicht viralen Verfahren basieren, sowie durch Liposomen vermittelte Verfahren der Zuführung.
Methoden für die Zuführung von Genen werden wirksam sein, um beispielsweise Tumorzellen für eine Bestrahlung und/oder für chemotherapeutische Wirkstoffe zu sensitivieren. Siehe Wheldon, T. E. et al., Radiother Oncol 48(1): 5–13 (1998) (Methoden für die Zuführung von Genen für eine Verstärkung der fraktionierten Bestrahlungstherapie). Durch diese Methoden kann ein wesentlicher therapeutischer Vorteil erzielt werden, trotz Transfektionseffizienzen von signifikant weniger als 100%, einer transienten Retention des transfizierten Inhibitors und/oder einer Existenz einer Subpopulation von Zielzellen, die für eine Therapie unempfänglich sind.
Wie oben diskutiert wird, besteht die Einschränkung der herkömmlichen Bestrahlungstherapie darin, dass ihre Tumorspezifität gering ist. Diese Beschränkung kann überwunden werden, indem die Expression von Antisense-KIA10175-Inhibitoren gezielt auf Tumorzellen gerichtet wird. Dies kann beispielsweise durch Verknüpfen des Gens für den KIAA0175-Inhibitor mit einem mittels Bestrahlung induzierbaren Promotor erreicht werden, so dass eine Gentherapie durch externe Strahlen der Bestrahlung lokalisiert werden kann. McBride, W. H. et al., Nat. Med. 1: 1215–1217 (1995) und Weichselbaum, R. R. et el., Lancet Suppl II: S10–S12 (1997), von denen jedes vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Alternativ dazu können Methoden für die Zuführung von Genen verwendet werden, um endogenes KIAA0175 innerhalb von Tumorzellen direkt auszuschalten, wodurch die Tumorzellen hypersensitiv in Bezug auf eine Bestrahlung oder in Bezug auf chemotherapeutische Wirkstoffe werden. Beispielsweise kann das KIAA0175-Gen durch Transfektion eines Vektors zur Genverabreichung anvisiert werden, der einen KIAA0175-Inhibitor trägt.
Die bevorzugte Transfektion in Tumorzellen oder die Expression in Tumorzellen kann durch Verwendung eines gewebespezifischen oder eines Zellzyklus-spezifischen Promotors erreicht werden, wie beispielsweise durch die Promotoren für das Prostata-spezifische Antigen oder für die Immunglobulingene (Vile, R. G. et al., Cancer Res. 53: 962–967 (1993) und Vile, R. G., Semin. Cancer Biol. 5: 437–443 (1994)), oder durch Verwendung von trophischen Viren, die auf bestimmte Organe oder Strukturen beschränkt sind, wie beispielsweise ein replikationsselektives und neurotrophes Virus, das nur proliferierende Zellen im zentralen Nervensystem infizieren kann.
Um einen therapeutischen Vorteil zu erzielen, sollte KIAA0175 somit vorzugsweise innerhalb der Tumorzellen inhibiert werden. Dies kann erreicht werden, indem ein Gen, das einen KIAA0175-Inhibitor exprimiert, ein KIAA0175-Antisense-Molekül, ein für das KIAA0175-Gen spezifischen Repressor oder ein Inhibitor des Proteinprodukts des KIAA0175-Gens transfiziert wird.
Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "Vektor für die Zuführung eines Gens" im Allgemeinen ein Nukleinsäurekonstrukt, das ein Antisense-Molekül von Interesse enthält, und in bestimmten Ausführungsformen in der Lage ist, die Expression dieses Antisense-Moleküls zu steuern, wie es beispielsweise in Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, Kapitel 21, S. 555–590 (Hrsg. B. P. Glick und J. J. Pasternak, 2. Auflage 1998); Jolly, Cancer Gene Ther. 1: 51–64 (1994); Kimura, Human Gene Ther. 5: 845–852 (1994); Connelly, Human Gene Ther. 6: 185–193 (1995); und Kaplitt, Nat. Gen. 6: 148–153 (1994) beschrieben ist.
Eine Vielzahl von Systemen für die Zuführung von Genen, die auf einem Virus basieren oder nicht auf einem Virus basieren, sind als für die Verabreichung von KIAA0175-Inhibitoren geeignet beschrieben worden. Systemen für die Zuführung von Genen, die auf einem Virus basieren, umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Retrovirus, wie beispielsweise Moloney-Maus-Leukämievirus, Spumaviren und Lentiviren; Adenovirus; Adeno-assoziiertes Virus; und Herpes-simplex-Virus-Vektorsysteme. Viren jedes Typs sind problemlos von Hinterlegungen oder Sammlungen erhältlich, wie beispielsweise von der American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110–2209), oder sie können von bekannten Quellen unter Verwendung problemlos verfügbarer Materialien und Verfahren isoliert werden.
Die erfindungsgemäßen Systeme für die Zuführung von Genen werden sowohl bei in vivo- als auch bei ex vivo-Therapie-behandlungen Anwendung finden. Jede dieser Anwendungen ist nachstehend genauer beschrieben.
1. Retrovirale Systeme für die Zuführung von Genen
Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden retrovirale Vektoren für die Zuführung von Genen bereitgestellt, die so konstruiert sind, dass sie ein KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül enthalten oder exprimieren. Wie vorliegend verwendet bezeichnet der Begriff "KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül" im Allgemeinen eine Nukleinsäuresequenz, die KIAA0175-Inhibitoraktivität aufweist. Solche Antisense-Moleküle werden insbesondere die KIAA0175-Genexpression sowie die p53- und/oder p21-Proteinmenge verringern. Die erfindungsgemäßen retroviralen Vektoren für die Zuführung von Genen können problemlos aus einer Vielzahl von Retroviren konstruiert werden, einschließlich z. B. Retroviren vom Typ B, C und D sowie Spumaviren und Lentiviren. Siehe RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory (2. Auflage 1985).
Ein beliebiges der oben genannten Retroviren kann auf Basis der vorliegenden Offenbarung und auf Basis von Standardverfah ren mit rekombinanter DNA verwendet werden, um retrovirale Vektoren für die Zuführung von Genen zusammenzusetzen oder zu konstruieren. Siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2. Auflage 1989) und Kunkle, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488 (1985). Darüber hinaus können in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung Teile der retroviralen Vektoren für die Zuführung von Genen von unterschiedlichen Retroviren stammen.
Ein retroviraler Vektor, der für die Expression eines KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküls geeignet ist, muss mindestens einen Transkriptionspromotor/Enhancer oder (ein) Locus-definierende(s) Element(e) umfassen, oder andere Elemente, die die Genexpression durch andere Mittel kontrollieren, wie beispielsweise durch alternierendes Spleißen, nuklearen RNA-Export, post-translationale Modifikation von mRNA oder post-transkriptionale Modifikation von Protein. Solche Vektorkonstrukte müssen ferner ein Verpackungssignal, lange terminale Wiederholungen (long terminal repeats, LTRs) oder einen Teil davon umfassen sowie Primerbindungsstellen für den positiven und den negativen Strang, die für das verwendete Retrovirus geeignet sind (sofern diese nicht bereits in dem retroviralen Vektor vorhanden sind). Der retrovirale Vektor kann wahlweise auch ein Signal umfassen, das die Polyadenylierung steuert, selektierbare Marker, wie beispielsweise Neomycin-Resistenz, TK, Hygromycin-Resistenz, Phleomycin-Resistenz, Histidinol-Resistenz oder DHFR, sowie eine oder mehrere Restriktionsstellen und eine Translationsterminationssequenz. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden retrovirale Vektorkonstrukte für die Zuführung von Genen bereitgestellt, die einen 5'-LTR, eine tRNA-Bindungstelle, ein Verpackungssignal, ein oder mehrere heterologes Sequenzen, einen Ursprung für die DNA-Synthese des zweiten Strangs und einen 3'-LTR umfassen, wobei dem Vektorkonstrukt Sequenzen, die für gag/pol oder env kodieren, fehlen.
Andere retrovirale Vektoren für die Zuführung von Genen können ebenfalls im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich beispielsweise diejenigen, die in den nachfolgenden Veröffentlichungen offenbart werden, welche vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind: EP 0,415,731 ; WO 90/07936 ; WO 94/03622 ; WO 93/25698 ; WO 93/25234 ; US-Patent Nr. 5,219,740 ; WO 93/11230 ; WO 93/10218 ; Vile et al., Cancer Res. 53: 3860–3864 (1993); Vile et al., Cancer Res. 53: 962–967 (1993); Ram et al., Cancer Res. 53: 83–88 (1993); Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33: 493–503 (1992); Baba et al., J. Neurosurg. 79: 729–735 (1993); US-Patent Nr. 4,777,127 , GB 2,200,651 , EP 0,345,242 und WO 91/02805 .
Verpackungszelllinien, die für die Verwendung mit dem oben beschriebenen retroviralen Vektorkonstrukten für die Zuführung von Genen geeignet sind, können problemlos hergestellt werden. Siehe beispielsweise US-Patent Nrn. 5,716,832 und 5,591,624 . Diese Verpackungszelllinien können verwendet werden, um Hersteller-Zelllinien (die auch als Vektorzelllinien oder "VCLs" bezeichnet werden) für die Produktion von rekombinanten Vektorpartikeln zu erzeugen. Es kann bevorzugt sein, die Verpackungszelllinien, die ausgehend von humanen parentalen Zelllinien (z. B. HT1080-Zellen) oder von parentale Zelllinien vom Nerz (mink) hergestellt wurden, wodurch die Produktion von rekombinanten Retroviren ermöglicht wird, welche die Inaktivierung in humanem Serum vermeiden.
2. Adeno-assozierte virale Vektorsysteme für die Zuführung von Genen
Adeno-assoziierte Viren (AAV) besitzen mehrere Eigenschaften, die sie besonders geeignet für die Entwicklung von Vektoren für die Zuführung von Genen im Allgemeinen und für die Zuführung von Polynukleotiden, die für KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküle kodieren, im Besonderen machen. Für einen allgemeinen Überblick über AAV-Expressionssysteme, siehe Rabinowitz et al., Current Opin. Biotech. 9(5): 470–475 (1998). AAV ist ein nicht-pathogenes, defektes humanes Parvovirus, das ohne ein Adeno- oder Herpes-Helfervirus nicht infektiös ist. Somit wird AAV in Abwesenheit eines Helfervirus latent ins Wirtsgenom integriert. Darüber hinaus weist AAV den Vorteil gegenüber den oben diskutierten Retroviren auf, dass es in der Lage ist, einen großes Spektrum von sich teilenden und ruhenden Zelltypen zu transduzieren.
Eine Vielzahl von AVV-Vektoren für die Zuführung von Genen kann verwendet werden, um die Expression von einem oder mehreren KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekülen zu steuern. Repräsentative Beispiele für solche Vektoren umfassen die AAV-Vektoren, die von Srivastava in WO 93/09239 ; Samulski, et al., J. Virol. 63: 3822–3828 (1989); Mendelson, et al., Virol. 166: 154–165 (1988); und Flotte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(22): 10613–10617 (1993) offenbart werden, und die vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Kurz gesagt kann ein erfindungsgemäßer AAV-Vektor für die Zuführung von Genen in folgender Reihe das Nachfolgende umfassen: eine 5'-invertierte terminale Wiederholung (5'-inverted terminal repeat) aus einem Adeno-assoziierten Virus; ein Polynukleotid, das für das KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül kodiert; eine Sequenz, die in funktionsfähiger Weise mit dem KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül verknüpft ist, und die seine Expression in einem Zielgewebe, in einem Zielorgan oder in einer Zielzelle reguliert; und ein 3'-invertierte terminale Wiederholung aus einem Adeno-assoziierten Virus. Eine geeignete regulatorische Sequenz für die Expression eines KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküls ist z. B. die Enhancer-/Promotor- Sequenz des Zytomegalievirus (CMV). Darüber hinaus kann der AAV-Vektor vorzugsweise eine Polyadenylierungssequenz, wie beispielsweise die Polyadenylierungssequenz von bovinem Wachstumsfaktor (BGH), aufweisen.
Im Allgemeinen sollten AAV-Vektoren eine Kopie des AAV-ITR an jedem Ende des KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküls aufweisen, um die Replikation, Verpackung, die effiziente Integration ins Wirtszellgenom und die Freisetzung aus dem Chromosom zu ermöglichen. Die 5'-ITR-Sequenz besteht aus den Nukleotiden 1 bis 145 am 5'-Ende des AAV-DNA-Genoms, und die 3'-ITR umfasst die Nukleotide 4681 bis 4536 des AAV-Genoms. Vorzugsweise kann der AAV-Vektor auch mindestens 10 Nukleotide umfassen, die dem Ende des ITR folgen (d. h. einen Teil der sogenannten "D-Region").
Die optimale Verpackung eines Vektors für die Zuführung von Genen aus Adeno-assoziiertem Virus erfordert, dass das 5'-ITR und das 3'-ITR durch ungefähr 2–5 kB voneinander getrennt sind. Es wird jedoch ersichtlich sein, dass der ideale Abstand zwischen ITR-Sequenzen in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Verpackungssystem variieren kann. Dieser Abstand kann durch Einbau eines "Füll"- oder "Auffüll"-Polynukleotidfragments erreicht werden, das die Gesamtgröße der Nukleinsäuresequenz zwischen den zwei ITRs auf zwischen 2 und 5 kB bringt. Wenn das KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül kleiner ist als 2–5 kB, kann ein nicht-kodierendes Auffüll-Polynukleotid eingebaut werden, beispielsweise 3' von der 5'-ITR-Sequenz und 5' von dem KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül. Die genaue Nukleotidsequenz des Auffüllfragments ist kein wichtiges Element des finalen Konstrukts.
Abhängig von der genauen vorgeschlagenen Verwendung können mehrere Kopien des KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküls eingebaut werden (anstelle des Einbaus eines Auffüllfragments), unter anderem, um die optimale ITR-Sequenzbeabstandung zu erreichen. Es kann bevorzugt sein, die Polynukleotide als zwei oder mehrere getrennte Transkriptionseinheiten zu organisieren, von denen jede mit einem eigenen Promotor und einem eigenen Polyadenylierungssignal ausgestattet ist.
Rekombinante AAV-Vektoren der vorliegenden Erfindung können aus einer Vielzahl von Adeno-assoziierten Viren erzeugt werden, einschließlich beispielsweise Serotypen 1 bis 6. Es wird beispielsweise erwartet, dass ITRs von einem beliebigen AAV-Serotyp ähnliche Strukturen und Funktionen in Bezug auf Replikation, Integration, Ausschneiden und transkriptionelle Mechanismen aufweisen.
Im Rahmen von bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Expression des KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Moleküls durch einen separaten Promotor erreicht (z. B. durch einen viralen Promotor). Repräsentative Beispiele für geeignete Promotoren in dieser Hinsicht umfassen einen CMV-Promotor, einen RSV-Promotor, einen SV40-Promotor oder einen MoMLV-Promotor. Andere Promotoren, die in ähnlicher Weise im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen zell- oder gewebespezifische Promotoren oder induzierbare Promotoren. Repräsentative induzierbare Promotoren umfassen Tetracyclin-Response-Promotoren (z. B. den "Tet"-Promotor), die von Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 5547–5551 (1992); Gossen et al., Science 268: 1766–1769 (1995); Baron et al., Nucl. Acids Res. 25: 2723–2729 (1997); Blau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 797–799 (1999); Bohl et al., Blood 92: 1512–1517 (1998); und Haberman et al., Gene Therapy 5: 1604–1611 (1998) beschrieben worden sind; das Ecdyson-Promotorsystem, das in No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 3346–3351 (1996) beschrieben worden ist; und andere regulierbare Promotoren und Promotorsysteme, wie die in Rivera et al., Nat. Med. 2: 1028–1032 (1996) beschriebenen.
Der AAV-Vektor für die Zuführung von Genen kann ferner zusätzliche Sequenzen umfassen, beispielsweise solche von einem Adenovirus, der dabei hilft, eine gewünschte Funktion für den Vektor zu bewirken. Solche Sequenzen umfassen beispielsweise diejenigen, die bei der Verpackung des AAV-Vektors für die Zuführung von Genen in Adenoviruspartikel helfen.
Verpackungszelllinien, die für die Produktion von Adeno-assoziierten viralen Vektoren geeignet sind, können routinemäßig mit Hilfe von problemlos verfügbaren Methoden hergestellt werden. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,872,005 , das vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Geeignete Verpackungssysteme für die erfindungsgemäßen AAV-Genzuführsystemen werden mindestens die Gene für die AAV-Replikation und das Capsid umfassen.
Bevorzugte Verpackungszelllinien können sowohl ein AAV-Helfervirus als auch einen AAV-Genzuführvektor, der das KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül umfasst, enthalten. Für ausführliche Beschreibungen von beispielhaften Systemen für Verpackungszelllinien siehe beispielsweise Holscher, C. et el., J. Virol. 68: 7169–7177 (1994); Clark, K. R et el., Hum. Gene Ther. 6: 1329–1341 (1995); und Tamayosa, K. et el., Hum. Gen. Ther. 7: 507–513 (1996), die vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Alternativ dazu kann die Verpackung von AAV in vitro in einem zellfreien System erreicht werden, um Transfektionsprotokolle oder Verpackungszelllinien überflüssig zu machen. Solche in vitro-Systeme umfassen einen AAV-Vektor für die Zuführung von Genen, der das KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül umfasst sowie eine Quelle für ein Rep-Protein, ein Capsid-Protein und Adeno-Proteine, die Helfervirus-Funktionen bereitstellen. Die letztgenannten Proteine werden typischerweise in Form eines Zellextrakts bereitgestellt. Repräsentative in vitro-Systeme werden ferner in Ding, L. et al., Gen. Ther. 4: 1167–1172 (1997) und Zhou, Z. et el., J. Virol. 72: 3241–3247 (1998) beschrieben, die vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
3. Andere virale Gen-Zuführvektorsysteme
Neben den retroviralen Vektoren und den Vektoren, die auf einem Adeno-assoziierten Virus basieren, können zahlreiche andere virale Vektorsysteme für die Zuführung von Genen für die Expression von KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekülen verwendet werden. Beispielsweise können gemäß einer Ausführungsform der Erfindung adenovirale Vektoren verwendet werden. Repräsentative Beispiele solcher Vektoren umfassen diejenigen, die beispielsweise in Berkner, Biotechniques 6: 616–627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252: 431–434 (1991); WO 93/9191 ; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91(1): 215–219 (1994); Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(24): 11498–502 (1993); Guzman et al., Circulation 88(6): 2838–48 (1993); Guzman et el., Cir. Res. 73(6): 1202–1207 (1993); Zabner et al., Cell 75(2): 207–216 (1993); Li et al., Hum. Gene Ther. 4(4): 403–409 (1993); Caillaud et al., Eur. J. Neurosci. 5(10): 1287–1291 (1993); Vincent et al., Nat. Genet. 5(2): 130–134 (1993); Jaffe et al., Nat. Genet. 1(5): 372–378 (1992); und Levrero et al., Gene 101(2): 195–202 (1991); und WO 93/07283 ; WO 93/06223 ; und WO 93/07282 beschrieben sind.
Die erfindungsgemäßen Vektoren für die Zuführung von Genen umfassen ferner Herpesvektoren. Repräsentative Beispiele solcher Vektoren umfassen diejenigen, die von Kit in Adv. Exp. Med. Biol. 215: 219–236 (1989) beschrieben sind; und diejenigen, die in US-Patent Nr. 5,288,641 und in EP 0176170 (Roizman) beschrieben sind. Zusätzliche exemplarische Herpes-simplex- Virus-Vektoren umfassen HFEM/ICP6-LacZ, beschrieben in WO 95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, beschrieben in Geller, Science 241: 1667–1669 (1988), und in WO 90/09441 und WO 92/07945 ; HSV Us3::pgC-lacZ, beschrieben in Fink, Human Gene Therapy 3: 11–19 (1992); und HSV 7134,2 RH 105 und GAL4, beschrieben in EP 0453242 (Breakefield), und diejenigen, die bei der ATCC unter den Zugriffsnummern ATCC VR-977 und ATCC VR-260 hinterlegt sind.
Vektoren für die Zuführung von Genen können ferner aus einer großen Vielzahl von anderen Viren erzeugt werden, einschließlich z. B. Poliovirus (Evans et al., Nature 339: 385–388 (1989); und Sabin, J. Biol. Standardization 1: 115–118 (1973)); Rhinovirus; Poxviren, wie beispielsweise Canary-Poxvirus oder Vacciniavirus (Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 317–321 (1989); Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86–103 (1989); Flexner et al., Vaccine 8: 17–21 (1990); US-Patent Nrn. 4,603,112 , 4,769,330 und 5,017,487 ; WO 89/01973 ); SV40 (Mulligan et al., Nature 277: 108–114 (1979); Influenzavirus (Luytjes et al., Cell 59: 1107–1113 (1989); McMicheal et al., N. Eng. J. Med. 309: 13–17 (1983); und Yap et al., Nature 273: 238–239 (1978)); HTV (Poznansky, J. Virol. 65: 532–536 (1991)); Masern ( EP 0440219 ); Astrovirus (Munroe et al., J. Vir. 67: 3611–3614 (1993)); und Coronavirus, sowie anderer viraler Systeme (z. B. EP 0,440,219 ; WO 92/06693 ; US-Patent Nr. 5,166,057 ).
4. Nicht-virale Vektoren für die Zuführung von Genen
Andere Vektoren und Verfahren für die Zuführung von Genen, die für die Expression von KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekülen verwendet werden können, umfassen beispielsweise Nukleinsäureexpressionsvektoren; polykationische, kondensierte DNA, verknüpft oder unverknüpft mit abgetötetem Adenovirus allein, siehe beispielsweise Curiel, Hum Gene Ther 3: 147–154 (1992); Liganden-verknüpfte DNA, siehe beispielsweise Wu, J Biol Chem 264: 16985–16987 (1989); eukaryontsche Zell-Zuführvektoren; Ablagerung von photopolymerisierten Hydrogelmaterialien; eine tragbare Partikelgun für die Zuführung von Genen, wie es in US-Patent Nr. 5,149,655 beschrieben ist; ionisierende Strahlung, wie es in US 5,206,152 und in WO 92/11033 beschrieben ist; eine Nukleinladungsneutralisation oder eine Fusion mit Zellmembranen. Zusätzliche Ansätze werden in Philip, Mol Cell Biol 14: 2411–2418 (1994), und in Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 1581–1585 (1994) beschrieben.
Es kann eine Partikel-vermittelte Genzuführung verwendet werden. Kurz gesagt kann das KIAA0175-Inhibitor-Antisense-Molekül von Interesse in herkömmliche Vektoren eingebracht werden, die herkömmliche Kontrollsequenzen eine Expression in hohem Ausmaß umfassen, und sie können anschließend mit synthetischen Gen-Zuführmolekülen, wie beispielsweise mit polymeren, DNA-bindenden Kationen, wie beispielsweise Polylysin, Protamin und Albumin inkubiert werden, die mit einem Liganden für das Zell-Targeting verknüpft sind, wie beispielsweise mit Asialoorosomucoid, wie es in Wu, et al., J. Biol. Chem. 262: 4429–4432 (1987) beschrieben ist; mit Insulin, wie es in Hucked, Biochem Pharmacol 40: 253–263 (1990) beschrieben ist; mit Galaktose wie es in Plank, Bioconjugate Chem 3: 533–539 (1992) beschrieben ist; mit Laktose oder mit Transferrin.
Nackte DNA kann ebenfalls verwendet werden. Beispielhafte Verfahren zur Einbringung nackter DNA sind in WO 90/11092 und in US-Patent Nr. 5,580,859 beschrieben. Die Aufnahmeeffizienz kann unter Verwendung biodegradierbarer Latexbeads verbessert werden. Latexbeads, die mit DNA beschichtet sind, werden effizient in die Zellen transportiert, nachdem die Beads die Endozytose ausgelöst haben. Das Verfahren kann ferner durch Behandlung der Beads zur Erhöhung der Hydrophobizität verbessert werden, wodurch das Endosom zerstört und die DNA in das Zytoplasma freigesetzt wird.
Liposomen können als Vehikel für die Zuführung von Genen verwendet werden, wie es in den US-Patent Nr. 5,422,120 , in den PCT-Patentveröffentlichung Nrn. WO 95/13796 , WO 94/23697 und WO 91/144445 und in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 524,968 beschrieben ist. Nukleinsäuresequenzen können in herkömmliche Vektoren, die herkömmliche Kontrollsequenzen für eine Expression in hohem Ausmaß enthalten, eingebracht werden und anschließend mit synthetischen Molekülen für die Zuführung von Genen, wie beispielsweise mit polymeren, DNA-bindenden Kationen, wie Polylysin, Protamin und Albumin inkubiert werden, die mit Liganden für das Zell-Targeting verknüpft sind, wie beispielsweise mit Asialoorosomucoid, Insulin, Galaktose, Laktose oder Transferrin. Andere Zuführungssysteme umfassen die Verwendung von Liposomen, um DNA, die das Gen unter Kontrolle einer Vielzahl von gewebespezifischen oder ubiquitär-aktiven Promotoren umfassen, einzukapseln. Eine weitere nicht-virale Zuführung, die für eine Verwendung geeignet ist, umfasst mechanische Zuführungssysteme, wie beispielsweise der Ansatz, der in Woffendin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91(24): 11581–11585 (1994) beschrieben wird. Darüber hinaus können die kodierende Sequenz und das Expressionsprodukt davon durch Ablagerung photopolymerisierter Hydrogelmaterialien erreicht werden.
Beispielhafte Liposomen und polykationische Vehikel für die Zuführung von Genen sind diejenigen, die in den US-Patent Nrn. 5,422,120 und 4,762,915 , in PCT-Patentveröffentlichung Nrn. WO 95/13796 , WO 94/23697 und WO 91/14445 , in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 524,968 und in Starrier, Biochemistry, S. 236–240 (1975) W. H. Freeman, San Francisco; Shokai, Biochem. Biophys. Acta. 600: 1 (1980); Bayer, Biochem. Biophys. Acta. 550: 464 (1979); Rivet, Methods Enzymol. 149: 119 (1987); Wang, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7851 (1987); Plant, Anal. Biochem. 176: 420 (1989) beschrieben sind.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" ist wie vorliegend verwendet die genaue Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung, die verabreicht werden soll, und sie kann durch einen Arzt unter Beachtung der individuellen Unterschiede bezüglich Alter, Gewicht, Tumorart und Tumorgröße oder bezüglich des Grads der Metastasierung und des allgemeinen Zustands des Patienten bestimmt werden. Es kann allgemein gesagt werden, dass eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die vorliegenden Inhibitoren umfasst, therapeutisch wirksam ist, wenn eine beliebige Wirkung der Inhibitoren, welche vorliegend beschrieben wird, erzielt wird (z. B. Inhibierung der Expressionsmengen von KIAA0175, p53, p21 oder anderen Molekülen stromabwärts von KIAA0175), wenn die gewünschte Sensitivierung der Tumorzellen in Bezug auf Bestrahlung oder chemotherapeutische Wirkstoffe erzielt wird und/oder wenn die Nebenwirkungen der Krebsmittel verringert werden. Die optimale Dosierung und das optimale Behandlungsprotokoll für einen bestimmten Patienten kann problemlos durch den Fachmann im Bereich der Medizin bestimmt werden, indem der Patienten auf Anzeichen der Erkrankung oder auf eine Verbesserung untersucht wird und die Behandlung demgemäß angepasst wird.
BEISPIELE
Die folgenden experimentellen Beispiele werden lediglich als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung aufgeführt.
BEISPIEL 1
EXPRESSION VON KIAA0175-mRNA
Dieses Beispiel offenbart die Northernblot-Analyse der gewebespezifischen und krebsspezifischen Expression von KIAA0175-mRNA.
Eine für KIAA0175 spezifische DNA-Sonde wurde aus einem internen 0,7 kB-Fragment des offenen Leserahmens von KIAA0175 erzeugt. Dieses DNA-Fragment wurde radioaktiv durch Standardverfahren mit α-³²P-ATP markiert (Stratagene; La Jolla, CA), und es wurde als Sonde verwendet, um kommerziell erhältliche Blots von Geweben und Krebszelllinien, die von Clonetech (7760-1, 7759-1 und 7757-1), zu untersuchen. Die spezifische Hybridisierung der KIAA0175-Sonde wurde durch Autoradiographie nachgewiesen.
Von den verschiedenen mittels Northernblot-Analyse untersuchten Geweben exprimierten die Hoden die höchsten Mengen KIAA0175-mRNA. Thymus und Kolon exprimierten geringere Mengen KIAA0175-mRNA, gefolgt von Plazenta und Milz (in der Reihenfolge nachlassender Expression). Von den verschiedenen Krebszelllinien, die untersucht wurden, zeigte MOLT-4 die höchsten Mengen KIAA0175-mRNA, gefolgt von HeLa-, S3-, K562- und SW480-Zellen, die mittlere Mengen KIAA0175-mRNA exprimierten, und HL-60- und Rahi-Zellen, die noch geringere Mengen KIAA0175-mRNA exprimierten. Es wurde kaum KIAA0175-mRNA in A549- und G361-Zellen nachgewiesen.
BEISPIEL 2
AUTOPHOSPHORYLIERUNG DES KIAA0175-PROTEINS
Dieses Beispiel zeigt das KIAA0175 eine Autophosphorylierungsaktivität aufweist, und dass diese Aktivität durch eine ein zelne Aminosäuresubstitution bei Lysin-40 beseitigt werden kann.
Plasmidkonstrukte, die das KIAA0175-Wildtyp-Protein und das kinaseinaktive K40A-mutierte Protein exprimieren, wurden hergestellt. Diese Plasmide exprimieren beide KIAA0175-Varianten als Hämagglutinin (HA)-Fusionsproteine, wodurch deren Isolierung über Immunpräzipitation und Detektion durch Westernhybridisierung ermöglicht wird.
Der Plasmidvektor pcDNA3.1 (Invitrogen) enthält eine multiple Klonierungsstelle und ein CMV-Promotor, um die Subklonierung und Expression der KIAA0175-cDNAs, welche eine HA-Anhang-Sequenz aufweisen, zu ermöglichen.
Cos 7-Zellen wurden entweder mit dem nackten Vektor pcDNA3.1 transfiziert, oder sie wurden mit pcDNA3.1 transfiziert, der das KIAA0175-Wildtyp-Protein oder das kinaseinaktive KIAA0175-Protein exprimiert. Die KIAA0175-Proteine wurden mit dem monoklonalen Anti-HA-Antikörper (COVANCE/Babco) immunpräzipitiert. Die Kinaseaktivität wurde durch Inkubation der immunpräzipitierten Proteine in Gegenwart von 10 μCi γ-³²P-ATP, 10 mM ATP, 1 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂ und 50 mM Tris, pH 7,5 bestimmt. Die Proteine wurden einer Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel unterworfen, und die Proteine wurden auf eine Nitrocellulose-Membran überführt. Die Kinaseaktivität wurde durch Messen des ³²P-Einbaus, der durch Autoradiographie gemessen wurde, bestimmt. Immunpräzipitierte Proteine wurden mittels Western-Analyse mit Anti-HA-Antikörpern nachgewiesen.
Die Daten zeigen dass Cos 7-Zellen, die mit nacktem pcDNA3.1-Plasmidvektor transfiziert wurden, kein mit HA präzipitierbares KIAA0175-Protein erzeugten. Cos 7-Zellen, die entweder mit dem Wildtyp oder mit der K40A-Mutante transfiziert wurden, produzieren ungefähr äquivalente Mengen des jeweiligen KIAA0175-Proteins, wobei jedoch nur das Wildtyp-Protein eine signifikante Kinaseaktivität aufweist.
BEISPIEL 3
PROTEINMENGEN VON REKOMBINANTEM UND ENDOGENEM KIAA0175 NACH BEHANDLUNG DER ZELLEN MIT γ-BESTRAHLUNG UND HYDROXYHARNSTOFF
Dieses Beispiel zeigt, dass die Mengen an KIAA0175-Protein nach Behandlung von Zellen, die entweder rekombinantes oder endogenes KIAA0175 exprimierten, mit γ-Bestrahlung oder Hydroxyharnstoff ansteigen.
Rekombinante HA-KIAA0175-Proteinmengen in Cos 7-Zellen wurden entweder ohne Behandlung oder nach Behandlung durch γ-Bestrahlung oder Hydroxyharnstoff nachgewiesen. Die Lysate wurden ohne vorhergehende Immunpräzipitation der Ha-Fusionsproteine direkt auf SDS-Polyacrylamidgele geladen. Die Ha-Fusionsproteine wurden durch Anti-HA-Antikörper als Sonde nachgewiesen.
Auf ähnliche Weise wurden die endogenen KIAA0175-Proteinmengen in Zellen ohne Behandlung oder nach Behandlung mit γ-Bestrahlung (HeLa-Zellen) oder Hydroxyharnstoff (Arent-Zellen) nachgewiesen. Die Lysate wurden ohne vorherige Immunpräzipitation der KIAA0175-Proteine direkt auf SDS-Polyacrylamidgele geladen. Die KIAA0175-Proteine wurden mit Anti-KIAA0175-Antikörpern als Sonde nachgewiesen.
Insgesamt zeigten die Daten, dass die Behandlung von Cos 7-Zellen mit γ-Bestrahlung oder Hydroxyharnstoff zu einer Erhöhung der KIAA0175-Proteinmengen führte, unabhängig davon, ob das KIAA0175-Protein als rekombinantes HA-Fusionsprotein oder endogen exprimiert wurde.
BEISPIEL 4
KINETIKDATEN DES KIAA0175-TRANSKRIPTS NACH VERABREICHUNG EINES ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDS
Dieses Beispiel offenbart, dass die Mengen der KIAA0175-mRNA durch Verabreichung eines KIAA0175-Antisense-Oligonukleotids herunterreguliert werden können.
Die folgenden Antisense-Olignukleotide wurden in den vorliegend offenbarten Experimenten verwendet:
HT1080-Zellen exprimieren endogenes KIAA0175. Diese Zellen wurden entweder mit dem Oligonukleotid FITC (Negativkontrolle) oder mit dem Oligonukleotid AKT1 (Positivkontrolle), oder mit den Oligonukleotiden 1182 oder 545 transfiziert. Kurz gesagt wurden 100 nM des jeweiligen Antisense-Oligonukleotids mit Lipitoid-1-Transfektionsmittel (Huang et al., Chemistry and Biology 5(6): 346–354 (1998)) in einem Volumen-zu-Volumen-Verhältnis von 1:3 in OPTIMEM (GibcoBRL) gemischt. Die Mischung wurde den HT1080-Zellen in Komplettmedium (EMEM, 10% hitzeinaktiviertes, fetales Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin und 1000 μg/ml Streptomycin) zugesetzt, und die Zellen wurden bei 37°C für 4 bis 5 Stunden in Gegenwart des Antisense-Oligonukleotids inkubiert, bevor auf frisches Komplettmedium gewechselt wurde. Die Gesamt-RNA wurde am Tag 1 oder 24, 48 oder 72 Stunden nach der Transfektion extrahiert, und die mRNA-Mengen von KIAA0175 wurden durch Northern-Analyse nachgewiesen. 20 μg Gesamt-RNA wurden in eine Elektrophorese auf einem denaturierenden Agarosegel eingesetzt. Die RNA wurde auf Nitrocellulose überführt, und die KIAA0175-mRNA wurde durch Untersuchung mit einem ³²P-markierten KIAA0175-cDNA-Fragment von 0,7 kB als Sonde nachgewiesen. Um die gleichmäßige Beladung der einzelnen Bahnen zu kontrollieren, wurde die KIAA0175-Sonde von dem Blot entfernt, und es wurde erneut mit einer ³²P-markierten G3PDH-cDNA-Sonde, die von Clontech erhalten wurde, getestet.
Die Daten zeigten, dass jedes der untersuchten KIAA0175-Antisense-Oligonukleotide, d. h. 1182, 545 oder 736 bei der Verringerung des Niveaus der KIAA0175-mRNA-Expression wirksam war. Im Gegensatz dazu waren die reversen Kontrollprimer (RC1182 und RC736) sowie die Kontrollprimer AKT und FITC alle bei der Verringerung der KIAA0175-mRNA-Expression unwirksam. Die KIAA0175-mRNA-Expression nahm über einen Zeitraum von 24 bis 72 Stunden nach der Verabreichung des 545-Antisense-Oligonukleotids und des 1182-Antisense-Oligonukleotids schrittweise zu. FITC hatte in dem untersuchten Zeitraum keinen Effekt auf die KIAA0175-mRNA-Expression.
BEISPIEL 5
WESTERN-ANALYSE DER PROTEINMENGEN VON KIAA0175, P53, ERK2 UND P21 NACH VERABREICHUNG EINES ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDS
sDieses Beispiel zeigt die Wirkung der Verabreichung eines KIAA0175-Antisense-Oligonukleotids auf die Proteinmengen von KIAA0175, p53 und p21.
In getrennten Experimenten wurden entweder HT1080-Zellen oder HCT116-Zellen, die endogenes KIAA0175 und p53 exprimierten, entweder mit FITC, mit KIAA0175-Antisense-Oligonukleotiden (d. h. mit 545 oder 1182) oder mit den entsprechenden reversen Kontroll-Oligonukleotiden (RC oder RC545) transfiziert. Gesamt-Zelllysate wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese fraktioniert und auf Nitrocellulose-Membranen überführt. Spezifische Proteine wurden durch Western-Analyse unter Verwendung von Antikörpern nachgewiesen, die entweder gegen KIAA0175 (polyklonales Antiserum aus Kaninchen), p53, Erk2 oder p21 gerichtet waren; Antikörper wie angegeben. Antikörper gegen p53, p21 und Erk2 wurden von Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) erhalten.
In HT1080-Zellen verursachte die Verabreichung jedes der KIAA0175-Antisense-Oligonukleotide eine Verringerung sowohl der p53-Proteinmenge als auch der p21-Proteinmenge, wobei jedoch die Proteinmenge von Erk2 nicht beeinflußt wurde. Die maximale Antisense-Aktivität von 1182 in HT1080-Zellen wurde sowohl für das KIAA0175-Protein als auch für das p53-Protein bei 48 Stunden beobachtet. Wie vorliegend beschrieben wurden ähnliche Ergebnisse mit HCT116-Zellen erhalten, was ferner auf die breite Art der Wirkung von KIAA0175-Antisense-Molekülen in einer Vielzahl von Zelllinien hindeutet.
BEISPIEL 6
WESTERN-ANALYSE DER PROTEINMENGEN VON P53, ERK2 und P21 NACH γ-BESTRAHLUNG VON ZELLEN, DIE MIT EINEM KIAA0175-ANTISENSE-OLIGONUKLEOTID TRANSFIZIERT WURDEN
Dieses Beispiel zeigt die Auswirkung eines KIAA0175-Antisense-Oligonukleotids auf die durch γ-Bestrahlung induzierte Hochregulierung der p53- und p21-Proteinmenge.
HT1080-Zellen, die endogenes KIAA0175 exprimieren, wurden mit dem KIAA0175-Antisense-Oligonukleotid (1182) und mit dem entsprechenden reversen Kontroll-Oligonukleotid (RC1182) transfiziert. Nach Kultivieren für 24 Stunden wurden die transfizierten Zellen mit 10 Gy γ-Bestrahlung behandelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung wurden die Zellen geerntet, und es wurden Lysate hergestellt und einer SDS-PAGE unterzogen. Die Proteine p53, Erk2 und p21 wurden durch Western-Analyse nachgewiesen.
Die Daten zeigten, dass die Verabreichung des Antisense-Oligonukleotids 1182 die durch γ-Bestrahlung induzierte Erhöhung der p53-Proteinmenge, die bei dem RC1182-Oligonukleotid beobachtet wurde, blockierte. In ähnlicher Weise verursachte das 1182-Oligonukleotid eine Verringerung der p21-Proteinmengen. Als Folge der verringerten p53-Expressionsniveaus zeigten Zellen, die beispielsweise mit dem 1182-Antisense-Oligonukleotid transfiziert waren, eine Erhöhung der Bestrahlungssensitivität und folglich funktioniert das 1182-Antisense-Oligonukleotid als Bestrahlungssensitivierungsmittel.
BEISPIEL 7
PARTIELLER VERLUST DES ANHALTENS DES ZELLZYKLUS BEI γ-BESTRAHLUNG IN HT1080-ZELLEN, DIE MIT EINEM KIAA0175-ANTISENSE-MOLEKÜL TRANSFIZIERT WURDEN
Dieses Beispiel zeigt die Auswirkung von KIAA0175-Antisense-Molekülen auf das Anhalten des Zellzyklus in Reaktion auf eine γ-Bestrahlung.
Weil sowohl p53 als auch p21 beim Übergang von der G1-Phase in die S-Phase des Zellzyklus beteiligt sind, wurden die folgenden Experimente durchgeführt, um die Auswirkung von KIAA0175-Antisense-Molekülen auf die Regulation des Zellzyklus festzustellen.
Tabelle 1 zeigt den prozentualen Anteil von HT1080-Zellen in jeder Stufe des Zellzyklus zu verschiedenen Zeitpunkten nach Behandlung mit γ-Bestrahlung. Bei 24 Stunden wurden Zellen sowohl in der G1- als auch in der G2-Phase angehalten, wie durch den erhöhten prozentualen Anzahl von Zellen in der G0/G1-Phase und in der G2/M-Phase im Vergleich zu dem abnehmenden prozentualen Anteil von Zellen in der S-Phase angezeigt wird. Tabelle 1

0 24 50 72 h nach γ-Bestr. (8Gy)

G0–G1 50,5 59,7 65,2 67,6

S 35,6 13,6 9,5 10,5

G2-M 13,9 26,7 25,3 21,9
Tabelle 2 zeigt die Auswirkungen von KIAA0175-Antisense-Molekülen auf das durch γ-Bestrahlung induzierte Anhalten des Zellzyklus. In Zellen, die mit Antisense-Molekülen transfi ziert waren, gab es im Vergleich zu Zellen, die mit einem "reversen Kontroll"-Antisense-Molekül als Kontrolle transfiziert waren, eine Verringerung bei der Akkumulation von Zellen in der G1-Phase und eine minimierte Verringerung bei der Anzahl von Zellen in der S-Phase. Im Gegensatz dazu blieb der prozentuale Anteil von Zellen, die sich im Phasenübergang G2/M befanden, durch die Verabreichung eines KIAA0175-Antisense-Moleküls unverändert, was zeigt, dass die Auswirkung von KIAA0175-Antisense-Molekülen bei der Freigabe des durch γ-Bestrahlung induzierten Anhaltens des Zellzyklus spezifisch für die G1-Phase in HT1080-Zellen ist. Tabelle 2

RC1182 1182

– + – +

G0–G1 47,6 52,5 47,4 39,3

S 33 14,9 25,7 18,6

G2-M 19,4 32,6 26,8 42,17
Ohne auf eine spezifische Theorie für die vorliegende Erfindung beschränkt zu sein zu wollen, verweisen diese Daten auf eine wichtige Rolle von p53 beim Anhalten des Zellzyklus bei DNA-Schädigung am G1-Kontrollpunkt und legen nahe, dass die Verabreichung von KIAA0175-Antisense-Molekülen eine Verringerung der Genexpression und der Aktivität von p53 verursacht, wodurch die durch γ-Bestrahlung induzierte Blockierung des G1-S-Zellzyklusübergangs abgeschwächt wird.
BEISPIEL 8
SENSITIVIERUNG VON HCT-116-ZELLEN IN BEZUG AUF γ-BESTRAHLUNG UND HYDROXYHARNSTOFF DURCH VERABREICHUNG VON KIAA0175-ANTISENSE-MOLEKÜLEN
Dieses Beispiel zeigt, dass KIAA0175-Antisense-Moleküle wirksam bei der Sensitivierung von Zellen in Bezug auf γ-Bestrahlung oder Hydroxyharnstoff sind.
Die γ-Bestrahlungsbehandlung wurde wie folgt durchgeführt: Am Tag 1 wurden HCT116-Zellen entweder mit dem KIAA0175-Antisense-Molekül Nr. 545 (545) oder mit dem reversen 545-Kontrollmolekül (RC) transfiziert und auf Gewebekulturplatten ausplattiert. Am Tag 3 wurde jeweils eine Platte der 545-transfizierten Zellen und der RC-transfizierten Zellen mit einer γ-Bestrahlung behandelt (2, 4 oder 8 Gy) und für weitere 2 Stunden kultiviert. Die mit γ-Bestrahlung behandelten Zellen sowie die unbehandelten HCT116-Kontroll-Zellen wurden trypsiniert, ausgezählt und in Dreifachansätzen auf Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 1000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 11 Tagen Kultur wurden die Zellen auf ihre Lebensfähigkeit untersucht, indem eine Färbung mit Kristallviolett durchgeführt wurde. Die Gesamtzahl der Zellkolonien wurde anschließend ausgezählt. Repräsentative Daten zeigten, dass die Verabreichung des 545-Antisense-Moleküls die Sensitivität von HCT116-Zellen in Bezug auf γ-Bestrahlung erhöhte, was durch eine Verringerung der Anzahl lebensfähiger Kolonien angezeigt wurde, die aus 545-behandelten Zellen im Vergleich zu RC-behandelten Zellen hervorgingen.
Die Behandlung mit Hydroxyharnstoff wurde wie folgt ausgeführt: Am Tag 1 wurden HCT116-Zellen entweder mit dem KIAA0175-Antisense-Molekül Nr. 545 (545) oder mit dem reversen 545-Kontrollmolekül (RC) transfiziert und auf Gewebekulturplatten ausplattiert. Am folgenden Tag (Tag 2) wurde jeweils eine Platte der 545-transfizierten Zellen und der RC-transfizierten Zellen mit Hydroxyharnstoff behandelt (finale Konzentration 1 mM) und für weitere 24 Stunden kultiviert. Am Tag 3 wurden die mit Hydroxyharnstoff behandelten Zellen sowie die unbehandelten HCT116-Kontroll-Zellen trypsiniert, ausgezählt und in Dreifachansätzen auf Gewebekulturplatten mit 6 Vertiefungen in einer Dichte von 1000 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 11 Tagen Kultur wurden die Zellen auf ihre Lebensfähigkeit untersucht, indem eine Färbung mit Kristallviolett durchgeführt wurde. Die Gesamtzahl der Zellkolonien wurde anschließend ausgezählt. Repräsentative Daten zeigten, dass die Verabreichung des 545-Antisense-Moleküls die Sensitivität von HCT116-Zellen in Bezug auf Hydroxyharnstoff erhöhten, was durch eine Verringerung der Anzahl von lebensfähigen Kolonien angezeigt wurde, die aus 545-behandelten Zellen im Vergleich zu RC-behandelten Zellen hervorgingen.
BEISPIEL 9
SENSITIVIERNG VON TUMORZELLEN IN BEZUG AUF CHEMOTHERAPEUTISCHE WIRKSTOFFE DURCH VERABREICHUNG VON KIAA0175-ANTISENSE-OLIGONUKLEOTIDEN
Dieses Beispiel zeigt die Sensitivierung von Tumorzellen durch Verabreichung von KIAA0175-Antisense-Molekülen.
Die Wirkung von KIAA0175-Antisense-Molekülen auf die Sensitivität von Zellen in Bezug auf chemotherapeutische Wirkstoffe wurde in verschiedenen Zelllinien unter Verwendung des Laktatdehydrogenase (LDH)-Zytotoxizitätsassays untersucht, wobei im Wesentlichen wie folgt vorgegangen wurde:

Tag 1: Zellen wurden in 4 getrennten Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät, üblicherweise 5000 Zellen/Vertiefung, und es wurde bei 37°C und 5 CO₂ inkubiert.
Tag 2: Die Zellen wurden mit den Antisense-Oligonukleotiden KIA175-1182 und KIA175-545 (SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 1) transfiziert, sowie mit den reversen komplementären Kontrollen, RC1182 und RC545 (SEQ ID NO: 6 bzw. SEQ ID NO: 2), wobei im Wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben vorgegangen wurde, mit und ohne Wirkstoff. Eine Platte (Tag 0) wurde als Aussähkontrolle untransfiziert belassen.

Die Transfektion wurde unter Verwendung eines Lipidvehikels für die Zuführung durchgeführt, wie es in der WO 01/16306 beschrieben ist, die vorliegend vollumfänglich eingeschlossen ist. Kurz gesagt verwendete die Transfektion Mittel, die als "Lipitoide" und "Cholesteroide" beschrieben sind, beispielsweise in den PCT-Veröffentlichungen WO 01/16306 , WO 98/06437 und WO 99/08711 , die auf den US-Seriennummern 60/023,867, 60/054,743 und 09/132,808 basieren, welche ebenfalls vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind. Es wird in diesen Veröffentlichungen gezeigt, dass Konjugate aus Lipid und kationischem Peptoid wirksame Reagenzien für die in vitro Zuführung von Plasmid-DNA in Zellen sind. Ein beliebiger der in den obigen Anmeldungen beschriebenen Träger ist für die Verwendung bei der Transfektion der vorliegend beschriebenen Oligonukleotide geeignet.
Diese Verbindungen können durch herkömmliche Synthese in Lösung oder durch Festphasen-Synthese hergestellt werden. In einer solchen Methode, die in der oben zitierten WO 99/08711 beschrieben ist, wird der N-Terminus eines an die Säule gebundenen Peptoids mit einem Spacer acyliert, wie beispielsweise mit Fmoc-Aminohexansäure oder Fmoc-3-Alanin. Nach Entfernung der Fmoc-Gruppe wird die primäre Aminogruppe mit Cholesterolchlorformat umgesetzt, wobei eine Carbamatverbindung gebildet wird. Das Produkt wird dann mit Trifluoressigsäure von der Säule gespalten und durch Reverse-Phase-HPLC gereinigt. Ein von einer Fettsäure abgeleiteter Lipidrest, wie beispielsweise ein Phospholipid, kann anstelle des Steroidrests verwendet werden. Das Steroid oder der andersartige Lipidrest kann auch durch andere Verbindungen an den Peptoidrest gebunden sein, wobei diese von beliebiger Länge und für den Fachmann problemlos verfügbar sind.
Abhängig vom Zelltyp wurden verschiedene Lipidvehikel für verschiedene Zeiträume der Transfektion verwendet. Die Transfektionszeit überschritt jedoch nicht 24 Stunden. Die Transfektion wurde in Komplettmedium durchgeführt, und die finale Antisense-Oligonukleotid-Konzentration betrug 300 nM pro Vertiefung. In den Vertiefungen mit Wirkstoff wurde der Wirkstoff der Kultur zu Beginn der Transfektion zugesetzt.

Beginnend am Tag 3: Die Zellen wurden gewonnen, 1 Platte/Tag und die Freisetzung von LH in den Überstand wurde unter Verwendung eines Kits von Roche gemäß den Anweisungen des Herstellers (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) gemessen (Daten markiert als Tag 1, 2, 3).

Für jede Probe sind die Daten als Verhältnis der Menge von LDH in den Vertiefungen, die Zellen enthielten, welche mit Antisense (AS) transfiziert waren, zu der Menge von LDH in Vertiefungen, die Zellen enthielten, die mit den reversen Komplementären Kontrollen (RC) transfiziert waren (d. h.: AS/RC) ausgedrückt. Somit werden Zellen, die sensitiv in Bezug auf einen Wirkstoff werden, sterben und LDH in den Überstand freigeben. Eine Vergrößerung des Verhältnisses verweist auf einen verstärkten Zelltod und somit auf höhere Mengen von LDH im Medium. Ein Verhältnis von mehr als 1,5 zeigt eine Wirkung des Antisense im Vergleich zur reversen, komplementären Kontrolle an.

Die in Tabelle 3 zusammengefassten Daten zeigen, dass weder KIAA0175-1182 noch KIAA0175-545 eine Wirkung auf die normale Brustepithel-Zelllinie 184B5 aufweist. Im Gegensatz dazu zeigt Tabelle 4, dass KIAA01754-545 die metastatischen Brustkrebszellen MDA-MB-231 in Bezug auf die Wirkungen von Cisplatin und Campthesin (CPT) sensitiviert. Es schien, dass es die Zellen in Bezug auf Wirkung von Doxorubicin (Doxo) nicht sensitiviert. Die Daten in Tabelle 4 zeigen ferner, dass beide Antisense-Moleküle allein eine Erhöhung des Zelltods in der Brustkrebs-Zelllinie verursachten, was darauf verweist, dass KIAA0175 direkt durch Inhibitoren angegriffen wird, und dass ein solcher Inhibitor therapeutisch in Abwesenheit anderer chemotherapeutischer Wirkstoffe verwendet werden kann. Tabelle 3: Wirkung von KIAA0175-Antisense –/+ Cisplatin auf Die normale Brustepithel-Zelllinie 184B5

Tag	Bcl2AS (+ Kontrolle)	KIA175-1182	KIA175-545	KIA175-545 7 μM Cisplatin
0 1 2 3	0,0000 1,2909 1,5415 1,3150	0,0000 1,0223 0,9065 1,0663	0,0000 1,1152 1,1258 1,2934	0,0000 1,0691 1,1928 1,1284

Tabelle 4: Wirkung von KIAA0175-Antisense –/+ Wirkstoff auf die Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB-231

Tag	Bcl2AS	KIA175-1182	KIA175-545	KIA175-545 + Cisplatin	KIA175-545 + Doxo	KIA175-545 + CPT
0 1 2 3	1,03 1,04 2,2 2,23	0,76 2,04 1,67 1,52	0,84 1,05 1,37 1,62	0,71 1,10 1,72 1,95	0,89 1,05 1,39 1,34	0,79 1,12 1,69 1,88

Cis: Cisplatin; Doxo: Doxorubicin; CPT: Campthesin,

BEISPIEL 10
PHOSPHORYLIERUNG VON KIAA0175 DURCH ATM IN REAKTION AUF GAMMA-BESTRAHLUNG
Ataxia telangiectasia mutated (ATM) ist eine Kinase aus der Subfamilie der PI-3-ähnlichen Kinasen und spielt eine zentrale Rolle bei der Reaktion auf DNA-Schädigung. Man nimmt an, dass ATM primär die Reaktion auf eine γ-Bestrahlung kontrolliert.
Die Aminosäuremotive SQ oder TQ sind die bevorzugten Stellen der Phosphorylierung von ATM in zahlreichen seiner bekannten Substrate, einschließlich p53, Chk2, Mdm2 usw. (Kim, S. T. et al., J. Biol. Chem. 1999 274(53): 37538–43). KIAA0175 enthält 3 SQ (Ser 100, Ser 125, Ser 391)-Stellen.
GST-Fusionsproteine, die die Aminosäuren 42–182, 227–325 und 327–517 von KIAA0175 enthielten, wurden exprimiert, aus Escherichia coli gereinigt und auf ihre Fähigkeit untersucht, als Substrat für ATM in vitro zu fungieren. Die Proteine wurden mit ATM-Immunpräzipitaten phosphoryliert. Eine Fusion, die die Aminosäuren 327–517 und S³⁹¹Q enthielt war ein Substrat für ATM. Im Gegensatz dazu war die Phosphorylierung von zwei weiteren KIAA0175-Fusionen, die die Aminosäuren 42–182 (enthal tend S¹⁰⁰Q und S¹²⁵Q) und die Aminosäuren 227–325 ohne SQ-Stellen umfassten, nicht erfolgreich. Darüber hinaus war die Phosphorylierung mit KIAA0175 (327–517) vergleichbar mit derjenigen, die bei einigen anderen Substraten von ATM beobachtet wurde, welche im selben Assay eingeschlossen waren, GST-p53 (1–106), GST-Chk2(1–222) und GST-hDM2 (330–491).
Um weiter zu testen, ob die KIAA0175-Phosphorylierung mittels ATM durch eine DNA-Schädigung reguliert wird, und um weitere putative Stellen der Phosphorylierung zu kartieren, wurde Serin 391 zu Alanin mutiert. ATM, das aus Zellen immunpräzipitiert wurde, die mit γ-Bestrahlung (IR) behandelt worden waren, zeigte eine erhöhte Phosphorylierung gegenüber KIAA0175 (327–517) um den Faktor von etwa 2–3, ähnlich zu der, die bei p53 oder Chk2 beobachtet wurde. Die Mutation von Serin 391 zu Alanin schaltete die durch Bestrahlung induzierte Phosphorylierung durch ATM komplett aus. Diese Ergebnisse zeigen, dass ATM KIAA0175 direkt in vitro in Reaktion auf eine DNA-Schädigung phosphorylieren kann, und es bestätigen, dass die primäre Stelle der Phosphorylierung am Serin 391 liegt.
Der Fachmann wird erkennen oder in der Lage sein, lediglich unter Verwendung von Standardexperimenten festzustellen, dass zahlreiche Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der vorliegend beschriebenen Erfindung bestehen. Solche spezifischen Ausführungsformen und Äquivalente sollen von den nachfolgenden Ansprüche umfasst sein. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Antisense-Moleküls, das sich auf KIAA0175 (SEQ ID NO: 9) bezieht, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Chemosensitivität und/oder der Bestrahlungssensitivität einer Säugetierzelle.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Säugetierzelle eine Tumorzelle ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Erhöhung der Chemosensitivität und/oder der Bestrahlungssensitivität durch eine Messung bestimmt wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Messung einer Verringerung der Proteinmengen von p53 oder p21, die durch γ-Bestrahlung oder Hydroxyharnstoff verursacht wird; der Messung einer Verringerung im Anhalten des Zellzyklus, das durch γ-Bestrahlung oder Hydroxyharnstoff verursacht wird; und der Messung einer Erhöhung der Zellsensitivierung, die durch γ-Bestrahlung oder Hydroxyharnstoff verursacht wird.
Verwendung eines Antisense-Moleküls, das sich auf KIAA0175 (SEQ ID NO: 9) bezieht, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verringerung der Nebenwirkungen einer Krebstherapie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Antisense-Molekül, das sich auf KIAA0175 (SEQ ID NO: 9) bezieht, eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 5.