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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen mit Polypeptid-Analoga
des Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors ("G-CSF"), damit zusammenhängende Nukleinsäuren, und
Vektoren, Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung der vorliegenden,
zu G-CSF analogen Polypeptide mit rekombinanter DNA. Zusätzlich werden
pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren der Verwendung bereitgestellt.
Einige Ausführungsformen
der Erfindung sollten auch noch über
Zusammensetzungen mit G-CSF-Analoga hinaus verallgemeinerbar sein.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Viele
therapeutische Liganden rufen zelluläre Reaktionen durch Binden
an Zelloberflächenrezeptoren hervor,
um zelluläre
Reaktionen hervorzurufen. Das Arzneistoffdesign konzentriert sich
typischerweise auf die Fähigkeit
eines Liganden, fest und spezifisch an sein beabsichtigtes Ziel
zu binden. Wenn der Arzneistoff jedoch ein Protein und das Ziel
ein Zelloberflächenrezeptor
ist, gibt es, von einer Analyse auf der Systemebene aus, zusätzliche
Sachverhalte zu berücksichtigen.
Wenn therapeutische Liganden auf der Oberfläche einer Zelle an Rezeptoren
binden, wird eine intrazelluläre
Signalkaskade ausgelöst,
die letztendlich zu einer angemessenen zellulären Reaktion führt. Zusätzlich beginnt
fast sofort eine Modulation – im
Allgemeinen eine Abschwächung – dieser
Signale durch zelluläres
Trafficking der Liganden-Rezeptor-Komplexe. Die Komplexe auf der
Oberfläche
der Zelle werden in Vesikel internalisiert, die mit endosomalen
Kompartimenten fusionieren. Von Endosomen aus können die Moleküle entweder
zur Degradation in Lysosomen geleitet werden oder intakt der Wiederverwendung
auf der Zelloberfläche
zugeführt
werden, wo freie und ligandengebundene Rezeptoren erneut präsentiert
werden und freier Ligand in das extrazelluläre Medium freigesetzt wird.
Neueste Evidenz legt nahe, dass das Resultat dieser Sortierentscheidung
für Komplexe,
die Wachstumsfaktoren oder Cytokine einbeziehen, häufig mit
der endosomalen Affinitätskonstante
für die
Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung zusammenhängt: Komplexe, die gebunden
bleiben, werden leicht abgebaut, während die, die dissoziieren,
der Wiederverwendung zugeführt
werden [Lauffenburger et al., Chem. Biol. 5: R257–R263 (1998)].
Im Allgemeinen scheint die Dissoziation von Komplexen in Endosomen
das Rezeptor-Recycling zu verstärken,
weil es zu veränderten
Wechselwirkungen zwischen den Rezeptoren und endosomalen Rückhaltekomponenten
führt.
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Zusätzlich deutet
das Modellieren für
eine geringe Zahl intrazellulärer
Komplexe, was für
viele klinisch wichtige Cytokin-Rezeptor-Systeme der Fall ist, eine
besonders starke positive Korrelation zwischen der inversen endosomalen
Affinität
und der Fraktion der Wiederverwendung zugeführter Liganden an [French und
Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng. 25: 690–707 (1997)]. So könnte der
Arzneistoff, falls ein Ligand so gestaltet werden könnte, dass
er die endosomale Dissoziation nach dem Binden an seine Zielzelle
und Erzeugen von Signalen in seiner Zielzelle verstärkt, die
Herunterregulierung des Rezeptors reduzieren, so dass Zellen auf
weitere Ligandenstimulation ansprechbarer würden. Die Lebensdauer und Wirksamkeit
des Arzneistoffes könnten auch
verstärkt
werden, falls das Liganden-Recycling durch endosomale Dissoziation
vermehrt würde.
Dies steht im Gegensatz zu dem herkömmlichen Ansatz, die Ligandenstärke durch
verstärkte
Affinität
zu verbessern. Falls sich Verstärkungen
der extrazellulären
Affinität
auf Endosomen ausdehnen, könnten
derartige Versuche tatsächlich
kontraproduktiv sein, weil sie die Herunterregulierung des Rezeptors
und möglicherweise
die Liganden-Verarmung erhöhen.
So kann das zelluläre
Trafficking ein Engpass beim Verstärken der Ligandenstärke sein,
besonders in Fällen,
wo Abbau durch rezeptorvermittelte Endozytose signifikant ist.
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Ein
System, bei dem die Optimierung zellulärer Trafficking-Eigenschaften
eine tiefgreifende Auswirkung auf die Stärke haben könnte, ist das des Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors
(G-CSF) und dessen Rezeptors (G-CSFR). G-CSF ist ein Cytokin von
19 kD, bei dem es sich um einen der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren
handelt, die auch koloniestimulierende Faktoren genannt werden.
G-CSF wird verwendet, um die Zahlen der weißen Blutzellen (neutrophilen
Zellen) zu erhöhen,
wenn die Blutwerte derartiger Zellen gefährlich niedrig sind. Dies kommt
häufig
vor, wenn bestimmte Antikörper,
anti-HIV-Therapien und/oder Chemotherapien das Knochenmark supprimieren.
Eine neueste Untersuchung dokumentiert, dass G-CSF nicht nur die
Zahl der neutrophilen Zellen im Blut erhöht, sondern auch noch die funktionellen
Killing-Fähigkeiten dieser
Zellen verstärkt
[Vecchiarelli et al., J. Infect. Dis. 171: 1448–1454 (1995)]. G-CSF stimuliert spezifisch die
Proliferation und Differenzierung neutrophiler Vorläuferzellen
zu reifen neutrophilen Zellen [Fukunaga et al., Cell 74: 1079–1087 (1993)]
und ist zum Behandeln bei Neutropenie-Leiden nützlich [Welte et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82: 152–1530
(1985); Souza et al., Science 232: 61–65 (1986); Gabrilove, Sem. Hematol. 26(2):
1–14 (1989)].
G-CSF erhöht
die Zahl der zirkulierenden Granulozyten und es ist berichtet worden,
dass es die Infektion in Sepsis-Modellen verbessert. G-CSF-Verabreichung hemmt
auch die Freisetzung des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF), einem bei
Gewebeverletzung während
Sepsis und Abstoßung
wichtigen Cytokin [Wendel et al., J. Immunol. 149: 918–924 (1992)].
G-CSF ist ein Mitglied der Gruppe-I-Cytokin-Superfamilie, die durch eine antiparallele
4-helikale Bündel-Struktur
gekennzeichnet ist und andere therapeutisch wichtige Arzneistoffe,
wie zum Beispiel Erythropoetin und das Wachstumshormon, einschließt. G-CSF
bindet spezifisch und mit hoher Affinität (scheinbare KD ~
100 pM) [Morstyn, Dexter, & Foote
(Hrsg.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) in: Clinical Practice, Ausg. 2.,
Marcel Dekker, Inc., New York (1998)] an G-CSFR, was zu einem Liganden-Rezeptor-Komplex
mit einer 2:2-Stöchiometrie
führt [Horan
et al., Biochemistry 35: 4886–4896
(1996); Horan et al., J. Biochem. 121: 370–375 (1997)]. Der extrazelluläre Bereich
von G-CSFR enthält
die ligandenbindende Cytokin-Rezeptor-Homologie-(CRH-) Domäne [Fukunaga et al., EMBO J.
10: 2855–2865
(1991)] und kürzlich wurde
die Kristallstruktur von G-CSF im Komplex mit der CRH-Domäne von G-CSFR aufgeklärt, wobei
sie die erwartete 2:2-Stöchiometrie
von Ligand:Rezeptor zeigte [Aritomi et al., Nature, 401: 713–717 (1999)].
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Bei
Menschen ist endogenes G-CSF im Blutplasma nachweisbar [Jones et
al., Bailliere's
Clin. Hematol. 2(1): 83–111
(1989)]. G-CSF wird von Fibroblasten, Makrophagen, T-Zellen, Trophoblasten,
Endothelzellen und Epithelzellen produziert und ist das Expressionsprodukt
eines Gens mit nur einer Kopie, das vier Exons und fünf Introns
umfasst und auf Chromosom siebzehn liegt. Die Transkription dieses
Locus produziert eine mRNA-Spezies, die unterschiedlich prozessiert
wird, was zu zwei Formen der G-CSF-mRNA
führt,
wobei eine Version ein Protein von 177 Aminosäuren kodiert und die andere
ein Protein von 174 Aminosäuren
kodiert [Nagata et al., EMBO J. 5: 575–581 (1986)]. Es ist festgestellt
worden, dass die aus 174 Aminosäuren
bestehende Form spezifische biologische Aktivität in vivo aufweist. SEQ ID
NO: 1 legt eine DNA vor, welche die 174-Aminosäuren-Spezies von G-CSF kodiert
und die entsprechende Sequenz von Aminosäuren wird in SEQ ID NO: 2 dargelegt.
G-CSF ist mit anderen Arten kreuzreaktiv, so dass anhaltende Neutrophil-Leukozytose
hervorgerufen wird, wenn menschliches G-CSF einem anderen Säuger, wie
zum Beispiel einer Maus, einem Hund oder einem Affen, verabreicht
wird [Moore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7134–7138 (1987)].
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Menschliches
G-CSF kann aus etlichen Quellen erhalten und gereinigt werden. Natürliches
menschliches G-CSF kann aus den Überständen kultivierter
menschlicher Tumorzelllinien isoliert werden. Die Entwicklung rekombinanter
DNA-Technologie hat die Herstellung von Mengen an G-CSF in glykosylierter
Form als Produkt eukaroytischer Wirtszellexpression und G-CSF in
nicht glykosylierter Form als Produkt prokaroytischer Wirtszellexpression
im kommerziellen Maßstab
ermöglicht.
Siehe zum Beispiel US-Patent
Nr. 4.810.643 (Souza).
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Es
ist festgestellt worden, dass G-CSF bei der Behandlung von Indikationen,
bei denen eine Zunahme der neutrophilen Zellen Vorteile bereitstellt,
nützlich
ist. Für
Krebspatienten ist G-CSF zum Beispiel als Mittel zum selektiven
Stimulieren der Produktion neutrophiler Zellen vorteilhaft, um hämatopoetische
Defizite zu kompensieren, die sich aus Chemotherapie oder Strahlentherapie
ergeben. Andere Indikationen schließen die Behandlung verschiedener
Infektionskrankheiten und damit zusammenhängender Leiden, wie zum Beispiel Sepsis,
die typischerweise durch einen Bakterienmetaboliten verursacht wird,
ein. G-CSF ist auch alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen,
wie zum Beispiel anderen Cytokinen, zum Wachstum oder zur Expansion
von Zellen in Kultur nützlich
(zum Beispiel für
Knochenmarktransplantate oder ex-vivo-Expansion). G-CSF ist Transplantatpatienten
als ein Zusatz zur Behandlung einer Infektion oder zur Behandlung
der Neutropenie verabreicht worden [Diflo et al., Hepatology 16:
PA 278 (1992); Wright et al., Hepatology 14: PA 48 (1991); Lachaux
et al., J. Ped. 123:1005–1008
(1993); Colquehoun et al., Transplantation 56: 755–758 (1993)]. G-CSF wird jedoch schnell
durch rezeptorvermittelte Endozytose von peripheren neutrophilen
Zellen und Vorläuferzellen
im Knochenmark, die G-CSFR exprimieren, beseitigt [Morstyn, Dexter, & Foote (Hrsg.)
Filgrastim (r-metHuG-CSF) in: Clinical Practice, Ausg. 2., Marcel
Dekker, Inc., New York (1998)]. So wird die Stärke des Arzneistoffes durch
diesen negativen Rückkopplungsmechanismus
reduziert. Da Zellen G-CSFR normalerweise in geringen Mengen exprimieren,
kann das Senken der endosomalen Affinität des Komplexes nicht nur die Herunterregulierung
des Rezeptors reduzieren, sondern kann auch das Liganden-Recycling
verstärken,
wie durch Modellieren vorhergesagt wird [French und Lauffenburger,
Ann. Biomed. Eng. 25: 690–707
(1997)]. Deshalb ist G-CSF ein erstklassiger Kandidat für Mutagenese,
um die Trafficking-Eigenschaften zu verstärken und damit die Arzneistoffstärke zu verbessern.
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Von
verschiedenen veränderten
G-CSFs ist berichtet worden. Im Allgemeinen ist beim Gestalten von Arzneistoffen
bekannt, dass bestimmte Änderungen
bestimmte strukturelle Wirkungen haben. Zum Beispiel könnte das
Deletieren eines Cysteins zum Entfalten eines Moleküls führen, das
in seinem unveränderten
Zustand normalerweise über
eine Disulfidbrücke
gefaltet ist. Es gibt andere, dem Fachmann bekannte, Verfahren zum
Hinzufügen,
Deletieren oder Substituieren von Aminosäuren, um die Funktion eines
Proteins zu ändern.
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Rekombinante
menschliche G-CSF-Mutanten sind hergestellt worden, aber das Herstellungsverfahren
schließt
eine umfassende Information über
die Struktur-Funktions-Beziehung
nicht ein. Zum Beispiel ist von der Mutation und biochemischen Modifikation
von Cys18 berichtet worden [Kuga et al., Biochem. Biophy. Res. Comm.
159: 103–111
(1989); Lu et al., Arch. Biochem. Biophys. 268: 81–92 (1989)].
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Im
US-Patent Nr. 4.810.643 mit dem Titel "Production of Pluripotent Granulocyte
Colony-Stimulating Factor" (das
hier durch Bezugnahme aufgenommen ist) werden Polypeptid-Analoga
und Peptidfragmente von G-CSF im Allgemeinen offenbart. Bestimmte
offenbarte G-CSF Analoga schließen
solche ein, bei denen die Cysteine an den Positionen 17, 36, 42,
64 und 74 (von den Spezies mit 174 Aminosäuren oder denen mit 175 Aminosäuren, wobei
die zusätzliche
Aminosäure
ein N-terminales Methionin ist) durch andere Aminosäuren (wie
zum Beispiel Serin) substituiert sind, und G-CSF mit einem Alanin
an der ersten (N-terminalen) Position.
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EP 0 335 423 mit dem Titel "Modified human G-CSF" offenbart wie verlautet
die Modifikation von mindestens einer Aminogruppe in einem Polypeptid
mit hG-CSF-Aktivität.
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EP 0 272 703 mit dem Titel "Novel Polypeptide" offenbart wie verlautet
G-CSF-Derivate mit
einer substituierten oder deletierten Aminosäure am oder "in der Nachbarschaft" des N-Terminus.
Auch Okabe et al. [Blood 75 (9): 1788–1793 (1990)] offenbart wie
verlautet Modifikationen von fünf
Positionen des N-terminalen Bereichs von menschlichem G-CSF.
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EP 0 459 630 mit dem Titel "Polypeptides" offenbart wie verlautet
Derivate von natürlich
vorkommendem G-CSF mit mindestens einer der biologischen Eigenschaften
des natürlich
vorkommenden G-CSF und einer Lösungsstabilität von mindestens
35 bei 5 mg/ml, wobei bei dem Derivat mindestens das Cys
17 der nativen Sequenz durch einen Ser
17-Rest ersetzt ist und das Asp
27 der
nativen Sequenz durch einen Ser
27-Rest ersetzt
ist.
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EP 0 256 843 mit dem Titel "Expression of G-CSF
and Muteins Thereof and Their Uses" offenbart wie verlautet eine modifizierte
DNA-Sequenz, die G-CSF-kodiert, wobei der N-Terminus zur verstärkten Proteinexpression
in rekombinanten Wirtszellen modifiziert ist, ohne die Aminosäurequenz
des Proteins zu ändern.
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EP 0 243 153 mit dem Titel "Human G-CSF Protein
Expression" offenbart
wie verlautet, dass G-CSF durch Inaktivieren von mindestens einer
Hefe-KEX2-Protease-Prozessierungsstelle
für eine
erhöhte
Ausbeute bei der rekombinanten Herstellung unter Verwendung von
Hefe modifiziert werden soll.
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Shaw,
US-Patent Nr. 4.904.584 mit dem Titel "Site-Specific Homogeneous Modification
of Polypeptides",
offenbart wie verlautet Lysin-veränderte Proteine.
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WO/9012874
offenbart wie verlautet Cystein-veränderte Varianten von Proteinen.
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Das
australische Patentanmeldungs-Dokument Nr. AU-A-10948/92 mit dem
Titel "Improved
Activation of Recombinant Proteins" offenbart wie verlautet das Hinzufügen von
Aminosäuren
zu einem Terminus eines G-CSF-Moleküls zu dem Zweck, beim Falten
des Moleküls
nach prokaryotischer Expression zu helfen.
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Das
australische Patentanmeldungs-Dokument Nr. AU-A-76380/91 mit dem
Titel "Muteins of
the Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)" offenbart wie verlautet
Muteine von G-CSF in der Sequenz Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile an
Position 50–56
des G-CSF mit 174 Aminosäuren
und Position 53 bis 59 des G-CSF mit 177 Aminosäuren und/oder mindestens einem
der vier Histidinreste an den Positionen 43, 79, 156 und 170 des
reifen G-CSF mit 174 Aminosäuren
oder an den Positionen 46, 82, 159 oder 173 des reifen G-CSF mit
177 Aminosäuren.
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GB 2 213 821 mit dem Titel "Synthetic Human Granulocyte
Colony Stimulating Factor Gene" offenbart wie
verlautet eine synthetische, G-CSF kodierende Nukleinsäuresequenz,
die Restriktionsstellen eingliedert, um die Kassetten-Mutagenese
ausgewählter
Bereiche zu erleichtern und flankierende Restriktionsstellen, um das
Eingliedern des Gens in ein erwünschtes
Expressionssystem zu erleichtern.
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Das
US-Patent Nr. 5.214.132 offenbart wie verlautet die Modifikation
von menschlichem G-CSF an den Aminosäurepositionen 1, 3, 4, 5 und
17 [siehe auch Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103–111 (1989)].
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Das
US-Patent Nr. 5.218.092 offenbart wie verlautet die Modifikation
von menschlichem G-CSF an den Aminosäurepositionen 1, 3, 4, 5, 17,
145 und 147.
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Das
US-Patent Nr. 5.581.476 offenbart die dreidimensionale Struktur
von G-CSF auf atomarer Ebene. Aus dieser dreidimensionalen Struktur
kann man mit deutlicher Bestimmtheit vorhersagen, wie Änderungen
in der Zusammensetzung eines G-CSF-Moleküls zu strukturellen Änderungen
führen
können.
Diese strukturellen Kennzeichen können mit biologischer Aktivität korreliert
werden, um G-CSF-Analoga zu gestalten und herzustellen.
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Signaltransduktion,
der Weg, auf dem G-CSF den zellulären Stoffwechsel beeinflusst,
ist derzeit nicht gründlich
verstanden. Im Allgemeinen bindet G-CSF an und aktiviert den G-CSF-Zelloberflächenrezeptor durch
Konformationsänderungen.
Diese Bindung löst
dadurch eine Signal-Kaskade aus (z.B. das Rekrutieren von Kinasen
zur cytoplasmatischen Domäne),
was anscheinend die Änderungen
in bestimmten Vorläuferzellen
auslöst,
die zu zellulären
Reaktionen wie zum Beispiel Differenzierung, Proliferation und Wanderung
führt. Man
denkt, dass der G-CSF/G-CSFR-Komplex endozytischen Trafficking-Vorgängen der
Internalisierung und Sortierung zum Recycling oder Abbau unterworfen
wird [Lauffenburger und Linderman, Rezeptors: Models for Binding,
Trafficking, and Signaling, New York: Oxford University Press (1993)].
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Die
endozytische Aufnahme von G-CSF ermöglicht den intrazellulären proteolytischen
Cytokin-Abbau in endosomalen und/oder lysosomalen Kompartimenten.
Internalisierte Cytokinrezeptoren können, wenn sie nicht der Wiederverwendung
zugeführt
werden, zerstört
werden. So könnte
endozytisches Trafficking die Verarmung von G-CSF aus dem extrazellulären Medium
sowie die Herunterregulierung des G-CSF-Rezeptors verursachen. Demgemäß wäre es vorteilhaft,
die G-CSF-Struktur in einer Weise zu verändern, die richtige Rezeptoraktivierung
zur Signaltransduktion erhält,
aber die endozytische Internalisierung verringert und/oder das endosomale
Sortieren in Richtung Recycling statt Abbau verstärkt [Lauffenburger
et al., Scratching The (Cell) Surface: Cytokine Engineering For
Improved Ligand/Receptor Trafficking Dynamics, Chem & Biol 5: R257–R263 (1988)].
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Es
gibt also einen Bedarf, bessere therapeutische Liganden von G-CSF
zu entwickeln. Derartige Mittel hätten längere Halbwertszeiten und würden stärkere Zellproliferation
induzieren, falls der Ligand nicht so zu Endozytose und anschließendem lysosomalen
Abbau neigen würde.
Demgemäß ist es
ein Ziel der vorliegenden Erfindung, diese Liganden und Verfahren
zu ihrer Herstellung und zum Testen von ihnen bereitzustellen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In
dieser Erfindung beschreiben wir einen Ansatz, die Stärke von
G-CSF durch gestaltete Verbesserungen im zellulären Trafficking zu verbessern.
Es ist festgestellt worden, dass die Substitutionen der vorliegenden
Erfindung im Vergleich zum G-CSF von SEQ ID NO: 2 oder rekombinantem
G-CSF mit einem Methioninrest an Position –1 ("metG-CSF" oder "r-met-HuG-CSF") zu G-CSF-Analoga mit einer Wirkung
auf zelluläres
Trafficking führen.
Soweit hierin nicht anders angegeben, werden diese Spezies gemeinsam
als "Wildtyp" bezeichnet. Die
Wirkungen von diesen Modifikationen demonstrieren Vorteile in der
Stabilität
und der Stärke, die
bei anderen G-CSF-Spezies nicht gesehen werden. Insbesondere stellen
dieses Analoga eine verstärkte zelluläre Reaktion
(eine G-CSF-agonistische Art von Aktivität) bereit. Derartige Änderungen
der zellulären
Reaktion finden durch Beeinflussen der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder
der Vorgänge
des Sortierens, Recyclings und Abbaus über die endozytischen Liganden/Rezeptor-Traffickingwege statt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptide,
die eine Aminosäuresubstitution
in der Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus: 1) Substitution von Asparaginsäure durch Histidin an Position
Nummer 109, [His109]G-CSF; 2) Substitution
von Asparaginsäure
durch Histidin an Position Nummer 112, [His112]G-CSF;
3) Substitution von Glutamin durch Histidin an Position Nummer 119,
[His119]G-CSF; und 4) eines der Polypeptidanaloga,
wahlweise einschließlich eines
N-terminalen Methionylrestes. Derartige Analoga können zusätzlich mit
einem oder mehreren wasserlöslichen
Polymeren derivatisiert werden.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung Polynukleotide bereit, die vorstehend beschriebene,
zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptide kodieren. Derzeit bevorzugte
Polynukleotide werden in den DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 3, 5 oder
7 (und den Komplementärsträngen) dargelegt
und schließen
solche ein, die zusätzlich
einen N-terminalen Methionylrest kodieren.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
beinhaltet die Erfindung ein Expressionskonstrukt, das ein Polynukleotid,
wie vorstehend dargelegt, enthält.
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Darüberhinaus
stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die ein Polynukleotid,
wie vorstehend dargelegt, enthält.
Derzeit bevorzugte Wirtszellen werden aus der Gruppe, bestehend
aus Bakterien, Säugerzellen, Tumorzellen,
Hefezellen und Insektenzellen, ausgewählt.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen der
zu G-CSF analogen Polypeptide [His109]G-CSF,
[His112]G-CSF, [His119]G-CSF
und deren Met–1-Spezies
aus einer Wirtszelle bereit, die Nukleinsäure, die derartige Analoga
kodiert, enthält,
wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren der Wirtszelle, die ein
Polypeptid, wie vorstehend dargelegt, enthält, unter Bedingungen, welche die
Expression eines derartigen Polypeptids erleichtern; und Erhalten
eines derartigen, zu G-GSF analogen Polypeptids.
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Die
Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit,
die ein zu G-CSF analoges Polypeptid, wie vorstehend dargelegt,
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfassen. Diese Zusammensetzungen können bei Verfahren zum Behandeln
von hämatopoetischen,
neurologischen oder mit der Fortpflanzung zusammenhängenden
Leiden eingesetzt werden, die daraus bestehen, eine wirksame Menge einer
wie vorstehend dargelegten Zusammensetzung an einen Patienten, der
dessen bedarf, zu verabreichen. Derartige Leiden schließen reduzierte
hämatopoetische
Funktion, reduzierte Immunfunktion, reduzierte Zahl neutrophiler
Zellen, reduzierte Mobilisierung neutrophiler Zellen, Mobilisierung
peripherer Blutvorläuferzellen, Sepsis,
schwerwiegende chronische Neutropenie, Knochenmarktransplantate,
Infektionskrankheiten, Leukopenie, Thrombozytopenie, Anämie, Verbessern
der Übertragung
von Knochenmark während
einer Transplantation, Verbessern der Knochenmarkerholung bei der
Behandlung von strahlungs-, chemisch oder chemotherapeutisch induzierter
Knochenmarkaplasie oder Myelosuppression und erworbenes Immundefektsyndrom ein.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, Zellen für Chemotherapie
oder Strahlentherapie zu sensibilisieren, bestehend aus dem Verabreichen
einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie
vorstehend dargelegt, an einen Patienten, der dessen bedarf.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Kultivieren hämatopoetischer
Zellen in vitro bereit, umfassend: Platzieren der Zellen in ein
geeignetes Kulturmedium, wobei das geeignete Kulturmedium ein zu
G-CSF analoges Polypeptid, wie vorstehend dargelegt, enthält; und
Bereitstellen geeigneter Bedingungen für das Wachstum der hämatopoetischen
Zellen.
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Die
Erfindung stellt auch ein Verfahren, wie vorstehend dargelegt, bereit,
wobei die Behandlung, das Sensibilisieren oder Kultivieren die Verwendung
von mindestens einem zusätzlichen
Faktor, ausgewählt
aus EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, Interleukinen,
IGF-1, LIF, Interferon, einem neurotrophen Faktor, dem flt-3/flk-2-Liganden
und einem Fibroblastenwachstumsfaktor, einschließt. Dementsprechend stellt
die Erfindung ein Kit bereit, das Komponenten für das Kultivieren hämatopoetischer
Zellen enthält,
bestehend aus: einem der Polypeptidanaloga, wie vorstehend dargelegt,
zum Herstellen von Medium zum Kultivieren hämatopoetischer Zellen geeignete Komponenten
und wahlweise mindestens einen zusätzlichen Faktor, wie vorstehend
dargelegt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Es
ist festgestellt worden, dass G-CSF bei der Behandlung verschiedener
Leiden, bei denen eine Zunahme der neutrophilen Zellen Vorteile
bereitstellt, nützlich
ist. Zum Beispiel ist G-CSF für
Krebspatienten als Mittel zum selektiven Stimulieren der Produktion
neutrophiler Zellen vorteilhaft, um hämatopoetische Defizite zu kompensieren,
die sich aus Chemotherapie oder Strahlentherapie ergeben. Andere
Indikationen schließen die
Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten und damit zusammenhängender
Leiden, wie zum Beispiel Sepsis, die typischerweise durch einen
Bakterienmetaboliten verursacht wird, ein. G-CSF ist auch alleine oder
in Kombination mit anderen Verbindungen, wie zum Beispiel anderen
Cytokinen, zum Wachstum oder zur Expansion von Zellen in Kultur
(zum Beispiel für
Knochenmarktransplantate oder ex-vivo-Expansion) nützlich. G-CSF
ist Transplantatpatienten als ein Zusatz zur Behandlung einer Infektion
oder zur Behandlung der Neutropenie verabreicht worden. G-CSF wird
jedoch schnell durch rezeptorvermittelte Endozytose von peripheren neutrophilen
Zellen und Vorläuferzellen
im Knochenmark, die G-CSFR exprimieren, beseitigt und so wird die Stärke des
Arzneistoffes durch diesen negativen Rückkopplungsmechanismus reduziert.
Da Zellen G-CSFR normalerweise in geringen Mengen exprimieren, kann
das Senken der endosomalen Affinität des Komplexes nicht nur die
Herunterregulierung des Rezeptors reduzieren sondern kann auch das
Liganden-Recycling verstärken,
wie durch Modellieren vorhergesagt wird. Deshalb würde die
Arzneistoffstärke
durch Mutationen des G-CSF verbessert, welche die Trafficking-Eigenschaften
verbessern würden.
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Die
vorliegende Erfindung befasst sich mit neuen, zu G-CSF analogen
Polypeptiden, die Vorteile in der Stabilität demonstrieren, die bei anderen
G-CSF-Spezies nicht gesehen werden. Insbesondere stellen diese Analoga
eine verstärkte
zelluläre
Reaktion (eine superagonistische oder G-CSF-agonistische Art von
Aktivität) im
Vergleich zu Wildtyp-G-CSF bereit. Derartige Änderungen der zellulären Reaktion
ergeben sich durch Beeinflussen der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder
der Vorgänge
des Sortierens, Recyclings und Abbaus über die endozytischen Liganden/Rezeptor-Traffickingwege.
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Alle
analogen Änderungen
der vorliegenden Erfindung beruhen auf der 174-Aminosäuren-Sequenz für G-CSF
in SEQ ID NO: 2. Einem Fachmann wird ersichtlich sein, dass die
Analoga der vorliegenden Erfindung auch mit einem N-terminalen Methioninrest
konstruiert werden können.
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Die Überschriften
der Abschnitte werden hierin nur für organisatorische Zwecke verwendet
und sollen nicht so ausgelegt werden, dass sie in irgendeiner Weise
den beschriebenen Inhalt beschränken.
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A. Rolle von G-CSF bei
der Behandlung von Neutropenie
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Es
ist festgestellt worden, dass G-CSF bei der Behandlung von Leiden
nützlich
ist, bei denen eine Zunahme der neutrophilen Zellen Vorteile bereitstellt.
Für Krebspatienten
ist G-CSF zum Beispiel als Mittel zum selektiven Stimulieren der
Produktion neutrophiler Zellen vorteilhaft, um hämatopoetische Defizite zu kompensieren,
die sich aus Chemotherapie oder Strahlentherapie ergeben. Andere
Indikationen schließen
die Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten und damit zusammenhängender
Leiden, wie zum Beispiel Sepsis, die typischerweise durch einen
Bakterienmetaboliten verursacht wird, ein. G-CSF ist auch alleine
oder in Kombination mit anderen Verbindungen, wie zum Beispiel anderen
Cytokinen, zum Wachstum oder zur Expansion von Zellen in Kultur
(zum Beispiel für
Knochenmarktransplantate oder ex-vivo-Expansion) nützlich.
G-CSF ist Transplantatpatienten als ein Zusatz zur Behandlung einer
Infektion oder zur Behandlung der Neutropenie verabreicht worden
(Diflo et al., Hepatology 16: PA 278 (1992); Wright et al., Hepatology
14: PA 48 (1991); Lachaux et al., J. Ped. 123: 1005–1008 (1993);
Colquehoun et al., Transplantation 56: 755–758 (1993)].
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Der
Begriff "Neutropenie" bezeichnet ein Leiden
mit einer abnormal geringen Zahl neutrophiler Zellen im peripheren
Blutkreislauf. Die neutrophile Zelle entsteht aus dem Knochenmark
und ist vollständig
reif, wenn sie in den Blutkreislauf freigesetzt wird. Sie ist dann
vollständig
bereit, in ihrer Rolle an vorderster Front der zellulären Abwehr
zu funktionieren. Sie wird aktiviert, d. h. fähig, viele ihrer Funktionen
auszuüben,
indem sie bestimmten proinflammatorischen Mediatoren und den chemotaktischen
Faktoren, die sie zum Ort eines anreizenden Stimulus anziehen, ausgesetzt
wird. Schwerwiegende Neutropenie kann lebensbedrohlich sein, weil sie
zu schwerwiegenden Infektionen führen
kann.
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Alternativ
dazu bezeichnet der Begriff "Neutrophilie" ein Leiden mit einer
abnormal hohen Zahl neutrophiler Zellen im peripheren Blutkreislauf.
Neutrophilie, oder eine erhöhte
Leukozytenzahl, hat viele Ursachen, einschließlich Belastung durch extreme Kälte, Hitze,
kürzliche
Operation, körperliches
Trauma, jede Art von Infektion, Verbrennungen, Schocks, Tumore,
nicht durch Infektion verursachte Entzündung, wie zum Beispiel Gicht,
Arthritis, Schilddrüsenprobleme
und Drogen.
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B. G-CSF-Analoga der vorliegenden
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung zieht die Herstellung von Analoga der Wildtyp-G-CSF-Polypeptide und der sie
kodierenden Polypeptide in Betracht, wobei 1) Histidin für Asparaginsäure an Position
109 substituiert wird, [His109]G-CSF; 2)
Histidin für
Asparaginsäure
an Position 112 substituiert wird, [His112]G-CSF;
und 3) Histidin für
Glutamin an Position 119 substituiert wird, [His119]G-CSF,
und deren Met–1-Spezies.
Die vorstehenden Substitutionen entsprechen der Nummerierung von
SEQ ID NO: 2. Die Aminosäuresequenzen
für diese
drei Analoga können
in SEQ ID NO: 4, 6 bzw. 8 gefunden werden. Die vorliegende Erfindung
zieht die Herstellung von Polypeptiden in Betracht, die zum menschlichen
G-CSF analog sind, die eine erhöhte
Stärke
relativ zu Wildtyp-G-CSF beim Stimulieren der zellulären Proliferation
und erhöhte
Halbwertszeiten haben. Derartige Änderungen der zellulären Reaktion
finden durch Beeinflussen der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder der
Vorgänge des
Sortierens, Recyclings und Abbaus über die endozytischen Liganden/Rezeptor-Traffickingwege
statt.
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Diese
Analoga wurden mittels eines allgemeinen Computersystems für das Design
von Liganden unter Verwendung einzelner Substitutionen zu Histidin
entwickelt, die als pH-aktivierte Schalter wirken, um die zellulären Trafficking-Eigenschaften
zu verbessern. Die hierin beschriebene Strategie nutzt den pH-Unterschied
zwischen dem extrazellulären
Medium und endosomalen Kompartimenten als Schalter zur Protonierung
von Histidin aus, um die endosomale Affinität des Liganden-Rezeptor-Komplexes
zu reduzieren, und es wird vorausgesagt, dass dies das Recycling
von intaktem Liganden zurück
in das extrazelluläre
Medium verstärkt.
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Die
Auswahl von Resten für
eine Mutation zu Histidin wurde durch elektrostatische Erwägungen geleitet.
Es war die Absicht, G-CSF-Analoga zu schaffen, die G-CSFR mit nahezu
der (oder wenn möglich,
höherer
als) Wildtyp-Affinität
bei neutralem Histidin binden würden,
die aber bei positiv geladenem Histidin schwach binden würden. Bei
saurem pH-Wert würde
die Bindungsaffinität
von der bei neutralem pH-Wert auf Kosten des Deprotonierens von
Histidin in ungebundenem G-CSF gesenkt [Yang und Honig, J. Mol.
Biol. 231: 459–474
(1993)]. Falls der pKa-Wert von Histidin
in ungebundenem Protein 6,5 wäre
[Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742: 576–585 (1982)], würde dies
zu einer 10-fach geringeren Affinität bei pH 5,5 führen.
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Kandidaten
für Histidinmutationen
wurden durch ein Drei-Schritt-Verfahren in silico identifiziert.
Zuerst wurde die Beschaffenheit der elektrostatischen Bindungswechselwirkungen
unter Verwendung eines Verfahrens [Kangas und Tidor, J. Chem. Phys.
109: 7522–7545
(1998)] quantifiziert, das ausdrücklich
Liganden-Ablösung
und -Wechselwirkung berücksichtigt
und Bereiche an der Berührungsfläche lokalisiert,
die für
optimales Binden etwas zu negativ oder zu positiv sind. Zweitens
wurden Versuchs-Histidinanaloga
von G-CSF (sowohl neutrale als auch positiv geladene) konstruiert
und energieminimiert. Drittens wurde die elektrostatische freie Bindungsenergie
von jedem berechnet.
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Das
hierin ausführlich
beschriebene Konzept bezieht neue G-CSF-Mutanten ein, die rational
gewählt wurden.
Die Kristallstruktur des Komplexes aus G-CSF und dessen Rezeptor,
G-CSFR, wurde benutzt, um das elektrostatische Nettopotenzial an
der Hauptbindungs-Berührungsfläche zwischen
Ligand und Rezeptor zu berechnen. Aminosäurereste auf G-CSF, die restliches
elektrostatisches Nettopotenzial beitrugen, wurden als Kandidaten
für Mutagenese
gewählt.
Die Vorherrschaft übermäßig negativer
Bereiche zeigt eine überhöhte negative
Ladungsdichte an und schließt
Stellen ein, die den geladenen Resten Glu19,
Asp109 und Asp112 sowie
den polaren Resten Gln20, Thr116 und
Gln119 entsprechen, was anzeigt, dass es
eine unzureichende entsprechende positive Ladungsdichte vom Rezeptor
gibt. Elektrostatische Beiträge
zum Binden können
durch verringerte negative Ladung auf dem Liganden an diesen sechs
Stellen verstärkt
werden; neutrales Histidin kann im Komplex toleriert werden, aber
positiv geladenes Histidin könnte
die positive Ladungsdichte des Rezeptors abstoßen. Um diese Stellen zu testen,
wurden an den identifizierten Resten einzelne Histidinmutanten mit
Hilfe eines Computers konstruiert.
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Unter
Verwendung der dreidimensionalen kristallographischen Struktur des
Komplexes aus G-CSF und seinem Rezeptor (G-CSFR) kann das elektrostatische
Nettopotenzial an der Hauptbindungs-Berührungsfläche zwischen Ligand und Rezeptor
berechnet werden. Siehe US-Patent Nr. 5.581.476 (hierin durch Bezugnahme
aufgenommen); Aritomi et al., Nature 401(6754): 713–718 (1999).
Aminosäurereste
auf G-CSF, die restliches
elektrostatisches Nettopotenzial beitrugen, wurden als Kandidaten
für Mutagenese
gewählt.
Sechs derartige Reste wurden auf G-CSF identifiziert: Asp112, Asp109, Gln119, Gln20, Thr116 und Glu19. Insbesondere
sind drei der vorgeschlagenen einzelnen Histidinsubstitutionen hergestellt
und getestet worden: Asp109His ([His109]G-CSF),
Asp112His ([His112]G-CSF)
und Gln119His ([His119]G-CSF)
(unter Verwendung der Nummerierung von SEQ ID NO: 2 mit dem Methionin
bei –1).
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Das
Grundprinzip der Histidinmutagenese von G-CSF war, das zellluläre Trafficking
von G-CSF und/oder G-CSFR zu beeinflussen. Nach dem Binden an G-CSFR auf der Oberfläche einer
Zelle wird G-CSF in die Zelle internalisiert und in endosomalen
Vesikeln wird eine Sortierentscheidung gefällt. Die Komponenten des Komplexes
können
entweder in den Lysosomen abgebaut werden oder intakt der Wiederverwendung
auf der Oberfläche
zugeführt
werden. Bei vielen anderen Liganden/Rezeptorsystemen ist bekannt,
dass der Ligand und Rezeptor, wenn sie im Komplex bleiben, vorzugsweise
abgebaut werden; wenn der Komplex jedoch in den Endosomen dissoziiert,
gibt es verstärktes
Recycling des Liganden und/oder Rezeptors. Auf der Zelloberfläche ist
der pH-Wert der Umgebung ungefähr
7,0; in den Endosomen ist der pH-Wert etwa 5,0–6,0. Da die Aminosäure Histidin
der einzige Rest ist, von dem erwartet wird, dass er in diesem pH-Bereich
titriert, ist zu erwarten, dass die Histidinsubstitution die zellulären Trafficking-Eigenschaften
beeinflusst. Genauer gesagt verändern
einzelne Histidinmutanten die Trafficking-Eigenschaften, beruhend
auf den Unterschieden in der elektrostatischen freien Bindungsenergie
bei pH 7,0 versus pH 5,0, ausschließlich infolge einer Protonierung des
mutierten Histidins bei pH 5,0.
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Speziell
durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen wird eine ortsspezifische
Mutagenese genomischer, cDNA- und synthetischer DNA-Sequenzen des
Wiltdtyp-G-CSF-Polypeptids. Derzeit bevorzugte erfindungsgemäße Polynukleotidsequenzen
schließen
die DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 3 [His109]G-CSF; SEQ
ID NO: 5 [His112]G-CSF; SEQ ID NO: 7 [His119]G-CSF und deren Met–1-Spezies
ein. Diese DNA-Sequenzen können
auch modifiziert werden, um eine andere Version von G-CSF zu kodieren,
die mindestens eine der hämatopoetischen
biologischen Eigenschaften des natürlich vorkommenden menschlichen
G-CSF hat. Vorzugsweise handelt es sich bei der biologischen Eigenschaft
um die Eigenschaft, an einen G-CSF-Rezeptor zu binden, aber eine
andere biologische Eigenschaft ist die Fähigkeit, die Proliferation
hämatopoetischer
Zellen zu stimulieren. Andere biologische Eigenschaften sind Fachleuten
ersichtlich (siehe auch Souza, vorstehend).
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Diese
DNA-Sequenzen können
Kodons eingliedern, welche die Transkription und Translation von mRNA
in mikrobiellen Wirten erleichtern. Derartige Herstellungs-Sequenzen können gemäß den auf
dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren leicht konstruiert werden.
Siehe auch Alton et al., PCT-veröffentlichte Anmeldung
WO 83/04053. Die vorstehenden DNAs können auch wahlweise einen N-terminalen
Methionylrest kodieren.
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Die
durch die Erfindung bereitgestellten DNA-Sequenzen sind beim Erzeugen
neuer und nützlicher
viraler und Plasmid-DNA-Vektoren, neuer und nützlicher transformierter und
transfizierter prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen (einschließlich Bakterien-,
Hefe- und Säugerzellen,
die man in Kultur wachsen lässt)
und neuer und nützlicher
Verfahren für
das Wachstum derartiger Wirtszellen in Kultur, die zur Expression der
vorliegenden G-CSF-Analoga fähig
sind, nützlich.
Die DNA-Sequenzen, welche die hierin beschriebenen, biologisch aktiven
G-CSF-Analoga kodieren (oder die entsprechenden RNAs) können zur
Gentherapie in Fällen
nützlich
sein, wo Unterproduktion von G-CSF gelindert würde oder der Bedarf für erhöhte G-CSF-Spiegel besteht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der
vorliegenden G-CSF-Analoga mit rekombinanter DNA bereit. Bereitgestellt
wird ein Verfahren zum Herstellen der G-CSF-Analoga aus einer Wirtszelle,
die Nukleinsäure
enthält,
die derartige Analoga kodiert, bestehend aus: a) Kultivieren der
Wirtszelle, die eine Nukleinsäure
enthält,
die derartige G-CSF-Analoga kodiert, unter Bedingungen, welche die
Expression eines derartigen DNA-Moleküls erleichtern; und b) Erhalten
derartiger G-CSF-Analoga.
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Man
kann derartige G-CSF-Analoga wahlweise von anderen im Verfahren
erhaltenen Komponenten reinigen und isolieren. Verfahren zur Reinigung
können
im US-Patent Nr.
5.849.883 gefunden werden. Andere Verfahren sind auf dem Fachgebiet
wohlbekannt (siehe auch Souza, vorstehend).
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Wirtszellen
können
prokaryotisch oder eukaryotisch sein und schließen Bakterien, Säugerzellen
(wie zum Beispiel Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Affenzellen,
Nierenzellen von Babyhamstern, Krebszellen oder andere Zellen),
Hefezellen und Insektenzellen ein. Bevorzugt wegen der größten Bequemlichkeit
bei der kommerziellen Herstellung ist eine Herstellung unter Verwendung
einer Bakterien-Wirtszelle.
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C. Proteinherstellung
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In
Anbetracht der vorstehenden Offenbarung von Polypeptiden, die zum
menschlichen G-CSF analog sind, wird es dem Fachmann möglich sein,
zum menschlichen G-CSF
analoge Polypeptide durch automatisierte Peptidsynthese, durch rekombinante
Techniken oder beides herzustellen.
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Die
Analoga des menschlichen G-CSF der Erfindung können in Lösung oder auf einem festen
Träger in Übereinstimmung
mit herkömmlichen
Techniken synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthetisierer
sind im Handel erhältlich
und können
in Übereinstimmung
mit bekannten Protokollen verwendet werden. Siehe zum Beispiel Stewart
und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, Pierce Chemical
Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield,
Science 232: 341–347
(1986) und Barany und Merrifield, The Peatides, Gross und Meienhofer
(Hrsg.), Academic Press, New York, 1–284 (1979). Das aktive Protein
kann leicht synthetisiert und dann in Durchmusterungsassays durchgemustert
werden, die so gestaltet werden, dass reaktive Peptide identifiziert
werden.
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Alternativ
dazu kann eine Vielfalt von Vektor/Wirt-Expressionssystemen benutzt
werden, um eine für ein
Analogon des menschlichen G-CSF kodierende Sequenz zu enthalten
und zu exprimieren. Dieses schließen Mikroorganismen wie Bakterien,
die mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren
transformiert sind, Hefe, die mit Hefe-Expressionsvektoren transformiert
ist, Insektenzellsysteme, die mit viralen Expressionsvektoren (z.B.
Baculovirus) infiziert sind, Pflanzenzellsysteme, die mit viralen
Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus,
TMV) transfiziert oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B.
dem Plasmid Ti oder pBR322) transformiert sind oder tierische Zellsysteme
ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Säugerzellen, die bei rekombinanten
Proteinherstellungen nützlich
sind, schließen
VERO-Zellen, HeLa-Zellen, Ovarzelllinien aus chinesischem Hamster
(CHO), COS-Zellen (wie zum Beispiel COS-7), die Zellen W138, BHK,
HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 und 293 ein, sind aber nicht
darauf beschränkt.
Exemplarische Protokolle für
die rekombinante Expression des Proteins werden hierin nachstehend
beschrieben.
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Ein
Hefesystem kann eingesetzt werden, um die Analoga des menschlichen
G-CSF der vorliegenden Erfindung
zu erzeugen. Der kodierende Bereich der cDNA für ein Analogon des menschlichen
G-CSF wird durch PCR amplifiziert. Eine DNA, welche die Hefe-Leadersequenz
Prepro-Alpha kodiert, wird aus genomischer Hefe-DNA in einer PCR-Reaktion
unter Verwendung eines Primers, der die Nukleotide 1–20 des
Gens für
den alpha-Mating-Faktor enthält,
und eines weiteren Primers, der zu den Nukleotiden 255–235 dieses
Gens komplementär
ist, amplifiziert [Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933–943 (1982)].
Die kodierende Sequenz für den
Prepro-Alpha-Leader und Fragmente mit der kodierenden Sequenz für ein menschliches
G-CSF-Analogon werden in ein Plas mid ligiert, das den Promotor der
Hefe-Alkohol-Dehydrogenase (ADH2) enthält, so dass der Promotor die
Expression eines Fusionsproteins steuert, das aus dem Prepro-Alpha-Faktor besteht, der
an das reife, zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptid fusioniert
ist. Wie von Rose und Broach [Meth. Enz. 185: 234–279, Goeddel
(Hrsg.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990)] gelehrt wird,
schließt
der Vektor weiterhin einen ADH2-Transkriptionsterminator stromabwärts von
der Klonierungsstelle, den Hefe-Replikationsursprung "2-micron", das Hefegen leu-2d,
die Hefegene REP1 und REP2, das E.-coli-Gen für beta-Lactamase und einen
E.-coli-Replikationsursprung ein. Die Gene für beta-Lactamase und leu-2d
stellen Selektion in Bakterien bzw. Hefe bereit. Das Gen leu-2d
ermöglicht
auch eine erhöhte
Kopienzahl des Plasmids in Hefe, um höhere Expressionswerte zu induzieren.
Die Gene REP1 und REP2 kodieren Proteine, die an der Regulation
der Plasmid-Kopienzahl beteiligt sind.
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Das
im vorhergehenden Absatz beschriebene DNA-Konstrukt wird unter Verwendung
eines bekannten Verfahrens, z.B. Lithiumacetat-Behandlung [Stearns
et al., Meth. Enz. 185: 280–297
(1990)], in Hefezellen transformiert. Der ADH2-Promotor wird nach
Erschöpfung
der Glukose im Wachstumsmedium induziert [Price et al., Gene 55:
287 (1987)]. Die Prepro-Alpha-Sequenz bewirkt eine Sekretion des
Fusionsproteins aus den Zellen. Dazu begleitend spaltet das Hefeprotein
KEX2 die Prepro-Sequenz von den reifen Analoga des menschlichen
G-CSF ab [Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330–5334 (1984)].
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Alternativ
dazu können
Analoga des menschlichen G-CSF unter Verwendung eines im Handel
erhältlichen
Expressionssysstems, z.B. des Pichia-Expressionssystems (Invitrogen,
San Diego, CA), in Hefe rekombinant exprimiert werden, indem den
Anleitungen des Herstellers gefolgt wird. Dieses System beruht auch
auf der Prepro-Alpha-Sequenz,
um die Sekretion zu steuern, aber die Transkription des Inserts
wird nach Induktion durch Methanol durch den Promotor der Alkoholoxidase
(AOX1) angetrieben.
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Das
sezernierte Analogon des menschlichen G-CSF wird aus dem Hefe-Wachstumsmedium
z.B. durch die Verfahren gereinigt, die verwendet werden, um ein
Analogon des menschlichen G-CSF aus Überständen von Bakterien- und Säugerzellen
zu reinigen.
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Alternativ
dazu kann die cDNA, die Analoga des menschlichen G-CSF kodiert,
in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 kloniert werden (PharMingen,
San Diego, CA). Dieser Vektor, der ein Analogon des menschlichen
G-CSF enthält,
wird dann gemäß den Anleitungen
des Herstellers (PharMingen) verwendet, um Spodoptera frugiperda
Zellen in proteinfreien sF9-Medien zu infizieren und rekombinantes
Protein herzustellen. Das Protein wird unter Verwendung einer Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia,
Piscataway, NJ) und aufeinanderfolgender Säulen, die nach Molekulargröße ordnen
(Amicon, Beverly, MA), aus den Medien gereinigt und konzentriert
und in PBS resuspendiert. Eine SDS-PAGE-Analyse zeigt eine einzelne
Bande und bestätigt die
Größe des Proteins
und eine Edman-Sequenzierung auf einem Proton 2090 Peptid-Sequenzierer bestätigt dessen
N-terminale Sequenz.
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Alternativ
dazu können
die Analoga des menschlichen G-CSF in einem Insektensystem exprimiert werden.
Insektensysteme zur Proteinexpression sind Fachleuten wohlbekannt.
In einem derartigen System wird ein Autographa californica nuclear
polyhedrosis-Virus (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um fremde Gene in
Spodoptera frugiperda Zellen oder in Trichoplusia Larven zu exprimieren.
Die kodierende Sequenz für
ein Analogon des menschlichen G-CSF wird in einen nichtessentiellen
Bereich des Virus kloniert, wie zum Beispiel das Polyhedrin-Gen,
und unter Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gestellt. Eine erfolgreiche
Insertion des Analogons des menschlichen G-CSF macht das Polyhedrin-Gen
inaktiv und produziert einen rekombinanten Virus, dem die Hüllprotein-Hülle fehlt.
Die rekombinanten Viren werden dann verwendet, um S. frugiperda
Zellen oder Trichoplusia Larven zu infizieren, in denen ein Analogon
des menschlichen G-CSF exprimiert wird [Smith et al., J. Virol.
46: 584 (1983); Engelhard EK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91: 3224–7
(1994)].
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In
einem anderen Beispiel wird die DNA-Sequenz, welche die reife Form
des Proteins kodiert, durch PCR amplifiziert und in einen geeigneten
Vektor kloniert, zum Beispiel pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ). Der
pGEX Vektor wird so gestaltet, dass er ein Fusionsprotein herstellt,
das Glutathion-S-transferase (GST), die durch den Vektor kodiert
wird, und ein Protein umfasst, das durch ein DNA-Fragment kodiert
wird, das in die Klonierungsstelle des Vektors eingefügt wird.
Die Primer für
die PCR können
so erzeugt werden, dass sie zum Beispiel eine geeignete Spaltungsstelle
einschließen.
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Das
rekombinante Fusionsprotein kann dann von dem GST-Anteil des Fusionsproteins
abgespalten werden. Das Konstrukt aus pGEX-3X/Analogon des menschlichen
G-CSF wird dann in E. coli XL-1 Blue Zellen (Stratagene, La Jolla
CA) transformiert und einzelne Transformanten werden isoliert und
wachsen gelassen. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wird
gereinigt und unter Verwendung eines automatisierten Sequenzierers
teilweise sequenziert, um die Anwesenheit des Gen- Inserts, das das
erwünschte
Analogon des menschlichen G-CSF kodiert, in der richtigen Orientierung
zu bestätigen.
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Während bestimmte
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung in Betracht ziehen, das zum menschlichen
G-CSF analoge Protein unter Verwendung synthetischer Peptid-Synthetisierer
und anschließender
FPLC-Analyse und geeigneter Neufaltung der Cystein-Doppelbindungen
herzustellen, wird in Betracht gezogen, dass eine rekombinante Proteinherstellung
auch verwendet werden kann, um zum menschlichen G-CSF analoge Peptidzusammensetzungen
herzustellen. Zum Beispiel wird eine Induktion des Fusionsproteins
aus GST/Analogon des menschlichen G-CSF erreicht, indem man die
transformierte XL-1 Blue Kultur bei 37°C in LB-Medium (ergänzt durch
Carbenicillin) bis zu einer optischen Dichte von 0,4 bei einer Wellenlänge von
600 nm wachsen lässt,
gefolgt von weiterer, 4 Stunden langer Inkubation in Anwesenheit
von 0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
(Sigma Chemical Co., St. Louis MO).
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Das
Fusionsprotein, von dem erwartet wird, dass es als unlöslicher
Einschlusskörper
in den Bakterien hergestellt wird, kann folgendermaßen gereinigt
werden. Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, in 0,15 M NaCl,
10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA gewaschen und mit 0,1 mg/ml Lysozym
(Sigma Chemical Co.) 15 Min. lang bei Raumtemperatur behandelt.
Das Lysat wird durch Sonifizieren geklärt und Zellüberreste werden durch 10 Min.
lange Zentrifugation bei 12.000 × g pelletiert. Das Pellet,
welches das Fusionsprotein enthält,
wird in 50 mM Tris, pH 8 und 10 mM EDTA resuspendiert, auf 50% Glycerin überschichtet
und 30 Min. lang bei 6.000 × g
zentrifugiert. Das Pellet wird in Mg++-
und Ca++-freier phosphatgepufferter Standard-Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert.
Das Fusionsprotein wird weiter durch Fraktionieren des resuspendierten
Pellets in einem denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gel (Sambrook
et al., vorstehend) gereinigt. Das Gel wird in 0,4 M KCl eingeweicht,
um das Protein sichtbar zu machen, das dann ausgeschnitten und in
Gel-Laufpuffer ohne SDS eluiert wird. Falls das Fusionsprotein aus
GST/Analogon des menschlichen G-CSF in Bakterien als lösliches
Protein hergestellt wird, kann es unter Verwendung des GST-Reinigungs-Moduls
(Pharmacia Biotech) gereinigt werden.
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Das
Fusionsprotein kann Verdauung unterworfen werden, um die GST von
dem reifen, dem menschlichen G-CSF analogen Protein abzuspalten.
Die Verdauungsreaktion (20–40 μg Fusionsprotein,
20–30
Einheiten menschliches Thrombin (4000 U/mg (Sigma) in 0,5 ml PBS])
wird 16–48
Std. bei Raumtemperatur inkubiert und auf ein denaturierendes SDS-PAGE-Gel
geladen, um die Reaktionsprodukte zu fraktionieren.
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Das
Gel wird in 0,4 M KCl eingeweicht, um die Proteinbanden sichtbar
zu machen. Die Identität
der Proteinbande, die dem erwarteten Molekulargewicht des Analogons
des menschlichen G-CSF entspricht, kann durch teilweise Aminosäuresequenzanalyse
unter Verwendung eines automatisierten Sequenzierers (Applied Biosystems
Model 473A, Foster City, CA) bestätigt werden.
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Alternativ
dazu kann die DNA-Sequenz, die das vorhergesagte reife, zum menschlichen
G-CSF analoge Protein kodiert, in ein Plasmid kloniert werden, das
einen erwünschten
Promotor und wahlweise eine Leadersequenz enthält [siehe z.B. Better et al.,
Science 240: 1041–43
(1988)]. Die Sequenz dieses Konstrukts kann durch automatisiertes
Sequenzieren bestätigt
werden. Das Plasmid wird dann in den E.-coli-Stamm MC1061 unter
Verwendung von Standardverfahren, die CaCl2-Inkubation
und Hitzeschockbehandlung der Bakterien einsetzen (Sambrook et al.,
vorstehend), transformiert. Man lässt die transformierten Bakterien
in mit Carbenicillin ergänztem
LB-Medium wachsen und die Herstellung des exprimierten Proteins
wird durch Wachstum in einem geeigneten Medium induziert. Falls
vorhanden, beeinflusst die Leadersequenz die Sekretion des reifen,
zum menschlichen G-CSF analogen Proteins und wird während der
Sekretion abgespalten.
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Das
sezernierte rekombinante Protein wird aus dem bakteriellen Kulturmedium
durch das hierin nachstehende Verfahren gereinigt.
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Säuger-Wirtssysteme
zur Expression des rekombinanten Proteins sind Fachleuten auch wohlbekannt. Wirtszell-Stämme können wegen
einer besonderen Fähigkeit
gewählt
werden, das exprimierte Protein zu prozessieren oder bestimmte posttranslationale
Modifikationen zu produzieren, die beim Bereitstellen der Proteinaktivität nützlich sind.
Derartige Modifikationen des Polypeptids schließen Acetylierung, Carboxylierung,
Glykosylierung, Phosphorylierung, Modifikation mit Lipiden und Acylierung
ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Posttranslationales Prozessieren,
das eine "Prepro"-Form des Proteins
spaltet, kann auch für
eine korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion wichtig sein.
Unterschiedliche Wirtszellen, wie zum Beispiel CHO, HeLa, MDCK,
293, WI38 und dergleichen haben eine spezifische zelluläre Maschinerie
und kenzeichnende Mechanismen für
derartige posttranlationale Aktivitäten und können gewählt werden, um die korrekte
Modifikation und Prozessierung des eingeführten fremden Proteins sicherzustellen.
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In
einem besonders bevorzugten Verfahren der rekombinanten Expression
der zum menschlichen G-CSF analogen Proteine der vorliegenden Erfindung
werden 293- Zellen
mit Plasmiden, welche die cDNA für ein
Analogon des menschlichen G-CSF enthalten, in den pCMV-Vektor (5' CMV Promotor, 3' HGH poly-A-Sequenz)
und pSV2neo (der das neo-Resistenzgen enthält) durch das Calciumphosphatverfahren
kotransfiziert. Vorzugsweise sollten die Vektoren vor der Transfektion
mit Sca I linearisiert werden. In ähnlicher Weise kann ein alternatives
Konstrukt unter Verwendung eines ähnlichen pCMV-Vektors, bei
dem das neo-Gen eingegliedert ist, verwendet werden. Stabile Zelllinien
werden aus einzelnen Zellklonen durch beschränkende Verdünnung in Wachstumsmedien, die
0,5 mg/ml G418 (ein Neomycin-ähnliches
Antibiotikum) enthalten, 10–14
Tage lang selektiert. Die Zelllinien werden auf die Expression eines
Analogons des menschlichen G-CSF hin durch ELISA oder Western-Blot
durchgemustert und hoch exprimierende Zelllinien werden für ein Wachstum
im großen
Maßstab
expandiert.
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Es
ist vorzuziehen, dass die transformierten Zellen für eine Langzeit-Proteinherstellung
mit hoher Ausbeute verwendet werden, und stabile Expression ist
an sich wünschenswert.
Sobald derartige Zellen mit Vektoren transformiert sind, die selektierbare
Marker zusammen mit der erwünschten
Expressionskassette enthalten, kann man den Zellen erlauben, 1–2 Tage
in einem angereicherten Medium zu wachsen, bevor sie auf selektive
Medien umgestellt werden. Der selektierbare Marker wird so gestaltet,
dass er Resistenz gegen Selektion verleiht, und seine Anwesenheit
erlaubt Wachstum und Gewinnung von Zellen, welche die eingeführten Sequenzen
erfolgreich exprimieren. Resistente Klumpen stabil transformierter
Zellen können
unter Verwendung von Zellkulturtechniken, die für die Zelle geeignet sind,
proliferiert werden.
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Etliche
Selektionssysteme können
verwendet werden, um die Zellen, die transformiert worden sind, für die rekombinante
Proteinherstellung zu gewinnen. Derartige Selektionssysteme schließen die
Gene für Thymidinkinase
aus HSV, Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase
und Adenin-Phosphoribosyltransferase in tk-, hgprt- beziehungsweise
aprt-Zellen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Anti-Metaboliten-Resistenz kann auch
als Selektionsbasis für
dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht, gpt, das Resistenz gegen
Mycophenolsäure
verleiht, neo, das Resistenz gegen das Aminoglycosid G418 verleiht,
also, das Resistenz gegen Chlorsulfuron verleiht, und hygro, das
Resistenz gegen Hygromycin verleiht, verwendet werden. Zusätzliche
selektierbare Gene, die nützlich
sein können,
schließen
trpB, das Zellen erlaubt, Indol anstelle von Tryptophan zu benutzen,
oder hisD, das Zellen erlaubt, Histinol anstelle von Histidin zu
benutzen, ein. Marker, die einen sichtbaren Hinweis zur Identifikation
von Transformanten ergeben, schließen Anthocyane, β-Glucuronidase
und dessen Substrat GUS und Luciferase und dessen Substrat Luciferin
ein.
-
D. Proteinreinigung
-
Es
wird wünschenswert
sein, die zum menschlichen G-CSF analogen Proteine, die durch die
vorliegende Erfindung erzeugt werden, zu reinigen. Proteinreinigungstechniken
sind Fachleuten wohlbekannt. Diese Techniken beziehen auf einer
Ebene die grobe Fraktionierung des zellulären Milieus in eine Polypeptidfraktion
und Fraktionen ohne Polypeptid ein. Wenn das Polypeptid von anderen
Proteinen abgetrennt worden ist, kann das Polypeptid von Interesse
unter Verwendung chromatographischer und elektrophoretischer Techniken weiter
gereinigt werden, um eine teilweise oder vollständige Reinigung (oder Reinigung
bis zur Homogenität) zu
erreichen. Analytische Verfahren, die besonders zur Herstellung
eines reinen Peptids geeignet sind, sind Ionenaustauschchromatographie,
Ausschlusschromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese und isoelektrische
Fokussierung. Ein besonders effizientes Verfahren, Peptide zu reinigen,
ist schnelle Protein-Flüssigchromatographie
oder sogar HPLC.
-
Bestimmte
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung betreffen die Reinigung, und, in besonderen
Ausführungsformen,
die wesentliche Reinigung eines kodierten Proteins oder Peptids.
Der Begriff "gereinigtes
Protein oder Peptid",
wie hierin verwendet, soll eine Zusammensetzung, die frei von anderen
Komponenten isolierbar ist, bezeichnen, wobei das Protein oder Peptid
zu einem Grad relativ zu seinem natürlich erhältlichen Zustand gereinigt
wird. Ein gereinigtes Protein oder Peptid bezeichnet deshalb auch
ein Protein oder Peptid, das frei von der Umgebung ist, in der es
natürlicherweise
vorkommen kann.
-
Im
Allgemeinen bezeichnet "gereinigt" eine Protein- oder
Peptidzusammensetzung, die einer Fraktionierung unterworfen worden
ist, um verschiedene andere Komponenten zu entfernen, wobei die
Zusammensetzung im Wesentlichen ihre exprimierte biologische Aktivität beibehält. Wo der
Begriff "wesentlich
gereinigt" verwendet
wird, bezeichnet diese Benennung eine Zusammensetzung, bei der das
Protein oder Peptid die Hauptkomponente der Zusammensetzung bildet,
wobei sie zum Beispiel etwa 50%, etwa 60%, etwa 70%, etwa 80%, etwa
90%, etwa 95% oder mehr der Proteine in der Zusammensetzung ausmacht.
-
Verschiedene
Verfahren zum Quantifizieren des Reinigungsgrades des Proteins oder
Peptids sind Fachleuten angesichts der vorliegenden Offenbarung
bekannt. Diese schließen
zum Beispiel das Bestimmen der spezifischen Aktivität einer
aktiven Fraktion oder das Abschätzen
der Polypeptidmenge in einer Fraktion durch SDS/PAGE-Analyse ein.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Abschätzen der Reinheit einer Fraktion
ist es, die spezifische Aktivität
der Fraktion zu berechnen, sie mit der spezifischen Aktivität des anfänglichen
Extrakts zu vergleichen, und so den Reinheitsgrad zu berechnen,
der hierin durch eine "-fache
Reinigungszahl" abgeschätzt wird.
Die tatsächlichen
Einheiten, die verwendet werden, um die Aktivitätsmenge zu repräsentieren, hängen natürlich von
der besonderen Assaytechnik ab, die gewählt wird, um der Reinigung
zu folgen, und davon, ob das exprimierte Protein oder Peptid eine
nachweisbare Aktivität
aufweist.
-
Verschiedene
zur Verwendung bei einer Proteinreinigung geeignete Techniken sind
Fachleuten wohlbekannt. Diese schließen zum Beispiel Präzipitation
mit Ammoniumsulfat, PEG, Antikörpern
oder dergleichen, Hitzedenaturierung, gefolgt von Zentrifugation,
Chromatographieschritte, wie zum Beispiel Ionenaustausch, Gelfiltration,
Umkehrphasen-, Hydroxylapatit- und Affinitätschromatographie, isoelektrische
Fokussierung, Gelelektrophorese und Kombinationen derartiger und
anderer Techniken ein. Wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt
ist, glaubt man, dass die Reihenfolge, mit der die verschiedenen
Reinigungsschritte ausgeführt werden,
geändert
werden kann, oder dass bestimmte Schritte ausgelassen werden können, und
immer noch ein geeignetes Verfahren zur Herstellung eines wesentlich
gereinigten Proteins oder Peptids ergeben.
-
Es
gibt keine allgemeine Erfordernis, dass das Protein oder Peptid
immer in dem gereinigtesten Zustand bereitgestellt werden muss.
Es wird in der Tat in Betracht gezogen, dass weniger wesentlich
gereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen von Nutzen sind.
Eine teilweise Reinigung kann erreicht werden, indem weniger Reinigungsschritte
in Kombination verwendet werden, oder durch Benutzen unterschiedlicher Arten
des gleichen allgemeinen Reinigungsschemas. Es ist zum Beispiel
ersichtlich, dass eine Kationenaustausch-Säulenchromatographie, die unter
Verwendung einer HPLC-Apparatur durchgeführt wird, im Allgemeinen einer
höhere "-fache" Reinigung ergeben
wird als die gleiche Technik unter Verwendung eines Niedrigdruck-Chromatographiesystems.
Verfahren, die einen niedrigen Grad relativer Reinigung aufweisen,
können Vorteile
bei der Gesamtgewinnung eines Proteinprodukts oder beim Aufrechterhalten
der Aktivität
eines exprimierten Proteins haben.
-
Es
ist bekannt, dass die Wanderung eines Polypeptids bei unterschiedlichen
Bedingungen von SDS/PAGE manchmal signifikant variieren kann [Capaldi
et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 76: 425 (1977)]. Es ist deshalb
ersichtlich, dass unter unterschiedlichen Elektrophoresebedingungen
die scheinbaren Molekulargewichte gereinigter oder teilweise gereinigter
Expressionsprodukte variieren können.
-
Man
kann derartige G-CSF-Analoga wahlweise von anderen Komponenten,
die bei dem Verfahren erhalten werden, reinigen und isolieren. Reinigungsverfahren
können
im US-Patent Nr. 5.849.883 gefunden werden. Andere Verfahren sind
auf dem Fachgebiet wohlbekannt (siehe auch Souza, vorstehend, jedes
hier durch Bezugnahme aufgenommen). Diese Dokumente beschreiben
spezifische beispielhafte Verfahren zur Isolierung und Reinigung
von G-CSF-Zusammensetzungen, die beim Isolieren und Reinigen der
G-CSF-Analoga der vorliegenden Erfindung nützlich sein können. In
Anbetracht der Offenbarung dieser Patente ist es offensichtlich,
dass sich ein Fachmann zahlreicher Reinigungstechniken bewusst wäre, die
verwendet werden können,
um G-CSF aus einer bestimmten Quelle zu isolieren.
-
Es
wird auch in Betracht gezogen, dass eine Kombination von Anionenaustausch- und Immunaffinitätschromatographie
eingesetzt werden kann, um gereinigte Zusammensetzungen mit einem
G-CSF-Analogon der vorliegenden Erfindung herzustellen.
-
E. Vektoren zum Klonieren,
zum Gentransfer und zur Expression
-
Wie
im vorhergehenden Abschnitt diskutiert wurde, werden Expressionsvektoren
eingesetzt, um das zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptidprodukt
zu exprimieren, das dann gereinigt werden und zur Behandlung der
Neutropenie verwendet werden kann. In anderen Ausführungsformen
können
Expressionsvektoren in Gentherapie-Anwendungen verwendet werden, um die
Nukleinsäuren,
die ein Analogon des menschlichen G-CSF kodieren, in Zellen einzuführen, die
dessen bedürfen,
und/oder um die Expression eines Analogons des menschlichen G-CSF
in derartigen Zellen zu induzieren. Der vorliegende Abschnitt ist
auf eine Beschreibung der Herstellung derartiger Expressionsvektoren
gerichtet.
-
Expression
erfordert, dass geeignete Signale in den Vektoren bereitgestellt
werden, die verschiedene regulatorische Elemente einschließen, wie
zum Beispiel Enhancer/Promotoren aus sowohl Virus- als auch Säuger-Quellen,
die eine Expression der Gene von Interesse in Wirtszellen antreiben.
Elemente, die so gestaltet sind, dass die Stabilität und Translatierbarkeit
von messenger-RNA in Wirtszellen optimiert wird, werden auch beschrieben.
Die Bedingungen für
die Verwendung etlicher dominanter Arzneistoff-Selektionsmarker zum
Etablieren permanenter, stabiler Zellklone, die das Produkt exprimieren,
werden auch bereitgestellt, sowie ein Element, dass die Expression
der Arzneistoff-Selektionsmarker mit der Expression des Polypeptids
verbindet.
-
a. Regulatorische Elemente
-
Promotoren und Enhancer.
-
Überall in
dieser Anwendung soll der Begriff "Expressionskonstrukt" oder "Expressionsvektor" jede Art eines genetischen Konstrukts
einschließen,
das eine Nukleinsäure
enthält,
die Genprodukte kodiert, wobei ein Teil oder die ganze kodierende
Nukleinsäuresequenz
fähig ist,
transkribiert zu werden. Das Transkript kann zu einem Protein translatiert
werden, muss aber nicht. In bestimmten Ausführungsformen schließt die Expression sowohl
die Transkription eines Genes als auch die Translation von mRNA
zu einem Genprodukt ein. Die Nukleinsäure, die ein Genprodukt kodiert,
steht unter transkriptioneller Kontrolle eines Promoters. Ein "Promotor" bezeichnet eine
DNA-Sequenz, die durch die Synthesemaschinerie der Zelle oder eine
eingeführte
Synthesemaschinerie erkannt wird, und die erforderlich ist, um die
spezifische Transkription eines Gens zu initiieren. Der Begriff "unter transkriptioneller
Kontrolle" bedeutet,
dass der Promotor am richtigen Ort und in der richtigen Orientierung
in Relation zu der Nukleinsäure
ist, um die Initiation der RNA-Polymerase und die Expression des Gens
zu kontrollieren.
-
Der
Begriff "Promotor" wird hierin verwendet,
um eine Gruppe transkriptioneller Kontrollmodule zu bezeichnen,
die um die Initiationsstelle für
RNA-Polymerase II herum angehäuft
sind. Vieles am Denken darüber, wie
Promotoren organisiert sind, wird aus Analysen einiger viraler Promotoren
abgeleitet, einschließlich
derer für
die Thymidin-Kinase-(tk)
aus HSV und die SV40 frühen
Transkriptionseinheiten. Diese Untersuchungen, vermehrt durch neuere
Arbeit, haben gezeigt, dass sich Promotoren aus diskreten funktionellen
Modulen zusammensetzen, wobei jedes aus ungefähr 7–20 bp DNA besteht und eine
oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionelle
Aktivator- oder Repressorproteine enthält.
-
Mindestens
ein Modul in jedem Promotor hat die Funktion, die Startstelle für die RNA-Synthese
zu positionieren. Das am besten bekannte Beispiel dafür ist die
TATA-Box, aber in
einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, wie zum Beispiel
dem Promotor für
das Gen der terminalen Säuger-Desoxynucleotidyltransferase
und dem Promotor für
die späten
SV40-Gene, hilft ein diskretes Element, das über der Startstelle selbst liegt,
den Inititationsort festzulegen.
-
Zusätzliche
Promotorelemente regulieren die Häufigkeit der transkriptionellen
Initiation. Typischerweise liegen diese im Bereich 30–110 bp
stromaufwärts
von der Startstelle, obwohl von etlichen Promotoren kürzlich gezeigt
wurde, dass sie funktionelle Elemente auch stromabwärts der
Startstelle enthalten. Der Abstand zwischen Promotorelementen ist
häufig
flexibel, so dass die Promotorfunktion erhalten bleibt, wenn Elemente umgekehrt
oder relativ zueinander bewegt werden. Im tk-Promotor kann der Abstand
zwischen Promotorelementen auf 50 bp auseinander erhöht werden,
bevor die Aktivität
zu sinken beginnt. Abhängig
vom Promotor scheint es, dass einzelne Elemente entweder kooperativ
oder unabhängig
funktionieren können,
um die Transkription zu aktivieren.
-
Man
glaubt nicht, dass der jeweilige Promoter, der eingesetzt wird,
um die Expression einer Nukleinsäuresequenz
von Interesse zu kontrollieren, wichtig ist, so lange er fähig ist,
die Expression der Nukleinsäure in
der gezielt veränderten
Zelle zu steuern. So ist es vorzuziehen, wo eine menschliche Zelle
gezielt verändert wird,
den kodierenden Nukleinsäurebereich
angrenzend an und unter die Kontrolle eines Promotors zu platzieren,
der fähig
ist, in einer menschlichen Zelle exprimiert zu werden. Allgemein
ausgedrückt
könnte
ein derartiger Promotor entweder einen menschlichen oder viralen
Promotor einschließen.
-
In
verschiedenen Ausführungsformen
können
der Promotor des immediate-early-Gens
des menschlichen Cytomegalovirus (CMV), der frühe SV40-Promotor, das lange
terminale Repeat des Rous Sarcoma Virus, β-Aktin, der Ratten-Insulin-Promotor,
der Promotor der Phosphoglycerinkinase und der Promotor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, die
alle wohlbekannte Promotoren und Fachleuten leicht erhältlich sind,
verwendet werden, um eine Expression der kodierenden Sequenz von
Interesse auf hohem Niveau zu erhalten. Die Verwendung anderer viraler
oder Säugerzellen-
oder bakterieller Phagen-Promotoren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt
sind, um die Expression einer kodierenden Sequenz von Interesse
zu erreichen, wird ebenfalls in Betracht gezogen, vorausgesetzt,
dass die Expressionsniveaus für
einen bestimmten Zweck ausreichen. Durch Einsetzen eines Promotors
mit wohlbekannten Eigenschaften können das Niveau und Muster
der Expression des Proteins von Interesse nach Transfektion oder
Transformation optimiert werden.
-
Die
Auswahl eines Promotors, der in Reaktion auf spezifische physiologische
oder synthetische Signale reguliert wird, kann eine induzierbare
Expression des Genprodukts gestatten. Einige induzierbare Promotorsysteme
sind zur Herstellung viraler Vektoren erhältlich. Ein derartiges System
ist das Ecdyson-System (Invitrogen, Carlsbad, CA), das so gestaltet
wird, dass es die regulierte Expression eines Gens von Interesse
in Säugerzellen
ermöglicht.
Es besteht aus einem straff regulierten Expressionsmechanismus,
der praktisch keine Grundexpression des Transgens erlaubt, aber
eine über
200-fache Induzierbarkeit.
-
Ein
anderes induzierbares System, das nützlich wäre, ist das Tet-OffTM oder Tet-OnTM-System
(Clontech, Palo Alto, CA), das ursprünglich von Gossen und Bujard
entwickelt wurde [Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
15; 89 (12): 5547–51
(1992); Gossen et al., Science 268 (5218): 1766–9 (1995)].
-
Unter
einigen Umständen
kann es wünschenswert
sein, die Expression eines Transgens in einem Gentherapie-Vektor
zu regulieren. Zum Beispiel können
unterschiedliche virale Promotoren mit variierenden Aktivitätsstärken, abhängig von
dem erwünschten
Expressionsniveau, benutzt werden. In Säugerzellen wird der Immediate-early-Promotor aus
CMV oft verwendet, um eine starke transkriptionelle Aktivierung
bereitzustellen. Modifizierte Versionen des CMV-Promotors, die weniger
stark sind, sind auch verwendet worden, wenn reduzierte Expressionsniveaus
des Transgens erwünscht
sind. Wenn die Expression eines Transgens in hämatopoetischen Zellen erwünscht ist,
werden oft retrovirale Promotoren, wie zum Beispiel die LTRs von
MLV oder MMTV, verwendet. Andere virale Promotoren, die abhängig von
der erwünschten
Wirkung verwendet werden können,
schließen
SV40, das LTR von RSV, die LTRs von HIV-1 und HIV-2, Adenovirus-Promotoren, zum
Beispiel aus dem E1A-, E2A- oder MLP-Bereich, das LTR von AAV, den
Blumenkohlmosaikvirus, HSV-TK und den Avian Sarcoma Virus ein.
-
Auf ähnliche
Weise können
gewebespezifische Promotoren verwendet werden, um Transkription
in spezifischen Geweben oder Zellen zu bewirken, um so die potenzielle
Toxizität
oder unerwünschte
Wirkungen auf Gewebe zu reduzieren, auf die nicht gezielt wird.
Zum Beispiel können
Promotoren wie zum Beispiel PSA, Probasin, saure Prostataphosphatase
oder Prostata-spezifisches glandulares Kallikrein (hK2) verwendet
werden, um auf Genexpression in der Prostata abzuzielen.
-
Bei
bestimmten Indikationen kann es wünschenswert sein, Transkription
zu spezifischen Zeiten nach Verabreichung des Gentherapie-Vektors
zu aktivieren. Dies kann mit Promotoren wie zum Beispiel jenen durchgeführt werden,
die durch ein Hormon oder Cytokin regulierbar sind. Zum Beispiel
kann die Verwendung von durch Androgen oder Östrogen regulierten Promotoren
bei Gentherapie-Anwendungen vorteilhaft sein, bei denen die Indikation
ein Gonadengewebe ist, wo spezifische Steroide produziert oder hingeleitet
werden. Derartige Promotoren, die durch ein Hormon regulierbar sind,
schließen
MMTV, MT-1, Ecdyson und RuBisco ein. Man erwartet, dass andere,
durch ein Hormon regulierte Promotoren, wie zum Beispiel die auf
Schilddrüsen-, Hypophysen- und Nebennierenrindenhormone
ansprechenden, in der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Auf Cytokine und
Entzündungsproteine
ansprechende Promotoren, die verwendet werden könnten, schließen K- und
T-Kininogen [Kageyama et al., J. Biol. Chem. 262 (5): 2345–51(1987)],
c-fos, TNF-alpha, C-reaktives Protein [Arcone et al., Nucleic Acids
Res. 16 (8): 3195–207
(1988)], Haptoglobin [Oliviero et al., EMBO J. 6 (7): 1905–12 (1987)],
Serumamyloid A2, C/EBP-alpha, IL-1, IL-6 [Poli und Cortese, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86 (21): 8202–6 (1989)], Komplement C3 [Wilson
et al., Mol. Cell. Biol. 10 (12): 6181-91 (1990)], IL-8, saures
Alpha-1-Glykoprotein [Prowse und Baumann, Mol. Cell. Biol. 8 (1):42–51 (1988)],
Alpha-1-Antitrypsin, Lipoprotein-Lipase [Zechner et al., Mol. Cell.
Biol. 8 (6): 2394–401
(1988)], Angiotensinogen [Ron et al., Mol. Cell. Biol. 11 (5): 2887–95 (1991)],
Fibrinogen, c-Jun (durch Phorbolester, TNF-alpha, UV-Strahlung,
Retinsäure
und Wasserstoffperoxid induzierbar), Collagenase (durch Phorbolester
und Retinsäure
induziert), Metallothionein (durch Schwermetall und Glucocorticoid
induzierbar), Stromelysin (durch Phorbolester, Interleukin-1 und
EGF induzierbar), Alpha-2-Makroglobulin
und Alpha-1-Antichymotrypsin ein.
-
Andere
Promotoren, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden könnten,
schließen Lac-regulierbare,
durch Wärme
(Überhitzung)
induzierbare Promotoren und strahlungsinduzierbare, z.B. EGR [Joki
et al., Hum. Gene Ther. 6 (12): 1507–13 (1995)], Alpha-Inhibin,
RNA Pol III tRNA met und andere Aminosäurepromotoren, U1 snRNA [Bartlett
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 20; 93 (17): 8852–7 (1996)],
MC-1, PGK, β-Aktin
und α-Globin
ein. Viele andere Promotoren, die nützlich sein können, werden
in Walther und Stein [J. Mol. Med. 74 (7): 379–92 (1996)] aufgeführt.
-
Es
ist vorgesehen, dass jeder der vorstehenden Promotoren, allein oder
in Kombination mit einem anderen, gemäß der vorliegenden Erfindung
abhängig
von der erwünschten
Wirkung nützlich
sein kann. Zusätzlich
sollte diese Promotorenliste nicht als erschöpfend oder beschränkend aufgefasst
werden und Fachleuten werden andere Promotoren bekannt sein, die
in Verbindung mit den hierin offenbarten Promotoren oder Verfahren
verwendet werden können.
-
Ein
anderes regulatorisches Element, das für eine Verwendung in der vorliegenden
Erfindung in Betracht gezogen wird, ist ein Enhancer. Dabei handelt
es sich um genetische Elemente, welche die Transkription von einem
Promotor aus erhöhen
und an einer entfernten Position auf dem gleichen DNA-Molekül liegen.
Enhancer sind ganz wie Promotoren organisiert. Das heißt, sie
bestehen aus vielen einzelnen Elementen, von denen jedes ein oder
mehrere transkriptionelle Proteine bindet. Die Grundunterscheidung
zwischen Enhancern und Promotoren ist funktionsbedingt. Ein Enhancerbereich
als ganzer muss fähig
sein, Transkription aus der Entfernung zu stimulieren; dies muss
auf eine Promotorregion oder ihre Komponenten-Elemente nicht zutreffen.
Auf der anderen Seite muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente
haben, welche die Initiation der RNA-Synthese an einer bestimmten
Stelle und in einer bestimmten Richtung steuern, während Enhancern
diese Spezifitäten
fehlen. Promotoren und Enhancer sind oft überlappend und zusammenhängend und
scheinen oft eine sehr ähnliche
modulare Organisation zu haben. Bei der vorliegenden Erfindung nützliche
Enhancer sind Fachleuten wohlbekannt und hängen von dem jeweiligen Expressionssystem,
das eingesetzt wird, ab [Schart et al., Results Probl. Cell. Differ.
20: 125–62
(1994); Bittner et al., Meth. Enzymol. 153: 516–544 (1987)].
-
Polyadenylierungssignale.
-
Dort,
wo ein cDNA-Insert eingesetzt wird, wird man typischerweise wünschen,
ein Polyadenylierungssignal einzuschließen, um eine richtige Polyadenylierung
des Gentranskripts zu bewirken. Es wird nicht geglaubt, dass die
Art des Polyadenylierungssignals ausschlaggebend für die erfolgreiche
Ausführung
der Erfindung ist und jede derartige Sequenz, wie zum Beispiel die
Polyadenylierungssignale des menschlichen oder Rinder-Wachstumshormons
und SV40, kann eingesetzt werden. Auch ein Terminator wird als ein
Element der Expressionskassette in Betracht gezogen. Diese Elemente
können
dazu dienen, die Niveaus der Message zu verstärken und das Durchlesen von
der Kassette in andere Sequenzen hinein zu minimieren.
-
IRES.
-
In
bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung wird die Verwendung von internen Ribosomen-Eintrittsstellen-(IRES)
Elementen in Betracht gezogen, um Multigen- oder polycistronische Messages zu schaffen. IRES-Elemente
sind fähig,
das Ribosomen-Scanning-Modell der von 5'-methyliertem Cap abhängigen Translation
zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu beginnen [Pelletier
und Sonenberg, Nature 334: 320–325
(1988)]. IRES-Elemente aus zwei Mitgliedern der Picornavirus-Familie
(Poliovirus und Encephalomyocarditis) sind beschrieben worden (Pelletier
und Sonenberg, 1988, vorstehend), sowie ein IRES aus einer Säuger-Message
[Macejak und Sarnow, Nature 353: 90–94 (1991)]. IRES-Elemente
können
an heterologe offene Leserahmen gebunden werden. Mehrere offene
Leserahmen können
zusammen transkribiert werden, jeder durch ein IRES abgetrennt,
wodurch polycistronische Messages geschaffen werden. Kraft des IRES-Elementes
ist den Ribosomen jeder offene Leserahmen für eine effiziente Translation
zugänglich.
Mehrere Gene können
unter Verwendung eines einzigen Promotors/Enhancers, um eine einzige
Message zu transkribieren, effizient exprimiert werden.
-
Jeder
heterologe offene Leserahmen kann an IRES-Elemente gebunden werden.
Dies schließt
Gene für
sezernierte Proteine, Proteine mit mehreren Untereinheiten, die
durch unabhängige
Gene kodiert werden, intrazelluläre
oder membrangebundene Proteine und selektierbare Marker ein. Auf
diese Weise kann die Expression einiger Proteine gleichzeitig mit
einem einzigen Konstrukt und einem einzigen selektierbaren Marker in
eine Zelle gentechnisch eingebaut werden.
-
b. Abgabe von Expressionsvektoren
-
Es
gibt etliche Weisen, auf die Expressionsvektoren in Zellen eingeführt werden
können.
In bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung umfasst das Expressionskonstrukt einen Virus oder
ein gentechnisch verändertes
Konstrukt, das von einem Virusgenom abgeleitet ist. In anderen Ausführungsformen
wird nicht-virale Abgabe in Betracht gezogen. Die Fähigkeit
bestimmter Viren, in Zellen durch Rezeptor-vermittelte Endocytose
zu gelangen, in ein Wirtszellgenom zu integrieren und Virus-Gene
stabil und effizient zu exprimieren, hat sie zu attraktiven Kandidaten
für den
Transfer fremder Gene in Säugerzellen
gemacht [Ridgeway, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors
and their uses, Rodriguez & Denhardt
(Hrsg.), Stoneham: Butterworth, 467–492, 1988; Nicolas und Rubenstein,
In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses,
Rodriguez & Denhardt
(Hrsg.), Stoneham: Butterworth, 493–513, 1988; Baichwal und Sugden,
In: Gene Transfer, Kucherlapati (Hrsg.), New York, Plenum Press,
117–148,
1986; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (Hrsg.), New York:
Plenum Press, 149–188,
1986)]. Die ersten als Genvektoren verwendeten Viren waren DNA-Viren
einschließlich
der Papovaviren (Simian Virus 40, Rinderpapillomavirus und Polyomavirus)
(Ridgeway, 1988, vorstehend; Baichwal und Sugden, 1986, vorstehend)
und Adenoviren (Ridgeway, 1988, vorstehend; Baichwal und Sugden,
1986, vorstehend). Sie haben eine relativ niedrige Kapazität für fremde
DNA-Sequenzen und haben ein restringiertes Wirtsspektrum. Darüberhinaus
werfen ihr onkogenes Potenzial und ihre zytopathischen Wirkungen
in permissiven Zellen Sicherheitsbedenken auf. Sie können nur
bis zu 8 kb fremdes genetisches Material unterbringen, können aber
leicht in eine Vielfalt von Zelllinien und Labortieren eingeführt werden
(Nicolas und Rubenstein, 1988, vorstehend; Temin, 1986, vorstehend).
-
Es
wird jetzt allgemein anerkannt, dass DNA unter Verwendung einer
Vielfalt von Virus-Vektoren in eine Zelle eingeführt werden kann. In derartigen
Ausführungsformen
kann es sich bei den Expressionskonstrukten, die virale Vektoren
umfassen, welche die Gene von Interesse enthalten, um einen Adenovirus-
(siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5.824.544, US Patent Nr. 5.707.618,
US Patent Nr. 5.693.509, US Patent Nr. 5.670.488, US Patent Nr.
5.585.362), einen Retrovirus- (siehe zum Beispiel US Patent Nr.
5.888.502, US Patent Nr. 5.830.725, US Patent Nr. 5.770.414, US
Patent Nr. 5.686.278 und US Patent Nr. 4.861.719), einen mit Adenovirus
assoziierten Virus- (siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5.474.935,
US Patent Nr. 5.139.941, US Patent Nr. 5.622.856, US Patent Nr.
5.658.776, US Patent Nr. 5.773.289, US Patent Nr. 5.789.390, US
Patent Nr. 5.834.441, US Patent Nr. 5.863.541, US Patent Nr. 5.851.521
und US Patent Nr. 5.252.479), einen Adenovirus-, mit Adenovirus
assoziierten Hybridvirus- (siehe zum Beispiel. US Patent Nr. 5.856.152)
oder einen Vaccinia-Virus- oder einen Herpes-Virus-(siehe zum Beispiel
US Patent Nr. 5.879.934, US Patent Nr. 5.849.571, US Patent Nr.
5.830.727, US Patent Nr. 5.661.033 und US Patent Nr. 5.328.688)
Vektor handeln.
-
Es
gibt etliche Alternativen zu einem viralen Transfer genetischer
Konstrukte. Dieser Abschnitt stellt eine Diskussion von Verfahren
und Zusammensetzungen nicht-viralen
Gentransfers bereit. DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung werden
im Allgemeinen an eine Zelle abgegeben, und in bestimmten Situationen kann
die Nukleinsäure
oder das zu transferierende Protein unter Verwendung nicht-viraler
Verfahren transferiert werden.
-
Einige
nicht-virale Verfahren zum Transfer von Expressionskonstrukten in
kultivierte Säugerzellen werden
durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen. Diese schließen die
Calciumphosphat-Präzipitation
[Graham und Van Der Eb, Virology 52: 456–467 (1973); Chen und Okayama,
Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752
(1987); Rippe et al., Mol. Cell. Biol. 10: 689–695 (1990)], DEAE-Dextran
[Gopal, Mol. Cell. Biol. 5: 1188–1190 (1985)], Elektroporation
[Tur-Kaspa et al., Mol. Cell. Biol. 6: 716–718 (1986); Potter et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161–7165 (1984)], direkte Mikroinjektion
[Harland und Weintraub, J. Cell Biol. 101: 1094–1099 (1985)], mit DNA beladene
Liposomen [Nicolau und Sene, Biochim. Biophys. Acta. 721: 185–190 (1982);
Fraley et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348–3352 (1979);
Felgner, Sci. Am. 276 (6): 102–106 (1997);
Felgner, Hum. Gene Ther. 7 (15): 1791–3 (1996)], Sonifikation von
Zellen [Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8463–8467 (1987)],
Genbombardierung unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen
[Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568–9572 (1990)],
und rezeptorvermittelte Transfektion [Wu und Wu, J. Biol. Chem.
262: 4429–4432
(1987); Wu und Wu, Biochem. 27: 887–892 (1988); Wu und Wu, Adv.
Drug Deliv. Rev. 12: 159–167
(1993)] ein.
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Sobald
das Konstrukt in die Zelle abgegeben worden ist, kann die Nukleinsäure, die
das therapeutische Gen kodiert, an unterschiedlichen Stellen platziert
und exprimiert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die Nukleinsäure, die
das therapeutische Gen kodiert, stabil in das Genom der Zelle integriert
werden. Diese Integration kann am verwandten Ort und in der verwandten
Orientierung durch homologe Rekombination geschehen (Gen-Ersetzung)
oder sie kann an einem zufälligen,
unspezifischen Ort integriert werden (Genvermehrung). In noch weiteren
Ausführungsformen
kann die Nukleinsäure
in der Zelle stabil als ein getrenntes, episomales DNA-Segment aufrechterhalten
werden. Derartige Nukleinsäure-Segmente
oder "Episome" kodieren Sequenzen,
die ausreichen, um die Aufrechterhaltung und Replikation unabhängig von
oder synchron mit dem Zellzyklus der Wirtszelle zu gestatten. Wie
das Expressionskonstrukt an eine Zelle abgegeben wird und wo in
der Zelle die Nukleinsäure
verbleibt, hängt
von der Art des eingesetzten Expressionskonstrukts ab.
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In
einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung kann das Expressionskonstrukt in einem Liposom eingefangen
sein. Liposomen sind vesikuläre
Strukturen, die durch eine zweischichtige Phospholipidmembran und
ein inneres wässriges
Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen haben mehrere
Lipidschichten, die durch wässriges
Medium getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide
in einem Überschuss
an wässriger
Lösung
suspendiert werden. Die Lipidkomponenten unterziehen sich vor der
Bildung von geschlossenen Strukturen einer Selbst-Umlagerung und
fangen Wasser und gelöste
Stoffe zwischen den Lipid-Doppelschichten ein [Ghosh und Bachhawat,
In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific
receptors and ligands, Wu & Wu
(Hrsg.), New York: Marcel Dekker, S. 87–104 (1991)]. Die Zugabe von DNA
zu kationischen Liposomen verursacht einen topologischen Übergang
von Liposomen zu optisch doppelbrechenden flüssigkristallinen kondensierten
Kügelchen
[Radler et al., Science 275 (5301): 810–4 (1997)]. Diese DNA-Lipidkomplexe
sind potenzielle nicht-virale Vektoren zur Verwendung bei Gentherapie
und -abgabe.
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Liposomvermittelte
Nukleinsäureabgabe
und Expression fremder DNA in vitro ist sehr erfolgreich gewesen.
In der vorliegenden Erfindung werden auch verschiedene kommerzielle
Ansätze
in Betracht gezogen, welche die Technologie der "Lipofektion" einbeziehen. In bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung kann das Liposom einen Komplex mit einem hämagglutinierenden
Virus (HVJ) bilden. Es ist gezeigt worden, dass dies die Fusion
mit der Zellmembran erleichtert und den Zelleintritt von liposomverkapselter
DNA fördert
[Kaneda et al., Science 243: 375–378 (1989)]. In anderen Ausführungsformen
kann das Liposom in Verbindung mit nukleären chromosomalen Nicht-Histon-Proteinen
(HMG-1) komplexiert sein oder eingesetzt werden [Kato et al., J.
Biol. Chem. 266: 3361–3364
(1991)]. In noch weiteren Ausführungsformen
kann das Liposom in Verbindung mit sowohl HVJ als auch HMG-1 komplexiert
oder eingesetzt werden. Insofern sind derartige Expressionskonstrukte
erfolgreich beim Transfer und der Expression von Nukleinsäure in vitro
und in vivo eingesetzt worden. Dann sind sie für die vorliegende Erfindung
anwendbar.
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Andere
Vektor-Abgabesysteme, die eingesetzt werden können, um eine Nukleinsäure, die
ein therapeutisches Gen kodiert, in Zellen abzugeben, schließen rezeptorvermittelte
Abgabevehikel ein. Diese nutzen die selektive Aufnahme von Makromolekülen durch
rezeptorvermittelte Endocytose in fast allen eukaryotischen Zellen
aus. Wegen der zelltypspezifischen Verteilung verschiedener Rezeptoren
kann die Abgabe hochspezifisch sein (Wu und Wu, 1993, vorstehend).
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Vehikel
für das
rezeptorvermittelte Gen-Targeting bestehen im Allgemeinen aus zwei
Komponenten: einem für
den Zellrezeptor spezifischen Liganden und einem DNA-bindenden Mittel.
Einige Liganden sind für rezeptorvermittelten
Gentransfer verwendet worden. Die am ausgiebigsten charakterisierten
Liganden sind Asialo-Orosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987, vorstehend)
und Transferrin [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (9):
3410–3414
(1990)]. Kürzlich
ist ein synthetisches Neoglycoprotein, das den gleichen Rezeptor wie
ASOR erkennt, als Genabgabevehikel verwendet worden [Ferkol et al.,
FASEB J. 7: 1081–1091
(1993); Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4086 –4090 (1994)]
und der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) ist auch verwendet worden,
um Gene an Plattenepithelkarzinomzellen abzugeben (Myers, EPO 0273085).
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In
anderen Ausführungsformen
kann das Abgabevehikel einen Liganden und ein Liposom umfassen. Zum
Beispiel setzten Nicolau et al. [Methods Enzymol. 149: 157–176 (1987)]
Lactosylceramid, ein Galaktose-terminales Asialgangliosid, das in
Liposo men eingebaut war, ein und beobachteten eine Zunahme bei der Aufnahme
des Insulingens durch Hepatozyten. Es ist daher praktikabel, dass
eine Nukleinsäure,
die ein therapeutisches Gen kodiert, durch beliebig viele Rezeptor-Liganden-Systeme
mit oder ohne Liposomen auch spezifisch in einen bestimmten Zelltyp
abgegeben werden kann.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung kann das Expressionskonstrukt einfach aus nackter rekombinanter
DNA oder Plasmiden bestehen. Der Transfer des Konstrukts kann durch
jedes der vorstehend erwähnten
Verfahren durchgeführt
werden, welche die Zellmembran physikalisch oder chemisch permeabilisieren.
Dies ist besonders für
Transfer in vitro anwendbar; es kann jedoch ebenfalls für eine in-vivo-Verwendung
angewendet werden. Dubensky et al. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:
7529–7533
(1984)] injizierten Polyomavirus-DNA in Form von CaPO4-Präzipitaten
erfolgreich in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen und
demonstrierten aktive virale Replikation und akute Infektion. Benvenisty
und Neshif [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9551–9555 (1986)] demonstrierten
auch, dass direkte intraperitoneale Injektion von CaPO4-präzipitierten
Plasmiden zur Expression der transfizierten Gene führte.
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Eine
andere Ausführungsform
der Erfindung zum Transferieren nackter DNA-Expressionskonstrukte in Zellen kann
Teilchenbeschuss einbeziehen. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit
ab, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf hohe Geschwindigkeit zu
beschleunigen, wodurch ihnen erlaubt wird, Zellmembranen zu durchbohren
und in Zellen hineinzukommen, ohne sie zu töten [Klein et al., Nature 327:
70 –73
(1987)]. Einige Geräte
zum Beschleunigen kleiner Teilchen sind entwickelt worden. Ein derartiges
Gerät beruht
auf einer hohen Spannungsentladung, um einen elektrischen Strom
zu erzeugen, der wiederum die Bewegungskraft bereitstellt [Yang
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568–9572 (1990)]. Die verwendeten
Mikroprojektile haben aus biologisch inerten Stoffen wie zum Beispiel
Wolfram- oder Goldkügelchen
bestanden.
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F. Verfahren zum Behandeln
der Neutropenie
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Wie
hierin vorstehend erwähnt,
wird in Betracht gezogen, dass die Analoga des menschlichen G-CSF oder
die Vektoren, die Polynukleotide umfassen, die derartige Proteine
kodieren, bei Ersatztherapie-Protokollen für die Behandlung der Neutropenie
eingesetzt werden. Es ist festgestellt worden, dass G-CSF bei der
Behandlung von Indikationen nützlich
ist, bei denen eine Zunahme der neutrophilen Zellen Vorteile bereitstellt. Für Krebspatienten
ist G-CSF zum Beispiel als Mittel zum selektiven Stimulieren der
Produktion neutrophiler Zellen vorteilhaft, um hämatopoetische Defizite zu kompensieren,
die sich aus Chemotherapie oder Strahlentherapie ergeben. Andere
Indikationen schließen
die Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten und damit zusammenhängender
Leiden, wie zum Beispiel Sepsis, die typischerweise durch einen
Bakterienmetaboliten verursacht wird, ein. G-CSF ist auch alleine
oder in Kombination mit anderen Verbindungen, wie zum Beispiel anderen
Cytokinen, zum Wachstum oder zur Expansion von Zellen in Kultur
(zum Beispiel für
Knochenmarktransplantate oder ex-vivo-Expansion)
nützlich.
G-CSF ist Transplantatpatienten als ein Zusatz zur Behandlung einer
Infektion oder zur Behandlung der Neutropenie verabreicht worden.
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a. Auf Protein beruhende
Therapie
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Eine
der therapeutischen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen,
welche die Analoga des menschlichen G-CSF der vorliegenden Erfindung
umfassen, für einen
Patienten, der dessen bedarf. Wie vorstehend diskutiert können die
Proteine durch rekombinante Mittel oder durch automatisierte Peptidsynthese
erzeugt worden sein. Die Formulierungen mit Analoga des menschlichen
G-CSF können
für eine
derartige Therapie, beruhend auf dem Verabreichungsweg, ausgewählt werden und
können
Liposom-Formulierungen ebenso wie klassische pharmazeutische Zubereitungen
einschließen.
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Die
zum menschlichen G-CSF analogen Proteine werden zu einer geeigneten
Zubereitung formuliert und an eine oder mehrere Stellen im Patienten
in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. In besonders
bevorzugten Ausführungsformen
erfolgt die auf Proteinen, die zum menschlichen G-CSF analog sind,
beruhende Therapie durch kontinuierliche oder zeitweise intravenöse Verabreichung.
Mit "therapeutisch
wirksamer Menge" bezeichnet
die vorliegende Erfindung die Menge eines Analogons des menschlichen
G-CSF, die ausreicht, um eine beobachtbare Änderung im Niveau einer oder
mehrerer biologischer Aktivitäten
von G-CSF zu unterstützen.
Die Änderung
kann entweder ein erhöhtes
Niveau der G-CSF-Aktivität
sein. Vorzugsweise handelt es sich bei der Änderung um eine Erhöhung der
Proliferation neutrophiler Zellen.
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Fachleute
werden verstehen, dass die Mengen eines Analogons des menschlichen
G-CSF zur therapeutischen Verwendung variieren können. Es wird in Betracht gezogen,
dass die spezifische Aktivität
der zum menschlichen G-CSF analogen Proteinherstellung im Bereich
von etwa 100 Einheiten/mg Protein bis etwa 500 Einheiten/mg Protein
liegen kann. Eine bestimmte Herstellung eines Analogons des menschlichen
G- CSF kann so etwa
100 Einheiten/mg Protein, etwa 125 Einheiten/mg Protein, etwa 150
Einheiten/mg Protein, etwa 175 Einheiten/mg Protein, etwa 200 Einheiten/mg
Protein, etwa 225 Einheiten/mg Protein, etwa 250 Einheiten/mg Protein,
etwa 275 Einheiten/mg Protein, etwa 300 Einheiten/mg Protein, etwa
325 Einheiten/mg Protein, etwa 350 Einheiten/mg Protein, etwa 375
Einheiten/mg Protein, etwa 400 Einheiten/mg Protein, etwa 425 Einheiten/mg
Protein, etwa 450 Einheiten/mg Protein, etwa 475 Einheiten/mg Protein
und etwa 500 Einheiten/mg Protein umfassen. Ein besonders bevorzugter
Bereich reicht von etwa 100 Einheiten/mg Protein bis etwa 200 Einheiten/mg
Protein; ein stärker
bevorzugter Bereich liegt zwischen etwa 150 und etwa 200 Einheiten/mg
Protein. Vorzugsweise ist die Proteinzusammensetzung im Wesentlichen
frei von kontaminierenden Faktoren, Kontaminationsniveau weniger
als 0,02 % (Gew./Gew.). Zusammensetzungen mit Analoga des menschlichen
G-CSF, die zur Injektion in einen Patienten geeignet sind, können zum
Beispiel aus einer lyophilisierten Probe, die ein gereinigtes Analogon
des menschlichen G-CSF und stabilisierende Salze umfasst, durch
Rekonstitution mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel
hergestellt werden.
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Die
Verabreichung der Zusammensetzungen kann systemisch oder lokal sein
und kann eine Injektion einer therapeutisch wirksamen Menge der
Proteinzusammensetzung mit einem Analogon des menschlichen G-CSF
an einer einzelner Stelle umfassen. Jede Fachleuten bekannte Verabreichungsweise
einer therapeutischen Zusammensetzung der Erfindung wird in Betracht
gezogen, einschließlich
zum Beispiel intravenös,
intramuskulär,
subkutan oder ein Katheter für
Langzeitverabreichung. Alternativ dazu wird in Betracht gezogen, dass
die therapeutische Zusammensetzung an mehreren Stellen an den Patienten
abgegeben wird. Die mehrfachen Verabreichungen können gleichzeitig erbracht
oder über
einen Zeitraum von einigen Stunden verabreicht werden. In bestimmten
Fällen
kann es vorteilhaft sein, einen kontinuierlichen Fluss der therapeutischen Zusammensetzung
bereitzustellen. Eine zusätzliche
Therapie kann auf einer periodischen Basis verabreicht werden, zum
Beispiel täglich,
wöchentlich
oder monatlich.
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b. Kombinationstherapie
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Zusätzlich zu
Therapien, die ausschließlich
auf der Abgabe der Analoga des menschlichen G-CSF beruhen, wird
Kombinationstherapie ausdrücklich
in Betracht gezogen. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung
wird in Betracht gezogen, dass die Therapie mit dem Analogon des
menschlichen G-CSF in ähnlicher Weise
in Verbin dung mit anderen Mitteln verwendet werden könnte, die
gewöhnlich
zur Behandlung der Neutropenie verwendet werden.
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Um
das geeignete therapeutische Resultat unter Verwendung der Verfahren
und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu erreichen, würde man
im Allgemeinen eine Zusammensetzung bereitstellen, die das Analogon
des menschlichen G-CSF und mindestens ein anderes therapeutisches
Mittel (zweites therapeutisches Mittel) umfasst. In der vorliegenden
Erfindung wird in Betracht gezogen, dass das zweite therapeutische
Mittel die Verabreichung oder den Einschluss mindestens eines zusätzlichen
Faktors einbezieht, der aus EPO, G-CSF, M-GDF, SCF, GM-CSF, M-CSF,
CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10,
IL-11, IL-12 oder verschiedenen anderen Interleukinen, IGF-1, LIF,
Interferon (wie zum Beispiel α, β, gamma oder
Konsensus), neurotrophen Faktoren (wie zum Beispiel BDNF, NT-3,
CTNF oder Noggin), anderen multipotenten Wachstumsfaktoren (wie
zum Beispiel, in dem Ausmaß,
wie von diesen gezeigt wurde, dass sie derartige multipotente Wachstumsfaktoren
sind, der flt-3/flk-2-Ligand, der Stammzellproliferationsfaktor
und der Faktor aus totipotenten Stammzellen), Fibroblastenwachstumsfaktoren
(wie zum Beispiel FGF) und Analoga, Fusionsmoleküle oder andere Derivate der
Vorstehenden. Zum Beispiel ist festgestellt worden, dass G-CSF in
Kombination mit SCF periphere Blutvorläuferzellen in vivo mobilisiert.
Ex vivo wurde zum Beispiel festgestellt, dass G-CSF in Kombination
mit SCF, IL-3 und IL-6 zur Expansion peripherer Blutzellen nützlich ist.
In ähnlicher
Weise werden die vorliegenden G-CSF-Analoga ähnliche Verwendungen bereitstellen.
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Die
Kombinationstherapie-Zusammensetzungen würden in einer kombinierten
Menge bereitgestellt, die wirksam ist, um das erwünschte therapeutische
Resultat bei der Behandlung der Neutropenie herzustellen. Dieser
Vorgang kann das In-Kontakt-Bringen
der Zellen mit dem Analogon des menschlichen G-CSF und dem(n) zweiten
Mittel(n) oder Faktor(en) zur gleichen Zeit einbeziehen. Dies kann
durch Verabreichen einer einzelnen Zusammensetzung oder pharmakologischen
Formulierung, die beide Mittel enthält, erreicht werden, oder durch
Verabreichen von zwei getrennten Zusammensetzungen oder Formulierungen
zur gleichen Zeit, wobei eine Zusammensetzung die therapeutische
Zusammensetzung mit einem Analogon des menschlichen G-CSF einschließt und die
andere das zweite therapeutische Mittel einschließt.
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Alternativ
dazu kann die Behandlung mit dem Analogon des menschlichen G-CSF der Behandlung
mit dem anderen Mittel um Abstände,
die von Minuten bis Wochen reichen, vorangehen oder folgen. In Ausführungen,
bei denen das zweite therapeutische Mittel und das Analogon des
menschlichen G-CSF getrennt verabreicht werden, würde man
im Allgemeinen sicherstellen, dass kein signifikanter Zeitraum zwischen
der Zeit jeder Abgabe verstreichen würde, so dass das zweite Mittel
und das Analogon des menschlichen G-CSF immer noch fähig wären, eine
vorteilhaft kombinierte Wirkung auszuüben. In derartigen Fällen wird
in Betracht gezogen, dass man beide Modalitäten innerhalb von etwa 12 –24 Stunden
voneinander und stärker
bevorzugt innerhalb von 6–12
Stunden voneinander verabreichen würde, wobei eine Verzögerungszeit
von nur etwa 12 Stunden am meisten bevorzugt würde. In einigen Situationen
kann es jedoch wünschenswert
sein, den Zeitraum zur Behandlung signifikant auszudehnen, wobei
einige Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis einige Wochen (1, 2, 3, 4,
5, 6, 7 oder 8) zwischen den jeweiligen Verabreichungen verstreichen.
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Eine
systemische Abgabe von Expressionskonstrukten oder -proteinen, die
zum menschlichen G-CSF analog sind, an Patienten kann ein sehr wirksames
Verfahren zum Abgeben eines therapeutisch wirksamen Gens sein, um
der sofortigen klinischen Manifestation der Krankheit entgegenzuwirken.
Alternativ dazu kann die örtliche
Abgabe des Analogons des menschlichen G-CSF und/oder des zweiten
therapeutischen Mittels unter bestimmten Umständen angemessen sein.
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G. Assays zum Bestimmen
der Aktivität
und Bindung eines G-CSF-Analogons
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In
bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung kann es notwendig sein, die Aktivität eines
Analogons des menschlichen G-CSF zu bestimmen. Insbesondere muss
die Wirkung der therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung auf die Neutropenie vielleicht überwacht werden. Fachleute
sind sich zahlreicher Assays zum Bestimmen der G-CSF-Aktivität bewusst,
von denen einige im vorliegenden Abschnitt beschrieben werden. Es
ist auf keinen Fall beabsichtigt, dass dies eine erschöpfende Liste derartiger
Assays sein soll und es wird nur beabsichtigt, dass dies bestimmte
beispielhafte Assays bereitstellt, die Fachleuten wohlbekannt sind,
die beim Bestimmen der G-CSF-Aktivität der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können.
Weiterhin beschreibt der vorliegende Abschnitt auch Assays zur Bestimmung
der G-CSFBindung
von G-CSF an dessen Rezeptor. Beispielhafte in-vitro- und in-vivo-Assays
zum Bestimmen dieser Aktivitäten
werden hierin nachstehend bereitgestellt.
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a. In-vitro-Assays
-
Zellproliferationsassays.
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Zellproliferationsassays,
von denen einige hierin beschrieben werden, werden verwendet, um
die Wirkung eines G-CSF-Analogons auf das Induzieren der Zellproliferation
zu bestimmen. Viele Assays sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und
einiger dieser Assays werden wie folgt beschrieben.
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Zählen von Zellen.
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Zellen
werden 24 Std, vor der Initiierung des Zellproliferationsexperimentes
in ergänztes
MEMα-Medium
(ohne G-CSF) passagiert, und zu diesem Zeitpunkt werden parallele
Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 105 Zellen/ml
in MEMα-Medium
mit 125 pM Wildtyp-G-CSF oder G-CSF-Analoga inkubiert. Das Zellwachstum in
jedem Kolben wird an den Tagen 2, 5 und 8 wie folgt gemessen. Kurz
gesagt werden Zellen in einer isotonischen Lösung (ISOTON II, Coulter Diagnostics,
Hialeah, FL) verdünnt
und in einem Coulter-Zellgerät
gezählt (Coulter
Electronics, Hialeah, FL).
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Einbau von 3H-Thymidin.
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Dieser
Assay beruht auf dem Einbau von markiertem 3H-Thymidin
die neu sythetisierte DNA von Zellen nach der Zellteilung. Einige
Forscher verwenden auch das Thymidin-Analogon 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU)
anstelle von [3H]-Thymidin in Proliferationsassays.
Kurz gesagt werden Zellen 24 Std. vor der Initiierung des Zellproliferationsexperimentes
in ergänztes
MEMα-Medium
(ohne G-CSF) passagiert, und zu diesem Zeitpunkt werden parallele
Vertiefungen/Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 105 Zellen/ml
in MEMα-Medium
mit 125 pM Wildtyp-G-CSF oder G-CSF-Analoga inkubiert. 3H-Thymidin
wird 12 –24
Std. vor dem Zählen
(Beenden des Experiments) zu der Zellkultur gegeben und am Ende
des Assays wird die Menge radioaktiven Einbaus in die DNA mit einem
Flüssig-Szintillationszähler gemessen.
Einzelheiten dieses Verfahrens sind einem Fachmann wohlbekannt.
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MTT.
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MTT
wird für
die quantitative Bestimmung der Zellproliferation und -aktivierung
z.B. als Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Cytokine verwendet.
Es wird auch für
die Quantifizierung antiproliferativer oder cytotoxischer Wirkungen,
die z.B. durch den Tumornekrosefaktor α oder β vermittelt werden, und für die Messung der
Interferon-Wirkung
verwendet. Der Assay beruht auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes
MTT zu lila Formazan-Kristallen durch metabolisch aktive Zellen.
Diese Salzkristalle sind in wässrigen
Lösungen
unlöslich,
können
aber durch Zugeben der Solubilisierungslösung, die im Kit eingeschlossen
ist, und Inkubieren der Platten über
Nacht in befeuchteter Atmosphäre
(z.B. 37 °C,
6,5% CO2) solubilisiert werden. Das solubilisierte
Formazan-Produkt wird unter Verwendung eines ELISA-Lesegerätes spektrophotometrisch
quantifiziert. Eine Zunahme der Zahl der lebenden Zellen führt zu einer
Zunahme der gesamten metabolischen Aktivität in der Probe. Diese Zunahme
korreliert direkt mit der Menge gebildeter lila Formazan-Kristalle,
wie durch die Absorption überwacht
wird. Ein im Handel erhältlicher
MTT-Assay kann von Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) gekauft
werden.
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Ligandenverarmungsassay.
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Eine
Ligandenverarmung wird für
jedes Protein im Zeitverlauf wie hierin beschrieben gemessen. Wie in
den vorstehenden Experimenten werden G-CSF-abhängige (OCI/AML1) Zellen 24
Std. vor der Initiierung des Ligandenverarmungsexperimentes in ergänztes MEMα-Medium (ohne
G-CSF) passagiert, und zu diesem Zeitpunkt werden parallele Kolben
mit Zellen bei einer Dichte von 105 Zellen/ml
in MEMα-Medium
mit 125 pM Wildtyp-G-CSF oder einem G-CSF-Analogon inkubiert. Nach
24 Std. wird die Zellzahl in jedem Kolben wie vorstehend beschrieben
gemessen und ein Aliquot von jedem Medium-Überstand, der nach einer Zentrifugation zum
Pelletieren von Zellresten erhalten wird, wird bei –20 °C zum Messen
der G-CSF-Konzentration gelagert. Dies wird 8 Tage lang alle 24
Std. wiederholt. Die Konzentrationen von G-CSF in den Proben der Medium-Überstände werden
dann unter Verwendung eines enzymverbundenen Immunadsorptionsassay-
(ELISA-) Kits quantifiziert, das von R & D Systems (Minneapolis, MN) erhalten
wurde.
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Internalisierungs- und
Recycling-Experimente.
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Internalisierungsexperimente
werden über
einen Zeitraum von 5 Min. durchgeführt, ähnlich wie in publizierter
Arbeit [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol. Metabol.
32: E1–E9
(1995)]. Kurz gesagt werden 108 Zellen zweimal
mit PBS gewaschen und dann in markiertem Ligand 30 Min. lang auf
Eis inkubiert, um Oberflächenkomplexe
zu erhalten. Die Zellen werden wieder zweimal mit eiskaltem PBS
gewaschen und bei t = 0 bei 37 °C
in MEMα resuspendiert.
Die Änderung
bei Oberflächenkomplexen
und internen Komplexen wird über
einen Zeitraum von 5 Min. verfolgt; ein Graph von internen Komplexen
gegen das Zeitintegral der Oberflächenkomplexe ergibt eine lineare
Beziehung, deren Steigung die Geschwindigkeitskonstante der Komplexinternalisierung
ist [Wiley et al., J. Biol. Chem. 257: 4222 –4229 (1982)]. Recycling-Experimente
werden auf eine mit den Internalisierungsexperimenten identische
Weise durchgeführt,
außer über einen
Zeitraum von 25 Min. Ergebnisse aus Recycling-Experimenten werden
Parameter-angepasst, um Recycling-Geschwindigkeitskonstanten zu
erhalten.
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Bindungsassays.
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Molekulare
Bindungsassays, von denen manche hierin beschrieben werden, werden
verwendet, um das Binden eines G-CSF-Analogons an G-CSFR abzuschätzen. Diese
in-vitro- und auf Zellen beruhenden Assays werden wie folgt beschrieben.
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BIACORE.
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Die
Ligandenbindungsaffinität
eines G-CSF-Analogons an den G-CSF-Rezeptor
wird unter Verwendung eines BIAcore®2000
(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) gemessen. Wildtyp-G-CSF, an das
Histidin angehängt
wurde, wird auf der Chip-Oberfläche immobilisiert
und freier Rezeptor (~ 0,25–10
nM) wird über
den Chip geleitet, um eine Standard-Gleichgewichtskurve zu erzeugen
und um die Wildtyp-Bindungsaffinität unter Verwendung eines 1:1
-Bindungsmodells zu berechnen. Um die Bindungsaffinität jeder
Mutante zu bestimmen, wird 2 nM freier Rezeptor mit einer bekannten
Konzentration des mutanten Liganden gemischt und über den Chip
geleitet. Die Gleichgewichtsbindungsaffinitäten der Mutanten werden unter
Verwendung eines 1:1 -Bindungsmodells mit Kompetition bestimmt.
Bindungsaffinitätsergebnisse
werden unter Verwendung der BIA Auswertungssoftware 3.1 (BIAcore,
Inc.) analysiert und Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (KD) werden bestimmt.
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ELISA.
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Die
Bindung von mutanten G-CSF-Analoga an G-CSFR wird in einem Kompetitionsassay
im ELISA-Format gemessen. In diesem Assay wird G-CSFR mit dem nicht
neutralisierenden G-CSF-Rezeptor-Antikörper LMM741 (PharMingen, San
Diego, CA) gemäß dem Protokoll
des Herstellers eingefangen. Analoge Proteine werden dann auf ihre
Fähigkeit
hin analysiert, mit HRP-markiertem G-CSF um die Rezeptorbindung zu
kompetieren.
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b. In-vivo-Assays
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Bevor
die Zusammensetzungen mit Analoga des menschlichen G-CSF der vorliegenden
Erfindung in menschlichen therapeutischen Protokollen eingesetzt
werden, kann es wünschenswert
sein, die Wirkungen derartiger Zusammensetzungen in Tiermodellen
zu überwachen.
Es gibt etliche Tiermodelle, die in in-vivo-Assays verwendet werden
können,
die Fachleuten bekannt sind und die bei der vorliegenden Erfindung
nützlich sein
können.
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Um
die Wirksamkeit der Protein- und Gentherapie-Zusammensetzungen mit
Analoga des menschlichen G-CSF der vorliegenden Erfindung zu bestimmen,
können
derartigen Tieren die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
intramuskulär
und/oder intravenös
injiziert werden, und die Fähigkeit,
die Proliferation neutrophiler Zellen zu stimulieren, kann in Anwesenheit
und Abwesenheit der Zusammensetzungen bestimmt werden. Derartige
Bestimmungen sind hilfreich beim Bereitstellen einer Beratung über die
Dosierungen und Verabreichungszeiten und die Wirksamkeit einer bestimmten
Zusammensetzung gegen Neutropenie. Bei Gentherapieprotokollen kann
Immunfluoreszenzfärbung
von Schnitten, die aus biopsiertem Muskel erhalten werden, durchgeführt werden,
und die Expression des Analogons des menschlichen G-CSF in den transduzierten
Muskelfasern kann bestimmt werden.
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H. Pharmazeutische Zusammensetzungen
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Die
vorliegende Erfindung beinhaltet auch pharmazeutische Zusammensetzungen,
die wirksame Mengen Polypeptidprodukte der Erfindung zusammen mit
pharmazeutisch verträglichen
Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln,
Lösungsvermittlern,
Emulgatoren, Adjuvantia und/oder Trägern, die in der G-CSF-Therapie
nützlich
sind, umfassen. Derartige Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel
mit verschiedenem Puffergehalt (z.B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat),
pH-Wert und Ionenstärke,
Zusätze
wie zum Beispiel Detergenzien und solubilisierende Mittel (z.B.
Tween 80, Polysorbat 80), Anitoxidantien (z.B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit),
Konservierungsmittel (z.B. Thimersol, Benzylalkohol) und Volumenvergrößerungsmittel (z.B.
Laktose, Mannitol), Einschluss des Materials in teilchenförmigen Zubereitungen
polymerer Verbindungen, wie zum Beipiel Polymilchsäure, Polyglykolsäure usw.
oder in Assoziation mit Liposomen, ein. Derartige Zusammensetzungen
beeinflussen den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit
der in-vivo-Freisetzung, und die Geschwindigkeit der in-vivo-Clearance der
vorliegenden G-CSF-Analoga. Siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences. 18. Ausg.
(1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, Seiten 1435 –1712.
-
Derivate
der vorliegenden G-CSF-Analoga sind auch hierin beinhaltet. Derartige
Derivate schließen Moleküle ein,
die durch ein oder mehrere wasserlösliche Polymermoleküle, wie
zum Beispiel Polyethylenglykol, oder durch die Zugabe von Polyaminosäuren, einschließlich Fusionsproteinen
(Verfahren dafür
sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt) modifiziert werden. Derartige
Derivatisierungen können
einzeln am N- oder C-Terminus
vorkommen oder es kann mehrere Derivatisierungsstellen geben. Eine
Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren mit Lysin kann zusätzliche
Stellen für
eine Derivatisierung bereitstellen. (Siehe US-Patent Nr. 5.824.784
und US Patent Nr. 5.824.778).
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Die
vorliegenden Analoga oder deren Derivate können zur Injektion oder zur
oralen, nasalen, pulmonalen, topischen oder anderen Arten der Verabreichung
formuliert werden, wie ein Fachmann erkennen wird. Die Formulierung
kann flüssig
sein oder zur Rekonstitution fest, wie zum Beispiel lyophilisiert,
sein.
-
Im
Allgemeinen sind die vorliegenden Analoga (oder deren Derivate)
auf die gleiche Weise nützlich wie
derzeit erhältliche
G-CSFs nützlich
sind, außer
dass die vorliegenden Analoga eine verstärkte zelluläre Reaktion bereitstellen (superagonistische
oder G-CSF-agonistische Aktivität).
Derartige Änderungen
in der zellulären
Reaktion finden durch Beeinflussung der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder
der Vorgänge
des Sortierens, Recyclings und Abbaus mittels der endozytischen
Liganden/Rezeptor-Trafficking-Wege
statt.
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Diese
Verwendungen schließen
die Behandlung einer Vielfalt von hämatopoetischen, neurologischen und
mit der Fortpflanzung zusammenhängenden
Leiden ein. Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren zur
Herstellung von Medikamenten können
so für
die Behandlung derartiger Leiden nützlich sein. Leiden, die durch
die Verabreichung der vorliegenden Analoga gelindert oder moduliert
werden, sind typischerweise diejenigen, die durch eine reduzierte
hämatopoetische
oder Immun-Funktion gekennzeichent sind und, genauer gesagt, durch
eine reduzierte Zahl neutrophiler Zellen. Derartige Leiden können als
ein Verlauf der Therapie für
andere Zwecke induziert werden, wie zum Beispiel Chemotherapie oder
Strahlentherapie. Derartige Leiden können sich aus Infektionskrankheiten,
wie zum Beispiel bakteriellen, viralen, Pilz- oder anderen Infektionskrankheiten
ergeben. Zum Beispiel ergibt sich Sepsis aus bakterieller Infektion.
Oder derartige Leiden können
erblich oder durch die Umwelt verursacht sein, wie zum Beispiel
schwerwiegende Neutropenie oder Leukämien. Das Alter kann auch eine
Rolle spielen, wie in der geriatrischen Situation; Patienten können eine
reduzierte Zahl neutrophiler Zellen oder eine reduzierte Mobilisierung
neutrophiler Zellen aufweisen. Einige derartige Leiden werden in
Filgrastim (r-metHuG-CSF) In: Clinical Practice, Morstyn und Dexter
(Hrsg.), Marcel Dekker, Inc., New York (1993), S. 351, rezensiert.
Andere, weniger untersuchte Leiden, die durch die Verabreichung
der vorliegenden Analoga gelindert oder moduliert werden können, können die
Reduktion von Lipiden (oder Cholesterin) im Blutkreislauf und bestimmte
kardiovaskuläre
Leiden einschließen,
da G-CSF die Produktion von Plasminogenaktivatoren induzieren kann.
Zusätzlich
können
die vorliegenden G-CSF-Analoga zur Mobilisierung peripherer Blutvorläuferzellen
verwendet werden.
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Die
vorliegenden G-CSF-Analoga (oder Derivat-Zusammensetzungen) können auch
in vitro verwendet werden. Zum Beispiel kann man in einer Gentherapiesituation
wünschen,
eine hämatopoetische
Zelle mit exogener DNA zu transfizieren und diese Zelle unter Verwendung
der vorliegenden Formulierungen mit G-CSF-Analoga zu kultivieren.
Daher bezieht die Erfindung, in noch einer anderen Ausführungsform,
ein Verfahren zum Kultivieren hämatopoetischer
Zellen in vitro ein, umfassend: a) Platzieren der Zellen in ein
geeignetes Kulturmedium, wobei das geeignete Kulturmedium eine Zusammensetzung
mit einem G-CSF-Analogon gemäß der vorliegenden
Erfindung enthält,
und b) Bereitstellen geeigneter Bedingungen für das Wachstum der hämatopoetischen
Zellen.
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Vor
allem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transfizieren
hämatopoetischer
Zellen mit exogener DNA bereit, umfassend: a) das Kultivieren der
hämatopoetischen
Zellen mit einer Zusammensetzung mit einem G-CSF-Analogon gemäß der vorliegenden
Erfindung und b) das Transfizieren der kultivierten Zellen mit exogener
DNA. Bei den hämatopoetischen
Zellen kann es sich zum Beispiel um Knochenmarkzellen oder periphere
Blutvorläuferzellen
handeln. Zusätzlich
können
andere, einem Fachmann wohlbekannte Zellen verwendet werden.
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Um
Zusammensetzungen, die ein Analogon des menschlichen G-CSF enthalten,
zur klinischen Verwendung herzustellen, ist es notwendig, die viralen
Expressionsvektoren, Proteine und Nukleinsäuren als pharmazeutische Zusammensetzungen
herzustellen, d. h. in einer für
in-vivo-Anwendungen geeigneten Form. Im Allgemeinen wird dies das
Herstellen von Zusammensetzungen erforderlich machen, die im Wesentlichen frei
von Pyrogenen sowie anderen Verunreinigungen, die für Menschen
oder Tiere schädlich
sein könnten, sind.
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Man
wird im Allgemeinen wünschen,
geeignete Salze und Puffer einzusetzen, um die Abgabevektoren stabil
zu machen und die Aufnahme durch Zielzellen zu ermöglichen.
Puffer werden auch eingesetzt, wenn rekombinanten Zellen in einen
Patienten eingeführt
werden. Wässrige
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame
Menge des Analogons des menschlichen G-CSF oder eines Expressionsvektors
für Zellen,
in einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder wässrigen
Medium gelöst
oder dispergiert. Derartige Zusammensetzungen werden auch als Inokula
bezeichnet. Der Begriff "pharmazeutisch
oder pharmakologisch verträglich" bezeichnet molekulare
Einheiten und Zusammensetzungen, die keine nachteiligen, allergischen
oder anderen unpassenden Reaktionen produzieren, wenn sie an ein
Tier oder einen Menschen verabreicht werden. Wie hierin verwendet
schließt "pharmazeutisch verträglicher
Träger" jedes und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle
und antifungale Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel
und dergleichen ein. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel
für pharmazeutische
Wirkstoffe ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Außer insofern,
als ein herkömmliches
Medium oder Mittel mit den Vektoren oder Zellen der vorliegenden
Erfindung inkompatibel ist, wird dessen Verwendung in therapeutischen
Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Ergänzende Wirkstoffe können auch
in die Zusammensetzungen eingegliedert werden.
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Die
wirksamen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen klassische
pharmazeutische Zubereitungen ein. Eine Verabreichung dieser Zusammensetzungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung wird auf jedem herkömmlichen
Weg stattfinden, sofern das Zielgewebe auf diesem Weg zugänglich ist.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch jedes herkömmliche
Verfahren in den Patienten eingeführt werden, d. h. durch intravenöse, intradermale,
intramuskuläre,
intramammäre,
intraperitoneale, intrathekale, retrobulbäre, intrapulmonale (z.B. termingerechte
Freisetzung), durch orale, sublinguale, nasale, anale, vaginale
oder transdermale Abgabe oder durch chirurgische Einpflanzung an
einer bestimmten Stelle. Die Behandlung kann aus einer einzelnen
Dosis oder einer Vielzahl von Dosen über einen Zeitraum bestehen.
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Die
wirksamen Verbindungen können
zur Verabreichung als Lösungen
der freien Base oder pharmakologisch verträgliche Salze in Wasser, die
auf geeignete Weise mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie zum Beispiel
Hydroxypropylcellulose, gemischt werden, hergestellt werden. Auch
können
Dispersionen in Glycerin, flüssigen
Polyethylenglykolen und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter
gewöhnlichen
Lagerungs- und Verwendungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen
ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu
verhindern.
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Die
zur injizierbaren Verwendung geeigneten pharmazeutischen Formen
schließen
sterile wässrige Lösungen oder
Dispersionen und sterile Pulver zur jederzeit möglichen Herstellung steriler
injizierbarer Lösungen
oder Dispersionen ein. Auf jeden Fall muss die Form steril sein
und muss in dem Ausmaß flüssig sein, dass
eine leichte Spritzbarkeit existiert. Sie muss unter den Herstellungs-
und Lagerungsbedingungen stabil sein und muss gegen die kontaminierende
Wirkung von Mikororganismen, wie zum Beispiel Bakterien und Pilzen,
konserviert werden. Der Träger
kann ein Lösungsmittel oder
ein Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol
(zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und
dergleichen), geeignete Gemische davon und Pflanzenöle enthält. Die
richtige Fluidität
kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Überzugs, wie zum Beispiel Lecithin,
aufrecht erhalten werden, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen
Teilchengröße im Falle
von Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven
Mitteln. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch
verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel herbeigeführt werden,
zum Beispiel Parabens, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal
und dergleichen. In vielen Fällen
ist es vorzuziehen, isotonische Mittel einzuschließen (zum
Beispiel Zucker oder Natriumchlorid). Eine verlängerte Absorption der injizierbaren
Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln in den Zusammensetzungen
herbeigeführt
werden, welche die Absorption verzögern (zum Beispiel Aluminiummonostearat
und Gelatine).
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Sterile
injizierbare Lösungen
werden durch Einbringen der wirksamen Verbindungen in der erforderlichen
Menge im geeigneten Lösungsmittel
mit verschiedenen anderen, vorstehend aufgeführten Bestandteilen nach Bedarf
hergestellt, gefolgt von Sterilfiltration. Im Allgemeinen werden
Dispersionen durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten wirksamen
Bestandteile in ein steriles Vehikel hergestellt, der das Grund-Dispersionsmedium
und die erforderlichen anderen Bestandteile aus den vorstehend aufgeführten enthält. Im Falle von
sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind
die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken,
die ein Pulver des wirksamen Bestandteils plus jedes zusätzlichen
erwünschten
Bestandteils aus einer vorher sterilfiltrierten Lösung davon
ergeben.
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Wie
hierin verwendet schließt "pharmazeutisch verträglicher
Träger" jedes und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle
und antifungale Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel
und dergleichen ein. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel
für pharmazeutisch
wirksame Substanzen ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Außer insofern,
als herkömmliche
Medien oder ein Mittel mit dem wirksamen Bestandteil inkompatibel
ist, wird dessen Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen
in Betracht gezogen. Ergänzende
wirksame Bestandteile können
auch in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
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Zur
oralen Verabreichung können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit Exzipienten eingebracht
werden und in Form von nicht einnehmbaren Mundspülungen und Zahnpasten verwendet
werden. Eine Mundspülung
kann hergestellt werden, die den wirksamen Bestandteil in der erforderlichen
Menge in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie zum Beispiel einer Natriumboratlösung (Dobell's Solution) enthält. Alternativ dazu
kann der wirksame Bestandteil in eine antiseptische Spülung eingebracht
werden, die Natriumborat, Glycerin und Kaliumbicarbonat enthält. Der
wirksame Bestandteil kann auch in Zahnpasten dispergiert werden, einschließlich Gelen,
Pasten, Pulver und Aufschwemmungen. Der wirksame Bestandteil kann
in einer therapeutisch wirksamen Menge zu einer Zahnpaste gegeben
werden, die Wasser, Bindemittel, Schleifmittel, Geschmacksmittel,
Schäummittel
und Feuchthaltemittel einschließen
kann.
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Die
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer neutralen Form
oder als Salz formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze
schließen
die Säureadditionssalze
(gebildet mit den freien Aminogruppen des Proteins) und die mit
anorganischen Säuren,
wie zum Beispiel Salz- oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren, wie
zum Beispiel Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen, gebildeten ein.
Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch
von anorganischen Basen wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-,Ammonium-,
Kalzium- oder Eisen(III)-hydroxiden und solchen organischen Basen
wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen
abgeleitet werden.
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Nach
der Formulierung werden die Lösungen
auf eine Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel
ist, und in einer derartigen Menge, wie sie therapeutisch wirksam
ist. Die Formulierungen werden leicht in einer Vielfalt von Dosierungsformen
wie zum Beispiel als injizierbare Lösungen, Arzneistoff freisetzende
Kapseln und dergleichen verabreicht. Zur parenteralen Verabreichung
in einer wässrigen
Lösung sollte
die Lösung
zum Beispiel auf geeignete Weise gepuffert sein, falls nötig, und
das flüssige
Verdünnungsmittel
zuerst mit ausreichend Kochsalzlösung
oder Glukose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen
Lösungen
sind speziell zur intravenösen,
intramuskulären,
subkutanen und intraperitonealen Verabreichung geeignet.
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Im
Allgemeinen wird eine wirksame Menge der vorliegenden G-CSF-Analoga
(oder ihrer Derivate) durch das Alter, Gewicht, und das Leiden oder
den Schweregrad der Krankheit des Empfängers bestimmt. Siehe Remington's Pharmaceutical
Sciences, vorstehend, Seiten 697–773, hierin durch Bezugnahme
aufgenommen. Typischerweise kann eine Dosierung zwischen etwa 0,001 μg/kg Körpergewicht/Tag
und etwa 1000 μg/kg
Körpergewicht/Tag
verwendet werden, aber, wie ein Fachmann erkennen wird, kann mehr
oder weniger verwendet werden. Das Dosieren kann einmal oder mehrmals
täglich
stattfinden, oder weniger häufig,
und kann in Verbindung mit anderen Zusammen setzungen wie hierin
beschrieben stattfinden. Es sollte angemerkt werden, dass die vorliegende
Erfindung nicht auf die hierin zitierten Dosierungen beschränkt ist.
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Eine "Einheitsdosis" wird als diskrete
Menge einer therapeutischen Zusammensetzung definiert, die in einem
geeigneten Träger
dispergiert ist. Zum Beispiel werden die Polypeptidzusammensetzungen,
wo Polypeptide parenteral verabreicht werden, im Allgemeinen in
Dosen injiziert, die von 1 μg/kg
bis 100 mg/kg Körpergewicht/Tag
reichen, vorzugsweise in Dosen, die von 0,1 mg/kg bis etwa 50 mg/kg
Körpergewicht/Tag
reichen. Eine parenterale Verabreichung kann mit einem anfänglichen
Bolus ausgeführt
werden, gefolgt von kontinuierlicher Infusion, um therapeutische
Kreislaufniveaus des Arzneistoffprodukts aufrechtzuerhalten. Fachleute
werden die wirksamen Dosierungen und Verabreichungsregimes leicht
optimieren, wie sie durch gute medizinische Praxis und den klinischen
Zustand des einzelnen Patienten bestimmt werden.
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Die
Dosierungshäufigkeit
hängt von
den pharmakokinetischen Parametern der Mittel und den Verabreichungswegen
ab. Die optimalen pharmazeutischen Formulierungen werden von einem
Fachmann, abhängig
vom Verabreichungsweg und der erwünschten Dosierung, bestimmt.
Siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical
Sciences, vorstehend, Seiten 1435–1712. Derartige Formulierungen
können
den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der
in-vivo-Freisetzung und die Geschwindigkeit der in-vivo-Clearance
der verabreichten Mittel beeinflussen. Abhängig vom Verabreichungsweg
kann eine geeignete Dosis gemäß dem Körpergewicht,
der Körperoberflächen oder
der Organgröße berechnet
werden. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, die nötig ist,
um die geeignete Behandlungsdosis zu bestimmen, wird von Fachleuten
routinemäßig ohne übermäßiges Experimentieren
durchgeführt,
speziell angesichts der Dosierungsinformation und der Assays, die
hierin offenbart werden, sowie der pharmakokinetischen Ergebnisse,
die bei Tieren oder menschlichen Klinikversuchen beobachtet wurden.
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Geeignete
Dosierungen können
durch die Verwendung etablierter Assays zum Bestimmen des Grades
der Neutropenie in Verbindung mit relevanten Dosis-Wirkungs-Ergebnissen nachgeprüft werden.
Das endgültige
Dosierungsregime wird durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung
von Faktoren, welche die Wirkung von Arzneistoffen modifizieren,
z.B. der spezifischen Aktivität
des Arzneistoffes, des Schweregrades der Schädigung und der Ansprechbarkeit
des Patienten, des Alters, des Zustands, des Körpergewichts, des Geschlechts
und der Ernährung
des Patienten, des Schweregrades einer Infektion, der Verabreichungszeit und
anderer klinischer Faktoren bestimmt. Während Untersuchungen durchgeführt werden,
wird weitere Information bezüglich
geeigneter Dosierungsniveaus und einer geeigneten Behandlungsdauer
für spezifische Krankheiten
und Leiden hervorkommen.
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Bei
Gentherapieausführungsformen,
die virale Abgabe einsetzen, kann die Einheitsdosis bezüglich der
Dosis von Virusteilchen, die verabreicht werden, berechnet werden.
Virusdosen schließen
eine bestimmte Zahl von Virusteilchen oder Plaque-bildenden Einheiten
(pfu) ein. Für
Ausführungsformen,
die Adenovirus einbeziehen, schließen bestimmte Einheitsdosen
103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 oder 1014 pfu
ein. Die Teilchendosen können
wegen der Anwesenheit von infektionsunfähigen Teilchen etwas höher liegen
(10- bis 100-fach).
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Es
ist selbstverständlich,
dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren
der Erfindung in den Gebieten der Humanmedizin und Tiermedizin nützlich sein
können.
So kann der zu behandelnde Patient ein Säugetier sein, vorzugsweise
ein Mensch oder ein anderes Tier. Für tiermedizinische Zwecke schließen die
Patienten zum Beispiel Nutztiere, einschließlich Kühen, Schafen, Schweinen, Pferden und
Ziegen, Haustiere, wie zum Beispiel Hunde und Katzen, exotische
und/oder Zootiere, Labortiere, einschließlich Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen
und Hamstern, und Geflügel,
wie zum Beispiel Hühner,
Truthähne,
Enten und Gänse,
ein.
-
Zusätzlich zieht
die vorliegende Erfindung ein Kit in Betracht, das Komponenten zum
Kultivieren von Knochenmarkzellen oder peripheren Blutvorläuferzellen
enthält,
umfassend: a) eine Zusammensetzung mit einem G-CSF-Analogon der
vorliegenden Erfindung; und b) Komponenten, die zum Herstellen von
Medium zum Kultivieren von Knochenmarkzellen oder peripheren Blutvorläuferzellen
geeignet sind.
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I. Beispiele
-
Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden, nichtbeschränkenden
Beispiele genauer beschrieben, die angeboten werden, um die Erfindung
vollständiger
zu veranschaulichen, aber nicht so ausgelegt werden sollen, dass
sie deren Umfang beschränken.
Die Beispiele veranschaulichen die Herstellung der vorliegenden
G-CSF-Analoga und das Testen dieser Analoga in vitro. Fachleuten
wird selbstverständlich
sein, dass die in diesen Beispielen beschriebenen Techniken Techniken
repräsentieren,
die von den Erfindern als in der Durchführung der Erfindung gut funktionierend
beschrieben werden und als solche bevorzugte Weisen für deren
Durchführung
ausmachen. Es sollte jedoch ersichtlich sein, dass Fachleute angesichts der vorliegenden
Offenbarung anerkennen, dass viele Änderungen in den bestimmten
Verfahren gemacht werden können,
die offenbart werden, und immer noch ein gleiches oder ähnliches
Ergebnis erhalten werden kann, ohne vom Wesen und Umfang der Erfindung
abzuweichen.
-
BEISPIEL 1
-
Grundprinzip des Designs
für Histidinmutanten
-
G-CSF-Mutanten
wurden auf dem Prinzip beruhend, dass eine Histidin-Titrierung eine
relativ enge Bindung auf der Zelloberfläche aufrechterhalten aber zu
schwächerer
Bindung in endosomalen Kompartimenten führen könnte, gestaltet. Unter Ausnutzung
der pH-Senkung von ungefähr
7 auf der Zelloberfläche
auf zwischen 5 und 6 in Endosomen wurden die Mutanten so gestaltet,
dass sie die elektrostatischen Wechselwirkungen bei extrazellulärem pH-Wert
größtenteils
aufrechterhalten (oder verbessern), aber die Wechselwirkung bei endosomalem
pH-Wert verschlechtern. Der pKa-Wert von
Histidin auf der Oberfläche
von freiem Liganden (~ 6,5) [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742:
576–585
(1982)] legt, in Anbetracht der geeigneten lokalen Proteinumgebung,
nahe, dass die Histidin-Titrierung zu großen pH-abhängigen Wirkungen auf die Bindung
zwischen extrazellulären
und endosomalen Medien führen
könnte.
Berechnungen wurden verwendet, um Kandidaten für Stellen für eine Histidinsubstitution
zu identifizieren. Bevorzugte Stellen waren solche, bei denen die berechnete
Bindungsaffinität
bei neutralem Histidin mit Wildtyp vergleichbar und bei positiv
geladenem Histidin signifikant schwächer war.
-
BEISPIEL 2
-
Herstellung und Charakterisierung
von G-CSF-Analoga
-
G-CSF-Analoga
wurden entweder durch Insertions- oder ortsspezifische Mutagenese
von DNA, die r-met-HuG-CSF kodiert, unter Verwendung des Verfahrens
der Overlap-Extension PCR [Aiyar et al., Meth. Mol. Biol. 57: 177 –191 (1996)]
hergestellt. Nach dem Bestätigen
der Mutationen durch Sequenzanalyse wurde jede Mutante in E. coli
K12 exprimiert, erneut gefaltet und wie in [Lu et al., J. Biol.
Chem. 267: 8770 –8777 (1992)]
beschrieben gereinigt. Für
Protokolle und Verfahren [siehe auch "Recombinant PCR", Russell Higuchi, In: PCR Protocols,
Innis, Gelfand, Sninsky und White (Hrsg.), Academic Press, Inc.
San Diego, CA (1990); und "Site-directed
mutagenesis of cloned DNA",
In: Molecular Cloning: A Lab Manual, Sambrook, Fritsch und Maniatis
(Hrsg.), Cold Spring Harbor Press, CSH, N. Y. (1989)]. Über die
E. coli Expression von r-met-HuG-CSF ist
zuvor berichtet worden. Siehe US Patent Nr. 4.810.643 und US Patent
Nr. 5.849.883. Die DNA, die rekombinantes menschliches G-CSF kodiert,
hatte am Anfang ein Methioninkodon, gefolgt von Kodons für die 174-Aminosäure-Spezies
des menschlichen G-CSF. Die gereinigten r-met-HuG-CSF-Analoga behalten
das initiierende Methioninkodon bei (Position Met –1).
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Die
Aminosäuresequenz
und Nukleinsäuresequenz
für [His109]G-CSF werden in SEQ ID NO: 3 (DNA) und
4 (Aminosäure)
gezeigt. Die Aminosäuresequenz
und Nukleinsäuresequenz
für [His112]G-CSF werden in SEQ ID NO: 5 (DNA) und
6 (Aminosäure)
gezeigt. Die Aminosäuresequenz
und Nukleinsäuresequenz
für [His119]G-CSF werden in SEQ ID NO: 7 (DNA) und
8 (Aminosäure)
gezeigt.
-
Eine
Bestätigung
der Identität
der G-CSF-Analoga der vorliegenden Erfindung wurde durch N-terminale
Aminosäuresequenzierung
der intakten Proteine erreicht. Die Sequenzen der gereinigten G-CSF-Analoga
passten zu den Sequenzen, die aus den jeweiligen DNA-Sequenzen,
wie zum Beispiel den in SEQ ID NO: 3, 5 und 7 gezeigten, vorhergesagt
wurde. Derartige Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt [Shively, EXS
88: 99–117
(2000)].
-
Strukturherstellung von
Histidinmutanten
-
Die
Röntgenkristallstruktur
von G-CSF im 2:2 -Komplex mit der ligandenbindenden Domäne von G-CSFR
wurde von Aritomi et al. [Nature, 401: 713 –717 (1999)] unter Verwendung
von Ergebnissen bis 2,8 Å aus
Kristallen, die bei pH 7,5 gewachsen waren und aufrechterhalten
wurden, gelöst
[Aritomi et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 56: 751 –753 (2000)].
Die Struktur (Eingang 1 CD9) wurde aus der Proteindatenbank (www.rcsb.org/pdb/)
[Berman et al., Nucl. Acids Res. 28; 235 –242 (2000)] erhalten. Die
hierin beschriebenen Berechnungen konzentrieren sich auf die Berührungsfläche, die
durch die Segmente A und B gebildet wird, bei der es sich um die
Hauptbindungs-Berührungsfläche handelt,
die ein G-CSF-Molekül
(A) und eine CRH-Domäne
von G-CSFR (B) einbezieht.
Die Koordinaten für
diese Ketten wurden aus dem Koordinaten-File extrahiert und die Positionen polarer
und aromatischer Wasserstoffatome wurden unter Verwendung von CHARMM
konstruiert [Brooks et al., J. Comput. Chem. 4: 187–217 (1983);
Brunger und Karplus, Proteins 4: 148 –156 (1988)]. Zusätzlich wurde
eine kleine Zahl fehlender Positionen schwerer Atome, alte weit
von der Berührungsfläche entfernt,
in Standardgeometrie unter Verwendung von CHARMM konstruiert. Eine
Untersuchung der titrierbaren Seitenketten an der Berührungsfläche im Wildtypkomplex,
von denen es sich bei keiner um Histidin handelte, legte nahe, alle
in ihren neutralen Standard-pH-Titrierzuständen zu lassen.
-
In-silico-Mutagenese von
G-CSF für
Histidinmutanten
-
Die
potenziellen Stelle für
Histidinmutationen wurden durch ein in-silico-Verfahren identifiziert.
Die Konformationen aller Liganden- und Rezeptorseitenketten an der
Bindungs-Berührungsfläche innerhalb
von 10 Å von
der Mutation, einschließlich
der Mutation selbst, wurden unter Verwendung einer Standard-Rotamerbibliothek
auf ein rigides Gerüst
umgepackt [Dunbrack und Karplus, J. Mol. Biol. 230; 543 –574 (1993)].
Die Energiefunktion gliederte van der Waals-Wechselwirkungen und
elektrostatische Wechselwirkungen mit einer entfernungsabhängigen Dielektrizitätskonstante
(ε = 4r,
wobei r in Å ist)
und ohne Cutoff ein, wie in CHARMM19 implementiert ist [Brooks et
al. J. Comput. Chem. 4: 187–217
(1983); Gilson und Honig, Nature 330: 84 –86 (1987)], das ausgeweitet
wurde, um PARSE partielle atomare Ladungen einzuschließen [Sitkoff et
al., J. Phys. Chem. 98; 1978–1988
(1994)]. Energieminimierte Komplexe wurden unter Verwendung der Dead-end-Elimination
(und A*) gefunden [Desmet et al., Nature 356; 539–542 (1992);
Goldstein, Biophys. J. 66: 1335 –1340 (1994)]. Wenn dieses
Verfahren auf den Wildtypkomplex angewendete wurde, rekonstruierte es
die Kristallstruktur auf korrekte Weise bis zur Auflösung der
Rotamerbibliothek.
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Elektrostatische Berechnungen
für Histidinmutanten
-
Die
Auswahl von Resten in G-CSF für
Mutationen zu Histidin wurde durch elektrostatische Erwägungen bestimmt.
Die Berechnungsdetails waren ähnlich
zu publizierter Arbeit [Hendsch und Tidor, Protein Sci. 8; 1381 –1392 (1999)].
Berechnungen des elektrostatischen Kontinuums wurden durch Lösen der
linearisierten Poisson-Boltzmann-Gleichung
mit Differenzenverfahren unter Verwendung einer lokal modifizierten
Version des Computerprogramms DELPHI ausgeführt [Gislon und Honig, Nature,
330, 84–86
(1987); Gilson et al., J. Comput. Chem. 9: 327 –335 (1988); Sharp und Honig,
Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19: 301 –332 (1990). Die PARSE-Parameter
wurden für
Atomradien und partielle atomare Ladungen verwendet (Sitkoff et al.,
J. Phys. Chem. 98; 1978–1988
(1994)]. Für
die Protein-Dielektrizitätskonstante
wurde ein Wert von 4 verwendet und für das Lösungsmittel ein Wert von 80.
Die molekulare Oberfläche
wurde unter Verwendung einer kugelförmigen Sonde von 1,4 Å beschrieben
und die Gesamtionenstärke
wurde als 145 mM gewählt,
mit einer Stern-Schicht von 2 Å.
Berechnungen wurden unter Verwendung eines Zwei-Schritt-Fokussierungsverfahrens mit
23% und 92% Füllung
durchgeführt.
Zur Sichtbarmachung des elektrostatischen Potenzials wurde ein würfelförmiges Gitter
von 65 × 65 × 65 Rastereinheiten
verwendet. Für
Berechnungen der elektrostatischen freien Bindungsenergie wurde
ein Raster von 191 × 191 × 191 verwendet
(endgültiges
Rastermaß 0,476 Å) und jeder angegebene
Wert war der Mittelwert von 10 Verschiebungen des Moleküls relativ
zum Raster. Eine elektrostatische Komplementarität legte sechs Kandidaten-Mutationsstellen
nahe. Die Vorherrschaft übermäßig negativer
Bereiche zeigt eine überhöhte negative
Ladungsdichte an und schließt
Stellen ein, die den geladenen Resten Glu19,
Asp109 und Asp112,
sowie den polaren Resten Gln20, Thr116 und Gln119 entsprechen.
-
Strukturerzeugung
der Histidinmutanten
-
Mutante
Komplexe, in denen jeder der sechs Ligandenreste (Glu19,
Gln20, Asp109, Asp112, Thr116 und Gln119) einzeln zu Histidin mutiert wurde, wurden
durch Berechnung erzeugt. Jede Position wurde mit zwei neutralen
Histidin-Tautomeren (die entweder am δ- oder ε-Stickstoff protoniert waren,
was als Hisδ 0 beziehungsweise Hisε 0 angezeigt wird) und positiv geladenem Histidin
(His+) substituiert. Ein eingeschränktes Minimierungsverfahren
wurde benutzt, bei dem den Mutantenseitenketten und denen der benachbarten
Reste vollständige
Freiheit gegeben wurde, sich unter Verwendung von Algorithmen, die
auf Dead-end-Elimination und A* beruhen, umzupacken [Desmet et al.,
Nature 356; 539–542
(1992); Goldstein, Biophys. J. 66: 1335 –1340 (1994); Leach und Lemon,
Proteins 33: 227 –239
(1998)]. Die Komplementarität
der mutanten Komplexe wurde sichtbar gemacht und mit Wildtyp verglichen.
-
Auswahl von
Kandidaten für
Histidinmutanten
-
Kandidaten
wurden für
experimentelle Tests auf dem Prinzip beruhend ausgewählt, dass
Mutanten den Rezeptor etwa so gut wie (oder vielleicht sogar besser
als) Wildtyp für
das besser bindende His0-Tautomer (den Zelloberflächen-Bedingungen
entsprechend) und signifikant schlechter als Wildtyp für His+ (den endosomalen Bedingungen entsprechend)
binden sollten. Sobald der Unterschied zwischen der Bindung von
His0 und His+ mehr
als ein paar kcal/mol betrug, gab es keinen Vorteil darin, ihn größer zu machen,
denn er wäre
größer als
die Kosten, His+ im ungebundenen Zustand
zu deprotonieren und als His0 zu binden.
So wurden Asp109His und Asp112His
hergestellt und zur experimentellen Charakterisierung gereinigt.
Zusätzlich
wurde auch Gln119His hergestellt und gereinigt,
weil vorhergesagt wurde, dass es auf der Zelloberfläche besser
als Wildtyp binden würde,
obwohl es aus den Berechnungen nicht klar war, ob die Bindung in
Endosomen signifikant schwächer sein
würde.
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Werte der elektrostatischen
freien Bindungsenergie für
Wildtyp und Histidinmutanten
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Der
elektrostatische Beitrag zur freien Bindungsenergie für Wildtyp
und jede der Hisδ 0-,
Hisε 0 und His+- Mutanten
wurde unter Verwendung eines einfachen rigiden Bindungsmodells und
von Kontinuum-Elektrostatik berechnet. Obwohl es nicht alle Einzelheiten
der Bindung explizit behandelt, ist dieses Modell unkompliziert anzuwenden
und sollte fähig
sein, mäßige bis
große
Bindungsunterschiede zwischen den Komplexen zu unterscheiden. Die
Ergebnisse zeigen wenige unterschiedliche Verhaltensweisen. Die
meisten Mutanten zeigen eine Bindung von His0 (mindestens
einem der Histidin-Tautomere), die fast, aber nicht ganz so gut
ist wie Wildtyp (bis zu 2,5 kcal/mol schlechter). Zwei Ausnahmen
sind Glu19His0,
das im Komplex nicht toleriert wird (berechnet als etwa 10 kcal/mol
schlechter bindend als Wildtyp) und Glu119His0, das als etwas besser als Wildtyp bindend
berechnet wird (mit 1,7 kcal/ml für das Hisδ 0-Tautomer). Interessanterweise scheint Glu19 für
die Rezeptorbindung essentiell zu sein [Reidhaar-Olson et al., Biochemistry
35: 9034–9041
(1996); Layton et al., J. Biol. Chem. 274: 17445 –17451 (1999)].
In einem Zellproliferationsassay bringt Glu19Ala
im Wesentlichen keine Reaktion hervor (Ergebnisse nicht gezeigt),
was mit dieser Berechnung konsistent ist. Für drei der Mutanten [Glu19His ([19His]G-CSF),
Asp109His ([109His]G-CSF)
und Asp112His ([His112]G-CSF) wird vorhergesagt,
dass sich die pH-Abhängigkeit
der Bindung in die gewünschte
Richtung ändert,
weil His+ eine berechnete freie Bindungsenergie
hat, die etwa 5 oder mehr kcal/mol schlechter als His0 (und
mehr als 7 kcal/mol schlechter als Wildtyp) ist. Für die anderen
drei Mutanten, [Gln21His ([His21]G-CSF),
Thr117His ([His117]G-CSF),
und Gln119His ([His119]G-CSF)],
ist der Unterschied in der Bindung zwischen His0 und
His+ zu gering, um bezüglich der Vorhersagen sicher
zu sein (weniger als 1 kcal/mol).
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BEISPIEL 3
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Experimentelles Material
und Zellkultur
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Minimales
essentielles Medium alpha (MEMα),
L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin und fötales Rinderserum (FBS) wurde
von Life Technologies, Inc. (Rockville, MD) erhalten. Die isotonische
Lösung
für das Coulter
Zählgerät (ISOTON
II, Coulter Diagnostics, Hialeah, FL) wurde von Curtin Matheson
Scientific Inc. (Houston, TX) erhalten.
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Die
G-CSF-abhängige
Suspensionszelllinie OCI/AML1, ein großzügiges Geschenk von Ernest A.
McCulloch [Ontario Cancer Institute (OCI), Princess Margaret Hospital,
610 University Avenue, Toronto, Ontario, M5G 2M9, Canada], wurde
für alle
Experimente verwendet. Zellen wurden routinemäßig in 75 cm2 großen Corning-Gewebekulturkolben
in MEMα,
ergänzt
mit 20% FBS, 200 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100
g/ml Streptomycin und 270 pM G-CSF, in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5%
CO2 kultiviert. Die Zellen wurden alle 3
oder 4 Tage auf 105 Zellen/ml passagiert.
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BEISPIEL 4
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Experimentelle Ergebnisse
mit Histidinmutanten
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Zellproliferationsassay
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Alle
drei Histidinmutanten-[His109]G-CSF, [His112]G-CSF und [His119]G-CSF – wurden
in einem G-CSF-abhängigen
Zellproliferationsassay mit Wildtyp-G-CSF verglichen. OCI/AML1-Zellen
wurden 24 Std. vor der Initiierung des Zellproliferationsexperimentes
in ergänztes
MEMα-Medium
(ohne G-CSF) passagiert, und zu diesem Zeitpunkt wurden parallele
Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 105 Zellen/ml
in MEMα-Medium
mit 125 pM Wildtyp-G-CSF, [His109]G-CSF,
[His112]G-CSF oder [His119]G-CSF inkubiert. Das
Zellwachstum in jedem Kolben wurde an den Tagen 2, 5 und 8 unter
Verwendung eines Coulter-Zellgerätes
gemessen. Nach zwei Tagen konnten keine Unterschiede in der Zellproliferation
nachgewiesen werden. Nach fünf
Tagen jedoch erhöhte
[His119]G-CSF die Zellproliferation signifikant.
Bis zum Tag acht war die Zahl der mit [His119]G-CSF
behandelten Zellen fast das doppelte der Zahl der Kontrolle und
Zellen, die mit [His109]G-CSF und [His112]G-CSF behandelt wurden, zeigten kleinere,
aber signifikante Erhöhungen über die
Kontrolle hinaus. Deshalb waren alle Mutanten stärker als Wildtyp beim Fördern der
Zellproliferation, trotz der Tatsache, dass alle mutierten Reste
direkt an der Berührungsfläche mit
dem Rezeptor liegen.
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Ligandenverarmung
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Eine
Ligandenverarmung wurde für
jedes Protein im Zeitverlauf gemessen. Wie in den vorstehenden Experimenten
wurden OCI/AML1-Zellen 24 Std. vor der Initiierung des Ligandenverarmungsexperimentes
in ergänztes
MEMα-Medium
(ohne G-CSF) passagiert und zu diesem Zeitpunkt wurden parallele
Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 105 Zellen/ml
in MEMα-Medium
mit 125 pM Wildtyp-G-CSF, [His109]G-CSF, [His112]G-CSF
oder [His119]G-CSF inkubiert. Nach 24 Std.
wurde die Zellzahl in jedem Kolben wie vorstehend beschrieben gemessen
und ein Aliquot von jedem Medium-Überstand, der nach einer Zentrifugation
zum Pelletieren von Zellresten erhalten wurde, wurde zum Messen
der G-CSF-Konzentration bei –20 °C gelagert.
Dies wurde 8 Tage lang alle 24 Std. wiederholt. Die Konzentrationen
von G-CSF, [His109]G-CSF, [His112]G-CSF
und [His119]G-CSF in den Proben der Medium-Überstände wurden
dann unter Verwendung eines enzymverbundenen Immunadsorptionsassay-
(ELISA-) Kits quantifiziert, das von R & D Systems (Minneapolis, MN) erhalten wurde.
Jede Überstandsprobe
wurde im Duplikat analysiert. Beide Asp→His-Mutanten, von denen vorhergesagt
wurde, dass sie in Bezug auf Trafficking-Eigenschaften die Besten
sein würden,
ergaben Halbwertszeiten, die mindestens das 10-fache der Halbwertszeit
von Wildtyp-G-CSF betrugen. Es scheint tatsächlich, dass die früher bemerkte
Verstärkung
der Zellproliferation beider Asp→His-Mutanten {[His109]G-CSF und [His112]G-CSF} relativ
zu Wildtyp bis zum Tag 8 ein direktes Ergebnis davon ist, genügend Liganden
zur Verfügung
zu haben, um die Zellen zu stimulieren. Zusätzlich hatte die Gln→His-Mutante,
[His119]G-CSF, eine Halbwertszeit, die 6-fach
größer als
die Halbwertszeit von Wildtyp war. Dies war signifikant, da die
Stärke
dieser Mutante zu fast zweimal so viel Zellen wie Wildtyp bis Tag
8 führte,
und man deshalb erwarten könnte,
dass das zelluläre
Trafficking dieser Mutante größer als
das des Wildtyps wäre.
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Mindestens
zwei unabhängige
Experimente wurden sowohl für
die Zellproliferations- als auch für die Ligandenverarmungsuntersuchungen
durchgeführt.
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Ligandenbindung
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Die
Ligandenbindungsaffinität
eines G-CSF-Analogons an den G-CSF-Rezeptor wird unter Verwendung
eines BIAcore®2000
(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) gemessen. Wildtyp-G-CSF, an das
Histidin angehängt
wurde, wird auf der Chip-Oberfläche
immobilisiert und freier Rezeptor (~ 0,25–10 nM) wird über den
Chip geleitet, um eine Stan dard-Gleichgewichtskurve zu erzeugen
und um die Wildtyp-Bindungsaffinität unter Verwendung eines 1:1
-Modells zu berechnen. Um die Liganden-Bindungsaffinität jeder
Mutante zu bestimmen, wird 2 nM freier Rezeptor mit einer bekannten
Konzentration eines mutanten Liganden gemischt und über den Chip
geleitet. Die Gleichgewichtsbindungsaffinitäten der Mutanten werden unter
Verwendung eines 1:1 -Modells mit Kompetition bestimmt. Bindungsaffinitätsergebnisse
werden unter Verwendung der BIA Auswertungssoftware 3.1 (BIAcore,
Inc.) analysiert und Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (KD) werden bestimmt.
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Um
zu bestimmen, ob die Erhöhung
der Halbwertszeit und Stärke
der Mutanten höheren
Ligandenrecycling-Geschwindigkeiten zuzuschreiben waren, wurden
Geschwindigkeitskonstanten, die auf die Komplex-Internalisierung
und das Ligandenrecycling schließen lassen, wie folgt gemessen
und über
sie wurde berichtet.
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Internalisierung der G-CSF-Analoga
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Internalisierungsexperimente
wurden mit zwei der G-CSF-Analoga, [His109]G-CSF, [His112]G-CSF, über einen Zeitraum von 5 Min.
durchgeführt, ähnlich wie
in publizierter Arbeit [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol.
Metabol. 32: E1–E9
(1995)]. Kurz gesagt wurden 108 Zellen zweimal
mit PBS gewaschen und dann in markiertem Ligand 30 Min. lang auf
Eis inkubiert, um Oberflächenkomplexe
zu erhalten. Die Zellen werden wieder zweimal mit eiskaltem PBS
gewaschen und bei t = 0 bei 37 °C
in MEMα resuspendiert.
Die Änderung bei
Oberflächenkomplexen
und internen Komplexen wurde über
einen Zeitraum von 5 Min. verfolgt; ein Graph von internen Komplexen
gegen das Zeitintegral der Oberflächenkomplexe ergibt eine lineare
Beziehung, deren Steigung die Geschwindigkeitskonstante der Komplexinternalisierung
ist [Wiley et al., J. Biol. Chem. 257: 4222 –4229 (1982)]. Zwischen dem
Wildtyp-G-CSF und den Analoga [His109]G-CSF
und [His112]G-CSF wurden keine Unterschiede
in den Internalisierungsgeschwindigkeiten nachgewiesen. Die Fehler,
die mit den Internalisierungsexperimenten verbunden sind, sind Standardabweichungen
von mindestens drei unabhängigen
Experimenten.
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Recycling der G-CSF-Analoga
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Recycling-Experimente
wurden mit zwei der G-CSF-Analoga, [His109]G-CSF,
[His112]G-CSF, auf eine mit den vorstehenden
Internalisierungsexperimenten identische Weise durchgeführt, außer über einen
Zeitraum von 25 Min. Ergebnisse aus Recycling-Experimenten wurden Parameter-angepasst,
um Recycling-Geschwindigkeitskonstanten zu erhalten. Es wurde festgestellt,
dass die Recycling-Geschwindigkeitskonstanten für die Mutanten mindestens 50%
größer waren
als die von Wildtyp, mit 95% Konfidenz durch den Zwei-Proben-t-Test.
Die mit den Recyclingexperimenten verbundenen Fehler waren Standardabweichungen
von mindestens drei unabhängigen
Experimenten. Diese Verbesserung beim Ligandenrecycling war genau
das Ziel, das durch die Verwendung des hierin vorgelegten Modellierens
durch Berechnung angestrebt wurde. Während die gemessene Erhöhung des
Recyclings gewissermaßen
aus einer Internalisierungsrunde stammt, ergibt sich die enorme
Vermehrung der Halbwertszeit der Mutanten aus der verbundenen Wirkung
der Internalisierung, des Recyclings, der Reinternalisierung und
so weiter. So kann die iterative Wirkung des Recycling-Phänomens die
Arzneistoffstärke
durch Erhöhen
von dessen Lebensdauer in vivo und Reduzieren des negativen Feedbacks,
das durch die Arzneistoff-induzierte Expansion von Zellen, die den
Zellrezeptor exprimieren, propagiert wird, stark verbessern.
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Demgemäß ist, wie
vorstehend angezeigt, festgestellt worden, dass die Histidinsubstitutionen
der vorliegenden Erfindung zu G-CSF-Analoga führen, die in einem Zellproliferationsassay
die gleiche oder eine größere Stärke relativ
zu Wildtyp-G-CSF aufweisen. Auch waren die Halbwertszeiten der Mutanten
6- bis 10-mal so hoch wie die von Wildtyp-G-CSF. Darüberhinaus
induziert [His119]G-CSF die Zellproliferation
so, dass sie bis zum Tag 8 fast das zweifache der von Wildtyp-G-CSF
beträgt.
Zusätzlich
wurde das Ligandenrecycling signifikant verbessert, obwohl die Internalisierungsgeschwindigkeit
unverändert
war. Diese Ergebnisse sind signifikant, weil sie nahelegen, dass
das zelluläre
Trafficking dieser Mutanten relativ zu Wildtyp verbessert ist. Derartige Änderungen
der zellulären
Reaktion finden durch Beeinflussen der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder
der Vorgänge
des Sortierens, Recyclings, und des Abbaus über die endozytischen Liganden/Rezeptor
Trafficking-Wege statt.
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Die
hierin vorgelegte Methodik ist auch noch auf andere Systeme über das
G-CSF/G-CSFR-System hinaus
verallgemeinerbar. In Anbetracht einer Kristallstruktur eines Ligandenrezeptorkomplexes
stellt die "Histidin-Austausch"-Technik einen Rahmen
zum Erzeugen von Mutanten mit verstärktem endosomalen Recycling
von Komponenten der dem Trafficking unterworfenen Komplexe bereit.
Dies ist die erste Arbeit, die ein rationales Arzneistoffdesign
im Zusammenhang einer zellulären
Trafficking-Analyse auf einer System-Ebene demonstriert, anstelle
von einzelnen Bindungs- oder Signal-Vorgängen
per se.
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Während die
vorliegende Erfindung in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen
beschrieben worden ist, ist es selbstverständlich, dass dem Fachmann Variationen
und Modifikationen einfallen werden. Deshalb ist beabsichtigt, dass
die angehängten
Ansprüche
alle derartigen äquivalenten
Veränderungen
abdecken, die, wie beansprucht, innerhalb des Umfangs der Erfindung
vorkommen.
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