DE69922150T2

DE69922150T2 - Deoxyhypusin reagenz und peptide

Info

Publication number: DE69922150T2
Application number: DE69922150T
Authority: DE
Inventors: J. Raymond BERGERON
Original assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 1998-08-19
Filing date: 1999-08-19
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-08-20
Also published as: EP1032585B1; JP2002523423A; WO2000011020A9; US6258931B1; EP1032585A1; ATE283276T1; CA2306456A1; DE69922150D1; AU5898799A; WO2000011020A1; EP1032585A4

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, als Reagenz für die Synthese von Deoxyhypusin enthaltenden Peptiden geeignetes Deoxyhypusinderivat. Die Erfindung betrifft weiterhin solche Peptide, die unter Verwendung dieses Reagenz synthetisiert wurden.
Hintergrund der Erfindung
Beschreibung des Stands der Technik
Hypusin, [(2S, 9R)-2,11-diamino-9-hydroxy-7-Azaundecansäure] oder [N_ε-(4-amino-2-hydroxybutyl)lysin], eine ungewöhnliche, natürlich auftretende Aminosäure mit der folgenden Struktur:
wurde zuerst von Shiba et al. 1971 [Biochim. Biophys. Acta., Vol. 244, Seiten 523–531 (1971)] aus Rindernhirnextrakten isoliert. Das Molekül besitzt zwei chirale Zentren, eines an Position 2 und eines an Position 9, von welchen beide als R oder S nach der Cahn-Ingold-Prelogmethode klassifiziert werden können. Es wurde gezeigt, dass das (2S, 9R)-Diastereomer (B), welches als eine posttranslationale Modifikation von Lysin gebildet wird,
in einem Vorläuferprotein des eukaryotischen Initiationsfaktors „elF-5A" (früher als e1F-4D bezeichnet; die Nomenklatur der Initiationsfaktoren wurde überarbeitet) [Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 80, Seiten 1854–1857 (1983); und Safer, Eur. J. Biochem., Vol. 186, Seiten 1–3 (1989)] vorkommt. Deoxyhypusin, [2,11-diamino-7-Azaundecansäure] besitzt die folgende chemische Struktur:
Die natürlich auftretende Form besitzt an der 2-Position ein chirales Zentrum in der (S)-Konfiguration.
Das 17-kDa-Protein elF-5A scheint unter vielen eukaryotischen Arten einschließlich Hefen und höheren Säugetieren hoch konserviert zu sein, was für dessen Wichtigkeit aus einer evolutionären Perspektive spricht. [Wohl, T., et.al., Mol. Gen. Genet., Vol. 241, 305–311 (1993); Magdolen, V. et al., Mol. Gen. Genet., Vol. 244, 646–652 (1994)]. Insbesondere die 12-Aminosäureregion, die den Hypusinrest umgibt, L-Ser-L-Thr-L-Ser-L-Lys-L-Thr-Gly-Hpu-L-His-Gly-L-His-L-Ala-L-Lys (SEQ. ID NO:1), ist extrem hoch konserviert innerhalb der Arten. [Bartig, D. et al., Eur. J. Biochem., Vol. 204, 751–758 (1992)].
Die Hypusinierung von elF-5A bzw. die „Reifung" des Proteins tritt als posttranslationales Vorkommnis auf. [Park, M.H. et al., J. Biol. Chem., Vol. 257, 7217–7222 (1982)]. Zunächst wird über die Deoxyhypusinsynthase eine Aminobutylgruppe von Spermidin entfernt, und an Lys-50 des humanen Proteins angefügt. [Park, M.H.; Wolff, E.C.; Abbruzzese, A.; Folk, J.E., Adv. Exp. Med. Bio. Chem., Vol. 250, 435–447 (1988); Wolff, E.C.; Park, M.H.; Folk, J.E. J.Biol. Chem., Vol. 265, 4793–4799 (1990)]. Danach führt die Deoxyhypusinhydroxylase die Hydroxylgruppe am C-9 in der (R-)Konfiguration ein [Park (1982)].
In der Mitte der 70er Jahre wurde gezeigt, dass elF-5A das Verbinden der ribosomalen Untereinheiten stimuliert, und die Reaktivität der 80 S-gebundenen Met-t-RNA mit Puromycin verstärkt [Anderson et al., FEBS Lett., Vol. 76, Seiten 1–10 (1977); und Kemper et al., J. Biol. Chem., Vol. 251, Seiten 5551–5557 (1976)]. Später, 1983, schlugen Cooper et al., supra, vor, dass ein Hypusinmodifiziertes Protein als wichtiger Initiationsfaktor in allen wachsenden eukaryotischen Zellen dient. 1986 isolierten Park et al. [J. Biol. Chem., Vol. 261, Seiten 14515–14519 (1986)] das elF-5A Protein aus humanen roten Blutzellen und bestimmten die Aminosäuresequenz, die den einzelnen Hypusinrest umgibt, als Thr-Gly-Hpu-His-Gly-His-Ala-Lys (SEQ ID NO:2). Zusätzlich ist die Synthese von elF-5A Analoga von hoher therapeutischer Bedeutung wegen der potentiellen Anwendung zur Kontrolle der HIV-Replikation [Bevec et al., J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, Seiten 10829–10833 (1994); und Ruhl et al. J. Cell Biol., Vol. 123, Seiten 1309–1320 (1994)]. [Biochimica et Biophysica Acta, 997 (1989) 248–255, Abruzzese et al., offenbart die Inhibition von Deoxyhypusin durch Polyamine und durch ein Deoxyhypusinpeptid].
Der Inhibitor der Deoxyhypusinsynthase, N¹-guanyl-1,7-diaminoheptan (CG₇) inhibiert das Wachstum von CHO-Zellen, ohne den Polyaminmetabolismus zu berühren. [Park, M.H., et al., J. Biol. Chem., Vol. 269, 27827–27832 (1994)]. Gerichtete Mutageneseexperimente, bei denen Lys-50 mit Arginin ersetzt wurden, resultierten in einem nicht-funktionalen Protein in Hefezellen; das Arginin konnte nicht so modifiziert werden, dass es Hyposin bildet [Schnier, J, et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 11, 3105–3114 (1991)]. Hefezellen, bei denen die Wildtyp-Kopie des Gens mit einer mutierten Kopie ersetzt worden war, wuchsen nicht mehr. Die genaue Rolle des Hypusinrestes in oder bei der elF-5A Aktivität verbleibt unklar. Während es klar ist, dass das N-terminale Methionin des Proteins durch eine Acetylgruppe ersetzt wird, und dass die Acytelierung am Lys-47 auftritt, scheint keines dieser Ereignisse kritisch für die Funktion des Proteins zu sein [Klier, H. et al., FEBS Lett. Vol. 334, 360–364 (1993); Klier, H., et al., Biochemistry, Vol. 34, 14693–14702 (1995)].
Der wahrscheinlich faszinierendste Aspekt bezüglich elF-5A ist dessen Rolle bei der Replikation des humanen Immundefizienzvirus (HIV); elF-5A ist ein transaktivierender Faktor bei der Replikation von HIV. [Ruhl, M., et al., J. Cell Biol., Vol. 123, 1309–1320 (1993)]. Das elF-5A Molekül bindet an einen Komplex, der zwischen dem Rev Response Element (RRE) im Stamm-Loop IIB der viralen mRNA und Rev, einem viralen Protein, das als Kernexportsignal dient, gebildet wird. [Ruhl et al., supra]. Sobald elF-5A an Rev-RRE bindet, kann der jetzt aktive elF-5A-Rev-RRE Komplex aus dem Kern heraus transportiert werden; die virale Replikation läuft weiter. Bei Experimenten, bei denen Antisenesnukleotide verwendet wurden, um elF-5A Synthese zu verhindern, wurde die virale Replikation inhibiert. [Gerace, L., Cell, Vol. 82, 341–344 (1995)]. Außerdem wurde in Gelshiftexperimenten gezeigt, dass die hyposin- oder deoxyhypusinenthaltenden Fragmente für das Binden von elF-5A an Rev-RRE erforderlich waren. Unter Beachtung dieser Beobachtungen werden zwei Themen besonders interessant. Bevec et al. haben gezeigt, dass Rev Domänen aufweist, welche sowohl den nuklearen Import als auch den nuklearen Export steuern. Obwohl bestimmte elF-5A Mutanten fähig sind, in den Kern transportiert zu werden und an Rev-RRE zu binden, verhindern sie doch den Kernexport und damit die virale Replikation. [Bevec, D., et al., Science, Vol. 271, 1858–1860 (1960); Junker, U.; et al., Hum. Gene Ther., Vol. 7, 1861–1869 (1996)].
Die Beobachtungen, dass elF-5A erforderlich ist für sowohl mitotische Ereignisse als auch für die virale Replikation von HIV, und dass unreifes elF-5A deoxyhypusiniert oder hypusiniert werden muss, um aktiv zu werden, machen die Inhibierung der elF-5A Deoxyhypusinierung oder Hypusinierung ein interessantes Ziel bei therapeutischen Strategien für die Entwicklung von Arzneimitteln gegen Krebs oder als antivirales Arzneimittel. Eine weitere potentielle antivirale Strategie umfasst die Identifizierung der prinzipiellen Plattform innerhalb von elF-5A, welche für den nuklearen Import verantwortlich ist, und welche das Binden an Rev-RRE ermöglichen wird, jedoch nicht den nuklearen Export der viralen Nachricht.
Um die oben beschriebenen biochemischen Ereignisse untersuchen zu können, und um therapeutische Strategien für die Entwicklung von Arzneimitteln gegen Krebs und Viren entwickeln zu können, besteht ein Bedarf an einer synthetischen Methodologie zur Herstellung von Modellpeptiden, welche Hypusin und Deoxyhypusin enthalten. Ein Reagenz und ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, welche Hypusin umfassen, ist in US 6,248,866 offenbart. Neue Peptide, die Hypusin umfassen und über das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, sind in US 6,492,489 offenbart. Das Hypusinreagenz und die Peptide sind ebenso in Bergeron, R.J. et al., J. Org. Chem., Vol. 62, 3285–3290 (1997) offenbart. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Peptide bereitzustellen, die Deoxyhypusin umfassen, und ein Reagenz und ein Verfahren für deren Herstellung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Deoxyhypusinderivat bereit, welches als Reagenz zur Synthetisierung von Peptiden, die Deoxyhypusin umfassen, verwendbar ist, wobei das Derivat die Formel aufweist:
worin Q₁ und Q₂ gleich oder verschieden sein können und Aminoschutzgruppen sind, und Q₃ eine Aminoschutzgruppe ist, die orthogonal zu Q₁ und Q₂ ist.
Ein zusätzliches Ausführungsbeispiel der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese des oben definierten Deoxyhypusinreagenzes umfassend:

a. Bereitstellung eines Esters des Nε-, Nα-zweifach geschützten Lysins, wobei der Ester die Formel hat:
worin Prot und Prot' wechselseitige orthogonale Aminoschutzgruppen sind und R der Rest eines veresternden Alkohols ist, welcher orthogonal bezüglich Prot und Prot' ist,
b. Entfernung von Prot von Nε von (a) und Umwandlung des Produktes zu einer Verbindung der Formel:
c. Kondensation von (b) mit 3-Cyanopropanal und Reduktion des intermediären Imins zu einem Cyanid der Formel:
d. Reduktion von (c) zur Herstellung eines Triamins der Formel:
e. Schutz der freien Aminogruppen von (d) zur Herstellung eines Esters der Formel:
f. Entfernung von R und Prot' von (e) zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
g. Acylierung der freien Aminogruppe zur Herstellung des Deoxyhypusinderivats (1).

Die Reduktion in den Stufen (c) und (d) kann gegebenenfalls innerhalb einer Reaktion durchgeführt werden.
Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung betrifft Verbindungen der Struktur (2) S-deoxyHpu-T (2)welche unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes synthetisiert werden können, und wobei deoxyHpu ein Deoxyhypusinaminosäurerest ist, und S und T jeweils unabhängig voneinander Peptidreste sind, welche zwischen 0 und 12 Aminosäurenlänge aufweisen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen finden bei der Untersuchung von biochemischen Prozessen, die Hypusin und Deoxyhypusin umfassen, Verwendung.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist die Darstellung eines Reaktionsschemas für die Synthese eines Beispiels für ein erfindungsgemäßes Deoxyhypusinreagenz und für freies Deoxyhypusin. Reagentien sind: (a) Nα-BOC-Nε-CBZ-L-lysin tert-butyl ester, Benzol, Molekularsiebe; (b) H₂, PtO₂, THF; (c) H₂, Pd/C, PtO₂, HOAc; (d) CBZ-ONSu, KHCO₃; (e) TFA, Triethylsilan, CH₂Cl₂; (f) FMOC-ONSu, Na₂CO₃; (g) Piperidin; (h) HBr/HOAc in TFA, Phenol, Pentamethylbenzol, Trüsopropylsilan.
2 ist die Darstellung einer polymergebundenen Synthese eines Deoxyhypusinhexapeptids. Reagenzien: (a) HBr/Essigsäure in TFA, Phenol, Pentamethylbenzol, Trüsopropylsilan, 1,2-Ethandithiol.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In den vorstehenden und den nachfolgenden Beschreibungen der vorliegenden Beschreibung werden geeignete Beispiele und Verdeutlichungen der verschiedenen innerhalb der vorliegenden Erfindung umfassten Definitionen detailliert wie folgt erklärt.
Der Ausdruck „Aminoschutzgruppe", wie er hierin verwendet wird, soll Gruppen (Q₁, Q₂ und Q₃) bezeichnen, die anstelle eines Wasserstoffatoms einer Aminogruppe oder von Aminogruppen eingefügt werden, um die Aminogruppe(n) während der Synthese zu schützen.
Die Auswahl einer geeigneten Aminoschutzgruppe hängt von dem Schutzgrund und der geplanten Verwendung des geschützten Produkts ab. Wird die Schutzgruppe ausschließlich für den Schutz während der Synthese verwendet, kann eine konventionelle Aminoschutzgruppe verwendet werden. Geeignete Aminoschutzgruppen sind auf dem Fachgebiet bekannt und beispielsweise von Bodanszky in Principles of Synthesis, Springer-Verlag, New York (1984); und von Ives im U.S.-Patent No. 4,619,915 und in den vielen verschiedenen Publikationen über Peptidchemie, auf die im Folgenden Bezug genommen wird, beschrieben. Siehe auch Methoden der Organischen Chemie, Houben-Weyl, Vol. 15, No. 1 für Schutzgruppen und Vol. 15, No. 2 für Verfahren zur Peptidsynthese. Beispielhafte Aminoschutzgruppen für die Verwendung bei der Synthese umfassen Acylgruppen wie beispielsweise Tert-butoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC), Benzoyl, Acetyl und Ähnliches. Noch weitere konventionelle Aminoschutzgruppen für die Verwendung bei der Synthese werden in der Literatur beschrieben [Bodanszky, supra, und Ives, supra].
Wird vorliegend der Ausdruck „orthogonal" in Verbindung mit dem Ausdruck „Schutzgruppe(n)" verwendet, so sollen damit Schutzgruppen in dem Molekül bezeichnet werden, die in Gegenwart weiterer Schutzgruppen aus dem Molekül selektiv entfernt werden können, ohne dass die anderen Schutzgruppen betroffen sind.
Die oben diskutierten verschiedenen Schutzgruppen für die Aminofunktionen können die Aminofunktionen in erfindungsgemäßen Aminosäuren-Peptiden (oder deren Vorläufermolekülen) über auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren ersetzen. Verfahren für die chemische Entfernung von Schutzgruppen (falls diese nicht in dem pharmazeutisch verwendbaren Endprodukt erhalten werden sollen) sind ebenso dem geübten Fachmann gut bekannt. Typischerweise werden Aminoschutzgruppen chemisch durch Acidolyse (saure Hydrolyse) oder Hydrogenierung entfernt, abhängig von der ausgewählten verwendeten Schutzgruppe. Carboxy-schützende Gruppen werden typischerweise chemisch durch saure oder basische Hydrolyse entfernt. Schutzgruppen, die in das pharmazeutische Endprodukt eingebaut werden, müssen einer hydrolytischen oder metabolischen Spaltung in vivo zugänglich sein.
Das erfindungsgemäße Deoxyhypusinreagenz is als Syntheson für die Herstellung von Peptiden, insbesondere für ein Deoxyhypusinanalogon der elF-5A Pentapeptidsequenz verwendbar. Peptide umfassend Deoxyhypusin können durch aufeinanderfolgendes Zufügen einer Aminosäure oder einer geschützten Aminosäure hergestellt werden, oder durch das Hinzufügen des Reagenzes zu einem Peptid, welches keinen Aminoterminus besitzt. Daher kann das Reagenz im Verlauf der Peptidsynthese direkt in ein Dipeptid oder ein größeres Fragment eingebaut werden. Die α-Stickstoffschutzgruppe des Deoxyhypusinreagenz kann zu jedem Zeitpunkt der Synthese entfernt werden, und die Carboxylatgruppe einer Aminosäure, einer geschützten Aminosäure oder eines Peptids ohne Carboxylatgruppe kann daran gebunden werden. Verfahren für die aufeinanderfolgende Addition von Aminosäuren zur Bildung von Peptiden unter Verwendung von geeigneten Schutzgruppen sind auf dem Gebiet gut bekannt. Eine exzellente Zusammenfassung solcher Verfahren einschließlich von Festphasensynthese und von Lösungssynthese ist in US Patent No. 4,530,920 (Nestor et al.) enthalten, auf welches sich hiermit berufen wird, und welches durch Bezugnahme hierin vollumfänglich mit aufgenommen wird. Siehe auch Solid Phase Peptide Synthesis, second edition, John Morrow Stewart und Janis Dillaha Young, eds., Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984). Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Peptide können auch über Segmentkondensationsverfahren hergestellt werden, wie sie im Stand der Technik beschrieben sind. [Bodanszky, supra und Methoden der Organischen Chemie supra].
In Verbindungen der Struktur (2) sind S und T Peptidreste von Null bis etwa 12 Aminosäuren Länge, und vorzugsweise Peptidreste von 0 bis etwa 6 Aminosäuren Länge. Besonders bevorzugt sind S und T Peptidreste von 0 bis etwa 3 Aminosäuren Länge. S und T können unabhängig voneinander in der Länge und in der Zusammensetzung der Aminosäurereste variieren. Nicht begrenzende Beispiele für erfindungsgemäße Peptide sind:
L-Ser-L-Thr-L-Ser-L-Lys-L-Thr-Gly-deoxyHpu-L-His-Gly-L-His-L-Ala-L-Lys, (SEQ. ID NO:3)
L-Cys-L-Thr-Gly-deoxyHpu-L-His-Gly (SEQ. ID NO: 4), deoxyHpu-L-His-Gly,
L-Thr-Gly-deoxyHpu-L-His-Gly (SEQ. ID NO: 5),
L-Lys-L-Thr-Gly-deoxyHpu-L-His-Gly (SEQ. ID NO: 6),
worin die DeoxyHpu-Verbindung das 2(S)-Isomer des 2(R)-Isomers davon ist. Liegt Deoxyhypusin in der 2(R)-Konfiguration vor, werden die erfindungsgemäßen Verbindungen ausgehend von dem entsprechend konfigurierten Lysinausgangsmaterial gebildet.
Erfindungsgemäße Verbindungen können zur Untersuchung von biochemischen Prozessen verwendet werden, die Hypusin und Deoxyhypusin umfassen, beispielsweise bei der Untersuchung von Transportmechanismen für elF5A und dem Zusammenspiel mit der Bildung des funktionalen elF5A-Rev-RRE-Komplexes, welcher wiederum den nuklearen Export eines solchen Komplexes behindert.
Ein spezifisches Beispiel für die Synthese des Deoxyhypusinreagenz 10 ist in 1 gezeigt. Der erste Schritt umfasst eine Molekularsieb-unterstützte Kondensation von 3-Cyanopropanal 5 (Sumimoto, H.; Kobayashi, K., J. Polym. Sci., Vol. 4, 907–916 (1966)] mit dem Nα-BOC-tert-butyl Ester von L-lysin (4) und der Reduktion des resultierenden Zwischenprodukts Imin über H₂/PtO₂ [Knapp, S.; Hale, J.J.; Bastos, M.; Molina, A.; Cheil, K.Y., J. Org. Chem., Vol. 57, 6239–6256 (1992)] zu dem Deoxyhypusingerüst 6. Das Nitril an 6 wurde weiter reduziert unter Verwendung von H₂ über Pd/C und PtO₂ in Essigsäure zu 8; die N-7 und N-12 -Positionen wurden mit CBZ-ONSu umgesetzt, um das vierfach geschützte Deoxyhypusin 8 herzustellen. Beide tert-butyl Schutzgruppen wurden mit Trifluoroessigsäure und Triethylsilan entfernt [Mehta, A.; Jaouhari,R.; Benson, T.J.; Douglas, K.T., Tetrahedron Lett., Vol. 33, 5441–5444 (1992)], und die Aminosäure 9 wurde in die Nα-FMOC-di-CBZ-geschützte Verbindung 10 umgesetzt. Dieses Reagenz wurde sowohl entschützt, um freies Deoxyhypusin zu erhalten, als auch um ein Deoxyhypusin-enthaltenden Hexapeptid zu bilden.
Für freies Deoxyhypusindihydrochlorid (11) wurde das Deoxyhypusinreagenz 10 zunächst mit Piperidin behandelt, um die FMOC-Schutzgruppe zu entfernen, und dann unter Verwendung von 30 % HBr in Trifluoressigsäure mit einem Cocktail von Kationenfängern (1) entschützt. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Reaktanden in Wasser gelöst, und die Nicht-Salze wurden in Methyltert-butyl-Ether extrahiert. Nach Konzentrierung wurde das Produkt unter Verwendung von Methylenchlorid/Methanol/Ammoniumhydroxyd als Laufinittel auf Kieselgel chromatographiert. Das freie Amin wurde in das Dihydrochloridsalz 11 überführt. Die Analysenwerte des Endprodukts stimmten mit den Literaturwerten überein [Knapp, S.; Hale, J.J.; Bastos, M.; Molina, A.; Cheil, K.Y., J. Org. Chem., Vol. 57, 6239–6256 (1992)].
Deoxyhypusinreagenzmoleküle von unterschiedlichen Stereochemien können in ähnlicher Weise unter Verwendung von Ausgangsmaterialien anderer Stereochemie, beispielsweise unter Verwendung von D-Lysinen, erhalten werden.
Das Deoxyhypusinreagenz wurde verwendet, um Cys-Thr-Gly-Deoxyhypusin-His-Gly herzustellen. Die Synthese des Hexypeptids 13 (2) wurde auf einem 2-Chlortritylharz unter Verwendung der SPPS und der FMOC-Chemie mit HBTU als aktivierendem Mittel durchgeführt. Die Cystein- und Histidinreste des Hexapeptids wurden jeweils als 4-Methoxytrityl-(Mmt) bzw. 4-Methyltrityl-Gruppen (Mtt) Derivate geschützt, während das Threonin als Tert-butyl-Ether geschützt wurde. 12 wurde dann mit HBr/Essigsäure in TFA entschützt, 1,2-Ethanedithiol, um die Disulfidbindung zu verhindern, und einem „Cocktail" von Carbocationenfängern (Phenol, Pentamethylbenzol, Trüsopropylsilan) bei Raumtemperatur. Das Endpeptid 13 wurde über Reverse-phase HPLC gereinigt. Die Hochfeld (600 MHz) ¹H NMR bei zwei unterschiedlichen Temperaturen, und die Aminosäureanalyse zeigten die korrekte Struktur des Hexapeptids.
Beispiele
Die Erfindung wird dargestellt durch die folgenden, nicht-begrenzenden Beispiele, welche sich auf die Reaktionsschemata, welche in den 1-2 dargestellt sind, beziehen, worin ¹H NMR Spektra bei 300 MHz aufgenommen wurden, falls nichts anderes ausgeführt wird; die ¹³C NMR Spektra wurden bei 75 MHz aufgenommen, soweit nichts anderes ausgeführt wird; die chemischen Verschiebungen sind in parts per million, ausgehend von einem internen Tetramethylsilan oder Natrium 3-(trimethyl-silyl)-propionatstandard angegeben; die Kopplungskonstanten (J) sind in Hz angegeben; die Massenspektra wurden mit Hilfe eines Kratos MS 80RFA oder einem Finnigan 4516 MS-Instrument durchgeführt; optische Drehungen wurden bei 589 nm (der NaD-Linie) in einem Perkin-Elmer 341-Polarimeter durchgeführt, wobei c ausgedrückt wird als Gramm pro Verbindung pro 100 ml; und die Schmelzpunkte wurden nicht korrigiert. Chemische Reagenzien wurden von Aldrich, Fluka oder Sigma Chemical Co. gekauft, und ohne weitere Reinigung verwendet.
Beispiel 1. Nα-BOC-Nε-CBZ-L-Lysin Tert-Butyl Ester (3)
Natriumhydrogencarbonat (2.81 g, 33.47 mmol) in Wasser (75 ml) wurde zu H-Lys (CBZ)-O-t-Bu Hydrochlorid (12.00 g, 32.18 mmol) in Chloroform (100 ml) zugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Minuten unter einer N₂-Atmosphäre gerührt. Di-tert-butyl dicarbonat (7.02 g, 32.18 mmol) in Chloroform (50 ml) wurde hinzugefügt; und das Gemisch wurde für 1,5 Stunden refluxiert und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Phasen wurden getrennt, die wässrige Phase wurde mit Chloroform (3 × 100 ml) extrahiert, und die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Konzentrierung in Vakuo befolgt von einer Blitzchromatographie (3:1 hexan:ethyl acetat) ergab (3) (13.82 g, 98 %) als ein farbloses Öl. ¹H NMR (CDCI₃) δ 7.30 (s, 5H), 5.10 (s, 2H) 4.82, (m, 1H), 4.18 (m, 1H), 3.20 (m, 2H), 1.90-1.30 (m, 6H), 1.48 (s, 9H), 1.46 (s, 9H); ¹³C NMR (CD₃OD) δ 173.8, 158.8, 158.1, 138.4, 129.4, 128.9, 128.7, 82.5, 80.4, 67.3, 55.7, 41.4, 32.4, 30.4, 28.7, 28.3, 24.0. HRMS m/z errechnet für C₂₃H₃₇N₂O₆ 437.2652, gefunden 437.2643. Anal. errechnet für C₂₃H₃₆N₂O₆: C 63.28, H 8.31, N 6.42. Gefunden: C 63.13; H 8.28, N 6.47. [α]²⁷ _D+5,0° (c=2.00, CHCl₃).
Beispiel 2. Nα-BOC-L-LYSINE TERT-BUTYL ESTER HYDROCHLORID (4)
Nα-BOC-Nε-CBZ-L-Lysin Tert-butyl ester (3) (34.51 g, 79.15 mmol) wurde in einem Gemisch von 300 ml absoluten EtOH und 1 N HCl (88 ml) gemischt. Vor der Einspeisung von H₂ gas wurde 10 % Pd-C (2.95 g) hinzugefügt. Nach 7 Stunden wurde zusätzlicher Katalysator (1.0 g) hinzugefügt. Nach 5 Stunden wurde die schwarze Suspension durch ein Celitebett gefiltert, und mit EtOH gewaschen. Das Filtrat wurde aufkonzentriert, und der Rückstand unter hohem Vakuum getrocknet, wodurch Nα-BOC-L-lysin tert-butyl ester als dessen Hydrochloridsalz (4) erhalten wurde (26.59 g, 99 %) ¹H NMR (CD₃OD) δ 3.95 (dd, 1H, J = 8.8, 5.0), 2.93 (t, 2H, J = 7.7), 1.84-1.60 (m, 6H), 1.45 (s, 9H), 1.43 (s, 9H); ¹³C NMR (CD₃OD) δ 173.5, 158.2, 82.7, 80.5, 79.5, 55.5, 40.6, 32.1, 28.7, 28.3, 23.9. HRMS m/z errechnet für C₁₅H₃₁N₂O₄ 303.2284, gefunden 303.2272. [α]²⁶ _D-10.1° (c = 1.00, CH₃OH).
Beispiel 3. 3-Cyanopropanal (5)
Ein Gemisch aus Wasser (50 ml) und 3-Cyanopropionaldehyd diethyl acetal (10.0 g, 63.6 mmol) wurde 4 Stunden unter einer N₂-Atmosphäre refluxiert, und dann bei Umgebungsdruck destilliert, um Wasser und Ethanol zu entfernen. Die für den Reflux und die anfängliche Destillierung verwendete Glasware wurde unmittelbar vor der Verwendung säuregewaschen, indem sie in 3 N HCl für 15 Minuten eingetaucht wurde und dann 2 Mal mit Wasser gespült wurde. Das verbleibende Öl wurde in eine trockene, Kurzweg-Destillationsvorrichtung überführt und unter reduziertem Druck destilliert, wodurch 5 erhalten wurden (4.15 g, 78 %): bp 80-82°C (1.3 mm Hg). 1H NMR (CDCl3) 2.63 (t, 2H, J = 7.05), 2.91 (t, 2H, J = 7.05), 9.80 (s, 1H).
Beispiel 4. (2S)-11-Amino-2-[(Tert-butoxycarbonyl)amino]-7-azaundecansäure tert-butyl ester, diacetat salz (7)
Eine Lösung von 4 (1.00 g, 2.95) in Chloroform (30 ml) wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (2 × 30 ml) extrahiert, und dann mit Wasser (30 ml). Die organische Phase wurde getrocknet, evaporiert, und über Nacht in vacuo getrocknet, wodurch das freie Amin von 4 (749 mg, 84 %) erhalten wurde. Dieses Öl wurde evaporiert und über Nacht in vacuo getrocknet, wodurch das freie Amin von 3 (749 mg, 84 %) erhalten wurde. Das Öl wurde in Benzol (100 ml) enthaltend 5 (230.5 mg, 2.77 mmol) gelöst und aktivierte 3A Molekularsiebe (20.30 g). Die Reaktion wurde unter Argon für 4,5 h gerührt, wodurch das Immin von 6 erhalten wurde. Die Lösung wurde gefiltert und in vacuo konzentriert. Unter Argon wurde trockenes THF (100 ml) und PtO₂ (150 mg) hinzugefügt; und dies wurde unter H₂-Gas 17 Stunden gerührt. Die schwarze Suspension wurde durch Celite filtriert, wodurch 6 erhalten wurde. Das Filtrat wurde aufkonzentriert und der Rückstand wurde unmittelbar in Eisessig (25 ml) gelöst. Unter Argon wurde PtO₂ (152 mg) und 10 % Pd-C-Katalysator hinzugeführt; die Suspension wurde unter H₂-Gas für 23 Stunden gerührt, durch Celite filtriert und mit Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wurde in vacuo konzentriert. Die azeotrope Entfernung der Essigsäure mit Toluol ergab 7 als farbloses Öl (650 mg, 53 % errechnet aus den freien Aminen): ¹H NMR (D₂O) δ 1.20-2.00 (m, 10H), 1.40 (s, 9H), 1.47 (s, 9H), 1.97 (s, 6H), 2.97-3.13 (m, 6H), 3.97 (dd, 1H, J = 9.0, 5.5).
Beispiel 5. (2S)-11-[(Benzyloxycarbonyl)amino]-2-[(Tertbutoxvcarbonyl)amino]-7-(Carbobenzyloxy)-7-azaundecansäure tert-butyl ester (8)
7 (556 mh, 1.13 mmol) wurde unter Argon in H2O (15 ml) und Diethylether (30 ml) gelöst. Das biphasische Gemisch wurde gerührt und auf 0°C gekühlt, bei welcher Temperatur KHCO3 (1.19 g, 11.9 mmol) hinzugefügt wurde. CBZ-ONSu (660.0 mg, 2.648 mmol) wurde in fünf Portionen über 20 Minuten zugefügt. Die Lösung wurde stehen gelassen, bis sie Raumtemperatur erreichte und für 21 Stunden gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase wurde mit Ether gewaschen, und die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet. Die auf Konzentration und Reinigung über Blitzchromatographie (2:1 Hexan/ethylacetat) ergab 8 (271 mg, 37 %) als farbloses Öl: ¹H NMR δ 1.20-1.80 (m, 10H), 1.43 (s, 9H), 1.44 (s, 9H), 3.09 (m, 2H), 3.18-3.32 (m, 4H), 3.91 (m, 1H), 5.06 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 7.26-7.37 (m, 10H); ¹³C NMR (CDCI3) δ 22.4, 25.4, 25.8, 27.2, 28.0, 28.3, 32.5, 40.7, 46.5, 47.0, 53.8, 66.6, 66.9, 79.6, 81.7, 127.9, 128.0, 128.5, 136.9, 155.4, 156.1, 156.4, 171.9; HRMS m/z errechnet für C₃₅H₅₂N₃O₈ 642.3754, gefunden 642.3746. [α]²³ _D = -9.3° (c 1.01, CH₃OH).
Beispiel 6. 2(S)-Amino-11-[(Benzylsoxycarbonyl)amino]7-(Carbobenzyloxy)-7-azaundecansäure(9)
8 (271 mg, 0.422 mmoL) wurde unter Argon zu einem Gemisch aus Trifluoressigsäure (770 mg, 6.7 mmol), CH2Cl2 (3.0 ml) und Triethylsilan (330 mg, 2.8 mmol) hinzugefügt; dieses wurde bei Raumtemperatur für 23 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auch konzentriert; das resultierende Öl wurde in Wasser gelöst (5.0 ml) und mit gesättigter NaHCo3-Lösung auf pH 7 eingestellt. Diese Lösung wurde aufkonzentriert; der Rückstand wurde über Chromatographie an einer C-18-Säule (30 % Azeton/Wasser gefolgt von 55 % Azeton/Wasser) gereinigt, wodurch 9 (137 mg, 67 %) als ein farbloses Öl erhalten wurde: ¹H NMR (19.7°C) δ 1.30-1.66 (m, 8H), 1.78 (m, 2H), 3.09 (m, 2 H), 3.20-3.33 (m, 4H), 3.45 (m, 1H), 5.05 (s, 2H), 5.09 (s, 2H), 7.26-7.37 (m, 10H); HRMS m/z errechnet für C₂₆H₃₆N₃O₆ 486.2604, gefunden 486.2614.
Beispiel 7. 11-[(Benzyloxycarbonyl)amino]-7-(carbobenzyloxy)-2(S)-[9-Fluorenyl-methoxycarbonyl)amino]-7-azaundecansäure (10)
Eine Lösung 9-Fluroenylmethyl N-Succinimidylcarbonat (143 mg, 0.42 mmol) in DMF (1.60 ml) wurde zu einer Lösung von 9 (135 mg, 0.278 mmol) in 9 % Na2CO3 (655.9 mg, 0.557 mmol) bei 0°C hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 21 Stunden unter AR gerührt. Der pH wurde mit 0.1 N HCl auf 7.0 eingestellt. Das Gemisch wurde als ein Öl aufkonzentriert und über Blitzchromatographie (CHCl3, dann 95 % CHCl3/MeOH) gereinigt, wodurch 10 (115 mg, 58 %) als ein farbloses Öl erhalten wurde: ¹H NMR (19.2°C) δ 1.22-1.92 (m, 10H), 3.08 (m, 2 H), 3.16-3.30 (m, 4H), 4.12 (m, 1H), 4.21 (t, 1H, J = 6.9), 4.30-4.45 (m, 2H), 5.04 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 7.22-7.42 (m, 14H), 7.66 (m, 2H), 7.78 (d, 2H, J = 7.5); HRMS m/z errechnet Ca₄₁H₄₆N₃O₈ 708.3285, gefunden 708.3284. [α]²² _D = +9.3° (c 1.00, CHCl₃).
Beispiel 8. (S)-Deoxyhypusin dihydrochlorid (11)
Phenol (270 mg), Pentamethylbenzol (250 mg) und Ester 10 (53 mg, 75 μmol) wurden in Trifluoressigsäure (5 ml) bei 0°C unter Argon gelöst. Unter starkem Rühren wurde Trüsopropylsilan (200 μl) und 30 % HBR/Essigsäure hinzugefügt, und die Lösung wurde 5 Minuten gerührt, bevor sie auf Raumtemperatur erwärmt wurde und dann für zusätzlich 55 Minuten gerührt. Das Rohprodukt wurde durch Blitzchromatographie gereinigt [1:2:1 CH₂Cl₂/MeOH/NH₃(aq)], Kieselgel 60, auskonzentriert, gelöst in 1 ml H₂O und auf pH = 4.5 mit 0.1 N HCl eingestellt. Die Aufkonzentrierung und die Rekristallisierung aus 1:9:15 H₂O/MeOH/Et₂O ergab 11 als das Dihydrochloridsalz (6.6 mg, 30 %): ¹H NMR (D₂O) δ 1.53 (m, 2 H), 1.76 (m, 6H), 1.97 (m, 2H), 3.01-3.15 (m, 6H), 3.98 (t, 1H, J = 6.3). HRMS m/z errechnet für C₁₀H₂₄N₃O₂ 218.1868, gefunden 218.1900. [α]²¹ _D = +17.0° (c 0.44, 6 N HCl).
Beispiel 9. Verbindung 12
Die Synthese des polymergebundenen, geschützten Peptides 12 wurde auf einem Applied Biosystems 432A-Synthesizer mit einem 2-Chlorotritylharz bei Raumtemperatur durchgeführt. Geignet geschützte Aminosäuren und das Deoxyhypusinreagenz 10 wurden verwendet.
Beispiel 10. Cys-Thr-Gly-Deoxyhypusin-His-Gly 813)
Das polymergebundene Peptid 12 (87.4 mg), Phenol (250 mg) und Pentamethylbenzol (2.50 mg) wurden in entgastem TFA (5.0 ml) bei 0°C gelöst. Trüsopropylsilan (100 μl), 1,2-ethandithiol (100 μl), und gesättigtes HBr in CH₃COOH-Lösung (200 μl) wurden unter einer Ar-Atmosphäre hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und dann unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 10 % CH₃COOH (10 ml) gelöst und mit Methyl tert-butyl ether (3 × 25 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wurde in vacuo aufkonzentriert, und der Rückstand wurde über eine präparative HPLC (Lösungssysteme A, wässrige TFA 0.1 %; und B, 0.1 % TFA in CH₃CN; einen linearen Gradienten von 0–20 % B in 85 Minuten; Flussrate 12 ml/Min; Detektion bei 214 nm; Retentionszeit = 13.7 Min) unter Verwendung einer C-18 Reverse phase Säule (Vydac Protein & Peptide C-18) gereinigt, wodurch 13 als ein farbloses Öl (8.0 mg, 28 %, errechnet als Tetrakistrifluoroacetatsalz) erhalten wurde: 1H NMR (600MHz, 6.0 °C) δ 1.26 (d, 3H, J = 6.2), 1.38 (m, 2H), 1.63-1.81 (m, 8H), 2.98-3.11 (m, 7H), 3.15 (dd, 1H, J = 14.9, 5.6), 3.19 (dd, H, J = 15.4, 8.1), 3.31 (dd, 1H, J = 15.4; 6.2), 3.94-4.06 (m, 4 H), 4.23 (m, 1H), 4.30 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.42 (d, 1H, J = 4.8), 4.77 (m, 1 H), 7.32 8s, IH), 8.64 (s, 1H). AA-Analyse: Thr 0.65, Gly 2.34, His 1.02.
Sequenzprotokoll:

Claims

Verfahren zur Synthese eines Deoxyhypusin Derivats mit der Formel:
worin: Q₁ und Q₂ gleich oder verschieden sein können und Aminoschutzgruppen sind, und Q₃ eine Aminoschutzgruppe ist, die orthogonal zu Q₁ und Q₂ ist, bei welchem Verfahren man: a. einen Ester des N_ε-, N_α-zweifachgeschützten Lysins bereitstellt, wobei der Ester die Formel hat:
worin Prot und Prot' wechselseitige orthogonale Aminoschutzgruppen sind und R der Rest eines veresternden Alkohols ist, welcher orthogonal bezüglich Prot und Prot' ist, b. Prot von N_ε aus (a) entfernt und das Produkt zu einer Verbindung der Formel umwandelt:
c. (b) mit 3-Cyanopropanal kondensiert und das intermediäre Imin zu einem Cyanid der Formel reduziert:
d. (c) zur Herstellung eines Triamins der Formel reduziert:
e. die freien Aminogruppen von (d) zur Herstellung eines Esters der Formel schützt:
f. R und Prot' von (e) zur Herstellung einer Verbindung der Formel entfernt:
g. und die freie Aminogruppe zur Herstellung des Deoxyhypusin Derivats (1) acyliert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ester (a) bereitsgestellt wird in dem man das N_ε , N_α-zweifachgeschützte L-Lysin verestert, wobei Prot Carbobenzyloxy ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Prot'BOC ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R t-Butyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Prot von (a) durch Hydrierung entfernt wird um (b) zu ergeben.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrierung in Gegenwart von PtO₂ bewirkt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die CN-Gruppe von (c) durch katalytische Hydrierung zu einer Amiogruppe umgewandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrierung in Gegenwart einer Mischung aus Palladium-C und PtO₂ durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die freien Aminogruppen von (d) mit einem reaktiven Carbobenzyloxycarbonsäure Derivat acyliert werden um (e) herzustellen, worin Q₁ und Q₂ jeweils Carbobenzyloxygruppen sind.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das reaktive Carbobenzyloxycarbonsäure Derivat N-(Benzylcarbonyloxy) succinimid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet das R und Prot' durch Umsetzung mit Trifluoressigsäure entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion mit Trifluoressigsäure in Gegenwart von Triethysilan durchgeführt wird.
Verfahren Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die freie Aminogruppe von (f) mit 9-Fluorenylmethyl-N-Succinimidylcarbonat acyliert wird zur Herstellung eines Hypusinreagenz worin Q₃ Fluorenylmethoxycarbonyl ist.
Ein Peptid der Formel L-Cys-L-Thr-Gly-Deoxyhypusin-L-His-Gly (SEQ ID No:4).