DE69921241T2

DE69921241T2 - Metall-immobilisierte Affinitätsharze

Info

Publication number: DE69921241T2
Application number: DE69921241T
Authority: DE
Inventors: Minh Tran Quang
Original assignee: AFFILAND; AFFILAND ANS
Current assignee: AFFILAND; AFFILAND ANS
Priority date: 1998-07-13
Filing date: 1999-07-12
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-07-13
Also published as: EP0972566A3; ATE279979T1; US6441146B1; CA2277372C; CA2277372A1; EP0972566B1; EP0972566A2; DE69921241D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Metallchelatbildnerharze und ihr Herstellungsverfahren.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Metallchelat-Affinitätschromatographie (MCAC) (auch als immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) bekannt), die mit durch Porath et al. (Nature, 258,589 (1975)) eingeführten, affinitätsimmobilisierten Metallharzen arbeitet und für die Reinigung von Proteinen verwendet wird, die benachbarte Histidinreste enthalten, ist heute zu einem starken und vielseitigen Werkzeug für das Reinigen natürlicher und rekombinanter 6x-His-markierter (oder nichtmarkierter) Proteine und Peptide geworden.
Bei dem von diesen Autoren verwendeten Liganden hat es sich um Iminodiessigsäure (IDE) gehandelt. Studien der paramagnetischen Elektronenresonanz- und Absorptionsspektren haben gezeigt, dass die IDE ein dreizähniger Ligand ist und die Konfiguration des Komplexes IDE-M²⁺ (1:1) mit M²⁺ = zweiwertige Metallionen eine quadratische oder tetraedrische ist (R. Dallocchio et al.; J. Coord. Chem., 25, 265 (1992)). Das erklärt, warum die immobilisierte IDE einen stabilen Komplex mit dem Cu²⁺- und Zn²⁺-Ion, jedoch nicht mit anderen Schwermetallionen bilden kann, die für eine beständige Form eine oktaedrische Konfiguration erforderlich machen.
Es ist auch bekannt, dass Histidin die einzige α-Aminosäure ist, die dazu fähig ist, mit verschiedenen mehrwertigen Metallionen wie folgt oktaedrische Komplexe zu bilden: His -M²⁺-His (B. Rao et al.; J. Inorg. Nucl. Chem.; 33, 809 (1971); M.M. Harding et al.; Acta Cryst., 16, 643 (1963):

– jedes Histidin ergibt 3 Koordinationsbindungen an das M²⁺, d.h. die 3-N-Gruppe des Imidazolrings und die NH₂- und COOH-Gruppen der Aminosäure; die 1-NH Gruppe des Imidazolrings nimmt an der Bildung der Komplexe nicht teil (C.C. Mc Donald et al.; JACS, 85 3736 (1963)).
– Die Komplexbildung ist stereoselektiv (J.H. Ritsma et al.; Recueil, 88, 411 (1969)).
– Die Komplexchemie von Histamin und Imidazol ist schon beschrieben worden (W.R. Walker et al.; J. Coord. Chem., 3, 77 (1973); Aust. J. Chem., 23, 1973 (1970)).

Des Weiteren haben Einkristall-Röntgenstrahlenanalyse(Simon H. Whitlow; Inorg. Chem., 12, 2286 (1973)) und Infrarotspektralstudien (J. Tomita et al.; JACS, 36, 1069 (1963) und J. Phys. Chem., 69, 404 (1965)) gezeigt, dass Trinatriumnitrilotriacetat (Na₃NTA) ein dreizähniger Ligand für verschiedene mehrwertige M²⁺-Metallionen ist und die entsprechenden NTA-M²⁺-Komplexe eine oktaedrische Konfiguration aufweisen:

– bei einem pH-Wert von 5,5 – 10,0, kann NTA eine Mischung von HN⁺(CH₂-COO^-)₃ und N(CH₂-COO^-)₃ sein.
– Nur das Carboxylat und nicht geladene N-Gruppen nehmen an der Koordinationsbindung teil. Die Carboxyl- und geladenen N-Gruppen nehmen an derartigen Verknüpfungen nicht teil.

Die auf Agarose immobilisierten NTA-Derivate, die von E. Hochuli et al. (J. Chromatogr., 411, 177 (1987)) und der US-Patentschrift 4,877,830 (1989) eingeführt worden sind, können daher ein interessantes Verfahren für die Reinigung von Histidin enthaltenden Proteinen darstellen. Ihre Liganden sind H₂N-(CH₂)_n-CH(COOH)-N(CH₂-COOH)₂ (n = 2.4) und die dabei entstehenden Harze sind: Harz-NH-(CH₂)_n-CH(COOH)-N(CH₂-COOH)₂(n = 2.4)
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist daraufhin ausgerichtet, neue Chelatbildnerharze mit verbesserten charakteristischen Eigenschaften im Vergleich mit den Verbindungen des Stands der Technik bereitzustellen, die für die Metallchelat-Affinitätschromatographie geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Verfahren für die Zubereitung derartiger Harze.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein einfaches, schnelles und billiges Herstellungsverfahren für neuartige Harze für die IMAC und im Folgenden Pentadentat-Chelatbildner-(PDC)Harze genannte Harze, die den M²⁺-Ionen auf vorteilhafte Weise 5 Koordinationsbindungen bieten. Die Koordinationsbindungen können zu einer verbesserten Stabilität der erhaltenen oktaedrischen Komplexe führen und eine Koordinationsstelle ist für die Wechselwirkung mit und selektive Bindung an zugängliche Cystein-/Histidin-Reste und hauptsächlich Histidin enthaltende Biomoleküle, die bevorzugt aus der aus Proteinen oder Peptiden bestehenden Gruppe ausgewählt werden, frei.
Des Weiteren sind die PDC-Harze in der Lage, mit verschiedenen mehrwertigen Metallionen, einschließlich Cu²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺ und Co²⁺ eine Chelatbildung einzugehen unter Bildung der entsprechenden Metallchelatharze, die im Folgenden Cu-PDC, Ni-PDC, Zn-PDC bzw. Co-PDC genannt werden. Diese vier Harze werden im Folgenden für das Reinigen von Histidin enthaltenden natürlichen und rekombinanten Proteinen oder Peptiden verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die PDC-Harze, bei denen die Proteine nicht in die Poren des Harzes eindringen können (die Molekulargewichte von Proteinen sind definitionsmäßig höher als 5000 Dalton). Bevorzugt handelt es sich bei dem Harz um PDC-Sephadex^® G-25 (das von Sephadex^® G-25, Pharmacia, Uppsala, Schweden, erhalten worden ist).
Außerdem hängt das Binden von Histidin enthaltenden Proteinen an die chelatisierten Metalle von dem Metall-PDC-Harz-Komplex und der Zugänglichkeit von Histidinresten ab, die wiederum von der Konfiguration der Proteine, die von Interesse sind, abhängt. Aus diesem Grund gibt es keine Universalregel zum Voraussagen der Größenordnung der Bindung Histidin enthaltender Biomoleküle an Cu²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺ und Co²⁺.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein PDC-Kit bestehend aus vier einzelnen Säulen, d.h. Cu-PDC, Ni-PDC, Zn-PDC und Co-PDC, die das passendste Metallchelatharz bestimmen, das für das Reinigen natürlicher und rekombinanter Biomoleküle geeignet ist, die bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen oder Peptiden ausgewählt werden.
Die erfindungsgemäßen Cu-PDC-Harze werden als Universalträger für das kovalente Immobilisieren von Proteinen unter Anwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids und auch als Konzentrationsharze zum Reduzieren des Volumens einer Proteinlösung verwendet.
Eine letzte Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Pentadentat-Chelatbildner-(PDC-) Harze und insbesondere des erfindungsgemäßen PDC-Sephadex^® G-25, zum Erzielen von Wasser und Puffern, die frei von mehrwertigen Metallionen sind. Insbesondere ist das erfindungsgemäße PDC-Sephadex^® G-25 für die Zubereitung von „Metalloproteinen", die frei von Schwermetallionen sind, oder Proteinen, die frei von Schwermetallionen sind, auf die Schritte der immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie hin nützlich.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie von Y. Tomita et al. (JACS, 36, S. 1069 (1963) und J. Phys. Chem., 690, 404 (1965)) erwähnt, sind das NTA (Nitrilotriacetat) und möglicherweise die immobilisierten NTA-Derivate bei einem physiologischen pH-Wert die Mischung von dreizähnigen und vierzähnigen Liganden für die M²⁺-Metallionen. Die Konzentration an oktaedrischen NTA-M²⁺-Komplexen kann deshalb bei einem physiologischen pH-Wert viel geringer sein als diejenige des gesamten NTA.
Die erfindungsgemäßen Pentadentat-Chelatbildner-(PDC)Harze, insbesondere folgender Formel, sind die ideale Lösung dieses Problems : Harz-N(CH₂-COOH)-(CH₂)₄-CH(COOH -N(CH₂-COOH)₂. Bei einem physiologischen pH-Wert sind die Harze eine Mischung von dreizähnigen und fünfzähnigen Liganden für die M²⁺-Metallionen. Die Konzentration an oktaedrischen PDC-M²⁺-Komplexen sowie ihre entsprechende Aufnahmefähigkeit für Histidin enthaltende Proteine sind daher optimal.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Verfahren für die Herstellung einer Verbindung der Formel: Harz-ω-N-Lysin, das durch die Reaktion zwischen Bis-Lysin-M²⁺, insbesondere dem Bis-Lysin-Cu²⁺- und einem aktivierten Harz der Formel: Harz-O-CH₂-Ethylenepoxid oder irgendeiner anderen aktivierten Matrix, die in der Lage ist, mit -NH₂ enthaltenden organischen Verbindungen zu reagieren, synthetisiert wird. Bevorzugt kann es sich bei der bei dem im obigen Verfahren verwendeten Trägermatrix um irgendwelche funktionalisierten oder aktivierten Harze handeln, die bei der Herstellung von Affinitätsharzen verwendet werden, bevorzugt einem Harz, das aus der aus Sepharose^® CL-4B-, CL-6B-, Fast Flow- und Sephadex^® G-25-Harzen (Pharmacia, Uppsala, Schweden), Cellulose und/oder Baumwolle bestehende Gruppen ausgewählt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Reaktionsverfahren für das Harz-ω-N-Lysin mit einem Überschuss an Halogenessigsäure, bevorzugt Bromessigsäure, in einem basischen Medium, das die Bildung des erfindungsgemäßen fünfzähnigen Harzes: Harz-ω-N-Lysin + Br-CH₂-COOH in basischem Medium → Harz-N(CH₂-COOH)-(CH₂)₄-CH(COOH)-N(CH₂-COOH)₂ erlaubt.
Die vorliegende Erfindung wird nun in weiteren Einzelheiten mit Bezug auf die eingeschlossenen, nicht einschränkenden Beispiele beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1
75 g Lysinmonochlorhydrat wurden in einer Lösung von 33 g Natriumhydroxid und 330 ml destilliertem Wasser gelöst. Dieser Lösung wurde eine Lösung von 51,6 g CuSO₄ in 150 ml destilliertem Wasser (bis zum völligen Auflösen bei 30 °C erhitzt) zugegeben. Der entsprechende Komplex wurde ohne Reinigung für die folgenden Arbeiten verwendet (jedoch könnte eine Reinigung durch Zusetzen von Ethanol bis zur Bildung einer nicht mischbaren Phase durchgeführt werden.
Beispiel 2
300 ml Sepharose^® CL-4B, die reichlich mit destilliertem Wasser gewaschen worden waren, wurden mit 195 ml 2M NaOH, in 450 ml destilliertem Wasser und 75 ml Epichlorhydrin verdünnt, 2 Stunden bei 40 °C aktiviert. Das entsprechende aktivierte Harz wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, bis ein neutraler pH-Wert erreicht wurde. Diesem aktivierten Harz wurden 150 ml 2M NaOH und die in Beispiel 1 zubereitete Lösung zugegeben. Die Mischung wurde bei 40 °C 3 Stunden und daraufhin bei 50 °C über Nacht leicht gerührt.
Das dabei entstehende Harz wurde reichlich mit destilliertem Wasser, bis der pH-Wert des Abwassers 7,0 erreichte, dann reichlich mit wässriger verdünnter Säurelösung und schließlich mit einem Überschuss an destilliertem Wasser bis zur vollständigen Entfärbung des Harzes, gewaschen. Dieses Harz war ausreichend rein für die folgenden Arbeiten.
Beispiel 3
Zu 300 ml des in Beispiel 2 zubereiteten Harzes wurden 405 ml 2M NaOH und eine Lösung von 75 g Bromessigsäure und 270 ml 2M NaOH zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden bei 4 °C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde reichlich mit destilliertem Wasser, bis der pH-Wert des Abwassers 7,0 erreichte, gewaschen und dann in 0,5M NaCl in Gegenwart von 0,02 (Gew.-/Vol.)-% NaN₃ gelagert.
Beispiel 4
Einer Lösung von 10 g MCl₂ oder MSO₄ (M = Cu oder Zn oder Ni oder Co) in 800 ml destilliertem Wasser wurden 300 ml des in Beispiel 3 zubereiteten Harzes zugegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten vorsichtig gerührt. Das chelatisierte Metallharz wurde abfiltriert, 3-mal mit 500 ml destilliertem Wasser, 3-mal mit 500 ml 0,1M NaH₂PO₄, pH 4, 0, 3-mal mit 500 ml 0, 1M NaH₂PO₄, pH 8, 0 und schließlich einmal mit 500 ml 0,1M NaH₂PO₄, pH 7,5, gewaschen. Das Harz wurde in 0,1M NaH₂PO₄, pH 7,5 in Gegenwart von 0,05 (Gew.-/Vol.-)% NaN₃ gelagert. Die so erhaltenen Harze wurden Cu-PDC, Ni-PDC, Zn-PDC bzw. Co-PDC genannt.
Beispiel 5
Vier Harze, d.h. Cu-PDC, Ni-PDC, Zn-PDC und Co-PDC, die in Beispiel 4 erhalten wurden, wurden einzeln in vier kleine Polyethylensäulen eingefüllt, bis in jeder 1 ml Harz erreicht worden war. Der Satz dieser vier Säulen wurde PDC-Kit genannt. In den folgenden Beispielen 6, 7, 8, 9, 10 wurde die Reinigung der Proteine, die von Interesse sind, unter Zuhilfenahme des PDC-Kits wie folgt erreicht:

– Jede Säule wurde mit 2 ml der mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS) 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 7,5; 0,1 (Gew.-/Vol.-)% NaN₃ äquilibriert (Puffer A).
– Das rohe geklärte Lysat, das das Protein, das von Interesse, in Puffer A enthielt, wurde in jede Säule wie für jeden Fall angegeben, eingefüllt.
– Jede Säule wurde dann dreimal mit 2 ml Puffer A, dreimal mit 2 ml Puffer B (Puffer A + 4M Harnstoff, pH 7, 5), dreimal mit 2 ml Puffer C (Puffer A + 8M Harnstoff pH 7,5), einmal mit 2 ml Puffer D (Puffer A auf pH 6,0 eingestellt) und schließlich einmal mit 2 ml Puffer A gewaschen.
– Jede Säule wurde dreimal mit 2 ml Puffer E (Puffer A + 100 mM Imidazol, pH 7,5) und dreimal mit 2 ml Puffer F (Puffer A + 200 mM Imidazol, pH 7,5) eluiert.
– Die aus jedem Reinigungsschritt erhaltenen Fraktionen wurden mit Hilfe des geeignetsten Systems, z.B. O.D. bei 280 nm, Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelectrophorese (SDS-PAGE) usw. untersucht.

Beispiel 6: Reinigung von Proteinen unter Zuhilfenahme des PDC-Kits (wie in Beispiel 5 beschrieben)

– Das rohe geklärte Lysat von 6x-His-markiertem HSP 60 (Hitzeschockprotein) von Helicobacter pylori, in E. coli exprimiert (Konzentration von HSP60: ca. 5 mg/ml)
– Probevolumen, das in jede der Säulen des PDC-Kits eingefüllt wurde: 500 Mikroliter (vergleiche Figuren).

Beispiel 7: Reinigung von Proteinen unter Zuhilfenahme des PDC-Kits (wie in Beispiel 5 beschrieben)

– Das rohe geklärte Lysat von 6x-His-markierter Urease von Helicobacter pylori, in E. coli exprimiert (Konzentration der Urease: ca. 1 mg/ml)
– Probevolumen, das in jede der Säulen des PDC-Kits eingefüllt wurde: 2 ml.

Ergebnisse:
Ni-PDC kann zum Reinigen der nativen Urease und Zn-PDC zum Erhalten der α-Kette (MG 60.000 Dalton) und der β-Kette (MG 30.000 Dalton) von Urease verwendet werden, was durch SDS-PAGE klar bewiesen wird.
Beispiel 8: Reinigung von Proteinen unter Zuhilfenahme des PDC-Kits (wie in Beispiel 5 beschrieben)

– Das rohe geklärte Lysat von 6x-His-markiertem Penicillin-Bindungsprotein 5 (MG = 70.000 Dalton) aus E. coli (Konzentration des Penicillin bindenden Proteins 5: ca. 0,1 mg/ml)
– Probevolumen, das in jede Säule des PDC-Kits eingefüllt wurde: 2 ml.

Ergebnisse:
Ni-PDC ist das Beste für diese Reinigung, wie durch SDS-PAGE klar bewiesen worden ist.
Beispiel 9: Reinigung von Proteinen unter Zuhilfenahme des PDC-Kits (wie in Beispiel 5 beschrieben)

– Der rohe Extrakt (erneut gelöster Ammoniumsulfatniederschlag), der eine mesophile alkalische Protease MG 50.000 Dalton (Zinkprotein) aus Pseudomonas aeruginosa IFO (Institute of fermentation of Osaka) 3455 (Konzentration alkalischer Protease: ca. 1 mg/ml) enthielt.
– Probevolumen, das in jede Säule des PDC-Kits eingefüllt wurde: 1 ml (vergleiche Figuren).

Beispiel 10: Reinigung von Proteinen unter Zuhilfenahme des PDC-Kits (wie in Beispiel 5 beschrieben)
Probevolumen, das in die Säule eingefüllt wurde: 10 ml rohes geklärtes Lysat mutierter Triosephosphatisomerase aus E. coli, die 8 Histidinreste (5 zugängliche) enthielt.
Ergebnisse:
Die Ni-PDC erlaubte die Reinigung von mutierter Triosephosphatisomerase in einem einzigen Schritt unter Gewinnung von 15 mg Protein/ml Nassgel, wie durch SDS-PAGE klar bewiesen.
Beispiel 11
Eine Lösung von 10 mg menschlichem Thyroxin-Bindungsglobulin (TBG), das in 50 ml Puffer A (vergleiche Beispiel 5) gelöst worden war, wurde in die 1 ml Cu-PDC-Säule gefüllt. Die optische Dichte bei 280 nm des Durchflusses zeigte, dass das gesamte TBG in der Säule zurückgehalten wurde. Die Gewinnung des mit 2 ml Puffer E (vergleiche Beispiel 5) eluierten TBGs ergab ca. 95 % (9,5 mg). Seine durch RIA (Radioimmunassay) bestimmte Aktivität erwies sich als unbeeinflusst.
Beispiel 12
20 mg Rinderserumalbumin (RSA), das in 5 ml Puffer A (vergleiche Beispiel 5) gelöst worden war, wurden 15 Minuten mit 1 ml Cu-PDC-Harz gemischt, das mit dem gleichen Puffer voräquilibriert worden war. Die Suspension wurde abfiltriert, jeweils mit 5 ml Puffer A, der auf pH 8,0 eingestellt worden ware, 5 ml Puffer A, der auf pH 4,0 eingestellt worden war und mit 5 ml Puffer, der auf pH 5,5 eingestellt worden war, gewaschen.
Die optische Dichte, bei 280 nm, der Filtrate aus jedem Waschschritt zeigten, dass fast die Gesamtheit des RSA vom Cu-PDC zurückgehalten wurde.
Eine Lösung von 10 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, die in 1 ml destilliertem Wasser gelöst worden war, wurde der Suspension von 1 ml des RSA-Cu-PDC-Harz-Komplexes zugegeben, der vorher in 4 ml Puffer A, pH 5,5, erhalten worden war. Die Mischung wurde über Nacht bei 4 °C leicht geschüttelt.
Das Harz wurde abfiltriert, reichlich mit Puffer A gewaschen. Die Cu²⁺-Ionen wurden von dem Harz mit 0,1 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), pH 7,4, ausgetrieben. Das Harz wurde dann mit 25 ml Puffer A, der auf pH 4,0 eingestellt worden war, 25 ml Puffer A, der auf pH 8,0 eingestellt worden war, gewaschen und in Puffer A, pH 7,5, gelagert.
Die Gewinnung eines derartigen kovalenten immobilisierten Produkts, d.h. RSA-PDC, war quantitativ.
Beispiel 13
100 ml von 1 g Rinderserumalbumin (RSA) in Puffer A (vergleiche Beispiel 5), das 5 mg CuCl₂, 5 mg Ni₂SO₄, 5 mg ZnCl₂, 5 mg CoCl₂ und 1 mg CaCl₂ enthielt, wurden in eine Säule von großem Querschnitt eingefüllt, die 10 ml PDC-Sephadex^® G-25 enthielt. Die so erhaltene Lösung von RSA war frei von mehrwertigen Metallionen.

Claims

Pentadentat-Chelatbildnerharz (PDC-Harz) der Formel: Harz-N(CH₂-COOH)-(CH₂)₄-CH(COOH)-N(CH₂-COOH)₂
PDC-Harz nach Anspruch 1, wobei das Harz Poren aufweist, die das Eindringen von Proteinen mit einem Molekulargewicht von mehr als 5000 Dalton nicht erlauben.
PDC-Harz nach Anspruch 1, wobei das Harz an ein mehrwertiges Metallion koordiniert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺ und Co²⁺.
Pentadentat-Chelatbildner-Kit (PDC-Kit) bestehend aus vier einzelnen Pentadentat-Chelatbildnerharzen, wobei jedes der besagten Harze an ein anderes zweiwertiges Metallion koordiniert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺ und Co²⁺.
Verfahren für das Zubereiten eines Pentadentat-Chelatbildner- (PDC-) Harzes nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Schritte des: a) Reagierens einer Trägermatrix eines Harzes mit einem Metall-Chelatbildner der Formel: Bis-Lysin-Cu²⁺, um eine Verbindung der Formel: Harz-ω-N-Lysin zu bilden, b) Reagierens der besagten Verbindung der Formel Harz-ω-N-Lysin mit einem Überschuss an Halogenessigsäure in einem basischen Medium, um Pentadentat-Chelatbildner- (PDC-) Harz zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Halogenessigsäure Bromessigsäure ist.
Zwischenprodukt der Formel: Harz-ω-N-Lysin.
Verfahren für das Reinigen von natürlichen und/oder rekombinanten Proteinen oder Peptiden, umfassend den Schritt des Kontaktierens der Proteine oder Peptide mit dem Harz nach Anspruch 3 oder dem Pentadentat-Chelatbildner-Kit (PDC-Kit) nach Anspruch 4.
Verfahren zur Erzielung von Schwermetallionen freiem Wasser und/oder freien Puffern, umfassend das Kontaktieren des Schwermetallionen enthaltenden Wassers und/oder der Schwermetallionen enthaltenden Puffer mit dem Harz nach Anspruch 2.
Verfahren für das vollständige Entfernen von Schwermetallionen aus Metalloproteinen und/oder Proteinen, die auf eine immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) hin erhalten worden sind, umfassend das Kontaktieren der Metalloproteine und/oder Proteine mit dem Harz nach Anspruch 2.
Verfahren für eine kovalente Immobilisierung eines Proteins, umfassend: a) das Kontaktieren des Proteins mit dem Harz nach Anspruch 3, wobei das Harz an das zweiwertige Metallion Cu²⁺ koordiniert ist, wobei das besagte Kontaktieren dadurch zur Bildung eines Protein-Pentadentat-Chelatbildner-(PDC-)Cu²⁺-Harzkomplexes führt; b) das Kontaktieren des Komplexes mit einem wasserlöslichen Carbodiimid, um das Protein kovalent an das PDC-Cu²⁺-Harz anzukoppeln und c) das Entfernen des zweiwertigen Metallions Cu²⁺ von dem Komplex mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um ein kovalent angekoppeltes Protein-PDC-Harz zu bilden.
Verfahren für das Reduzieren des Volumens einer Proteinlösung umfassend: a) das Kontaktieren der Proteinlösung mit dem Harz nach Anspruch 3, wobei das Harz an das zweiwertige Metallion Cu²⁺ koordiniert ist, wobei das besagte Kontaktieren dadurch zur Bildung eines Protein-PDC-Cu²⁺-Harzkomplexes führt; b) das Eluieren des Proteins des PDC-Cu²⁺-Harzes mit einer hohen Konzentration an Imidazolpuffer eines pH-Werts von 7,4.