DE69920405T2

DE69920405T2 - Verwendung des heregulins als epithelzellenwachstumsfaktor

Info

Publication number: DE69920405T2
Application number: DE69920405T
Authority: DE
Inventors: Mark Sliwkowski; A. Jeffrey KERN
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Genentech Inc
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Genentech Inc
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-02-03
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2019-02-04
Also published as: ES2329467T3; DK1510579T3; EP1053009A2; ATE276756T1; EP1510579A3; CA2318857C; WO1999039729A3; DE69920405D1; DE69941228D1; WO1999039729A2; JP4485051B2; EP1510579B1; AU2581599A; US20020042087A1; ES2229679T3; EP1510579A2; EP1053009B1; JP2002509076A; ATE438720T1; CA2318857A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von HER2-, HER3- und/oder HER4-Liganden, insbesondere Heregulin-Polypeptiden, als Epithelzellen-Wachstumsfaktoren.
Beschreibung des Hintergrunds und der verwandten Gebiete
Die HER- (ErbB-) Familie gehört zur Unterklasse I der Rezeptor-Tyrosinkinase-Überfamilie und besteht aus drei unterschiedlichen Rezeptoren, HER2, HER3 und HER4. Ein Ligand für diese ErbB-Familie ist das Protein Heregulin (HRG), ein mehrere Domänen enthaltendes Protein mit zumindest 15 unterschiedlichen Isoformen.
Die Transduktion von Signalen, die Zellwachstum und Differenzierung regulieren, wird teilweise durch Phosphorylierung verschiedener Zellproteine reguliert. Protein-Tyrosinkinasen sind Enzyme, die diesen Prozess katalysieren. Von Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen wird angenommen, dass sie das Zellwachstum über Ligandenstimulierte Tyrosin-Phosphorylierung intrazellulärer Substrate steuern. Wachstumsfaktor-Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen der Klasse-I-Unterfamilie umfassen den vom erbBI-Gen kodierten Epidermiswachstumsfaktorrezeptor (EGFR). erbBI ist ursächlich mit menschlicher Malignität in Zusammenhang gebracht worden. Insbesondere ist die verstärkte Expression dieses Gens in aggressiveren Karzinomen der Brust, Blase und des Magens beobachtet worden.
Das zweite Element der Klasse-I-Unterfamilie, p185^neu, wurde ursprünglich als Produkt des transformierenden Gens aus Neuroblastomen chemisch behandelter Mäuse identifiziert. Das neu-Gen (auch erbB2 und HER2 genannt) kodiert für eine 185 kDa-Rezeptorprotein-Tyrosinkinase. Die Amplifikation und/oder Überexpression des menschlichen HER2-Gens korreliert mit einer schlechten Prognose bei Brust- und Eierstockkrebsformen (Slamon et al., Science 235, 177-182 (1987); und Slamon et al., Science 244, 707-712 (1989)). Die Überexpression von HERZ ist mit anderen Karzinomen, einschließlich Karzinomen des Magens, der Gebärmutterschleimhaut, Speicheldrüse, Lunge, Niere, des Darms und der Blase korreliert worden. Demgemäß beschreiben und beanspruchen Slamon et al. im US-Patent Nr. 4.968.603 verschiedene Diagnosetests für die Bestimmung der HER2-Genamplifikation oder Expression in Tumorzellen. Slamon et al. entdeckten, dass die Gegenwart mehrerer Genkopien des HER2-Onkogens in Tumorzellen anzeigt, dass sich die Krankheit mit höherer Wahrscheinlichkeit über die primäre Tumorstelle hinaus ausbreitet und dass die Krankheit daher eine aggressivere Behandlung erfordert, als ansonsten durch andere Diagnosefaktoren indiziert wäre. Slamon et al. schließen daraus, dass der HER2-Genamplifikationstest zusammen mit der Bestimmung des Lymphknotenstatus für einen stark verbesserten prognostischen Nutzen sorgt.
Ein weiteres verwandtes, erbB3 oder HER3 genanntes Gen ist ebenfalls beschrieben worden. Siehe US-Patent Nr. 5.183.884; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9193-9197 (1989); EP-Patentanmeldung Nr. 444.961A1; und Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2900-2904 (1993). Kraus et al. (1989) entdeckten, dass merklich erhöhte Mengen an erbB3-mRNA in gewissen menschlichen Mammatumorzelllinien vorhanden waren, was darauf hinweist, dass erbB3 wie erbB1 und erbB2 eine Rolle bei menschlichen Malignitäten spielen könnte. Außerdem zeigten Kraus et al. (1993), dass die EGF-abhängige Aktivierung der katalytischen ErbB3-Domäne eines chimären EGFR/ErbB3-Rezeptors in einer proliferativen Reaktion in transfizierten NIH-3T3-Zellen resultierte. Es wird nunmehr angenommen, dass dies das Resultat von endogenem ErbB1 oder ErbB2 in NIH-T3T ist. Darüber hinaus bewiesen diese Forscher, dass einige menschliche Mammatumorzelllinien eine signifikante Erhöhung der stationären ErbB3-Tyrosinphosphorylierung zeigen, was ein weiterer Hinweis dafür ist, dass dieser Rezeptor eine Rolle bei menschlichen Malignitäten spielen könnte. Die Rolle von erbB3 beim Krebs ist von anderen erforscht woden. Es ist gefunden worden, dass es bei Brust- (Lemoine et al., Br. J. Cancer 66, 1116-1121 (1992)), Magen-Darm- (Poller et al., J. Pathol. 168, 275-280 (1992), Raikumer et al., J. Pathol. 170, 271-278 (1993) und Sanidas et al., Int. J. Cancer 54, 935-940 (1993)) und Pankreas-Krebsformen (Leomoine et al., J. Pathol. 168, 269-273 (1992) und Friess et al., Clinical Cancer Research 1, 1413-1420 (1995)) überexprimiert wird.
Die Klasse-I-Unterfamilie der Wachstumsfaktor-Rezeptorprotein-Tyrosinkinasen ist erweitert worden, um den HER4/Erb4-Rezeptor zu umfassen. Siehe EP-Patentanmeldung Nr. 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 1746-1750 (1993); und Plowman et al., Nature 366, 473-475 (1993). Plowman et al. fanden, dass die erhöhte HER4-Expression eng mit bestimmten, aus dem Epithel entstehenden Karzinomen, einschließlich mit Brust-Adenokarzinomen korreliert. Diagnoseverfahren zum Nachweis menschlicher neoplastischer Leiden (insbesondere Brustkrebsformen), welche die HER4-Expression beurteilen, werden in der EP-Patentanmeldung Nr. 599.274 beschrieben.
Die Suche nach dem Aktivator des HER2-Onkogens führte zur Entdeckung einer Familie von Heregulin-Polypeptiden. Diese Proteine scheinen aus dem alternativen Spleißen eines einzigen Gens hervorzugehen, das von Orr-Urtreger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1867-1871 (1993) im kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 8 kartiert wurde. Siehe auch Lee und Wood, Genomics 16, 790-791 (1993).
Holmes et al. isolierten und klonierten eine Familie von Polypeptidaktivatoren für den HER2-Rezeptor, die sie Heregulin-αα (HRG-α), Heregulin-β1 (HRG-β1), Heregulin-β2 (HRG-β2), Heregulin-β2-ähnlich (HRG-β2-ähnlich) und Heregulin-β3 (HRG-β3) nannten. Siehe Holmes et al., Science 256, 1205-1210 (1992); WO 92/20798; und US-Patent Nr. 5.367.060. Das 45 kDa-Polypeptid HRG-α wurde aus dem konditionierten Medium der menschlichen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 gereinigt. Diese Forscher bewiesen die Fähigkeit der gereinigten Heregulin-Polypeptide, die Tyrosin-Phosphorylierung des HER2-Rezeptors in MCF7-Brusttumorzellen zu aktivieren. Darüber hinaus wurde die mitogene Aktivität der Heregulin-Polypeptide an SK-BR-3-Zellen (die hohe Mengen des HER2-Rezeptors exprimieren) illustriert. Wie andere Wachstumsfaktoren, die der EGF-Familie angehören, scheinen lösliche HRG- Polypeptide von einem membrangebundenen Vorläufer zu stammen (der pro-HRG genannt wird), der proteolytisch prozessiert wird, um die lösliche 45 kDa-Form freizusetzen. Diesen pro-HRGs fehlt ein N-terminates Signalpeptid.
Obgleich die ersten 213 Aminosäurereste der Hereguline identisch sind, werden sie in zwei Haupttypen, α und β; eingeteilt, und zwar auf Basis von zwei EGF-artigen Variantendomänen, die sich in ihren C-terminalen Abschnitten unterscheiden. Trotzdem sind diese EGF-artigen Domänen hinsichtlich des Abstands von sechs darin enthaltenen Cysteinresten identisch. Auf Basis eines Aminosäurevergleichs fanden Holmes et al., dass HRGs zwischen dem ersten und sechsten Cystein in der EGF-artigen Domäne eine Ähnlichkeit von 45 % mit dem Heparin-bindenden, EGF-artigen Wachstumsfaktor (HB-EGF), eine Ähnlichkeit von 35 % mit Amphiregulin (AR), eine Ähnlichkeit von 32 % mit TGF-α und eine Ähnlichkeit von 27 % mit EGF aufweisen.
Der neu-Differenzierungsfaktor von 44 kDa (NDF), der das Ratten-Äquivalent zum menschlichen HRG ist, wurde erstmals von Peles et al., Cell 69, 205-216 (1992); und Wen et al., Cell 69, 559-572 (1992) beschrieben. Wie die HRG-Polypeptide weist NDF eine Immunglobulin- (Ig-) Homologiedomäne, gefolgt von einer EGF-artigen Domäne auf und es fehlt ihm ein N-terminales Signalpeptid. Im Wesentlichen führten Wen et al., Mol. Cell. Biol. 14(3), 1909-1919 (1994) eine „erschöpfende Klonierung" durch, um die Familie von NDFs zu erweitern. Diese Arbeit offenbarte sechs unterschiedliche Fibroblasten-Pro-NDFs. Die Nomenklatur von Holmes et al. übernehmend, werden die NDFs auf Basis der Sequenzen der EGF-artigen Domänen entweder als α-; oder als β-Polypeptide klassifiziert. Die Isoformen 1 bis 4 werden auf Basis des variablen Abschnitts, der nur aus Membran besteht („justamembran"), (zwischen der EGF-artigen Domäne und Transmembrandomäne) charakterisiert. Außerdem werden die Isoformen a, b und c beschrieben, die zytoplasmatische Domänen variabler Länge aufweisen. Diese Forscher ziehen den Schluss, dass verschiedene NDF-Isoformen durch alternatives Spleißen erzeugt werden und unterschiedliche gewebespezifische Funktionen erfüllen. Siehe auch EP 505.148 ; WO 93/22424; und WO 94/28133, die NDF betreffen.
Falls et al., Cell 72, 801-815 (1993) beschreiben ein weiteres Element der Heregulin-Familie, das sie Polypeptid für Acetylcholinrezeptor-induzierende Aktivität (ARIA) nennen. Das vom Huhn stammende ARIA-Polypeptid stimuliert die Synthese von Muskel-Acetylcholinrezeptoren. Siehe auch WO 94/08007. ARIA ist ein Heregulin des β-Typs, dem die gesamte, an Glykosylierungsstellen reiche Spacer-Region zwischen der Ig-artigen Domäne und der EGF-artigen Domäne von HRGα und HRGβ1-β3 fehlt.
Marchionni et al., Nature 362, 312-318 (1993) identifizierten mehrere vom Rind stammende Proteine, die sie Glia-Wachstumsfaktoren (GFFs) nennen. Diese GFFs haben die Ig-artige Domäne und EGF-artige Domäne mit den anderen oben beschriebenen Heregulin-Proteinen gemeinsam, weisen jedoch außerdem eine amino-terminale Kringle-Region auf. GFFs weisen im Allgemeinen die vollständige glykosylierte Spacer-Region zwischen der Ig-artigen Domäne und der EGF-artigen Domäne nicht auf. Nur einer der GFFs, GGFII wies ein N-terminates Signalpeptid auf. Siehe auch WO 92/18627; WO 94/00140; WO 94/04560; WO 94/26298; und WO 95/32724, die GFFs und Verwendungen davon betreffen.
Ho et al., J. Biol. Chem. 270(4), 14523-14532 (1995) beschreiben ein weiteres Element der Heregulin-Familie, das vom sensorischen und motorischen Neuron abstammender Faktor (SMDF) genannt wird. Dieses Protein weist eine für alle anderen Heregulin-Polypeptide charakteristische EGF-artige Domäne, jedoch eine davon verschiedene N-terminale Region auf. Der strukturelle Hauptunterschied zwischen SMDF und den anderen Heregulin-Polypeptiden ist das Fehlen der Ig-artigen Domäne und des „Glyco"-Spacers in SMDF, die für alle anderen Heregulin-Polypeptide charakteristisch sind. Eine weitere Eigenschaft von SMDF ist die Gegenwart von zwei Abschnitten hydrophober Aminosäuren nahe dem N-Terminus.
Während die Heregulin-Polypeptide erstmals auf Basis ihrer Fähigkeit identifiziert wurden, den HER2-Rezeptor zu aktivieren (siehe Holmes et al., s.o.), ist entdeckt worden, dass gewisse neu- und neu-transfizierte Fibroblasten exprimierende Eier stockzellen weder an NDF banden oder vernetzen, noch auf NDF reagierten, um Tyrosin-phosphoryliert zu werden (Peles et al., EMBO J. 12, 961-971 (1993)). Dies wies darauf hin, dass eine weitere Zellkomponente zur Verleihung der vollen Heregulin-Reaktionsfähigkeit erforderlich war. Carraway et al. wiesen anschließend nach, dass ¹²⁵I-rHGRβ1_177-244 an stabil mit Rinder-erbB3 transfizierte NIH-T3T-Fibroblasten banden, nicht jedoch an nicht-transfizierte Elternzellen. Demgemäß schließen sie daraus, dass ErbB3 ein Rezeptor für HRG ist und die Phosphorylierung von intrinsischen Tyrosinresten sowie die Phosphorylierung des ErbB2-Rezeptors in Zellen vermitteln, die beide Rezeptoren exprimieren. Carraway et al., J. Biol. Chem. 269(19), 14303-14306 (1994). Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269(20), 14661-14665 (1994) fanden, dass mit HER3 alleine transfizierte Zellen niedrigere Affinitäten für Heregulin zeigen, wogegen mit HER2 sowie HER3 transfizierte Zellen höhere Affinitäten zeigen.
Diese Beobachtung korreliert mit dem früher von Kokai et al., Cell 58, 287-292 (1989); Stern et al., EMBO J. 7, 995-1001 (1988); und King et al., 4, 13-18 (1989) beschriebenen „Rezeptor-Crosstalking". Diese Forscher fanden, dass die Bindung von EGF an EGFR in der Aktivierung der EGFR-Kinasedomäne und Kreuz-Phosphorylierung von p185^HER2 resultierte. Es wird angenommen, dass dies ein Ergebnis der Liganden-induzierten Rezeptor-Heterodimerisierung und der gleichzeitigen Kreuz-Phosphorylierung der Rezeptoren im Heterodimer ist (Wada et al., Cell 61, 1339-1347 (1990)).
Plowman und seine Mitarbeiter haben auf ähnliche Weise die p185^HER4/p185^HER2-Aktivierung untersucht. Sie exprimierten p185^HER2 alleine, p185^HER4 alleine oder die beiden Rezeptoren gemeinsam in menschlichen T-Lymphozyten und bewiesen, dass Heregulin zur Stimulierung der Tyrosin-Phosphorylierung von p185^HER4 fähig ist, die p185^HER2-Phopshorylierung jedoch nur in Zellen stimulieren konnte, die beide Rezeptoren exprimierten. Plowman et al., Nature 336, 473-475 (1993).
Die biologische Rolle von Heregulin ist von mehreren Forschergruppen untersucht worden. Beispielsweise fanden Falls et al. (oben erörtert), dass ARIA eine Rolle bei der Myotubulus-Differenzierung, nämlich bei der Beeinflussung der Synthese und Konzentration von Neurotransmitter-Rezeptoren in den postsynaptischen Muskelzellen motorischer Neuronen spielt. Corfas und Fischbach wiesen nach, dass ARIA auch die Anzahl an Natriumkanälen im Hühnermuskel erhöht. Corfas und Fischbach, J. Neuroscience 13(5), 2118-2125 (1993). Es ist außerdem gezeigt worden, dass GFFII für subkonfluente ruhende menschliche Myoblasten mitogen ist und dass die Differenzierung klonaler menschlicher Myoblasten bei fortdauernder Gegenwart von GFFII in einer größeren Anzahl an Myotubuli sechs Tage nach der Differenzierung resultiert (Sklar et al., J. Cell. Biochem., Abst. W462, 18D, 540 (1994)). Siehe auch WO 94/26298, veröffentlicht am 24. November 1994.
Holmes et al., s.o., fanden, dass HRG eine mitogene Wirkung auf Säugetierzelllinien (wie z.B. SK-BR-3 und MCF-7) ausübte. Die mitogene Aktivität von GGFs auf Schwann'sche Zellen ist ebenfalls beschrieben worden. Siehe z.B. Brockes et al., J. Biol. Chem. 255(18), 8374-8377 (1980); Lemke und Brockes, J. Neurosci. 4, 75-83 (1984); Brockes et al., Ann. Neurol. 20(3), 317-322 (1986); J. Brockes, Methods in Enzym. 147, 217-225 (1987) und Marchionni et al., s.o. Schwann'sche Zellen stellen wichtige Gliazellen dar, die Myelinscheiden um die Axons von Neuronen herum bereitstellen, wodurch einzelne Nervenfasern gebildet werden. Folglich ist es offensichtlich, dass Schwann'sche Zellen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, Funktion und Regeneration peripherer Nerven spielen. Die Implikationen daraus sind vom therapeutischen Standpunkt von Levi et al., Neuroscience 14(3), 1309-1319 (1994) behandelt worden. Levi et al. erörtern die Möglichkeit zur Konstruktion einer Zell-Prothese, die menschliche Schwann'sche Zellen umfasst, die in geschädigte Rükkenmarksbereiche transplantiert werden könnte. Verfahren zum Kultivieren Schwann'scher Zellen ex vivo sind beschrieben worden. Siehe WO 94/00140 und Li et al., J. Neuroscience 16(6), 2012-2019 (1996).
Pinkas-Kramarski et al. fanden, dass NDF scheinbar in Neuronen und Gliazellen im embryonalen und adulten Rattenhirn und Primärkulturen von Rattenhirnzellen exprimiert werden und legten. nahe, dass es als Überlebens- und Reifungsfaktor für Astrozyten agieren könnten (Pinkas-Kramarski et al., PNAS USA 91, 9387-9391 (1994)). Meyer und Birchmeier, PNAS USA 91, 1064-1068 (1994) analysierten die Expression von Heregulin während der Maus-Embryogenese und im perinatalen Tier unter Verwendung von In-situ-Hybridisierungs- und RNase-Schutz-Experimenten. Siehe auch Meyer et al., Development 124(18), 3575-3586 (1997). Diese Autoren ziehen den Schluss, dass auf Basis der Expression dieses Moleküls Heregulin eine In-vivo-Rolle als mesenchymaler und neuronaler Faktor spielt. Gleichermaßen fanden Danilenko et al., Abstract 3101, FASEB 8(4-5), A535 (1994); Danilenko et al., Journal of Clinical Investigation 95(2), 842-851 (1995), dass die Wechselwirkung von NDF und HER2-Rezeptor für die Steuerung der Epidermis-Migration und Differenzierung während der Wundheilung von Bedeutung ist.
Ram et al., Journal of Cellular Physiology 163, 589-596 (1994) beurteilten die mitogene Aktivität von NDF auf die immortalisierte menschliche Mammaepithelzelllinie MCF-10A. Danilenko et al., J. Clin. Invest. 95, 842-851 (1995) untersuchten, ob NDF die Epidermis-Migration in einem In-vivo-Modell der Heilung einer tief ausgeschnittenen Wunde über die teilweise Dicke beeinflusst. Es wird berichtet, dass keine statistisch signifikanten Unterschiede der proliferierenden basalen und superbasalen Keratinozyten in Kontrollwunden gegenüber mit rhNDF-α₂ behandelten Wunden auftraten. Marikovsky et al., Oncogene 10, 1403-1411 (1995) untersuchten die proliferativen Reaktionen einer aneuploiden kontinuierlichen BALB-MK-Keratinozytenzelllinie und beurteilten die Wirkungen von α- und β-Isoformen von NDF auf Epidermis-Keratinozyten.
Die Beziehung zwischen der Struktur und Funktion neuer Proteine kann unter Verwendung einer beliebigen einer Vielzahl von verfügbaren Mutationsanalysetechniken untersucht werden. Beispiele derartiger Techniken umfassen Alanin-Scanning-Mutagenese und Phagemid-Display. Alanin-Scanning kann verwendet werden, um aktive Reste (d.h., Reste, die eine signifikante Wirkung auf die Proteinfunktion ausüben) in einem Protein oder in einer Proteindomäne zu identifizieren. Beispielsweise verwendeten Cunningham und Wells das Alanin-Scanning zur Identifizierung von Resten im menschlichen Wachstumshormon, die für die Bindung an seinen Rezeptor wichtig waren. Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989). Beim Alanin-Scanning wird ein für das/die zu scannende Protein oder Domäne kodierendes Gen in einen Expressionsvektor insertiert und die Mutagenese durchgeführt, um eine Reihe von Vektoren zu erzeugen, die für Proteine oder Domänen kodieren, bei denen Reste der Reihe nach zu Alanin umgesetzt sind. Die kodierten Proteine oder Domänen werden aus diesen Vektoren exprimiert und die Aktivitäten der Alaninsubstituierten Varianten daraufhin getestet, um jene mit veränderter Aktivität zu identifizieren. Ein Veränderung der Aktivität weist darauf hin, dass der Rest an der Alanin-substituierten Position ein aktiver Rest ist.
Der Phagemid-Display wurde entwickelt, um das Screening einer großen Anzahl an Varianten-Polypeptiden für eine bestimmte Bindungsaktivität zu ermöglichen. Smith und Parmley wiesen nach, dass fremde Peptide effizient an der Oberfläche filamentöser Phagen „präsentiert" werden können, indem kurze Genfragmente in das Gen II des fd-Phagen insertiert werden. Smith, Science 228, 1315-1317 (1985); Parmley und Smith, Gene 73, 305-318 (1985). Das Gen-III-Hüllprotein ist mit ungefähr fünf Kopien an einem der Enden des Phagenteilchens vorhanden. Die modifizierten Phagen wurden „Fusionsphagen" genannt, da sie die fremden Peptide an das Gen-III-Hüllprotein fusioniert präsentierten. Da jedes Fusions-Phagenteilchen ungefähr fünf Kopien des Fusionsproteins präsentierten, wurde dieser Phagen-Display-Modus „polyvalente Präsentation" genannt.
Scott et al. und Cwirla et al. zeigten, dass Fusionsphagenbibliotheken durch als „Panning" bekannte sequentielle Affinitätsselektionen gescreent werden konnten. Scott et al., Science 249, 386-390 (1990); Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990). Jedoch schlugen frühe Bemühungen fehl, hochaffine Fusionsphagen zu selektieren. vermutlich wegen der Polyvalenz der Phagenteilchen. Diese Problem wur de mit der Entwicklung eines „monovalenten" Phagen-Display-Systems gelöst, bei dem das Fusionsprotein in einem niedrigen Ausmaß aus einem Phagemid exprimiert wird und ein Helferphage einen großen Überschuss des Hüllproteins der Wildform bereitstellt. Bass et al., Proteins 8, 309-314 (1990); Lowman et al., Biochem. 30, 10822-10838 (1991). Monovalenter Phagen-Display kann verwendet werden, um eine große Anzahl von Varianten-Polypeptiden zu erzeugen und zu screenen, um jene zu isolieren, die mit hoher Affinität an ein Ziel von Interesse binden.
In den Vereinigten Staaten werden ungefähr 50.000 Säuglinge jedes Jahr mit einem Geburtsgewicht von weniger als 1,5 kg geboren. Ungefähr zwei Drittel dieser Säuglinge mit sehr niedrigem Geburtsgewicht weisen Anzeichen von Lungenunterentwicklung auf, die sich als Atemnot kurz nach der Geburt äußert. Der Großteil dieser Säuglinge benötigt eine mechanische Beatmung. Atemnotsyndrom, das durch unzureichende pulmonale Tensid-Faktor-Produktion sowie strukturelle Unterentwicklung der Lunge verursacht wird, ist für die in diesen frühgeborenen Neugeborenen beobachteten Atemprobleme verantwortlich. Gut entwickelte Alveolen sind notwendig, um für einen effizienten Sauerstoffübergang von der Luft-Flüssig-Grenzfläche der Lunge in den systemischen Kreislauf zu sorgen. Tensid-Proteine sind für die Verminderung der Oberflächenspannung bei niedrigen Lungenvolumina und die Verhinderung eines Alveolarkollaps entscheidend.
Es besteht weiterhin ein Bedarf an einem Behandlungsverfahren für das Atemnotsyndrom und andere Krankheiten, die mit unreifer Lungenentwicklung und niedriger Lungentensid-Produktion zusammenhängen.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Allgemeinen ist ein Ziel der Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Induktion des Wachstums und der Entwicklung von Epithelzellen zum Zwecke der Förderung der Reparatur und Heilung einer Gewebeschädigung oder Verletzung.
Demgemäß ist es eines der Ziele der Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung des Atemnotsyndroms bei Patienten, in erster Linie menschlichen Patienten bereitzustellen, die eine solche Behandlung benötigen. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Induktion des Wachstums und der Entwicklung von Lungenepithelzellen. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines Verfahrens der Erhöhung der Lungentensid-Protein-A-Produktion in der Lunge von Personen mit beeinträchtigtem Sauerstoffübergang in den Lungenalveolen. Diese Erfindung ist bei der Behandlung von Säuglingen/Neugeborenen mit Atemnot, sowie Jugendlichen und Erwachsenen mit schlechter Lungenfunktion aufgrund von Lungenverletzung oder Schädigung zweckdienlich.
Es ist nunmehr entdeckt worden, dass diese Ziele und die breitere Zielsetzung der Behandlung von Leiden, die mit der Schädigung und Verletzung von Epithelzellen im Zusammenhang stehen, durch Verabreichen eine wirksamen Menge eines Heregulin-Liganden, vorzugsweise eines Polypeptids oder Fragments davon an einen Patienten erreicht werden können, der eine derartige Behandlung benötigt. Diese Heregulin- (HRG-) Polypeptide umfassen HRG-α, HRG-β1, HRG-β2, HRG-ß3 und andere HRG-Polypeptide, die mit Antikörpern kreuzreagieren, die gegen diese Familienelemente gerichtet sind und/oder die im Wesentlichen wie oben definiert homolog sind, und umfasst HRG-Varianten, wie z.B. N-terminale und C-terminale Fragmente davon. Ein bevorzugtes HRG ist der in den 1A-1D offenbarte, der im Weiteren als HRG-α bezeichnet wird. Andere bevorzugte HRGs sind die in 2A-2E offenbarten und als HRG-β1 bezeichneten Liganden; die in 3A-3E offenbarten und als HRG-β2 bezeichneten Liganden; die in 4A-4C offenbarten und als HRG-β3 bezeichneten Liganden.
Demgemäß stellt die Erfindung die Verwendungen und Verfahren bereit, die in den angefügten Ansprüchen dargelegt sind.
In einer ihrer Ausführungsformen nutzt die Erfindung HRG-Agonist-Antikörper. In dieser Ausführungsform werden HER2/HER3 oder Fragmente davon (die auch durch In-vitro-Verfahren synthetisiert werden können) an ein immunogenes Polypeptid fusioniert (durch rekombinante Expression oder eine In-vitro-Peptidbindung) und dieses Fusionspolypeptid wird seinerseits verwendet, um Antikörper gegen ein HER2/HER3-Epitop herzustellen. Agonist-Antikörper werden aus dem Serum immunisierter Tiere gewonnen. Alternativ dazu werden monoklonale Antikörper aus In-vitro-Zellen oder in vivo immunisierten Tieren auf herkömmliche Weise hergestellt. Wenn erwünscht, können die Agonist-Antikörper durch Phagen-Display-Selektion aus einer Phagenbibliothek von Antikörpern oder Antikörperfragmenten erlangt werden. Durch routinemäßiges Screening identifizierte, bevorzugte Antikörper werden an den Rezeptor binden, werden jedoch im Wesentlichen nicht mit irgendwelchen anderen bekannte Liganden, wie z.B. EGF kreuzreagieren, und werden die HER-Rezeptoren HER2, HER3 und/oder HER4 aktivieren. Außerdem können Antikörper gewählt werden, die fähig sind, spezifisch an einzelne Elemente der HRG-Familie, z.B. an HRG-α, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β3 zu binden und die Agonisten davon sind.
Im Allgemeinen betrifft die Erfindung das Regenerieren und/oder Reparieren einer Epithelzellenverletzung durch Stimulieren von Wachstum und Proliferation von Epithelzellen, insbesondere Duktus- und Flimmer-Epithelzellen. Die Epithelzellen können durch zahlreiche Arten von Insulten verletzt sein, beispielsweise durch Verletzung aufgrund von chirurgischen Schnitten oder Resektionen, Chemikalien- oder Rauchinhalation oder Aspiration, chemischer oder biochemischer Geschwürbildung, Zellschädigung aufgrund von Virus- oder Bakterieninfektionen usw. Die Epithelzellen, die beeinträchtigt werden können, umfassen jegliche Epithelzelle, die HER2, HER3 und/oder HER4 exprimiert; geeignete Zellen sind beispielsweise in der Lunge, Magenschleimhaut, Gebärmutterschleimhaut, im Eileiter, in den Brustdrüsen, im Pankreas, in den Speicheldrüsen usw. lokalisiert. Das gemäß der Erfindung hergestellte Medikament stimuliert das Wachstum und die Proliferation der Epithelzellen, die Reparatur und Neubildung der Zellbarrieren von Organen und ermöglicht es den beeinträchtigten Geweben, normale physiologische Funktionen rascher zu entwickeln. Beispielsweise werden Lungenepithelzellen durch Rauchinhalation geschädigt, was in Emphysem resultiert. Die Behandlung von Lungenzellen mit dem gemäß der Er findung hergestellten Medikament regeneriert die Barrierenschicht von Lungenepithelzellen, verbessert die Sauerstoffsättigung und beschleunigt die Entwicklung einer Barriere gegen Infektion. Gleichermaßen kann die Zellschädigung aufgrund der Aspiration von Magensäure mit dem gemäß der Erfindung hergestellten Medikament behandelt werden, um die Regeneration von Epithelzellen zu fördern.
Kurzbeschreibung der Figuren
1A-1D stellen die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 1) für die cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 2) dar, die in einem gemäß US-Patent Nr. 5.367.060 erlangten Klone enthalten ist. Das initiierende Methionin (Met) von HRG-α befindet sich an Position 45.
2A-2E stellen die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 3) und cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 4) einer möglichen kodierenden Sequenz eines gemäß US-Patent Nr. 5.367.060 erlangten Klons für HRG-β1 dar. Das initiierende Met befindet sich bei M31.
3A-3E stellen die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 5) und cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 6) einer Nucleotidsequenz eines gemäß US-Patent Nr. 5.367.060 erlangten Klons für HRG-β2 dar.
4A-4C stellen die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 7) und cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 8) einer Nucleotidsequenz eines gemäß US-Patent Nr. 5.367.060 erlangten Klons für HRG-β3 dar.
5A-4D stellen die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 9) und cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 10) einer Nucleotidsequenz eines gemäß US-Patent Nr. 5.367.060 erlangten Klons für HRG-β2-artiges Protein dar.
6A-6C stellen einen Vergleich der Aminosäurehomologien mehrere bekannter Hereguline der Typen α, β1, β2, β2-artig und β3 in absteigender Reihenfolge dar und illustrieren die Aminosäureinsertionen, Deletionen und Substitutionen, die diese HRG-Formen charakterisieren (Seq.-ID Nr. 1, 3, 5, 9 und 7).
7A-7C stellen die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 11) und cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 12) von γ-HRG dar, das wie im US-Patent mit der Seriennummer 08/891.845 beschrieben erlangt wurde. Die hydrophobe Region ist unterstrichen. Die EGF-artige Domäne ist schattiert und die Cysteinreste in der EGF-artigen Domäne eingekreist dargestellt. N-gebundene Glykosylierungsstellen sind über der Nucleinsäuresequenz mit einem () markiert.
8 stellt die cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 13) und Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 14) von SMDF dar, der wie im US-Patent mit der Seriennummer 08/339.517 beschrieben erlangt wurde. Eine EGF-artige Domäne und die apolaren und ungeladenen Domänen (d.h. „apolar I", bestehend aus Resten von ungefähr 48-62, und „apolar II", bestehend aus Resten von ungefähr 76-100) sind unterstrichen. Cysteine in der EGF-artigen Domäne und im „Cystein-Knoten" in der einzigartigen N-terminalen Domäne („NTD-cys-Knoten") sind eingerahmt. Das Stopcodon ist mit dem Buchstaben „O" bezeichnet.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
HRG-Liganden, insbesondere Polypeptide und Agonist-Antikörper davon weisen eine Affinität für HER2-, HER3- und/oder HER4-Rezeptoren oder Kombinationen davon auf und stimulieren diese bei der Autophosphorylierung. In der Definition von HRG-Liganden sind zusätzlich zu HRG-α, HRG-β1, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β3 und HRG-β2-artig andere Polypeptide umfasst, die den HER2-, HER3- und/oder HER4-Rezeptor binden, die eine wesentliche Aminosäuresequenzhomologie zu HRG-α und HRG-β1 aufweisen. Derartige zusätzliche Polypeptide fallen in den Definitions bereich von HRG als Familie von Polypeptidliganden, die an die HER2-, HER3- und/oder HER4-Rezeptoren binden.
Heregulin-Polypeptide binden mit variierenden Affinitäten an die HER2-, HER3- und/oder HER4-Rezeptoren. Im Allgemeinen werden die HER3- und HER4-Rezeptoren mit hoher Affinität gebunden. Es ist außerdem bekannt, dass eine Heterodimerisierung von HER2 mit HER3 und von HER2 mit HER4 mit anschließender Rezeptor-Kreuzphosphorylierung wie oben beschrieben auftritt. Bei der vorliegenden Erfindung wird das Wachstum und/oder die Proliferation der Epithelzellen induziert, wenn ein Heregulin-Protein mit einem einzelnen Rezeptormolekül oder Rezeptordimer wechselwirkt oder daran bindet, so dass die Rezeptor-Phosphorylierung induziert wird. Die Bindung und Aktivierung von HER2, HER3, HER4 oder Kombinationen davon umfasst daher die Aktivierung jeglicher Form des Rezeptors, die für die Aktivierung und biologische Funktion des Rezeptors notwendig ist, einschließlich monomere Rezeptoren und dimere Rezeptorformen. Dimere Rezeptorformen können unten beispielsweise als HER2/HER3, HER2/HER4 und HER3/HER4 bezeichnet werden.
I. Definitionen
Im Allgemeinen haben die folgenden Ausdrücke oder Wendungen bei Verwendung in der Beschreibung, in den Beispielen und Ansprüchen die angegebene Definition.
Ein „Heregulin"- (HRG-) Ligand ist hierin als jeglicher isolierter Ligand definiert, der vorzugsweise eine Polypeptidsequenz ist, die eine biologische Eigenschaft eines natürlich vorkommenden HRG-Polypeptids aufweist. Liganden, die im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten sind, umfassen die oben festgelegten NDF-, ARIA- und GGF-Wachstumsfaktor-Heregulin-Proteine, sowie die hierin im Detail besprochenen SMDF- und HRG-Polypeptide. Diese isolierten NDF-, ARIA- und GGF-Heregulin-Polypeptide sind auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. HRG umfasst die in den 1A-1D, 2A-2E, 3A-3E, 5A-4C, 5A-5D, 6A-6C, 7A-7C und 8 dargestellten Polypeptide und Säugetier-Analoga davon. Umfasst sind HRG-Varianten, wie z.B. das in der am 22: Jänner 1998 veröffentlichten WO 98/02541 beschriebene γ-HRG; die in der am 13. August 1998 veröffentlichten WO 98/35036 beschriebenen Varianten; und die im am 23. Juni 1998 erteilten US-Patent Nr. 5.770.567 (WO 96/15244) beschriebenen SMDF-Varianten. Diese Anmeldungen sind hierin in vollem Umfang durch Verweis aufgenommen. Diese Varianten können mit den unten beschriebenen Verfahren, gegebenenfalls zusammen mit auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Alanin-Scanning- und Phagen-Display-Techniken hergestellt werden. Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989); Bass et al., Proteins 8, 309-14 (1990); Lowman et al., Biochem. 30, 10832-38 (1991).
Unter dem Ausdruck „normale" Epithelzelle wird eine Epithelzelle verstanden, die nicht transformiert, d.h., nicht-kanzerös und/oder nicht-immortalisiert ist. Weiters ist die normale Epithelzelle vorzugsweise nicht aneuploid. Aneuploidie besteht, wenn der Kern der Zelle kein exaktes Vielfaches der haploiden Anzahl an Chromosomen enthält, wobei ein oder mehrere Chromosomen in größerer oder geringerer Anzahl als der Rest vorhanden sind. Typische Eigenschaften transformierter Zellen, die außerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung liegen, umfassen die Fähigkeit, Tumore zu bilden, wenn sie in immun-unterdrückte Mäuse (Nacktmäuse) implantiert werden, die Fähigkeit, in Suspension oder in einem halbfesten Medium, wie z.B. Agar zu wachsen, einen Verlust der Kontakthemmung, was die Ansammlung von Zellen zu Kolonien oder Häufungspunkten ermöglicht, einen Verlust der Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren oder Serum, Zelltod, wenn das Wachstum von Zellen gehemmt wird, und die Desorganisation von Actinfilamenten. Speziell im Schutzumfang der Erfindung umfasst sind normale Epithelzellen, die üblicherweise keine Tumore in Mäusen bilden, an Kunststoff oder Glas anhaftend wachsen (verankerungsabhängig sind), eine Kontakthemmung aufweisen, Serum-enthaltende Hormone und Wachstumsfaktoren benötigen, lebensfähig bleiben, wenn das Wachstum durch Fehlen von Serum arretiert ist, und wohlgeordnete Actinfilamente enthalten. Obgleich die normalen Epithelzellen vorzugsweise keine kultivierten Zellen sind, sind für die Erfindung auch nicht-transformierte, nicht-immortalisierte, aus Säugetiergewebe isolierte Epit helzellen geeignet. Diese isolierten Zellen können für mehrere Generationen (bis zu ungefähr 10 oder sogar 50 Generationen) gezüchtet werden, und zwar in Gegenwart eines Heregulins, um das Wachstum und/oder die Proliferation der isolierten Epithelzellenprobe zu induzieren, d.h. die Probe zu expandieren. Die expandierte Probe kann dann zum Zwecke der Wiederbesiedelung des Epithelzellengewebes (Reepithelisierung) wieder in das Säugetier eingebracht werden. Dies ist insbesondere für die Reparatur einer Gewebeverletzung oder Schädigung zweckdienlich.
Eine „Epithelzelle" ist eine Zelle, die in einer zellulären, avaskulären Schicht lokalisiert ist, welche die freie (kutane, muköse oder seröse) Oberfläche eines Organs bedeckt oder eine Röhre oder Höhle eines Tierkörpers auskleidet. Lungenepithelzellen umfassen Bronchienepithelzellen, Typ-II-Zellen und Clara-Zellen. Der Ausdruck „Epithelzelle", wie er hierin verwendet wird, steht im Einklang mit der auf dem Gebiet der Erfindung anerkannten Definition von Epithelzellen im Epithel. Siehe beispielsweise die Definition in Taber's Encyclopedic Medical Dictionary, 12. Ausg., F.A. Davis Company (Hrsg.) (1973).
Unter „biologische Eigenschaft" wird für die Zwecke hierin eine biologische oder antigene Funktion oder Aktivität in vivo verstanden, die direkt oder indirekt von einer HRG-Sequenz (ob sie in ihrer nativen oder denaturierten Konformation vorliegt) oder von einer beliebigen Teilsequenz davon ausgeführt wird. Biologische Funktionen umfassen Rezeptorbindung, jegliche Enzymaktivität oder Enzymmodulationsktivität, jegliche Trägerbindungsaktivität, jegliche Hormonaktivität, jegliche Aktivität bei der Förderung oder Hemmung der Adhäsion von Zellen an eine extrazelluläre Matrix oder an Zelloberflächenmoleküle, oder jegliche strukturelle Rolle. Jedoch umfassen biologische Funktionen nicht antigene Funktionen, d.h. das Aufweisen eines Epitops oder einer antigenen Stelle, das/die zur Kreuzreaktion mit Antikörpern gegen ein natürlich vorkommendes HRG-Polypeptid fähig ist.
Ein „biologisch aktives" HRG ist hierin als ein Polypeptid definiert, dass eine biologische Funktion mit einer HRG-Sequenz gemeinsam hat, das außerdem eine antigene Funktion aufweisen kann (aber nicht muss). Eine bekannte Hauptwirkung oder Hauptfunktion von HRG ist die eines Ligandenpolypeptids, das eine qualitative biologische Aktivität der Bindung an HER2, HER3 und/oder HER4 aufweist, die in der Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinase resultiert (ein „aktivierender Ligand"). Einer der Tests für aktivierende Liganden ist der unten beschriebene HRG-Tyrosin-Autophosphorylierungstest. Im Schutzumfang von HRG enthalten sind, so wie der Ausdruck hierin verwendet wird, HRG, die hierin dargelegte translatierte reife Aminosäuresequenzen des vollständigen menschlichen HRG aufweisen; deglykosylierte oder unglykosylierte HRG-Derivate, Aminosäuresequenzvarianten der HRG-Sequenz und HRG-Derivate, die fähig sind, eine mit HRG gemeinsame biologische Eigenschaft zu zeigen. Obgleich natives HRG ein membrangebundenes Polypeptid ist, sind lösliche Formen, wie z.B. jene Formen, denen eine funktionelle Transmembrandomäne fehlt, ebenfalls in dieser Definition enthalten. Insbesondere umfasst sind Polypeptidfragmente der HRG-Sequenz, die einen N-Terminus an irgendeinem der Reste von ungefähr S216 bis ungefähr A227 und ihren C-Terminus an irgendeinem der Reste von ungefähr K268 bis ungefähr R286 aufweisen, sowie die in 6A-c dargestellten homologen Sequenzen, die hiernach zusammen für alle HRGs als die Wachstumsfaktordomäne (GFD) bezeichnet werden.
Ein „antigenisch aktives" HRG ist als ein Polypeptid definiert, das eine antigene Funktion eines HRG aufweist und das außerdem eine biologisch Funktion aufweisen kann (jedoch nicht muss).
In bevorzugten Ausführungsformen ist antigenisch aktives HRG ein Polypeptid, das mit einer Affinität von zumindest ungefähr 10^-9 l/Mol an einen gegen eine natürlich vorkommende HRG-Sequenz hergestellten Antikörper bindet. Insbesondere bevorzugt ist das antigenisch aktive HRG ein Polypeptid, das an einen Antikörper bindet, der gegen eines der HRGs in seiner nativen Konformation hergestellt wurde. HRG in seiner nativen Form ist im Allgemeinen HRG, wie es sich in der Natur findet, das nicht durch chaotrope Mittel, Hitze oder eine andere Behandlung denaturiert worden ist, welche die dreidimensionale Struktur von HRG, wie sie beispielsweise durch Mi gration an nicht-reduzierenden, nicht-denaturierenden, nach Größe trennenden Gelen ermittelt wird, wesentlich modifiziert. Der bei dieser Ermittlung verwendete Antikörper kann ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper sein, der durch Formulieren von nativem HRG aus einer Nicht-Kaninchen-Spezies in Freund'schem kompletten Adjuvans, subkutanes Injizieren der Formulierung und Boosten der Immunantwort durch intraperitoneale Injektion der Formulierung bis zur Erreichung des Plateaus des Anti-HRG-Antikörper-Titers hergestellt wurde.
Für gewöhnlich weist biologisch oder antigenisch aktives HRG eine Aminosäuresequenz mit zumindest 75 %, bevorzugter zumindest 80 %, noch bevorzugter zumindest 90 % und insbesondere zumindest 95 % Aminosäuresequenzidentität zu einer gegebenen HRG-Sequenz auf. Identität oder Homologie bezüglich einer HRG-Sequenz ist hierin als prozentueller Anteil an Aminosäureresten in der Kandidatsequenz definiert, der mit den HRG-Resten im HRG aus 6A-6C identisch ist, und zwar nach Angleichen der Sequenzen und Einführen von Lücken, die gegebenenfalls notwendig sind, um die maximale prozentuelle Homologie zu erzielen, wobei jegliche konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität unberücksichtigt bleiben. N-terminale, C-terminale oder interne Extensionen, Deletionen oder Insertionen in die HRG-Sequenz sind nicht dahingehend auszulegen, dass sie die Homologie beeinflussen.
Folglich umfassen die biologisch aktiven und antigenisch aktiven HRG-Polypeptide, die Gegenstand dieser Erfindung sind, jede vollständige HRG-Sequenz; Fragmente davon, die eine fortlaufende Sequenz von zumindest 5, 10, 15, 20, 25, 30 oder 40 Aminosäureresten aus der HRG-Sequenz aufweisen; Aminosäuresequenzvarianten der HRG-Sequenz, worin ein Aminosäurerest N- oder C-terminal oder innerhalb der HRG-Sequenz oder ihrer oben definierten Fragmente insertiert worden ist; Aminosäuresequenzvarianten der HRG-Sequenz oder ihrer oben definierten Fragmente, worin ein Aminosäurerest durch einen anderen Rest substituiert worden ist. HRG-Polypeptide umfassen jene, die vorherbestimmte, z.B. mittels ortsgerichteter Mutagenese oder PCR-Mutagenese eingeführte Mutationen enthalten, sowie HRG- Polypeptide aus anderen Tierspezies, wie z.B. Kaninchen-, Ratten-, Schweine-, nicht-menschliches Primaten-, Pferde-, Mäuse- und Schaf-HRG und Allele oder andere natürlich vorkommende Varianten der vorangehenden menschlichen Sequenzen; Derivate von HRG oder seiner oben definierten Fragmente, worin HRG oder seine Fragmente durch chemische, enzymatische oder andere geeignete Mittel kovalent durch eine Gruppierung substituiert worden sind, die nicht die natürlich vorkommende Aminosäure ist (beispielsweise eine nachweisbare Gruppierung, wie z.B. ein Enzym oder Radioisotop); Glykosylierungsvarianten von HRG (Insertion einer Glykosylierungsstelle oder Deletion einer beliebigen Glykosylierungsstelle durch Deletion, Insertion oder Substitution einer geeigneten Aminosäure); und lösliche HRG-Formen, wie z.B. HRG-GFD oder jene, denen eine funktionelle Transmembrandomäne fehlt.
Unter „isoliert" wird ein Ligand, wie z.B. HRG verstanden, der aus einer Komponente seiner natürlichen Umgebung identifiziert und abgetrennt und/oder gewonnen worden ist. Verunreinigende Komponenten seiner natürlichen Umgebung sind Materialien, die üblicherweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen für HRG stören, und können Proteine, Hormone und andere Substanzen umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen wird HRG gereinigt, und zwar 1) auf ein Ausmaß von mehr als 95 Gew.-% Protein, wie es mit dem Lowry-Verfahren oder einem anderen validierten Proteinbestimmungsverfahren gemessen wird, und insbesondere auf ein Ausmaß von mehr als 99 Gew.-%, (2) auf ein Ausmaß, das ausreicht, um zumindest 15 Reste der N-terminalen oder internen Aminosäuresequenz zu erlangen, und zwar durch Verwendung des besten im Handel erhältlichen Aminosäuresequenzierers, der zum Anmeldedatum dieser Erfindung vermarktet wird, oder 3) bis zur Homogenität mittels SDS-PAGE unter Verwendung von Coomassie-Blau oder, vorzugsweise, Silberfärbung. Ein isoliertes HRG umfasst HRG in situ in rekombinanten Zellen, da zumindest eine Komponente der natürlichen Umgebung von HRG nicht vorhanden sein wird. Ein isoliertes HRG umfasst HRG aus einer Spezies in einer rekombinanten Zellkultur einer anderen Spezies, da HRG unter diesen Umständen frei von Polypep tiden aus der Quelle sein wird. Für gewöhnlich wird jedoch HRG durch zumindest einen Reinigungsschritt hergestellt.
Gemäß dieser Erfindung ist eine HRG-Nucleinsäure RNA oder DNA, die mehr als zehn Basen enthält, die für ein biologisch oder antigenisch aktives HRG kodieren, die zur Nucleinsäuresequenz, die für ein derartiges HRG kodiert, komplementär ist oder an eine Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die für ein derartiges HRG kodiert und unter stringenten Bedingungen stabil an diese gebunden bleibt.
Vorzugsweise kodiert eine HRG-Nucleinsäure für ein Polypeptid, das zumindest 75 % Sequenzidentität, bevorzugter zumindest 80 %, noch bevorzugter zumindest 85 %, noch bevorzugter zumindest 90 % und insbesondere bevorzugt zumindest 95 % Sequenzidentität mit einer HRG-Sequenz teilt. Vorzugsweise enthält die hybridisierende HRG-Nucleinsäure zumindest 20, bevorzugter zumindest ungefähr 40 und insbesondere bevorzugt zumindest ungefähr 90 Basen.
Eine isolierte HRG-Nucleinsäure umfasst eine Nucleinsäure, die identifiziert und von zumindest einer verunreinigenden Nucleinsäure abgetrennt ist, mit der sie für gewöhnlich in der natürlichen Quelle der HRG-Nucleinsäure assoziiert ist. Eine isolierte HRG-Nucleinsäure liegt daher in einer anderen Form oder in einem anderen Milieu vor, als sie sich in der Natur findet. Jedoch umfasst eine isolierte HRG-Nucleinsäure eine HRG-Nucleinsäure in für gewöhnlich HRG-exprimierenden Zellen, wo sich die Nucleinsäure an einer Chromosomenstelle befindet, die sich von der natürlicher Zellen unterscheidet oder anderenfalls von einer DNA-Sequenz flankiert wird, die sich von der in der Natur auftretenden unterscheidet. Eine für HRG kodierende Nucleinsäure kann in spezifischen Hybridisierungstests verwendet werden, insbesondere jene Abschnitte einer für HRG kodierenden Sequenz, die nicht mit anderen bekannten DNA-Sequenzen hybridisieren. „Stringente Bedingungen" sind jene, die (1) niedrige Ionenstärke und hohe Temperatur für das Waschen einsetzen, beispielsweise 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat/0,1 % NaDodSO₄ bei 50 °C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel, wie z.B. Formamid einsetzen, beispielsweise 50 Vol.-% Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Ficoll, 0,1 Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42 °C; oder (3) 50 % Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 g/ml), 0,1 % SDS und 10 % Dextransulfat bei 42 °C mit Waschungen bei 42 °C in 0,2 × SSC und 0,1 % SDS einsetzen.
Der Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die zur Expression einer operabel gebundenen, kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die Kontrollsequenzen, die beispielsweise für Prokaryoten zweckdienlich sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosombindungsstelle und möglicherweise andere noch schlecht verstandene Sequenzen. Eukaryotische Zellen setzen bekanntermaßen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer ein.
Eine Nucleinsäure ist „operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine kodierende Sequenz gebunden, wenn sie so positioniert ist, das die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen bedeutet „operabel gebunden", dass die verbundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Falle eines Sekretionsleaders zusammenhängend sind sich in Lesephase befinden. Jedoch müssen Enhancer nicht zusammenhängend sein. Die Bindung wird durch Ligation an zweckdienlichen Restriktionsstellen erzielt. Falls derartige Stellen nicht vorhanden sind, dann werden synthetische Oligonucleotidadaptoren oder Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Ein „exogenes" Element ist hierin so definiert, das darunter eine Nucleinsäuresequenz verstanden wird, die für die Zelle fremd ist oder für die Zelle homolog ist, sich jedoch an einer Position in der Wirtszellen-Nucleinsäure befindet, an der sie für gewöhnlich nicht auftritt.
Die Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und Zellkultur" werden bei Verwendung hierin wechselseitig verwendet und alle derartigen Bezeichnungen umfassen die Nachkommenschaft. Folglich umfassen die Ausdrücke „Transformanten" und „transformierte Zellen" die gegenständliche Primärzelle und davon abstammende Kulturen ohne Berücksichtigung der Anzahl an Transfers. Es versteht sich außerdem, dass nicht alle Nachkommen hinsichtlich des DNA-Gehalts genau identisch sein müssen, und zwar aufgrund von beabsichtigten oder unbeabsichtigten Mutationen. Mutierte Nachkommen, welche dieselbe Funktion oder biologische Aktivität aufweisen, auf die hin in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurde, sind umfasst. Wo davon verschiedene Bezeichnungen beabsichtigt sind, gehen sie aus dem Kontext klar hervor.
„Plasmide" werden durch den Kleinbuchstaben „p" gekennzeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangehen oder nachfolgen. Die Anfangsplasmide hierin sind im Handel erhältlich, sind uneingeschränkt öffentlich erhältlich oder können aus derartigen erhältlichen Plasmiden nach veröffentlichen Verfahren konstruiert werden. Außerdem sind andere äquivalente Plasmide auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und dem Durchschnittsfachmann offensichtlich.
„Restriktionsenzymverdau" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Derartige Enzyme werden Restriktionsendonucleasen genannt und die Stelle, für die jedes Enzym spezifisch ist, wird Restriktionsstelle genannt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich und es werden ihre von den Anbietern ermittelten Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Anforderungen verwendet. Restriktionsenzyme werden üblicherweise durch Abkürzungen be zeichnet, die aus einem Großbuchstaben, gefolgt von anderen Buchstaben, die den Mirkoorganismus verkörpern, aus dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erhalten wurde, und einer anschließenden Zahl zusammengesetzt sind, die das jeweilige Enzym bezeichnen. Im Allgemeinen wird ungefähr 1 mg Plasmid oder DNA-Fragment mit ungefähr 1-2 Einheiten Enzym in ungefähr 20 ml Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden von Hersteller spezifiziert. Für gewöhnlich wird eine Inkubation von ungefähr 1 Stunde bei 37 °C verwendet, kann jedoch gemäß den Anleitungen des Anbieters variieren. Nach der Inkubation wird das Protein oder Polypeptid durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die verdaute Nucleinsäure aus der wässrigen Fraktion durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen. Dem Verdau mit einem Restriktionsenzym kann eine Hydrolyse der terminalen 5'-Phosphate mit bakterieller Alkalischer Phosphatase folgen, um die „Zirkularisierung" der beiden restriktionsgespaltenen Enden eines DNA-Fragments oder die Bildung einer geschlossenen Schleife zu verhindern, welche die Insertion eines weiteren DNA-Fragments an der Restriktionsstelle verhindern würde. Wenn nicht anders angegeben, folgt dem Verdau von Plasmiden keine 5'-terminate Dephosphorylierung. Verfahren und Reagenzien zur Dephosphorylierung sind die herkömmlichen, wie sie in den Abschnitten 1.56-1.61 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) beschrieben sind.
Unter „Gewinnung" oder „Isolierung" eines gegebenen DNA-Fragments aus einem Restriktionsverdau wird die Trennung des Verdaus an Polyacrylamid- oder Agarosegelen mittels Elektrophorese, Identifizierung des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität gegenüber jener von Marker-DNA-Fragmenten bekannten Molekulargewichts, Entfernung des das gewünschte Fragment enthaltenden Gelabschnitts und Trennung des Gels von DNA verstanden. Dieses Verfahren ist allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Lawn et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103-6114 (1981) und Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980).
Die „Northern-Analyse" ist ein Verfahren, das zur Identifizierung von RNA-Sequenzen verwendet wird, die an eine bekannte Sonde, wie z.B. an ein Oligonucleotid, DNA-Fragment, an eine cDNA oder ein Fragment davon oder an ein RNA-Fragment hybridisieren. Die Sonde ist mit einem Radioisotop, wie z.B. ³²P, oder durch Biotinylierung oder mit einem Enzym markiert. Die zu analysierende RNA wird üblicherweise elektrophoretisch an einem Agarose- oder Polyacrylamidgel getrennt, auf Nitrozellulose, Nylon oder eine andere geeignete Membran übertragen und mit der Sonde hybridisiert, und zwar unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, wie z.B. jene, die in den Abschnitten 7.39-7.52 von Sambrook et al., s.o., beschrieben sind.
„Ligation" bezieht sich auf den Vorgang der Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei Nucleinsäurefragmenten. Um DNA-Fragmente miteinander zu ligieren, müssen die Enden der DNA-Fragmente miteinander kompatibel sein. In manchen Fällen werden die Enden nach dem Endonucleaseverdau direkt kompatibel sein. Jedoch kann es erforderlich sein, die nach Endonucleaseverdau üblicherweise erzeugten überstehenden Enden zu stumpfen Enden umzusetzen, um sie für die Ligation kompatibel zu machen. Um die Enden abzustumpfen, wird die DNA in einem geeigneten Puffer für zumindest 15 Minuten bei 15 °C mit ungefähr 10 Einheiten des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I oder T4-DNA-Polymerase in Gegenwart der vier Desaxyribonucleotidtriphosphate behandelt. Die DNA wird dann durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation gereinigt. Die miteinander zu ligierenden DNA-Fragmente werden in ungefähr äquimolaren Mengen in die Lösung gegeben. Die Lösung wird auch ATP, Ligasepuffer und eine Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase mit ungefähr 10 Einheiten je 0,5 mg DNA enthalten. Falls die DNA in einen Vektor zu ligieren ist, wird der Vektor zuerst durch Verdau mit der/den geeigneten Restriktionsendonuclease(n) linearisiert. Das linearisierte Fragment wird dann mit bakterieller Alkalischer Phosphatase oder Kälberdarm-Phosphatase behandelt, um die Selbst-Ligation während dem Ligationsschritt zu verhindern.
Unter „Herstellung" von DNA aus Zellen wird das Isolieren der Plasmid-DNA aus einer Kultur der Wirtszellen verstanden. Herkömmlich verwendete Verfahren zur DNA-Herstellung sind Plasmidherstellungen im großen und kleinen Maßstab, die in den Abschnitten 1.25-1.33 von Sambrook et al., s.o., beschrieben sind. Nach der Herstellung der DNA kann sie mittels Verfahren gereinigt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind, wie z.B. mit jenen, die im Abschnitt 1.40 von Sambrook et al., s.o., beschrieben sind.
„Oligonucleotide" sind kurzkettige, einzel- oder doppelsträngige Polydesoxynucleotide, die durch bekannte Verfahren (wie z.B. Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung von Festphasentechniken, wie sie beispielsweise in der am 4. Mai 1988 veröffentlichten EP 266.032 beschrieben sind, oder über Desoxynucleosid-H-phosphonat-Zwischenprodukte, wie von Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399-5407 (1986) beschrieben wird) chemisch synthetisiert werden. Sie werden dann an Polyacrylamidgelen gereinigt.
Die Technik der „Polymerasekettenreaktion" oder „PCR" bezieht sich bei Verwendung hierin im Allgemeinen auf ein Verfahren, worin geringste Mengen eines speziellen Stücks von Nucleinsäure, RNA und/oder DNA wie im am 28. Juli 1987 erteilten US-Patent 4.683.195 beschrieben amplifiziert werden. Im Allgemeinen müssen Sequenzinformationen über die Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus verfügbar sein, so dass Oligonucleotidprimer konstruiert werden können; diese Primer sind hinsichtlich der Sequenz den entgegengesetzten Strängen des zu amplifizierenden Templats ähnlich oder damit identisch. Die 5'-terminalen Nucleotide der beiden Primer können mit den Enden des amplifizierten Materials übereinstimmen. PCR kann verwendet werden, um spezielle RNA-Sequenzen, spezielle DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA und aus zellulärer Gesamt-RNA transkribierte cDNA, Bakteriophagen- oder Plasmidsequenzen usw. zu amplifizieren. Siehe allgemein Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987); Erlich (Hrsg.), PCR Technology, Stockton Press, NY (1989). Wie hierin verwendet, wird PCR als eines der Beispiele, jedoch nicht als das einzige Beispiel eines Nucleinsäurepolymerasereaktionsverfahrens zum Amplifizieren einer NucleinsäureTestprobe betrachtet, das die Verwendung einer bekannten Nucleinsäure (DNA oder RNA) als Primery verwendet und eine Nucleinsäurepolymerase einsetzt, um ein spezielles Stück Nucleinsäure zu amplifizieren oder zu erzeugen oder ein spezielles Stück Nucleinsäure zu erzeugen, das zu einer bestimmten Nucleinsäure komplementär ist.
Der „HRG-Tyrosin-Autophosphorylierungstest" zum Nachweis der Gegenwart oder Bioaktivität von HRG-Liganden kann verwendet werden, um die Reinigung eines Liganden für die HER2- und HER3-Rezeptoren zu überwachen. Dieser Test basiert auf der Annahme, dass ein spezifischer Ligand für, den Rezeptor die Autophosphorylierung des Rezeptors stimulieren wird, und zwar analog zu EGF und seiner Stimulierung der EGF-Rezeptor-Autophosphorylierung. Siehe Sadich et al., Anal. Biochem. 235, 207-214 (1996). MDA-MB-453-Zellen oder MCF7-Zellen, die hohe Mengen an p185^HER2-Rezeptoren, jedoch vernachlässigbare Mengen an menschlichen EGF-Rezeptoren enthalten, wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD (ATCC-Nr. HTB-131) erhalten und in Gewebekultur mit 10 % Fötalkälberserum in DMEM/Hams F12- (1:1-) Medium gehalten. Für den Test wurden die Zellen trypsinisiert und zu 150.000 Zellen/Napf in 24-Napf-Platten (Costar) ausplattiert. Nach der Inkubation mit Serum enthaltendem Medium über Nacht wurden die Zellen vor dem Test für 2-18 Stunden in serumfreies Medium gegeben. 100 μl-Aliquote der Testproben wurden jedem Napf zugegeben. Die Zellen wurden für 5-30 Minuten (typischerweise 30 Minuten) bei 37 °C inkubiert und das Medium entfernt. Die Zellen in jedem Napf wurden mit 100 μl SDS-Gel-Denaturierungspuffer (SEPROSOL, Enpotech Inc.) behandelt und die Platten bei 100 °C für 5 Minuten erhitzt, um die Zellen aufzulösen und die Proteine zu denaturieren. Aliquote aus jedem Napf wurden an 5-bis 20%igen Gradienten-SDS-Gelen (NOVEX, Encinitas, CA) nach den Anleitungen des Herstellers der Elektrophorese unterzogen. Nachdem die Farbstofffront das untere Ende des Gels erreicht hatte, wurde die Elektrophorese gestoppt und ein Blatt PVDF-Membran (PROBLOTT, ABI) auf das Gel gelegt und die Proteine in einer Blotting-Kammer (BioRad) bei 200 mA für 30-60 Minuten aus dem Gel auf die Mem bran überfragen. Nach dem Blotten wurden die Membranen mit 0,1 % TWEEN-20-Tensidpuffer mit 5 % BSA enthaltender, TRIS-gepufferter Salzlösung für 2-18 Stunden inkubiert, um unspezifische Bindung zu blockieren, und dann mit einem Maus-Anti-Phosphotyrosin-Antikörper (Upstate Biological Inc., NY) behandelt. Anschließend wurden die Membran-Blots mit an Alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-Anti-Maus-Antikörper behandelt. Die Gele wurden unter Verwendung des PROTOBLOT-Systems von Promega entwickelt. Nach dem Trocknen der Membranen wurde die Dichte der p185^HER2 entsprechenden Banden in jeder Proben-Lane mit einem an einen Macintosh-Computer angeschlossenen SCANJET Plus-Scanner von Hewlett Packard quantifiziert. Die Anzahl an Rezeptoren pro Zelle in den MDA-MB-453-Zellen ist derart, dass unter diesen experimentellen Bedingungen das p185^HER2-Protein das hauptsächliche markierte Protein ist.
Die „Protein-Mikrosequenzierung" wurde auf Basis der folgenden Verfahren zustande gebracht. Die Proteine aus dem letzten HPLC-Schritt wurden entweder durch automatisierten Edman-Abbau mit einem Gasphasensequenzierer von Applied Biosystems, Modell 470A, der mit einem 120 A PTN-Aminosäureanalysator ausgestattet war, direkt sequenziert oder nach Verdau mit verschiedenen Chemikalien oder Enzymen sequenziert. PTH-Aminosäuren wurden unter Verwendung des CHROMPERFECT-Datensystems (Justice Innovations, Palo Alto, CA) integriert. Die Sequenzinterpretation wurde an einem Digital Equipment Corporation Computer VAX 11/785 wie beschrieben durchgeführt (Henzel et al., J. Chromatography 404, 41-52 (1987)). In manchen Fällen wurden Aliquote der HPLC-Fraktionen der Elektrophorese an 5- bis 20%igen Polyacrylamidgelen unterzogen, elektrisch auf eine PVDF-Membran (PROTOBLOT, ABI, Foster City, CA) übertragen und mit Coomassie-Brilliant-Blau gefärbt (P. Matsudaira, J. Biol. Chem. 262, 10035-10038 (1987)). Das spezifische Protein wurde für die N-terminate Sequenzierung aus dem Blot herausgeschnitten. Um interne Proteinsequenzen zu bestimmen, wurden HPLC-Fraktionen unter Vakuum (SPEEDVAC) getrocknet, in geeigneten Puffern resuspendiert und mit Bromcyan, dem Lysin-spezifischen Enzym Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) oder Asp-N (Boehringer Mannheim, Indinanapolis, Ind.) verdaut.
Nach dem Verdau wurden die resultierenden Peptide als Gemisch sequenziert oder wurden vor der oben beschriebenen Sequenzierung mittels HPLC an einer mit einem Propanolgradienten in 0,1 % TFA entwickelten C4-Säule aufgetrennt.
„Antikörper" (Abs) und „Immunglobuline" (Igs) sind Glykoproteine, welche dieselben strukturellen Eigenschaften aufweisen. Obgleich Antikörper eine Bindungsspezifität gegen ein spezielles Antigen aufweisen, umfassen Immunglobuline sowohl Antikörper, als auch andere antikörperartige Moleküle, denen eine Antigenspezifität fehlt. Polypeptide der letzteren Art werden beispielsweise in niedrigen Konzentrationen vom Lymphsystem und in erhöhten Mengen von Myelomen produziert.
Der Papainverdau von Antikörpern produziert zwei identische Antigenbindungsfragmente, die „Fab"-Fragmente genannt werden, die beide eine einzelne Antigenbindungsstelle und ein „Fc"-Restfragment aufweisen, dessen Name seine Fähigkeit widerspiegelt, leicht zu kristallisieren. Die Pepsinbehandlung liefert ein F(ab')₂-Fragment, das zwei antigenkombinierende Stellen aufweist und nach wie vor in der Lage ist, Antigen zu vernetzen.
„Fv" ist ein Antikörper-Minimalfragment, das eine vollständige Antigenerkennungs- und Bindungsstelle enthält. Diese Region besteht aus einem Dimer aus einer Schwerkette und einer variablen Leichtkettendomäne in enger, nicht-kovalenter Verbindung. Es ist diese Konfiguration, in der die drei hypervariablen Regionen jeder variablen Domäne wechselwirken, um eine Antigenbindungsstelle an der Oberfläche des V_H-V_L-Dimers zu definieren. Zusammen verleihen die sechs hypervariablen Domänen dem Antikörper die Antigenbindungsspezifität. Jedoch ist sogar eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines Fv, das lediglich drei für ein Antigen spezifische hypervariable Regionen umfasst) fähig, Antigen zu erkennen und zu binden, obgleich bei einer niedrigeren Affinität als die vollständige Bindungsstelle.
Das Fab-Fragment enthält außerdem die konstante Domäne der Leichtkette und die erste konstante Domäne (CH1) der Schwerkette. Fab'-Fragmente unterscheiden sich von Fab-Fragmenten durch die Anfügung einiger Reste am Carboxylterminus der Schwerketten-CH1-Domäne, einschließlich eines oder mehrerer Cysteinreste aus der Gelenkregion des Antikörpers. Fab'-SH ist hierin die Bezeichnung für Fab', bei dem der/die Cysteinrest(e) der konstanten Domäne eine freie Thiolgruppe trägt/tragen. F(ab')₂-Antikörperfragmente wurden ursprünglich als Paare von Fab'-Fragmenten produziert, die Gelenk-Cysteine zwischen ihnen aufweisen. Andere chemische Kopplungen von Antikörperfragmenten sind ebenfalls bekannt.
Die „Leichtketten" von Antikörpern (Immunglobulinen) aus jeglicher Vertebratenspezies können einer von zwei eindeutig zu unterscheidenden Klassen zugeordnet werden, die auf Basis der Aminosäuresequenzen ihrer konstanten Domänen Kappa (κ) und Lambda (λ) genannt werden.
In Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz der konstanten Domäne ihrer Schwerketten können Immunglobuline verschiedenen Klassen zugeordnet werden. Es gibt fünf Hauptklassen von Immunglobulinen: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere davon können weiter in Unterklassen (Isotypen) unterteilt werden, z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2. Die konstanten Schwerkettendomänen, die den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen entsprechen, werden α, δ, ε, γ bzw. μ genannt. Die Untereinheitenstrukturen und dreidimensionalen Konfigurationen der verschiedenen Immunglobulinklassen sind wohlbekannt.
Der Ausdruck „Antikörper" wird hierin im weitesten Sinne verwendet und umfasst im Speziellen monoklonale Antikörper (einschließlich monoklonale Antikörper voller Länge), polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper) und Antikörperfragmente, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen.
„Antikörperfragmente" umfassen einen Abschnitt eines Antikörpers voller Länge, im Allgemeinen die antigenbindende oder variable Domäne davon. Beispiele von Antikörperfragmenten umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente; Diabodies; li neare Antikörper; Einzelketten-Antikörpermoleküle; und multispezifische Antikörper, die aus Antikörperfragmenten gebildet werden.
Der Ausdruck „monoklonaler Antikörper" bezieht sich bei Verwendung hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erlangt wurde, d.h. die einzelnen, die Population umfassenden Antikörper sind identisch mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind höchst spezifisch und richten sich gegen eine einzige Antigenstelle. Darüber hinaus richtet sich jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzige Determinante (Epitop) am Antigen im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind. Der Modifikator „monoklonal" kennzeichnet den Charakter des Antikörpers dahingehend, dass er aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erlangt wurde und ist nicht dahingehend auszulegen, als dass die Produktion des Antikörpers irgendein spezielles Verfahren erfordert. Beispielsweise können gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende monoklonale Antikörper mit dem erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) beschriebenen Verfahren hergestellt werden oder können durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567). Die „monoklonalen Antikörper" können außerdem beispielsweise aus Phagen-Antikörperbibliotheken unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) und Marks et al., J. Mol.-Biol. 222, 581-597 (1991) beschriebenen Techniken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen im Speziellen „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), bei denen ein Abschnitt der Schwer- und/oder Leichtkette homolog zu oder identisch mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die aus einer bestimmten Spezies stammen oder die einer bestimmten Antiköperklasse oder Unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) homolog zu oder identisch mit entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die aus einer anderen Spezies stammen oder einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, sowie Frag mente derartiger Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (US-Patent Nr. 4.816.567; und Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)).
„Humanisierte" Formen nicht-menschlicher Antikörper (z.B. Maus-Antikörper) sind chimäre Antikörper, die eine von einem nicht-menschlichen Immunglobulin stammende Minimalsequenz enthalten. Humanisierte Antikörper sind größtenteils menschliche Immunglobuline (Empfängerantikörper), in denen Reste hypervariabler Regionen des Empfängers durch Reste hypervariabler Regionen aus einer nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie z.B. Maus, Ratte, Kaninchen oder nicht-menschlichen Primaten mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen sind Gerüstregion- (FR-) Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die im Empfängerantikörper oder Spenderantikörper nicht vorkommen. Diese Modifizierungen werden vorgenommen, um die Leistungsfähigkeit des Antikörper weiter zu verfeinern. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der hypervariablen Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FRs jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst gegebenenfalls außerdem zumindest einen Abschnitt einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins. Für weitere Einzelheiten siehe Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichman et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992).
„Einzelketten-Fv"- oder „sFv"-Antikörperfragmente umfassen die V_H- und V_L-Antikörperdomänen, worin diese Domänen in einer einzigen Polypeptidkette vorliegen. Im Allgemeinen umfassen Fv-Polypeptide weiters einen Polypeptidlinker zwischen den V_H- und V_L-Domänen, der es dem sFv ermöglicht, die gewünschte Struktur für die Antigenbindung auszubilden. Für einen Überblick über sFV siehe Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg und Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 269-315 (1994).
Der Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerkettendomäne (V_H) umfassen, die mit einer variable Leichtkettendomäne (V_L) in derselben Polypeptidkette verbunden ist (V_H-V_L). Durch Verwenden eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen an derselben Kette zu ermöglichen, werden die Domänen gezwungen, sich mit komplementären Domänen einer anderen Kette zu paaren und zwei Antigenbindungsstellen auszubilden. Diabodies werden ausführlicher beispielsweise in EP 404.097 ; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993) beschrieben.
Der Ausdruck „lineare Antikörper" bezieht sich bei Verwendung in der gesamten Anmeldung auf die in Zapata et al., Protein Eng. 8(10), 1057-1062 (1995) beschriebenen Antikörper. Zusammenfassend umfassen diese Antikörper ein Paar von Tandem-Fd-Segmenten (V_H-C_H1-V_H-C_H1), die ein Paar von Antigenbindungsregionen bilden. Lineare Antikörper können bispezifisch oder monospezifisch sein.
II. Verwendung und Herstellung von HRG-Sequenzen
H. Herstellung von HRG-Sequenzen, einschließlich Varianten
Das bei der Herstellung einer HRG-Sequenz einzusetzende System hängt üblicherweise von der jeweiligen gewählten HRG-Sequenz ab. Wenn die Sequenz ausreichend klein ist, kann HRG durch In-vitro-Polypeptidsyntheseverfahren hergestellt werden. Am häufigsten wird HRG jedoch in rekombinanter Zellkultur unter Verwendung der unten beschriebenen Wirt-Vektor-Systeme hergestellt. Ein geeignetes HRG umfasst jegliches biologisch aktive und antigenisch aktive HGR.
Im Allgemeinen werden Säugetier-Wirtszellen eingesetzt und derartige Wirte können Posttranslationssysteme zur Prozessierung von HRG-Präprosequenzen in der üblichen Weise enthalten oder auch nicht. Falls die Wirtszellen derartige Systeme enthalten, dann ist es möglich, natürliche Subdomänenfragmente, wie z.B. HRG-GFD aus den Kulturen zu gewinnen. Falls nicht, dann kann die richtige Prozessierung durch Transformieren der Wirte mit dem/den erforderlichen Enzym(en) erreicht werden oder indem sie einem In-vitro-Verfahren zugeführt werden. Jedoch ist es nicht notwendig, Zellen mit den vollständigen Präpro- oder Strukturgenen für ein gewähltes HRG zu transformieren, wenn nur die Produktion von Fragmenten von HRG-Sequenzen, wie z.B. einer HRG-GFD gewünscht wird. Beispielsweise wird ein Startcodon an das 5'-Ende der für eine HRG-GFD kodierenden DNA ligiert und diese DNA verwendet, um Wirtszellen zu transformieren und das Produkt direkt als die Met-N-terminale Form zu exprimieren (falls erwünscht, kann das fremde Met in vitro oder durch endogene N-terminate Demethionylasen entfernt werden). Alternativ dazu wird HRG-GFD als Fusion mit einer von der Wirtszelle erkannten Signalsequenz exprimiert, die die reife HRG-GFD wie unten weitergehend beschrieben prozessiert und sekretiert. Aminosäuresequenzvarianten der nativen HRG-GFD-Sequenzen werden in derselben Weise produziert.
Zwischen dem ersten N-terminalen reifen Rest und dem ersten N-terminalen Rest der HRG-GFD-Sequenz lokalisierte HRG-Sequenzen, die HRG-NTD genannt werden, können zumindest teilweise als unkonventionelle Signalsequenz oder als ein normal zirkulierender Träger/Vorläufer für HRG-GFD mit einzigartiger biologischer Aktivität agieren. HRG-NTD wird in derselben Weise wie das Molekül voller Länge produziert, jedoch aus der Expression von DNA, in der ein Stopcodon am C-Terminus von HRG-NTD lokalisiert ist. Außerdem werden HRG-Varianten aus für Protein kodierender DNA exprimiert, in der sich die GFD- sowie NTD-Domänen in ihrer richtigen Orientierung befinden, jedoch eine Aminosäureinsertion, Deletion oder Substitution an der GFD-NTD-Spaltstelle (in der Sequenz VKC lokalisiert) enthalten, welche die proteolytische Spaltung der NTD-GFD-Verbindungsstelle in vivo verhindert und worin ein Stopcodon am 3'-Ende der für die GFD kodierenden Sequenz positioniert ist. In einem Beispiel dieser Gruppe von Varianten (HRG-NTDXGFD genannt) wird (1) der in der NTD-GFD-Verbindungssequenz VKC vorhandene Lysinrest deletiert oder (vorzugsweise) durch einen anderen Rest substituiert, der nicht Arginyl ist, wie z.B. Histidyl, Alanyl, Threonyl oder Seryl, und (2) ein Stopcodon in die Sequenz RCT oder RCQ anstelle von Cysteinyl oder Threonyl (für HRG-α) oder Glutaminyl (für HRG-β) eingeführt.
Ein bevorzugter HRG-α-Ligand mit Bindungsaffinität für p185^HER2 umfasst die Aminosäuren 226-265 aus 1A-D. Dieser HRG-α-Ligand kann außerdem bis zu 1-20 zusätzliche Aminosäuren umfassen, die der Aminosäure 226 vorangehen, und 1-20 Aminosäuren, die der Aminosäure 265 folgen. Ein bevorzugter HRG-β-Ligand mit Bindungsaffinität für p185^HER2 umfasst die Aminosäuren 226-265 aus 2A-E. Dieser HRG-β-Ligand kann bis zu 1-20 zusätzliche Aminosäuren umfassen, die der Aminosäure 226 vorangehen, und 1-20 Aminosäuren, die der Aminosäure 265 folgen.
Wie oben erwähnt, sind andere HRG-Sequenzen, die gemäß dieser Erfindung herzustellen sind, jene der GFD. Diese werden in vitro synthetisiert oder in rekombinanter Zellkultur produziert. Diese werden am kostengünstigsten in Hefe oder E. coli durch Sekretion unter der Kontrolle eines HRG-heterologen Signals wie unten beschrieben produziert, obgleich die Herstellung in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetierproteinsignals, wie z.B. jenem von tPA, UK oder eines sekretierten Virusproteins, ebenfalls vorgesehen ist. Die GFD kann die Sequenz eines nativen HRG sein oder kann eine Variante davon sein, wie unten beschrieben wird. GFD-Sequenzen umfassen jene, in denen ein oder mehrere Reste aus einem Element der EGF-Familie in oder auf die GFD-Sequenz substituiert werden.
Ein weiteres HRG ist eines, das die GFD und die Sequenz zwischen dem C-Terminus der GFD und dem N-Terminus der Transmembrandomäne enthält (wobei letztere die C-terminale Spaltdomäne oder CTC genannt wird). In dieser Variante (HRG-GFD-CTC) liegt das DNA-Startcodon am 5'-Ende der HRG-heterologen Si gnalsequenz oder dem 5'-Ende der für GFD kodierenden Region benachbart vor, und ein Stopcodon findet sich anstelle von einem der ersten ungefähr 1 bis 3 Reste der extrazellulären Domäne (ECD) oder ersten ungefähr 1-2 Reste der Transmembrandomäne. Außerdem sind in einigen HRG-GFD-CTC-Varianten die Codons in der GFD-CTC-Proteolysestelle durch Substitution, Insertion oder Deletion modifiziert. Die GFD-CTC-Proteolysestelie ist die Domäne, die den C-terminalen GFD-Rest und ungefähr 5 Reste N- und 5 Reste C-terminal von diesem Rest enthält. Es ist bekannt, dass die Met-227-terminalen und Val-229-terminalen HRG-α-GFD biologisch aktiv sind. Der C-Terminus für HRG-α-GFD kann Met-227, Lys-228, Val-229, Gln-230, Asn-231 oder Gln-232 sein und kann für HRG-β-GFD Met-226, Ala-227, Ser-228, Phe-229, Trp-230 oder Lys231/Ser231 sein. Der native C-Terminus kann leicht durch C-terminale Sequenzierung bestimmt werden, obgleich es nicht entscheidend ist, dass HRG-GFD den nativen Terminus aufweisen, solange die GFD-Sequenz die gewünschte Aktivität besitzt. In manchen Ausführungsformen von HRG-GFD-CTC-Varianten wird/werden die Aminosäureänderung(en) im CTC auf ihre Fähigkeit hin gescreent, der Proteolyse in vitro zu widerstehen und die für die Erzeugung von HRG-GDF verantwortliche Protease zu hemmen.
HRG-ECD-Varianten können hergestellt werden, indem ein Stopcodon an derselben Stelle wie für HRG-GFD-CTC-Varianten bereitgestellt wird. HRG-ECD kann irgendeine oder mehrere der oben im Zusammenhang mit ihren Subfragmenten beschriebenen Varianten umfassen, z.B. die GFD-CTC-Varianten, die CTC-Proteolysestelle-Modifizierungen enthalten.
Falls gewünscht wird, die längeren HRG-Polypeptide herzustellen und die 5'- oder 3'-Enden des gegebenen HRG hierin nicht beschrieben sind, kann es notwendig sein, Nucleinsäuren herzustellen, bei denen die fehlenden Domänen durch homologe Regionen aus vollständigeren NRG-Nucleinsäuren bereitgestellt werden. Alternativ dazu können die fehlenden Domänen durch Sondieren von Bibliotheken unter Verwendung der in den Figuren offenbarten DNAs oder ihrer Fragmente erlangt werden.
A. Isolierung von für Heregulin kodierender DNA
Die für HRG kodierende DNA kann aus jeglicher cDNA-Bibliothek erlangt werden, die aus Gewebe hergestellt wurde, von dem angenommen wird, das es HRG-mRNA aufweist und diese in einem nachweisbaren Ausmaß exprimiert. Ein HRG-α-Gen kann folglich aus einer Genom-Bibliothek erlangt werden. Ähnliche Verfahren können zur Isolierung anderer HRG-Gene verwendet werden, wie z.B. für HRG-β1, HRG-β2 oder HRG-β3 kodierende Gene.
Bibliotheken werden mit Sonden gescreent, die konstruiert sind, um das Gen von Interesse oder das von ihm kodierte Protein zu identifizieren. Für cDNA-Expressionsbibliotheken umfassen geeignete Sonden monoklonale und polyklonale Antikörper, die HRG-α spezifisch erkennen und binden; Oligonucleotide einer Länge von ungefähr 20-80 Basen, die für bekannte oder mutmaßliche Abschnitte von HRG-α-cDNA aus derselben oder einer anderen Spezies kodieren; und/oder komplementäre oder homologe cDNAs oder Fragmente davon, die für dasselbe oder ein ähnliches Gen kodieren. Geeignete Sonden für das Screenen von genomischen DNA-Bibliotheken umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Oligonucleotide; cDNAs oder Fragmente davon, die für dasselbe oder ein ähnliches Gen kodieren; und/oder homologe genomische DNAs oder Fragmente davon. Das Screening der cDNA oder genomischen Bibliothek mit der gewählten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden, wie sie in den Kapiteln 10-12 von Sambrook et al., s.o., beschrieben sind.
Ein alternatives Mittel zur Isolierung des für HRG-α kodierenden Gens ist die Verwendung des Polymerasekettenreaktions (PCR-) Verfahrens, wie es im Abschnitt 14 von Sambrook et al., s.o., beschrieben ist. Dieses Verfahren erfordert die Verwendung von Oligonucleotidsonden, die an HRG-α hybridisieren. Strategien zur Auswahl von Oligonucleotiden werden unten beschrieben.
Ein weiteres alternatives Verfahren zum Erlangen des Gens von Interesse ist seine chemische Synthese unter Verwendung von einem der in Engels et al., Angew. Chem. Ed. Engl. 28, 716-734 (1989) beschriebenen Verfahren. Diese Verfahren umfassen Triester-, Phosphit-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren, PCR- und andere Autoprimer-Verfahren, sowie Oligonucleotidsynthesen auf festen Trägern. Diese Verfahren können verwendet werden, falls die gesamte Nucleinsäuresequenz des Gens bekannt ist oder die Sequenz der zum kodierenden Strang komplementären Nucleinsäure verfügbar ist, oder man kann alternativ dazu, falls die Ziel-Aminosäuresequenz bekannt ist, mögliche Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung von bekannten und bevorzugten kodierenden Resten für jeden Aminosäurerest ableiten.
Ein bevorzugtes Verfahren zur praktischen Umsetzung dieser Erfindung ist die Verwendung von sorgfältig ausgewählten Oligonucleotidsequenzen, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Geweben, vorzugsweise menschlichen Brust-, Darm-, Speicheldrüsen-, Plazenta-, Fötus-, Hirn- und Karzinom-Zelllinien zu screenen. Andere biologische Quellen von DNA, die für einen Heregulin-artigen Liganden kodieren, umfassen andere Säugetiere und Vögel. Unter den bevorzugten Säugetieren befinden die folgenden Ordnungen: Rind, Schaf, Maus und Nager.
Die als Sonden gewählten Oligonucleotidsequenzen sollten eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, so dass falsch-positive Ergebnisse minimiert werden. Die eigentliche(n) Nucleinsäuresequenz(en) kann/können beispielsweise auf konservierten oder höchst homologen Nucleinsäuresequenzen oder Regionen von HRG-α beruhen. Die Oligonucleotide können an einer oder mehreren Positionen degeneriert sein. Die Verwendung degenerierter Oligonucleotide kann von besonderer Bedeutung sein, wo eine Bibliothek aus einer Spezies gescreent wird, bei der die bevorzugte Codonverwendung in dieser Spezies nicht bekannt ist. Das Oligonucleotid muss markiert sein, so dass sie bei Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen werden kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren ist die Verwendung von ³²P-markiertem ATP mit Polynucleotidkinase, wie auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt ist, um das Oligonucleotid radioaktiv zu markieren. Jedoch können andere Verfahren verwendet werden, um das Oligonucleotid zu markieren, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Biotinylierung und Enzymmarkierung.
Von besonderen Interesse ist eine HRG-α-Nucleinsäure, die für ein Polypeptid voller Länge kodiert. In manchen bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Nucleinsäuresequenz die native HRG-α-Signalsequenz. Eine Nucleinsäure, welche die gesamte für das Protein kodierende Sequenz aufweist, wird durch Screenen ausgewählter cDNA- oder Genom-Bibliotheken und, falls erforderlich, unter Verwendung herkömmlicher Primerextensionsverfahren erlangt, die im Abschnitt 7.79 von Sambrook et al., s.o., beschrieben sind, um Vorläufer und Prozessierungszwischenprodukte der mRNA nachzuweisen, die möglicherweise nicht in cDNA revers-transkribiert worden ist.
Für HRG-α aus 1A-1D kodierende DNA kann verwendet werden, um über Hybridisierung unter Einsatz der oben besprochenen Verfahren DNA zu isolieren, die für den analogen Liganden aus einer anderen Spezies kodiert. Die bevorzugten Tiere sind Säugetiere, insbesondere Rind, Schaf, Pferd, Katze, Hund und Nager und im Spezielleren Ratten, Mäuse und Kaninchen.
B. Aminosäuresequenzvarianten von Heregulin
Aminosäuresequenzvarianten von HRG werden durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in HRG-DNA oder durch In-vitro-Synthese des gewünschten HRG-Polypeptids hergestellt. Derartige Varianten umfassen beispielsweise Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten in der für menschliche HRG-Sequenzen dargestellten Aminosäuresequenz. Jegliche Kombination von Deletion, Insertion und Substitution kann vorgenommen werden, um zum endgültigen Konstrukt zu gelangen unter der Voraussetzung, dass das endgültige Konstrukt die gewünschten Eigenschaften besitzt. Ausgeschlossen vom Schutzumfang dieser Erfin dung sind HRG-Varianten oder Polypeptidsequenzen, die nicht neu sind und sich nicht in nahe liegender Weise aus dem Stand der Technik ergeben. Die Aminosäureänderungen können außerdem posttranslationelle Prozesse von HRG-α verändern, wie z.B. die Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen, Veränderung der Membranverankerungseigenschaften, Veränderung der intrazellulären Lokalisation von HRG, indem die Leadersequenz des nativen HRG durch Insertieren, Deletieren oder anderweitig beeinflusst wird, oder die Modifizierung seiner Empfindlichkeit gegen proteolytische Spaltung.
Die HRG-Sequenz kann proteolytisch verarbeitet werden, um eine Reihe von HRG-Fragmenten zu erzeugen. HRG-GFD-Sequenzen von HRG-α enthalten alle die Aminosäuresequenz zwischen dem HRG-α-Cystein 226 und Cystein 265. Der Aminoterminus eines HRG-α-Fragments kann aus der Spaltung jeglicher Peptidbindung zwischen Alanin 1 und Cystein 226 resultieren, vorzugsweise in Nachbarschaft zu einem Arginin, Lysin, Valin oder Methionin und insbesondere bevorzugt zwischen Methionin 45 und Serin 46. Der Carboxyterminus eines HRG-α-Fragments kann aus der Spaltung jeglicher Peptidbindung zwischen Cystein erfolgen, vorzugsweise in Nachbarschaft zu einem Arginin, Lysin, Valin oder Methionin und insbesondere bevorzugt zwischen Lysin 272 und Valin 273, zwischen Lysin 278 und Alanin 279 oder zwischen Lysin 285 und Arginin 286. Die resultierenden HRG-α-Liganden, die aus einer derartigen Verarbeitung resultieren, sind bevorzugte Liganden.
HRG-β-GFDs sind analog zu jenen, die oben für HRG-α-GFDs besprochen wurden. Jede HRG-β-GFD enthält das Polypeptidsegment von Cystein 212 bis Cystein 251 aus 2A-E. Der Aminoterminus eines HRG-β1-Fragments kann aus der Spaltung jeglicher Peptidbindung zwischen Alanin 1 und Cystein 212 resultieren, vorzugsweise in Nachbarschaft zu einem Arginin, Lysin, Valin oder Methionin und insbesondere bevorzugt zwischen Methionin 31 und Serin 32. Der Carboxyterminus eines HRG-β1-Fragments kann aus der Spaltung jeglicher Peptidbindung zwischen Cystein 251 aus 2A-2E resultieren, vorzugsweise in Nachbarschaft zu einem Arginin, Lysin, Valin oder Methionin und insbesondere bevorzugt zwischen Valin 255 und Methionin 256, zwischen Lysin 261 und Histidin 262, zwischen Lysin 276 und Alanin 277 oder zwischen Lysin 301 und Threonin 302. Die resultierenden HRG-β1-Liganden, die aus einer derartigen proteolytischen Verarbeitung resultieren, gehören zu den bevorzugten Liganden. Gleichermaßen kann die Verarbeitung zur Herstellung bevorzugter Fragment-Liganden von HRG-β2 auf Basis der 3A-3E und von HRG-β3 auf Basis der 4A-4C durch Spalten von HRG-Sequenzen aus 3A-3E und 4A-4C, vorzugsweise in Nachbarschaft zu einem Arginin, Lysin, Valin oder Methionin erzielt werden.
Bei der Konstruktion von HRG-Aminosäuresequenzvarianten hängt der Ort der Mutationsstelle und die Beschaffenheit der Mutation üblicherweise von der/den zu modifizierenden HRG-Eigenschaft(en) ab. Die Stellen für die Mutation können einzeln oder hintereinander modifiziert werden, z.B. durch (1) Substituieren, zunächst durch konservativ gewählte Aminosäuren und dann durch drastischer gewählte Aminosäuren in Abhängigkeit von den erzielten Ergebnissen, (2) Deletieren des Ziel-Rests oder (3) Insertieren von Resten anderer Rezeptorliganden in Nachbarschaft zur Stelle am gewählten Ort.
Ein zweckdienliches Verfahren zur Identifizierung gewisser Reste oder Regionen des HRG-Polypeptids, die bevorzugte Orte für die Mutagenese sind, wird „Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt, wie von Cunningham und Wells, Science 244, 1081-1085 (1989) beschrieben wird. Hier wird ein Rest oder eine Gruppe von Ziel-Resten identifiziert (z.B. geladene Reste, wie z.B. Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (insbesondere bevorzugt Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der umgebenden wässrigen Umgebung im Inneren oder außerhalb der Zelle zu bewirken. Jene Domänen, die eine funktionelle Sensibilität auf die Substitutionen zeigen, werden dann verfeinert, indem weitere oder andere Varianten eingeführt oder die Substitutionsstellen durch diese ersetzt werden. Folglich muss die Beschaffenheit der Mutation an sich nicht vorherbestimmt sein, während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzvariation vorherbestimmt ist. Um beispielsweise die Lei stungsfähigkeit einer Mutation an einer gegebenen Stelle zu optimieren, kann eine Ala-Scanning- oder Zufallsmutagenese am Ziel-Codon oder an der Ziel-Region durchgeführt werden, wobei die exprimierten HRG-Varianten auf optimale Kombination der gewünschten Aktivität hin gescreent werden.
Es gibt zwei Hauptvariablen bei der Konstruktion von Aminosäuresequenzvarianten: der Ort der Mutationsstelle und die Beschaffenheit der Mutation. Diese sind Varianten der HRG-Sequenz und können natürlich vorkommende Allele (die keine Manipulation der HRG-DNA erfordern) oder vorherbestimmte mutierte, durch Mutieren der DNA hergestellte Formen darstellen, um entweder zu einem Allel oder zu einer Variante zu gelangen, die in der Natur nicht vorkommt. Im Allgemeinen hängt der Ort und die Beschaffenheit der gewählten Mutation von der zu modifizierenden HRG-Eigenschaft ab. Offensichtlich sind solche Varianten, die beispielsweise HRG zu einem bekannten Rezeptorliganden umsetzen, im Schutzumfang dieser Erfindung nicht enthalten, noch sind es jegliche andere HRG-Varianten oder Polypeptidsequenzen, die nicht neu sind und sich nicht aus nahe liegender Weise aus dem Stand der Technik ergeben.
Aminosäuresequenzdeletionen liegen in Allgemeinen im Bereich von ungefähr 1 bis 30 Resten, vorzugsweise ungefähr 1 bis 10 Resten und typischerweise sind ungefähr 1 bis 5 sind zusammenhängend. Deletionen können in Regionen niedriger Homologie zu anderen Vorläufern der EGF-Familie eingeführt werden, um die Aktivität von HRG zu modifizieren. Deletionen aus HRG in Bereichen wesentlicher Nomologie mit anderen Sequenzen der EGF-Familie werden mit höherer Wahrscheinlichkeit die biologische Aktivität von HRG in einem signifikanteren Ausmaß modifizieren. Die Anzahl aufeinander folgender Deletionen wird so gewählt, dass die Tertiärstruktur von HRG in der betroffenen Domäne, z.B. Cysteinvernetzung, Beta-Faltblattstruktur oder Alpha-Helix erhalten bleiben.
Aminosäuresequenzinsertionen umfassen amino- und/oder carboxyterminale Fusionen in einem Längenbereich von einem Rest bis zu Polypeptiden, die hundert oder mehr Reste enthalten, sowie Intrasequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Reste. Intrasequenz=lnsertionen (d.h. Insertionen innerhalb der HRG-Sequenz) können im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 1 bis 10 Resten, bevorzugter 1 bis 5 und insbesondere 1 bis 3 Resten liegen. Beispiele terminaler Insertionen umfassen HRG mit einem N-terminalen Methionylrest (ein Artefakt der direkten Expression von HRG in bakterieller rekombinanter Zellkultur) und die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus von HRG, um die Sekretion von reifem HRG aus rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern. Derartige Signalsequenzen werden im Allgemeinen aus der vorgesehenen Wirtszellspezies erlangt und sind daher zu ihr homolog. Geeignete Sequenzen umfassen STII, tPA oder Ipp für E. coli, Alpha-Faktor für Hefe und Virussignale, wie z.B. Herpes-gD für Säugetierzellen.
Andere Insertionsvarianten von HRG umfassen die Fusion eines immunogenen Peptids an den N- oder C-Terminus von HRG, z.B. bakterielle Polypeptide, wie z.B. Beta-Lactamase oder ein vom trp-Locus aus E. coli kodiertes Enzym, oder Hefeprotein, Rinderserumalbumin und chemotaktische Polypeptide. Es werden C-terminale Fusionen von HRG-ECD mit Proteinen erwogen, die eine lange Halbwertszeit aufweisen, wie z.B. konstante Immunglobulinregionen (oder andere Immunglobulinregionen), Albumin oder Ferritin, wie sie in der am 6. April 1989 veröffentlichten WO 89/02922 beschrieben sind.
Eine weitere Gruppe von Varianten sind Aminosäuresubstitutionsvarianten. Bei diesen Varianten ist zumindest ein Aminosäurerest im HRG-Molekül entfernt und stattdessen ein anderer Rest insertiert. Die Stellen größten Interesses für die Substitutionsmutagense umfassen die als die aktive(n) Stelle(n) von HRG identifizierten Stellen sowie Stellen, wo die in HRG-Liganden aus verschiedenen Spezies vorkommenden Aminosäuren sich hinsichtlich der Sperrigkeit, Ladung und/oder Hydrophobizität der Seitenkette wesentlich unterscheiden. Eine wahrscheinliche Subdomäne von HRG-GFD mit biologischer Aktivität als Wachstumsfaktor ist das C-terminale Segment, insbesondere innerhalb der Sequenz ungefähr von Glycin 218 bis Valin 226 (HRG-α) und Glycin 218 bis Lysin 228/Serin 228 (HRG-β) auf Basis der Analogie zur EGF-Untersequenz, die EGF-Aktivität aufweist.
Andere Stellen von Interesse sind jene, in denen bestimmte Reste von aus verschiednen Spezies erlangten HRG-artigen Liganden identisch sind. Diese Positionen können für die biologische Aktivität von HRG wichtig sein. Diese Stellen, besonders jene, die innerhalb einer Sequenz von zumindest drei anderen identisch konservierten Stellen liegen, werden auf eine relativ konservative Weise substituiert. Derartige konservative Substitutionen sind in Tabelle 1 unter dem Titel „bevorzugte Substitutionen" dargestellt. Falls solche Substitutionen in einer Änderung der biologischen Aktivität resultieren, dann werden substantiellere Änderungen, die in Tabelle 1 als beispielhafte Substitutionen bezeichnet sind, eingeführt und die Produkte gescreent.
Tabelle 1
Substantielle Modifizierungen der Funktion oder immunologischen Identität von HRG werden durch Auswählen von Substitutionen erzielt, die sich in ihrer Wirkung auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptidgerüsts im Bereich der Substitution, beispielsweise als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Ziel-Stelle oder (c) der Sperrigkeit der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden auf Basis gemeinsamer Seitenketteneigenschaften in Gruppen unterteilt:

1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutral-hydrophil: Cys, Ser, Thr;
3) sauer: Asp, Glu;
4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) Reste, welche die Kettenausrichtung beeinflussen: Gly, Pro; und
6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.

Nicht-konservative Substitutionen bedingen den Austausch eines Elements aus einer dieser Klassen gegen ein anderes. Derartige substituierte Reste können in HRG-Regionen eingeführt werden, die zu anderen Rezeptorliganden homolog sind, oder bevorzugter in nicht-homologe Regionen des Moleküls.
In einer der Ausführungsformen der Erfindung ist es wünschenswert, eine oder mehrere der im Molekül vorhandenen Proteasespaltstellen zu inaktivieren. Diese Stellen werden durch Prüfung der kodierten Aminosäuresequenz Identifiziert. Wo Proteasespaltstellen identifiziert werden, werden sie gegen proteolytische Spaltung inaktiv gemacht, und zwar durch Substituieren des Ziel-Rests durch einen anderen Rest, vorzugsweise einen basischen Rest, wie z.B. Glutamin, oder einen hydrophilen Rest, wie z.B. Serin; durch Deletieren des Rests; oder durch Insertieren eines Prolylrests unmittelbar nach dem Rest.
In einer weiteren Ausführungsform wird jeglicher Methionylrest, der nicht der Anfangsmethionylrest der Signalsequenz ist, oder jeglicher Rest, der sich innerhalb von ungefähr frei Resten N- oder C-terminal eines jeglichen solchen Methionylrests befindet, durch einen anderen Rest (vorzugsweise gemäß Tabelle 1) substituiert oder deletiert.
Jeglicher Cysteinrest, der nicht an der Erhaltung der richtigen Konformation von HRG beteiligt ist, kann ebenfalls, im Allgemeinen durch Serin substituiert werden, um die Oxidationsstabilität des Moleküls zu verbessern und eine anomale Vernetzung zu verhindern.
Stellen, die für Substitutionen, Deletionen oder Insertionen besonders geeignet sind, umfassen die folgenden vom N-Terminus von HRG-α aus 1A-1D ausgehend nummerierten Stellen:

1) Mögliche Glycosaminoglycan-Additionsstellen an den Serin-Glycin-Dipeptiden bei 42-43, 64-65, 151-152;
2) mögliche Asparagin-gebundene Glykosylierung an den Positionen 164, 170, 208 und 437, Stellen (NDS) 164-166, (NIT) 170-172, (NTS) 208-210 und NTS (609-611);
3) mögliche O-Glykosylierung in einem Cluster von Serin und Threonin bei 209-218;
4) Cysteine bei 226, 234, 240, 254, 256 und 265;
5) Transmembrandomäne bei 287-309;
6) Schleife 1, abgegrenzt durch die Cysteine 226 und 240;
7) Schleife 2, abgegrenzt durch die Cysteine 234 und 254; und
8) mögliche Protease-Prozessierungsstellen bei 2-3, 8-9, 23-24, 33-34, 36-37, 45-46, 48-49, 62-63, 66-67, 86-87, 110-111, 123-124, 134-135, 142-143, 272-273, 278-279 und 285-286.

Analoge Regionen in HRG-β1 können durch Bezugnahme auf seine Sequenz ermittelt werden. Die analogen HRG-β1-Aminosäuren können wie oben für HRG-α erörtert mutiert oder modifiziert werden. Analoge Regionen in HRG-β2 können ebenfalls durch Bezugnahme auf seine Sequenz ermittelt werden. Die analogen HRG-β2-Aminosäuren können wie oben für HRG-α oder HRG-β1 erörtert mutiert oder modifi ziert werden. Analoge Regionen in HRG-β3 können durch Bezugnahme auf seine Sequenz ermittelt werden. Weiters können die analogen HRG-β3-Aminosäuren wie oben für HRG-α, HRG-β1 oder HRG-β2 erörtert mutiert oder modifiziert werden.
Eine weitere HRG-Variante ist γ-HRG (oder Gamma-Heregulin). γ-HRG ist jegliche Polypeptidsequenz, die zumindest eine biologische Eigenschaft des Nativsequenz-γ-HRG mit der Seq.-ID Nr. 11 besitzt. Die biologische Eigenschaft dieser Variante ist dieselbe wie die oben erwähnte für HRG. Diese Variante umfasst nicht nur das aus einer nativen γ-HRG-Quelle, wie z.B. menschlichen MDA-MB-175-Zellen oder aus einer anderen Quelle, wie z.B. aus einer anderen Tierspezies isolierte Polypeptid, sondern auch das durch rekombinante oder synthetische Verfahren hergestellte Polypeptid. Sie umfasst außerdem Variantenformen, einschließlich funktionelle Derivate, allelische Varianten, natürlich auftretende Isoformen und Analoga davon. Manchmal ist das γ-HRG „natives γ-HRG", was sich auf endogenes γ-HRG-Polypeptid bezieht, das aus einem Säugetier isoliert worden ist. Das γ-HRG kann auch „Nativsequenz-γ-HRG" sein, soweit es dieselbe Aminosäuresequenz wie ein natives γ-HRG aufweist (z.B. das in 7A-7C dargestellte menschliche γ-HRG). Aminosäuresequenzvarianten der nativen Sequenz werden durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die Nativsequenz-DNA oder durch In-vitro-Synthese des gewünschten Polypeptids hergestellt. Derartige Varianten umfassen beispielsweise Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der für das menschliche Protein in 7A-7C dargestellten Sequenz, wie oben allgemein für andere HRG beschrieben ist. Jegliche Kombination von Deletion, Insertion und Substitution wird vorgenommen, um zum endgültigen Konstrukt zu gelangen unter der Vorrausetzung, dass das endgültige Konstrukt die gewünschten Eigenschaften besitzt. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationelle Prozesse der nativen Sequenz verändern, wie z.B. das Verändern der Anzahl und Position von O-Glykosylierungsstellen.
Eine weitere Variante ist das Polypeptid, das als der vom sensorischen und motorischen Neuron abstammende Faktor (SMDF) bezeichnet wird, dessen Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen (Seq.-ID Nr. 13 und 14) in 8 dargestellt sind, das wie in WO 96/15244 beschrieben hergestellt werden kann. Die SMDF-Polypeptide der Erfindung zeigen die Eigenschaften der Bindung an die HER2/HER3-Rezeptoren und der Stimulation des Wachstums und der Differenzierung von Epithelzellen auf eine ähnliche Weise wie die oben behandelten HRG-Polypeptide. Aminosäuresequenzvarianten des Nativsequenz-SMDF werden durch Einführen geeigneter Nucleotidänderungen in die Nativsequenz-SMDF-DNA oder durch In-vitro-Synthese des gewünschten SMDF-Polypeptids hergestellt, wie oben für andere HRG allgemein festgestellt worden ist. Derartige Varianten umfassen beispielsweise Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Resten innerhalb der für menschliches SMDF in 8 dargestellten Sequenz. Jegliche Kombination von Deletion, Insertion und Substitution wird vorgenommen, um zum endgültigen Konstrukt zu gelangen unter der Voraussetzung, dass das endgültige Konstrukt die gewünschten Eigenschaften besitzt. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationelle Prozesse des Nativsequenz-SMDF verändern, wie z.B. das Verändern der Anzahl und Position von O-Glykosylierungsstellen.
Weitere Varianten umfassen Polypeptide, in denen die Variante eine Substitution an einem gewählten Rest aufweist, der einem aus Folgendem gewählten Rest des 645 Aminosäuren langen, nativen menschlichen Heregulin-β1 entspricht:
S177, H178, L179, V180, K181, E184, E186,
K187, T188, V191, N192, G193, G194, E195,
M198, V199, K200, D201, N204, P205, S206,
R207, Y208, L209, K211, P213, N214, E215,
T217, G218, D219, Q222, N223, Y224, S228, und F229.
In einer Variation dieser Ausführungsform ist die Aminosäuresubstitution nicht ein Ersatz des gewählten Rests durch einen Rest des Epidermiswachstumsfaktors (EGF), der dem gewählten Rest entspricht.
Andere Heregulin-β1-Varianten umfassen eine Aminosäuresubstitution, die aus Folgendem gewählt ist:
S117W; H178S, E, R, oder A; V180Q, I oder E;
K181P oder A; A183G; E184V, W, K, R, G, oder N;
K185E, S, Q, oder G; E186R; K187E oder A; T188Q;
E195Q; F197Y; M198R oder K; K200R; D20 IT oder i;
P205T oder Y; S206K, H, G, P, oder R; R207Y;
Y208R oder L; L209M oder G; K211 R; P213S, T, N, oder K;
N214L, K, S, oder E; F216M; N223H oder W; und M226I.
In einer Variation dieser Ausführungsform umfasst die Heregulin-Variante Sätze von Aminosäuresubstitutionen, die aus dieser Gruppe gewählt sind. Manche Heregulin-Varianten der Erfindung, die Sätze von Aminosäuresubstitutionen aufweisen, zeigen eine zumindest 50fache Steigerung der HER3-Rezeptoraffinität, die außerdem von einer Steigerung der HER4-Rezeptoraffinität begleitet ist. Spezielle Varianten umfassen:
A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M148K, K200R, D201I, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, M226I;
P205T, S206H, R207Y, Y208R, L209M;
P205T, S206K, R207Y, Y208R, L209G;
N223W, M226I;
N223H, M226I;
S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R. K187E, T188G, M226I;
P205Y. S206G, R207Y, Y208L, L209M. M2261;
A183G, K185E, F186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T:
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y205L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
F147Y, M148R, D201T. P205Y, S206G, R207Y, Y208L. L209M:
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M. M226I;
F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L. L209M, M2261;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, MI98R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M; N223H, M226I; und
A183G, K185E. E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I.
Zusätzlich zur Einbeziehung einer oder mehrerer hierin offenbarter Aminosäuresubstitutionen kann die Heregulin-Variante eine oder mehrere Modifizierungen aufweisen, wie z.B. eine Aminosäuresubstitution, eine Insertion von zumindest einer Aminosäure, eine Deletion von zumindest einer Aminosäure oder eine chemische Modifizierung. Beispielsweise stellt die Erfindung eine Heregulin-Variante bereit, die ein Fragment ist. In einer Variation dieser Ausführungsform umfasst das Fragment Reste, die einem Abschnitt des menschliche Heregulin-β1 entsprechen, der sich ungefähr vom Rest 175 bis ungefähr zum Rest 230 erstreckt (d.h. eine EGF-artige Domäne ist). Beispielsweise kann sich das Fragment vom Rest 177 bis zum Rest 244 erstrecken und kann durch rekombinante Techniken hergestellt werden (rHRGβ1-177-244).
DNA, die für Aminosäuresequenzvarianten von HRG kodieren, kann mit einer Vielzahl von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf die Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Falle von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenzvarianten) oder die Herstellung durch Oligonucleotid-vermittelte (oder ortsgerichtete) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer früher hergestellten Variante oder einer Nicht-Varianten-Version von HRG. Diese Techniken können HRG-Nucleinsäure (DNA oder RNA) oder zur HRG-Nücleinsäure komplementäre Nucleinsäure einsetzen.
Die Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Substitutions-, Deletions- und Insertionsvarianten von HRG-DNA. Diese Technik ist auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt und wird von Adelman et al., DNA 2, 183 (1983) beschrieben. Zusammenfassend wird HRG-DNA durch Hybridisieren eines für die gewünschte Mutation kodierenden Oligonucleotids an ein DNA-Templat hybridisiert, wobei das Templat die einzelsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, der die unveränderte oder native DNA-Sequenz von HRG enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen vollständigen komplementären Strang des Templats zu synthetisieren, der folglich den Oligonucleotidprimer inkorporiert und für die gewählte Änderung in der HRG-DNA kodiert.
Im Allgemeinen werden Oligonucleotide einer Länge von zumindest 25 Nucleotiden verwendet. Ein optimales Oligonucleotid weist üblicherweise 12 bis 15 Nucleotide auf, die an beiden Seiten des/der für die Mutation kodierenden Nucleotids/e vollständig komplementär zum Templat sind. Dies gewährleistet, dass das Oligonucleotid richtig an das einzelsträngige DNA-Templatmolekül hybridisiert. Die Oligonucleotide können leicht unter Verwendung von Techniken synthetisiert werden, die auf. dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie sie z.B. von Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978) beschrieben werden.
Ein einzelsträngiges DNA-Templat kann auch durch Denaturieren einer doppelsträngigen Plasmid- (oder anderen) DNA unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt werden.
Zur Änderung der nativen DNA-Sequenz (um beispielsweise Aminosäuresequenzvarianten zu erzeugen) wird das Oligonucleotid an das einzelsträngige Templat unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, üblicherweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1, wird dann zugegeben, um den komplementären Strang des Templats unter Verwendung des Oligonucleotids als Primer für die Synthese zu synthetisieren. Dadurch wird ein Heteroduplex-Molekül gebildet, so dass einer der DNA-Stränge für die mutierte HRG-Form kodiert und der andere Strang (das ursprüngliche Templat) für die native, unveränderte HRG-Sequenz kodiert. Dieses Heteroduplex-Molekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle, üblicherweise in einen Prokaryoten, wie z.B. E. coli JM101 transformiert. Nachdem die Zellen gezüchtet sind, werden sie auf Agaroseplatten ausgestrichen und unter Verwendung des mit ³²P-Phosphat radioaktiv markierten Oligonucleotids gescreent, um diejenigen Bakterienkolonien zu identifizieren, welche die mutierte DNA enthalten. Die mutierte Region wird dann entfernt und in einen geeigneten Vektor zur Proteinproduktion eingesetzt, und zwar im Allgemeinen in einen Vektor des Typs, der typischerweise zur Transformation eines geeigneten Wirts eingesetzt wird.
Das eben beschriebene obige Verfahren kann modifiziert werden, so dass ein Heteroduplex-Molekül erzeugt wird, worin beide Stränge des Plasmids die Mutation(en) enthalten. Die Modifizierungen sind die folgenden: Das einzelsträngige Oligonucleotid wird an das einzelsträngige Templat wie oben beschrieben anneliert. Ein Gemisch von drei Desoxyribonucleotiden, Desoxyriboadenosin 8dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP) wird mit einem modifizierten, dCTP-(aS) genannten Thio-Desoxyribocytosin (das von Amersham Corporation erhalten werden kann) kombiniert. Dieses Gemisch wird dem Templat-Oligonucleotid-Komplex zugegeben. Bei Zugabe von DNA-Polymerase zu diesem Gemisch wird ein DNA-Strang erzeugt, der zum Templat mit Ausnahme der mutierten Basen identisch ist. Außerdem enthält dieser neue Strang dCTP-(aS) anstelle von dCTP, das dazu dient, ihn vor dem Restriktionsendonucleaseverdau zu schützen. Nachdem der Templatstrang des doppelsträngigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym genickt worden ist, kann der Templatstrang mit Exolll-Nuclease oder einer anderen geeigneten Nuclease hinter der die zu mutierende(n) Stelle(n) enthaltenden Region verdaut werden. Die Reaktion wird dann gestoppt, um ein Molekül zu hinterlassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Homoduplex wird dann unter Verwendung von DNA-Polymerase in Gegenwart aller vier Desoxyribonucleotid-Triphosphate, ATP und DNA-Ligase gebildet. Dieses Homoduplex-Molekül kann dann in eine geeignete Wirtszelle, wie z.B. E. coli JM101 wie oben beschrieben transformiert werden.
Für HRG-Mutanten kodierende DNA mit mehr als einer zu substituierenden Aminosäure kann auf eine von mehreren Weisen erzeugt werden. Falls die Aminosäuren in der Polypeptidkette nahe beieinander liegen, können sie gleichzeitig unter Verwendung eines Oligonucleotids mutiert werden, das für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen kodiert. Falls jedoch die Aminosäuren in einigem Abstand voneinander lokalisiert (durch mehr als ungefähr zehn Aminosäuren getrennt) sind, ist es schwieriger, ein einzelnes Oligonucleotid zu erzeugen, dass für alle der gewünschten Änderungen kodiert. Stattdessen kann eine von zwei alternativen Verfahren eingesetzt werden.
Im ersten Verfahren wird ein gesondertes Oligonucleotid für jede zu substituierende Aminosäure erzeugt. Die Oligonucleotide werden dann gleichzeitig an die einzelsträngige Templat-DNA anneliert und der zweite DNA-Strang, der aus dem Templat synthetisiert wird, kodiert für alle der gewünschten Aminosäuresubstitutionen.
Das alternative Verfahren umfasst zwei oder mehr Mutageneseumläufe, um die gewünschte Mutante herzustellen. Der erste Umlauf erfolgt wie für die Einzelmutanten beschrieben: DNA der Wildform wird für das Templat verwendet, ein für die erste(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierendes Oligonucleotid wird an dieses Templat anneliert und das Heteroduplex-DNA-Molekül wird dann erzeugt. Der zweite Mutageneseumlauf setzt die im ersten Mutageneseumlauf hergestellte mutierte DNA als Templat ein. Folglich enthält dieses Templat bereits eine oder mehrere Mutationen. Das für die zusätzliche(n) gewünschte(n) Aminosäuresubstitution(en) kodierende Oligonucleotid wird dann an dieses Templat anneliert und der resultie rende DNA-Strang kodiert nunmehr für Mutationen aus dem ersten sowie zweiten Mutageneseumlauf. Diese resultierende DNA kann als Templat in einem dritten Mutageneseumlauf verwendet werden, usw.
PCR-Mutagenese ist zur Herstellung von Aminosäurevarianten von HRG ebenfalls zweckdienlich. Während sich die folgende Diskussion auf DNA bezieht, versteht es sich, dass die Technik auch mit RNA Anwendung findet. Die PCR-Technik bezieht sich im Allgemeinen auf das folgende Verfahren (siehe Ehrlich, s.o., das Kapitel von R. Higuchi, S. 61-70). Wenn kleine Mengen Templat-DNA als Anfangsmaterial in einer PCR verwendet werden, können Primer, die sich hinsichtlich der Sequenz von der entsprechenden Region in einer Templat-DNA unterscheiden, verwendet werden, um relativ große Mengen eines spezifischen DNA-Fragments zu erzeugen, das sich von der Templatsequenz nur an denjenigen Positionen unterscheidet, wo sich die Primer vom Templat unterscheiden. Zur Einführung einer Mutation in eine Plasmid-DNA, wird einer der Primery so konstruiert, dass er die Position der Mutation überlappt und die Mutation enthält: die Sequenz des anderen Primers muss mit einem Abschnitt des entgegengesetzten Strangs des Plasmids identisch sein, jedoch kann sich diese Sequenz irgendwo entlang der Plasmid-DNA befinden. Es wird jedoch bevorzugt, dass sich die Sequenz des zweiten Primers innerhalb von 200 Nucleotiden derjenigen des ersten befindet, so dass das Ende der gesamten amplifizierten, von den Primern gebundenen DNA-Region leicht sequenziert werden kann. Die PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaars wie jenem gerade beschriebenen resultiert in einer Population von DNA-Fragmenten, die sich an der Position der vom Primer festgelegten Mutation und möglicherweise an anderen Positionen unterscheiden, da das Templat-Kopieren etwas fehleranfällig ist.
Falls das Verhältnis Templat zu Produkt extrem niedrig ist, inkorporiert die überwiegende Mehrheit der Produkt-DNA-Fragmente die gewünschte(n) Mutation(en). Dieses Produktmaterial wird verwendet, um die entsprechende Region im Plasmid, die als PCR-Templat diente, unter Verwendung standardmäßiger DNA-Technologie zu entfernen. Mutationen an gesonderten Positionen können gleichzeitig eingeführt werden, indem entweder ein mutierter zweiter Primer verwendet wird oder eine - zweite PCR mit anderen mutierten Primern durchgeführt wird und die beiden resultierenden PCR-Fragmente in einer drei- (oder mehr-) teiligen Ligation gleichzeitig an das Vektorfragment ligiert werden.
In einem speziellen Beispiel der PCR-Mutagenese wird Templat-Plasmid-DNA (1 mg) durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die eine einzigartige Erkennungsstelle in der Plasmid-DNA außerhalb der zu amplifizierenden Region aufweist. Von diesem Material werden 100 ng einem PCR-Gemisch zugegeben, das PCR-Puffer, der die vier Desoxynucleotid-Triphosphate enthält und in den GENEAMP-Sets enthalten ist (bezogen von Perkin-Eimer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA), und 25 pmol jedes Oligonucleotidprimers auf ein Endvolumen von 50 ml enthält. Das Reaktionsgemisch wird mit 35 ml Mineralöl überschichtet. Die Reaktion wird für 5 Minuten bei 100 °C denaturiert, kurz auf Eis gegeben, worauf 1 ml Thermus aquaticus- (Taq-) DNA-Polymerase (5 Einheiten/ml, erworben von Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT und Emeryville, CA) unter die Mineralölschicht gegeben werden. Das Reaktionsgemisch wird dann in einen DNA-Thermocycler (erworben von Perkin-Elmer Cetus) eingeführt, der wie folgt programmiert wird:
2 Minuten 55 °C,
30 Sekunden 72 °C, dann 19 Zyklen der Folgenden:
30 Sekunden 94 °C,
30 Sekunden 55 °C und
30 Sekunden 72 °C.
Am Ende des Programms wird das Fläschchen aus dem Thermocycler entnommen und die wässrige Phase in ein neues Fläschchen überführt, mit Phenol/Chloroform (50:50:Vol) extrahiert und mit Ethanol präzipitiert, und die DNA mittels Standardverfahren gewonnen. Dieses Material wird anschließend den geeigneten Behandlungen zur Insertion in einen Vektor unterzogen.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von Varianten, die Kassettenmutagenese, basiert auf der von Wells et al., Gene 34, 315 (1985) veröffentlichten Technik. Das Anfangsmaterial ist das Plasmid (oder ein anderer Vektor), das die zu mutierende HRG-DNA umfasst. Das/die Codon(s) in der zu mutierenden HRG-DNA wird/werden identifiziert. Es muss eine einzigartige Restriktionsendonucleasestelle an beiden Seiten der identifizierten Mutationsstelle(n) vorliegen. Falls keine derartige Restriktionsstellen vorhanden sind, können sie erzeugt werden, indem das beschriebene Oligonucleotid-vermittelte Mutageneseverfahren verwendet wird, um sie an geeigneten Orten in der HRG-DNA einzuführen. Nachdem die Restriktionsstellen in das Plasmid eingeführt worden sind, wird das Plasmid an diesen Stellen geschnitten, um es zu linearisieren. Ein doppelsträngiges Oligonucleotid, das für die Sequenz der DNA zwischen den Restriktionsstellen kodiert, jedoch die gewünschte(n) Mutation(en) enthält, wird unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert. Die beiden Stränge werden gesondert synthetisiert und dann unter Verwendung von Standardtechniken miteinander hybridisiert. Dieses doppelsträngige Oligonucleotid wird als Kassette bezeichnet. Diese Kassette ist so konstruiert, dass sie 3'- und 5'-Enden aufweist, die mit den Enden des linearisierten Plasmids kompatibel sind, so dass sie direkt in das Plasmid ligiert werden kann. Dieses Plasmid enthält nunmehr die mutierte HRG-DNA-Sequenz.
C. Insertion von DNA in ein Klonierungsvehikel
Die cDNA oder genomische DNA, die für Nativ- oder Varianten-HRG kodiert, wird in einen replizierbaren Vektor zur weiteren Klonierung (Amplifikation der DNA) oder Expression insertiert. Es sind zahlreiche Vektoren verfügbar und die Wahl des geeigneten Vektors hängt üblicherweise von Folgendem ab: 1) ob er für DNA-Amplifikation oder für DNA-Expression zu verwenden ist, 2) von der Größe der in den Vektor zu insertierenden DNA und 3) von der mit dem Vektor zu transformierenden Wirtszelle. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten in Abhängigkeit von seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von RNA) und der Wirtszelle, mit der er kompatibel ist. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf eine oder mehrere der folgenden: eine Signalsequenz, ein Replikationsstartpunkt, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancerelement, ein Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
(i) Signalsequenz-Komponente
Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann Teil einer HRG-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Von der nativen HRG-DNA wird angenommen, dass sie für eine Signalsequenz am Aminoterminus (5'-Ende der für HRG kodierenden DNA) des Polypeptids kodiert, die während der posttranslationellen Prozessierung des Polypeptids gespalten wird, um den reifen HRG-Polypeptidliganden zu bilden, der an den HER2/HER3-Rezeptor bindet, obgleich eine herkömmliche Signalstruktur nicht ersichtlich ist. Natives HRG wird aus der Zellen sekretiert, verbleibt jedoch in der Membran, da es eine Transmembrandomäne und eine zytoplasmatische Region in der carboxyterminalen Region des Polypeptids enthält. Folglich wird bei einer sekretierten, löslichen Version von HRG die carboxyterminale Domäne des Moleküls einschließlich der Transmembrandomäne für gewöhnlich deletiert. Dieses trunkierte Varianten-HRG-Polypeptid kann aus der Zelle sekretiert werden unter der Voraussetzung, dass die für die trunkierte DNA kodierende Variante für eine Signalsequenz kodiert, die vom Wirt erkannt wird.
HRG dieser Erfindung kann nicht nur direkt exprimiert werden, sondern auch als Fusion mit einem heterologen Polypeptid, vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid mit einer spezifischen Spaltstelle am N- und/oder C-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein oder kann Teil einer HRG-DNA sein, die in den Vektor insertiert wird. Im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten sind HRG, bei denen die native Signalsequenz deletiert und durch eine heterologe Signalsequenz ersetzt ist. Die gewählte heterologe Signalsequenz sollte eine sein, die von der Wirtszelle erkannt und prozessiert, d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten wird. Für prokaryotische Wirtszellen, welche die native HRG-Signalsequenz nicht erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryotische Signalsequenz substituiert, die beispielsweise aus der Gruppe der Alkalische Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leader gewählt ist. Für die Hefesekretion kann die native HRG-Signalsequenz durch die Hefeinvertase-, Alpha-Faktor- oder Saure Phosphatase-Leader substituiert werden. Bei der Säugetierzellexpression ist die native Signalsequenz ausreichend, obgleich andere Säugetier-Signalsequenzen geeignet sind.
(ii) Replikationsstartpunkt-Komponente
Expressions- sowie Klonierungsvektoren enthalten im Allgemeinen eine Nucleinsäuresequenz, die dem Vektor die Replikation in einer oder mehreren Wirtszellen ermöglicht. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Klonierungsvektoren eine, die es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen DNA des Wirts zu replizieren und umfasst Replikationsstartpunkte oder autonom replizierende Sequenzen. Derartige Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsstartpunkt für das Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2m-Plasmid-Startpunkt ist für Hefe geeignet und verschiedene Virus-Startpunkte (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen zweckdienlich. Im Allgemeinen wird die Replikationsstartpunkt-Komponente für Säugetierexpressionsvektoren nicht benötigt (der SV40-Startpunkt kann typischerweise nur deshalb verwendet werden, weil der den frühen Promotor enthält).
Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d.h. sie sind zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen fähig, können jedoch zur Expression in einen anderen Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert und derselbe Vektor dann zur Expression in Hefe oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er nicht fähig ist, sich unabhängig vom Wirtszellenchromosom zu replizieren.
DNA kann außerdem durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Dies wird leicht durch Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirte erzielt, beispielsweise durch Aufnehmen einer DNA-Sequenz in den Vektor, die komplementär zu einer in genomischer Bacillus-DNA vorkommenden Sequenz ist. Die Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in der homologen Rekombination mit dem Genom und der Insertion von HRG-DNA. Jedoch ist die Gewinnung genomischer DNA, die für HRG kodiert, komplexer als die eines exogen replizierten Vektors, da ein Restriktionsenzymverdau erforderlich ist, um die HRG-DNA herauszuschneiden. Die DNA kann mittels PCR amplifiziert und ohne jegliche Replikationskomponente direkt in die Wirtszellen transfiziert werden.
(iii) Selektionsgen-Komponente
Expressions- und Klonierungsvektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch selektierbarer Marker genannt wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das zum Überleben transformierter, in einem selektiven Kulturmedium gezüchteter Wirtszellen notwendig ist. Wirtszellen, die nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformiert sind, werden im Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin verleihen, (b) auxotrophe Defekte komplementieren oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z.B. das für D-Alanin-Racemase kodierende Gen.
Eines der Beispiele eines Selektionsschemas setzt ein Medikament ein, um das Wachstum einer Wirtszelle zum Stillstand zu bringen. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert sind, exprimieren ein Gen, das Medikamentenresistenz verleiht und überleben folglich das Selektionsschema. Beispiele einer derartigen dominanten Selektion verwenden die Medikamente Neomycin (Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan et al., Science 209, 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410-413 (1985)). Die oben angegebenen drei Beispiele setzen bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle ein, um Resistenz gegen das geeignete Medikament G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu übertragen.
Ein weiteres Beispiel geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen sind jene, welche die Identifizierung von Zellen ermöglichen, die zur Aufnahme von HRG-Nucleinsäure kompetent sind, wie z.B. Dihydrofolatreduktase (DHFR) oder Thymidinkinase. Die Säugetierzellen-Transformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, dem nur die Transformanten einzigartig angepasst sind, um zu überleben, da sie den Marker aufgenommen haben. Der Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen ausgeübt, unter denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium nacheinander verändert wird, wodurch eine Amplifikation des Selektionsgens sowie der für HRG kodierenden DNA bewirkt wird. Die Amplifikation ist derjenige Prozess, durch den Gene, die für die Produktion eines für das Wachstum entscheidenden Proteins eher benötigt werden, in den Chromosomen aufeinander folgender Generationen rekombinanter Zellen tandemwiederholt werden. Gesteigerte Mengen an HRG werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zuerst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx) enthält, das ein kompetitiver Antagonist von DHFR ist. Eine geeignete, Wirtszelle beim Einsatz von DHFR der Wildform ist die hinsichtlich DHFR-Aktivität defekte Chinahamster-Eierstock-(CHO-) Zelllinie, die wie von Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980) beschrieben hergestellt und vermehrt wird. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Konzentrationen Methotrexat exponiert. Dies führt zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und, gleichzeitig, mehrerer Kopien anderer, die Expressionsvektoren umfassender DNA, z.B. der für HRG kodierenden DNA. Diese Amplifikationstechnik kann mit jedem ansonsten geeigneten Wirt verwendet werden, z.B. ATCC-Nr. CCL61 CHO-K1, ungeachtet der Gegenwart von endogenem DHFR, falls beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen eingesetzt wird, das gegen Mtx höchst resistent ist ( EP 117.060 ). Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wirte der Wildform, die endogenes DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen transformiert oder cotransformiert sind, die für HRG, DHFR-Protein der Wildform und einen weiteren selektierbaren Marker, wie z.B. Aminoglycosid-3'-phosphotransferase (APH) kodieren, durch Zellwachstum in Medium selektiert werden, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker enthält, wie z.B. ein aminoglycosidisches Antibiotikum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418 (Siehe US-Patent Nr. 4.965.199).
Ein geeignetes Gen zur Verwendung in Hefe ist das im Hefeplasmid YRp7 vorhandene trp1-Gen (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); oder Tschemper et al., Gene 10, 157 (1980)). Das trp1-Gen stellt einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm bereit, dem die Fähigkeit zum Wachstum auf Tryptophan fehlt, z.B. ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 (1977)). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefewirfszellgenom sorgt dann für eine wirksame Umgebung zum Nachweis der Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan bereit. Gleichermaßen werden Leu2-defekte Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte, das Leu2-Gen tragende Plasmide komplementiert.
(iv) Promotor-Komponente
Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der von einem Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an eine HRG-Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromauf (5') des Startcodons eines Strukturgens (im Allgemeinen innerhalb von ungefähr 100 bis 1.000 bp) lokalisiert sind, welche die Transkription und Translation einer bestimmten Nucleinsäure, wie z.B. HRG kontrollieren und an die sie operabel gebunden sind. Derartige Promotoren fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die eine erhöhte Transkription aus DNA unter ihre Kontrolle initiieren, und zwar in Reaktion auf eine gewisse Verände rung der Kulturbedingungen, z.B. auf die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder auf eine Temperaturänderung. Derzeit ist eine große Anzahl an Promotoren wohlbekannt, die von einer Vielzahl an möglichen Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel an für HRG kodierende DNA gebunden, indem der Promotor durch Restriktionsenzymverdau aus der Quell-DNA entfernt und die isolierte Promotorsequenz in den Vektor insertiert wird. Die native HRG-Promotorsequenz sowie viele heterologe Promotoren können verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression von HRG-DNA zu steuern. Jedoch werden heterologe Promotoren bevorzugt, da sie im Allgemeinen eine stärkere Expression und höhere Ausbeuten an exprimiertem HRG im Vergleich zum nativen HRG-Promotor erlauben.
Zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignete Promotoren umfassen die b-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); und Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), Alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980) und EP 36.776 ), tPa (US-Patent Nr. 5.641.655) und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)). Jedoch sind andere bekannte bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen sind veröffentlicht worden, wodurch es einem Fachmann ermöglicht wird, sie an für HRG kodierende DNA operabel zu ligieren (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980), und zwar unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren, um jegliche erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen werden im Allgemeinen außerdem eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz enthalten, die operabel an die für HRG kodierende DNA gebunden ist.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg 7, 149 (1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofruc tokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Saure Phosphatase, mit dem Stickstoffmetabolismus assoziierte Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden in Hitzeman et al., EP 73.657A weitergehend beschrieben. Hefe-Enhancer werden ebenfalls vorteilhaft mit Hefepromotoren verwendet.
Promotorsequenzen für Eukaryoten sind bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die sich ungefähr 25 bis 30 Basen stromauf derjenigen Stelle befindet, wo die Transkription initiiert wird. Eine weitere Sequenz, die sich 70 bis 80 Basen stromauf des Transkriptionsstarts vieler Gene findet, ist eine CXCAAT-Region, wobei X jegliches Nucleotid sein kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine AATAAA-Sequenz, die das Signal zur Addition des Poly-A-Schwanzes an das 3'-Ende der kodierenden Sequenz sein kann. Alle dieser Sequenzen werden in geeigneter Weise in Säugetier-Expressionsvektoren insertiert.
Die HRG-Gentranskription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen kann durch Promotoren kontrolliert werden, die aus den Genomen von Viren erlangt werden, wie z.B. aus Polyoma-Virus, Geflügelpocken-Virus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarcomavirus, Cytomegalovirus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und insbesondere bevorzugt Simian-Virus 40 (SV40), aus heterologen Säugetier-Promotoren, z.B. einem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, aus Hitzeschock-Promotoren und aus dem Promotor, der normalerweise mit der HRG-Sequenz as soziiert ist unter der Voraussetzung, das solche Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden zweckdienlicherweise als ein SV40-Restriktionsfragment erlangt, das außerdem den SV40-Replikationsstartpunkt enthält (Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan und Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398-7402 (1981)). Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird zweckdienlicherweise als ein HindIII E-Restriktionsfragment erlangt (Greenaway et al., Gene 18, 355-360 (1982)). Ein System zur Expression von DNA in Säugetier-Wirten unter Verwendung des Rinder-Papillomavirus als Vektor wird im US-Patent 4.419.446 offenbart. Eine Modifizierung dieses Systems wird im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982) über die Expression von für Immuninterferon in Affenzellen kodierender cDNA; Reyes et al., Nature 297, 598-601 (1982) über die Expression von menschlicher b-Interferon-cDNA in Mauszellen unter der Kontrolle eines Thymidinkinase-Promotors aus Herpes-simplex-Virus; Canaani und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166-5170 (1982) über die Expression des menschlichen Interferon-b1-Gens in kultivierten Maus- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982) über die Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, Hühnerembryo-Fibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen. Wiederholung des Rous-Sarcomavirus als Promotor.
(v) Enhancerelement-Komponente
Die Transkription einer für HRG dieser Erfindung kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird häufig durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente einer Länge von üblicherweise ungefähr 10-300 bp, die an einem Promotor wirken, um seine Transkription zu erhöhen. Enhancer sind von der Ausrichtung und Position relativ unabhängig und sind 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell. Bio. 3, 1108 (1983)) der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983) sowie innerhalb der kodierenden Sequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)) gefunden worden. Viele Enhancersequenzen sind aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, a-Fetoprotein und InsuIlin). Typischerweise wird man jedoch einem Enhancer aus einem Virus einer eukaryotischen Zelle verwenden. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts (bp 100-270), den frühen Cytomegalovirus-Promotor-Enhancer, den Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsstartpunkts und Adenovirus-Enhancer (siehe auch Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982) über Enhancer-Elemente zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren). Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' der HRG-DNA gespleißt werden, befindet sich jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' des Promotors.
(vi) Transkriptionsterminationskomponente
In eukaryotischen Wirten (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, Mensch oder kernhaltige Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendete Expressionsvektoren enthalten üblicherweise auch Kontrollsequenzen, die zur Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Derartige Sequenzen sind üblicherweise aus 5'- und gelegentlich 3'-untranslatierten Regionen eukaryotischer oder viraler DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente im untranslatierten Abschnitt der für HGR kodierenden mRNA transkribiert werden. Die 3'-untranslatierten Regionen umfassen außerdem Transkriptionsterminationsstellen.
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben aufgezählten Komponenten der gewünschten Kodierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, setzt standardmäßige Ligationstechniken ein. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form neu ligiert, um die benötigten Plasmide zu erzeugen.
Für die Analyse zur Bestätigung korrekter Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden die Ligationsgemische verwendet, um E. coli K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) zu transformieren, wobei erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls durch Ampicillin- oder Tetracyclinresisfenz selektiert werden. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, mittels Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder mit dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981) oder mit dem Verfahren von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980) sequenziert.
Insbesondere zweckdienlich bei der praktischen Umsetzung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression von für HRG kodierender DNA in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen umfasst die vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der zur effizienten Replikation in einer Wirtszelle fähig ist, so dass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum hohe Mengen eines gewünschten, vom Expressionsvektor kodierten Polypeptids synthetisiert. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die bequeme Identifizierung von Polypeptiden, die von den klonierten cDNAs kodiert werden, sowie das rasche Screening derartiger Polypeptide auf erwünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Folglich sind vorübergehende Expressionssysteme in der Erfindung insbesondere zum Zwecke der Identifizierung von Analoga und Varianten von HRG brauchbar, die eine HRG-artige Aktivität aufweisen. Ein solches vorübergehendes Expressionssystem ist im US-Patent Nr. 5.024.939 beschrieben.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaptierung auf die Synthese von HRG in rekombinanter Vertebratenzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson et al., EP 117.060 und EP 117.058 beschrieben. Ein insbesondere zweckdienliches Plasmid für die Säugetierzellkulturexpression von HRG ist pRK5 (EP Veröffentlichungs-Nr. 307.247).
D. Selektion und Transformation von Wirtszellen
Geeignete Wirtszellen zur Klonierung und Expression der Vektoren hierin sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten umfassen Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise E. coli, Bacilli, wie z.B. B. subtilis, Pseudomonas-Spezies, wie z.B. P. aeruginosa, Salmonella typhimurium oder Serratia marcescans. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierungswirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obgleich andere Stämme, wie z.B. E. coli B, E. coli 1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325) geeignet sind. Diese Beispiele sind illustrativ und nicht einschränkend. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle minimale Mengen an proteolytischen Enzymen sekretieren. Alternativ dazu sind In-vitro-Verfahren der Klonierung, z.B. PCR oder andere Nucleinsäurepolymerase-Reaktionen geeignet.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroorganismen, wie z.B. filamentöse Pilze oder Hefe geeignete Wirte für HRG-kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete unter den niederen eukaryotischen Wirtsmikroorganismen. Jedoch sind eine Reihe anderer Gattungen, Spezies und Stämme allgemein verfügbar und hierin zweckdienlich, wie z.B. Schizosaccharomyces pombe (Beach und Nurse, Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985), Kluyveromyces-Wirte (USSN 4.943.529), wie z.B. K. lactis (Louvencourt et al., J. Bacteriol. 737 (1983); K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans und K. marxianus, yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ), Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265-278 (1988); Candida, Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259-5263 (1979), und filamentöse Pilze, wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991) und Aspergillus-Wirte, wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470-1474 (1984) und A. niger (Kelly und Hynes, EMBO J. 4, 475-479 (1985)).
Geeignete Wirtszellen zur Expression eines glykosylierten HRG-Polypeptids stammen von mehrzelligen Organismen. Derartige Wirtszellen sind zu komplexen Prozessierungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur, ob Vertebraten- oder Invertebratenkultur praktikabel. Beispiele von Invertebratenzellen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen, wie z.B. Spodoptera frugiperda- (Raupe), Aedes aegypti- (Stechmücke), Aedes albopictus- (Stechmücke), Drosophila melanogaster- (Fruchtfliege) und Bombyx mori-Wirtszellen sind identifiziert worden (siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, J.K. Setlow et al. (Hrsg.), Bd. 8, Plenum Publishing, S. 277-279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592-594 (1985)). Eine Vielzahl derartiger Virusstämme ist öffentlich erhältlich, z.B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-S-Stamm von Bombyx mori NPV, und derartige Viren können als der Virus hierin gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera frugiperda-Zellen verwendet werden.
Pflanzenzellkulturen von Baumwolle, Mais, Kartoffel, Sojabohne, Petunie, Tomate und Tabak können als Wirte eingesetzt werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit gewissen Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, der vorher manipuliert worden ist, um HRG-DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für HRG kodierende DNA so in den Pflanzenzellen-Wirt übertragen, dass er transfiziert wird. und unter geeigneten Bedingungen HRG-DNA exprimiert. Außerdem sind mit Pflanzenzellen kompatible Regulations- und Signalsequenzen verfügbar, wie z.B. der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssequenzen (Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982)). Außerdem sind aus der Stromauf-Region des T-DNA 780-Gens isolierte DNA-Segmente fähig, das Ausmaß der Transkription Pflanzenexprimierbarer Gene in rekombinante DNA enthaltendem Pflanzengewebe zu erhöhen (siehe EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989).
Jedoch hat das Größte Interesse an Vertebratenzellen bestanden und die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Zellkultur) ist in den letzten Jahren zu einem Routineverfahren geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson (Hrsg.) (1973)). Beispiele zweckdienlicher Säugetier-Wirtszelllinien sind durch SV40 transformierte Affennieren-CV1-Linie (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Urnierenlinie (193- oder zum Wachstum in Suspensionskultur subklonierte 293-Zellen, Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. reprod. 23, 243-251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Grüne-Meerkatzen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Mammatumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 (1982)); MRC 5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomzelllinie (Hep G2). Bevorzugte Wirtszellen sind menschliche Urnieren-293-Zellen und Chinahamster-Eierstockzellen. Die Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den oben beschriebenen Expressions- oder Klonierungsvektoren dieser Erfindung transformiert und in herkömmlichen Nährmedien kultiviert, die in geeigneter Weise zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikation der für die gewünschten Gene kodierenden Sequenzen modifiziert sind.
Transfektion bezieht sich auf das Aufnehmen eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ob jegliche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Dem Durchschnittsfachmann sind zahlreiche Transfektionsverfahren bekannt, beispielsweise CaPO₄ und Elektroporation. Eine erfolgreiche Transfektion wird üblicherweise erkannt, wenn irgendein Anzeichen der Tätigkeit dieses Vektors in der Wirtszelle auftritt.
Unter Transformation wird das Einführen von DNA in einen Organismus verstanden, so dass die DNA entweder als extrachromosomales Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle wird eine Transformation unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für derartige Zellen geeignet sind. Die im Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., s.o., beschriebene, Calciumchlorid einsetzende Calciumbehandlung wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die wesentliche Zellwandbarrieren enthalten. Die Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird für die Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983) und in der am 29. Juni 1989 veröffentlichten WO 89/05859 beschrieben wird. Für Säugetierzellen ohne derartige Zellwände wird das in den Abschnitten 16.30-16.37 von Sambrook et al., s.o., beschriebene Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren bevorzugt. Allgemeine Aspekte der Säugetier-Wirtszellsystem-Transformationen sind von Axel im am 16. August 1983 erteilten US-Patent Nr. 4.399.216 beschrieben worden. Transformationen in Hefe werden typischerweise nach dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977) und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979) durchgeführt. Jedoch können andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kerninjektion, Elektroporation oder Protoplastenfusion ebenfalls verwendet werden.
E. Kultivieren der Wirtszellen
Zur Produktion des HRG-Polypeptids dieser Erfindung verwendete prokaryotische Zellen werden in geeigneten Medien kultiviert, wie sie in Sambrook et al., s.o., allgemein beschrieben sind.
Die zur Herstellung von HRG dieser Erfindung verwendeten Säugetier-Wirtszellen können in einer Vielzahl von Medien kultiviert werden. Im Handel erhältliche Medien, wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Außerdem kann ein beliebiges der in Ham und Wal lac, Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes und Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980), US-Patenten Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; WO 90/03430; WO 87/00159; US-Patent mit der Anmeldenummer 30.985; oder US-Patent Nr. 5.122.469 beschriebenen Medien als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jegliches dieser Medien kann wie benötigt mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder Epidermiswachstumsfaktor),m Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. GENTAMYCIN-Medikament), Spurenelementen (als anorganische Verbindungen definiert, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Beliebige andere notwendige Ergänzungen können in geeigneten Konzentrationen, die dem Fachkundigen auf dem Gebiet der Erfindung üblicherweise bekannt sind, ebenfalls aufgenommen werden. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen sind jene, die vorher mit der für die Expression gewählten Wirtszelle verwendet worden sind und sind dem Durchschnittsfachmann offensichtlich.
Die Wirtzellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in In-vitro-Kultur, sowie Zellen, die sich in einem Wirtstier befinden.
Es ist weiters vorgesehen, dass HRG dieser Erfindung durch homologe Rekombination oder mit rekombinanten Herstellungsverfahren hergestellt werden kann, die, Kontrollelemente einsetzen, die in Zellen eingeführt werden, die bereits für HRG kodierende DNA enthalten, die gegenwärtig auf dem Gebiet der Erfindung in Verwendung sind. Beispielsweise wird ein leistungsfähiges Promotor/Enhancer-Element, ein Suppressor oder ein exogenes Transkriptionsmodulationselement in das Genom der vorgesehenen Wirtszelle insertiert, und zwar in einer Nachbarschaft und Orientierung, die ausreicht, um die Transkription der für das gewünschte HRG kodierenden DNA zu beeinflussen. Das Kontrollelement kodiert nicht für HRG der Erfindung, sondern die DNA ist im Genom der Wirtszellen vorhanden. Man screent als Nächstes auf Zellen, welche wie gewünscht HRG dieser Erfindung herstellen oder erhöhte oder verminderte Expressionsstärken aufweisen.
F. Nachweisen der Gen-Amplifikation/Expression
Eine Genamplifikation und/oder Expression kann in der Probe direkt gemessen werden, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting zur Quantifizierung von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde auf Basis der hierin bereitgestellten Sequenzen. Es können verschiedene Marker eingesetzt werden, am häufigsten Radioisotope, insbesondere ³²P. Jedoch können andere Techniken ebenfalls eingesetzt werden, wie z.B. die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als die Stelle für die Bindung von Avidin oder Antikörpern, die mit einer breiten Vielfalt von Markern, wie z.B. Radionukliden, Fluoreszierern, Enzymen und dergleichen markiert sein können. Alternativ dazu können Antikörper eingesetzt werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe der DNA-Protein-Duplexe erkennen können. Die Antikörper können wiederum markiert sein und der Test durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden wird, so dass bei der Bildung des Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von an den Duplex gebundenem Antikörper nachgewiesen werden kann.
Eine Genexpression kann alternativ dazu mit immunologischen Verfahren gemessen werden, wie z.B. durch immunhistochemische Markierung von Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur- oder Körperflüssigkeiten, um die Expression des Genprodukts direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen Färbetechniken wird eine Probe typischerweise durch Entwässerung und Fixierung präpariert, gefolgt von Reaktion mit markierten Antikörpern, die für das gekoppelte Genprodukt spezifisch sind, wobei die Marker üblicherweise optisch nachweisbar sind, wie z.B. Enzymmarker, Fluoreszenzmarker, Lumineszenzmarker und dergleichen. Eine besonders empfindliche Färbetechnik, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734-738 (1980) beschrieben.
Für die immunhistochemische Färbung und/oder das Testen von Probenflüssigkeiten zweckdienliche Antikörper können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können in jedem Tier hergestellt werden. Zweckdienlicherweise können die Antikörper gegen ein natives HRG-Polypeptid oder gegen ein synthetisches Peptid auf Basis der hierin bereitgestellten DNA-Sequenzen wie weiter unten beschrieben hergestellt werden.
G. Reinigung der Heregulin-Polypeptide
HRG wird aus einer Zellmembranfraktion gewonnen. Alternativ dazu wird ein(e) proteolytisch gespaltene(s) oder ein(e) trunkierte(s) exprimierte(s) lösliche(s) HRG-Fragment oder Subdomäne aus dem Kulturmedium als lösliches Polypeptid gewonnen. Ein HRG wird aus Wirtszelllysaten gewonnen, wenn es direkt ohne ein Sekretionssignal exprimiert wird.
Wenn HRG in einer rekombinanten Zelle exprimiert wird, die nicht menschlichen Ursprungs ist, ist HRG frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Jedoch ist es wünschenswert, HRG von rekombinanten Zellproteinen oder Polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die bezüglich HRG im Wesentlichen homogen sind. Als erster Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen. Die Membran- sowie löslichen Proteinfraktionen werden dann getrennt. HRG kann dann aus der löslichen Proteinfraktion (was die Gegenwart einer Protease erfordert) und aus der Membranfraktion des Kulturlysats in Abhängigkeit davon gereinigt werden, ob HRG membrangebunden ist. Die folgenden Verfahren sind beispielgebend für geeignete Reinigungsverfahren: Fraktionierung an Immunaffinitäts- oder Ionentauschersäulen; Ethanolpräzipitation; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie an Kieselerde, Heparin-SEPHAROSE oder an einem Kationentauscherharz, wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammonsulfatpräzipitation; und Gelfiltration, beispielsweise unter Verwendung von SEPHADEX G-75:
HRG-Varianten, in denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert worden sind, werden in derselben Weise wie das native HRG gewonnen, wobei jegliche wesentlichen durch die Variation veranlassten Änderungen der Eigenschaften berücksichtigt werden. Beispielsweise erleichtert die Herstellung einer HRG-Fusion mit einem anderen Protein oder Polypeptid, z.B. mit einem bakteriellen oder viralen Antigen die Reinigung; eine Immunaffinitätssäule, die Antikörper gegen das Antigen enthält, kann zur Absorption der Fusion verwendet werden. Immunaffinitätssäulen, wie z.B. eine polyklonale Kaninchen-Anti-HRG-Säule kann eingesetzt werden, um die HRG-Variante durch ihre Bindung an zumindest einem verbleibenden Immunepitop zu absorbieren. Ein Proteaseinhibitor, wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann ebenfalls zweckdienlich sein, um den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und Antibiotika können enthalten sein, um das Wachstum hinzugekommener Kontaminanten zu verhindern. Ein Fachkundiger wird anerkennen, dass für natives HRG geeignete Reinigungsverfahren eine Modifizierung erfordern können, um Änderungen des Charakters von HRG-Varianten oder bei Expression in rekombinanter Zellkultur Rechnung zu tragen.
H. Kovalente Modifizierungen von HRG
Kovalente Modifizierungen von HRG-Polypeptiden sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten. Sowohl natives HRG, als auch Aminosäuresequenzvarianten von HRG werden gegebenenfalls kovalent modifiziert. Ein Typ der im Schutzumfang dieser Erfindung enthaltenen kovalenten Modifizierung ist ein HRG-Polypeptidfragment. HRG-Fragmente, wie z.B. HRG-GDF, die bis zu ungefähr 40 Aminosäurereste aufweisen, werden zweckdienlicherweise durch chemische Synthese oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des HRG-Polypeptids voller Länge oder des Varianten-HRG-Polypeptids hergestellt. Andere Arten kovalenter Modifizierungen von HRG oder Fragmenten davon werden in das Molekül eingeführt, indem die Ziel- Aminosäurereste von HRG oder Fragmenten davon mit einem organischen Derivatisierungsmittel zur Reaktion gebracht werden, das fähig ist, mit gewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten zu reagieren.
Cysteinylreste werden am häufigsten mit α-Haloacetalen (und entsprechenden Aminen), wie z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid zur Reaktion gebracht, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethylderivate zu liefern. Cysteinylreste werden außerdem durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozolyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chior-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,0-7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Para-Bromphenacylbromid ist ebenfalls zweckdienlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung eines Amino-enthaltenden Rests umfassen Imidoester, wie z.B. Methylpicolinimidat; Pyridoxalphopshat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und die Transaminasekatalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, unter ihnen Phenylglyoxal, 2,3-Butnadion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert, dass die Reaktion aufgrund des hohen pK_a der Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie mit der Epsilon-Aminogruppe des Arginins reagieren.
Die spezifische Modifizierung von Tyrosinylresten kann bei speziellem Interesse an der Einführung spektraler Marker in Tyrosinylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan erfolgen. Am häufigsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyl-Tyrosyl-Spezies bzw. 3-Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²⁵I oder ¹³¹I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung im Radioimmuntest herzustellen, wobei das oben beschriebene Chloramin T-Verfahren geeignet ist.
Carboxylseitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') modifiziert, wobei R und R' verschiedene Alkylgruppen sind, wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Darüber hinaus werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgesetzt.
Die Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zur Vernetzung von HRG mit einer wasserlöslichen Trägermatrix zur Verwendung in einem Verfahren zur Reinigung von Anti-HRG-Antikörpern und umgekehrt zweckdienlich. Herkömmlich verwendete Vernetzungsmittel umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Hydroxysuccinimidylester, wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleimide, wie z.B. Bis-N-maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel, wie z.B. Methyl-3-((p-azidophenyl)dithio)propioimidat liefern photoaktivierbare Zwischenprodukte, die fähig sind, Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden. Alternativ dazu werden reaktive wasserunlösliche Matrices, wie z.B. Bromcyan-aktivierte Kohlenhydrate und die in den US-Patenten Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; und 4.330.440 beschriebenen reaktiven Substrate zur Proteinimmobilisierung eingesetzt.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter milden sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste liegen im Schutzumfang dieser Erfindung.
Andere Modifizierungen umfassen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der a-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidinseitenketten (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79-86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung jeglicher Cq-terminalen Carboxylgruppe.
HRG wird gegebenenfalls mit einem zu HRG heterologen Polypeptid fusioniert. Das heterologe Polypeptid ist gegebenenfalls eine Ankersequenz wie jene, die sich in einem Phagenhüllprotein findet, wie z.B. M13-Gen-III- oder Gen-VIII-Proteine. Diese heterologen Polypeptide können über Seitenketten oder über die terminalen Reste kovalent an HRG-Polypeptid gekoppelt werden.
HRG kann außerdem durch Verändern seines natürlichen Glykosylierungsmusters kovalent modifiziert werden. Ein oder mehrere Kohlenhydratsubstituenten in diesen Ausführungsformen werden modifiziert, indem die Monosaccharidkomponenten an einer gegebenen Stelle addiert, entfernt oder variiert werden oder indem Reste in HRG modifiziert werden, so dass diese Glykosylierungsstellen addiert oder deletiert werden.
Die Glykosylierung von Polypeptiden ist entweder N-verknüpft oder O- verknüpft. N-verknüpft bezieht sich auf die Bindung der Kohlenhydratgruppierung an die Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin (wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist) sind die Erkennungssequenzen für die enzymatische Bindung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette. Folglich erzeugt die Gegenwart von einem dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine mögliche Glykosylierungsstelle. O- verknüpft Glykosylierung bezieht sich auf die Bindung von einem oder mehreren der Zucker N- Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxyaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obgleich 5-Hydroxyprolin oder 5-hydroxylysin ebenfalls verwendet werden können.
Glykosylierungsstellen werden dem HER hinzugefügt, indem seine Aminosäuresequenz so verändert wird, dass sie eine oder mehrere der oben beschriebenen Tripeptidsequenzen enthält (für N-verknüpfte Glykosylierungsstellen). Die Änderung kann außerdem durch Addition von oder Substitution durch einen/m oder mehrere(n) Serin- oder Threoninreste(n) an HRG vorgenommen werden (für O- verknüpfte Glykosylierungsstellen). Der Einfachheit halber wird HRG vorzugsweise über Änderungen auf DNA-Ebene verändert, insbesondere durch Mutieren der für HRG kodierenden DNA an vorgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die in die gewünschten Aminosäuren translatieren.
Die chemische oder enzymatische Kopplung von Glykosiden an HRG erhöht die Anzahl an Kohlenhydratsubstituenten. Diese Verfahren sind insofern vorteilhaft, als dass sie nicht die Produktion der Polypeptide in einer Wirtszelle erfordern, die zur N- und O- verknüpften Glykosylierung fähig ist. In Abhängigkeit vom verwendeten Kopplungsmodus kann/können der/die Zucker an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen, wie z.B. jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen, wie z.B. jene von Serin-Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste, wie z.B. jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren sind in der am 11. September 1987 veröffentlichten WO 87/05330 und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., S. 259-306 (1981) beschrieben.
An einem HRG vorhandene Kohlenhydratgruppierungen werden auch chemisch oder enzymatisch entfernt. Die chemische Deglykosylierung erfordert die Exposition des Polypeptids mit der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Behandlung resultiert in der Spaltung der meisten oder aller Zucker mit Ausnahme des verknüpfenden Zuckers (N-Acetylglucosamin oder N- Acetylgalactosamin), während das Polypeptid intakt verbleibt. Die chemische Deglykosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987) und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981) beschrieben. Kohlenhydratgruppierungen werden durch eine Vielzahl von Endo- und Exo-Glycosidasen vom HRG entfernt, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987) beschrieben wird.
Die Glykosylierung wird außerdem durch Tunicamycin supprimiert, wie von Duskin et al., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982) beschrieben wird. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glycosid-Bindungen.
HRG kann auch durch Binden von HRG an verschiedene nicht-proteinartige Polymere, wie z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene in einer Weise modifiziert werden, wie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 dargelegt ist.
Einer der bevorzugten Wege zur Erhöhung der In-vivo-Zirkulationshalbwertszeit von nicht-membrangebundenem HRG ist seine Konjugation an ein Polymer, das eine verlängerte Halbwertszeit verleiht, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG). (Maxfield et al., Polymer 16, 505-509 (1975); F.E. Bailey et al., in: Nonionic Surfactants, M.J. Schick (Hrsg.), S. 794-821 (1967); A. Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3582-3586 (1977); A. Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys. 7, 175-186 (1984); N.V. Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1487-1491 (1987); R. Goodson et al., Bio/Technology 8, 343-346 (1990)). Es ist berichtet worden, dass die Konjugation an PEG eine verminderte Immunogenität und Toxizität aufweist (A. Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 252, 3578-3581 (1977)).
HRG kann außerdem in Mikrokapseln eingeschlossen werden, die beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation (beispielsweise Hydroxymethylcellulose oder Gelatinemikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln), in kolloidalen Medikamentenabgabesystemen (beispielsweise Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoparti keln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen hergestellt werden. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausg., Osol et al. (Hrsg.) (1980) offenbart.
Der Fachkundige auf dem Gebiet der Erfindung ist fähig, Varianten zu screenen, um die optimale Variante für den beabsichtigten Zweck auszuwählen. Beispielsweise wird eine Änderung des immunologischen Charakters von HRG, wie z.B. eine Änderung der Affinität für ein gegebenes Antigen oder für den HER2-Rezeptor, mit einem Immuntest der kompetitiven Art unter Verwendung eines Standards oder einer Kontrolle, wie z.B. eines nativen HRG (insbesondere einer nativen HRG-GFD) gemessen. Andere mögliche Modifizierungen von Protein- oder Polypeptideigenschaften, wie z.B. Redox- oder Thermostabilität, Hydrophobizität, Anfälligkeit für proteolytischen Abbau, Stabilität in rekombinanter Zellkultur oder im Plasma, oder die Tendenz mit Trägern oder zu Multimeren zu aggregieren, werden mit Verfahren getestet, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
1. Herstellung von Heregulin-Antikörpern
Die Antikörper dieser Erfindung werden durch routinemäßiges Screening erlangt und umfassen polyklonale, monoklonale Antikörper und Fragmente davon.
Polyklonale Antikörper werden vorzugsweise in Tieren durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des maßgeblichen Antigens und eines Adjuvans hergestellt. Es kann zweckdienlich sein, das maßgebliche Antigen an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. an Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsin-Inhibitor unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, wobei R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen das Antigen, immunogene Konjugate oder Derivate immunisiert, indem z.B. 100 μg oder 5 μg des Proteins oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina Freund'schem kompletten Adjuvans vermischt und die Lösung intradermal an mehreren Stellen injiziert wird. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Peptid- oder Konjugatmenge in Freund'schem kompletten Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. Sieqben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum auf Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer sein Plateau erreicht hat. Vorzugsweise werden die Tiere mit dem Konjugat desselben Antigens geboostet, das jedoch an ein anderes Protein und/oder durch ein anderes Vernetzungsmittel konjugiert ist. Konjugate können außerdem in rekombinanter Zellkultur als Fusionsproteine hergestellt werden. Außerdem werden Aggregationsmittel, wie z.B. Alaun in geeigneter Weise verwendet, um die Immunantwort zu verstärken.
Monoklonale Antikörper können mit dem erstmals von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975) beschriebenen Hybridomverfahren hergestellt werden, oder können durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden (US-Patent Nr. 4.816.567).
Beim Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Tier, wie z.B. ein Hamster oder Makaken („macaque monkeys") wie hierin oben beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder zur Produktion von Antikörpern fähig sind, die spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden dann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59-103 (1986)).
Die so hergestellten Hybridomzellen werden ausgesät und in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten elterlichen Myelomzellen hem men. Wenn beispielsweise den elterlichen Myelomzellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, wird das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) umfassen, wobei diese Substanzen das Wachstum von HGPRT-defekten Zellen verhindert.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die effizient fusionieren, eine stabile Produktion von Antikörpern im hohen Ausmaß durch die selektierten, Antikörper-produzierenden Zellen fördern und gegen ein Medium, wie z.B. HAT-Medium sensitiv sind. Unter diesen bevorzugten Myelomzelllinien befinden sich Maus-Myelomlinien, wie z.B. jene, die von MOP-21- und M.C.-11-Maustumoren abstammen, die vom Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA erhältlich sind, und SP-2- und X63-Ag8-653-Zellen, die von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelom-Zelllinien sind zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper ebenfalls beschrieben worden (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker Inc., New York, S. 51-63 (1987)).
Das Kulturmedium, in dem die Zellen wachsen, wird auf Produktion von gegen das Antigen gerichteten monoklonalen Antikörpern getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität der von den Hybridomzellen produzierten monoklonalen Antikörper durch Immunpräzipitation oder durch einem In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzyme-linked-immunoabsorbent-assay (ELISA) ermittelt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise mit der Scatchard-Analyse von Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220 (1980) bestimmt werden.
Nachdem Hybridomzellen identifiziert sind, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdün nungsverfahren subkloniert und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59-103 (1986)). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise D-MEM- oder RMPI-1640-Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumore in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden in geeigneter Weise vom Kulturmedium, von der Aszitesflüssigkeit oder vom Serum durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren getrennt, wie z.B. durch Protein-A-SEPHAROSE, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie.
Für die monoklonalen Antikörper kodierende DNA kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. durch Verwendung von Oligonucleotidsonden, die fähig sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten der monoklonalen Antikörper kodieren) leicht isoliert werden. Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle derartiger DNA. Wenn einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren gesetzt werden, die dann in Wirtszellen, wie z.B. E.-coli-Zellen, Simian-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die ansonsten kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erlangen. Die rekombinante Produktion von Antikörpern wird unten ausführlicher beschrieben.
Antikörper produzierende Hybridomzelllinien werden durch Screenen der Kulturüberstände auf Antikörper identifiziert, die an HER2/HER3-Rezeptoren binden. Dies wird routinemäßig durch herkömmliche Immuntests erzielt, und zwar unter Verwendung löslicher Rezeptorpräparate oder durch FACS unter Verwendung eines zellgebundenen Rezeptors und markierten Kandidat-Antikörpers. Agonisten-Antikörper sind vorzugsweise Antikörper, welche die Autophosphorylierung im oben beschriebenen HRG-Tyrosin-Autophosphorylierungstest stimulieren.
Die Hybridzelllinien können in vitro in Zellkulturmedien in Kultur gehalten werden. Die Zelllinien dieser Erfindung können in einer Zusammensetzung selektiert und/oder gehalten werden, welche die kontinuierliche Zelllinie in Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin- (HAT-) Medium umfasst. In der Tat kann sie, wenn die Hybridzelllinien einmal etabliert sind, auf einer Vielzahl von nährstoffmäßig adäquaten Medien gehalten werden. Darüber hinaus können die Hybridzelllinien auf eine beliebige Anzahl herkömmlicher Art und Weisen gelagert werden, einschließlich Einfrieren und Lagerung unter Flüssigstickstoff. Eingefrorene Zelllinien können wiederbelebt und unbegrenzt be neu aufgenommener Synthese und Sekretion des monoklonalen Antikörpers kultiviert werden. Der sekretierte Antikörper wird durch herkömmliche Verfahren, wie z.B. Präzipitation, Ionentauscherchromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen aus dem Gewebekulturüberstand gewonnen. Die hierin beschriebenen monoklonalen Antikörper werden ebenfalls je nach Lage des Falles durch herkömmliche Verfahren der Reinigung von IgG oder IgM, die vordem zur Reinigung dieser Immunglobuline aus gepooltem Plasma verwendet worden sind, z.B. durch Ethanol- oder Polyethylenglykol-Präzipitationsverfahren aus Hybridomzellkulturen gewonnen.
Menschliche Antikörper können verwendet werden und sind vorzuziehen. Derartige Antikörper können durch Verwenden menschlicher Hybridome erlangt werden (Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77 (1985)). Chimäre Antikörper, Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567, (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984); Neuberger et al., Nature 312, 604 (1984); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985)), die eine variable Maus-Anti-HER2/HER3-Region und eine konstante menschliche Region geeigneter biologischer Aktivität aufweisen (wie z.B. die Fähigkeit, menschliches Komplement zu aktivieren und ADCC zu vermitteln), sind im Schutzumfang dieser Erfindung enthalten, so wie es . auch humanisierte Antikörper sind, die durch herkömmliche CDR-Pfropfverfahren hergestellt werden (Riechman et al., Nature 332, 333-327 (1988); EP 328.404 A1 ; EP 02.394.000 A2 ).
Techniken zur Erzeugung rekombinanter DNA-Versionen der antigenbindenden Regionen von Antikörpermolekülen (Fab oder Fragmente variabler Regionen), welche die Erzeugung monoklonaler Antikörper umgehen, sind in der praktischen Umsetzung dieser Erfindung ebenfalls vorgesehen. Man extrahiert Antikörper-spezifische Messenger-RNA-Moleküle aus einem immunisierten Subjekt entnommenen Immunsystemzellen, transkribiert diese in komplementäre DNA (cDNA) und kloniert die cDNA in ein bakterielles Expressionssystem und selektiert auf die gewünschten Bindungseigenschaften. Das Scripps/Stratagene-Verfahren verwendet ein Bakteriophagen-Lambda-Vektorsystem, das eine Leadersequenz enthält, welche die Migration des exprimierten Fab-Proteins in den periplasmatischen Raum (zwischen die Bakterienzellmembran und die Zellwand) oder seine Sekretion bewirkt. Man kann rasch eine große Anzahl von funktionellen Fab-Fragmenten erzeugen und screenen, um jene zu identifizieren, welche die Rezeptoren mit den gewünschten Eigenschaften binden. Alternativ dazu können die Antikörper durch Phagen-Display-Techniken, die in Hoogenboom, Tibtech Februar 1997 (Bd. 15); Neri et al., Cell Biophysics 27, 47-61 (1995); Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-55 (1994); und Soderlind et al., Immunol. Rev. 130, 109-124 (1992) und den darin beschriebenen Literaturstellen beschrieben sind, sowie durch die in Lowman et al., Biochem. 30, 10832-10838 (1991) beschriebene monovalente Phagen-Display-Technik hergestellt werden.
2. Therapeutische Zusammensetzungen, Verabreichung und Verwendung von Heregulin und Agonisten-Antikörpern
Die HRG werden in der vorliegenden Erfindung dazu verwendet, um Epithelzellenwachstum, beispielsweise Lungenepithelzellenwachstum, Proliferation und Differenzierung zu induzieren und um die Produktion von Tensid-Protein A durch Lungenzellen zu erhöhen. Diese Wirkungen ermöglichen die Behandlung von Krankheitszuständen, die mit Gewebeschädigung in Verbindung stehen, beispielsweise chronische obstruktive Lungenerkrankung (COPD), einschließlich Subtypen davon, wie z.B. chronische Bronchitis, Emphysem, Asthma usw., neonatale Lungenerkrankungen, einschließlich neonatales Atemnotsyndrom, Mekonimatemsyndrom, chronische Lungenerkrankung des Neugeborenen, kongenitale Diaphragmahernie usw., akute Lungenverletzungen, einschließlich Rauch- oder Chemikalieninhalation, Pneumonitis aufgrund von Aspiration, Strahlung usw., Beinahe-Ertrinken, Zystofibrose und andere traumatische Epithelzellentraumen, einschließlich Krankheiten, die mit Operationswunden und Resektionen in Verbindung stehen, Geschwüre, Läsionen und Geweberisse, und zwar mit dem gemäß der Erfindung hergestellten Medikament.
Ein bevorzugte Indikation für die Behandlung mit dem gemäß der Erfindung hergestellten Medikament ist die Behandlung von COPD. COPD ist ein Spektrum chronischer entzündlicher Atemwegserkrankungen, die durch Husten, Auswurf, Dyspnoe, Luftstromlimitierung und beeinträchtigten Gasaustausch gekennzeichnet sind. COPD ist bei älteren Populationen häufig und zeigt ein Muster allmählich abfallender Lungenfunktion. Typischerweise weist ein Patient chronischen Husten mit klarem Auswurf auf, der sich zu einem Husten mit dickflüssigem Auswurf verschlimmert und von einem schlechten Luftaustausch begleitet ist. Diese Zustände führen häufig zu einer Herzerkrankung und zum Tod. Viele Personen mit COPD weisen eine chronische Bronchitis gemeinsam mit Emphysem auf. Die vorliegenden Erfindung ist von besonderer Bedeutung, da sie den Lungenzerstörungsprozess in COPD-Patienten heilt, verlangsamt und/oder umkehrt. Hinsichtlich dieser Wirkung unterscheidet sich das gemäß der Erfindung hergestellte Medikament stark von typischen Behandlungen von COPD, bei denen Symptome behandelt werden, nicht jedoch die darunter liegende Zerstörung von Lungengewebe und Funktion.
Das gemäß der Erfindung hergestellte Medikament kann jedoch mit anderen Therapien zur Behandlung einer Lungenerkrankung, wie z.B. COPD kombiniert oder gemeinsam verabreicht werden. Beispielsweise kann das gemäß der Erfindung hergestellte Medikament gemeinsam mit der Verabreichung eines anticholergenen Bronchodilatators, wie z.B. Ipratropiumbromid (ATROVENT, erhältlich von Boehringer Ingelheim) der Tiotropium, eines Beta-adrenergischen Rezeptoragonisten, wie z.B. Albuterol (PROVENTIL, erhältlich von Schering) oder Salmeterol, von Steroiden, wie z.B. Prednison, Retinsäure, Phosphodiesterase-Inhibitoren, Endothelin- Antagonisten, Metalloproteinase-Inhibitoren, Elastase-Inhibitoren, RadikalInhibitoren, Serinprotease-Inhibitoren, Neutrophilen-Elastase-Inhibitoren, Lungentensid-Zusammensetzungen, wie z.B. Beractant (SURVANTA, erhältlich von Ross Labs.), PDGF, FGF, EGF, Wachstumshormon oder anderen Proteinwachstumsfaktoren usw. oder Kombinationen davon verwendet werden. Die relative Menge des HRG und der zusätzlichen Verbindung(en) kann leicht von einem Arzt im Hinblick auf die individuellen Symptome des Patienten ermittelt werden. Es wird erwartet, dass diese Zusammensetzungen und die relativen Mengen der darin enthaltenen Komponenten wie erforderlich variiert werden, um den speziellen Bedürfnisse eines Patienten gerecht zu werden, und dass sie unter Verwendung herkömmlicher physikalisch-chemischer und medizinischer Tests für die Lungenfunktion überwacht und eingestellt werden.
Therapeutische Formulierungen von HRG oder Agonisten-Antikörper werden zur Lagerung durch Vermischen des HRG-Proteins mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o.) in Form eines lyophilisierten Kuchens oder wässriger Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare (weniger als ungefähr 10 Reste) Polypeptide; Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; chelatierende Mittel, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside, wie z.B. TWEEN, PLURONICS oder Polyethylenglykol (PEG).
Für eine In-vivo-Verabreichung verwendete HRG- oder Antikörperzusammensetzungen müssen steril sein. Dies wird leicht durch Filtration durch sterile Filtrationsmem branen vor oder nach Lyophilisierung und Rekonstitution erzielt. HRG oder Antikörper wird für gewöhnlich in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische HRG- oder Antikörperzusammensetzungen werden im Allgemeinen in einen Behälter gegeben, der eine sterile Füllöffnung aufweist, beispielsweise ein Beutel oder Fläschchen für intravenöse Lösungen mit einem von einer Subkutankanüle durchstechbaren Stopfen.
Der Weg der HRG- oder Antiköperverabreichung steht mit bekannten Verfahren im Einklang, z.B. Injektion oder Infusion durch intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale, intramuskuläre, intraokuläre, intraarterielle, Pulver- oder Flüssigaerosol-Verabreichung an die Nase oder Lunge, oder intraläsionale Wege, oder durch Systeme mit nachhaltiger Freisetzung, wie sie unten erwähnt sind. Der HRG-Ligand kann kontinuierlich durch Infusion oder durch Bolusinjektion verabreicht werden. Ein Agonisten-Antikörper wird vorzugsweise in derselben Weise verabreicht oder durch Verabreichung in den Blutstrom oder in die Gewebsflüssigkeit.
HRG, die HRG-Variante oder das Fragment und Agonist-Antikörper können unter Anwendung bekannter Techniken sprühgetrocknet oder sprühgefriergetrocknet werden (Yeo et al., Biotech. and Bioeng. 41, 341-346 (1993); Gombotz et al., PCT/US90/02421).
Geeignete Beispiele von Präparaten mit nachhaltiger Freisetzung umfassen semipermeable Matrices fester hydrophober Polymere, die das Protein enthalten, wobei die Matrices in Form von Formteilen, z.B. Filmen oder Mikrokapseln vorliegen. Beispiele von Matrices mit nachhaltiger Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie sie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167-277 (1981) und Langer, Chem. Tech. 12, 98-105 (1982) beschrieben werden, oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gamma-Ethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547-556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. LUPRON DEPOT (injizierbare Mikrokügelchen, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuproidacetat zusammengesetzt sind) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ). Während Polymere, wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen für über 100 Tage ermöglichen, setzen gewisse Hydrogele Proteine für kürzere Zeiträume frei. Wenn verkapselte Proteine für lange Zeit im Körper verbleiben, können sie als Ergebnis der Exposition mit Feuchte bei 37 °C denaturieren oder aggregieren, was in einem Verlust biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität resultiert. Es können rationale Strategien für die Proteinstabilisierung in Abhängigkeit vom beteiligten Mechanismus entwickelt werden. Wenn beispielsweise der Aggregationsmechanismus als Bildung intermolekularer S-S-Bindungen über Thio-Disulfid-Austausch erkannt wird, kann eine Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Kontrollieren des Feuchtegehalts unter Verwendung geeigneter Zusatzstoffe und Entwickeln spezieller Matrixzusammensetzungen erzielt werden.
HRG- oder Antikörperformulierungen mit nachhaltiger Freisetzung umfassen außerdem in Liposomen eingeschlossene(s) HRG oder Antikörper. HRG oder Antikörper enthaltende Liposomen werden mittels Verfahren hergestellt, die an sich bekannt sind: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030-4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung Nr. 83-118008; US-Patente Nr. 4.485.045 und 4.544.545; und EP 102.324 . Für gewöhnlich sind die Liposomen vom kleinen (ungefähr 200-800 Angström) unilamellaren Typ, in denen der Lipidgehalt mehr als ungefähr 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der gewählte Anteil für die optimale HRG-Therapie eingestellt wird. Liposomen mit erhöhter Zirkulationszeit sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
Eine wirksame Menge von therapeutisch einzusetzendem HRG oder Antikörper hängt üblicherweise beispielsweise von den therapeutischen Zielen, dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten ab. Außerdem ist die Menge an HRG- Polypeptid im Allgemeinen geringer als die Menge eines Agonisten-Antikörpers. Demgemäß wird es für den Therapeuten notwendig sein, die Dosierung zu titrieren und den Verabreichungsweg wie erforderlich zu modifizieren, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische tägliche Dosis kann im Bereich von ungefähr 1 μg/kg bis ungefähr 1 mg/kg und bis zu 100 mg/kg oder in Abhängigkeit von den oben erwähnten Faktoren betragen. Typischerweise wird der Kliniker HRG oder Antikörper verabreichen, bis eine Dosierung erreicht ist, welche die gewünschte Wirkung erzielt. Der Fortschritt dieser Therapie wird leicht durch herkömmliche Tests, beispielsweise Tensid-Protein-A-Produktion überwacht.
In einer weiteren Ausführungsform können Epithelzellen aus einem Säugetiergewebe erlangt oder isoliert werden, um eine normale Epithelzellenprobe unter Verwendung von Techniken zu erhalten, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind (Biopsie usw.). Diese Probe kann dann mit einem Heregulin-Protein behandelt werden, um das Wachstum und/oder die Proliferation von Epithelzellen in der Probe zu induzieren, wodurch die Population primärer Epithelzellen expandiert wird. Typischerweise wird Heregulin in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 100 nM, vorzugsweise 1-50 nM der In-vitro-Epithelzellen-Zellkultur zugegeben. Wenn gewünscht, können die primären Epithelzellen für mehrere Generationen in vitro kultiviert werden, um die Epithelzellenpopulation ausreichend zu expandieren. Die Epithelzellen werden unter Bedingungen kultiviert, die für die Säugetierzellkultur wie oben erörtert geeignet sind. Nach der Expansion wird die expandierte Probe zum Zwecke der Reepithelisierung des Säugetiergewebes wieder in das Säugetier eingeführt. Beispielsweise können aus einem Patienten mit Emphysem oder chronischer obstruktiver Lungenerkrankung isolierte Lungenepithelzellen erlangt, expandiert und wieder in die Lunge eingeführt werden, um die Reepithelisierung des geschädigten Lungengewebes zu beschleunigen, wodurch die Lungenfunktion wiederhergestellt wird. Die expandierten Zellen können durch Aspiration oder Intubation unter Verwendung von Verfahren wieder in die Lunge eingeführt werden, die auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt sind.
Die hierin in Bezug auf HRG-α oder HRG im Allgemeinen beschriebenen Verfahren können auf ähnliche Weise auf andere HEG, wie z.B. HRG-β1, HRG-β2 und HRG-β3 und auf Varianten davon, sowie auf die Antikörper angewendet werden. Die folgenden Beispiele werden zur Illustration bereitgestellt und schränken die Erfindung nicht ein.
Beispiele
Beispiel 1 Herstellung von Heregulinen

(a) Die Hereguline HRG-α, HRG-β1, HRG-β2, HRG-β2-artig und HRG-β3 wurden wie im US-Patent Nr. 5.367.060 beschrieben aus dem Zellkulturmedium isoliert, kloniert und exprimiert.
(b) SMDF-Polypeptide wurden wie in WO 96/15244 beschrieben hergestellt.
(c) γ-HRG-Polypeptid wurde wie unten beschrieben hergestellt und charakterisiert.

Reagenzien: Die EGF-artige Domäne von HRGβ1_(177-244) wurde in E. coli exprimiert, gereinigt und wie früher beschrieben radioiodiert (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem. 269, 14661-14665 (1994)). Die monoklonalen Anti-HER2-Antikörper 2C4 und 4D5 sind anderswo beschrieben worden (Fendly et al., Cancer Research 50, 1550-1558 (1990)).
HER3- und HER4-Immunoadhäsine: Eine einzigartige MI-I-Stelle wurde gentechnisch in ein Plasmid, das die menschliche IgG-Schwerkette exprimiert, an der für die Gelenksregion des Immunglobulins kodierenden Region eingebaut. MI-I-Stellen wurden ebenfalls gentechnisch in einen Satz von HER-Expressionsplasmiden an der für die ECD/-TM-Verbindungen kodierenden Region dieser Rezeptoren eingebaut. Alle Mutagenesen wurden unter Verwendung des Kunkel-Verfahrens durchgeführt (T. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488 (1985)). Die MI-I-Stellen wurden einge setzt, um die geeigneten HER-IgG-Fusionskonstrukte herzustellen. Die Fusionsverbindungsstellen der verschiedenen HER-IgG-Chimären waren die folgenden: für HER2, E⁶⁴⁶ _HER2-(TR)-DKTH²²⁴ _VH; für HER3, L⁶³⁶ _HER3-(TR)-DKTH²²⁴ _VH; für HER4, G⁶⁴⁰ _HER4-(TR)-DKTH²²⁴ _VH. Die konservierte TR-Sequenz stammt von der MI-I-Stelle. Die endgültigen Expressionskonstrukte befanden sich in einem pRK-artigen Plasmidgerüst, worin die eukaryotische Expression von einem CMV-Promotor angetrieben wird (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2, 3-10 (1990)).
Um Protein für In-vitro-Experimente zu erlangen, wurden anhaftende HEK-293-Zellen mit den geeigneten Expressionsplasmiden unter Verwendung standardmäßiger Calciumphosphatverfahren transfiziert (Gorman et al., s.o., und Huang et al., Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990)). Serum enthaltendes Medium wurde 15 Stunden nach der Transfektion durch serumfreies Medium ersetzt und die transfizierten Zellen für 5-7 Tage inkubiert. Das resultierende konditionierte Medium wurde geerntet und durch Protein-A-Säulen (1 ml, Pharmacia HiTrap^TM) geschickt. Gereinigte IgG-Fusionen wurden mit 0,1 M Zitronensäure (pH 4,2) in 1 M Tris (pH 9,0) enthaltende Röhrchen eluiert. Die eluierten Proteine wurden anschließend gegen PBS dialysiert und unter Verwendung von Centri-prep-30-Filtern (Amicon) konzentriert. Glycerin wurde auf eine Endkonzentration von 25 % zugegeben und das Material bei -20 °C gelagert. Materialkonzentrationen wurden über Fc-ELISA bestimmt.
Zellkultur: Die menschlichen Brustkrebszelllinien MDA-MB-175, MDA-MB-231, SK-BR-3 und MCF7 wurden von der American Type Culture Collection erhalten und in einem 50:50-Gemisch von Ham's Medium F12 und Dulbecco's Modified Eagle-Medium (DMEM) gehalten, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 2 mM Glutamin und 10 % Penicillin-Streptomycin ergänzt war.
Erzeugung und Charakterisierung der cDNA-Bibliothek: Gesamt-RNA wurde aus MDA-MB-175-Zellen unter Verwendung des Guanidinium-Isothiocyanat-Cäsiumchlorid-Verfahrens gereinigt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)). Poly (A)*-RNA wurde unter Verwendung von Oligo-(dT)-Dynabeads (DYNAL) wie von Lieferanten empfohlen isoliert. Erst- und Zweitstrang-Synthesen wurde unter Verwendung eines cDNA-Synthesesets von Gibco BRL durchgeführt. λgt10-cDNA-Rekombinanten wurden erzeugt, wenn ein cDNA-Klonierungssystem von Amersham verwendet wurde. Die In-vitro-Verpackung wurde unter Verwendung von Gigapack-II-Verpackungsextrakt (Stratagene) durchgeführt. Das PstI-XhoI-HRGβ3-cDNA-Fragment (nt 144-618) wurde durch Zufallsprimen markiert und es wurden 1 × 10⁶ Plaques gescreent. Positive Klone wurden durch sekundäres und tertiäres Screening bestätigt und gereinigt. Phagen-DNA wurde als ein BamHI-Fragment isoliert und in die entsprechende Stelle von pBluescript SL subkloniert. Klon 5 wurde unter Verwendung des Sequenase-DNA-Sequenzierungssets Version 2.0 (United States Biochemicals Inc.) vollständig sequenziert. Es wurden beide Stränge sequenziert.
Bakterielles Expressionssystem: Ein cDNA-Fragment des Klons 5 (nt 1690-2722) wurde in den pET-32 TRX-Fusionsvektor (Novagen) subkloniert. Dieses BglII-BglII-Fragment wurde in die BamHI-Stelle des pET32a-Plasmids insertiert. Die trxγ-(Aminosäuren 455-768) Proteinexpression in E. coli wurde wie vom Lieferanten empfohlen induziert.
Reinigung von rekombinantem γ-HRG: trxγ-exprimierende E.-coli-Zellen wurden gesammelt und zu 9 ml/g in 50 mM Tris-HCl, pH 8, suspendiert. Es wurde Lysozym auf eine Endkonzentration von 0,2 mg/ml zugegeben und die Lösung für 1 Stunde auf Eis gerührt. Dnase I (10 μg/ml) und MgCl₂ (4 mM) wurden zugesetzt. Die Lösung wurde dann für 30 Minuten beschallt und die Zellpellets danach gesammelt. Die Pelletfraktion wurde zu 250 mg/g in 6 M Gdn-HCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,8 gelöst. Die solubilisierten Proteine wurden durch Zugabe von 1/10 Volumenanteil 1 M Na₂SO₃ und 1/10 Volumenanteil 0,2 M Na₂S₄O₆ sulfitolysiert. Die Reaktion wurde für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur ablaufen gelassen und das Protein durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer High Load Superdex^TM 75 Prep-Grade-Säule (Pharmacia) gereinigt. Die Neufaltung wurde durch Zugabe von 1 mM Cystein ausgelöst und 10 mM Methionin wurde als Antioxidans zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proteinkonzentration wurde durch quantitative Aminosäureanalyse bestimmt.
Northern- und Southern-Hybridisierung: Gesamt-RNA wurde mit dem Verfahren von Chomczynski et al., Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987) isoliert. Poly (A)⁺ wurde unter Verwendung von Oligo-d(T)-Zellulosesäulen (Qiagen) wie vom Lieferanten empfohlen isoliert. RNA wurde in einem 0,8 % Formaldehyd/1 % Agarosegel denaturiert und nach Größe fraktioniert und auf eine Nylonmembran (Hybond, Amersham) übertragen. Die RNA wurde UV-vernetzt (UV Stratalinker, Stratagene). Die Vorhybridisierung wurde bei 42 °C in 50 % Formamid/1 % SDS/1 M NaCl, 10 % Dextransulfat und 100 μg/ml Hering-Spermien-DNA für zumindest 12 Stunden durchgeführt. cDNA-Sonden wurden unter Verwendung von entweder einem Restriktionsfragment mit komplementärer Sequenz zur EGF-artigen Domäne von HRGγ3 oder einem für die einzigartige Sequenz von γ-HRG (nt 1238-1868) kodierenden cDNA-Fragment durch Zufallsprimen markiert (Prime-It II, Stratagene). Die Hybridisierung wurde in derselben, das ³²P-markierte Fragment enthaltenden Lösung bei 42 °C für 16 Stunden durchgeführt. Die Blots wurden mehrere Male mit 2 × SSC/1 % SDS bei Raumtemperatur gewaschen. Die Blots wurden luftgetrocknet und mit Du Pont Reflection^TM-Film mit Verstärkerfolien bei -80 °C für 7-40 Stunden exponiert. Mehrere Northern-Blots (Clontech) menschlicher Gewebe, die 2 μg Poly (A)⁺ aus Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm, Dickdarm, Peripherblutleukozyten, herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas enthielten, wurden mit einer radioaktiv markierten γ-HRG-cDNA-Sonde (nt 841-1447) wie von Lieferanten empfohlen hybridisiert.
Genomische MDA-MB-175- und MDA-MB-231-DNA wurden wie in Sambrook et al., s.o., isoliert. Die DNA wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, vor der Übertragung mit 0,25 M HCl behandelt und auf eine Nylonmembran (Hybond, Amersham) übertragen. Das BglII-Ndel-cDNA-Fragment von γ-HRG (nt 1690-2351) wurde durch Zufallsprimen ebenfalls radioaktiv markiert und als Hybridisierungssonde verwendet. Die Vorhybridisierung wurde in 6 × SSC/5 × Denhard's/0,75 % SDS, 10 % Dextransulfat und 100 μg/ml Hering-Spermien-DNA bei 68 °C für 4 Stunden durchgeführt und die Hybridisierung mit radioaktiv markierter Sonde wurde über Nacht durchgeführt. Es wurden dieselben Waschbedingungen wie für die Northern-Blots verwendet mit der Ausnahme, dass ein Waschschritt mit 0,2 × SSC/0,1 % SDS bei 68 °C hinzugeführt wurde, und es wurde mit der Detektion wie oben beschrieben fortgesetzt.
¹²⁵I-HRG-Bindungstest: Bindungstests wurden in Abbrechstreifen-Näpfen von Nunc durchgeführt. Die Platten wurden über Nacht bei 4 °C mit 100 μl einer Lösung von 5 μg/ml Ziege-Anti-Mensch-Antikörper (Boehringer Mannheim) in 50 mM Carbonatpuffer (pH 9,6) beschichtet. Die Platten wurden zweimal mit Waschpuffer (PBS/0,05 % Tween-20) gewaschen und mit 100 μl 1 % BSA/PBS für 30 Minuten geblockt. Der Puffer wurde entfernt und jeder Napf mit 15 ng IgG-Fusionsprotein in 1 % BSA/PBS unter kräftigem Schütteln für 1,5 Stunden inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit Waschpuffer gespült und die kompetitive Bindung durch Zugabe variierender Mengen an γ-HRG und ¹²⁵I-HRGβ1 unter kräftigem Schütteln durchgeführt. Nach einer Inkubation für 1,5 bis 2 Stunden wurden die Näpfe dreimal mit Waschpuffer gewaschen, entleert und die einzelnen Näpfe unter Verwendung eines 100 Series Iso Data-γ-Zählers gezählt.
Tyrosinphosphorylierungstest: MCF7-Zellen wurden in 24-Napf-Platten zu 1 × 10⁵ Zellen/Napf in 10 % FBS enthaltendem F12/DMEM ausplattiert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit serumfreiem F12/DMEM gewaschen und für 6 Stunden serumausgehungert. Verschiedene Konzentrationen bakteriell exprimiertes, trunkiertes γ-HRG (d.h. 0 pM, 22 pM, 66 pM, 200 pM und 600 pM trxγ-HRG) oder ungereinigtes konditioniertes Medium von MDA-MB-175-Zellen wurden in Bindungspuffer (0,1 % BSA in F12/DMEM) hergestellt und jedem Napf zugegeben. Nach 8 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Medium vorsichtig abgesaugt und die Reaktionen durch Zugabe von 100 μl Probenpuffer (5 % SDS, 0,25 % 2-Mercaptoethanol, 25 mM Tris-HCl, pH 6,8) gestoppt. 20 μl jeder Probe wurden in einem 4- bis 12%igen Gradientengel (Novex) nach Größe fraktioniert und dann elektrophoretisch auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Antiphosphotyrosin- (4G10, von UBI, mit 1 μg/ml verwendet) Immunblots wurden entwickelt und die vorherrschende reaktive Bande bei M_r~180 kDa mittels Reflexionsdensitometrie quantifiziert.
Produktion und Charakterisierung von konditioniertem Medium aus MDA-MB-175-Zellen: Zellen wurden in T175-Kolben ausgesät und gezüchtet, bis 70-80 % Konfluenz (~2,5 × 10⁷ Zellen/Kolben) erreicht waren. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in serumfreiem F12/DMEM-Medium für 3-4 Tage gezüchtet. Das Medium wurde dann gesammelt, filtriert und unter Verwendung einer Ultrafiltrationszelle mit YM10-Diaflo-Ultrafiltrationsmembranen (Amicon) konzentriert. γ-HRG wurde in konditioniertem Medium von MDA-MB-175-Zellen durch Western-Blot-Analyse unter nicht-reduzierenden Bedingungen sichtbar gemacht. γ-HRG wurde mittels HPLC unter Verwendung einer C4-Umkehrphasensäule teilweise gereinigt. CHO-exprimiertes Volllängen-HRGβ1 (Lane 1) und teilgereinigtes γ-HRG (Lane 2) wurden der Elektrophorese unterzogen, der Blot wurde mit HER2/HER4-IgG-Heterodimeren sondiert und der Western-Blot entwickelt. Eine Bande von ~64 kDa war in derjenigen Lane zu sehen, die die teilweise gereinigten Überstand enthielt, wogegen CHO-exprimiertes HRGβ1 voller Länge als 45 kDa-Protein migrierte.
Zellproliferationstest mit Kristallviolett: Tumorzelllinien wurden in den folgenden Dichten in 96-Napf-Platten ausplattiert: 2 × 10⁴ Zellen/Napf für MDA-MB-175 und 1 × 10⁴ Zellen/Napf für SK-BR-3. Das Medium enthielt 1 % FBS und die Zellen wurden für 2 Stunden anhaften gelassen. Monoklonale Antikörper, Immunoadhäsionen (10 μg(ml) oder Medium alleine wurden den Zellen zugegeben und für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. rHRGβ1_177-244 wurde in einer Endkonzentration von 1 nM, oder 100 nM für die Neutralisierung der Immunoadhäsion zugegeben und die Zellen für 4 Tage inkubiert. Die Monolayers wurden mit PBS gewaschen und mit 0,5 % Kristallviolett gefärbt/fixiert. Die Platten wurden luftgetrocknet, der Farbstoff mit 0,1 M Natriumcitrat (pH 4,2) in Ethanol (50:50) eluiert und die Absorption bei 540 nm gemessen.
Isolierung und Sequenzanalyse von γ-HRG: Um das Heregulin-Transkript in MDA-MB-175-Zellen zu charakterisieren, wurde eine γgt 10-cDNA-Bibliothek mit aus dieser Zelle stammender mRNA konstruiert. Die Bibliothek wurde mit einer cDNA-Sonde gescreent, die der EGF-artigen Domäne und einem Abschnitt der N-terminalen Sequenz von HRGβ3 entsprach. Es wurden verschiedene Klone identifiziert. Einer der Klone, der die cDNA-Sequenz voller Länge zu enthalten schien, wurde isoliert und sequenziert. 7A-7D zeigt die Nucleotidsequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz von γ-HRG. Das einzelne offene Leseraster von 2303 bp beginnt mit einem ATG-Codon bei nt 334. Dieses Startcodon liegt in einem Nucleotidsequenz-Zusammenhang, der bekanntermaßen eine mögliche Translationsinitiationsstelle ist (Kozak, Nucleic Acid Research 15, 8125-8148 (1987)). Es wurden mehrere Terminationscodons stromauf des Initiationscodons gefunden. Dem Stopcodon bei nt 2637 folgt eine 3'-nicht-kodierende Sequenz, die mit anderen HRG-Isoform-Sequenzen identisch ist und ein Polyadenylierungssignal, gefolgt von einer A-reichen Region umfasst. Das offene Leseraster kodiert für ein Protein mit 768 Aminosäureresten mit einem berechneten Molekulargewicht von 84,2 kDa.
(d) Die Selektion von HRG-β1-Varianten, die der minimalen EGF-artigen Domäne entsprechende Reste enthalten (HRG-β1 177-228), wurde unter Verwendung des monovalenten Phagen-Display durchgeführt. Für diese Varianten werden die Restenummern (in Klammer) außerdem bezüglich der Position des Rests in der minimalen EGF-artigen Domäne (d.h. HRG-β1 EGF 1-52) ausgedrückt.
Varianten von HRG-β1-EGF wurden unter Verwendung des monovalenten Phagen-Display nach dem Verfahren von Bass et al., Proteins 8, 309-314 (1990) hergestellt und selektiert. Wie unten ausführlich behandelt wird, wurde ein HRG-β1-EGF-Phagemidvektor hergestellt, in dem HRG-β1-EGF an ein C-terminales Fragment des M13-Hüllproteins pIII fusioniert war. Es wurde eine Kunkel-Mutagenese durchgeführt, um Stopcodons in diesen Vektor an für die Randomisierung gewählten Stellen einzuführen. Dieser Schritt gewährleistet, dass der Anfangsvektor unfähig ist, das Polypeptid der Wildform zu exprimieren. Abschnitte von vier bis sechs Resten pro Biblio thek wurden in linearer Weise randomisiert, mit Ausnahme der sechs Cysteine, Phe189 (HRG-β1 EGF Phe13) und der beiden äußersten C-terminalen Reste. Phe189 wurde nicht verändert, das dieser Rest als aromatischer Rest in EGF und TGF-α konserviert ist und eine Stapelungswechselwirkung mit Tyr208 (HRG-β1 EGF Tyr32) bildet (Jacobsen et al., Biochemistry 35, 3402-17 (1996)). HRG-β1 EGF wurde daher von acht Bibliotheken abgedeckt, die als A-e, G, H und I bezeichnet werden.
Bibliothek E, die HRG-β1 202-209 (HRG-β1 EGF 26-33) abdeckt, enthielt eine Deletion von drei Resten. Die deletierte Region entspricht einer ungeordneten Wende zwischen dem zweiten und dritten β-Faltblatt von HRG-β1 EGF, und die äquivalenten Aminosäuren fehlen in EGF und TGF-α. Eine HRG-β1 EGF-Kontrollvariante, bei der HRG-β1 202-204 (HRG-β1 EGF 26-28) von HRG8 deletiert ist (HRG63), band HRG-3-Ig mit einer ähnlichen Affinität wie das der Wildform.
Eine zusätzliche Bibliothek (F) wurde erzeugt, um ein aus Seitenketten aus dem ersten und zweiten β-Faltblatt zusammengesetztes Oberflächenstück zu randomisieren, das HRG-β1 178, 180, 198 und 200 (HRG-β1 EGF 2, 4, 22 und 24) umfasste.
Die gewählten Stellen in den Anfangsvektoren wurden durch Kunkel-Mutagenese randomisiert, um HRG-β1 EGF-Bibliotheken herzustellen. Phagen-Display-mutierte HRG-β1 EGFs wurden aus den Bibliotheken unter Bedingungen hergestellt, so dass statistisch jedes Phagenteilchen nicht mehr als eine Kopie des mutierten HRG-β1 EGF präsentierte. Siehe Bass et al., s.o. Dieser Phage wurde dann zur Bindung an HER-3-Ig, das an einer ELISA-Platte immobilisiert war, selektiert (dagegen sortiert). Gebundene Phagen wurden eluiert und zur Neuinfektion von Wirtszellen verwendet, die verwendet wurden, um neue Phagen für einen weiteren Sortierungsumlauf herzustellen. Dieser Vorgang wurde sechs bis sieben Mal für jede Bibliothek wiederholt. Zwölf Klone der aus jeder Bibliothek selektierten Phagen wurden dann sequenziert.
Tabelle 2: Varianten der Bibliothek A
Tabelle 3: Varianten der Bibliothek B
Tabelle 4: Varianten der Bibliothek C
Tabelle 5: Varianten der Bibliothek D
Tabelle 6: Varianten der Bibliothek E
Tabelle 7: Varianten der Bibliothek G
Beispiel 2 – HER2/HER3-Expression in embryonaler Rattenlunge
Rattenlungen wurden aus Rattenembryos am embryologischen Tag (E) 16, 18, 20 und nach der Geburt (P) an den Tagen 7, 14 und adult mikrodissektiert. Das isolierte Lungengewebe wurde in einem standardmäßigen Proteaseinhibitorpuffer homogenisiert und gleiche Proteinmengen der SDS-PAGE (4-10 %) unterzogen, auf Nitrozellulose geblottet und mit spezifischen Antikörpern (HER2, HER3, HER4 – Santa Cruz Biological, San Jose, CA, du HRG, 3G11, Genentech Inc.) unter Verwendung von Chemilumineszenztechniken identifiziert.
Die Analyse des Blots weist darauf hin, dass HER2 in hohem Ausmaß über die gesamte Entwicklung im Uterus exprimiert wird, bei E18 scheinbar ihr Maximum erreicht und nach der Geburt auf niedrigere adulte Ausmaße abfällt. Die HER3-Expression hat ihr Maximum bei E18 und fällt dann nach der Geburt auf niedrigere adulte Ausmaße ab. HER4 wird zu keinem Zeitpunkt während der Lungenentwicklung festgestellt. Eine HRG-Vorform (75 kDa-Protein) könnte bei E16 vorhanden sein, das Maximum bei E18 erreichen um dann auf niedrigere adulte Ausmaße abzufallen. Diese Daten legen nahe, dass das HER2/HER3-System entwicklungsmäßig während der Lungenentwicklung moduliert wird und der aktive Rezeptor ein HER2/HER3-Heterodimer sein könnte. Die Zeitspanne, während der die Rezeptoren das Expressionsmaximum erreichen (E18), stellt das pseudoglanduläre Stadium der Rattenlungenentwicklung dar (Tage 13-18), das an das kanalikuläre Stadium angrenzt (Tage 19-20). Während dem pseudoglandulären Stadium ist die Lungenepithel-Proliferation höher als zu jedem anderen Zeitpunkt. Während dem kanalikulären Stadium beginnt die Differenzierung mit dem Auftreten von Pneumozyten des Typs I und Pneumozyten des Typs II (Sufactant-produzierend). Dies weist auf eine Rolle für die HRG-/HER-Wechselwirkung in einem der Prozesse oder in beiden Prozessen hin.
Beispiel 3 – HER2/HER3-Expression in menschlicher Fötus-Lunge
Menschliche Fötus-Lunge wurde aus Embryos des mittleren Drittels (17-22 Wochen) erlangt. Lungengewebe wurde in serumfreiem Weymouth-Medium an einer Luft-Flüssig-Grenzfläche bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ kultiviert. Gewebe wurde aus der Kultur am Tag 0 (Tag des Erhalts des Gewebes) und nach 1-4 Tagen (D) in Kultur (D1-D4) geerntet, in einem standardmäßigen Proteaseinhibitorpuffer homogenisiert, worauf gleiche Proteinmengen der SDS-PAGE (4-20 %) unterzogen, auf Nitrozellulose geblottet und mit spezifischen Antikörpern identifiziert wurden.
HER2 wird bei D0 exprimiert und das Expressionsausmaß erhöht sich während der In-vitro-Kultur. HER3 ist in niedrigen oder nicht nachweisbaren Ausmaßen bei D0 zugegen und das Expressionsausmaß erhöht sich während der In-vitro-Kultur. HER4 wurde zu keinem Zeitpunkt während der Lungenentwicklung identifiziert. HRG wurde bei D0 nicht identifiziert, wurde jedoch als ein 75.000 Da-Protein bei D1-D2 identifiziert und das Expressionsausmaß erhöhte sich im Verlauf der Kulturzeit. Dieses menschliche Explantatmodell wiederholt einen Teil des normalen Lungenentwicklungsprogramms über die 5 Tage in Kultur hinweg. Die Entwicklung findet rasch statt, wobei sowohl die Proliferation, als auch die Differenzierung von Epithelzellen gemeinsam mit Luftraumbildung auftritt. Diese Daten zeigen an, dass das HER2/HER3-System auch während der menschlichen In-vitro-Lungenentwicklung moduliert wird und der aktive Rezeptor ein HER2/HER3-Heterodimer sein könnte. Das dritte Drittel stellt das späte pseudoglanduläre (Tage 42-112) und kanalikuläre Stadium (Tage 112-196) der menschlichen Lungenentwicklung dar. Wie bei der Ratte findet während dem pseudoglandulären Stadium die Proliferation und Bildung von zukünftigen Luftwegen statt. Während dem kanalikulären Stadium findet die Differenzierung des Epithels statt.
Beispiel 4 – Expression von HER2 und HER3 in menschlicher Lunge
HER2 und HER3 werden ausschließlich im Lungenepithel während der Lungenentwicklung exprimiert. Menschliche Lunge des mittleren Drittels wurde in vitro wie zuvor beschrieben kultiviert. Das Gewebe wurde täglich geerntet, schockgefroren und es wurden 5 μm-Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden auf Glasobjektträger montiert und eine Immunzytochemie unter Verwendung von standardmäßigen ABC-Verfahren durchgeführt. HER2, HER3 und HER4 wurden unter Verwendung von spezifischen Antikörpern wie oben beschrieben identifiziert.
Als Kontrolle wurde Lungengewebe bei D0 und D5 mit einem irrelevanten Antikörper gefärbt und es wurde keine Färbung nachgewiesen. Bei D0 ist die Lunge relativ ungeformt. Der Großteil des Gewebes sind Mesenchymzellen. Frühe Luftwege entwikkeln sich. Bei D5 sind Luftwege eindeutig feststellbar, wobei das dünnerwerden des Mesenchymgewebes und eine Proliferation des Lungenepithels erforderlich sind, um die sich vergrößernden Luftwege zu bedecken.
Unter Verwendung der HER2-Färbung bei D0 und D5 wurde festgestellt, dass HER2 an D0-Lungengewebe über das gesamte Lungenepithelgewebe gleichmäßig vorhanden ist. Es war keine Expression im Mesenchymgewebe vorhanden. Bis zum Zeitpunkt D5 verbleibt HER2 gleichmäßig verteilt und auf das Lungenepithel beschränkt.
Unter Verwendung der HER3-Färbekontolle bei D0 und D5 war HER3 im D0-Lungegewebe nachweisbar. Die Färbung war vergleichsweise schwächer als bei HER2 und war nicht homogen, was nahe legt, dass es spezielle Epithelbereiche gibt, die den HER3-Rezeptor exprimieren. Bis zum Zeitpunkt D5 wurde die Expression über das gesamte Lungenepithel homogener, jedoch eindeutig nicht gleichmäßig. Die Expression blieb Epithel-spezifisch.
Beispiel 5 – Herstellung von rHRGβ1_177-244
Das EGF-artige Domänenfragment HRG-β1 177-244 wurde aus dem Vektor pHL89 (der von Holmes et al., Science 256, 1205-1210 (1992) beschrieben wird) mittels PCR mit Primern amplifiziert, die NsiI/XbaI-enthaltende Überhänge aufweisen. Das Fragment wurde in den Phagemid-Display-Vektor pam-g3 durch Restriktionsverdau-Ligation an denselben Stellen insertiert, um das Konstrukt pHRG2-g3 (177-244) zu erzeugen. pam-g3 war ein Derivat von phGHam-g3, das für den Phagen-Display des menschlichen Wachstumshormons (hGH) konstruiert war und in Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10838 (1991) beschrieben wurde. pam-g3 wurde durch Entfernen des in phGHam-g3 vorhandenen hGH-Gens und Ersetzen dieses Gens mit einem Stuffer-Fragment hergestellt, das Raum für Spaltung an den zur Klonierung verwendeten Restriktionsstellen bereitstellt. Das HRG-β1-Fragment wurde an den Rest 247 von pIII angefügt.
Die aus dem oben beschriebenen Konstrukt exprimierte HRG-β1 EGF-artige Domäne wird durch Entfernen des „p" und „-g3" gekennzeichnet, die im Namen des Konstrukts auftreten. Folglich wird die aus dem pHRG2-g3-Konstrukt exprimierte HRG-β1 EGF-artige Domäne als „HRG2" bezeichnet.
Die Domäne wurde monovalent an Phagen als pIII-Fusionsprotein wie von Bass et al., Proteins 8, 309-314 (1990) beschrieben präsentiert.
Gleichermaßen wurden die Varianten HRG-β1_147-244, HRG-β1_147-244 und HRG-β1_177-227 hergestellt und wie oben beschrieben exprimiert.
Beispiel 6 - rHRGβ1_177-244 bewirkt eine beschleunigte Lungenentwicklung
Exogenes rHRGβ1_177-244 bewirkte eine beschleunigte Lungenentwicklung in vitro. Um zu ermitteln, ob die exprimierten HER2/HER3-Rezeptoren funktionell waren und um die Rolle der HRG-Stimulierung während der Lungenentwicklung in vitro zu ermitteln, wurden 10 mM rHRGβ1_177-244 der In-vitro-Kultur zugegeben. Das Gewebe wurde zum Zeitpunkt D5 geerntet, schockgefroren und es wurden 5 μm-Schnitte zur Analyse angefertigt.
Die Morphologie im Vergleich zu unbehandelten Kontrollproben war äußerst unterschiedlich. Es trat eine ausgeprägte Proliferation des Epithels auf. Luftwege, die typischerweise mit einer einzelnen Zellschicht überzogen sind, wiesen eine Dicke von 2-3 Zellen auf. Die Änderungen waren dosisabhängig mit einer stärkeren Epithelzellenreaktion bei höherer Konzentration. HER2 und HER3 waren nach wie vor ausschließlich im Epithel nachweisbar.
Beispiel 7 – Differenzierung der menschlichen Lunge
Eine Differenzierung der menschlichen Lungenepithelzellen findet nach HRG-Behandlung statt. Die Differenzierung wurde durch Tensid-Protein- (SPA-) Produktion gemessen. Alle Schnitte wurden auf SPA gefärbt. Menschliches Lungenexplantat färbte auf SPA mit einer Farbstofflokalisierung in Epithelzellen der Prä-Alveolargänge. Mit 10 mM HRG exponiertes menschliches Lungenexplantat zeigte eine Wirkung auf die SPA-Produktion. Als Differnenzierungskontrolle wurde ein Lungenexplantat mit 1 mM Dibutyryl-cAMP exponiert. Eine negative Kontrolle wurde ebenfalls mitgeführt. Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung eines isolierten HER2-, HER3- und/oder HER4-Aktivierungsliganden, der ein Heregulin- (HRG-) Polypeptid, eine HRG-Variante, ein HRG-Agonist-Antikörper oder ein Fragment davon ist, der fähig ist, an den HER2-, HER3- und/oder HER4-Rezeptor zu binden, um ein Medikament (a) zur Behandlung chronischer obstruktiver Lungenleiden oder (b) zur Behandlung von Atemnot oder Emphysem oder (c) zur Behandlung von Mukoviszidose herzustellen.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Aktivierungsligand zur Bindung eines menschlichen HER2-, HER3- und/oder HER4-Rezeptors fähig ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Aktivierungsligand menschliches HRG oder ein Fragment davon ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Aktivierungsligand aus der aus HRG-α, -β1, -β2, -β2-Ähnlichen und -β3 sowie Fragmenten davon bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Aktivierungsligand γ-HRG oder ein Fragment davon ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Aktivierungsligand rekombinantes menschliches HRG oder ein Fragment davon ist.
Verwendung nach Anspruch 6, worin das HRG rHRG-β1-177-244 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Aktivierungsligand ein Agonist-Antikörper ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Epithelzelle eine Lungenzelle ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Epithelzelle HER2/HER3, HER2/HER4, HER3/HER4, HER3 oder HER4 exprimiert.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Aktivierungsligand einem Patienten, der diesen benötigt, in einer täglichen Dosis von etwa 1 μg/kg bis 100 mg/kg verabreicht werden soll.
Vennrendung nach Anspruch 1, worin der Aktivierungsligand eine HRG-Variante ist.
Verwendung nach Anspruch 12, worin die HRG-Variante zumindest eine Amino-säuresubstitution an einem Rest aufweist, der einem Rest des 645 Aminosäuren langen nativen menschlichen Heregulin-β1 entspricht, ausgewählt aus: S177, H178, L179, V180, K181, E184, E186, K187, T188, V191, N192, G193, G194, E195, M198, V199, K200, D201, N204, P205, S206, R207, Y208, L209, K211, P213, N214, E215, T217, G218, D219, Q222, N223, Y224, S228, und F229.
Verwendung nach Anspruch 12, worin die HRG-Variante eine Heregulin-β1-Variante ist, die eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen umfasst, die aus Folgenden ausgewählt sind: a) S177W; b) H178S, E, R, oder A; c) V180Q, I, oder E; d) K181P oder A; e) A183G; f) E184V, W, K, R, G, oder N; g) K185E, S, Q,oder G; h) E186R; i)K187E oder A; j) T188Q; k) E195Q; l) F197Y; m) M198R oder K; n) K200R; o) D201T oder I; p) P205T oder Y; q) S206K, H, G, P, oder R; r) R207Y; s) Y208R oder L; t) L209M oder G; u) K211R; v) P213S, T, N, oder K; w) N214L, K, S, oder E; x) F216M; y) N223H oder W; und z) M226I.
Verwendung nach Anspruch 14, worin die HRG-Variante eine Gruppe von Aminosäuresubstitutionen umfasst und worin die Aminosäuresubstitutionen aus der aus Folgenden bestehenden Gruppe ausgewählt sind: a) A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, und M226I; b) A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T188G, und M226I; c) F197Y, M198K, K200R, D201I, und M226I; d) P205Y, S206G, R207Y, Y208L, und L209M; e) P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, und M226I; f ) P205T, S206H, R207Y, Y208R, und L209M; g) P205T, S206K, R207Y, Y208R, und L209G; h) N223W und M226I; i) N223H und M226I; j) S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, und M226I; k) P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, und M226I; l) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T; m) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, und L209M; n) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, und L209M; o) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, und M226I; p) F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, und L209M; q) F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, und M226I; r) F197Y, M198R, D201T, und M226I; s) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, und M226I; t) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, und M226I; u) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, und M226I; v) F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, und M226I; und w) A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, und M226I.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Aktivierungsligand ein von einem sensorischen und motorischen Neuron stammender Faktor ist.
Verfahren zur Herstellung einer erweiterten Probe von Epithelzellen zur Wiedereinbringung in einen Säugetierpatienten, der diese benötigt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) das Bereitstellen einer normalen Epithelzellenprobe, die von einem Säugetierpatienten erhalten wurde, und (b) das Kontaktieren der Probe mit einem isolierten Liganden, der eine HRG-Variante ist, die zur Bindung, an den HER2-, HER3- und/oder HER4-Rezeptor fähig ist und HER2-, HER3- und/oder HER4-Rezeptoren oder eine Kombination davon aktiviert, um Wachstum und/oder Proliferation von Epithelzellen in der Probe auszulösen und so eine erweiterte Probe zur Wiedereinbringung in den Säugetierpatienten zu erhalten.