DE60029460T3

DE60029460T3 - Verfahren mittels durch nukleinsäuren induziertes immunostimulatorisches interferon

Info

Publication number: DE60029460T3
Application number: DE60029460T
Authority: DE
Inventors: Gunther Dept.of Internal Medicine HARTMANN; Inc. Robert L. Coley Pharma. Group Wellesley BRATZLER; Arthur Iowa City KRIEG
Original assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; University of Iowa Research Foundation UIRF; Coley Pharmaceutical Group Inc
Current assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; University of Iowa Research Foundation UIRF; Coley Pharmaceutical Group Inc
Priority date: 1999-09-27
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2011-02-10
Anticipated expiration: 2020-09-28
Also published as: ZA200201959B; MXPA02003059A; EP1220684B2; WO2001022990A2; EP1220684B1; JP2003510290A; IL148844A0; CA2386019C; ATE333284T1; NZ517928A; WO2001022990A3; EP1220684A2; AU7619000A; ES2265980T3; DE60029460T2; DE60029460D1; CA2386019A1; ES2265980T5; AU783118B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Menschliches Interferon-alpha (IFN-α), auch bekannt als Leukozyten-Interferon und α-Interferon, umfasst eine Familie extrazellulärer Signalproteine mit antiviralen, antiproliferativen und immunmodulierenden Aktivitäten. IFN-α ist das erste Interferon, das identifiziert und kommerzialisiert wurde, und bleibt das bei klinischen Anwendungen am breitesten verwandte Interferon.
IFN-α ist ein Mitglied der Typ I-Interferon-Familie, die auch auch IFN-β, Omega (Leukozyten (II))-Interferon und Tau(Trophoblasten)-Interferon umfasst. Omega- und Tau-Interferone werden nicht klinisch verwendet. IFN-β, das auch als Fibroblasten-Interferon bekannt ist, ist gut charakterisiert, wird aber in der Klinik weniger eingesetzt als IFN-α. Fibroblasten sind die vorherrschenden zellulären Produzenten für IFN-β. IFN-β wurde in den Vereinigten Staaten für die Behandlung von rezidivierenden Formen der multiplen Sklerose zugelassen. Interferon gamma (IFN-γ), das auch als Gamma-Interferon bekannt ist, ist das einzige bekannte Typ II-Interferon. IFN-γ wird von aktivierten T-Lymphozyten produziert und spielt beim Aufbau einer Th1-Immunantwort eine wichtige Rolle. Sein therapeutischer Nutzen ist begrenzt. In den Vereinigten Staaten wurde menschliches IFN-γ für die Verringerung der Häufigkeit und Schwere von Infektionen mit chronischer Granumolatose zugelassen.
IFN-α selbst steht für eine Familie von mehr als einem Dutzend verwandter, homologer Proteine (Isoformen, Tabelle 1), von denen jedes von einem einzigartigen Gen codiert wird und von denen jedes ein einzigartiges Aktivitätsprofil aufweist. Die Aktivitäten der verschiedenen α-Interferon-Arten in Bezug auf Viren können um den Faktor zwanzig oder mehr differieren.
Klinisch verwendete IFN-α-Produkte sind rekombinante Proteine oder hochgereinigte natürliche Proteine einer einzelnen Isoform. Rekombinantes IFN-α wurde für die Verwendung bei der Behandlung einer Vielzahl von Tumoren und viralen Erkrankungen zugelassen (Tabelle 2).

Bis vor kurzem nahm man an, dass B-Lymphozyten die vorherrschenden Produzenten für IFN-α sind. Kürzlich wurde ein neuer Zelltyp im peripheren Blut als die Hauptquelle der Produktion von Typ I-Interferon identifiziert. Diese vorher unerkannten „natürliches Interferon-produzierenden Zellen” (IPC) waren viele Jahre lang als seltene CD4⁺/MHC-Klasse II⁺-Population (1:1000 innerhalb der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)) beschrieben worden, die nach viraler Infektion fähig sind, außergewöhnlich große Mengen von Typ I-IFN zu produzieren. Cella M et al. Nat. Med 5:919 (1999); Galy A et al. Blond 95: 128 (2000); Siegal FP et al. Science 284: 1835 (1999). Nach der Isolierung von IPCs aus dem peripheren Blut wird IL-3 für das Überleben dieses Zelltyps benötigt. Tabelle 1. Die Familie von menschlichem IFN-α

IFN-αA	(IFN-α2a)
IFN-α2	(IFN-α2b)
IFN-α4b	(IFN-α4)
IFN-αB2	(IFN-α8)
IFN-αC	(IFN-α10)
IFN-αD	(IFN-α1)
IFN-αF	(IFN-α21)
IFN-αG	(IFN-α5)
IFN-αH2	(IFN-α14)
IFN-αI	(IFN-α17)
IFN-αJ1	(IFN-α7)
IFN-αK	(IFN-α6)
IFN-αM1
IFN-αN
IFN-αWA	(IFN-α16)

Tabelle 2. Derzeitige klinische Zulassung für IFN-α

Zugelassen in den Vereinigten Staaten	Zugelassen außerhalb der Vereinigten Staaten
Chronische Hepatitis B Chronische Hepatitis C Haarzellen-Leukämie Haut-T-Zellen-Leukämie Chronische myeloische Leukämie Non-Hodgkin-Lymphom Adjuvans-Therapie für malignes Melanom Kaposi-Sarkom (in Zusammenhang mit AIDS) Condyloma acuminatum (spitze Kondylome)	Multiples Myelom Nierenzellkarzinom Blasenzellkarzinom Dickdarmkarzinom Zervikale Dysplasie Kehlkopfpapillomatose

Es wird angenommen, dass dendritische Zellen (DC) eine wichtige Rolle bei der Ausrichtung der Immunantworten gegen Neoantigene spielen. Banchereau J et al. Nature 392: 245 (1998). Vor kurzem erbrachte Belege legen das Vorkommen mehrerer distinkter DC-Subtypen in menschlichem peripherem Blut nahe. Zhong RK et al. J Immunol 163: 1254 (1999). Diese DC-Subtypen umfassen myeloische DC (mDC) und plasmazellenartige DC (pDC, auch bekannt als DC2-Zellen). Vorstufen der dendritischen Zellen enthalten zwei Untergruppen, eine CD11c⁺/CD123^+/–-Population (Vorläufer der mDC) und eine CD11c^–/CD123⁺⁺-Population (Vorläufer der pDC). Die letztere hat kürzlich grosse Aufmerksamkeit erregt, da berichtet wurde, dass sie identisch mit den natürlichen Typ I-IFN-produzierenden Zellen (IPC) sei. O'Doherty U et al. J Exp Med 178: 1067 (1993); Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101 (1997); Thomas R et al. J Immunol 153: 4016 (1994). Nach der Reifung entwickelt dieser Zelltyp charakteristische DC-Merkmale. O'Doherty U et al. J Exp Med 178: 1067 (1993); Thomas R et al. J Immunol 153: 4016 (1994); Galy A et al. Blood 95: 128 (2000); Chehimi J et al. Immunology 68: 488. (1989).
Die Häufigkeit der IPCs in PBMC in normalen Lebewesen bewegt sich im Bereich zwischen 0,2 und 0,6 Prozent. Sie sind gekennzeichnet durch die Abwesenheit der Abstammungs-Marker CD3 (T-Zellen), CD14 (Monozyten), CD19 (B-Zellen) und CD56 (NK-Zellen), durch die Abwesenheit von CD11c und durch ihre Expression von CD4, CD123 (IL-3-Rezeptor α, IL-3Rα) und MHC Klasse II. Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101–11 (1997); Rissoan M-C et al. Science 283: 1183–6 (1999); Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999); Cella M et al. Nat Med 5: 919–23 (1999). Morphologisch ähneln IPCs Lymphozyten. IPCs können aus PBMC durch eine Kombination von Sortieren von aktivierten Zellen mittels magnetischer Kügelchen (MACS) und Sortieren fluoreszenzaktivierter Zellen (Durchflusszytometrie, FACS) isoliert werden. Ohne die Zugabe von IL-3 sterben die meisten IPCs in der Zellkultur innerhalb von 3 Tagen. Eine Infektion der IPCs mit dem Herpes simplex-Virus (HSV, Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999)) oder Grippevirus (Cella M et al. Nat Med 5: 919–23 (1999)) führt zur Produktion großer Mengen von Typ I-Interferonen, wie bestimmt durch einen biologischen Test (Schutz von Fibroblasten vor vesikulärem Stomatitisvirus).
Neben ihrer Rolle als Trägerin des genetischen Codes wurde kürzlich gezeigt, dass DNA als Signalmolekül wirkt (Krieg AM, 1998, Biodrugs). Die Immunsysteme höherer Eukaryonten scheinen im Verlauf der Evolution einen Mechanismus entwickelt zu haben, um prokaryontische Nukleinsäuren auf der Grundlage unmethylierter CpG-Dinukleotide in bestimmten Basen-Zusammenhängen nachzuweisen. Krieg AM et al. Nature 374: 546–9 (1995). Unmethylierte CpG-Dinukleotide sind in bakterieller DNA verbreitet, aber in Wirbeltier-DNA unterrepräsentiert („CpG-Unterdrückung”) und methyliert. Bird AP Trends in Genetics 3: 342 (1987). DNA, die diese unmethylierten CpG-Dinukleotide in immunstimulierenden Basen-Zusammenhängen („CpG-Motive”) enthält, löst eine humorale Immunität aus durch Induktion der B-Zellen-Aktivierung, Resistenz gegen Aktivierungsinduzierte Apoptose und IL-6- und IgM-Sekretion aus. Krieg AM et al. Nature 374: 546–9 (1995); Yi AK et al. J Immunol 157: 5394 (1996); und Klinman D et al. Proc. Natl Acad Sci USA 92: 2879 (1996). Solche CpG-DNA aktiviert auch Monozyten und Makrophagen, Th1-artige Zytokine zu sekretieren. Ballas ZK et al. J Immunol 157: 1840 (1996); Cowdery JS et al. J Immunol 156: 4570 (1996); und Halpern MD et al. Cell Immunol 167: 72 (1996). Dies führt zur Aktivierung der lytischen Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) und IFN-γ-Sekretion. Ballas ZK et al. J Immunol 157: 1840 (1996); Cowdery JS et al. J Immunol 156: 4570 (1996); und Chace JH Clin Immunol Immunopath 84: 185–93 (1997).
Yamamoto et al. berichteten 1988 von ihren Erkenntnissen, nach denen eine als MY-1 bezeichnete Nukleinsäurefraktion, die aus Mycobacterium bovis (BCG) extrahiert war, in vitro Typ I-Interferone induzierte. Yamamoto S et al. Jpn J Cancer Res 79: 866–73 (1988). Daraufhin synthetisierten Tokunaga et al. einen Satz von 45-mer-Oligonukleotiden mit Sequenzen, die in cDNA vorhanden sind, die für drei zufällig ausgewählte, bekannte BCG-Proteine codiert, und fanden heraus, dass eine Sequenz, BCG-A4, ein starker Induktor von Typ I-IFN in Suspensionen von Maus-Milzzellen war. Tokunaga T et al. Microbiol Immunol 36: 55–66 (1992). Von einem 5'30-mer-Fragment, BCG-A4a, wurde berichtet, dass es ein so wirksamer Induktor von IFN war wie das intakte 45-mer BCG-A4.
Diese Wissenschaftler berichteten weiter, dass alle Oligonukleotide, die IFN induzierten, eine palindromische Hexamer-Sequenz GACGTC (vorhanden in BCG-A4 und BCG-A4a), AGCGCT und AACGTT, aber nicht ACCGGT, umfassten. Yamamoto S et al. J Immunol 148: 4072–6 (1992). Kimura et al. fanden anschliessend heraus, dass unter 30-mer-Phosphodiester-Oligodesoxynukleotiden (ODNs), die das Hexamer-Palindrom AACGTT und oligoA-, oligoC-, oligoT- und oligoG-Enden enthielten, das letztere (GGGGGGGGGGGGAACGTTGGGGGGGGGGGG, SEQ ID NO: 165) der stärkste Induktor für Typ I-IFN in Suspensionen von Maus-Milzzellen war. Kimura Y et al. J Biochem (Tokio) 116: 991–4 (1994).
Kürzlich wurde überraschenderweise entdeckt, dass CpG-ODN-Sequenzen mit der stärksten Aktivität auf menschliche B-Zellen keine nachweisbaren Titer von Typ I-IFN in PBMC induzierten. Hartmann G et al. J Immunol 164: 1617–24 (2000).
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der Erfindung wurde entdeckt, dass bestimmte immunstimulierende Nukleinsäuren (ISNAs) besonders als Einzelagenzien geeignet sind, um sowohl das Überleben als auch die Stimulierung von IPCs zu fördern. Gemäß der Erfindung wurde ebenfalls entdeckt, dass bestimmte ISNAs die Notwendigkeit von IL-3 für das Überleben von IPC und die Notwendigkeit einer viralen Infektion für die IPC-Aktivierung aufheben.
Zusätzlich wurde gemäß der Erfindung überraschenderweise entdeckt, dass bestimmte CpG-ISNA die Produktion großer Mengen von Typ 1-IFN induzieren, aber minimale Wirkungen auf die B-Zellen-Aktivierung aufweisen, wohingegen bestimmte andere CpG-ISNA menschliche B-Zellen und IPCs stark aktivieren, aber minimale Wirkungen auf die Induktion von Typ I-IFN aufweisen. Überraschenderweise wurde entdeckt, dass die CpG-ISNA, die starke Induktoren für Typ I-IFN sind, nicht notwendigerweise ein Hexamer-Palindrom GACGTC, AGCGCT oder AACGTT enthalten, das von Yamamoto und Kollegen beschrieben wurde. Yamamoto S et al. J Immunol 148: 4072–6 (1992).
Diese Entdeckungen eröffnen Wege für die Verwendung von ISNA, und insbesondere von bestimmten CpG-ISNA, als ein therapeutisches Agens für klinische Anwendungen, die die Verwendung von IFN-α erfordern. Klinische Strategien umfassen die lokale und systemische in vivo-Verabreichung von ISNA genauso wie ex vivo-Strategien, bei denen in vitro ISNA-aktivierte isolierte IPCs lokal oder systemisch re-infundiert werden. Diese therapeutischen Strategien schliessen die Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren (IL-3, GM-CSF, flt3-Ligand etc.) und anderen Reizen (Superantigene, virale Produkte) ein. CpG-ISNA der Erfindung, die Induktoren für Typ I-IFN sind, erlauben auch die in vitro-Produktion von natürlichen Interferonen unter Verwendung einer aus IPCs abgeleiteten Dauerzelllinie. Da natürliches IFN-α eine Familie von mehr als einem Dutzend separater Genprodukte ist, deren individuelle Produkte einzigartige Aktivitätsprofile aufweisen, ist die klinische Verwendung von natürlichen Interferonen dem aus einem einzelnen rekombinanten IFN-α-Gen abgeleiteten rekombinanten IFN-α möglicherweise vorzuziehen.
Gemäß der Erfindung wurde überraschenderweise auch entdeckt, dass Typ I-IFN eine als γδ-T-Zellen bezeichnete Untergruppe von T-Lymphozyten aktiviert. Zusätzlich wurde gemäß der Erfindung weiterhin entdeckt, dass CpG-ODN, die starke Induktoren für Typ I-IFN sind, aber nicht CpG-ODN, die starke Aktivatoren von B-Zellen und pDCs sind, ohne starke Induktoren für Typ I-IFN zu sein, γδ-T-Zellen aktivieren können, die innerhalb von einer Population von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) vorhanden sind. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, erscheint es wahrscheinlich, dass Typ I-IFN-induzierende CpG-ODN γδ-T-Zellen, die innerhalb der PBMC vorhanden sind, durch ihre Fähigkeit aktivieren können, die Sekretion von Typ I-IFN durch IPCs zu induzieren, die ebenfalls in den PBMC vorhanden sind.
Zusätzlich zur Fähigkeit, γδ-T-Zellen zu aktivieren, wurde gemäß der Erfindung überraschenderweise ebenfalls entdeckt, dass Typ I-IFN-induzierende CpG-ODN, aber nicht CpG-ODN, die starke Aktivatoren von B-Zellen und pDCs sind, ohne starke Induktoren für Typ I-IFN zu sein, die Proliferation von Antigen-aktivierten γδ-T-Zellen erhöhen können, die innerhalb einer Population von PBMCs vorhanden sind. Insbesondere ist die Proliferation im Zusammenhang mit der Anwesenheit von spezifischem nicht-Peptid-Antigen erhöht, z. B. dem Phosphoantigen Isopentenylpyrophosphat (IPP).
Gemäß der Erfindung wurde überraschenderweise ebenfalls entdeckt, dass bestimmte CpG-ODN in Zusammenhang mit IPP synergistisch die Produktion von IFN-γ und Perforin in γδ-T-Zellen induzieren.
Gemäß der Erfindung wurde im Rahmen einer weiteren überraschenden Entdeckung festgestellt, dass Typ I-IFN-induzierende CpG-ODN, aber nicht CpG-ODN, die starke Aktivatoren von B-Zellen und pDCs sind, ohne starke Induktoren für Typ I-IFN zu sein, die CD40-stimulierte IL-12-Produktion in PBMC blockieren können. Überraschenderweise wurde darüber hinaus herausgefunden, dass CpG-ODNs, die starke Aktivatoren von B-Zellen und pDCs sind, ohne starke Induktoren für Typ I-IFN zu sein, die gegenteilige Wirkung hatten, d. h. diese ODN erhöhten tatsächlich die CD40-stimulierte IL-12-Produktion in PBMC.
Gemäß der Erfindung wurde weiterhin entdeckt, dass CpG-ODN, die starke Aktivatoren von B-Zellen und pDCs sind, ohne starke Induktoren für Typ I-IFN zu sein, bessere Förderer des Antigen-spezifischen Primings und Rückrufs von menschlichen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) sind als CpG-ODN, die wirksame Induktoren von Typ I-IFN sind.
In einem Aspekt sieht die Erfindung eine Verbesserung für Therapien vor, die die Verabreichung von IFN-α an Lebewesen einschliessen. Diese Verbesserung schliesst die Co-Verabreichung von einer wirksamen Menge einer isolierten ISNA ein. In einer Ausführungsform ist das IFN-α in einer klinisch etablierten wirksamen Dosis für IFN-α alleine zu verabreichen. In einer anderen Ausführungsform ist das IFN-α in einer Dosierung unterhalb der klinisch etablierten wirksamen Dosis für IFN-α alleine zu verabreichen. Das IFN-α kann auch in der höchsten tolerierten Dosis von IFN-α in der Abwesenheit des Oligonukleotides verabreicht werden. In anderen Ausführungsformen ist das IFN-α in Dosen von 20 Prozent unterhalb, 30 Prozent unterhalb, 40 Prozent unterhalb oder sogar 50 Prozent unterhalb der höchsten tolerierten Dosis von IFN-α oder der klinisch etablierten wirksamen Dosis für IFN-α alleine zu verabreichen.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung daher die Verwendung einer isolierten Nukleinsäure für die Herstellung eines Medikamentes für die Verwendung zur Behandlung einer proliferativen Krankheit oder viralen Infektion, die eine IFN-α-Behandlung erfordert, wobei die besagte Nukleinsäure eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
wobei jeder Kleinbuchstabe für eine Phosphothioat-Bindung steht und jeder Großbuchstabe eine Phosphodiester-Bindung anzeigt.
In bestimmten bevorzugteren Ausführungsformen weist die ISNA eine Sequenz auf, die entspricht:
ggGGGACGAGCTCGTCgggggG (ODN 2247; SEQ ID NO: 11),
ggGGGACGATCGTCGgggggG (ODN 2255; SEQ ID NO: 16),
ggGGACGTTCGAACGTgggggG (ODN 2295); SEQ ID NO: 20),
ggGGTCGACGTCGACGTCGAGgggggG (ODN 2334; SEQ ID NO: 36) oder
ggGGACGACGTCGTGgggggG (ODN 2336; SEQ ID NO: 37), wobei jeder Kleinbuchstabe für eine Phosphothioat-Bindung steht und jeder Großbuchstabe eine Phosphodiester-Bindung anzeigt.
In einer Ausführungsform schliesst die Verbesserung weiterhin die Co-Verabreichung von Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) an das Lebewesen ein.
In einer Ausführungsform weist das Lebewesen eine proliferative Krankheit auf, wie Haarzellen-Leukämie, chronische myeloische Leukämie, Haut-T-Zellen-Leukämie, multiples Myelom, Follikellymphom, malignes Melanom, Plattenepithelkarzinom, mit AIDS verbundenes Kaposi-Sarkom, Nierenzellkarzinom, Prostatakarzinom, Blaszenzellkarzinom, zervikale Dysplasie und Dickdarmkarzinom. In einer weiteren Ausführungsform hat das Lebewesen eine virale Infektion wie Hepatitis B, Hepatitis C, Condyloma acuminatum, menschliches Immundefizienzvirus, Herpes, Cytomegalievirus, Epstein-Barr-Virus und Papillomavirus.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Supplementierung einer IFN-α-Behandlung eines Lebewesens ein. Dieser Aspekt der Erfindung schliesst die Verabreichung einer wirksamen Menge IFN-α und einer ISNA der Erfindung an ein Lebewesen ein, das eine IFN-α-Behandlung benötigt. Die IFN-α-Dosen, ISNAs, gleichzeitige Therapie und Zustände, die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem Aspekt der Erfindung erfordern, sind die gleichen wie diejenigen, die oben beschrieben sind.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst die Behandlung das Behandeln eines Lebewesens, um die IPCs des Lebewesens zu aktivieren. Dieses schliesst die Isolierung von IPCs aus dem Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die Kultivierung der isolierten IPCs in vitro, das in vitro Kontaktieren der IPCs mit einer wirksamen Menge einer isolierten ISNA und das Zurückgeben der kontaktierten Zellen an das Lebewesen. Die Zellen können in vitro auch mit einem Wachstumsfaktor oder einem Zytokin in Kontakt gebracht werden. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Kontaktieren der IPC-Zellen in vitro mit IL-3 oder GM-CSF. In einer weiteren Ausführungsform werden die Zellen in vitro bei Abwesenheit von IL-3 und/oder GM-CSF kultiviert. Die ISNAs und die Zustande, die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem Aspekt der Erfindung erfordern, sind oben beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Erhöhung der Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung eines Lebewesens ein. Dies schliesst die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung die IFN-α umfasst, an ein eine solche Behandlung benötigendes Lebewesen und die Co-Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an das Lebewesen ein, die eine Menge eines ISNA umfasst, die zusammen mit dem verabreichten IFN-α eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt. Die Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung ist größer als die Wirksamkeit der Verabreichung der gleichen Menge IFN-α in Abwesenheit der co-verabreichten IFN-α. Die ISNAs und Zustände, die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem Aspekt der Erfindung erfordern, sind wie oben beschrieben. In einer Ausführungsform werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen lokal verabreicht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Senkung der IFN-α-Dosis ein, die für eine wirksame Behandlung eines Lebewesens benötigt wird. Diese schliesst die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein eine Behandlung mit IFN-α benötigendes Lebewesen ein, die IFN-α umfasst, und die Co-Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ISNA umfasst, an das Lebewesen. Die Menge des verabreichten IFN-α ist geringer als eine IFN-α-Menge, die benötigt wird, um den gleichen therapeutischen Nutzen bei Abwesenheit einer Co-Verabreichung der ISNA zu erzielen. In bestimmten Ausführungsformen liegt die Menge des verabreichtem IFN-α mindestens 20 Prozent, mindestens 30 Prozent, mindestens 40 Prozent, oder gar mindestens 50 Prozent unter der Menge IFN-α, die bei Abwesenheit der co-verabreichaen immunstimulierenden Nukleinsäure benötigt wird. Die pharmazeutische Zusammensetzung, die die ISNA umfasst, kann lokal verabreicht werden. Die ISNAs und Zustände, die die Behandlung mit IFN-α nach diesem Aspekt der Erfindung erfordern, sind wie oben beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Verhinderung einer mit der IFN-α-Behandlung zusammenhängenden Nebenwirkung in einem Lebewesen ein, das eine Behandlung mit IFN-α erhält oder benötigt. Dies schliesst die Verabreichung von einer IFN-α-pharmazeutischen Zusammensetzung und einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das die Behandlugn benötigt, ein, die eine immunstimulierende Nukleinsäure in einer Menge umfasst, die zusammen mit dem verabreichten IFN-α eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt. Die mit der IFN-α-Behandlung zusammenhängende Nebenwirkung wird im Vergleich zu der Nebenwirkung, die auftritt, wenn IFN-α bei Abwesenheit der co-verabreichten ISNA verabreicht wird, reduziert. Die mit der IFN-α-Behandlung zusammenhängende Nebenwirkung ist möglicherweise systemisch. Die mit der IFN-α-Behandlung zusammenhängende Nebenwirkung, die von dem Verfahren verhindert wird, kann eine jede der folgenden umfassen: erkältungsähnlichen Syndrom, Fieber, Kopfschmerz, Schüttelfrost, Muskelschmerz, Müdigkeit, Anorexie, Übelkeit, Erbrechen, Diarrhöe und Depression. Die ISNAs und Zustande, die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem Aspekt der Erfindung erfordern, sind wie oben beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Erhöhung der Wirksamkeit einer IFN-α-Behandlung bei einem Lebewesen ein, das eine solche Behandlung benötigt. Dies schliesst die Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die IFN-α für die Behandlung dieses Zustandes umfasst, an ein Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die Isolierung natürlicher IFN-produzierender Zellen von einem Spender, das Kontaktieren der isolierten IFN-produzierenden Zellen ex vivo mit einer ISNA-Menge, die dahingehend wirkt, dass sie IFN-produzierende Zellen anregt, IFN-α freizusetzen, und die Verabreichung der kontaktierten Zellen an das Lebewesen ein. Der Spender kann, muss aber nicht das Lebewesen sein. Die Behandlung kann weiterhin das Kontaktieren der isolierten Zellen mit einem Antigen umfassen. Die Verabreichung der Zellen kann auf eine beliebige, für die Zwecke des Verfahrens geeignete Weise erfolgen und kann lokale Injektion umfassen. Die lokale Injektion kann über ein Blutgefäß erfolgen, das ein Zielgewebe versorgt. Das Blutgefäß kann unter anderem aus der Gruppe bestehend aus Leberarterie, Pfortader, Bauchhöhlenarterie und Milzarterie ausgewählt werden. Die ISNAs und Zustände, die die Behandlung mit IFN-α gemäß diesem Aspekt der Erfindung erfordern, sind wie oben beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Unterstützung des Überlebens der IPCs in vitro ein. Dies umfasst die Isolierung solcher Zellen aus einem Lebewesen, die Kultivierung der Zellen in einem sterilen Medium, das für Gewebekulturen geeignet ist, und das Kontaktieren der Zellen in vitro mit einer ISNA-Menge, die dahingehend wirkt, dass sie das Wachstum der Zellen bei Abwesenheit von IL-3 unterstützt, ein. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Zellen dendritische Zellen vom Vorläufer-Typ 2 sein. Die Kulturbedingungen können auch so ausgewählt werden, dass sie kein IL-3 und/oder GM-CSF enthalten, oder sie können IL-3, GM-CSF oder andere Wachstumsfaktoren und Zytokine enthalten. Die ISNAs, einschließlich der Oligonukleotide, Sequenzen, Modifikationen u. ä., gemäß diesem Aspekt der Erfindung, sind wie oben beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die in vitro-Stimulierung isolierter IPCs ein. Dies schliesst die Isolierung solcher Zellen aus einem Lebewesen, die Kultivierung der Zellen in einem sterilen, für Gewebekulturen geeigneten Medium und das Kontaktieren der Zellen in vitro mit einer ISNA-Menge ein, die dahingehend wirksam ist, dass sie die Sekretion von mindestens einem Typ I-Interferon oder die Expression von CD80 induziert. Die Kulturbedingungen können die Anwesenheit oder Abwesenheit von Interleukin-3, GM-CSF oder anderen Wachstumsfaktoren und Zytokinen umfassen. Die IPCs können dendritische Zellen vom Vorläufer-Typ 2 sein. Die ISNAs, einschliesslich der Oligonukleotide, Sequenzen, Modifikationen u. ä. gemäß diesem Aspekt der Erfindung, sind wie oben beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung schliesst die Behandlung die Stimulierung der Produktion eines Satzes von mindestens 3, 4, 5, 6, 7 oder gar 8 oder mehr Interferon-Subtypen ein. Dies schliesst das Kontaktieren von IFN-produzierenden Zellen mit einer ISNA ein. Die Zellen können, müssen aber nicht isoliert sein. Das Kontaktieren kann in vivo oder in vitro erfolgen. Die ISNAs, die Oligonukleotide, Sequenzen, Modifikationen u. ä. nach diesem Aspekt der Erfindung einschliessen, sind wie hierin beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Inhibierung der IL-12-Produktion bereitgestellt. Dieses Verfahren schliesst das Kontaktieren IL-12-produzierender Zellen bei Anwesenheit von Interferon-produzierenden Zellen unter Bedingungen, bei denen die IL-12-produzierenden Zellen normalerweise IL-12 produzieren, mit einer Menge einer immunstimulierenden Nukleinsäure ein, die dahingehend wirksam ist, dass sie die Sekretion von Typ I-Interferon induziert.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit, die eine Sequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgende umfasst:
wobei jeder Kleinbuchstabe für eine Phosphothioat-Bindung steht und jeder Großbuchstabe eine Phosphodiester-Bindung anzeigt.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine isolierte Nukleinsäure umfasst mit einer Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die folgende umfasst:
wobei jeder Kleinbuchstabe für eine Phosphothioat-Bindung steht und jeder Grossbuchstabe eine Phosphodiester-Bindung anzeigt, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. In einigen Ausführungsformen enthält die pharmazeutische Zusammensetzung auch IFN-α.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Interferon-Zusammensetzung zur Verabreichung an ein Lebewesen bereitgestellt. Die Zusammensetzung umfasst Interferon in einem Behälter zur Verabreichung an ein Lebewesen. Die Interferonmenge im Behälter beträgt mindestens ungefähr 10% weniger als die maximal tolerierte Dosis (MTD). Bevorzugterweise liegt die Interferonmenge im Behälter mindestens ungefähr 20% unter dem MTD, mindestens 30% unter dem MTD, mindestens 40% unter dem MTD oder sogar mindestens 50% unter dem MTD. Der Behälter kann auch eine ISNA umfassen.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Bereitstellung von Kits zur Verabreichung von Interferon und einer ISNA an ein Lebewesen vor. Die Kits umfassen einen Behälter, der eine Zusammensetzung beinhaltet, die IFN-α umfasst, sowie Anweisungen zur Verabreichung des Interferons an ein Lebewesen umfasst, das eine solche Behandlung benötigt, in einer Menge, die mindestens ungefähr 10% weniger als die MTD, 20% weniger als die MTD, 30% weniger als die MTD, 40% weniger als die MTD oder 50% weniger als die MTD beträgt. Der Kit kann im gleichen Behälter oder in einem getrennten Behälter eine ISNA umfassen. Der Kit kann auch Anweisungen für die Behandlung eines Lebewesens mit einem Zustand, der für eine Behandlung mit IFN-α empfänglich ist, umfassen.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden unten detaillierter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 stellt FACS-Analysen von Zellpopulationen während der Isolierung und Charakterisierung von IPCs mittels magnetischer Kügelchen und Durchflusszytometrie dar. Von links nach rechts werden gezeigt: Selektion von lin–/MHC Klasse II+-Zellen aus PBMCs; weitere Selektion von CD123+/MHC Klasse II+-Zellen von aus lin–/CD4+/MHC Klasse II+-Zellen; und Charakterisierung von frisch isolierten lin–/CD4+/MHC Klasse II+/CD123+ IPCs als CD80-.
2 stellt FACS-Analysen des Überlebens und der Aktivierung (CD80) von frisch isolierten IPCs nach zweitägiger Inkubation bei Anwesenheit von ausgewählten Wachstumsfaktoren und Stimuli dar. Wachstumsfaktor (GM-CSF) und/oder Stimulus (CpG-Oligonukleotid oder LPS) für jedes Feld: oben links, keine; oben Mitte, CpG-Oligonukleotid; oben rechts, LPS; unten links, GM-CSF; und unten Mitte, GM-CSF und CpG-Oligonukleotid. Die Zahl in der oberen rechte Ecke von jedem Feld zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) von CD80. Die Ergebnisse stehen für fünf unabhängige Experimente.
3 stellt FACS-Analysen dar, die die unterschiedlichen Wirkungen zeigen, die CpG und Poly IC auf das Überleben und die Aktivierung frisch isolierter IPCs haben. Alle Zellen wurden drei Tage lang bei Anwesenheit von IL-3 inkubiert. Die Zellen wurden anschließend für zusätzliche 24 Stunden inkubiert unter Zugabe von: nichts (linke Felder); CpG (mittlere Felder); oder Poly IC (rechte Felder). Die MFI von CD80 wird in jedem der unteren Felder oben rechts gezeigt. Die Ergebnisse stehen für drei unabhängige Experimente.
4 ist eine Kurve, die die Konzentration von IFN-α (durch IFN-α-spezifischen ELISA bestimmt) im Überstand bei Anwesenheit von IL-3 und GM-CSF für zwei Tage inkubierten IPCs darstellt, entweder mit CpG-Oligonukleotid (geschlossener Balken) oder ohne CpG-Oligonukleotid (offener Balken). Die Ergebnisse stehen für drei unabhängige Experimente.
5 zeigt eine Kurve, die die Konzentration von IFN-α darstellt, die in den Überständen von PBMC von verschiedenen Spender nach einer 48-ständigen Inkubation in Anwesenheit bei 3 μM ODN 2006 (n = 7), 1585 (n = 7), 2197 (n = 6), 2198 (n = 5) oder Medien ohne hinzugegebene ODN (n = 7) induziert ist. Die Fehlerbalken zeigen die SEM an.
6 zeigt eine Kurve, die die Dosis-Antwort von CpG-ODN-induzierter IFN-α-Synthese durch PBMC darstellt, die 48 Stunden lang bei Anwesenheit von ODN 2216, 1585, 2006 und 2243, deren Konzentration 0,2 bis 12 μg/m betrug, kultiviert wurden.
7 zeigt eine Kurve, die die CpG-ODN-vermittelte Stimulierung der IFN-α- und IFN-β-Produktion in PBMC darstellt, die bezüglich plasmazellenartigen dentritischen Zellen angereichert waren, mit (n = 3) und ohne (n = 4) Zugabe von Lipofectin (10 μg/m). PBMC wurden 48 Stunden lang bei Anwesenheit von IL-3 alleine (–) oder IL-3 mit Zugabe von ODN 2006, 1585, 2197 oder 2216 inkubiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte von drei oder vier unabhängigen Experimenten mit verschiedenen Spender gezeigt; jedes wurde zweifach ausgeführt. Die Fehlerbalken zeigen die SEM an. *p ≤ 0,0018 (Bonferroni-Dann-Korrektur).
8 zeigt eine Serie von vier Kurven, die die Ergebnisse von vier FACS-Experimenten zur Untersuchung des intrazellulären IFN-α darstellen. Feld A, Identifizierung von lin⁺- und lin^–-Zellen. Feld B, Identifizierung von CD123^+/–/HLA DR⁺⁺mDC (Gate II) und CD123⁺⁺/HLA DR⁺ pDC (Gate III) in lin^–-Zellen. Feld C, fehlende Färbung auf intrazelluläres IFN-α in lin⁺-Zellen. Feld D, Färbung auf intrazelluläres IFN-α in lin^–-Zellen.
9 zeigt eine Serie von sechs Kurven, die Ergebnisse aus sechs FACS-Experimenten zur Untersuchung von intrazellulärem IFN-α (Felder A) und TFN-α (Felder B) in lin^–/HRA DR⁺-plasmazellenartigen dentritischen Vorläuferzelien nach Stimulierung mit verschieden CpG-Oligonukleotiden (2006, 2216, beide mit 3 μg/m) darstellen. Brefeldin A wurde während der TFN-α-Inkubation hinzugefügt. MFI, mittlere Fluoreszenzintensität.
10 zeigt eine Kurve, die die CD86-Expression auf plasmazellenartigen dentritischen Zellen als Reaktion auf IL-3 alleine (–) oder auf IL-3 mit verschiedenen CpG-ODN (2006, 585, 2197 oder 2216, alle bei einer Konzentration von 3 μg/m) darstellt. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte von drei unabhängigen Experimenten mit Zellen von verschiedenen Spender gezeigt. Die Fehlerbalken zeigen die SEN. *p < 0,0018 (Bonferroni-Dunn-Korrektur).
11 stellt eine Kurve dar, die eine FACS-Reinigung von plasmazellenartigen dendritischen Zellen (Feld A) und die Sekretion von IFN-α und IFN-β durch gereinigte plasmazellenartige dentritische Zellen als Reaktion auf IL-3 mit oder ohne ODN 2216 (Feld B) zeigt.
12 stellt die NK-Zellen-vermittelte Lyse von K562-Zellen dar nach Exponierung von PBMC gegenüber ODN 2216, 1585, 2006, 2118, IL-2 oder Medium alleine.
13 zeigt eine Kurve, die die Konzentration von IL-8 (durch einen IL-8-spezifischen ELISA bestimmt), die im Überstand von IPCs nach zweitägiger Kultur bei Anwesenheit von IL-3 alleine (links), IL-3 supplementiert mit CpG-Oligonukleotid (Mitte) oder IL-3 supplementiert mit Poly IC (rechts) vorhanden ist, darstellt. Die Ergebnisse stehen für drei unabhängige Experimente.
14 zeigt eine Kurve, die die IFN-γ-Produktion durch γδ-T-Zellen als Reaktion of CpG-ODN 2006, 1585 oder 2216 bei Anwesenheit oder Abwesenheit von Nichtpeptid-Antigen Isopentenylpyrophosphat (IPP) darstellt. Ergebnisse werden als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für intrazelluläre Färbung auf IFN-γ, mit Medium alleine als Negativkontrolle, gezeigt. Daten werden als Mittelwert + SEM gezeigt; *(p < 0,01) und **(p < 0,001) zeigen p-Werte an, die gemäß dem Studenten-t-Test für gepaarte Probem berechnet wurden, wobei die Mediumkontrolle mit CpG-ODN und IPP alleine mit IPP + CpG-ODN verglichen wird.
15 zeigt ein Kurvenpaar, das die Proliferation von γδ-T-Zellen als Reaktion auf CpG-ODN 2006, 1585 oder 2216 bei Anwesenheit oder Abwesenheit des nicht-peptidischen Antigens Isopentenly-Pyrophosphat (IPP) darstellt. Feld A stellt die Kinetiken der γδ-T-Zellen-Expansion über zehn Tage aus einem repräsentativen Experiment dar. Feld B stellt die Expansion von γδ-T-Zellen zehn Tage nach Stimulierung mit IPP alleine oder in Kombination mit verschiedenen CpG-ODN dar. Für jedes ODN wurden zwischen neun und sechzehn Spender analysiert. Die Daten werden als x-fache Zunahme im Vergleich zu IPP alleine gezeigt (Mittelwert + SEN); *zeigt p < 0,05 an (IPP gegen IPP + CpG-ODN).
16 zeigt eine Kurve, die die Regulierung der CD40-induzierten IL-12p70-Produktion durch Typ I-IFN und durch verschiedene CpG-ODN darstellt. Die Daten sind als x-faches der IL-12p70-Produktion durch anti-CD40 alleine (Mittelwert = 143 pg/m) gezeigt und stehen für den Mittelwert plus SEM von drei verschiedenen Spender.
17 zeigt eine Serie von Kurven, die die Wirkungen von CpG-ODN 2006, 1585 und 2216 auf die Erinnerungs- und primäre peptidspezifische menschliche CTL-Reaktion darstellt. Felder A und C, peptidespezifische IFN-γ-produzierende CTL als Prozentsatz aller CD8⁺-T-Zellen für das Erinnerungsantigen Grippe-Matrix-Peptid bzw. für das primäre Antigen melan-A/mart-1-Peptid. Felder B und D, Antigen-spezifische Tetramer-positivfärbende CD8⁺-T-Zellen für das Erinnerungs-Antigen Grippe-Matrix-Peptid bzw. das primäre Antigen melan-A/mart-1-Peptid.
18 zeigt eine schematische Wiedergabe eines Kits, der einen Behälter umfasst, der eine Zusammensetzung beinhaltet, die IFN-α in einer Menge, die mindestens ungefähr 10% geringer ist als die maximal tolerierte Dosis (MTD) und, im gleichen Behälter oder in einem getrennten Behälter, eine ISNA umfasst. Der Kit kann auch Anweisungen für die Behandlung eines Lebewesens mit einem Krankheitsbild, das für die Behandlung mit IFN-α empfänglich ist, umfassen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung schliesst die Entdeckung ein, dass eine bestimmte Untergruppe von Blutzellen, natürlich IFN-produzierende Zellen (IPCs), durch ISNAs stimuliert werden, IFN-α zu produzieren. Diese Entdeckung war überraschend, weil es vorher unbekannt war, welcher Bestandteil eines UV-bestrahlten Virus oder von durch Hitze abgetöteten Bakterien für die Induktion der IFN-α-Produktion durch IPCs verantwortlich war. Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999). Die Entdeckung war ebenfalls überraschend, weil reife DC2s, die aus den IPCs entstehen, keine starken Produzenten für IFN-α sind. Weiterhin war ebenfalls bekannt, dass von Monozyten abgeleitete dendritische Zellen (DC1s) kein IFN-α als Reaktion auf CpG-Nukleinsäuren produzieren. Es war ebenfalls überraschend, dass eine ganze Reihe von IFN-α-Molekülen stimuliert wird. Zusätzlich schliesst diese Erfindung die lokale Induktion von IFN-α an der Stelle der ISNA-Verabreichung ein, wodurch toxische Wirkungen vermieden werden, die mit der systemischen Verabreichung von IFN in Dosen, die notwendig sind, um ähnliche lokale Konzentrationen von IFN-α zu erreichen, verbunden sind. Die Erfindung schliesst ebenfalls die unerwartete Entdeckung ein, dass ISNAs IFN-produzierende Zellen dazu stimulieren können, sie zu aktivieren, das co-stimulierende Molekül CD80 (B7-1) zu exprimieren. Eine weitere unerwartete Entdeckung ist, dass ISNAs das Überleben von IFN-produzierenden Zellen selbst in der Abwesenheit von Interleukin-3 unterstützen können. Diese verschiedenen Entdeckungen haben zu den in vivo, ex vivo, und in vitro-Erfindungen geführt, die hierin beschrieben sind.
Eine ISNA ist ein Nukleinsäuremolekül, das nach Kontaktieren mit Zellen des Immunsystems selbst in der Lage ist, kontaktierte Zellen des Immunsystems anzuregen, zu proliferieren und/oder aktiviert zu werden. Das Kontaktieren kann direkt oder indirekt sein, z. B. können die ISNA möglicherweise einen ersten Typ von Immunzellen direkt stimulieren, ein Produkt zu exprimieren, das wiederum einen zweiten Typ von Immunzellen stimulieren kann, der nicht der ISNA ausgesetzt gewesen ist oder nicht auf sie reagiert. Die immunstimulierende Wirkung der ISNA ist von einem beliebigen Produkt getrennt, das vielleicht zufällig durch die Sequenz der ISNA codiert wird. In ähnlicher Weise ist die immunstimulierende Wirkung einer ISNA verschieden von und hängt nicht ab von irgendeinem Antisense-Mechanismus. Nur bestimmte Nukleinsäuren sind ISNAs. Ursprünglich nahm man an, dass bestimmte palindromische Sequenzen immunstimulierend waren. Tokunaga T et al. Microbiol Immunol 36: 55–66 (1992); Yamamoto T et al. Antisense Res Dev. 4: 119–22 (1994). Weitere Arbeiten zeigten, dass nicht-palindromische Sequenzen ebenfalls immunstimulierend sind, solange sie CpG-Dinukleotide in bestimmten Sequenz-Zusammenhängen (CpG-Motive) enthalten. Krieg AM et al. Nature 374: 546–9 (1995). Die ISNAs können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Im Allgemeinen sind doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle in vivo stabiler, wohingegen einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle eine erhöhte Immunaktivität aufweisen. Daher wird in einigen Aspekten der Erfindung bevorzugt, dass die ISNA einzelsträngig ist, und in anderen Aspekten wird bevorzugt, dass die ISNA doppelsträngig ist.
Die Begriffe „Nukleinsäure” und „Oligonukleotid” werden synonym verwendet und bedeuten mehrere, kovalent verbundene Nukleotide, wobei jedes Nukleotid einen Zucker (z. B. Ribose oder Desoxyribose), der an eine Phosphatgruppe und an eine austauschbare organische Base gebunden ist, die entweder ein substituiertes Pyrimidin (z. B. Cytosin (C), Thymin (T) oder Uracil (U)) oder ein substituiertes Purin ist (z. B. Adenin (A) oder Guanin (G)), umfasst.
Wie hierin verwendet, beziehen sich die Begriffe „Nukleinsäure” und „Oligonukleotid” auf Oligoribonukleotide genau so wie auf Oligodesoxyribonukleotide. Diese Begriffe sollen auch Polynukleoside (d. h. ein Polynukleotid minus dem Phosphat) und ein jedes andere Polymer, das organische Basen enthält, umfassen. Nukleinsäuremoleküle können aus vorhandenen Nukleinsäurequellen (z. B. genomischer DNA oder cDNA) erhalten werden, sind aber vorzugsweise synthetisch (z. B. durch Oligonukleotidsynthese produziert).
Die Begriffe „Nukleinsäure” und „Oligonukleotid” umfassen auch Nukleinsäuren oder Oligonukleotide mit einer kovalent modifizierten Base und/oder Zucker. Z. B. umfassen sie Nukleinsäuren, die Rückgrat-Zucker aufweisen, die kovalent an andere organische Gruppen mit geringem Molekulargewicht als eine Hydroxygruppe an der 3'-Position und eine andere Gruppe als einer Phosphatgruppe an der 5'-Position befestigt sind. Derartige modifizierte Nukleinsäuren können möglicherweise eine 2'-O-alkylierte Ribose-Gruppe umfassen. Zusätzlich können modifizierte Nukleinsäuren möglicherweise Zucker wie Arabinose statt Ribose umfassen. Somit können die Nukleinsäuren bezüglich der Rückgrat-Zusammensetzung heterogen sein und dadurch eine jede mögliche Kombination aus miteinander verbundenen Polymer-Einheiten enthalten wie Peptid-Nukleinsäuren (die ein Aminosäuren-Rückgrat mit Nukleinsäure-Basen aufweisen). In einigen Ausführungsformen sind die Nukleinsäuren bezüglich der Rückgrat-Zusammensetzung homogen.
Nukleinsäuren können auch Basen-Analoga wie C-5-Propyn-modifizierte Basen umfassen. Wagner et al. Nature Biotechnology 14: 840–844 (1996). Purine und Pyrimidine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, 5-Methylcytosin, 2-Aminopurin, 2-Amino-6-chlorpurin, 2,6-Diaminopurin, Hypoxanthin und andere natürlich oder nicht-natürlicherweise vorkommende Nukleobasen, substituierte und nicht-substituierte aromatische Gruppen.
Die Nukleinsäure ist ein verbundenes Polymer aus Basen, Nukleobasen-Analoga oder Nukleotiden. Wie hierin im Zusammenhang mit verbundenen Einheiten einer Nukleinsäure verwendet, bedeutet „verbundene” oder „Bindung” zwei Einheiten, die aneinander durch ein beliebiges physikochemikalisches Mittel gebunden sind. Dies beinhaltet jede beliebige kovalente oder nicht-kovalente Bindung, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist. Solche Bindungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Natürliche Bindungen, die die gewöhnlich in der Natur gefundenen sind und die die einzelnen Einheiten einer Nukleinsäure verbinden, sind am üblichsten. Die einzelnen Einheiten einer Nukleinsäure können jedoch durch synthetische oder modifizierte Bindungen verbunden sein.
Die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung umfassen mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid. Ein Oligonudeotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid umfaßt, ist ein Nukleinsäuremolekül, das eine unmethylierte Cytosin-Guanin-Dinukleotidsequenz enthält (d. h. „CpG-DNA” oder DNA, die ein von einem 3'-Guanin gefolgtes 5'-Cytosin umfasst, das durch eine Phosphatbindung verbunden ist) und das Immunsystem aktiviert. Das gesamte CpG-Oligonukleotid oder Teile können unmethyliert sein, aber mindestens das C des 5'-CG-3' muss unmethyliert sein. Die CpG-Oligonukleotide können doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Die Begriffe CpG-Oligonukleotid oder CpG-Nukleinsäure, wie hierin verwendet, bezeichnen ein immunstimulierendes CpG-Oligonukleotid oder eine Nukleinsäure, sofern nicht anders angegeben.
Für die Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung können die Nukleinsäuren de novo unter Verwendung von irgendeiner aus einer Vielzahl von Verfahren synthetisiert werden, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Z. B. können die Nukleinsäuren unter Verwendung des β-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Verfahrens (Beaucage SL and Caruthers MH Tetrahedron Lett 22: 1859 (1981)) oder des Nucleosid-H-Phosphonat-Verfahrens (Garegg et al. Tetrahedron Lett 27: 4051 (1986); Froehler et al. Nucl Acid Res 14: 5399 (1986); Garegg et al. Tetrahedron Lett 27: 4055 (1986)), Gaffney et al. Tetrahedron Lett 29: 2619 (1988)) synthetisiert werden. Diese Reaktionen können von einer Vielzahl von automatisierten Oligonukleotidsynthesemaschinen ausgeführt werden, die auf dem Markt erhältlich sind. Diese Oligonukleotide werden als synthetische Oligonukleotide bezeichnet. Alternativ können ISNAs im großen Maßstab in Plasmiden produziert werden (siehe Sambrook, T., et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) und in kleinere Teile aufgetrennt oder als Ganzes verabreicht werden. Oligonukleotide können aus vorhandenen Nukleinsäuren (z. B. genomischer DNA oder cDNA) unter Verwendung von bekannten Techniken, wie denjenigen, die Restriktionsenzyme, Exonukleasen oder Endonukleasen verwenden, hergestellt werden. Oligonukleotide, die auf diese Weise hergestellt werden, werden als isolierte Oligonukleotide bezeichnet. Der Begriff ISNA umfasst sowohl synthetische als auch isolierte immunstimulierende Nukleinsäuren.
Für die Verwendung in vivo sind ISNAs bevorzugterweise relativ resistent gegen Abbau (sind z. B. stabilisiert). Ein „stabilisiertes Nukleinsäuremolekül” soll ein Nukleinsäuremolekül bezeichnen, das relativ resistent gegen in vivo-Abbau (z. B. durch eine Exo- oder Endonuklease) ist. Wenn z. B. das 3'-Ende eines Oligonukleotides eine Selbst-Komplementarität bezüglich einer stromaufwärts gelegenen Region aufweist, so dass es zurückfalten und eine Art Stemloop-Struktur bilden kann, dann wird das Oligonukleotid stabilisiert und zeigt daher eine höhere Aktivität.
Alternativ kann die Stabilisierung einer Nukleinsäure durch Phosphat-Rückgrat-Modifikationen erreicht werden. Bevorzugte stabilisierte Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung weisen ein modifiziertes Rückgrat auf. Es wurde gezeigt, dass die Modifikation des Oligonukleotid-Rückgrates eine erhöhte Aktivität der ISNAs mit sich bringt, wenn diese in vivo verabreicht werden. Diese stabilisierten Strukturen sind bevorzugt, da die ISNAs der Erfindung ein mindestens teilweise modifiziertes Rückgrat aufweisen. Z. B. liefern CpG-Oligonukleotide einer gegebenen Sequenz, die mindestens zwei Phosphothioat-Bindungen am 5'-Ende des Oligonukleotids und mehrere Phosphothioat-Bindungen am 3'-Ende umfassen, bevorzugterweise fünf, eine maximale Aktivität und schützen das Oligonukleotid vor dem Abbau durch intrazelluläre Exo- und Endonukleasen. Andere modifizierte Oligonukleotide umfassen Phosphodiester-modifizierte Oligonukleotide, Kombinationen von Phosphodiester- und Phosphothioat-Oligonukleotiden, Methylphosphonat, Methylphosphothioat, Phosphodithioat und Kombinationen davon. Jede dieser Kombinationen und ihre besonderen Wirkungen auf Immunzellen werden detaillierter in den veröffentlichten PCT-Patentanmeldungen PCT/US95/01570 und PCT/US97/19791 diskutiert, die Priorität der US-Patentanmeldungen 08/386,063 und 08/960,774 beanspruchen, die am 07. Februar 1995 bzw. 30. Oktober 1997 eingereicht wurden. Man nimmt an, dass diese Oligonukleotide mit modifiziertem Rückgrat aufgrund von verstärkter Nukleaseresistenz, erhöhter zellulärer Aufnahme, erhöhter Proteinbindung und/oder veränderter intrazellulärer Lokalisation möglicherweise eine höhere stimulierende Aktivität zeigen.
Modifizierte Rückgrate wie Phosphothioate können unter Verwendung von autmoatisierten Techniken, die entweder Phosphoramidat- oder H-Phosphonat-Reaktionen verwenden, synthetisiert werden. Aryl- und Alkyl-Phosphonate können hergestellt werden wie z. B. in US-Patent Nr. 4,469,863 beschrieben wird; und Alkylphosphotriester (bei denen die geladene Sauerstoffgruppe wie in US-Patent Nr. 5,023,243 und im europäischen Patent Nr. 092,547 beschrieben alkyliert ist) können durch automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Reagenzien hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung anderer DNA-Rückgratmodifikationen und -Substitutionen wurden beschrieben. Uhlmann E und Peyman A Chem Rev 90: 544 (1990); Goodchild J Bioconjugate Chem 1: 165 (1990).
Andere stabilisierte Oligonukleotide umfassen: nicht-ionische DNA-Analoga wie Alkyl- und Aryl-Phosphate (bei denen der geladene Phosphonat-Sauerstoff durch eine Alkyl- oder Aryl-Gruppe ersetzt ist) und Alkylphosphodiester und Alkylphosphotriester (bei denen die geladene Sauerstoffgruppe alkyliert ist). Auch von Oligonukleotiden, die an einem oder beiden Enden ein Diol wie Tetraethylenglykol oder Hexaethylenglykol enthalten, konnte gezeigt werden, dass sie im wesentlichen gegen Nuklease-Abbau resistent sind.
In einigen Ausführungsformen sind die gemäß der Erfindung nützlichen ISNAs S- und R-chirale ISNAs. Wie hierin verwendet, ist eine „S-chirale ISNA” eine ISNA, bei der wenigstens zwei Nukleotide eine Rückgratmodifikation aufweisen, die ein Chiralitätszentrum bildet, und bei der eine Vielzahl der Chiralitätszentren S-Chiralität aufweisen. Eine „R-chirale ISNA”, wie hierin verwendet, ist eine ISNA, bei der mindestens zwei Nukleotide eine Rückgratmodifikation aufweisen, die ein Chiralitätszentrum bildet, und bei der eine Vielzahl der chiralen Zentren R-Chiralität aufweisen. Die Rückgrat-Modifikation kann eine jede Art von Modifikation sein, die ein Chiralitätszentrum bildet. Die Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Phosphothioate, Phosphodithioate, Methylphosphonate, Methylphosphothioate und Kombinationen davon.
Die chiralen ISNAs müssen mindestens zwei Nukleotide innerhalb des Oligonukleotides aufweisen, die eine Rückgratmodifikation aufweisen. Jedoch können alle oder weniger als alle der Nukleotide in den Oligonukleotiden ein modifiziertes Rückgrat aufweisen. Von den Nukleotiden, die ein modifiziertes Rückgrat aufweisen (die als Chiralitätszentren bezeichnet werden) weist eine Vielzahl die gleiche Chiralität, S oder R, auf. Eine „Vielzahl”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Menge, die größer als 50% ist. Daher können weniger als alle der Chiralitätszentren S- oder R-Chiralität aufweisen, solange eine Vielzahl der Chiralitätszentren S- oder R-Chiralität aufweisen. In einigen Ausführungsformen weisen wenigstens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 100% der Chiralitätszentren S- oder R-Chiralität auf. In anderen Ausführungsformen weisen mindestens 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% oder 100% der Nukleotide Rückgratmodifikationen auf.
Die S- und R-chiralen ISNAs können durch ein jedes auf dem Gebiet für die Herstellung chiral reiner Oligonukleotide bekanntes Verfahren hergestellt werden. Viele Veröffentlichungen lehren Verfahren zur Herstellung stereoreiner Phosphothioat-Oligodesoxynukleotide unter Verwendung eines Oxathiaphospholan-Verfahren wurden veröffentlicht. Stec WJ et al. J Am Chem Soc 117: 12019 (1995). Andere Verfahren zur Herstellung chiral reiner Oligonukleotide wurden von Firmen wie ISIS Pharmaceuticals beschrieben. Auch US-Patente haben diese Verfahren ebenfalls beschrieben. Z. B. offenbaren die US-Patente mit den Nummern 5,883,237 ; 5,837,856 ; 5,599,797 ; 5,512,668 ; 5,856,465 ; 5,359,052 ; 5,506,212 ; 5,521,302 und 5,212,295 Methoden zur Erzeugung stereoreiner Oligonukleotide.
Ein „Lebewesen” soll einen Menschen oder ein Wirbeltier bezeichnen, was einen Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schwein, ein Schaf, eine Ziege, ein Huhn, einen nicht-menschlichen Primaten (z. B. Affe), einen Fisch (Arten in der Wasserwirtschaft, z. B. Lachs), ein Kaninchen, eine Ratte und eine Maus umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist.
Ein „Lebewesen, das eine proliferative Störung aufweist” ist ein Lebewesen, das nachweisbare und unerwünschte proliferierende Zellen aufweist. Die unerwünschte proliferierende Zelle kann in einem Lebewesen, das unter Krebs leidet, Krebszellen sein. Der Krebs kann ein maligner oder nicht-maligner Krebs sein. Krebsarten oder Tumore umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Krebs des Gallenganges, Blasenkrebs, Hirntumor, Brustkrebs, Zervixkarzinom, Koriokarzinom, Dickdarmkarzinom, Gebärmutterschleimhautkrebs, Speiseröhrenkrebs, Magenkrebs, intraepithelialer Tumor, Leukämie, Leberkrebs, Lungenkrebs (z. B. kleinzellig und nicht-kleinzellig), Lymphom, Melanom, multiples Myelom, Neuroblastom, Mundkrebs, Krebs der Eierstöcke, Pankreaskrebs, Prostatakrebs, Mastdarmkrebs, Nierenkrebs, Sarkome, Hautkrebs, Magenkrebs, Hodenkrebs und Schilddrüsenkrebs, aber auch andere Karzinome und Sarkome. In anderen Ausführungsformen können die unerwünschten proliferierenden Zellen Nicht-Krebszellen sein, z. B. Zellen, die mit einer Autoimmunkrankheit oder einem Entzündungszustand zusammenhängen.
Ein „Lebewesen, das eine virale Infektion aufweist” ist ein Lebewesen, das einem Virus ausgesetzt war und akute oder chronische Manifestationen aufweist oder nachweisbare Titer des Virus im Körper aufweist.
Beispiele von Viren, die in Menschen gefunden worden sind, umfassen, sind aber beschränkt auf: Retroviridae (z. B. menschliche Immundefizienzviren, wie HIV-1 (auch bezeichnet als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV oder HIV-III; und andere Isolate, wie HIV-LP); Picornaviridae (z. B. Polioviren, Hepatitis A-Virus; Enteroviren, menschliche Coxsackie-Viren, Rhinoviren, Echoviren); Calciviridae (z. B. Stämme, die Gastroenteritis verursachen); Togaviridae (z. B. Pferdeenzephalitisviren, Rubellaviren); Flaviridae (z. B. Dengue-Viren, Enzephalitisviren, Gelbfieberviren); Coronaviridae (z. B. Coronaviren); Rhabdoviridae (z. B. vesikuläre Stomatitisviren, Tollwut-Viren); Filoviridae (z. B. Ebolaviren); Paramyxoviridae (z. B. Parainfluenzaviren, Mumpsvirus, Masernvirus, Atmungs-syncytial-Virus); Orthomyxoviridae (z. B. Grippeviren); Bungaviridae (z. B. Hantaan-Viren, Bungaviren, Phleboviren und Nairo-Viren); Arenaviridae (hämorrhagische Fieberviren); Reoviridae (z. B. Reoviren, Orbiviren und Rotaviren); Birnaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus); Parvoviridae (Parvoviren); Papovaviridae (Papillomaviren, Polyomaviren); Adenoviridae (die meisten Adenviren); Herpesviridae (Herpes simplex-Virus (HSV) 1 und 2, Varizella Zoster-Virus, Cytomegalievirus (CMV), Herpesviren); Poxviridae (Variolaviren, Impfpockenviren, Pockenviren); und Iridoviridae (z. B. Afrikanischer Schweinefiebervirus); und unklassifizierte Viren (z. B. die ätiologischen Agentien der spongiformen Enzephalopathien, das Agens der Delta-Hepatitis-Krankheiten (man glaubt, dass es sich um einen defekten Satellit des Hepatitis B-Virus handelt), die Agentien der nicht-A-, nicht-B-Hepatitis (Klasse 1 = innerlich übertragen; Klasse 2 = parenteral übertragen (d. h. Hepatitis C); Norwalk- und verwandte Viren und Astroviren).
Auch wenn viele der oben beschriebenen Viren menschliche Störungen betreffen, ist die Erfindung auch für die Behandlung von nicht-menschlichen Wirbeltieren nützlich. Nicht-menschliche Wirbeltiere sind ebenfalls in der Lage, Infektionen zu entwickeln, die durch die hierin offenbarten ISNAs verhindert oder behandelt werden können. Z. B. sind die Verfahren dieser Erfindung zusätzlich zur Behandlung von infektiösen Krankheiten des Menschen bei der Behandlung von tierischen Infektionen nützlich.
Infektiöse Viren sowohl von menschlichen als auch nicht-menschlichen Wirbeltieren umfassen Retroviren, RNA-Viren und DNA-Viren. Diese Gruppe von Retroviren umfasst sowohl einfache Retroviren als auch komplexe Retroviren. Die einfachen Retroviren umfassen die Untergruppen der B-Typ-Retroviren, C-Typ-Retroviren und D-Typ-Retroviren. Ein Beispiel eines B-Typ-Retrovirus ist das Maus-Brustkrebsvirus (MMTV). Die C-Typ-Retroviren umfassen die Subgruppen C-Typ Gruppe A (umfasst Rous-Sarkom-Virus (RSV), Vogel-Leukämie-Virus (ALV) und Vogelmyeloblastose-Virus (AMV)) und C-Typ Gruppe B (umfasst murines Leukämie-Virus (MLV), Katzenleukämie-Virus (FeLV), murines Sarkomvirus (MSV), Gibbon-Affen-Leukämievirus (GALV), Milz-Nekrose-Virus (SNV), Reticuloendotheliosevirus (RV) und Affensarkomvirus (SSV)). Die D-Typ-Retroviren umfassen Mason-Pfizer-Affenvirus (MPMV) und Affenretrovirus Typ 1 (SRV-1). Die komplexen Retroviren umfassen die Untergruppen der Lentiviren, T-Zellen-Leukämie-Viren und Foamyviren. Lentiviren umfassen HIV-1, umfassen aber auch HIV-2, SIV, Visnavirus, Katzen-Immunodefizienz-Virus (FIV) und Pferde-infektiöse-Anämie-Virus (EIAV). Die T-Zellen-Leukämie-Viren umfassen HTLV-1, HTLV-2, Affen-T-Zellen-Leukämie-Virus (STLV) und Rinder-Leukämie-Virus (BFV). Die Foamyviren umfassen menschliches Foamyvirus (HFV), Affen-Foamyvirus (SFV) und Rinder-Foamyvirus (BFV).
Beispiele für andere RNA-Viren, die bei Wirbeltieren Antigene darstellen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die folgenden: Mitglieder der Familie der Reoviridae, einschließlich der Gattung Orthoreovirus (verschiedene Serotypen sowohl von Säugetier- als auch Vogel-Retroviren), die Gattung Orbivirus (Blauzungenvirus, Eugenangeevirus, Kemerovovirus, Afrikanische Pferdekrankheit-Virus und Colorado-Zecken-Fieber-Virus), der Gattung Rotavirus (menschliches Rotavirus, Nebraska-Kalb-Diarrhoe-Virus, murines Rotavirus, Affen-Rotavirus, Rinder- oder Schafs-Rotavirus, Vogel-Rotavirus); die Familie Picornaviridae, einschließlich der Gattung Enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus A und B, menschliche enterisch-zytopathische Orphan (ECHO)-Viren, Hepatitis A-Virus, Affen-Enteroviren, murine Encephalomyelitis (ME)-Viren, Poliovirus muris, Rinder-Enteroviren, Schweine-Enteroviren, der Gattung Cardiovirus (Encephalomyocarditis-Virus (EMC), Mengovirus), der Gattung Rhinovirus (menschliche Rhinoviren, die mindestens 113 Subtypen umfassen; andere Rhinoviren), der Gattung Apthiovirus (Maul- und Klauenseuche (FMDV) umfasst; die Familie Calciviridae, einschließlich vesikuläres Exanthema des Schweinevirus, San Miguel Seelöwen-Virus, Katzen-Picornavirus und Norwalkvirus umfasst; der Familie Togaviridae, einschließlich der Gattung Alphavirus (östliche Pferdeencephalitis-Virus, Semliki-Forest-Virus, Sindbis- Virus, Chikungunya-Virus, O'Nyong-Nyong-Virus, Ross-River-Virus, venezuelanische Pferdeencephalitis-Virus, westliches Pferdeencephalitis-Virus), die Gattung Flavirius (durch Moskito übertragenes Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, japanische Encephalitis-Virus, St. Louis Encephlaitis-Virus, Murray Valley Encephalitis-Virus, West-Nile-Virus, Kunjin-Virus, zentraleuropäisches-Zecken-übertragenes Virus, Far Esstern Zecken-übertragenes Virus, Kyasanur-Forrest-Virus, Louping-III-Virus, Powassan-Virus, Omsk-hämorrhagisches Fiebervirus), der Gattung Rubivirus (Rubella-Virus), der Gattung Pestivirus (Schleimhaut-Krankheiten-Virus, Hog-Cholera-Virus, Border-disease-Virus); die Familie Bunyaviridae, einschließlich der Gattung Bunyvirus (Bunyamwera und verwandte Viren, kalifornische Encephalitis-Gruppe-Viren), der Gattung Phlebovirus (sizilianisches Sandfliegenfieber-Virus, Rift Valley Fieber-Virus), der Gattung Nairovirus (Krim-Kongo hämorrhagisches Fiebervirus, Nairobi Schafskrankheit-Virus) und der Gattung Uukuvirus (Uukuniemi und verwandte Viren); der Familie Orthomyxoviridae, einschließlich der Gattung Grippevirus (Grippevirus Typ A, viele menschliche Subtypen); Schweinegrippevirus und Vogel- und Pferde-Grippe-Viren; Grippetyp B (viele menschliche Subtypen), und Grippetyp C (mögliche separate Gattung); der Familie Paramyxoviridae, der Gattung Paramyxovirus (Parainfluenzavirus Typ 1, Sendaivirus, Hämadsorptions-Virus, Parainfluenza-Viren Typ 2–5, Newcastle-Disease-Virus, Mumpsvirus), der Gattung Morbillivirus (Masernvirus, subakute sklerosierende Panencephalitis-Virus, Distemper-Virus, Rinderpest-Virus), der Gattung Pneumovirus (respiratorisches synzytisches-Virus (RSV), respiratorisches synzytiales Rinder-Virus und Lungenentzündungsvirus von Mäusen); Forest-Virus, Sindbis-Virus, Chikungunya-Virus, O'Nyong-Nyong-Virus, Ross-river-Virus, venezuelanische Pferde-Encephalitis, westliche Pferde-Encephalitis-Virus), der Gattung Flavirius (Mosquito-übertragenes Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, japanische Encephalitis-Virus, St. Louis Encephalitis-Virus, Murray Valley Encephalitis Virus, West-Nile-Virus, Kunjin-Virus, zentraleuropäisches Zecken-übertragenes Virus, Far Eastern Zecken-übertragenes Virus, Kyasanur Forest-Virus, Louping III-Virus, Powassan vrus, Omsk-hämorrhagisches Fiebervirus), der Gattung Rubivirus (Rubella-Virus), der Gattung Pestivirus (Schleimhaut-Krankheit-Virus, Wildschwein Cholera-Virus, Border-disease-Virus); der Familie Bunyaviridae, einschliceßlich der Gattung (Bunyamwera und verwandte Viren, kalifornische Encephalitisgruppe-Viren), der Genus Phlebovirus (sizilianisches Sandfliegen-Fiebervirus, Rift Valley-Fiebervirus), der Gattung Nairovirus (Krim-Kongo hämorrhagisches Fiebervirus, Nairobi-Schafskrankheitsvirus) und der Gattung Uukuvirus (Uukuniemi und verwandte Viren); der Familie Orthomyxoviridae, die Gattung Grippe-Virus (Grippe-Virus Typ A, viele menschliche Subtypen); Schweine-Grippevirus und Vogel- und Pferdegrippeviren; Grippetyp B (viele menschliche Subtypen) und Grippe Typ C (mögliche separate Gattung); der Familie Paramyxoviridae, einschließlich der Gattung Paramyxovirus (Parainfluenza-Virus Typ 1, Sendai-Virus, Hämadsorptions-Virus, Parainfluenza-Viren Typ 2–5, Newcastle-disease-Virus, Mumpsvirus), der Gattung Morbillivirus (Masernvirus, subakute sklerotisierende Panencephalitis-Virus, Distemper-Virus, Rinderpestvirus), die Gattung Pneumovirus (Respiratory-syncytial-Virus (RSV), respiratorisches synzytiales Rinder-Virus und Lungenentzündungsviren der Mäuse); der Familie Rhabdoviridae, einschließlich der Gattung Vesiculovirus (VSV), Chandipura-Virus, Flanders-Hart-Park-Virus), der Gattung Lyssavirus (Tollwut-Virus), Fischrhabdo-Viren, und zwei wahrscheinliche Rhabdoviren (Marburg-Virus und Ebola-Virus); der Familie Arenaviridae, einschließlich des die lymphozytischen Choriomengitis-Virus (LCM), Tacaribe-Virus-Komplexes und Lassa-Virus; der Familie Coronaviridae, einschließlich des infektiösen Bronchitisvirus (IBV), Maus-Hepatitis-Virus, menschlichen enteralen Coronavirus, und der Katzen-infektiöse Peritonitis (Katzen-Coronavirus).
Beispielhafte DNA-Viren, die in Wirbeltieren Antigene darstellen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: die Familie Poxviridae, einschließlich der Gattung Orthopoxvirus (Variola major, Variola minor, Affenpocken-Vaccinia, Kuhpocken, Büffelpocken, Kanninchenpocken, Ectromelie), der Gattung Leporipoxvirus (Myxom, Fibrom), der Gattung Avipoxvirus (Geflügelpocken, andere Vogelpockenviren), einschließlich der Gattung Capripoxvirus (Schafpocken, Ziegenpocken), der Gattung Suipoxvirus (Schweinepocken), einschließlich der Gattung Parapoxvirus (ansteckender postularer Dermatitisvirus, Pseudokuhpocken, papillärer Rinder-Stomatitis-Virus); der Familie Iridoviridae (afrikanisches Schweinefiebervirus, Froschviren 2 und 3, Fisch-Lymphozysten-Virus); die Familie Herpesviridae, die α-Herpesviren (Herpes Simplex Typen 1 und 2, Varicella-Zoster, Pferde-Abort-Virus, Pferde-Herpesvirus 2 und 3, Pseudotollwutvirus, infektiöser Rinderkeratoconjunctivitis-Virus, infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus, Katzenrhinotracheitis-Virus, infektiöser Laryngoracheitis-Virus), der Beta-Herpes-Viren (menschlicher Cytomegalievirus und Cytomeegalieviren von Schweinen, Affen und Nagetieren); der Gamma-Herpesviren (Epstein-Barr-Virus (EBV), Marek-Virus, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus sylvilagus, Meerschweinchen-Herpesvirus, Lucke-Tumor-Virus); der Familie Adenoviridae, einschließlich der Gattung Mastadenovirus (menschliche Untergruppen A, B, C, D, E, und ungruppierte; Affenadenoviren (mindestens 23 Serotypen), infektiöse Hunde-Hepatitis und Adenviren von Rindern, Schweinen, Schafen, Fröschen und vielen anderen Arten, der Gattung Aviaadenovirus (Vogel-Adenviren); und nicht-kultivierbare Adenviren; der Familie Papoviridae, einschließlich der Gattung Papillomavirus (menschliche Papillomaviren, Rinderpapillomaviren, Shope-Kanninchen-Papillomavirus und verschiedene pathogene Papilloma-Viren anderer Arten), der Gattung Polyomavirus (Polyomavirus, Affenbläschenbildendes Agens (SV-40), Kanninchen-bläschenbildendes Agens (RKV), K-Virus, BK-Virus, JC-Virus und andere Primaten-Polyomaviren wie lymphotropher Papillomavirus); der Familie Parvoviridae, einschließlich der Gattung Adeno-assoziierte Viren, der Gattung Parvovirus (Katzen-Panleukopenie-Virus, Rinderparvovirus, Hunde-Parvovirus, Aleutenherz-Krankheit-Virus, etc.). Schließlich können DNA-Viren Viren umfassen, die nicht in die obigen Familien passen, wie Kuru- und Creutzfeld-Jacob-Krankheit-Viren und chronische infektiöse neuropathische Agenzien (CHINA-Virus).
Jede der vorangehenden Listen ist beispielhaft, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie beschränkend sein sollen. Zusätzlich können andere Viren als Antigene für Immunisierungs-Vorgehensweise verwendet werden, entweder in intakter Form oder als Fragmente davon. Ein Antigen ist eine Substanz, die durch das Immunsystem als fremd erkannt wird, und die spezifische Immunität induziert. Antigene können Kohlenhydrate (einschließlich z. B. Polysaccharide, Glykolipide und Glycoproteine), Proteine und Polypeptide sein genauso wie andere Oligomere, Polymere und kleine Moleküle sein, die an die Antigenrezeptoren auf Immunzellen binden können. Die spezifische Immunität gegenüber einem Antigen kann die Antigenerkennung durch T-Zellen und/oder B-Zellen einschliessen.
Nukleinsäuren, die eine geeignete ISNA enthalten, können in jedem Wirbeltier wirksam sein. Verschiedene Nukleinsäuren, die eine ISNA enthalten, können in Abhängigkeit von der Säugetierart eine optimale Immunstimulierung auslösen. Demnach kann ein Oligonukleotid, das die optimale Stimulierung oder Inhibierung in Menschen verursacht, möglicherweise keine optimale Stimulierung oder Inhibierung in einer Maus verursachen, und umgekehrt. Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitung die optimalen Oligonukleotide, die für eine bestimmte Säugetierart nützlich sind, unter Verwendung von Routinetests, die hierin beschrieben und/oder auf dem Gebiet bekannt sind, identifizieren.
Die ISNA kann dem Lebewesen direkt verabreicht oder zusammen mit einem Nukleinsäure-Abgabekomplex verabreicht werden. Ein „Nukleinsäure-Abgabekomplex”, soll ein Nukleinsäuremolekül bezeichnen, das mit einem Zielmittel (z. B. einem Molekül, das zu einer höheren Bindungsaffinität an eine Zielzelle (z. B. B-Zellen-Oberflächen und/oder erhöhte zelluläre Aufnahme durch Zielzellen) verbunden ist (z. B. ionisch oder kovalent daran gebunden; oder darin eingekapselt). Beispiele für Nukleinsäure-Abgabekomplexe umfassen Nukleinsäuren, die verbunden sind mit: einem Sterol (z. B. Cholesterin), einem Lipid (z. B. ein kationisches Lipid, Virosom oder Liposom), oder einer Substanz, die Zielzellen spezifisch bindet (z. B. ein Ligand, der von einem Zielzellen-spezifischen Rezeptor erkannt wird). Bevorzugte Komplexe können in vivo möglicherweise ausreichend stabil sein, um eine erhebliche Trennung vor der Internalisierung durch die Zielzelle zu verhindern. Jedoch kann der Komplex unter geeigneten Bedingungen im Inneren der Zelle spaltbar sein, so dass die Nukleinsäure in einer funktionellen Form freigesetzt wird.
Die ISNA oder andere Therapeutika können alleine (z. B. in Saline oder Puffer) oder unter Verwendung von einem beliebigen der auf dem Gebiet bekannten Abgabevehikel verabreicht werden: Cochleate (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); Emulsomen (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOMs (Mowat et al., 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et al., 1999); Liposomen (Childers, et al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); lebende bakterielle Vektoren (z. B. Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998); lebende virale Vektoren (z. B. Vaccinia, Adenvirus, Herpes Simplex) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); Mikrosphären (Gupta et al., 1998, Jones et al., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); Nukleinsäureimpfstoffe (Fynan et al., 1993, Kulkin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii et al., 1997); Polymere (z. B. Carboxymethylzellulose, Chitosan) (Hamajima et al., 1998, Jabbal-Gill et al., 1998); Polymerringe (Wyatt et al., 1998); Proteosomen (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988, 1996, 1997); Natriumfluorid (Hashi et al., 1998); transgene Pflanzen (Tacket et al., 1998, Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); Virosomen (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998); Virus-artige Partikel (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Die Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass auch andere Abgabevehikel, die auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet werden können.
Zusammen mit den hierin bereitgestellten Lehren kann durch das Auswählen aus den verschiedenen aktiven Verbindungen und Gewichtungsfaktoren wie Wirksamkeit, relative Bioverfügbarkeit, Patientenkörpergewicht, Schwere von ungünstigen Nebenwirkungen und bevorzugte Verabreichungsweise, ein wirksames prophylaktisches oder therapeutisches Behandlungsschema geplant werden, das keine wesentliche Toxizität bewirkt und dennoch bei der Behandlung des speziellen Lebewesens völlig wirksam ist. Die wirksame Menge für eine bestimmte Anwendung kann in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Krankheit oder des Zustandes, die oder der behandelt wird, der besonderen verabreichten ISNA (z. B. die Anzahl der unmethylierten CpG-Motive oder ihre Position in der Nukleinsäure, das Ausmaß der Chiralität des Oligonukleotides), des Antigens, der Größe des Lebewesens, oder der Schwere der Krankheit oder des Zustandes schwanken. Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann die wirksame Menge einer bestimmten ISNA und/oder eines Antigens oder eines anderen therapeutischen Agens empirisch bestimmen, ohne dass unangemessene Versuche notwendig werden.
Bei erwachsenen menschlichen Lebewesen reichen Dosen der ISNA-Verbindungen, die hierin beschrieben sind, typischerweise von ungefähr 50 μg/Dosis bis 20 mg/Dosis, typischererweise von ungefähr 80 μg/Dosis bis 8 mg/Dosis und am typischsten von ungefähr 800 μg/Dosis bis 4 mg/Dosis. Angegeben in Relation zum Körpergewicht des Patienten reichen typische Dosierungen von ungefähr 0,5 bis 500 μg/kg/Dosis, typischererweise von ungefähr 1 bis 100 μg/kg/Dosis und am typischsten von ungefähr 10 bis 50 μg/kg/Dosis. Die Dosen werden von Faktoren abhängen, einschließlich des Weges der Verabreichung, z. B. kann für die orale Verabreichung eine erheblich größere Dosis notwendig sein als für die subkutane Verabreichung.
Die Formulierungen der Erfindung werden in pharmazeutisch akzeptablen Lösungen verabreicht, die routinemäßig pharmazeutisch akzeptable Konzentrationen von Salz, puffernden Agenzien, Konservierungsmitteln, kompatiblen Trägern, Adjuvanzien und optional anderen therapeutischen Inhaltsstoffen enthalten können.
Die ISNA kann in Verbindung mit anderen Agenzien gegeben werden, die auf dem Gebiet dafür bekannt sind, in Verbindung mit IFN-α virale und proliferative Störungen zu behandeln. Beispiele für solche andere Agenzien, die gegenwärtig verwendet werden oder Gegenstand von Untersuchungen bezüglich der Verwendung in Kombination mit IFN-α sind, umfassen Ribavirin, Amantadin, chemotherapeutische Agenzien (z. B. 5-Fluoruracil und BCNU), Strahlentherapie, Phototherapie, und Cytokine, einschließlich IL-2, IL-12 und IFN-γ.
Zur Verwendung bei der Therapie kann eine wirksame Menge der ISNA einem Lebewesen auf eine beliebige Weise verabreicht werden, die die ISNA an die gewünschte Stelle abgibt, z. B. mucosal, systemisch. Die „Verabreichung” der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auf jede Weise erreicht werden, die dem Fachmann bekannt ist. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen, sind aber nicht beschränkt auf oral, parenteral, in eine Verletzung einführend, topisch, transdermal, intramuskulär, intranasal, intratracheal, durch Inhalation, Okular, vaginal und rektal.
Für die orale Einnahme können die Verbindungen (d. h. ISNA, Antigen, andere therapeutische Agenzien) leicht durch Kombination der aktiven Verbindung(en) mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, formuliert werden. Solche Träger ermöglichen es, dass die Verbindungen der Erfindung als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirupe, Aufschlämmungen, Suspensionen u. dgl. für die orale Aufnahme durch ein zu behandelndes Lebewesen formuliert werden. Pharmazeutische Zubereitungen für die orale Verwendung können als feste Trägerstoffe erhalten werden, optional durch das Mahlen einer resultierenden Mischung, und Verarbeitung der Granula-Mischung, nach Zugabe geeigneter Hilfsmittel, wenn erwünscht, um Tabletten oder Dragee-Kerne zu erhalten. Geeignete Trägerstoffe sind insbesondere Füllmittel wie Zucker, die Lactose, Saccharose, Manitol oder Sorbitol umfassen; Zellulosezubereitungen wie z. B. Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Tragantgummi, Methylzellulose, Hydroxypropylmethyl-Zellulose, Natriumcarboxymethylzellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon (PVP). Wenn erwünscht, können Sprengmittel wie vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon wie Natriumalginat hinzugefügt werden. Optional können die oralen Formulierungen auch in Saline oder Puffer zur Neutralisierung von inneren sauren Bedingungen formuliert oder ohne einen Träger verabreicht werden.
Dragee-Kerne werden mit geeigneten Beschichtungen bereitgestellt. Zu diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die optional Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, Carbopolgel, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischungen enthalten können. Zu den Tabletten- oder Dragee-Beschichtungen können Farbstoffe oder Pigmente für die Identifizierung oder Charakterisierung verschiedener Kombinationen von aktiven Verbindungsdosen hinzugefügt werden.
Pharmazeutische Zubereitungen, die oral verwendet werden können, umfassen Push-fit-Kapseln aus Gelatine genauso wie weiche verschlossene Kapseln aus Gelatine und einem Weichmacher wie Glycerol oder Sorbitol. Die Push-fit-Kapseln können die aktiven Inhaltsstoffen unter Beimischung von Füllstoffen wie Lactose, Binder wie Stärken und/oder Schmiermitteln wie Talk oder Magnesiumstearat und optional Stabilisatoren enthalten. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen gelöst oder in geeigneten Flüssigkeiten wie fetten Ölen, flüssigem Paraffin oder flüssigen Polyethylenglycolen suspendiert sein. Zusätzlich können Stabilisatoren hinzugefügt werden. Mikrosphären, die für die orale Einnahme formuliert sind, können ebenfalls benutzt werden. Solche Mikrosphären sind auf diesem Gebiet gut definiert. Alle Formulierungen für die orale Verabreichung sollten in Dosen vorliegen, die für solche Verabreichungen geeignet sind.
Für die bukkale Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pasten, die auf die übliche Weise formuliert sind, annehmen.
Zur Verabreichung durch Inhalation können die Verbindungen für die Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung bequem in Form einer Aerosol-Spray-Darreichung aus unter Druck befindlichen Verpackungen oder einem Vernebler unter Benutzung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem anderen geeigneten Gas bequem abgegeben werden. Im Falle eines unter Druck befindlichen Aerosols kann die Dosierungseinheit durch das Bereitstellen eines Ventils für die Abgabe einer abgemessenen Menge festgelegt werden. Kapseln und Patronen aus z. B. Gelatine für die Verwendung in einem Inhalationsgerät oder Insufflator können so formuliert sein, dass sie eine Pulvermischung der Verbindung und eine geeignete Pulverbase wie beispielsweise Laktose oder Stärke umfassen.
Wenn es erwünscht ist, sie systemisch abzugeben, können die Verbindungen für die parenterale Verabreichung durch Injektion, z. B. durch Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion, formuliert sein. Formulierungen für die Injektion können in der Form von Einheitsdosierungen bereitgestellt werden, z. B. in Ampullen oder Mehrfachdosenbehältern mit einem hinzugefügten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln einnehmen und können Formulierungsagenzien wie suspendierende, stabilisierende und/oder dispergierende Agenzien umfassen.
Pharmazeutische Formulierungen zur parenteralen Verabreichung umfassen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspension hergestellt werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel umfassen fette Öle wie Sesamöl oder synthetische Fettsäureester wie Ethyloleat oder Triglyceride, oder Liposomen. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen, die die Viskosität der Suspension erhöhen wie Natriumcarboxymethyl-Zellulose, Sorbitol oder Dextran, enthalten. Optional kann die Suspension auch geeignete Stabilisatoren oder Agenzien umfassen, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu erlauben.
Alternativ können die aktiven Verbindungen in Pulverform zur Darreichung mit einem geeigneten Vehikel vor der Benutzung, z. B. sterilem, Pyrogen-freien Wasser, vorliegen.
Die Verbindungen können auch als Rektal- oder Vaginalzusammensetzungen wie Zäpfchen oder Retentionseinlaufmittel gestaltet sein, z. B. indem sie gewöhnliche Zäpfchen-Grundstoffe wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Zusätzlich zu den vorher beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch als Depotpräparate formuliert sein. Solche lang wirkenden Formulierungen können mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Materialien (z. B. als eine Emulsion in einem akzeptablen Öl) oder Innenaustausch-Harzen oder als mäßig lösliche Derivate, z. B. als mäßig lösliches Salz, formuliert werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch geeignete feste oder in einer Gelphase vorliegende Träger oder Bindemittel umfassen. Beispiele solcher Träger oder Bindemittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Kalziumkarbonat, Kalziumphosphat, verschiedene Zucker, Stärken, Zellulosederivate, Gelatine und Polymere wie Polyethylenglycole.
Geeignete flüssige oder feste pharmazeutische Präparate sind z. B. wässrige oder saline Lösungen zur Inhalation, mikroeinverkapselte, als Cochlear-Implantat bereitgestellte, auf mikroskopische Goldpartikel beschichtete, in Liposomen enthaltene, vernebelte, Aerosole, Kügelchen für die Implantation in die Haut, oder auf einem scharfen Objekt getrocknet, um in die Haut eingeritzt zu werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen auch Granulat, Pulver, Tabletten, beschichtete Tabletten, (Mikro)Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Cremes, Tropfen oder Präparate mit verzögerter langwieriger Freisetzung der aktiven Verbindung; wobei in solchen Präparaten Bestandteile und Zusatzstoffe und/oder Hilfssubstanzen wie Zersetzungsmittel, Bindemittel, Beschichtungsagenzien, Schwellmittel, Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßstoffe oder löslichkeitsverbessernde Stoffe in üblicher Weise wie oben beschrieben verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind für die Verwendung in einer Vielzahl von Systemen zur Medikamentenabgabe geeignet. Für einen kurzen Überblick über Verfahren zur Wirkstoffabgabe siehe Langer Science 249: 1527 (1990), das hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Die ISNAs können per se (nackt) oder in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verabreicht werden. Zur medizinischen Verwendung sollten die Salze pharmazeutisch akzeptabel sein, aber pharmazeutisch inakzeptable Salze können bequem benutzt werden, um pharmazeutisch akzeptable Salze davon herzustellen. Solche Salze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf solche, die aus den folgenden Säuren zubereitet sind: Salzsäure, Hydrogenbromid, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Salicylsäure, p-Toluensulfonsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Naphthalen-2-sulfonsäure und Benzensulfonsäure. Solche Salze können auch als Salze von Alkali- oder Erdalkalimetallen wie Natrium-, Kalium- oder Kalziumsalze der Carboxylsäuregruppe hergestellt sein.
Geeignete puffernde Agenzien umfassen: Essigsäure und ein Salz (1–2 Prozent Gew./Vol.); Zitronensäure und ein Salz (1–3 Prozent Gew./Vol.); Borsäure und ein Salz (0,5–2,5 Prozent Gew./Vol.); und Phosphorsäure und ein Salz (0,28–2 Prozent Gew./Vol.). Geeignete Konservierungsmittel umfassen Benzalkoniumchlorid (0.003–0,03 Prozent w/v); Chlorbutanol (0,3–0,9 Prozent Gew./Vol.); Hydroxybenzoesäureester (0,01–0,25 Prozent Gew./Vol.) und Thimerosal (0,004–0,02 Prozent Gew./Vol.).
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten eine wirksame Menge einer ISNA und optional Antigene und/oder andere therapeutische Agenzien, die optional in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten sind. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger” bedeutet ein oder mehrere kompatbile feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder einkapselnde Substanzen, die für die Verabreichung an einen Menschen oder ein anderes Wirbeltier geeignet sind. Der Begriff „Träger” bezeichnet einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlich oder synthetisch, mit dem der aktive Bestandteil verbunden ist, um die Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind auch in der Lage, mit den Verbindungen der vorliegenden Verbindung und auch miteinander auf eine Weise zusammengemischt zu sein, dass es keine Wechselwirkung gibt, die die erwünschte pharmazeutische Wirkung wesentlich beeinträchtigen würde.
Eine Vielzahl von Verabreichungswegen sind verfügbar. Der spezielle ausgewählte Modus wird natürlich von dem speziellen Adjuvans oder Antigen abhängen, das gewählt ist, dem besonderen Zustand, der behandelt wird, und der Dosierung, die für die therapeutische Wirksamkeit benötigt wird. Allgemein ausgedrückt können die Verfahren dieser Erfindung unter Verwendung jedes Verabreichungsmoduses, der medizinisch akzeptabel ist, ausgeführt werden; dies bedeutet einen jeden Modus, der einen wirksamen Umfang einer Immunantwort hervorruft ohne klinisch inakzeptable nachteilige Wirkungen zu verursachen. Bevorzugte Modi der Verabreichung werden oben diskutiert.
Die Zusammensetzungen können bequem in Einheitsdosierung dargereicht und durch ein jedes Verfahren, die auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannt sind, hergestellt werden. Alle Verfahren umfassen den Schritt, die Verbindungen in Verbindung mit einem Träger zu bringen, der einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile umfasst. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem die Verbindungen gleichförmig und sehr eng mit einem flüssigen Träger, einem fein gemahlenen festen Träger oder beiden in Verbindung gebracht wird, und dem Produkt wenn nötig dann die Form gegeben wird. Dosiseinheiten für Flüssigkeiten sind Fläschchen oder Ampullen. Dosiseinheiten für Feststoffe sind Tabletten, Kapseln und Zäpfchen. Für die Behandlung eines Patienten können in Abhängigkeit von der Aktivität der Verbindung, Art der Verabreichung, Zweck der Immunisierung (d. h. prophylaktisch oder therapeutisch), Art und Schwere der Störung, Alter und Körpergewicht des Patienten verschiedene Dosen notwendig sein. Die Verabreichung einer gegebenen Dosis kann sowohl durch Einzelverabreichung in der Form einer individuellen Dosiseinheit oder in der Form von mehreren kleineren Dosiseinheiten erfolgen.
Andere Abgabesysteme können Abgabesysteme für die zeitabhängige Freisetzung, verzögerte Freisetzung oder fortwährende Freisetzung umfassen. Solche Systeme können wiederholte Verabreichungen der Verbindungen vermeiden, was die Bequemlichkeit für das Lebewesen und den Arzt erhöht. Viele Arten von Freisetzungs-Abgabesystemen sind verfügbar und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Sie umfassen auf Polymeren basierende Systeme wie Poly (Laktid-Glycolid), Copolyoxalate, Polycaprolactone, Polyesteramide, Polyorthoester, Polyhydroxybutansäure, und Polyanhydride. Mikrokapseln der vorstehenden Polymere, die Medikamente enthalten, sind z. B. im US Patent 5,075,109 beschrieben. Abgabesysteme umfassen auch Nicht-Polymersysteme wie Lipide, die Sterole wie Cholesterin, Cholesterinester und Fettsäuren oder Neutralfette wie Mono-, Di- und Tri-Glyceride umfassen; Hydrogelfreisetzungssysteme; Polydimethylsiloxan-Systeme; Peptid-basierte Systeme; Wachsbeschichtungen; komprimierte Tabletten unter Verwendung von konventionellen Bindemitteln und Arzneimittelträgern; teilweise fusionierte Implantate u. dgl. Spezifische Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: (a) Erosionssysteme, bei denen ein Agens der Erfindung in einer Form innerhalb einer Matrix enthalten ist wie die in den US Patenten Nr. 4,452,775 , 4,675,189 und 5,736,152 beschriebene und (b) Diffusionssysteme, bei denen der aktive Bestandteil mit einer gesteuerten Geschwindigkeit aus einem Polymer austritt, wie in den US Patenten 3,854,480 , 5,133,974 und 5,407,686 beschrieben ist. Zusätzlich können Abgabesysteme, die auf Pumpen basieren, verwendet werden, von denen einige für die Implantation angepasst sind.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein Verfahren, das die Verabreichung von IFN-α erfordert, auf ein klinisches Verfahren für die Behandlung eines Lebewesens durch die Verabreichung von IFN-α mit dem Ziel ein erwünschtes therapeutisches Ergebnis zu erreichen. Es gibt eine Anzahl von klinischen Indikationen, für die IFN-α ein etabliertes therapeutisches Agens ist. Ein Lebewesen, das eine IFN-α Behandlung benötigt, weist eine klinische Indikation auf, bei der IFN-α ein etabliertes therapeutisches Agens ist. Diese klinischen Indikationen umfassen bestimmte virale Infektionen und bestimmte proliferative Störungen, insbesondere Krebs und Zustände vor Krebs. Die viralen Infektionen, bei denen IFN-α zum derzeitigen Zeitpunkt für die Verwendung in den Vereinigten Staaten zugelassen ist, sind Hepatitis B, Hepatitis C und Condylomata acuminata (Feigwarze oder anogenitale Warzen). Die Neoplasmen, für die IFN-α zum gegenwärtigen Zeitpunkt in den Vereinigten Staaten zur Verwendung zugelassen ist, sind Haarzell-Leukämie, kutane T-Zellen-Leukämie, chronische myelogene Leukämie (CML), nicht-Hodgkin's-Lymphom, malignes Melanom und das mit AIDS zusammenhängende Kaposi-Sarkom. Außerhalb der Vereinigten Staaten wird IFN-α auch klinisch eingesetzt bei Blasenzellen-Karzinom, Dickdarm-Karzinom, Nierenzell-Karzinom, multiplem Myelom, zervikale Dysplasie und Kehlkopf-Papillomatose. Andere Indikationen, für die die IFN-α-Behandlung untersucht wird, umfassen andere virale Infektionen und andere Krebsarten, einschließlich z. B. die Behcet'sche Krankheit, HIV, Prostatakrebs, kleinzelliges Lungenkarzinom, Pankreaskrebs, Plattenepithelzellenkrebs, Gliom, und malignes Pleurom u. a.
Wie hierin verwendet, bezeichnet eine pharmazeutische Zusammensetzung, die IFN-α umfasst, ein Präparat aus rekombinantem oder natürlichem IFN-α, das für die pharmazeutische Verwendung geeignet ist. IFN-α kann aus natürlichem Material gewonnen werden (z. B. Leukozytenmyeloblasten, Lymphozyten) oder daraus gewonnenem Material (z. B. Zelllinien) oder solchem, das mit rekombinanter DNA-Technologie hergestellt wurde. Details der Klonierung von IFN-α und dessen direkter Expression, insbesondere in Escherichia coli, waren der Gegenstand zahlreicher Veröffentlichungen. Die Herstellung von rekombinanten IFNs ist z. B. aus Gray et al. Nature 295: 503–8 (1982), Goeddel et al. Nature 284: 316–20 (1980), Goeddel et al. Nature 290: 20–26 (1981) und EP 174143 bekannt. In den Vereinigten Staaten ist IFN-α als rekombinantes menschliches IFN-α2a (ROFERON-A), rekombinantes menschliches IFN-α2b (INTRON A) und als gereinigtes natürliches IFN-αn3 (ALFERON N) verfügbar. Außerhalb der Vereinigten Staaten ist IFN-α auch als gereinigtes natürliches IFN-αn1 (WELLFERON) verfügbar.
Wie hierin verwendet, bezeichnet eine klinisch etablierte wirksame Dosis von IFN-α alleine eine Dosis von rekombinantem oder natürlichem IFN-α, die in Abwesenheit eines anderen Agens verabreicht wird, das die IFN-α-Bioverfügbarkeit erhöht, die die empfohlene Standarddosis für eine bestimmte klinische Indikation ist. Eine klinisch etablierte wirksame Dosis für IFN-α alleine kann jedoch die Verwendung von IFN-α in Kombination mit anderen Agenzien und Behandlungsmodalitäten, wie konventioneller Chemotherapie, Bestrahlungstherapie, antivirale Agenzien und einem chirurgischen Eingriff umfassen. Bei einer Mehrheit der Lebewesen würde man erwarten, dass die empfohlene Standarddosis von IFN-α für eine bestimmte klinische Indikation eine erwünschte klinische Wirkung entfaltet. Bei einer gegebenen klinischen Anwendung in einem gegebenen Lebewesen kann eine klinisch etablierte wirksame Dosis von IFN-α alleine auch eine IFN-Dosis bezeichnen, von der erwartet wird, wurde, oder würde, dass sie bei diesem Lebewesen für die Behandlung eines Zustandes des Lebewesens wirksam ist. Z. B. könnte ein Lebewesen auf eine Dosis von IFN-α alleine ansprechen, die geringer ist als die empfohlene Standarddosis. Umgekehrt könnte ein Lebewesen nicht in der Lage sein, eine klinisch etablierte wirksame Dosis aufgrund von tatsächlichen oder erwarteten Nebenwirkungen der IFN-α-Behandlung zu vertragen.
Die maximal tolerierte Dosis (MTD) einer beliebigen therapeutischen Verbindung wird als Teil ihrer klinischen Evaluierung bestimmt. Z. B. können klinische Studien der Phase I eine Bestimmung der maximalen tolerierten Dosis, der die Dosis begrenzenden Toxizitäten (DLT) und der Pharmakokinetiken einer Testverbindung umfassen. Somit ist die MTD einer jeden von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen therapeutischen Verbindung den Fachleuten auf dem Gebiet als Teil der öffentlichen Akte bekannt. Die MTD einer bestimmten therapeutischen Verbindung kann in Abhängigkeit von ihrer Formulierung (z. B. injizierbare Formulierung, implantierbare bioerosive Polymer-Formulierung, orale Formulierung), ihrem Verabreichungsweg (z. B. intravenös, oral, intratumoral), Art und Weise der Abgabe (z. B. Infusion, Bolusinjektion), Dosierungsschema (z. B. stündlich, täglich, wöchentlich) u. dgl. variieren. Die MTD wird häufig als die höchste Dosis definiert, bei der 50% der Testpersonen, denen der Wirkstoff verabreicht wurde, Dosis-begrenzende Toxizitäten entwickeln. Andere Definitionen, die klinisch relevant und allgemein anerkannt sind, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Beispiele für MTDs verschiedener IFN-α-Typen wurden in Studien veröffentlicht, die verschiedene Verabreichungswege, Indikationen, Kombinationen mit anderen Agenzien und klinische Konstellationen einschlossen. In einer Studie betrug die MTD von rekombinantem IFN-α2a 18 Millionen internationale Einheiten (IU), wenn es intramuskulär dreimal pro Woche in Kombination mit einer Phototherapie zur Behandlung von kutanem T-Zellen-Lymphom (funguide Pilzinfektion und Sézary-Syndrom) gegeben wurde. Kuzel TM et al. J Natl Cancer Inst 82: 203–7 (1990). Bei einer unabhängigen Studie wurde herausgefunden, dass die MTD von IFN-α2b für die Behandlung von kutanem T-Zellen-Lymphom 18 Millionen IU betrug, wenn es intramuskulär dreimal pro Woche gegeben wurde. Qiu B und Chen M Chin Med J (Engl) 109: 404–6 (1996). Die MTD für IFN-α2a war geringer, 3 Millionen IU subkutan dreimal pro Woche, bei Patienten, die sich wegen Mastdarmkrebs hohen Dosen einer Becken-Bestrahlung unterzogen. Perera F et al. Int J Radial Oncol Biol Phys 37: 297–303 (1997). Die MTD für IFN-α2b betrug bei Patienten mit mit AIDS zusammenhängendem Kaposi-Sarkom nach zytotoxischer Chemotherapie 10 Millionen IU pro Tag. Gill PS et al. J Biol Response Mod 9: 512–6 (1990). Bei noch einer anderen Studie betrug die MTD von IFN-α2b bei wöchentlicher Gabe als 24-Stunden-Infusion in Kombination mit 5-Fluoruracil und Leucovorin an Patienten mit metastatischem colorektalem Krebs 18 Millionen IU/m². Cascinu S et al. Anticancer Drugs 7: 520–4 (1996).
Die Bestimmung der maximalen tolerierten Dosis kann als Gewicht des Wirkstoffs pro Gewicht des Lebewesens, Gewicht des Wirkstoffs pro Körperoberflächen-Einheit etc. angegeben werden. Die MTD von Wirkstoffen gegen Krebs wird oft als Gewicht pro Quadratmeter (mg/m²) Körperoberfläche angegeben. Die MTD kann auch als Dosis relativ zu einer Zeit-Komponente angegeben werden wie Gewicht des Wirkstoffs pro Körperoberfläche pro Tag.
Bei Therapeutika, die noch nicht Gegenstand von klinischen Studien am Menschen oder Gegenstand einer beliebigen Art der Bestimmung der MTD beim Menschen (z. B. experimentelle oder hoch toxische Verbindungen) waren, kann ein Fachmann die MTD unter Verwendung von Tiermodellen abschätzen. Die Berechnung der MTD in Tieren kann oft auf der Grundlage einer Anzahl physiologischer Parameter wie Tod, bestimmten Vergiftungserscheinungen und durch den Wirkstoff ausgelösten Gewichtsverlust bestimmt werden. Bei Verwendung des Todes als Endpunkt kann die MTD die höchste den Versuchstieren gegebene Dosis sein, bei der jedes Mitglied der Testgruppe überlebte. Bei Verwendung von Toxizität als ein Endpunkt kann die MTD die Dosis sein, bei der eine mäßige, aber keine schwere Toxizität beobachtet wird. Bei Verwendung von Gewichtsverlust als Endpunkt kann die MTD die Dosis sein, oberhalb der eine bestimmte prozentuale Änderung des Körpergewichtes induziert wird. Andere Verfahren zur Bestimmung von MTDs unter Verwendung von Tiermodellen und verschiedenen Endpunkten sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die Korrelation von Tier-MTDs mit menschlichen MTDs für eine therapeutische Verbindung ist auf dem Gebiet der Pharmazie eine akzeptierte Vorgehensweise.
Demnach sieht die Erfindung in einem Aspekt die Bereitstellung von Zusammensetzungen und Formulierungen für die Verabreichung an ein Lebewesen vor, bevorzugt ein menschliches Lebewesen, die eine Menge an Interferon umfasst, die unter der maximalen tolerierten Dosis für Interferon liegt.
In einem Aspekt umfasst die Erfindung die Behandlung eines Lebewesens, das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, was die Co-Verabreichung einer wirksamen Menge einer isolierten ISNA in Verbindung mit der Verabreichung von IFN-α einschließt. Wie hierin verwendet, bezeichnet eine wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten ISNA, die bewirkt, dass Zellen IFN-α produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten ISNA, die bewirkt, dass Zellen in vivo IFN-α produzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine wirksame Menge einer isolierten ISNA jene Menge einer isolierten ISNA, die einer Menge entspricht, die bewirkt, dass Zellen in vitro IFN-α produzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten ISNA, die eine Erhöhung der lokalen oder zirkulierenden Menge von IFN-α oberhalb des entsprechenden Titers bewirkt, der nur durch die Verabreichung von exogenem IFN-α auftreten würde. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten ISNA, die den therapeutischen Nutzen von exogenem IFN-α über den erhöht, der ohne ISNA erhalten werden würde. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bezeichnet eine wirksame Menge einer isolierten ISNA die Menge einer isolierten ISNA, die erlauben würde, dass die gleiche therapeutische Wirkung mit einer gegebenen IFN-α-Menge erreicht wird, wenn das Oligonukleotid mit einer geringeren IFN-α-Dosis co-verabreicht wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Co-Verabreichen die Verabreichung von mindestens zwei Agenzien, wobei beide klinisch miteinander verbunden sind. Co-Verabreichung kann die Verabreichung von mindestens zwei Agenzien zusammen oder nacheinander umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ISNA entweder vor, zur gleichen Zeit oder nach der Verabreichung von IFN-α verabreicht, unter der Voraussetzung, dass die lokale oder systemische Konzentration von IFN-α über die entsprechende Konzentration von IFN-α erhöht wird, die durch die Verabreichung der gleichen IFN-α-Menge alleine erreicht würde. Co-Verabreichung bedeutet, dass die Verabreichung von Interferon-α zeitlich nahe genug an der Verabreichung der ISNA erfolgt, so dass ihre Wirkungen höher sind als die Wirkungen, die erreicht würden, wenn jeweils eines alleine in der gleichen Dosis verabreicht würde. Bevorzugterweise sind die Wirkungen mindestens additiv. Sie können auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, z. B. durch die systemische Verabreichung des Interferons und die lokale Verabreichung der ISNA.
In bestimmten Ausführungsformen, die die gleichzeitige Co-Verabreichung umfassen, können das IFN-α und die ISNA als eine einzige Formulierung hergestellt sein. In weiteren Ausführungsformen, die eine simultane Co-Verabreichung umfassen, können das IFN-α und die ISNA getrennt zubereitet und verabreicht werden. Im letzteren Fall können individuelle IFN-α- und ISNA-Formulierungen zusammen als Kit mit Anweisungen für die gleichzeitige Verabreichung verpackt sein. Ähnlich können individuelle INF-α- und ISNA-Formulierungen in Ausführungsformen, die die aufeinanderfolgende Co-Verabreichung erfordern, als Kit mit Anweisungen für die aufeinanderfolgende Verabreichung verpackt sein.
Wie hierin verwendet, bezeichnet lokal verabreicht die Verabreichung durch einen Weg, mit dem eine lokale IFN-α-Konzentration erreicht wird, die die systemische Konzentration von IFN-α übertrifft. Z. B. kann die lokale Verabreichung an eine bestimmte Verletzung oder ein bestimmtes Organ durch die direkte Injektion in die Verletzung oder das Organ oder durch die direkte Injektion in ein zuführendes Blutgefäß, das mit der Verletzung oder dem Organ, die/das zu behandeln ist, verbunden ist und es versorgt, erreicht werden. Beim Beispiel der lokalen Verabreichung an die Leber kann die lokale Verabreichung durch Injektion oder Infusion in die Leberarterie, die Baucharterie oder die Pfortader erreicht werden.
In einem anderen Aspekt schliesst die Erfindung die Ergänzung der IFN-α-Behandlung eines Lebewesens, das eine IFN-α-Behandlung benötigt, ein, wobei sowohl eine wirksame IFN-α-Menge als auch eine isolierte ISNA dem Lebewesen verabreicht werden. Das durch die ISNA induzierte IFN-α ergänzt das direkt an das Lebewesen verabreichte IFN-α, so dass die klinische Wirksamkeit einer gegebenen Dosis IFN-α erweitert wird. Weiterhin wird dadurch, dass das ISNA-induzierte IFN-α typischerweise eine Vielzahl von Subtypen umfasst, wohingegen das direkt verabreichte IFN-α typischerweise nur einen einzelnen Subtypen umfassen, die Bandbreite der biologischen Wirkungen, die durch die IFN-α-Behandlung bereitgestellt werden, ebenfalls durch die Co-Verabreichung der ISNA und des IFN-α erweitert.
Die Erfindung schließt auch die Erhöhung der Wirksamkeit einer IFN-α-Behandlung eines Lebewesens ein. Dieser Aspekt der Erfindung umfasst die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, die IFN-α beinhaltet, sowie die Co-Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die eine ISNA in einer Menge umfasst, die, zusammen mit dem verabreichten IFN-α, eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt, wobei die Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung höher als die Wirksamkeit der Verabreichung derselben Menge IFN-α bei Abwesenheit der Co-Verabreichung der ISNA ist.
Wie hierin verwendet, bezeichnet ein Verfahren zur Verstärkung der Wirksamkeit oder Erhöhung der Wirksamkeit einer IFN-α-Behandlung eines Lebewesens ein Verfahren, bei dem die Wirkung der Verabreichung einer gegebenen IFN-α-Dosis an ein Lebewesen zu einer größeren klinischen Wirkung führt als erwartet oder als vorher unter Verwendung der gleichen Dosis IFN-α beobachtet wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet das Verfahren die Co-Verabreichung einer ISNA-Menge in einer für die Induktion der Produktion von IFN-α durch IPCs wirksamen Menge. Die bei diesem Verfahren lokal oder systemisch erreichte Menge an IFN-α spiegelt Beiträge sowohl von dem verabreichten IFN-α als auch von dem induzierten IFN-α wieder, wodurch eine erhöhte Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung bei einer gegebenen Dosis von verabreichtem IFN-α erreicht wird. Die erhöhte Wirksamkeit könnte sich z. B. in einem größeren Ausmaß der Reaktion auf die Behandlung, einem schnelleren Verlauf der Reaktion auf die Behandlung oder einer verbesserten Umsetzung des Behandlungsplanes äußern.
Gemäß einem weiteren Aspekt schliesst die Erfindung die Verringerung einer für die Behandlung eines Lebewesens, das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, wirksamen Dosis an IFN-α ein. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die IFN-α umfasst, an ein Lebewesen, das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, und die Co-Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die eine Menge einer immunstimulierenden Nukleinsäure umfasst, die zusammen mit dem verabreichten IFN-α eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt, und wobei die Menge des verabreichten IFN-α geringer ist als eine Menge an IFN-α, die bei Abwesenheit der co-verabreichten immunstimulierenden Nukleinsäure erforderlich ist.
Wie hierin verwendet, bezeichnet ein Verfahren für die Senkung einer für die Behandlung eines Lebewesens wirksamen IFN-α-Dosis ein Verfahren, bei dem einem Lebewesen eine Menge an IFN-α oder IFN-α mit einer Häufigkeit verabreicht wird, die im Vergleich zu einer zuvor etablierten Menge oder Häufigkeit verringert ist, während eine erwünschte klinische Wirkung bei der Behandlung einer Störung des Lebewesens erreicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Dosismenge in einem klinisch bestimmten Umfang auf eine Menge reduziert werden, die, z. B., wenigstens 10% unter der üblichen oder maximalen tolerierten Dosis für IFN-α alleine liegt. In anderen bevorzugteren Ausführungsform kann die IFN-α-Dosis um einen klinisch bestimmten Umfang bis zu einer Menge reduziert werden, die mindestens 20%, mindestens 30% oder mindestens 40% unter der üblichen oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt. In einer bevorzugtesten Ausführungsform kann die Dosismenge von IFN-α in einen klinisch bestimmten Umfang auf eine Menge reduziert werden, die mindestens 50% unter der üblichen oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die Häufigkeit der Dosis in ein klinisch bestimmten Umfang auf eine Häufigkeit reduziert werden, die, z. B., mindestens 10% unter der üblichen oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt. In anderen bevorzugteren Ausführungsform kann die Häufigkeit der IFN-α-Dosis in einen klinisch bestimmten Umfang auf eine Häufigkeit reduziert werden, die mindestens 20%, mindestens 30%, oder mindestens 40% unter der üblichen oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt. In einer bevorzugtesten Ausführungsform kann die Häufigkeit der IFN-α-Dosis in einem klinisch bestimmten Umfang auf eine Häufigkeit reduziert werden, die mindestens 50% unter der üblichen oder maximalen tolerierten Dosis von IFN-α alleine liegt.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verhinderung einer mit einer IFN-α-Behandlung zusammenhängenden Nebenwirkung bei einem Lebewesen vor, das eine Behandlung mit IFN-α erhält oder benötigt. Das Verfahren schließt die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Lebewesen ein, das eine Behandlung mit IFN-α benötigt, die IFN-α enthält, und die Co-Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung an das Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die eine Menge einer immunstimulierenden Nukleinsäure umfasst, die zusammen mit dem verabreichten IFN-α eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt, und wobei eine mit einer IFN-α-Behandlung verbundene Nebenwirkung im Vergleich zu der Nebenwirkung reduziert ist, wenn IFN-α bei Abwesenheit der Co-Verabreichung der immunstimulierenden Nukleinsäure verabreicht wird.
IFN-α-Tests sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Sie umfassen direkte Tests, z. B. Enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA), die für mindestens ein IFN-α spezifisch sind, und indirekte Tests, z. B. funktionelle Tests, die die NK-Zellen-Aktivierung/Zytotoxizität umfassen (Trinchieri G Adv Immunoll 47: 187–376 (1989) und die Phänotypisierung durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungs-(FACS)-Analyse auf Klasse I MHC. Zusätzliche spezifische Testverfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind, können besonders nützlich bei Konstellationen sein, bei denen die lokale Konzentration oder die lokale Anwesenheit von IFN-α von Interesse ist; diese Verfahren umfassen z. B. Immunohistochemie, Nukleinsäure-Hybridisierung (z. B. Northern Blotting), Western Blotting, reverse Transkriptase/Polymerasekettenreaktion (RT/PCR) und in situ RT/PCR. Ein weiteres Verfahren, das den Nachweis von intrazellulärem IFN-α durch Flusszytometrie einschließt, wird unten in Beispiel 6 offenbart.
Wie hierin verwendet, bezeichnet ein Verfahren zur Verhinderung einer mit einer IFN-α-Behandlung verbundenen Nebenwirkung in einem Lebewesen ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit oder Schwere einer mit einer IFN-α-Behandlung verbundenen Nebenwirkung, die einem Lebewesen widerfährt, das eine IFN-α-Behandlung erhält. Wie hierin verwendet, ist eine mit einer IFN-α-Behandlung verbundenen Nebenwirkung eine klinische Nebenwirkung, die in einem Lebewesen als ein Ergebnis der Verabreichung von IFN-α an das Lebewesen induziert wird. Durch klinische Erfahrungen und klinische Versuche wurde eine Anzahl solcher Nebenwirkungen gut dokumentiert. Solche Nebenwirkungen sind bei einem Lebewesen häufig dosisbegrenzend. Systemische, mit einer IFN-α-Behandlung verbundenen Nebenwirkungen, die am häufigsten auftreten, umfassen: Grippe-artiges Syndrom, Fieber, Kopfschmerzen, Kältegefühl, Muskelschmerzen, Müdigkeit, Magersucht, Übelkeit, Erbrechen, Diarrhoe, Depression, Schilddrüsenunterfunktion, Neutropänie und Anämie. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mit einer IFN-α-Behandlung verbundenen Nebenwirkung ausreichend reduziert, um ein besseres Annehmen der IFN-α-Behandlung zu fördern. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die mit der IFN-α-Behandlung zusammenhängende Nebenwirkung ausreichend verringert, um die Wiederaufnahme einer IFN-α-Behandlung, die ansonsten durch diese Nebenwirkung ausgeschlossen wäre, zu erlauben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die mit der IFN-α-Behandlung verbundene Nebenwirkung ausreichend verringert, um eine Intensivierung einer IFN-α-Behandlung zu erlauben.
In einem anderen Aspekt sieht die Erfindung die Bereitstellung eines zweiten Verfahrens für die Verstärkung der Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung eines Lebewesens vor, das eine solche Behandlung benötigt. Dieses umfasst die Schritte der Verabreichung einer Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die IFN-α enthält, die für die Behandlung eines Zustandes des Lebewesens wirksam ist, an ein Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, der Isolierung natürlicher Interferon-produziernder Zellen (IPCs) aus einem Spender, des Kontaktierens der isolierten IPCs ex vivo mit einer Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine immunstimulierende Nukleinsäure umfasst, die wirksam ist, um die IPCs zu induzieren, IFN-α freizusetzen, und der Verabreichung der kontaktierten Zellen an das Lebewesen. Der Spender und das Lebewesen können eine einzige Person sein oder sie können verschiedene Personen sein. In bestimmten Ausführungsformen werden dem Lebewesen die kontaktierten Zellen lokal verabreicht, z. B. durch Injektion oder Infusion in ein Blutgefäß, das ein zu behandelndes Zielgewebe versorgt. Das Verfahren gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann optional das Kontaktieren der isolierten IPCs mit einem Antigen umfassen. Bei bestimmten Ausführungsformen kann das Verfahren auch das Kontaktieren der isolierten IPCs mit einem Wachstumsfaktor umfassen, den die IPCs nicht selbst produzieren. Ein derartiger Wachstumsfaktor, den die IPCs nicht produzieren, kann z. B. IL-3 oder GM-CSF umfassen und würde IL-8 und TNF-α ausschließen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff Wachstumsfaktor einen löslichen Signalfaktor, der einen darauf ansprechenden Zelltyp induziert, Reifung und Mitose zu durchlaufen. Die Wachstumsfaktor-Kategorien umfassen zahlreiche Zytokine, Wachstumsfaktoren per se und Hormone. Spezifische Beispiele für Wachstumsfaktoren umfassen ohne Beschränkung IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, GM-CSF, G-CSF, PDGF, TGF-β, NGF, IGFs, Wachstumshormon, Erythropoietin, Thrombopoietin u. ä.. Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Wachstumsfaktoren können Wachstumsfaktoranaloga und Wachstumsfaktor-Derivative wie Fusionsproteine für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff natürliches Interferon-produzierende Zellen (IPC) einen spezialisierten Leukozytentyp, der der Hauptproduzent von IFN-α als Antwort auf umhüllte Viren, Bakterien und Tumore ist. IPCs sind Abstammungs-negative (lin–)/CD4+/MHC Klasse II+-Zellen, die in geringer Häufigkeit in mononukleären Zellen des peripheren Blutes und im Mandelgewebe vorkommen. Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999); Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101–11 (1997). Die Häufigkeit von IPCs in PBMCs in normalen Lebewesen schwankt zwischen 0,2 und 0,6 Prozent. Sie sind gekennzeichnet durch die Abwesenheit der Abstammungs-Marker CD3 (T-Zellen), CD14 (Monozyten), CD19 (B-Zellen) und CD56 (NK-Zellen), durch die Abwesenheit von CD11c und durch ihre Expression von CD4, CD123 (IL-3-Rezeptor α, IL-3R α) und MHC Klasse II. Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101–11 (1997); Rissoan M-C et al. Science 283: 1183–86 (1999); Siegal FP et al. Sceince 284: 1835–7 (1999); Cella M et al. Nat Med 5: 919–23 (1999).
Wie hierin verwendet bezeichnet die Isolierung von IPCs aus einem Spender das Verfahren der Entfernung einer Körperflüssigkeit oder eines Körpergewebes, die/das IPCs enthält, aus einem Lebewesen und die Anreicherung der IPCs aus der Körperflüssigkeit oder dem Körpergewebe in einem Umfang, dass mindestens 1 Prozent dieser Zellen IPCs sind. In einer bevorzugtesten Ausführungsform sind mindestens 99 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 95 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 90 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 80 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 70 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 60 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 50 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 40 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 30 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 20 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 10 Prozent der Zellen IPCs. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 5 Prozent der Zellen IPCs. Die Anreicherung kann durch eine Reihe von Auswahlschritten erreicht werden, die, z. B., eine Negativselektion von Abstammungs-positiven Zellen durch Kontaktieren von Zellen mit magnetischen Kügelchen, die mit Antikörpern konjugiert sind, die für die Abstammungs-Marker spezifisch sind (d. h. anti-CD3, anti-CD11c, anti-CD14, anti-CD16, anti-CD19, anti-CD56), und dann das Laufenlassen der kontaktierten Zellen über eine Abreicherungssäule bei Anwesenheit eines stark magnetischen Feldes; einen Positivselektionsschritt, der das Kontaktieren der Zellen, die durch die Abreicherungssäule laufen, mit mit Mikrokügelchen konjugiertem anti-CD4 und das Laufenlassen der kontaktierten Zellen über eine Positivselektionssäule umfasst; und eine weitere Vermehrung der IPCs durch Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von anti-CD123 und anti-MHC Klasse II umfassen kann. Andere Verfahren können, wie von den Fachleuten auf dem Gebiet anerkannt werden wird, mit gleicher Wirkung verwendet werden, sofern sie zu der Isolierung oder Anreicherung von (lin–)/CD4+/CD123+/MHC Klasse II+-Interferon produzierenden Zellen in einem Umfang führen, dass mindestens 1 Prozent der lebensfähigen Zellen IPCs sind.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens für die Unterstützung des Überlebens natürliches Interferon-produzierender Zellen (IPCs) in vitro vor. Das Verfahren schließt die Isolierung von IPCs aus einem Lebewesen (wie oben beschrieben), die Kultivierung der IPCs in einem sterilen Medium, das für die Gewebekultur geeignet ist, und das Kontaktieren der IPCs in vitro mit einer Menge einer immunstimulierenden Nukleinsäure ein, die bei der Unterstützung des Wachstums der IPCs bei Abwesenheit von Interleukin 3 (IL-3) wirksam ist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die IPCs dendritische Zellen vom Vorläufer-Typ II (pDC2s; plasmazellenartige Monozyten). Siegel FP et al. Science 284: 1835–7 (1999). Die IPCs können unter geeigneten Gewebekulturbedingungen entweder mit oder, bemerkenswerterweise, ohne exogenes IL-3 und/oder GM-CSF kultiviert werden.
Wie hierin verwendet bezeichnet ein Verfahren zur Unterstützung des Überlebens von Interferon-produzierenden Zellen (IPCs) in vitro die Bereitstellung von einem Faktor oder die Induktion von einem Signal, das die Lebensfähigkeit von in einer in vitro-Kultur gehaltenen IPCs fördert. Zum Beispiel sterben die meisten IPCs normalerweise bei Abwesenheit von IL-3 innerhalb von 3 Tagen nach der Einbringung in die Zellkultur. Die Zugabe von IL-3 zu IPCs wird das Überleben der IPCs in der Kultur unterstützen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung ist IL-3 für das Überleben von IPCs in vitro nicht notwendig, wenn die IPCs mit einer wirksamen Menge ISNA kontaktiert werden.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Stimulierung isolierter Interferon-produzierender Zellen (IPCs) in vitro vor. Das Verfahren schliesst die Schritte der Isolierung von IPCs aus einem Lebewesen (oben beschrieben), die Kultivierung der IPCs in einem sterilen Medium, das für die Gewebekultur geeignet ist, und das Kontaktieren der IPCs in vitro mit einer Menge immunstimulierender Nukleinsäure ein, die für die Induktion der Sekretion von wenigstens einem Typ I-Interferon wirksam ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Typ-I-Interferon, das durch das Verfahren induziert wird, IFN-α. Wie oben beschrieben sind bevorzugte IPCs dendritischer Zellen vom Vorläufer-Typ 2 (pDC2s; plasmazellenartige Monozyten). Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999). Es ist wichtig, dass die IPCs in Kultur bei Abwesenheit von GM-CSF und ohne virale Infektion durch z. B. den Sendai-Virus, HSV oder Grippevirus stimuliert werden können. Die Aktivierung kann unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Verfahren getestet werden, die die FACS-Analyse des Zelloberflächen-Aktivierungsmarkers CD80 und ELISA oder Biotests (z. B. Schutz von Fibroblasten vor vesikulären-Stomatitisvirus) auf Typ I IFN umfassen.
Wie hierin beschrieben bezeichnet ein Verfahren zur Stimulierung isolierter Interferonproduzierender Zellen (IPCs) in vitro die Bereitstellung von einem Faktor oder die Induktion eines Signals, das zu einer Veränderung der IPC-Größe, -Morphologie oder der Expression eines Zelloberflächenantigens, eines Transkriptes oder eines sekretierten Produktes führt, das bei Abwesenheit des Faktors oder des Signals nicht für IPCs charakteristisch ist. Frisch isolierte IPCs zeigen bei Abwesenheit eines Signals, das durch virale Infektion, CD40L-Ligation oder GM-CSF bereitgestellt wird, eine glatte runde Lymphoid-Morphologie mit einem Durchmesser von 8–10 μm und exprimieren kein CD80 oder CD86 auf ihrer Zelloberfläche. Grouard G et al. J Exp Med 185: 1101–11 (1999). In ähnlicher Weise sekretieren frisch isolierte IPCs IFN-α nicht in großen Mengen. Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999). Im Gegensatz dazu entwickeln IPCs, die in vitro gegenüber IL-3 exponiert sind, Pseudopodien und eine verschleierte Morphologie, exprimieren CD80 und CD86 auf ihrer Oberfläche und sekretieren große Mengen an Typ I-IFN (IFN-α und IFN-β), wenn sie mit Ultraviolett-bestrahltem Herpes simplex-Virus, Sendai-Virus oder durch Hitze abgetötetem Staphylococcus aureus ausgesetzt sind. Grouard G et al. J Exp Med 185: 1110–11 (1999); Siegal FP et al. Science 284: 1835–7 (1999). Gemäß diesem Aspekt der Erfindung kann ISNA statt viraler Infektion, CD40L-Ligation oder GM-CSF verwendet werden, um ein Signal zu induzieren, das dahingehend wirkt, dass es für die Stimulierung isolierte IPCs in vitro wirksam ist.
Die Erfindung schließt weiterhin die Behandlung eines Lebewesens ein, um die Interferonproduzierenden Zellen (IPCs) des Lebewesens zu aktivieren. Das Verfahren schließt die Isolierung von IPCs aus einem Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, die Kultivierung der IPCs in vitro, das Kontaktieren der IPCs in vitro mit einer wirksamen Menge einer isolierten immunstimulierenden Nukleinsäure und die Rückgabe der kontaktierten IPCs an das Lebewesen ein. IPCs werden wie oben beschrieben aus einem Lebewesen isoliert und unter geeigneten in vitro Zellkulturbedingungen in Kultur gegeben. Derartige Kulturbedingungen können optional die Bereitstellung von exogenem Wachstumsfaktor, einschließlich IL-3 oder GM-CSF, umfassen. Jedoch werden IL-3 oder GM-CSF möglicherweise für die Zwecke des Verfahrens nicht benötigt. Gemäß diesem Verfahren kann das Lebewesen ohne direkte Verabreichung einer pharmazeutischen Zubereitung von IFN-α behandelt werden. Die Aktivierung der IPCs kann wie oben beschrieben getestet werden, wobei Bezug genommen wird auf in ähnlicher Weise erhaltene und kultivierte, aber nicht mit ISNA kontaktierte IPCs.
In noch einem weiteren Aspekt schliesst die Erfindung die Stimulierung der Produktion einer Vielzahl von Typ I-IFN-Subtypen ein. Das Verfahren schließt das Kontaktieren von IPCs mit einer Menge einer immunstimulierenden Nukleinsäure ein, die dahingehend wirkt, dass sie die Sekretion von mindestens zwei Typ I-Interferonen induziert. In einer Ausführungsform werden die IPCs mit ISNA in vivo in Kontakt gebracht. In weiteren Ausführungsformen werden die IPCs isoliert und/oder mit ISNA in vitro und geeigneten Zellkulturbedingungen in Kontakt gebracht. Verschiedene andere Ausführungsformen führen zur Induktion von mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 7, und mindestens 8 Subtypen von Typ I-IFN. Die verschiedenen Subtypen können unter Verwendung von Verfahren bestimmt werden, die in der Technik gut beschrieben und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, z. B. Subtypen-spezifische ELISA, amino-terminales Sequenzieren und Massenspektometrie (MS).
Matrix-unterstützte Laser Desoprtions/Ionisierungs-Flugzeit-(MALDI TOF)-MS und Elektrosprayionisierung (ESI)-MS sind mittlerweile Standardverfahren, die zur Identifizierung von Peptiden verwendet werden, die in femtomolaren Mengen zur Verfügung stehen. Mann M and Talbo G Curr Opin Biotechnol 7: 11–19 (1996); Mann M and Wilm M Trends Biochem Sci 20: 219–24 (1995); Mann M et al. Anal Chem 61: 1702–8 (1989). Einzelne Banden wurden aus dem Polyacrylamidgel ausgeschnitten, mit Trypsin geschnitten und dann eluiert, um Peptidfragmente zu ergeben, die der MALDI TOF-MS- oder ESI-MS-Analyse unterzogen werden. Die Kombinationen aus Masse/Ladungs-Daten aus der MS, Schnittstellen, Spezifität des Trypsin-Verdaus und der Peptidsequenz-Daten erlaubten die Identifizierung von einzelnen Proteinen und Peptiden. Die MALDI-TOF-MS-Analyse ergibt einen Massen-Fingerabdruck der geschnittenen und analysierten Proteine. Der Fingerabdruck ist nur für das Abgleichen mit einer Datenbank mit berechneten Peptidmassen, die vollständig sequenzierten Proteinen entsprechen, nützlich. Die ESI-MS-Analyse ist schwieriger, aber erlaubt die Identifizierung auf der Grundlage eines Vergleichs mit entweder vollständigen oder Teilsequenz-Ergebnissen. Die Massegenauigkeiten für beide Methoden kann 0,01 Prozent, d. h. 1 Da per 10 kDa übertreffen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Entdeckung, dass Typ I-IFN die Aktivierung und Proliferierung von γδ-T-Zellen induziert. Die γδ-T-Zellen sind Antigenspezifische T-Zellen in einem voraktivierten Zustand, die auf gewöhnliche Phosphat umfassende, nicht-peptidische Antigene ansprechen. Beispiele für γδ-T-Zellen-Antigene umfassen Phosphat umfassende nicht-peptidische Moleküle aus durch Hitze abgetöteten Mycobakterien; Isopentenylpyrophosphat (IPP) und verwandte Prenylpyrophosphatderivate; Monoethylphosphat; und γ-Monoethyl-Derivate von Nukleosid- und Desoxynukleosidtriphosphaten. Tanaka Y et al. Nature 375: 155–8 (1995). Frühere Studien zeigten dass γδ-T-Zellen eine Vielzahl von Lymphokinen sekretieren und zytolytische Reaktionen aufbauen können. Zum Beispiel stimuliert die Exposition der γδ-T-Zellen mit diesem Phosphat umfassenden Nicht-Peptid-Antigenen die IFN-γ-Produktion bei Abwesenheit von APC. Während sie eindeutig zu der T-Zellabstammung gehören, unterscheiden sich γδ-T-Zellen klar von α/β-T-Zellen und sie teilen mehrere Merkmale mit NK-Zellen. Die Beobachtungen, dass γδ-Zellen sich in durch mycobakterielle Infektionen verursachten Verletzung anhäufen, auf viral infizierte Zellen in einer Virus-unspezifischen Weise reagieren, weder Antigen-verarbeitende noch Antigen-präsentierende Zellen benötigen, und dass sie bevorzugterweise in verschiedenen Epithelien lokalisiert sind, legen zusammen nahe, dass γδ-Zellen möglicherweise auf Mustererkennung ansprechen und für eine erste Verteidigungslinie verantwortlich sind.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung wurde entdeckt, dass CpG-ODN in Kombination mit ITP synergistisch die Aktivierung von in PBMC vorhandenen menschlichen γδ-T-Zellen induzierten, wie durch die Produktion von IFN-γ und Perforin gemessen wurde. Zusätzlich wurde auch gemäß diesem Aspekt der Erfindung entdeckt, dass CpG-ODN in Verbindung mit IPP synergistisch die in in den PBMC vorhandenen menschlichen γδ-T-Zellen zur Proliferation anregen. Diese Wirkungen wurden durch die Isolierung von γδ-T-Zellen aus PBMC oder durch die Zugabe von neutralisierenden Antikörpern gegen Typ I-IFN aufgehoben, und sie wurden durch das Hinzufügen von rekombinantem Typ I-IFN reproduziert. Bemerkenswerterweise waren ODN 2216 und 1585, beide starke Induktoren für Typ I-IFN, in ihrer Wirkungen auf γδ-T-Zellen wirksamer als ODN 2006.
Bei Menschen werden Th1-Reaktionen durch IL-12 und/oder IFN-γ angetrieben. IL-12 und IFN-α/β fordern beide die IFN-γ Synthese in T-Zellen und NK-Zellen. Es war zuvor bekannt, dass IL-12 γδ-T-Zellen fördert, IFN-γ zu sekretieren. Da beschrieben worden war, dass IFN-β die IL-12-Produktion herunterreguliert, wurden Experimente durchgeführt, um die Wirkung auf die IL-12-Produktion zu untersuchen, die von ISNA, die Typ I-IFN induzieren, ausgeübt wird. Die Ergebnisse dieser Experimente (Beispiel 13) zeigen, dass bestimmte CpG-ODN die CD40-abhängige IL-12p70-Produktion durch einen IFN-α/β-vermittelten negativen Rückkopplungsmechanismus auf IL-12p40-mRNA-Produktion unterdrücken. Daher führt die Wechselwirkung von T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen über CD40L zu einem Zytokin-Milieu, das von IL-12 oder IFN-α/β beherrscht wird. Obwohl beide Th1-Reaktionen fördern, können CpG-ODN, die bessere Induktoren für die B-Zellen-Aktivierung als für Typ I-IFN sind, bei der Aktivierung naiver T-Zellen überlegen sein, und umgekehrt können CpG-ODN, die starken Induktoren für Typ I-IFN sind, eine höhere Aktivität aufweisen, voraktivierte und Gedächtnis-T-Zellen zu unterstützen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Interferonzusammensetzung zur Verabreichung an ein Lebewesen bereitgestellt. Die Zusammensetzung umfasst rekombinantes oder natürliches Interferon in einem Behälter zur Verabreichung an ein Lebewesen. Die Interferonmenge in dem Behälter ist mindestens ungefähr 10 Prozent geringer als die maximale tolerierte Dosis (MTD). Bevorzugterweise liegt die Interferonmenge in dem Behälter mindestens 20 Prozent unter der MTD, mindestens 30 Prozent unter der MTD, mindestens 40 Prozent unter der MTD, oder sogar mindestens 50 Prozent unter der MTD. In anderen Ausführungsformen liegt die Interferonmenge in dem Behälter mindestens ungefähr 20 Prozent unter, 30 Prozent unter, 40 Prozent unter oder sogar 50 Prozent unter der klinisch etablierten wirksamen Dosis. Der Behälter kann auch eine ISNA umfassen.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt stellt die Erfindung Kits für die Verabreichung von Interferon und einer ISNA an ein Lebewesen bereit. Unter Bezugnahme auf 18, die einen Kit 11 darstellt, umfassen die Kits einen Behälter 19, der eine Zusammensetzung 17 enthält, die IFN-α und Anweisungen 21 für die Verabreichung des Interferons an ein Lebewesen umfasst, das eine solche Behandlung benötigt, in einer Menge, die mindestens etwa 10 Prozent geringer als die maximale tolerierte Dosis (MTD), 20 Prozent geringer als die MTD, 30 Prozent geringer als die MTD, 40 Prozent geringer als die MTD oder 50 Prozent geringer als die MTD ist. Der Kit 11 kann eine ISNA in dem gleichen Behälter oder in einem getrennten Behälter 19 umfassen. Der Kit kann auch Anweisungen 21 für die Behandlung eines Lebewesens mit einer Krankheit, die mit IFN-α behandelt werden kann, umfassen. Beispiele für solche proliferativen und viralen Zustände sind wie oben beschrieben. Kit 11 umfasst auch eine Schachtel-ähnliche Verpackung 15.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die in keinster Weise als weiter begrenzend ausgelegt werden sollten.
BEISPIELE
Beispiel 1. Isolierung und Charakterisierung von IPCs.
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) enthalten eine Gesamtmenge von 0,2 bis 0,4 Prozent IPCs, die durch das Fehlen von Abstammungs-Markern (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) gekennzeichnet sind und die von anderen Abstammungs-negativen Zellen durch die Expression von CD4, CD123 (IL-3Rα) und MHC Klasse II unterschieden werden können.
IPCs wurden aus peripherem Blut unter Verwendung der VARIOMACS-Methode (Milteny Biotec, Auburn, CA) und der früher beschriebenen Methode isoliert. O'Doherty U et al. J Exp Med 178: 1067–76 (1993). PBMCs wurden aus dem Leukozyten/Trombozyten-Film aus gesunden Blutspendern durch Ficoll-Paque-Dichtegradient-Zentrifugation (Histopaque-1077, Sigma) erhalten, wie früher beschrieben. Hartmann G et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 291–9 (1996). Monoklonale Antikörper, die gegen CD3 (UCHT1), CD14 (M5E2), und CD19 (B43) gerichtet sind, wurden von PharMingen (San Diego) gekauft. PBMCs wurden mit anti-CD3-, CD14-, CD16-, CD19- und CD56-Antikörpern, die mit kolloidalen superparamagnetischen Mikrokügelchen konjugiert waren, inkubiert und über eine Abreicherungssäule in einem starken Magnetfeld laufen gelassen. Die daraus resultierenden Abstammungs-negativen (lin–)-Zellen im Durchfluss wurden mit einem mit Mikrokügelchen konjugierten Antikörper gegen CD4 inkubiert und über eine Positivselektionssäule laufen gelassen. Die weitere Reinigung von IPCs bis zu mehr als 99 Prozent aus lin–/CD4+-Zellen wurde durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) unter Verwendung von Phycoerythrin(PE)-markiertem anti-CD123 und FITC-markiertem anti-MHC Klasse II erreicht.
Die Oberflächenantigenfärbung wurde wie früher beschrieben ausgeführt. Hartmann G et al. J Pharmacol Exp Ther 285: 920–8 (1998). Monoklonale Antikörper gegen MHC Klasse II (HLA-DR, Immun-357) und CD80 (MAB104) wurden von Immunotech (Marseilles, Frankreich) gekauft. Alle anderen Antikörper wurden von PharMingen (San Diego) gekauft: mAbs gegen CD3 (UCHT1), CD14 (M5E2), CD19 (B43), und CD86 (2331 (FUN-1)). FITC-markiertes IgG1,κ (MOPC-21) und Phycoerythrin-markiertes IgG2b,κ wurden als Kontrolle für die spezifische Färbung verwendet. Lyons AB and Parish CR J Immuno Methods 171: 131–7 (1994).
Flusszytometrie-Daten wurden auf einem FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA), aufgenommen. Die spektrale Überlappung wurde durch geeignete Kompensation korrigiert. Die Analyse wurde mit lebendigen Zellen innerhalb eines morphologischen Gates (Streuung nach vorne (FFC), Seitenstreuung (SSC), > 94 Prozent der Zellen MHC Klasse II-positiv und Abstammungs-Marker negativ) ausgeführt. Die Daten wurden mit dem Computerprogramm FLOWJO (Version 2.5.1, Tree Star, Standford, CA) analysiert.
Ergebnisse. Die durch Trypan Blau-Ausschluss bestimmte Lebensfähigkeit betrug > 95 Prozent. Frisch isolierte IPCs sind negativ bezüglich der co-stimulierenden Moleküle CD80 und CD86. 1 zeigt die FACS-Analysen von mit magnetischen Kügelchen und Flusszytometrie aus PBMCs isolierten IPCs. Von links nach rechts werden gezeigt: Selektion von lin–/MHC Klasse II+-Zellen aus PBMCs; weitere Selektion von CD123+/MHC Klasse II+-Zellen aus lin–/MHC Klasse II+-Zellen; und Charakterisierung von frisch isolierten lin–/MHC Klasse II+/CD123+ IPCs als CD80-.
Beispiel 2. CpG-Oligonukleotid untersützt das Überleben und die Aktivierung von IPCs in vitro.
Die Mehrheit von frisch isolierten IPCs sterben innerhalb von 3 Tagen, wenn sie nicht in Anwesenheit von IL-3 oder GM-CSF inkubiert werden. Die verbleibenden lebenden Zellen sind nicht aktiviert oder nur schwach aktiviert. Wenn CpG-Oligonukleotide, aber keine anderen Wachstumsfaktoren zur Zellkultur von IPCs hinzugefügt werden, überleben die IPCs und werden stark aktiviert, wie durch ihre erhöhte Expression co-stimulierender Moleküle gezeigt ist (z. B. CD80, 2).
Frisch isolierte IPCs (siehe Beispiel 1) wurden in RPMI 1640 Kulturmedium suspendiert, das mit 10 Prozent (Vol./Vol.) Hitze-inaktiviertem (56°C, 1 Std.) FCS (HyClone), 1,5 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (alle von GIBCO/BRL) supplementiert war (Vollmedium). Alle Verbindungen wurden Endotoxin-getestet gekauft. Frisch präparierte IPCs (Endkonzentration 5 × 10⁵ Zellen pro ml) wurden zwei Tage lang in Vollmedium alleine oder in mit 6 μg/ml Phosphothioat CpG-ODN 2006 (5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'; SEQ ID NO: 147), 100 ng/ml LPS (aus Salmonella typhimurium, Sigma Katalog Nr. L2262), 800 Einheiten/ml GM-CSF (1,25 × 10⁴ Einheiten/mg, Genzyme) oder CpG-Oligonukleotid in Kombination mit GM-CSF ergänztem Vollmeidum inkubiert. Die Expression von CD80 und MHC Klasse II auf IPCs wurde durch Flusszytometrie (siehe Beispiel 1) untersucht.
Ergebnisse. Repräsentative Ergebnisse von fünf unabhängigen Experimenten sind in 2 dargestellt. Eine Einzelzugabe von CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147, 2 μg/ml) zu frisch präparierten IPCs war gegenüber GM-CSF (800 Einheiten/ml) darin überlegen, das Überleben der Zellen (74,3 Prozent ± 5,2 Prozent gegen 57,1 Prozent ± 2,3 Prozent) zu fördern. Die Kombination aus GM-CSF und CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) erhöhte die Anzahl der lebensfähigen Zellen weiter (81,0 Prozent ± 6,7 Prozent). Frisch isolierte IPCs, die zwei Tage lang ohne IL-3 oder GM-CSF in Kultur gehalten wurden, blieben unaktiviert, wie durch das Fehlen von Färbung auf CD80 angezeigt, selbst wenn LPS den Medien hinzugegeben wurde. Die Zugabe von GM-CSF induzierte CD80. Die Zugabe von CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147, 6 μg/ml) aktivierte IPCs in einem noch größeren Ausmaß als GM-CSF (800 Einheiten/ml). Eine weitere Aktivierung von IPCs trat auf, wenn GM-CSF und CpG-Oligonukleotid zusammen anwesend waren. Dies zeigt, dass CpG IL-3 und GM-CSF bei der Unterstützung des Überlebens von IPCs ersetzt. LPS trugen weder zum Überleben noch zur Aktivierung von IPCs bei (2).
Beispiel 3. CpG-Oligonukleotide, aber nicht Poly IC aktivierten IPCs in vitro.
IL-3 sorgt für das hervorragende Überleben von IPCs, aktiviert aber IPCs nicht. Wenn IL-3 mit CpG-Oligonukleotid kombiniert wurde, erhöhte sich die Expression von CD80 5 bis 20-fach (3). Poly IC, ein weiteres Polynukleotid mit wohlbekannten immunstimulierenden Wirkungen auf myeloide Zellen (dendritische Zellen, Makrophagen) stimulierte IPCs nicht.
Frisch präparierte IPCs (siehe Beispiel 1, Endkonzentration 3 × 10⁵ Zellen pro ml) wurden drei Tage lang in Vollmedium (siehe Beispiel 2), das mit 10 ng/ml in IL-3 supplementiert war, inkubiert. IPC-Kulturen wurden dann für weitere 24 Stunden weitergeführt (a) ohne zusätzliche Supplementierungen, (b) nach Zugabe von 6 μg/ml CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) und (c) nach Zugabe von 10 μg/ml Poly IC. Die Streuung nach vorne (FSC), die Seitenstreuung (SSC) und die Expression von CD80 und MHC Klasse II auf IPCs wurden durch Flusszytometrie (siehe Beispiel 1) untersucht.
Ergebnisse: Repräsentative Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten sind in 3 gezeigt. In Vollmedium, das mit IL-3 und CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147,6 μg/ml) supplementiert war, kultivierte IPCs waren größer und granulärer als IPCs, die in Vollmedium kultiviert wurden, das IL-3 alleine enthielt, oder in Vollmedium supplementiert mit IL-3 und Poly IC. Zusätzlich waren IPCs in mit IL-3 und CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147,6 μg/ml) supplementiertem Vollmedium stärker aktiviert als IPCs, die in Vollmedium, das IL-3 alleine enthielt, oder in mit IL-3 und Poly IC supplementiertem Vollmedium kultiviert wurden. Dies zeigt, dass CpG-Oligonukleotide IPCs in vitro aktivieren.
Beispiel 4. CpG-Oligonukleotid induziert die IFN-α-Produktion durch IPCs.
Die Induktion von Typ I-Interferon durch CpG in Ganz-PBMC ist früher gezeigt worden. Sun S et al. J Exp Med 188: 2335-42 (1998). Hier wird zum ersten Mal unter Verwendung eines ELISAs, der für 9 von 10 Subspezies von getestetem IFN-α spezifisch ist, gezeigt, dass IFN-α in IPCs durch ein CpG-Oligonukleotid innerhalb von 48 Stunden induziert wird.
Frisch präparierte IPCs (siehe Beispiel 1, Endkonzentration 3 × 10⁵ Zellen pro ml) wurden zwei Tage lang in Vollmedium (siehe Beispiel 2) inkubiert, das mit 10 ng/ml IL-3 und 800 Einheiten/ml GM-CSF (1,25 × 10⁴ Einheiten/mg, Genzyme) supplementiert war. Die Hälfte der Kulturen wurde mit 6 μg/ml CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) supplementiert. IFN-α wurde im Überstand unter Verwendung einer Kombination von getrennten ELISAs, die für IFN-α (Multispezies-ELISA für menschliches IFN-α, PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ) und für IFN-β (PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ) spezifisch waren, gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Der Multispezies-IFN-α-ELISA weist einen Bereich von 100 bis 5.000 pg/ml auf, weist alle menschlichen IFN-α-Subtypen außer IFN-αF nach und weist kein IFN-β oder IFN-γ nach. Der IFN-β-ELISA hat einen Bereich von 250 bis 10.000 pg/ml.
Ergebnisse. Repräsentative Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten erscheinen in 4. IPCs, die für 48 Stunden in mit 10 ng/ml IL-3, 800 Einheiten/ml GM-CSF und 6 μg/ml CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) supplementiertem Vollmedium kultiviert wurden, wurden im Vergleich zu ähnlichen Kulturen ohne hinzugegebenes CpG-Oligonukleotid stark induziert, IFN-α zu sekretieren. Dieses Ergebnis zeigt, das CpG-Oligonukleotid menschliche IPCs induziert, mehrere IFN-α–Subspezies zu sekretieren. Dieses Ergebnis zeigt auch, dass CpG-Oligonukleotid die in vitro-Produktion von natürlichen Interferonen unter Verwendung einer Dauer-Zelllinie, die aus IPCs abgeleitet ist, erlauben würde.
Beispiel 5. Identifizierung von CpG-ODN mit IFN-α– und IFN-β-induzierender Aktivität.
Das 24mer CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147), das drei aufeinanderfolgende „menschliche” CpG-Motive (5'GTCGTT 3') enthält, ist eine der wirksamsten CpG-Sequenzen bei der Aktivierung von menschlichen B-Zellen. Hartmann G et al. J Immunol 164: 944–53 (2000); Hartmann G et al. J Immunol 164: 1617–24 (2000). Im Gegensatz zu anderen mikrobiellen Stimuli wie LPS und Poly (I:C) fördert ODN 2006 das Überleben und die Aktivierung von pDC-Vorläufern stark. Jedoch ist die Fähigkeit von ODN 2006, Typ I-IFN in pDC-zu induzieren, im Vergleich zu seiner starken Fähigkeit, NK-Zellen zu aktivieren relativ schwach.

Um die Hypothese zu testen, dass andere CpG-ODN NK-Zellen durch Induktion von Typ I-IFN in pDC aktivieren können, wurde ein Satz von CpG-ODN mit bekannter NK-Zellen-Aktivität auf ihre Fähigkeit getestet, die IFN-α-Produktion in PBMC zu stimulieren. Der Satz von CpG-ODN umfasste die folgenden, wobei Kleinbuchstaben Phosphothioat-Bindungen kennzeichnen, Großbuchstaben Phosphodiester-Bindungen kennzeichnen und m 7-Deaza-Guanosin kennzeichnet:

tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt	ODN 2006	(SEQ ID NO: 147)
ggGGTCAACGTTGAgggggG	ODN 1585	(SEQ ID NO: 1)
gmGGTCAACGTTGAgggmggG	ODN 2197	(SEQ ID NO: 148)
ggGGAGTTCGTTGAgggggG	ODN 2198	(SEQ ID NO: 149)

Alle ODN wurden in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) bei einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst. In PBS verdünnte Aliquoten (0,4 mg/ml) wurden bei – 20°C gelagert und vor der Verwendung aufgetaut. Für alle Verdünnungen wurden pyrogenfreie Reagenzien verwendet. ODN wurden unter Verwendung des LAL-Tests (Bio Whittaker, Walkersville, MD; untere Nachweisgrenze 0,1 EU/ml) auf Endotoxin getestet.
Frisch isolierte PBMC wurden mit CpG-ODN (3 μg/ml) 48 Stunden lang inkubiert. IFN-α wurde im Überstand mit einem ELISA gemessen, der 10 von 13 Isoformen von IFN-α nachweist. Unter allen anfänglich untersuchten Sequenzen zeigte CpG-ODN 1585 (SEQ ID NO: 1) die höchste Aktivität, IFN-α in PBMC zu induzieren. ODN 1585 ist eine chimäre ODN (gemischtes Phosphothioat-Phosphodiester-Rückgrat) mit Poly G an beiden Enden und einem zentralen CpG-Dinukleotid innerhalb von eines 10mer Palindroms. Harmann G et al. J Pharmacol Exp Ther 285: 920 (1998). ODN 1585 stimulierte im Vergleich zu ODN 2006, das keine wesentlichen Mengen von IFN-α in PBMC induzierte (0,021 ± 0,015 ng/ml; n = 8), IFN-α im Nanogrammbereich (1,3 ± 0,4 ng/ml; n = 7) (5). Das Kontroll-ODN 2197 (7-Deaza-Guanosin-Substitution an Poly G-Enden, unfähig, G-Tetraden zu bilden) und ODN 2198 (CG und Poly G-Enden aber kein Palindrom) waren im wesentlichen inaktiv (5). Auf der Grundlage der Sequenz von ODN 1585 wurde ein neuer Satz von CpG-ODN entworfen. ODN 2216 (ggGGGACGATCGTCgggggG; SEQ ID NO: 7), das Poly G-Enden und drei CG-Dinukleotide innerhalb eines Palindroms enthält, ist ein Beispiel unter mehreren Sequenzen mit ausgeprägter IFN-α-induzierender Aktivität in PBMC (23,7 ± 5,2 ng/ml; n = 7).
CpG-ODN stimulierte die IFN-α-Produktion in einer konzentrationsabhängigen Weise ( 6). Die Aktivitäten von ODN 2216 und ODN 1585 wurden bei Konzentrationen von bis zu 12 μg/ml getestet, was bestätigt, dass die höhere Wirksamkeit von ODN 2216 keine konzentrationsabhängige Wirkung war. So geringen Mengen wie 0,4 μg/ml ODN 2216 induzierten erhebliche Mengen von IFN-α (0,7 mg/ml) in PBMC, wohingegen ODN 2006 und die GC-Kontrolle zu ODN 2216 (ggGGGAGCATGCTCgggggG; ODN 2243; SEQ ID NO: 150) selbst bei höheren Konzentrationen keine Wirkung hatten. Die maximale Aktivität wurde bei 3 μg/ml erreicht. Die Produktion von IFN-α konnte schon nach sechsstündiger Inkubation (0,2 ng/ml) nachgewiesen werden und erreichte nach 48 Stunden ein Plateau.
Die natürliches Interferon produzierende Zelle in PBMC nach Virusinfektion ist mit einer Häufigkeit von weniger als 0,5% identisch mit dem pDC-Vorläufer. PBMC wurden auf PDC-Vorläufer hin durch Verminderung von T-Zellen, NK-Zellen und Monozyten (2–18% CD123⁺⁺ pDC; 3–10% CD11c⁺ myeloide DC (mDC); 50–90% B-Zellen; n = 4) 10- bis 70-fach angereichert. Um die Lebensfähigkeit der pDC zu erhöhen, wurde IL-3 zu allen Proben gegeben. Diese Vorgehensweise führte zu einer 30- bis 60-fachen Erhöhung der IFN-α-Produktion (bis 428,3 ± 56,8 ng/ml mit ODN 2216; n = 4; 7, obere Reihe, linke Seite).
Die aktivsten CpG-ODN bei PBMC waren auch die in den mit pDC angereicherten Proben am aktivsten. ODN 2006, ODN 2197 oder IL-3 alleine induzierten nur wenig IFN-α (Mittelwert 0,8, 0,4 bzw. 0,6 ng/ml, n = 4). Poly (I:C) (7 μg/ml), das doppel-strängige RNA nachahmt und von dem bekannt ist, dass es IFN-α in Makrophagen induziert, war ein noch schwächerer Stimulus für IFN-α in auf pDC angereicherten Zellen (0,3 ng/ml, nicht in der Figur). Das gleiche CpG-ODN, das große Mengen an IFN-α induzierte, stimulierte auch die IFN-β-Produktion (bis zu 2,8 ± 0,8 ng/ml, n = 4; 7, untere Reihe, linke Seite). Wenn man berücksichtigt, dass IFN-β eine einzelne Isoform darstellt und dass IFN-α aus mindestens 13 Isoformen besteht, werden beachtliche IFN-β–Mengen produziert.
Um zu bestimmen, ob die zelluläre Aufnahme von CpG-ODN für die Induktion von IFN-α und IFN-β durch CpG-ODN entscheidend war, wurden die Wirkungen des kationischen Lipids Lipofectin untersucht (7, obere und untere Reihe, rechte Seite). Positiv geladene kationische Lipide bilden Komplexe mit negativ geladenen ODN, was die zelluläre Aufnahme von ODN erhöht. Lipofectin erhöht die Produktion von IFN-α und IFN-β, die durch CpG induziert wird (bis zu 786 ng/ml IFN-α, n = 3; und bis zu 9 ng/ml IFN-β, n = 3). Diese Erhöhung wurde bei allen untersuchten CpG-ODN festgestellt, war aber bei ODN 1585 am ausgeprägtesten (21-fach).
Beispiel 6. CpG-ODN-induziertes IFN-α wird ausschließlich durch plasmozytoide dentritische Vorläuferzellen produziert.
Um zu untersuchen, welcher Zelltyp innerhalb der PBMC IFN-α als Reaktion auf CpG-ODN produziert, wurde ein Protokoll entwickelt, das den Nachweis von intrazellulärem IFN-α auf der Grundlage einer einzelnen Zelle mittels Flusszytometrie erlaubt. PBMC wurden mit ODN 2216 (SEQ ID NO.: 7) oder ODN 2006 (SEQ ID NO.: 147) bei einer Konzentration von 3 μg/ml kultiviert. Nach 5 Stunden wurden die Zellen geerntet und eine intrazelluläre Färbung auf IFN-α durchgeführt.
Zur Analyse von intrazellulärem IFN-α wurde während der Inkubationsdauer kein Brefeldin A hinzugefügt, um die Proteinsekretion zu blockieren. PBMC wurden geerntet (ungefähr 600.000 Zellen pro Röhrchen), mit anti-CD123-Biotin (Pharmingen) inkubiert, in PBS gewaschen (400 g, 5 Minuten, 4°C) und mit Streptavidin-APC (Pharmingen), mit FITC-konjugiertem anti-Abstammungs-Cocktail (bestehend aus anti-CD3, -CD14, -CD16, -CD19, -CD20 und -CD56; Becton Dickinson) und anti-HLA DR-PerCP (Becton Dickinson) gefärbt. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen, in 100 μl Fixierungspuffer A (Fix and Perm Kit, Caltag Laboratories, Burlingame, CA) resuspensiert und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden noch einmal in 2 ml PBS gewaschen und dann in 100 μl Permeabilisierungspuffer B (Fix and Perm Kit) resuspensiert. 4 μg/ml Maus-antihuman-IFN-α-mAK (MMHA-11, PBL Biomedical Laboratories) wurden hinzugefügt. PE-markiertes Maus-IgG1 (MOPC-21, Pharmingen) wurde als Kontrollantikörper verwendet. Nach 15-minütiger Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur wurden die Zellen in 2 ml PBS gewaschen. Zum Nachweis von intrazellulärem IFN-α wurden die Zellen wiederum in 100 μl Permeabilisierungspuffer B (Fix and Perm Kit) resuspensiert und mit Ratten-anti-Maus-Ig-κ leichte Kette (R8-140, Pharmingen) als sekundärem Antikörper gefärbt. Nach dem Waschen in PBS wurden die Zellen durch Vierfarben-Flusszytometrie mit einem mit zwei Lasern (Anregung bei 488 nm und 635 nm) ausgestatteten Becton Dickinson FACS Calibur analysiert. Die spektrale Überlappung wurde durch geeignete Kompensation korrigiert und die Gates wurden unter Verwendung von Isotyp-Kontroll-Antikörpern eingestellt. Die Analyse wurde an lebenden Zellen innerhalb eines morphologischen Gates (FSC, SSC, > 97 % lebende Zellen, wie durch Propidiumiodid-Färbung bestätigt) durchgeführt. Die Daten wurden unter Verwendung von CELLQUEST (Becton Dickinson) oder FLOWJO Software (Version 2.5.1, Tree Star, Inc., Stanford, CA) analysiert.
Ergebnisse. Wie in 8A gezeigt, wurden Abstammungs⁺- und Abstammungs^–-(lin⁺ und lin^–) Zellen durch die Abstammungs-Markerexpression und Vorwärts-Streuungsmerkmale definiert. Nach Stimulierung mit ODN 2216 war intrazelluläres IFN-α in lin⁺-Zellen nicht nachweisbar, die die Monozyten und Makrophagen als potentielle IFN-α-produzierende Zellen enthalten (8C). Innerhalb der lin^–-Zellen, die hauptsächlich pDC und mDC enthalten, wies eine distinkte Population mit mittlerer HLA DR (MHC-Klasse II)-Expression eine für IFN-α positive Färbung auf (8D).
Innerhalb der lin^–-Population können mDC und pDC durch ihren HLA DR/CD123-Phänotyp unterschieden werden (8B). Die mDC sind CD123^+/+ und HLA DR⁺⁺ (Gate II); pDC sind CD123⁺⁺ und HLA DR⁺ (Gate III). Die CD123⁺⁺/HLA DR^–-Population sind Basophile. 9A zeigt die intrazelluläre Färbung auf IFN-α in lin^–/HLA DR⁺-Zellen. IFN-α wurde ausschließlich durch pDC als Reaktion auf ODN 2216 produziert, aber nicht als Reaktion auf ODN 2006. Unter den pDC färbten 46% positiv für IFN-α, was einer Häufigkeit von 0,25% der Zellen innerhalb der PBMC, die zu diesem speziellen Zeitpunkt der Färbung IFN-α produzieren, entspricht. In drei anderen Experimenten betrugen die Häufigkeiten von IFN-α-produzierenden Zellen als Reaktion auf ODN 2216 0,08%, 0,05% und 0,22% der PBMC (16%, 8% und 63% der pDC).
Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit pDC wurde in pDC nach Stimulierung mit ODN 2006 oder ODN 2216 keine IFN-α-Synthese nachgewiesen.
Demnach waren pDC die einzigen Zellen in den PBMC, die IFN-α als Reaktion auf CpG-ODN produzierten. Von Interesse ist, dass das intrazelluläre IFN-α-Färben ohne Brefeldin A durchgeführt wurde. Daher stellt die nachgewiesene Menge von IFN-α die tatsächliche IFN-α-Produktion zum Zeitpunkt der Ernte und nicht die über mehrere Stunden angesammelte IFN-α-Menge dar. Wenn Brefeldin A während der Inkubation hinzugefügt wurde, um die Proteinsekretion zu blockieren (Standardprotokoll für die Färbung von intrazellulärem Zytokin), wurden keine IFN-α-produzierenden Zellen nachgewiesen.
Beispiel 7. Sowohl IFN-α-induzierende als auch nicht-IFN-α-induzierende CpG-ODN stimulieren die frühe TFN-Produktion in plasmazellenartigen dendritischen Zellen.
Es wurde berichtet, dass pDC TNF-α als Reaktion auf IL-3 produzieren und demnach ihre eigene Reifung in einer autokrinen Art und Weise fördern. Hartmann G et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 291–9 (1996). Daher wurde die intrazelluläre Ansammlung von TFN-α in pDC als Reaktion auf verschiedene CpG-ODN untersucht (9B). PBMC wurden 5 Stunden lang mit ODN 2216 (SEQ ID NO.: 7) oder ODN 2006 (SEQ ID NO.: 147) bei 3 μg/ml in Abwesenheit von IL-3 inkubiert. Brefeldin A (1 μg/ml, Sigma) wurde während der fünfstündigen Stimulierungsperiode hinzugefügt, um die Zytokin-Sekretion zu blockieren. PBMC wurden geerntet (ungefähr 600.000 Zellen pro Röhrchen), mit anti-CD123-Biotin inkubiert, mit PBS gewaschen (400 g, 5 Minuten, 4°C) und mit Streptavidin-APC (Pharmingen), mit FITC-konjugiertem anti-Abstammungs-Cocktail und anti-HLA DR-PerCP (Becton Dickinson) gefärbt. Anschließend wurden die Zellen in PBS gewaschen, in 100 μl Fixierungspuffer A (Fix and Perm Kit, Caltag Laboratories, Burlingame, CA) resuspensiert und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden wieder in 2 ml PBS gewaschen und dann in 100 μl Permeabilisierungspuffer B (Fix and Perm Kit) resuspensiert. 5 μg/ml PE-markiertes Maus-anti-human TNF-α mAK (MAb11, Pharmingen) wurde als primärer Antikörper hinzugefügt. PE-markiertes Maus-IgG1 (MOPC-21, Pharmingen) wurde als Kontrollantikörper verwendet. Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln wurden die Zellen in 2 ml PBS gewaschen und dann durch Vierfarben-Flusszytometrie wie oben beschrieben analysiert.
Ergebnisse. Im Gegensatz zu IFN-α war der Prozentsatz an TNF-α-produzierenden pDC als Reaktion auf ODN 2006 und ODN 2216 ähnlich (59% gegenüber 56%). Zwei andere Experimente zeigten vergleichbare Ergebnisse (26 gegenüber 22% und 8 gegenüber 6% TNF-α⁺ pDC mit ODN 2006 bzw. ODN 2216). Die Produktion von TNF-α pro Zelle (MFI, mittlere Fluoreszenzintensität) war mit ODN 2216 konsistent höher als mit ODN 2006 (9B). Kein TNF-α wurde in mDC nachgewiesen. Abstammungs⁺-Zellen produzierten keine erheblichen Mengen von TNF-α als Reaktion entweder auf ODN 2006 oder ODN 2216.
Beispiel 8. Hochregulierung co-stimulierender Moleküle auf pDC als Reaktion auf IFN-α-induzierende CpG-ODN.
In früheren Studien wurde berichtet, dass ODN 2006 die Expression von co-stimulierenden Molekülen auf CD4⁺-DC des peripheren Blutes stimuliert. Zhong RK et al. J Immunol 163: 1354 (1999). Um die Fähigkeit von verschiedenen CpG-ODN zu untersuchen, CD80 und CD86 auf pDC hochzuregulieren, wurde der Gehalt der PBMC an Monozyten, T-Zellen und NK-Zellen vermindert, und die verbleibenden Zellen mit verschiedenen CpG-ODN bei Anwesenheit von IL-3 stimuliert. Nach 48 Stunden wurde die Expression von CD80 und CD86 auf pDC (CD123⁺⁺/HLA DR⁺) durch Dreifarben-Flusszytometrie untersucht. B-Zellen (CD123^–/HLA DR⁺) und mDC (CD123^+/–/HLA DR⁺⁺) wurden aus der Analyse ausgeschlossen. Wie in 10 gezeigt, wurde die Expression von CD86 auf pDC durch ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) ebenso wie durch ODN 1585 (SEQ ID NO: 1) und ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) erhöht. Die Wirkung von ODN 1585 wurde durch die Substitution des Poly G-Schwanzes mit 7-Deaza-Guanosin (ODN 2197; SEQ ID NO: 148) aufgehoben. Das nicht-palindromische CpG-ODN 2198 (SEQ ID NO: 149) war inaktiv. Die Hochregulierung von CD80 und HLA DR war der von CD86 ähnlich. Eine erhöhte Expression von CD80 und CD86 als Reaktion auf das schwach IFN-α-induzierende ODN 2006 war nach sechs Stunden nachweisbar. Im Gegensatz dazu zeigten ODN 1585 und ODN 2216 eine verzögerte Antwort, die später als nach 12 Stunden begann. Bei beiden stark IFN-α-induzierenden CpG-ODN (ODN 1585, ODN 2216) und dem schwach IFN-α-induzierende CpG-ODN (ODN 2006) wurde nach 48 Stunden ein Plateau erreicht. Zu späteren Zeitpunkten wurde die Identifizierung der pDC unter den PBMC durch Flusszytometrie durch die Herunterregulierung von CD123 während der Zellkultur erschwert.
Beispiel 9. Stimulierung der IFN-α- und IFN-β-Produktion durch CpG-ODN ist eine direkte Wirkung auf plasmazellenartige dendritische Zellen und wird teilweise durch magnetische anti-CD4-Kügelchen blockiert.
Um zu untersuchen, ob CpG-ODN die IFN-α-Produktion direkt induzieren, wurden gereinigte pDC und nicht pDC-angereicherte PBMC untersucht. PBMC wurden bezüglich Monozyten, T-Zellen, NK-Zellen und B-Zellen abgereichert. Aus der verbleibenden Zellpopulation wurden CD123⁺⁺ und HLA DR⁺-pDC durch FACS aussortiert, um gereinigte (97%) pDC zu ergeben (11A). Gereinigte pDC (160.000 Zellen/ml) wurden mit oder ohne ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) bei Anwesenheit von IL-3 inkubiert. Nach 48 Stunden wurden IFN-α und IFN-β im Überstand durch ELISA gemessen. Wie in 11B gezeigt, stimulierte ODN 2216 die Produktion hoher IFN-α-Titer (146 ng/ml; 1 pg pro einzelner pDC) und IFN-β-Titer (1 ng/ml) im Vergleich zu IL-3 alleine (< 10 pg/ml).
In den PBMC genauso wie in pDC-angereicherten PBMC wurden 4,2 ± 0,8 pg IFN-α (0,8 bis 1,4 U; n = 4) pro einzelner pDC produziert. Die IFN-α-Produktion der pDC war viel geringer, wenn pDC unter Verwendung magnetisch markiertem anti-CD4 mAK angereichert wurden. Dies war nicht auf einen Verlust an IFN-α-produzierenden Zellen in der CD4^–-Fraktion zurückzuführen, da die CD4^–-Fraktion kein IFN-α produzierte. Die Zugabe der CD4^–-Fraktion zurück zu CD4⁺-DC stellte die IFN-α-Reaktion nicht wieder her und schloss dadurch eine Sekundärwirkung des CpG-ODN durch zusätzliche Zellen in der CD4^–-Fraktion aus. Demnach schien das Quervernetzen von CD4 an der Oberfläche der pDC für die reduzierte Aktivität verantwortlich zu sein.
Beispiel 10. IFN-α-induzierende CpG-ODN stellen im Vergleich zu nicht-IFN-α-induzierenden CpG-ODN eine überlegene indirekte Aktivierung von NK-Zellen bereit.
Um zu untersuchen, ob CpG-ODN, die große Mengen an IFN-α induzieren, auch eine höhere Aktivierung der NK-Zellen zeigen, wurden PBMC mit verschiedenen CpG-ODN inkubiert. Die NK-Zellen-Aktivierung wurde als CD69-Expression (FACS) und durch die in vitro NK-Zellen-lytische Aktivität gemessen. Zur Bestimmung der NK-Zellen-lytischen Aktivität wurden PBMC mit verschiedenen ODN bei verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Nach 18 Stunden wurden die Zellen geerntet und als Effektorzellen in einem standardmäßigen vierstündigen ⁵¹Cr-Freisetzungstest gegen K562-Zielzellen wie früher beschrieben verwendet. Hartmann G et al. Gene Therapy 6: 893 (1999). Positivkontrollen umfassten rekombinantes IL-2 (100 IU/ml) und Negativkontrollen umfassten das Medium alleine. Ergebnisse werden ausgedrückt in % spezifischer Lyse: spezifische Lyse (%) = ((experimentelle Zähler – spontane Freisetzungszähler)/(maximale Freisetzungszähler – spontane Freisetzungszähler)) × 100%.
Ergebnisse. Die IFN-α-induzierenden ODN 2216 und ODN 1585 erhöhten den Prozentsatz an CD69-positiven (früher Marker der Aktivierung) NK-Zellen innerhalb von 24 Stunden (38 ± 12% mit ODN 2216; n = 5) im Vergleich zur Kontrolle ohne Stimulus (8 ± 2%; n = 5). ODN 2006 zeigte eine geringere Reaktion (19% ± 6%). In Übereinstimmung mit der erhöhten CD69-Expression war die NK-Zellen-vermittelte Lyse von K562-Zellen ausgeprägt erhöht, wenn PBMC mit CpG-ODN inkubiert wurden. Selbst bei der geringen Konzentration von 0,6 μg/ml war ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) immer noch so wirksam wie IL-2 (100 IU/ml) bei der Stimulierung der NK-Zellen-lytischen Aktivität (12). ODN 1585 (SEQ ID NO: 1) und ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) waren weniger wirksam. Selbst bei höheren Konzentrationen (6 μg/ml) war die GC-Kontrolle von ODN 1585 (5' ggGGTCAAGCTTGAgggggG 3'; ODN 2118; SEQ ID NO: 151) völlig inaktiv im Vergleich zu Medium alleine (12). Wenn gereinigte NK-Zellen mit CpG-ODN inkubiert wurden, war die CD69-Expression und Lyse der K562-Zellen nicht erhöht, was eine indirekte Wirkung von CpG-ODN auf NK-Zellen zeigt.
Beispiel 11. CpG-Oligonukleotid induziert die Produktion großer IL-8-Mengen durch IPCs.
IL-8 ist ein Chemokin, das andere Immunzellen anlockt. In IL-3 gewachsene IPCs produzieren kein IL-8, wohingegen CpG-Oligonukleotid die Produktion von großen IL-8-Mengen (im Mittel 23 ng/ml, 13) durch IPCs stimuliert.
Frisch präparierte IPCs (siehe Beispiel 1, Endkonzentration 2 × 10⁵ – 5 × 10⁵ Zellen pro ml) wurden zwei Tage lang in Vollmedium, das mit 10 ng/ml IL-3 supplementiert war, inkubiert. Eine Reihe von parallelen Kulturen wurde mit 10 μg/ml Poly IC supplementiert, und eine andere Reihe von parallelen Kulturen wurde mit 6 μg/ml CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147) supplementiert. Die Überstände wurden unter Verwendung eines für humanes IL-8 spezifischen ELISA gemäß der Anweisungen des Lieferanten analysiert.
Ergebnisse. Repräsentative Daten von drei verschiedenen Spender sind in 13 gezeigt. Die IL-8-Sekretion durch IPCs wurde durch die Zugabe von CpG-Oligonukleotiden zu IL-3 enthaltendem Vollmedium stark induziert. Dagegen hatte die Zugabe von Poly IC zum Medium keine Wirkung. Dieses Ergebnis zeigt, dass CpG-Oligonukleotide IPCs induzieren, große Mengen an IL-8 zu produzieren.
Beispiel 12. Typ I-IFN induziert die Aktivierung und Proliferation von γδ-T-Zellen.
Die γδ-T-Zellen (Vγ9/Vδ2) sind Antigen-spezifische T-Zellen in einer voraktivierten Phase, die auf übliche Nicht-Peptid-Phosphorantigene reagieren. Die Exponierung von γδ-T-Zellen gegen diese Antigene stimuliert bei Abwesenheit von APC die IFN-γ-Produktion. Um die γδ-T-Zellen-Aktivierung zu untersuchen, wurden PBMC (2 × 10⁶/ml) von gesunden Spender drei Tage lang mit 6 μg/ml CpG-ODN (2006, 1585 oder 2216) oder Medium alleine bei Anwesenheit oder Abwesenheit von 15 μM Isopentenyl/Pyrophosphat (IPP, spezifisches Phosphorantigen für Vγ9/Vδ2-Zellen) stimuliert. Brefeldin A wurde für die letzten vier Stunden hinzugegeben. Nach der Oberflächenfärbung gegen Vγ9-TCR und CD3 wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert und mit mAK gegen IFN-γ gefärbt. Bei der Dreifarben-Flusszytometrie wurden γδ-T-Zellen unter Verwendung ihres FSC/SSC-Profils, ihrer CD3- und TCR Vγ9-Expression gegatet und bezüglich der IFN-γ-Expression analysiert. Um die Ergebnisse von verschiedenen Spender zu vergleichen, wurden die Daten zunächst als X-fache Erhöhung im Vergleich zum Medium oder IPP-Kontrollen berechnet und dann mit dem Mittelwert des Mediums bzw. von IPP multipliziert. Für jedes CpG-ODN wurden zwischen 14 und 20 Spender analysiert. Die Daten sind als Mittelwerte + SEM gezeigt; *(p < 0,01) und **(p < 0,001) zeigen p-Werte an, die mit Hilfe des Student-t-Tests für gepaarte Proben berechnet worden, wobei Mediumkontrolle mit CpG-ODN und IPP alleine mit IPP + CpG-ODN verglichen wurden.
Um die γδ-T-Zellen-Proliferation zu untersuchen, wurden PBMC von gesunden Spender mit IPP (30 μM) bei Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen CpG-ODN (2006, 1585 oder 2216, jeweils 6 μg/ml) stimuliert. Die Expansion von γδ-TCR-positiven Zellen wurde durch Flusszytometrie mit einem anti-Vγ9-Antikörper untersucht und wird als Prozent TCR-Vγ9-positive Zellen innerhalb der lebensfähigen PBMC gezeigt. Zwischen 9 und 16 Spender wurden für jedes ODN analysiert. Die Daten sind als X-fache Erhöhung im Vergleich zu IPP allein (Mittelwert + SEM) gezeigt; *zeigt p < 0,05 (IPP gegen IPP + CpG-ODN) an.
Ergebnisse. Innerhalb der PBMCs reagierten sowohl γδ-T-Zellen als auch NK-Zellen, nicht aber αβ-T-Zellen auf CpG-ODN mit erhöhter CD69-Expression, IFN-γ- und TNF-α-Produktion, erhöhtem Perforingehalt und lytischer Aktivität. CpG-ODN induzierten die Produktion von IFN-γ (14) und Perforin in γδ-T-Zellen synergistisch in Kombination mit IPP. Die synergistische Wirkung war stärker ausgeprägt bei ODN 2216 und 1585 als bei ODN 2006, d. h. ODN, die starke Induktoren für Typ I-IFN sind. In gereinigten γδ-T-Zellen oder NK-Zellen zeigten CpG-ODN keine Aktivität oder sogar reduzierte IPP-stimulierte Aktivität.
Weiterhin verstärkten CpG-ODN synergistisch die proliferative Antwort von γδ-T-Zellen auf IPP (15). 15A zeigt die Kinetiken der γδ-T-Zellen-Expansion aus einem repräsentativen Experiment. 15B zeigt die Expansion von γδ-T-Zellen 10 Tage nach der Stimulierung mit IPP alleine oder in Kombination mit verschiedenen CpG-ODN.
Die Zugabe von rekombinatem IFN-α/β oder IL-12 ahmte die stimulierenden Wirkungen von CpG-ODN innerhalb der PBMC nach. Funktionelles IL12p70 konnte in den Überständen von mit CpG-ODN stimulierten PBMCs nicht nachgewiesen werden. Das Potential von CpG-ODN, γδ-T-Zellen und NK-Zellen zu aktivieren, korrelierte gut mit ihrer Fähigkeit, IFN-α/β zu induzieren. Die Blockade der IFN-α/β-Funktion durch eine Kombination von neutralisierendem Antikörper gegen IFN-α/β-Protein und den entsprechenden Rezeptor inhibierte die CpG-ODN-induzierte Aktivierung von γδ-T-Zellen und NK-Zellen. Ein neutralisierender Antikörper gegen IL-12 oder die Zugabe von IL-18-bindendem Protein reduzierte den IFN-γ-Grundtiter, nicht aber CpG-ODN-stimuliertes IFN-γ. Das Neutralisieren von TNF-α, IL-1β oder IL-15 zeigten keine Wirkung. Entsprechend zeigten die Ergebnisse, dass (i) IFN-α/β ein wirksamer Aktivator von γδ-T-Zellen ist; (ii) CpG-ODN γδ-T-Zellen und NK-Zellen durch Induktion von IFN-α/β aktiviert; (iii) CpG-ODN, die starke Induktoren für Typ I-IFN sind, bei der Aktivierung von γδ-T-Zellen und NK-Zellen wirksamer sind als ODN, die nicht starke Induktoren für Typ I-IFN sind; (iv) CpG-ODN Antigen-spezifische T-Zellen-Reaktionen in γδ-T-Zellen co-stimulieren; und (v) CpG-ODN-induzierte nicht-spezifische Aktivierung von γδ-T-Zellen und NK-Zellen frühes IFN-γ bereitstellt, das Th1-Reaktionen fördert.
Beispiel 13. Typ I-IFN-induzierende ISNA inhibieren die IL-12-Produktion.
Es wurde beschrieben, dass IFN-β die IL-12-Produktion herunterreguliert. Daher wurde die Wirkung von Typ I-IFN-induzierenden und nicht-Typ I-IFN-induzierenden ISNA auf die IL-12-Produktion wie folgt untersucht. PBMC (2 × 10⁶/ml) aus gesunden Spender wurden mit 25 μg/ml eines stimulierenden anti-CD40-Antikörpers bei Anwesenheit von IL-4 (100 U/ml), GM-CSF (10 U/ml) und IFN-γ (10 ng/ml) stimuliert. Es wurden entweder Medium, 6 μg/ml ODN 2006 (SEQ ID NO: 147), 6 μg/ml ODN 1585 (SEQ ID NO: 1) oder eine Kombination aus 5.000 U/ml rekombinantem IFN-α und 500 U/ml IFN-β hinzugegeben. Nach 48 Stunden wurde IL-12p70 im Überstand durch ELISA gemessen. Die Daten sind als X-faches der IL-12p70-Produktion durch anti-CD40 alleine (Mittelwert = 143 pg/ml) gezeigt und zeigen den Mittelwert (+ SEM) von drei verschiedenen Spender.
Ergebnisse. 16 zeigt, dass ODN 1585 in Kombination mit anti-CD40, die IL-12p70-Produktion verglichen mit anti-CD40-Kontrolle in einem Ausmaß inhibiert, das ähnlich der Inhibierung durch die Zugabe von rekombinantem IFN-α und rekombinantem IFN-β ist. Im Gegensatz dazu verstärkte ODN 2006 in Kombination mit anti-CD40 die IL-12p70-Produktion über die anti-CD40-Positivkontrolle hinaus. Diese Ergebnisse zeigen, dass ISNA, die Typ I-IFN induzieren, in PBMC die Produktion von IL-12p70 unterdrücken können, und dass umgekehrt ISNA, die Typ I-IFN nicht induzieren, die Produktion von IL-12p70 verstärken können.
Die Analyse der mRNA-Titer durch quantitative Echtzeit-PCR zeigte die Induktion von kleinen, aber gleichen Anzahlen von Kopien von IL-12p40 und IL-12p35-mRNA durch ISNA, die nicht Typ I-IFN induzieren. Im Gegensatz dazu induzierten ISNA, die Typ I-IFN induzieren, eine größere Anzahl von Kopien von IL-12p35-mRNA, IL-12p40-mRNA konnte aber nicht nachgewiesen werden. ISNA, die nicht Typ I-IFN induzieren, verstärkten (170%) und ISNA, die Typ I-IFN induzierten, blockierten (25%) die IL-12p70-Synthese. Die Inhibierung von IL-12p70 konnte durch rekombinantes IFN-β nachgeahmt werden. Eine Kombination von neutralisierenden Antikörpern gegen IFN-α/β-Protein und -Rezeptor kehrten die durch Typ I induzierende ISNA vermittelte Inhibierung von IL-12p70 um. Diese Ergebnisse zeigen, dass CpG-ODN, die starke Induktoren von Typ I-IFN sind, die CD40-abhängige IL-12p70-Produktion über einen IFN-α/β-vermittelten negativen Rückkopplungsmechanismus auf die IL-12p40-mRNA-Produktion unterdrücken. Demnach führt die Wechselwirkung von T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen über CD40L zu einem Zytokinmilieu, das von IL-12 (ISNA, die nicht Typ I-IFN induzieren) oder IFN-α/β (ISNA, die Typ I-IFN induzieren) beherrscht wird. Auch wenn beide Th1-Reaktionen fördern, können ISNA, die nicht Typ I-IFN induzieren, für die Aktivierung naiver T-Zellen überlegen, und ISNA, die Typ I-IFN induzieren, können eine höhere Aktivität aufweisen, voraktivierte und Gedächtnis-T-Zellen zu unterstützen.
Beispiel 14. Wirkung von CpG-ODN auf primäre und Erinnerungs-Peptid-spezifische menschliche CTL-Antworten.
CD8+-T-Zellen (1 × 10⁶) aus HLA A2-positiven gesunden Spendern wurden in 24 Napf-Platten bei Anwesenheit oder Abwesenheit von CpG-ODN 2006 (SEQ ID NO: 147), 1585 (SEQ ID NO: 1) oder 2216 (SEQ ID NO: 7) bei einer Konzentration von 6 μg/ml entweder mit einem HLA A2-beschränkten Peptid, das aus dem Grippematrixprotein (GILGFVFTL) abgeleitet wurde, oder einem Peptid, das aus dem Melan A/mart-1-Protein (ELAGIGILTV) abgeleitet wurde, stimuliert. Autologe PBMC (3 × 10⁶) wurden als APCs verwendet. Nach 14 Tagen wurden die Zellen geerntet, gewaschen und mit Grippematrix- oder Melan-A-Peptiden 6 Stunden erneut stimuliert. Brefeldin A wurde für die letzten vier Stunden hinzugefügt. Die Zellen wurden gegen CD8 und CD3 gefärbt, anschließend fixiert, permeabilisiert und mit mAK gegen IFN-γ gefärbt. Nach 14 Tagen wurde auch der Prozentanteil von Tetramerpositiven CD8⁺-T-Zellen (HLA-A2/melan-A-Peptid und HLA-A2/Grippematrix-Peptid) durch Flusszytometrie bestimmt. Tetramere sind Fluorchrom-markierte MHC-Peptidtetramere, die so konstruiert sind, dass sie spezifisch an einen Peptid-spezifischen T-Zell-Rezeptor binden, was ermöglicht, Peptid-spezifische T-Zellen unter Verwendung von Flusszytometrie zu identifizieren. Altman JD et al. Science 274: 94–96 (1996); US-Patent Nr. 5,635,363 .
Ergebnisse. In der Dreifarben-Flusszytometrie wurden CD8⁺-T-Zellen (CTL) auf IFN-γ-Expression analysiert. Die Ergebnisse sind in 17A und 17C als Prozent-IFN-γ-positive Zellen von allen CD8⁺-T-Zellen gezeigt. Die Peptidspezifität wurde durch Stimulierung mit einem irrelevanten HLA A2-Peptid, das aus HIV pol abgeleitet war, getestet und betrug weniger als 0,2% für alle Proben. Die Daten von sieben Spender sind als Mittelwert + SEM gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass ODN 2006 sowohl primäre als auch Erinnerungs-CTL-Antworten auf das melan A/mart-1-Peptid bzw. auf das Grippepeptid erhöhte, im Gegensatz zu ODN 1585 und ODN 2216, die eine geringere Erinnerung induzierten und keine Wirkung auf die Entwicklung von primären CTLs hatten oder sie sogar inhibierten.
Ergebnisse aus der Quantifizierung von Antigen-spezifischen CTLs unter Verwendung von MHC-Tetramer-Färbung sind für das Grippepeptid bzw. das melan A/mart-1-Peptid in 17B bzw. 17D gezeigt. Die Daten von 7 Spender sind als Mittelwert + SEM gezeigt; *zeigt p-Werte < 0,05 berechnet nach dem Student-t-Test für gepaarte Proben (Medium verglichen mit Stimulierung mit CpG-ODN).
Beispiel 15. IFN-α-Sekretion in „stark Reagierenden”
PBMC aus 12 verschiedenen Spender wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von ODN inkubiert, die aus einem Satz von ODN ausgewählt waren, der umfasste: ODN 2336 (SEQ ID NO: 37), ODN 2334 (SEQ ID NO: 36), ODN 2295 (SEQ ID NO: 20), ODN 2255 (SEQ ID NO: 16), ODN 2247 (SEQ ID NO: 11), ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) und ODN 2006 (SEQ ID NO: 147). Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass 6 der Spender als „stark Reagierende” klassifiziert werden konnten insoweit, als dass die Zellen dieser Blutspender mehr als 500 pg/ml (bis zu 7.000 pg/ml) IFN-α nach Inkubation mit dem ausgewählten ODN sekretierten. Eine Unterscheidung zwischen „stark” und „schwach” Reagierenden konnte gemacht werden, da die Zellen der 6 verbleibenden Spender nur IFN-α-Mengen zwischen 10 und 500 pg/ml sekretierten. Ein Grund für diese unterschiedlichen Ergebnisse mag sich aus der Verwendung von Leukozytenfilmen ergeben, die mindestens 24 Stunden alt sind. pDC, als der Hauptzelltyp, der IFN-α sekretiert, überleben nur ungefähr drei Tage in Zellkultur, so dass PBMC aus Leukozytenfilmen, die mindestens 24 Stunden alt sind, eine sehr geringe Anzahl dieses Zelltyps enthalten können.
IFN-α wurde in den obigen Experimenten unter Verwendung eines ELISA-Kits gemessen, das alle Subtypen von IFN-α erkennt. Dagegen messen die meisten anderen ELISA-Kits nur IFN-α2B. Daher wurden die Mengen an IFN-α2B gegen alle IFN-α-Subtypen in mehreren Experimenten verglichen, um Informationen über mögliche Unterschiede für die Induktion von verschiedenen IFN-α-Subtypen zu erhalten. Zusätzlich wurden die IFN-α-Mengen mit IFN-γ verglichen. Auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Studie gab es eine Korrelation zwischen der Induktion von IFN-α2B und allen IFN-α-Subtypen. Im Gegensatz dazu gab es jedoch keine klare Korrelation zwischen IFN-α und IFN-γ.
Beispiel 16. Induktion von IFN-α-Sekretion durch ausgewählte CpG-ODN
Menschliche PBMCs von einem einzelnen Spender wurden hinsichtlich DC durch die Anwendung des ersten Schrittes des Miltenyi C-Isolierungskits angereichert, was den Gehalt an Monozyten, NK-Zellen und T-Zellen vermindert, so dass vor allem B-Zellen, RBCs und DCs übrig bleiben. Diese wurden anschließend zwei Tage lang bei Anwesenheit von IL-3 (10 ng/ml) und verschiedenen ODN bei einer Konzentration von 6 μg/ml inkubiert: ODN 1585 (SEQ ID NO: 1), ODN 2022 (SEQ ID NO: 2), ODN 2118 (SEQ ID NO: 151), ODN 2184 (SEQ ID NO: 3), ODN 2185 (SEQ ID NO: 4), ODN 2192 (SEQ ID NO: 5), ODN 2197 (SEQ ID NO: 148), ODN 2198 (SEQ ID NO: 149), ODN 2204 (SEQ ID NO: 6), ODN 2216 (SEQ ID NO: 7) oder ODN 2217 (SEQ ID NO: 8). In parallelen Proben wurde IFN zu einer Konzentration von 1.000 U/ml hinzugefügt. Die Überstände wurden gesammelt und mit einem für IFN-α-spezifischen ELISA analysiert.
Ergebnisse. ODN induzierten IFN-α in unterschiedlichen Ausmaßen, mit etwas Steigerung durch die Hinzugabe von IFN-γ. Einige der ODN induzierten IFN-α in einem außergewöhnlichen Ausmaß (> 50.000 pg/ml), selbst bei Abwesenheit von hinzugefügtem IFN-γ.
Beispiel 17. Spender- und Sequenzabhängigkeit der IFN-α-Reaktion auf verschiedene ODN.
PBMC, die aus vier verschiedenen Spender gewonnen waren, wurden zwei Tage mit einer Vielzahl von ODN bei einer Konzentration von 0,1 μg/ml inkubiert. Der Satz von ODN umfasste die folgenden:
(Z in ODN 2313 steht für 5-Methylcytosin)
Überstände wurden gesammelt und mittels ELISA auf IFN-α getestet. In Parallelexperimenten wurden aus denselben vier verschiedenen Spender gewonnene PBMC zwei Tage lang mit dem gleichen Satz von ODN bei einer Konzentration von 1 μg/ml inkubiert.
Ergebnisse. Die Ergebnisse für PBMC, die von den vier Spendern gewonnen und mit ODN bei einer Konzentration von 0,1 μg/ml und mit ODN bei einer Konzentration 1 μg/ml inkubiert wurden, zeigten wiederum Dosis- und Spenderschwankungen, wobei mehrere ODN IFN-α auf Spiegel von mindestens 5.000 pg/ml induzierten und manche IFN-α auf Titer, die weit über 5.000 pg/ml hinausgingen, induzierten. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nukleinsäure mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
wobei ein jeder Kleinbuchstabe eine Phosphothioatbindung und ein jeder Großbuchstabe eine Phosphodiesterbindung anzeigt.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine isolierte Nukleinsäure mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

wobei ein jeder Kleinbuchstabe eine Phosphothioatbindung und ein jeder Großbuchstabe eine Phosphodiesterbindung anzeigt; und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, weiter umfassend Interferon alpha (IFN-α).
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, zur Verwendung in einer therapeutischen Anwendung.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1 oder eine pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, zur Verwendung bei der Behandlung einer proliferativen Erkrankung oder viralen Infektion, die eine IFN-α-Behandlung erfordert.
Verwendung einer isolierten Nukleinsäure für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung einer proliferativen Erkrankung oder einer viralen Infektion, die eine Interferon alpha (IFN-α)-Behandlung erfordert, wobei die Nukleinsäure eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
wobei ein jeder Kleinbuchstabe eine Phosphothioatbindung und ein jeder Großbuchstabe eine Phosphodiesterbindung anzeigt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Nukleinsäure zusammen mit IFN-α verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das IFN-α verabreicht werden soll: (a) mit einer Dosis unterhalb der klinisch etablierten wirksamen Dosis für IFN-α allein; (b) mit einer tolerierten Maximaldosis für IFN-α bei Abwesenheit der Nukleinsäure; oder (c) bei einer Dosierung von wenigstens 20, wenigstens 30, wenigstens 40 oder wenigstens 50% unterhalb der tolerierten Maximaldosis von IFN-α.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei dem Lebewesen Granulozyten-Monozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) co-verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Behandlung die Aktivierung der Interferon-produzierenden Zellen (IPCs) eines Lebewesens in einem Verfahren umfasst, in dem die IPCs aus dem Lebewesen isoliert, in vitro kultiviert, in vitro mit einer wirksamen Menge der Nukleinsäure kontaktiert und in das Lebewesen zurückgeführt werden sollen.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die IPCs in vitro mit einem Wachstumsfaktor, IL-3 und/oder GM-CSF kontaktiert werden.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Medikament eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, die die Nukleinsäure umfasst, und die Zusammensetzung einem Lebewesen zusammen mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die IFN-α umfasst, in einer Menge verabreicht werden soll, die, zusammen mit dem co-verabreichten IFN-α, eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt, wobei die Wirksamkeit der IFN-α-Behandlung besser ist als die Wirksamkeit der Verabreichung der gleichen Menge an IFN-α bei Abwesenheit der co-verabreichten Nukleinsäure.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Medikament eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, die die Nukleinsäure umfasst, und die Zusammensetzung einem Lebewesen zusammen mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die IFN-α umfasst, in einer Menge verabreicht werden soll, die, zusammen mit dem co-verabreichten IFN-α, eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt, wobei die Menge an co-verabreichtem IFN-α geringer ist als diejenige, die bei Abwesenheit der co-verabreichten Nukleinsäure erforderlich wäre.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Menge an verabreichtem IFN-α wenigstens 20, wenigstens 30, wenigstens 40 oder wenigstens 50% unterhalb der Menge von IFN-α liegt, die bei Abwesenheit der co-verabreichten Nukleinsäure erforderlich ist.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Medikament eine pharmazeutische Zusammensetzung ist, die die Nukleinsäure umfasst, und die Zusammensetzung einem Lebewesen zusammen mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die IFN-α umfasst, in einer Menge verabreicht werden soll, die, zusammen mit dem co-verabreichten IFN-α, eine wirksame IFN-α-Behandlung darstellt, wobei eine Nebenwirkung, die mit der IFN-α-Behandlung verbunden ist, verglichen mit der Nebenwirkung verringert ist, wenn IFN-α bei Abwesenheit der co-verabreichten Nukleinsäure verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12, 13 oder 15, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung lokal verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die mit der IFN-α-Behandlung verbundene Nebenwirkung systemisch ist und/oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus erkältungsähnlichem Syndrom, Fieber, Kopfschmerz, Schüttelfrost, Muskelschmerz, Müdigkeit, Anorexie, Übelkeit, Erbrechen, Diarrhö und Depression.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Behandlung das Verstärken der Wirksamkeit einer IFN-α-Behandlung in einem Lebewesen umfasst, das einer derartigen Behandlung bedarf, und das ex vivo Kontaktieren von IPCs, die von einem Spender isoliert sind, mit einer Menge der Nukleinsäure umfasst, die wirksam ist, um die IPCs zu induzieren, IFN-α freizusetzen; wobei die Zellen danach einem Lebewesen verabreicht werden sollen, das mit einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend IFN-α behandelt wird.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei der Spender das Lebewesen ist und/oder die isolierten IPCs weiter mit einem Antigen kontaktiert werden.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die kontaktierten Zellen durch lokale Injektion verabreicht werden sollen, bevorzugterweise durch ein Blutgefäß, das ein Zielgewebe versorgt, wobei bevorzugtererweise das Blutgefäß ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Leberarterie, einer Pfortader, einer Bauchhöhlenarterie und einer Milzarterie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–20, wobei die proliferative Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Haarzellleukämie, chronischer myelogenen Leukämie, Haut-T-Zell-Leukämie, multiplem Myelom, follikulärem Lymphom, malignem Melanom, Plattenepithelkarzinom, mit AIDS im Zusammenhang stehendem Kaposi-Sarkom, Hypernephrom, Prostatakarzinom, Blasenzellkarzinom, zervikale Dysplasie und Kolonkarzinom.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–20, wobei die virale Infektion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hepatitis B, Hepatitis C, Condyloma acuminatum, menschlichem Immundefizienzvirus, Herpes, Zytomegalievirus, Epstein-Barr-Virus und Papillomavirus.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die IPCs in Abwesenheit von IL-3 und/oder in Abwesenheit von GM-CSF kultiviert werden sollen.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Behandlung das Stimulieren der Produktion einer Vielzahl von Typ I-IFN-Subtypen und das Kontaktieren von IPCs in vivo mit einer Menge der Nukleinsäure umfasst, die wirksam ist, um die Sekretion von wenigstens zwei Typ I-Interferonen zu induzieren.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die IPCs dendritische Zellen vom Precursor-Typ II (pDC2s) sind.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die IPCs induziert werden, wenigstens drei, wenigstens vier, wenigstens fünf, wenigstens sechs, wenigstens sieben oder wenigstens acht Typ I-Interferone zu sekretieren.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Behandlung die Inhibierung von IL-12-Produktion umfasst, wobei Interferon-produzierende Zellen mit der Nukleinsäure in einer Menge kontaktiert werden, die wirksam ist, um eine Sekretion von Typ I-Interferon in Gegenwart von IL-12-produzierenden Zellen zu induzieren, unter Bedingungen, bei denen IL-12-produzierende Zellen normalerweise IL-12 produzieren.
Natürliche Interferon-produzierende Zellen (IPCs), hergestellt durch ex vivo Kontaktieren von IPCs, die aus einem Spender isoliert sind, mit einer Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfassend eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
wobei ein jeder Kleinbuchstabe eine Phosphothioatbindung anzeigt und ein jeder Großbuchstabe eine Phosphodiesterbindung anzeigt, für die Verabreichung in einem therapeutischen Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit von co-verabreichtem IFN-α bei der Behandlung einer proliferativen Erkrankung oder viralen Infektion.