DE69912842T2

DE69912842T2 - Antivirale nukleosidanaloga

Info

Publication number: DE69912842T2
Application number: DE69912842T
Authority: DE
Inventors: Nghe Nguyen-Ba
Original assignee: Shire BioChem Inc
Current assignee: Shire Canada Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: ID30477A; CN1334814A; CA2355712C; UY25878A1; DE69912842D1; US6358963B1; AP2001002207A0; IL143867A0; CZ20012352A3; CN1117751C; EA200100711A1; US20040058893A1; HUP0104827A3; KR20020013485A; AU1765700A; DK1140937T3; NO20013163L; NO20013163D0; ES2209532T3; WO2000039143A2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Endung betrifft neue Purinnukleosidanaloga, die als antivirale Mittel geeignet sind. Im Besonderen betrifft die Erfindung Purinnukleoside, die verbesserte Pharmakokinetikeigenschaften zeigen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den Vereinigten Staaten treten jedes Jahr mehr als 12 Millionen neuer Fälle sexuell übertragener Krankheiten (STD) auf. Unter den 10 bedeutendsten Krankheiten, die in den Vereinigten Staaten anzugeben sind, sind fünf STD einschließlich Chlamydia, Gonorrhoe, Syphilis, das Erworbene Immunschwäche Syndrom (AIDS)- und Hepatitis B-Virus(HBV)-Infektion, unter welchen AIDS- und HBV-Infektion nicht heilbar sind.
Im Falle von AIDS sagt die Weltgesundheitsorganisation voraus, dass im Jahr 2000 40 Millionen Menschen weltweit mit dem Human-Immunschwächevirus (HIV), dem Virus, das (AIDS) verursacht, infiziert sein werden. Hepatitis-Infektionen betreffen fünfmal mehr Personen als im Falle von HIV. Von der Weltgesundheitsorganisation ist berichtet worden, dass 2000 Millionen heute lebende Menschen mit dem HBV-Virus infiziert sind, von welchen 350 Millionen chronisch infiziert sind, und daher Gefahr laufen an einer Leberkrankheit zu sterben.
Wenngleich die Sterblichkeitsraten von AIDS aufgrund neuer Therapien fallen, bleibt AIDS die zweitwichtigste Todesursache bei Erwachsenen im Alter zwischen 29 und 40. Eine kombinierte Anti-HIV-Therapie ist derzeit Pflegestandard für Menschen, die mit HIV infiziert sind. Es gibt derzeit 11 Anti-HIV-Arzneimittel, die auf Verordnung erhältlich sind. Diese Anti-HIV-Arzneimittel fallen in drei Kategorien: Nukleosidanaloga, die Zidovudine, Didanosine, Zalcitabine, Stavudine oder Lamivudine umfassen; Proteaseinhibitoren, die Indinavir, Nelfinavir, Saquinavir und Ritonavir umfassen, und Nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI), die Nevirapine, Delavirdine und Efavirenz umfassen. Verglichen mit HIV gibt es derzeit nur wenige genehmigte Therapiemöglichkeiten für chronische Hepatitis B-Virusinfektion, welche Interferon und Lamivudine sind. Andere Arzneimittel sind derzeit in klinischen Versuchen, einschließlich Famciclovir, Lobucavir und Adefovir. Jedoch zeigten viele Studien, dass die meisten Patienten nach Abschluss der Therapie einen Rückfall erleiden und eine Resistenz gegenüber den Arzneimitteln entwickeln.
Die Entwicklung von Resistenz ist in jüngerer Zeit ein Hauptproblem bei der Behandlung von HIV- und HBV-Infektionen geworden. Resistenz tritt üblicherweise auf, wenn die verwendeten Arzneimittel kein ausreichendes Potenzial aufweisen, um Virusreplikation vollständig zu stoppen. Wenn das Virus an sich in der Gegenwart von Arzneimitteln reproduzieren kann, hat es die Möglichkeit, Veränderungen in seiner Struktur vorzunehmen, die als Mutationen bezeichnet werden, bis es eine findet, die es ihm erlaubt, trotz der Arzneimittel zu reproduzieren. Wenn eine Mutationen auftritt, wächst es dann ohne nachgewiesen zu werden und ist bald der dominante Stamm des Virus in dem Individuum. Das Arzneimittel wird zunehmend schwächer gegen den neuen Stamm. Zunehmend wird auch die Kreuzresistenz an Bedeutung gewinnen. Kreuzresistenz tritt auf, wenn Mutationen, die Resistenz gegenüber einem Arzneimittel bewirken, ebenfalls Resistenz gegenüber einem anderen bewirken. Mehrere Studien bewiesen, dass das Kombinieren von zwei Arzneimitteln die Entwicklung einer Resistenz gegenüber einem oder beiden Arzneimitteln verzögert, verglichen damit, wenn jedes Arzneimittel alleine verwendet wird. Andere Studien legen nahe, dass Kombinationen aus drei Arzneimitteln diesen Vorteil sogar noch weiter verbessern. Als ein Ergebnis nehmen viele Leute an, dass die beste Art zum Verhindern oder zumindest zum Verzögern von Resistenz die Verwendung von Multi-Arzneimittelkombinationstherapien ist. Jedoch steigt mit der Zunahme der Anzahl von Arzneimitteln auch das Risiko oder die Arzneimittelwechselwirkungen und Toxizität.
Ein Weg zum Erhöhen der Wirksamkeit eines Arzneimittels ist die Verbesserung seiner pharmakokinetischen Eigenschaften, die zu seiner therapeutischen Wirksamkeit beitrrgen. Die Wissenschaft der Pharmakokinetik ist die Untersuchung der Faktoren, die die Menge chemischer Mittel an ihren Stellen biologischer Wirkung zu verschiedenen Zeiten nach der Verarbreichung eines Mittels oder Arzneimittelmittels an biologische Systeme bestimmen. Die Pharmakokinetiken umfassen die Untersuchung der Arzneimittelabsorption und Verteilung („Biotranslokation"), die Untersuchung der chemischen Veränderungen, die ein Arzneimittel im Körper eingehen kann („Biotransformation") und die Untersuchung der Mittel, durch welche Arzneimittel im Körper gespeichert und aus ihm eliminiert bzw. ausgeschieden werden. Bei chronischer Arzneimitteltherapie ist die Bioverfügbarkeit der wichtigere Faktor, da er das Ausmaß betrifft, zu welchem ein Arzneimittel absorbiert wird und den Blutstrom erreicht oder auf andere Art für den Behandlungsort im Körper verfügbar ist. Die Bioverfügbarkeit ist direkt verknüpft mit der Fähigkeit des Arzneimittels zum Lösen in biologischen Fluiden.
Es ist berichtet worden, dass (-)-β-D-2,6-Diaminopurindioxolan(DAPD) und (-)β-D-1,3-Dioxolanguanin (DXG) eine hohe Effizienz bzw. Wirksamkeit gegen HIV-1 in verschiedenen Zellsystemen, minimale Kreuzresistenz mit Lamivudine und geringe Toxizität aufweisen. Jedoch haben diese Verbindungen schlechte pharmakokinetische Eigenschaften, die verbessert werden könnten. Es wäre daher zweckmäßig mit Verbindungen versorgt zu sein, die verbesserte Pharmakokinetiken aufweisen zur Verwendung bei der Behandlung von Patienten, die mit HIV und HBV infiziert sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einer Hinsicht liefert die vorliegende Erfindung neue Purin-cis-Nukleosid-Verbindungen der Formel (I)
und pharmzeutisch verträgliche Salze davon, worin
n 1 oder 2 ist,
R₄ ausgewählt ist aus H, COOH, CONH₂, OH, SH, NH₂, NO₂, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, Halogen, COR_a, worin R_a ein C_2-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl ist, oder COOR_b, worin R_b ein C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl ist;
R₃ H oder C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl ist;
X ausgewählt ist aus H, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Carbonyl, das substituiert ist mit einem C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, C_1-10-Aryl oder
worin jedes Rc unabhängig ausgewählt ist aus H, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl oder einer Hydroxyschutzgruppe; und worin
das Nukleosid in der Form des (–)-Enantiomers, des (+)-Enantiomers und Gemischen davon, einschließlich racemische Gemische, vorliegt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind geeignet bei der Therapie, insbesondere als antivirale Mittel.
In einer anderen Hinsicht wird ein Verfahren bereitgestellt zur Behandlung viraler Infektionen in einem Lebewesen, das eine solche Behandlung erfordert, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung der Erfindung an das Lebewesen.
In einer anderen Hinsicht wird eine pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, umfassend die Verbindung der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff.
Ein noch weiterer Aspekt ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Behandeln viraler Infektionen in einem Lebewesen, das eine derartige Behandlung erfordert, umfassend das Verabreichen an das Lebewesen einer Kombination, umfassend mindestens eine Verbindung gemäß Formel I und mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Nukleosidanaloga; Nicht-nukleosidischereverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) oder Protease-Inhibitoren.
In einer noch weiteren Hinsicht wird eine pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, umfassend mindestens eine Verbindung gemäß Formel I, mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Nukleosidanaloga; Nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI); oder Proteaseinhibitoren und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff.
In einer anderen Hinsicht ist die Erfindung die Verwendung einer Verbindung gemäß Formel I zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung viraler Infektionen.
DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einer Ausführungsform umfassen Verbindungen der vorliegenden Erfindung, diejenigen, worin die folgenden Ausführungsformen entweder unabhängig oder in Kombination vorliegen.
In einer Ausführungsform ist X H.
Alternativ ist X
worin jedes Rc unabhängig ausgewählt ist aus H, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl oder einer Hydroxyschutzgruppe, ausgewählt aus S-Acylthioethylester, Acyloxymethylester oder Alkylmethylcarbonat. In einer weiteren Ausführungsform ist X
worin jedes Rc unabhängig eine Hydroxyschutzgruppe ist, ausgewählt aus Acetyl-2-thioethylester, Pivaloyloxymethylester oder Isopropyloxycarbonyloxymethylester.
In einer Ausführungsform ist n 1.
In einer weiteren Ausführungsform ist R₃ H oder Methyl. In einer weiteren Ausführungsform ist R₃ H.
In einer weiteren Ausführungsform ist R₄ ausgewählt aus H, COOH, CONH₂, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl oder COOR_b, worin R_b ein C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist R₄ H, COOH oder C_1-6-Alkyl.
In einer weiteren Ausführungsform ist R₄ H, COOH, Methyl oder Ethyl. In einer weiteren Ausführungsform ist R₄ Methyl oder Ethyl.
In einer alternativen Ausführungsform ist R₄ COOH. In einer weiteren Ausführungsform ist R₄ H.
In einer weiteren Ausführungsform ist R₃ H oder Methyl und R₄ ist H. In einer weiteren Ausführungsform sind R₄ und R₃ H.
In einer Ausführungsform werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch Formel (Ia):
und pharmazeutisch verträgliche Salze davon dargestellt, worin jedes n, X, R₃ und R₄ wie oben definiert ist.
Dem Fachmann in der Technik wird bewusst sein, dass die Verbindungen der Formel (I) und (Ia) mindestens zwei chirale Zentren enthalten, welche durch ein Sternchen (*) in der allgemeinen Formel (I) und (Ia) markiert sind. Die Verbindungen der Formel (I) und (Ia) existieren so in der Form zweier verschiedener optischer Isomere (d. h. (+)- oder (–)-Enantiomere oder β-L und β-D). Alle derartigen Enantiomere und Gemische davon, einschließlich racemische Gemische, sind im Bereich der Erfindung enthalten. Das einzelne optische Isomer oder Enantiomer kann durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren erhalten werden, wie etwa chirale HPLC, enzymatische AufTrennung und chirale Hilfsmittel, oder kann stereoselektiv synthetisiert werden.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen mit verbesserten Pharmakokinetikeigenschaften bereitgestellt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen mit verbesserter Bioverfügbarkeit bereitgestellt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Behandeln einer viralen Infektion in einem Lebewesen, das eine solche Behandlung erfordert, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon an das Lebewesen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum Behandeln einer retroviralen Infektion in einem Lebewesen, das eine solche Behandlung benötigt, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon an das Lebewesen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Behandeln eines Lebewesens bereitgestellt, das durch das HIV-Virus infiziert ist, umfassend das Verabreichen an das Lebewesen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Behandeln eines Lebewesens bereitgestellt, das durch das HBV-Virus infiziert ist, umfassend das Verabreichen an das Lebewesen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon.
Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen:
Verbindung A cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Verbindung B cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Verbindung C cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-[1-carbonsäurecyclopropylamino]-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
In einer weiteren Ausführungsform umfassen Verbindungen der Erfindung:
Verbindung A(-) (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Verbindung B(-) (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Verbindung C(-) (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-[1-carbonsäurecyclopropylamino]-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
In einer Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Form des (+)-Enantiomers mindestens zu 95% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Form des (+)-Enantiomers mindestens zu 97% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Form des (+)-Enantiomers mindestens zu 99% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Form des (–)-Enantiomers mindestens zu 95% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Form des (–)-Enantiomers mindestens zu 97% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Form des (–)-Enantiomers mindestens zu 99% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung Verbindung A.
In einer Ausführungsform ist die Verbindung der vorliegenden Erfindung Verbindung A(-).
Es werden auch pharmazeutisch verträgliche Salze der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Der Ausdruck pharmazeutisch verträgliche Salze von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und (Ia) bedeutet diejenigen, die aus pharmazeutisch verträglichen anorganischen und organischen Säuren und Basen erhalten werden. Beispiele geeigneter Säuren umfassen Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Perchlor-, Fumar-, Malein-, Phosphor-, Glykol-, Milch-, Salicyl-, Succin-, Toluol-p-sulfon-, Wein-, Essig-, Zitronen-, Methansulfon-, Ameisen-, Benzoe-, Malon-, Naphthalin-2-sulfon- und Benzolsulfonsäuren. Andere Säuren, wie etwa Oxalsäure, können, wenngleich sie an sich pharmazeutisch nicht verträglich sind, als Zwischenprodukte zum Erhalten der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und ihrer pharmazeutisch verträglichen Säurezugabesalze geeignet sein.
Salze, die von geeigneten Basen abstammen, umfassen Alkalimetall-, (z. B. Natrium), Erdalkalimetall- (z. B. Magnesium), Ammonium- und NR₄ ⁺- (worin R C_1-4-Alkyl ist), Salze.
Hier nachfolgende Bezugnahmen auf eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und (Ia) und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze.
Wenn es nicht anders definiert ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise vom Fachmann in der Technik, die diese Erfindung betrifft, verstanden werden. Zusätzlich sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend und sollen nicht als begrenzend ausgelegt werden.
Wie in dieser Anmeldung verwendet, bedeutet der Ausdruck „Alkyl" eine unsubstituierte oder substituierte (durch ein Halogen, Nitro, CONH₂, COOH, O-C_1-6-Alkyl, O-C_2-6-Alkenyl, O-C_2-6-Alkinyl, Hydroxyl, Amino oder COOQ, worin Q C_1-6-Alkyl; C_2-6-Alkenyl; C_2-6-Alkinyl ist) geradkettige, verzweigtkettige oder cyclische Kohlenwasserstoffkomponente (z. B. Isopropyl, Ethyl, Fluorhexyl oder Cyclopropyl). Der Ausdruck Alkyl soll auch Alkyle umfassen, worin ein oder mehrere Wasserstoffatome durch ein Halogen ersetzt sind, bevorzugter ist das Halogen Fluor (z. B. CF₃- oder CF₃CH₂.-).
Die Ausdrücke „Alkenyl" oder „Alkinyl" bedeuten ein Alkyl, das mindestens eine ungesättigte Gruppe enthält (z. B. Allyl).
Der Ausdruck „Hydroxyschutzgruppe" ist im Bereich der organischen Chemie allgemein bekannt. Derartige Schutzgruppen können in T. Greene, Protective Groups In Organic Synthesis, (John Wiley & Sons, 1981) gefunden werden. Beispiele von Hydroxyschutzgruppen umfassen, ohne darauf begrenzt zu sein, Acetyl-2-thioethylester, Pivaloyloxymethylester und Isopropyloxycarbonyloxymethylester.
Wenn ein Schwefelatom vorliegt, kann das Schwefelatom in verschiedenen Oxidationszuständen, S, SO oder SO₂ vorliegen. Alle derartigen Oxidationszustände sind im Bereich der vorliegenden Erfindung.
Halogen bedeutet hier Fluor, Chlor, Brom und Jod, z. B. Fluor.
Es versteht sich, dass die Menge einer Verbindung der Erfindung, die erforderlich ist zur Verwendung bei einer Behandlung nicht nur mit der speziellen ausgewählten Verbindung variieren wird, sondern auch mit dem Verabreichungsweg, der Art des Zustands, für welchen eine Behandlung erforderlich ist und dem Alter und dem Zustand des Patienten und sie wird letztendlich im Ermessensbereich des zuständigen Arztes oder Tierarztes liegen. Im Allgemeinen liegt jedoch eine geeignete Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 750 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 60 mg/kg/Tag, am bevorzugtesten im Bereich von 1 bis 20 mg/kg/Tag.
Die gewünschte Dosis kann praktischerweise in einer Einzeldosis oder in geteilten Dosen zu geeigneten Intervallen verabreicht werden, z. B. als zwei, drei, vier oder mehr Dosen pro Tag.
Die Verbindung wird üblicherweise in Einheitsdosisform verabreicht; z. B. sind 10 bis 1500 mg, geeigneterweise 20 bis 1000 mg, am geeignetsten 50 bis 700 mg wirksamer Bestandteil pro Einheitsdosisform enthalten.
Idealerweise sollte der wirksame Bestandteil verabreicht werden, um Maximalplasmakonzentrationen der wirksamen Verbindung von etwa 1 bis etwa 75 μM, vorzugsweise etwa 2 bis 50 μM, am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 30 μM, zu erreichen. Dies kann z. B. erreicht werden durch die intravenöse Injektion einer 0,1- bis 5-%-igen Lösung des wirksamen Bestandteils, optional in Kochsalzlösung, oder durch orale Verabreichung als ein Bolus, der etwa 1 bis etwa 500 mg des wirksamen Bestandteils enthält. Wünschenswerte Blutgehalte können durch eine kontinuierliche Infusion, um etwa 0,01 bis etwa 5,0 mg/kg/Stunde vorzusehen, oder durch periodische Infusionen, die etwa 0,4 bis etwa 15 mg/kg des wirksamen Bestandteils erhalten, erhalten werden.
Wenngleich es möglich ist, dass zur therapeutischen Verwendung eine Verbindung der Erfindung als die Rohchemikalie verabreicht werden kann, ist es bevorzugt, den wirksamen Bestandteil als eine pharmazeutische Formulierung zu verabreichen. Die Erfindung liefert daher weiterhin eine pharmazeutische Formulierung, umfassend eine Verbindung der Formel (I) oder (Ia) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Träger hierfür und optional anderen therapeutischen und/oder prophylaktischen Bestandteilen. Der/die Träger muss/müssen in dem Sinne „verträglich" sein, dass er/sie kompartibel mit den anderen Bestandteilen der Formulierung ist/sind und nicht schädlich für den Rezipienten ist/sind.
Pharmazeutische Formulierungen umfassen diejenigen, die zur oralen, rektalen, nasalen, topischen (einschließlich bukkal und sublingual), transdermalen, vaginalen oder parenteralen (einschließlich intramuskulär, subkutan und intravenös) Verabreichung geeignet sind oder in einer Form sind, die geeignet zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation ist. Die Formulierungen können, wenn es geeignet ist, üblicherweise in diskreten Dosiseinheiten vorliegen und können durch eines der allgemein in der pharmazeutischen Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren umfassen den Schritt, dass die wirksame Verbindung mit flüssigen Trägern oder feinzerteilten festen Trägern oder beiden in Verbindung gebracht wird, und dann, falls erforderlich, Formen des Produkts in die gewünschte Formulierung.
Eine pharmazeutische Formulierung, die für orale Verabreichung geeignet ist, kann herkömmlicherweise als diskrete Einheiten vorliegen, wie etwa als Kapseln, Arzneikapseln oder Tabletten, welche jeweils eine vorbestimmte Menge des wirksamen Bestandteils enthalten; als ein Pulver oder als Granalien; als eine Lösung, eine Suspension oder als eine Emulsion. Der wirksame Bestandteil kann auch als ein Bolus, Electuarium oder eine Paste vorliegen. Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können übliche Hilfsstoffe enthalten, wie etwa Bindemittel, Füllstoffe, Schmierstoffe, Desintegrationsmittel bzw. Auflösemittel oder Benetzungsmittel. Die Tabletten können entsprechend allgemein in der Technik bekannter Verfahren beschichtet werden. Flüssige Oralpräparationen können in der Form von z. B. wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirup oder Elixieren sein, oder können als ein trockenes Produkt zum Konstituieren mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Anwendung vorliegen. Derartige flüssige Präparationen können herkömmliche Additive, wie etwa Suspensionsmittel, Emulgiermittel, nichtwässrige Vehikel (welche Speiseöle enthalten können) oder Konservierungsmittel, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch für parenterale Verabreichung formuliert werden (z. B. durch Injektion, z. B. Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion) und können in Dosisform in Ampullen, vorgefüllten Spritzen, kleinvolumigen Infusionen oder in Mehrfachdosisbehältnissen mit einem zugegebenen Konserverierungsmittel vorliegen. Die Zusammensetzungen können in solchen Formen sein, wie etwa Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln, und können Formulierungsmittel enthalten, wie etwa Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel. Alternativ kann der wirksame Bestandteil in Pulverform sein, erhalten durch aseptische Isolierung von sterilem Feststoff oder durch Lyophilisierung aus Lösung, zum Konstituieren mit einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor Anwendung.
Zur topischen Verabreichung in die Epidermis können die Verbindungen der Erfindung als Salben, Cremes oder Lotionen oder als ein transdermales Pflaster formuliert sein. Derartige transdermale Pflaster können Penetrationsverstärkungsmittel, wie etwa Linalool, Carvacol, Thymol, Citral, Menthol und t-Anethol, enthalten. Salben und Cremes können z. B. formuliert werden mit einem wässrigen oder öligen Grundmaterial unter der Zugabe geeigneter Verdickungs- und/oder Geliermittel. Lotionen können mit einem wässrigen oder öligen Grundmaterial formuliert werden und werden im Allgemeinen ein oder mehrere Emulgiermittel, Stabilisierungsmittel, Dispergiermittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel oder Färbemittel enthalten.
Formulierungen, die zur topischen Verabreichung in den Mund geeignet sind, umfassen Pastillen, die den aktiven Bestandteil in einem aromatisierten Grundmaterial, üblicherweise Sucrose und Akazie oder Tragant, umfassen; Pastillen, umfassend den wirksamen Bestandteil in einem inerten Grundmaterial, wie etwa Gelatine und Glycerin oder Sucrose und Akazie; und Mundwässer, die den wirksamen Bestandteil in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.
Pharmazeutische Formulierungen, die zur rektalen Verabreichung geeignet sind, worin der Träger ein Feststoff ist, liegen am bevorzugtesten als Einheitsdosissuppositorien vor. Geeignete Träger umfassen Kakaobutter und andere Materialien, die üblicherweise in der Technik verwendet werden und die Suppositorien können herkömmlich durch Mischen der wirksamen Verbindung mit dem/den weichgemachten oder geschmolzenen Träger/Trägern, gefolgt durch Abkühlen und Formen in Formen gebildet werden.
Formulierungen, die zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, können als Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprays vorliegen, die zusätzlich zum wirksamen Bestandteil solche Träger enthalten, wie diejenigen, von welchen in der Technik bekannt ist, dass sie geeignet sind.
Zur intranasalen Verabreichung können die Verbindungen der Erfindung als ein flüssiger Spray oder dispergierbares Pulver oder in der Form von Tropfen vorliegen. Tropfen können mit einem wässrigen oder nichtwässrigen Grundmaterial formuliert werden, welches auch ein oder mehrere Dispergiermittel, Solubilisiermittel oder Suspendiermittel enthält. Flüssige Sprays werden geeigneterweise aus Druckbehältern zugeführt.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die erfindungsgemäßen Verbindungen herkömmlicherweise aus einem Einblasegerät bzw. Inhaliergerät, Vernebelungsgerät oder einem unter Druck stehenden Behälter oder durch andere herkömmliche Mittel zum Zuführen eines Aerosolsprays zugeführt. Unter Druck stehende Behälter können ein geeignetes Treibmittel umfassen, wie etwa Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosiseinheit durch Vorsehen eines Ventils zum Zuführen einer abgemessenen Menge bestimmt werden.
Alternativ können zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation die erfindungsgemäßen Verbindungen in der Form einer Trockenpulverzusammensetzung sein, z. B. ein Pulvergemisch der Verbindung und eines geeigneten pulverförmigen Grundmaterials, wie etwa Lactose oder Stärke. Die Pulverzusammensetzung kann in Einheitsdosisform vorliegen, z. B. in Kapseln oder Patronen oder z. B. in Gelatine oder Blisterpackungen, aus welchen das Pulver mit der Hilfe eines Inhalators oder Insufflators verabreicht werden kann.
Wenn es gewünscht ist, können die oben beschriebenen Formulierungen, welche ausgelegt sind, um eine verzögerte Freisetzung des wirksamen Bestandteils zu ergeben, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Verbindung mit anderen antiviralen Mitteln verwendet werden.
In einer Ausführungsform umfassen Kombinationen der vorliegenden Erfindung, diejenigen, worin die folgenden Ausführungsformen vorliegen, entweder unabhängig oder in Kombination.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen antiviralen Mittel verwendet werden, das ausgewählt wird aus Nukleosidanaloga, NNRTI oder Proteaseinhibitoren.
In einer Ausführungsform ist das Nukleosidanaloge ein 1,3-Oxathiolananaloges.
In einer weiteren Ausführungsform ist das 1,3-Oxathiolananaloge Lamivudine, Coviracil oder 2-Hydroxymethyl-4-(cytosin-1'-yl)-1,3-Oxathiolan.
In einer weiteren Ausführungsform ist das 1,3-Oxathiolananaloge 2-Hydroxymethyl-4-(cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan.
In einer weiteren Ausführungsform ist das 1,3-Oxathiolananloge 2R-Hydroxymethyl-4R-(cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan.
In einer weiteren Ausführungsform ist das 1,3-Oxathiolan-Analoge 2S-Hydroxymethyl-4S-(cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen antiviralen Mittel verwendet werden, ausgewählt aus Zidovudine, Didanosine, Zalcitabine, Stavudine, Lamivudine, Nevirapine, Delavirdine, Efavirenz, Indinavir, Nelfinavir, Saquinavir oder Ritonavir.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen antiviralen Mittel verwendet werden, ausgewählt aus Nevirapine, Efavirenz, Zidovudine, Stavudine oder Lamivudine.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen antiviralen Mittel, ausgewählt aus Efavirenz, Zidovudine, Stavudine oder Lamivudine, verwendet werden.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen antiviralen Mittel, ausgewählt aus Efavirenz, Zidovudine oder Lamivudine verwendet werden.
In einer Ausführungsform werden die Verbindungen der Erfindung zusammen mit Efavirenz, Zidovudine oder Lamivudine verwendet. In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen antiviralen Mittel verwendet werden, ausgewählt aus Nevirapine, Zidovudine, Stavudine oder Lamivudine.
In einer Ausführungsform werden die Verbindungen der Erfindung zusammen mit Nevirapine, Zidovudine, Stavudine und Lamivudine verwendet.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen antiviralen Mittel verwendet werden, ausgewählt aus Zidovudine, Stavudine oder Lamivudine.
In einer Ausführungsform werden die Verbindungen der Erfindung zusammen mit Zidovudine, Stavudine oder Lamivudine verwendet.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit Zidovudine verwendet werden.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit Stavudine verwendet werden.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung mit Lamivudine verwendet werden.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit Nevirapine verwendet werden.
In einer Ausführungsform können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit Efavirenz verwendet werden.
Die Kombinationen, auf welche oben Bezug genommen wird, können herkömmlicherweise zur Verwendung in der Form einer pharmazeutischen Formulierung vorliegen und derartige pharmazeutische Formulierungen, die eine oben definierte Kombination zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, stellen daher einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Die einzelnen Komponenten derartiger Kombinationen können entweder aufeinanderfolgend oder gleichzeitig in getrennten oder kombinierten pharmazeutischen Formulierungen verabreicht werden.
Wenn die Verbindung (I) und (Ia) oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon in Kombination mit einem zweiten therapeutisch wirksamen Mittel gegen den gleichen Virus verwendet werden, kann die Dosis jeder Verbindung entweder die gleiche sein oder kann von derjenigen abweichen, die eingesetzt wird, wenn die Verbindung alleine verwendet wird. Geeignete Dosen werden durch den Fachmann in der Technik leicht zu beurteilen sein.
Das Verhältnis zwischen den Verbindungen der vorliegenden Erfindung und dem zweiten therapeutischen Mittel wird durch den Fachmann in der Technik leicht zu bestimmen sein. Zum Beispiel kann man von 1 : 1 bis etwa 1 : 50 Verbindungen der Erfindung : zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von 1 : 1 bis etwa 1 : 30 Verbindungen der Erfindung : zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 20 Verbindungen der Erfindung : zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von 1 : 1 bis etwa 1 : 15 Verbindungen der Erfindung : zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 10 Verbindungen der Erfindung : zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 5 Verbindungen der Erfindung : zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von 1 : 1 bis etwa 1 : 3 Verbindungen der Erfindung : zweites therapeutisches Mittel verwenden. Wenn ein weiteres therapeutisches Mittel zugegeben wird, werden die Verhältnisse dementsprechend eingestellt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können wie folgt hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und sollen nicht als begrenzend für den Bereich ausgelegt werden.
Schema 1.
Die Zielverbindung kann gemäß dem obigen Schema hergestellt werden:
Schritt a: 2-Benzoyloxy-acetaldehyd 1 wird umgesetzt mit Methyl (R-(+)-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-carboxylat 2 in der Gegenwart von para-Toluolsulfonsäure (pTSA) unter Transketalisierung, um 2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carboxymethylester 3 als ein Gemisch von cis- und trans-Isomeren in einem Verhältnis von 3 : 1 unter Bevorzugung des cis-Isomers herzustellen.
Schritt b: Der Carbonsäuremethylester 3 wurde selektiv unter Verwendung von Lithiumhydroxid hydrolysiert, um die entsprechenden Säurederivate 4a und 4b zu ergeben. Das Gemisch wurde durch Blitzchromatographie getrennt und jedes Isomer wurde weiter unabhängig verwendet.
Schritt c: Die Carbonsäurefunktion von 4a wurde dann in eine Acetoxyaustrittsgruppe durch Behandlung mit Bleitetraacetat übergeführt.
Schritt d: Das (2R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-acetoxy 4a wurde mit silyliertem 2-Amino-6-chlorpurin unter Verwendung von Trimethylsilyltrifluormethylsulfonat (TMSTf) als Aktivator gekoppelt, um ein Gemisch von cis- und trans-Isomeren der Nukleosidanaloga 6a und 6b in einem Verhältnis von 1,2 : 1, unter Bevorzugung des cis-Isomers, zu ergeben. Das Gemisch wurde durch Blitzchromatographie aufgetrennt und jedes Isomer wurde unabhängig weiter verwendet.
Schritt e: Das (-)-(2R, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlorpurin-9'-yl)-1,3-dioxolan 6a wurde mit Cyclopropylamin in Ethanol behandelt, um das entsprechende (-)-(2R, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan 7 in guter Ausbeute zu ergeben.
Schritt f: Die Entfernung der Benzoylschutzgruppe wurde durch Behandlung mit () -(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan 7 mit methanolischem Ammoniak erreicht, um das gewünschte Produkt (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan A in guter Ausbeute zu ergeben.
Beispiel 1. Methyl-2-(R,S)-benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-(R)-carboxylat
Zu einer Lösung von Methyl-2,3-O-isopropyliden-D-glycerat (Fluka: Katalognr. 59449), (9,76 g, 60,9 mmol, 1 Äq.) und Benzoyloxyacetaldehyd (10 g, 60,9 mmol, 1 Äq.) in Toluol (20 ml) wurde bei 80°C p-Toluolsulfonsäure (460 mg, 2,4 mmol, 4 Mol-%) zugegeben. Der Reaktionskolben wurde unter Vakuum für eine Stunde gehalten und es wurde ein Destillat (80 bis 85°C) während dieser Zeitdauer gesammelt. Der Rückstand wurde dann auf RT gekühlt und durch Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat als Eluent gereinigt, um 13,2 g (81%) der Zielverbindung als ein Gemisch von cis- und traps-Isomeren in einem Verhältnis von 3 : 1 zu erhalten.
Cis-Isomer:
¹N-NMR (CDCl₃): δ(ppm): 3,75 (s, 3H, CH ₃); 4,15 (dd, 1H, C₅-CH, 4,30 (dd, 1H, C₅-CH); 4,5 (m, 2H, CH ₂-O-CO-C₆H₅); 4,7 (m, 1H, C₄-CH); 5,4 (t, 1H, C₂-CH); 7,45–8,1 (m, 5H, Ar-CH).
Trans-Isomer:
¹H-NMR (CDCl₃): δ(ppm): 3,8 (s, 3H, CH ₃); 4,1 (dd, 1H, C₅-CH); 4,35 (dd, 1H, C₅-CH); 4,45 (m, 2H, CH ₂-O-CO-C₆H₅); 4,75 (m, 1H, C₄-CH); 5,5 (t, 1H, C₂-CH); 7,45–8,1 (m, 5H, Ar-CH).
BEISPIEL 2 (2R, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure. (2S, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure.
Zu einer Lösung von Methyl-2-(R,S)-benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-(R)-carboxylat (411 g, 1,54 mmol, 1 Äq., 2 : 1-Gemisch von cis- und traps-Isomeren) in einem 1 : 1-Gemisch aus THF und Wasser wurde Lithiumhydroxid (64,8 g, 1,54 mol, 1 Äq.) portionsweise über eine Dauer von 30 min. zugegeben, wobei die Reaktionsgefäßtemperatur unter 30°C gehalten wurde. Nach 90 min. wurde THF im Vakuum entfernt und die wässrige Lösung wurde auf einen pH-Wert von 2,5-3,2 durch tropfenweise Zugabe von 30%-iger (Gew/Gew) Schwefelsäure angesäuert. Die resultierende Lösung wurde mit Dichlormethan (4 × 400 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 380 g dunkles Öl zu ergeben. Die Isomere wurden durch Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von 2%-iger Essigsäure in Dichlormethan getrennt, um 220 g des cis-Isomers (56,5%) und 116 g des traps-Isomers (30%) zu erzeugen. Jedes der Isomere wurde unabhängig für den nächsten Schritt verwendet.
Cis-Isomer:
(2R, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure.
¹H-NMR (CDCl₃): δ (ppm): 4,2 (t, 1H, C₅-H); 4,4 (m, 1H); 4,5 (m, 1H); 4,7 (m, 2H); 5,4 (t, 1H, C₂-CH); 7,45–8,1 (m, 5H, Ar-CH); 7,2–8,0 (bs, 1H, COOH).
Trans-Isomer:
(2S, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure.
¹H-NMR (CDCl₃): δ(ppm): 4,15 (dd, 1H, C₅-H); 4,4 (t, 1H, C₅-H); 4,45 (m, 2H, CH ₂-OCOC₆H₅); 4,8 (dd, 1H, C₄-CH); 5,6 (t, 1H, C₂-CH); 7,45–8,1 (m, 5H, Ar-CH); 8,3–8,8 (bs, 1H, COOH).
BEISPIEL 3 (2R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(R,S)-acetoxy-1,3-dioxolan
Zu einer Lösung von (2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure (130 g, 0,515 mol, 1 Äq.) und Pyridin (60 ml, 0,741 mol, 1,44 Äq) in Acetonitril wurde bei 4°C Bleitetraacetat (Reinheit (Assay) 95%, 300 g, 0,678 mol, 1,25 Äq.) über eine Dauer von 20 min gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren für 18 Stunden bei RT gehalten. Die anorganischen Bestandteile wurden durch Filtration entfernt, das Filtrat wurde auf eine gesättigte Lösung von Natriumbicarbonat (2 l) gegeben, gefolgt von der Zugabe von festem Natriumbicarbonat (pH-Wert = 7–8). Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (3 × 400 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde konzentriert und durch Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Hexanen/Ethylacetat als Eluent gereinigt, um 93,5 g (68%) der Zielverbindung als ein Gemisch von cis- und trans-Isomeren in einem Verhältnis von 2 : 1 zu erhalten. Das Gemisch wurde für den nächsten Schritt verwendet.
Cis/trans-Isomere:
¹H-NMR (CDCl₃): δ(ppm): 2,0, 2,15 (s, 3H, CH ₃); 4,05–4,45 (m, 4H, CH); 5,45, 5,55 (t, 1H, C₂-CH); 6,4, 6,45 (dd, 1H, C₄-CH); 7,45–8,1 (m, 5H, Ar-CH).
BEISPIEL 4. (2R,4R)- und (2R,4S)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlorpurin-9'-yl)-1,3-dioxolan.
2-Amino-6-chlorpurin (4,15 g, 1,3 Äq.) in 50 ml Hexamethyldisilazan (HMDS), enthaltend 100 mg Ammoniumsulfat, wurde unter Rückfluss für 3 h erhitzt, wonach die klare Lösung bis zur Trockene im Vakuum eingedampft wurde. Der Rückstand wurde in 100 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst. (2R)-2-Benzoyloxymethyl-4-acetoxy-1,3-dioxolan (5 g) wurde durch zweimaliges Coverdampfen mit Benzol (2 × 30 ml) getrocknet und in 100 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst. Die Lösung wurde das Reaktionsgefäß übergeführt, das silylierte 2-Amino-6-chlorpurin-Lösung enthielt. Das Gemisch wurde in einem auf 60°C vorgeheizten Ölbad für 15 Minuten angeordnet, gefolgt von der Zugabe von Trimethylsilyltriflat (TMS-Tf, 3,8 ml, 1,1 Äq.). Das Gemisch wurde unter Rückfluss unter Stickstoff für 3 h erhitzt und die Lösung wurde braun. TLC (Hex : EtOAc 7 : 3 für Zucker und Hex : EtOAc 1 : 4 für Produkt) zeigte eine abgeschlossene Reaktion mit dem Verschwinden von Zucker und dem Vorliegen von zwei gut getrennten Flecken für cis- und trans-Produkt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, in eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung (100 ml) gegossen und für 10 Minuten gerührt. Die organische Schicht wurde gesammelt und die wässrige Schicht wurde zweimal mit Methylenchlorid (2 × 50 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wurde mit Wasser, Salzlösung gewaschen und über MgSO₄ auf herkömmliche Art getrocknet und Lösungsmittel wurde bis zur Trockene verdampft, um einen Schaum (7 g) zu ergeben. H-NMR des Rohprodukts zeigte eine saubere Reaktion mit cis- und trans-Produkten in einem Verhältnis von 1,2 : 1 unter Bevorzugung des cis-Isomers. Das Rohprodukt wurde auf Silikagel unter Verwendung eines Gradienten von Hexan : Ethylacetat 7 : 3, 1 : 1 und 2 : 3 als Eluent gereinigt, um 2,5 g trans-Isomer (weniger polar, α-Anomer) als ein Schaum, welcher in EtOH kristallisiert wurde, und 3 g cis-Isomer (polarer, β-Anomer) als ein Schaum, welcher in EtOH kristallisiert wurde, und 0,3 g Gemisch aus cis und trans, wobei cis im Überschuss war als ein Schaum für eine Gesamtausbeute von 82% zu erhalten.
Trans-Isomer:
(+)-(2R,4S)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Rf: 0,40 (Hexan-EtOAc 3 : 7)
[α_D] +21,16° (c 0,293 in CH₂Cl₂)
¹H-NMR (CDCl₃): δ(ppm): 4,45–4,55 (m, 4H; C₅-H₂, C₂-CH₂-OBz), 5,16 (b, 2H, NH₂), 5,83 (t, 1H, C₂-H, J = 3,8 Hz), 6,39 (dd, 1H, C₄-H), 7,45 (t, 2H, aromatisch), 7,62 (t, 1H, aromatisch), 7,92 (s, 1 H, C_8'-8), 8,10 (d, 2H, aromatisch).
U. V.: (CH₃OH) λ_max: 312 nm
Cis-Isomer:
(-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Rf: 0,26 (Hexan-EtOAc 3 : 7)
[α_D] –87,7° (c 0,2565 in CH₂Cl₂)
¹H-NMR (CDCl₃): δ(ppm): 4,25–4,33 dd, 1H, C5-H), 4,60–4,64 (m, 3H; C₅-H und C₂-CH₂-OBz), 5,17 (b, 2H, NH₂), 5,42 (t, 1H, C₂-H, J = 3,5 Hz), 6,33 (dd, 1H, C₄-H), 7,45 (t, 2H, aromatisch), 7,62 (t, 1H, aromatisch), 7,95 (d, 2H, aromatisch), 8,05 (s, 1H, C_8'-8).
U. V.: (CH₃OH) λ_max: 312 nm.
BEISPIEL 5. (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Zu einer Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (600 mg) in Ethanol (30 ml) wurde Cyclopropylamin (2 ml, = 18 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde vorsichtig unter Rückfluss (80–85°C) für 18 h erhitzt und auf Raumtemperatur gekühlt. Lösungsmittel wurde zur Trockene im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst, mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, Wasser, Salzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde auf Silikagel unter Verwendung von EtOAc : MeOH als Eluent gereinigt, um das gewünschte Produkt als einen Schaum in 80% Ausbeute (506 mg) zu ergeben.
Rf: 0,26 (CH₂Cl₂ : McOH 95 : 5)
[α_D] –67,7° (c 0,2565 in CH₂Cl₂)
¹N-NMR (CDCl₃): δ(ppm): 0,64–0,68 (m, 2H, CH₂ von Cyclopropyl), 0,91–0,96 (m, 2H, CH₂ von Cyclopropyl), 3,06 (b, 1H, CH von Cyclopropyl), 4,27–4,30 (dd, 1H, C₅-H), 4,54–4,57 (dd, 1H; C₅-H) 4,60 (t, 2H, C₂-CH₂-OBz), 5,37 (b, 2H, NH₂), 5,42 (t, 1 H, C₂-H), J = 3,5 Hz), 6,28 (b, 1H, NH), 6,35 (dd, 1H, C₄-H), 7,45 (t, 2H, aromatisch), 7,58 (t, 1H, aromatisch), 7,77 (s, 1H, C_8'-8), 8,01 (d, 2H, aromatisch).
U. V.: (CH₃OH)λ_max: 283 und 260 nm.
BEISPIEL 6. (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (Verbindung A)
Eine Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (480 mg) in 30 ml gesättigtem methanolischem Ammoniak wurde bei Raumtemperatur für 18 h gerührt. Das Gemisch wurde bis zur Trockene im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml Wasser gelöst, zweimal mit 10 ml Methylenchlorid gewaschen und lyophilisiert, um 283 mg weißen Feststoff in 80% Ausbeute zu ergeben.
Rf: 0,26 (CH₂Cl₂ : MeOH 9 : 1)
[α_D] –35,9° (c 0,334 in MeOH)
¹H-NMR (DMSO_d-6): δ(ppm): 0,55 (m, 2H, CH₂ von Cyclopropyl), 0,95 (m, 2H, CH₂ von Cyclopropyl), 3,15 (b, 1H, CH von Cyclopropyl), 3,80 (m, 2H, CH₂OH), 4,30 (dd, 1H, C₅-H), 4,55 (dd, 1H; C₅-H), 5,08 (t, 1H, C₂-H), 5,17 (b, H, OH), 6,15 (b, 2H, NH₂), 6,52 (dd, 1H, C₄-H), 7,72 (b, 1H, NH), 8,12 (s, 1H, C_8'-8).
U. V.: (CH₃OH) λ_max: 283 und 260 nm.
BEISPIEL 7. (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Zu einer Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (250 mg) in Ethanol (25 ml) wurde Cyclobutylamin (0,17 ml, = 3 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde vorsichtig unter Rückfluss (80–85°C) für 18 h erhitzt und auf Raumtemperatur gekühlt. Lösungsmittel wurde bis zur Trockene im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst, mit gesättigter NaHCO₃-Lösung, Wasser, Salzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde auf Silikagel unter Verwendung von EtOAc : MeOH 95 : 5 als Eluent gereinigt, um das gewünschte Produkt als ein Schaum mit 84% Ausbeute (230 mg) zu ergeben.
Rf: 0,31 (CH₂Cl₂ : McOH 95 : 5)
[α_D] –62,5° (c 0,4925 in CH₂Cl₂)
¹H-NMR (CDCl₃): δ(ppm): 1,74–1,78 (m, 2H, CH₂ von Cyclobutyl), 1,95–2,00 (m, 2H, CH₂ von Cyclobutyl), 2,43–2,45 (m, 2H, CH₂ von Cyclobutyl), 4,27–4,30 (dd, 1H, C₅-H), 4,54–4,57 (dd, 1H, C₅-H), 4,59 (t, 2H, C₂-CH₂-OBz), 4,75 (b, 1H, CH von Cyclobutyl), 5,37 (b, 2H, NH₂), 5,41 (t, 1H, C₂-H, J = 3,6 Hz), 6,00 (b, 1H, NH), 6,35 (dd, 1H, C₄-H), 7,45 (t, 2H, aromatisch), 7,58 (t, 1H, aromatisch), 7,75 (s, 1H, C_8'-8), 8,01 (d, 2H, aromatisch).
U. V.: CH₃OH λ_max: 283 und 263 nm.
Beispiel 8. (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (Verbindung B)
Eine Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan (214 mg) in 20 ml gesättigtem methanolischem Ammoniak wurde bei Raumtemperatur für 18 h gerührt. Das Gemisch wurde bis zur Trockene im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in 20 ml Wasser gelöst, zweimal mit 10 ml Ether gewaschen und bis zur Trockene unter Coverdampfung mit Ethanol eingedampft, um 154 mg reines Produkt als ein Schaum in 96% Ausbeute zu erhalten.
Rf: 0,52 (CH₂Cl₂ : MeOH 9 : 1)
[α_D] –29,04° (c 0,396 in MeOH)
¹N-NMR (DMSO_d-6): δ(ppm): 1,61 (m, 2H, CH₂ von Cyclobutyl), 2,06 (m, 2H, CH₂ von Cyclobutyl), 2,18 (m, 2H, CH₂ von Cyclobutyl), 3,58 (m, 2H, CH₂OH), 4,17 (dd, 1H, C₅-H), 4,40 (dd, 1H, C₅-H), 4,90 (b, 1H, CH von Cyclobutyl), 5,01 (t, 1H, C₂-H), 5,42 (b, H, OH), 5,87 (b, 2H, NH₂), 6,19 (dd, 1H, C₄-H), 7,62 (b, 1H, NH), 7,85 (s, 1H. C_8'-8).
U. V.: (CH₃OH) λ_max: 283 und 260 nm.
BEISPIEL 9. (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-{1-carbonsäurecyclopropylamino}-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (Verbindung C)
Zu einer Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (210 mg) in Ethanol (30 ml) wurde 1-Amino-2-cyclopropancarbonsäure (113 mg = 2 Äq.) und Triethylamin (0,2 ml, 2,5 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde vorsichtig unter Rückfluss (80 bis 85°C) für 72 h erhitzt und auf Raumtemperatur gekühlt. Lösungsmittel wurde bis zur Trockene im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in methanolischem Ammoniak (20 ml) gelöst und über Nacht gerührt. Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde auf Silikagel unter Verwendung eines Gradienten von CH₂Cl₂: MeOH 95 : 5 bis 9 : 1 gereinigt, um Nebenprodukt zu entfernen und letztendlich wurde das gewünschte Produkt mit CH₂Cl₂ : MeOH 4 : 1, enthaltend 0,5 Essigsäure, eluiert. Es ergaben sich 80 mg reines Produkt (42,5% Ausbeute).
Rf: 0,34 (CH₂Cl₂ : MeOH 4 : 1, enthaltend 0,5% AcOH)
¹H-NMR (DMSO_d6): δ(ppm): 1,05 (b, 2H, CH₂ von Cyclopropyl), 1,45 (b, 2H, CH₂ von Cyclopropyl), 3,58 (b, 2H, CH₂-OH), 4,17 (dd, 1H, C₅-H), 4,41 (dd, 1H; C₅-H), 5,12 (t, 1H, C₂-H), 5,15 (b, 1H, OH), 5,82 (b, 1H, NH), 6,19 (dd, 1H, C₄-H), 7,71 (b, H, NH), 7,86 (s, 1 H, C_8'-8).
U. V.: (CH₃OH) λ_max 283 und 264 nm.
BEISPIEL 10.
ANTI-HIV-WIRKSAMKEIT
ANTIVIRUS ASSAYS. Die Anti-HIV-1-Wirkung der Verbindung A(-) wurde unter Verwendung von HIV-1_IIIB in mehreren Zelltypen untersucht, wie früher beschrieben (Gu et al., 1992, 1994, 1999; Rando et al., 1995; Salomon et al., 1994). Kurz gesagt, wurden Zellen mit Virus mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,005 für T-Zellen-Assays und einem MOI von 0,5 für Monozytenzellen-Assays für 3 h inkubiert. Ungebundener Virus wurde dann durch Waschen der Zellen entfernt, gefolgt von einem Aussäen der Zellen in eine Platte mit 96 Vertiefungen. Die infizierten Zellen wurden in der Gegenwart mehrerer Konzentrationen der Testverbindung für 5 bis 7 Tage gezüchtet. Die Anti-HIV-1-Wirksamkeit wurde durch Testen der HIV-1 RT Aktivität oder des p24-Gehalts in den Zellkulturüberständen bestimmt. Alle Assays wurden zweifach durchgeführt. Zidovudine und/oder Lamivudine wurden als Kontrollen in jedem Versuch verwendet.
Vergleich der Verbindung A(-) mit anerkannten Anti-HIV-Mitteln. Die Verbindung A(-) wies 0,083 μm EC₅₀ gegen HIV-1_IIIB in MT-2-Zellen auf, was dem gleichen Grad Anti-HIV-1-Aktivität entspricht wie Lamivudine, Stavudine, Zalcitabine und Abacavir, jedoch weniger Aktivität als Zidovudine (Tabelle 1).
Tabelle 1. Vergleich der Anti-HIV- Aktivität der Verbindung A(-) mit anerkannten antiretroviralen Mitteln (bestimmt durch RT-Aktivität)
Aktivität der Verbindung A(-) gegen HIV-1 in verschiedenen Zellen. Anti-HIV-1- Aktivität der Verbindung A(-) wurde in verschiedenen Zelltypen getestet, einschließlich humanen periphären Monozytenzellen (PBMC), T-Zell- (MT-2 und MT-4) und Monozytenzell-(U937)-Linien. Die Verbindung A(-) hatte submikromolare EC₅₀ gegen HIV-1_IIIB in verschiedenen getesteten Zelltypen (Tabelle 2).
Tabelle 2. Anti-HIV-1-Wirksamkeit der Verbindung A(-) in verschiedenen Zelltypen (bestimmt durch RT-Aktivität).
Darüber hinaus wurde die antiretrovirale Aktivität der Verbindung A(-) ebenfalls unter Verwendung verschiedener Typen von HIV-1-Stämmen beurteilt. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigten, dass Verbindung A(-) wirksam gegen Nicht-Syncytium-induzierende (HIV-1-₉₈₈₁)-, dual-tropische (HIV-1_macBAL) und monocytropische (HIV-1_WRM8488)-Stämme waren.
Tabelle 3. Anti-HIV- Aktivität der Verbindung A(-) gegen verschiedene Typen von HIV-Stämmen (bestimmt durch p24)
Beispiel 11.
TOXIZITÄTSBEURTEILUNG
Die Zelltoxizität der Verbindungen wurde an verschiedenen Zellen unter Verwendung der [³H]-Thyimdin-Aufnahme beurteilt. Verschiedene Zellen, einschließlich Molt-4, HT1080, DU-145, HepG-2 und HSF wurden in einer Konzentration von 1–2 × 10³ Zellen pro Vertiefung (Platten mit 96 Vertiefungen) plattiert. Nach 24 h Inkubationsdauer wurden 10-fach-Verdünnungsreihen der Verbindungen (10^–4 M bis 10^–10 M) zu dem Kulturmedium gegeben und die Zellen wurden weiter für 72 h inkubiert. [³H]-Thymidin wurde während der letzten 18 h Inkubationsdauer zugegeben. Nach Inkubation mit dem [³H]-Thymidin wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit Trypsin behandelt wenn die Zellen klebrig waren und dann in Wasser resuspendiert (hypotonisches Lysieren von Zellen). Der Zellextrakt wurde direkt in einen Tomtec Harvester 96 übergeführt. Unter Verwendung dieses Geräts wird die extrahierte DNA auf Filter adsorbiert, gewaschen und das eingebaute [³H]-Thymidin wird dann gezählt. Die 50%-Cytotoxizitätskonzentration (CC₅₀) wurde durch Vergleich der Radioaktivitätszählungen pro Minute der Proben in der Gegenwart der Verbindungen gegenüber der Kontrolle bestimmt.
Die Zelltoxizität der Verbindungen wurde auch mit WST-1-Färben durch Beurteilen der Proliferation von MT-2, H9, Jurkat, U937 und CBMCs bestimmt. Die etablierten Zelllinien wurden in RPMI-Medium in Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung gezüchtet, während CBMCs in einer Konzentration von 0,05 × 10⁶/Vertiefung plattiert wurden. Eine 10-fach-Reihenverdünnung der Verbindung (10^–4–10^–7 M) wurde am Tag Null zugegeben. Am Tag 4 wurden die Zellen passagiert durch Austauschen des Halbmediums, das geeignet verdünnte Verbindung enthielt. Die Zellaktivitäten wurden am Tag 7 unter Verwendung des WST-1-Reagenz (Boehringer Mannheim) unter Befolgung des vom Hersteller bereitgestellten Protokolls beurteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4 Toxizität
Beispiel 12
VORBEREITENDE PHARMAKOKINETISCHE UNTERSUCHUNGEN
Die Bioverfügbarkeit der Verbindungen wurde in männlichen erwachsenen Ratten beurteilt, die eine Dosis intravenös über die Schwanzvene (5 mg/kg) und oral (20 mg/kg) zugeführt bekamen. Die Plasmaproben wurden 2, 5, 15, 30, 60, 90, 120 und 240 Minuten nach intravenösem Zudosieren und 5, 15, 30, 60, 90, 120, 240 und 360 Minuten nach oralem Zudosieren gesammelt.
Experimentelle Verfahren
Plasmaherstellung
Blutproben (1 ml) wurden aus den Rattenschwänzen in einem EDTAenthaltenden (3 ml) Vakuumbehältnis (Vacutainer) sowohl für iv- als auch po-Verabreichungen gesammelt. Plasmaproben wurden durch Zentrifugieren bei 2000 × g für 15 Minuten bei 4°C hergestellt.
HPLC-Analyse
Analytische Bedingungen:

HPLC-System: Zwei Waters 616 Pumpensysteme und zwei Alliance 2690 Systeme mit PDA 996,
Säule: Phenomenex Luna C18 (2), 5 μm, 250·4,6 mm,
Gradient: 0–35% Lösungsmittel A in 20 Minuten. Lösungsmittel A enthält Acetonitril mit 0,01% TFA und Lösungsmittel B enthält Millipore Wasser (0,25 μm Filter) mit 0,01% TFA,
Flussrate: 1,0 ml/min, UV: 200 bis 350 nm.

Festphasenextraktion:
Plasmaproben (verdünnt auf 1 ml mit Wasser) wurden auf das Abselut Nexus Sorbens (Nr. 1210–3100) aufgebracht und unter geringem Vakuum (ungefähr 5 Zoll Hg oder 16,93 kPa) durchgezogen. Ein Milliliter entionisiertes Wasser wurde zu dem Sorbens zugegeben und unter Vakuum durchgezogen. Die Extraktionssäule wurde für 1 Minute unter Verwendung eines Hochvakuums (> 10 mmHg oder 33,86 kPa) getrocknet. Ein Milliliter Methanol wurde zu der Abselut Nexus Säule gegeben und der Eluent wurde mit 1 bis 2 ml/min gesammelt. Der Eluent wurde bis zur Trockene unter Verwendung eines Speed Vac eingedampft und die Proben wurden in 120 μl H₂O rekonstituiert; 100 μl wurden zur Injektion verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben.
Tabelle 5. PK und orale Bioverfügbarkeit (BA)
BEISPIEL 14
ARZNEIMITTELRESISTENZPROFILE DER VERBINDUNG A(-)
Rekombinante HIV-1-Varianten wurden hergestellt durch Einbringen der angegebenen Mutationen in HXB2-D durch ortsspezifische Mutagenese, wie beschrieben (Gu et al. 1992, 1994). Die Virusausgangsmaterialien (virus stocks) wurden durch Transfizieren von MT-4-Zellen mit infektiösen viralen DNA-Konstrukten hergestellt. Antivirale Aktivität der Verbindung A(-) wurde wie in Beispiel 10 beschrieben, bestimmt. Die Verbindung A(-) zeigte leicht erniedrigte Aktivität gegen HIV-1-Varianten, die K65R- und/oder M184V-Mutation in der reversen Transkriptase aufweisen, blieben jedoch wirksam gegenüber anderen Varianten, die resistent gegenüber Zidovudine, Nicht-nukleosidische Inhibitoren und Proteaseinhibitoren waren (Tabelle 6).
Tabelle 6. Wirksamkeit der Verbindung A(-) gegenüber rekombinanten Arzneimittel-resistenten HIV-1-Varianten (bestimmt durch RT-Aktivität)
BEISPIEL 15
WIRKSAMKEIT DER VERBINDUNG A(-) GEGEN KLINISCHE HIV-1-ISOLATE.
Klinische Stämme wurden aus PBMCs von HIV-1 infizierten Individuen durch Co-Kultur mit PBMCs aus normalen Donoren isoliert. Um den RT-Genotyp der klinischen HIV-1-Isolate zu bestimmen, wurde die provirale DNA aus infizierten CD4* T-Zellen oder PBMCs extrahiert und die kompletten RT-codierenden Regionen wurden durch PCR, wie früher berichtet (Gu et al., 1992) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und dann direkt unter Verwendung von Primer RTS (5'-CCAAAAGTTAAACAATGGC-3') sequenziert, welcher am 5'-Teil der RT-codierenden Region lokalisiert ist (Nukleotid 2603–2621 von HXB2-D-Koordinaten). Antivirale Aktivität wurde wie in Beispiel 10 beschrieben, beurteilt.
Tabelle 7. Aktivität der Verbindung A(-) gegen klinische HIV-1-Isolate (bestimmt durch RT-Aktivität).
Tabelle B. Aktivität der Verbindung A(-) gegen Arzneimittel-resistente klinische Isolate in PBMCs (bestimmt durch p24)
BEISPIEL 16.
ARZNEIMITTELKOMBINATIONSWIRKUNGEN
Kombinationswirkungen der Vebindung A(-) mit Anti-HIV-1-Mitteln wurden in MT-2 oder PBMCs unter Verwendung von HIV-1_IIIB beurteilt. Die Kombinationen wurden durchgeführt unter Verwendung eines Damebrett-Kreuzmusters von Arzneimittelkonzentrationen. Die antiviralen Wirkungen wurden bestimmt durch Beobachten der RT-Aktivität in den Kulturüberständen. Die Daten wurden gemäß dem von Chou und Talalay (Chou und Talalay, 1984) und Prichard (Prichard et al., 1993) beschriebenen Verfahren analysiert. Die Kombinationsindizies (CI) der Verbindung A(-)M mit anderen Anti-HIV-1-Mitteln wurden unter Verwendung einer CalcuSyn-Software (Biosoft, Cambridge, UK) berechnet. Theoretisch zeigt ein CI-Wert von 1 eine Additivwirkung, ein CI-Wert von > 1 zeigt Antagonismus und ein CI-Wert von < 1 zeigt Synergismus. AcSynergy II Software wurde verwendet, um Synergie- oder Antagonist-Ausmaße für die Arzneimittelkombination zu berechnen.
Tabelle 9. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und Zidovudine in MT-2-Zellen
Tabelle 10. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und AZT (Zidovudine) in PBMCs
Tabelle 11. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und (Lamivudine) in MT-2-Zellen
Tabelle 12. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und Stavudine (d4T) in MT-2-Zellen
Tabelle 13. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und Nevirapine in MT-2-Zellen
BEISPIEL 17.
ZYTOTOXIZITÄTSANALYSE
Zelltoxizität wurde durch [³H]Thymidinaufnahme (de Muys et al., 1999) und WST-1-Färben beurteilt. In den [³H]Thymidinaufnahmeversuchen wurden Molt-4, HT1080, DU-145, HepG2 und HSF in einer Konzentration von 1–2 × 10³ Zellen pro Vertiefung (Platte mit 96 Vertiefungen) plattiert. PHA-stimulierte PBMCs wurden in einer Konzentration von 4 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung gezüchtet. Nachfolgend auf eine 24 h Vorinkubationsperiode wurden Testverbindungen (10^–4 M bis 10^–10 M) zugegeben und die Zellen wurden für zusätzliche 72 h inkubiert. [³H]Thymidin wurde während der letzten 18 h Inkubationsperiode zugegeben. Die Zellen wurden dann einmal mit PBS gewaschen, mit Trypsin behandelt, falls die Zellen anhaftend waren, und in Wasser resuspendiert (hypotonisches Lysieren von Zellen). Der Zellextrakt wurde direkt in einen Tomtec Harvester 96 gegeben. Die 50%-Zytotoxizitätskonzentration (CC₅₀) wurde durch Vergleichen der Radioaktivitätszählungen pro Minute, die von Arzneimittelgetesteten Proben erhalten wurden, mit denjenigen, die von den Kontroll(unbehandelten) Zellen erhalten wurden, bestimmt.
In den WST-1-Färbeversuchen wurden Zelllinien in RPMI-Mediumplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung gezüchtet bzw. kultiviert. CBMs wurden in einer Konzentration von 0,5 × 10⁶/Vertiefung platiert. Verbindungen (10^–4–10^–7 M) wurden am Tag null zugegeben. Zelllebensfähigkeit wurde am Tag 7 unter Verwendung des WST-1-Reagenz (Boehringer Mannheim) unter Befolgung des vom Hersteller bereitgestellten Protokolls beurteilt.
Die Verbindung A(-) hatte viel weniger Zytotoxizität als Zidovudine und Zalcitabine in den verschiedenen Zelltypen, die sowohl durch [³H]Thymidineinbau als auch WST-1-Färben beurteilt wurden (Tabelle 14).
Tabelle 14. Zytotoxizität der Verbindung A(-)
BEISPIEL 18.
MITOCHONDRIEN-DNA-TOXIZITÄTS-ASSAY
Mitochondrien-DNA(mtDNA)-Toxizität der Verbindung A(-) wurde in HepG2-Zellen getestet. Die Zellen wurden für 28 Tage unter der Verbindungsbehandlung gezüchtet. Die Zellen wurden einmal pro Woche passagiert. Jedoch das Zellkulturmedium, das die richtige Konzentration der Verbindung enthielt, wurde zweimal pro Woche gewechselt. Zalcitabine wurde als eine Kontrolle verwendet. Die Toxizität wurde durch Messen des Gehaltsverhältnisses von mtDNA und Kern-DNA (28s rDNA) durch einen Southern Hybridisierungsassay (de Muys et al., 1999) bestimmt. Die Verbindung A(-) zeigte keine signifikante mtDNA-Toxizität bis zur höchsten getesteten Konzentration von 100 μm (1).
BEISPIEL 19.
PHARMAKOKINETISCHE UNTERSUCHUNG DER VERBINDUNGEN DER ERFINDUNG
Verbindung A(-), DAPD und DXG wurden als eine Einzeldosis verabreicht, entweder intravenös durch die Drosselvene mit 10 mg/kg oder oral mit 20, 125, 500, 1000 oder 2000 mg/kg. Alle Ratten wurden für 12 Stunden vor der po-Dosierungsbehandlung nüchtern gehalten. Das sowohl für iv- als auch po-Verabreichungen verwendete Vehikel war 0,1% Carboxymethylcellulose und 0,1 % Tween[Marke] 80 in destilliertem Wasser, angesäuert auf einen pH-Wert von 3,15 mit 1 N HCl. Blutproben wurden den Ratten zu den in unten angegebenem Schema für alle oralen Dosen entnommen. Für insgesamt 10 Ratten für jede Verabreichung wurden sieben Zeitpunkte für die intravenöse Dosierung durch die Drosselvene (2, 5, 15, 30, 60, 120 und 240 min) und für die orale Dosierung (5-360 min) mit 20 mg/kg verwendet, während zwei zusätzliche Zeitpunkte bei 480 und 1440 Minuten für die oralen Dosen von 125 bis 2000 mg/kg verwendet wurden. Für jeden Zeitpunkt lagen 4 Ergebnisse vor, ausgenommen für den Zeitpunkt von 1440 Minuten als Blutproben durch die Drosselvene von allen Raten vor dem Opfern entnommen wurden.
Experimentelle Verfahren
Plasmaherstellung
Blutproben (1 ml) wurden aus den Rattenschwänzen in einem Vakuumbehälter mit EDTA (3 ml) gesammelt, sowohl für iv- als auch po-Verabreichungen. Plasmaproben wurden durch Zentrifugieren bei 2000 × g für 15 Minuten bei 4°C hergestellt.
HPLC-Analyse
Analytische Bedingungen:

Festphasenextraktion:
Plasmaproben (verdünnt auf 1 ml mit Wasser) wurden auf das Abselut Nexus Sorbens (Nr. 1210–3100) aufgebracht und unter geringem Vakuum (ungefähr 5 Zoll Hg) durchgezogen. Ein Milliliter entionisiertes Wasser wurde zu dem Sorbens zugegeben und unter Vakuum durchgezogen. Die Extraktionssäule wurde für 1 Minute unter Verwendung eines Hochvakuums (> 10 Zoll Hg oder 33,86 kPa) getrocknet. Ein Milliliter Methanol wurde zu der Abselut Nexus Säule gegeben und der Eluent wurde mit 1 bis 2 ml/min gesammelt. Der Eluent wurde bis zur Trockene unter Verwendung eines Speed Vac eingedampft und die Proben wurden in 120 μl H₂O rekonstituiert; 100 μl wurden zur Injektion verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 und 16 angegeben.
Tabelle 15: PK-Parameter für Verbindung A(-) nachfolgend auf iv- (10 mg/kg) oder po- (20 mg/kg) Verbreichung in Ratten
Tabelle 16 PharmaKokinetische Parameter von DAPD & DXG in männlichen und weiblichen Ratten nach iv- oder po-Verabreichung von DAPD
Unten sind die vollständigen Literaturstellen, die in der Anmeldung zitiert werden, aufgeführt:

1 De Muys, J. -M., H. Gourdeau, N. Nguyen-Ba, D. T. Taylor, P. S. Ahmed, T. Mansour, C. Locas, N. Richard, M. A. Wainberg und R. F. Rando. 1999. Antihuman immunodeficiency virus type 1 activity, intracellular metabolism, and pharmacokinetic evaluation of 2'-deoxy-3'-oxa-4'-thiocytidine. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 1835–1844.
2 Gu, Z., Q. Gao, M. A. Parniak, and M. A. Wainberg. 1992. Novel mutation in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase gene that encodes cross-resistance to 2',3'-dideoxyinosine and 2',3'-dideoxycytidine. J. Virol. 66: 12–19.
3 Gu, Z., Q. Gao, H. Fang, N. Salomon, M. A. Parniak, E. Goldberg, J. Cameron, and M. A. Wainberg. 1994a. Identification of a mutation at codon 65 in the IKKK motif of reverse transcriptase that encode human immunodeficiency virus resistance to 2',3'-dideoxycytidine and 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine. Antimicrob. Agents Chemother. 38: 275–281.
4 Gu, Z., M. A. Wainberg, N. Nguyen-Ba, L. L'Heureux, J. -M. De Muys, T. L. Bowlin, and R. F. Rando. 1999. Mechanism of action and in vitro activity of 1',3'-dioxolanylpurine nucleoside analogues against sensitive and drugresistant human immunodeficiency virus type 1 variants. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 43: 2376–2382.
5 Chou, T. C., and p Talalay. 1984. Quantitative analysis of dose effect relationships : the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 22: 27–55.
6 Prichard, M. N., L. E. Prichard, and C. Shipman, Jr. 1993. Strategic design and three-dimentional analysis of antiviral drug combinations. Antimicrob. Agents Chenmother. 37: 540–545.
7 Rando, R., J. Ojwang, A. Elbaggari, G. R. Reyes, R. Tinder, M. S. McGrath, and M. E. Hogan. 1995. Suppression of human immunodeficiency virus type 1 activity in vivo by oligonucleotide which form intramolecular tetrads. J. Biol. Chem. 270: 1754–1760.
8 Salomon, H., A. Belmonte, K. Nguyen, Z. Gu, M. Gelfand and M. A. Wainberg. 1994. Comparison of cord blood and peripheral blood mononuclear cells as targets for viral isolation and drug sensitivity studies involving human immunodeficiency virus type 1. J. Clin. Microbiol. 32: 2000-2002.

Claims

Cis-Nukleosid der Formel (I):
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, worin n 1 oder 2 ist, R₄ ausgewählt ist aus H, COOH, CONH₂, OH, SH, NH₂, NO₂, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, Halogen, COR_a, worin R_a ein C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl ist, und COOR_b, worin R_b ein C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl oder C_2-6-Alkinyl ist; R₃ H oder ein C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl ist; X ausgewählt ist aus H, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Carbonyl, das mit C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl, C_6-10-Aryl substituiert ist, oder
worin jedes Rc unabhängig ausgewählt ist aus H, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl oder einer Hydroxyschutzgruppe; und worin das Nukleosid in der Form des (–)-Enantiomers, (+)-Enantiomers und Gemischen davon, einschließlich racemischer Gemische, ist.
Nukleosid nach Anspruch 1, worin das Nukleosid in der (-)-Form vorliegt und mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 97% und bevorzugter mindestens 99% frei von der (+)-Form ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin die Hydroxyschutzgruppe ausgewählt ist aus Acetyl-2-thioethylester, Pivaloyloxymethylester oder Isopropyloxycarbonyloxymethylester.
Verbindung nach Anspruch 1, worin X H ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin n 1 ist.
Verbindung nach Anspruch 5, worin R₃ H oder Methyl ist oder R₄ H ist.
Verbindung nach Anspruch 5, worin R₄ H, COOH; CONH₂; C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl oder COR_b ist, worin R_b ein C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, C_2-6-Alkinyl ist.
Verbindung nach Anspruch 5, worin R₄ Methyl, Ethyl oder COOH ist.
Verbindung nach Anspruch 5, worin R₃ und R₄ H sind.
Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan und pharmazeutisch verträglichen Salzen davon, cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-[1-Carbonsäurecyclopropylamino]-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan und pharmazeutisch verträglichen Salzen davon, (+)-(2S,4S)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan, das zumindest 97% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer ist, (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan, das zumindest 97% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer ist, (+)-(2S,4S)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan, das zumindest zu 97% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer ist, (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-[1-carbonsäurecyclopropylamino]-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan, das zumindest zu 97 % frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer ist, und (+)-(2S,4S)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-[1-carbonsäurecyclopropylamino]-purin-9'-yl(-1,3-dioxolan, das zumindest zu 97% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer ist.
Verbindung nach Anspruch 1, welche cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan ist oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Verbindung nach Anspruch 1, welche (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan ist, das zumindest zu 97 frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer ist.
Kombinationen, die geeignet ist zur Behandlung viraler Infektionen, umfassend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon, umfassend mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Nukleosidanaloga; Nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTIs); oder Protease-Inhibitoren.
Kombination nach Anspruch 13, worin das Nukleosidanaloge ausgewählt ist aus Zidovudine, Didanosine, Zalcitabine, Stavudine oder Lamivudine.
Kombination nach Anspruch 13, worin der Nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitor ausgewählt ist aus Nevirapine, Delavirdine oder Efavirenz.
Kombination nach Anspruch 13, worin der Proteaseinhibitor ausgewählt ist aus Indinavir, Nelfinavir, Saquinavir oder Ritonavir.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Verwendung in der medizinischen Therapie, insbesondere zur Behandlung viraler Infektionen, wie etwa HIV- oder HBV-Infektionen.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung viraler Infektionen, insbesondere HIV- oder HBV-Infektionen.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 zusammen mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff.