DE69909104T2

DE69909104T2 - Neues verfahren zur herstellung von mitteln zur oberflächenbehandlung

Info

Publication number: DE69909104T2
Application number: DE69909104T
Authority: DE
Inventors: Elisabeth Scholander
Original assignee: Carmeda AB
Current assignee: Carmeda AB
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 1999-09-08
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2019-09-09
Also published as: PT1112097E; JP4152075B2; KR100669132B1; EP1112097A1; JP2003507082A; CA2342991A1; DK1112097T3; EP1112097B1; US6461665B1; BR9913516B1; KR20010088799A; ES2203177T3; WO2000013718A1; AU5765299A; NO984143L; CA2342991C; DE69909104D1; ATE243538T1; BR9913516A; NO984143D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Oberfläche eines Substrats mit verbesserter nicht-thrombogener Aktivität für Oberflächen, die für den Kontakt mit Körperflüssigkeiten oder -geweben oder Komponenten davon gedacht sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
Wenn die Oberfläche eines medizinischen Geräts, wie z. B. eines Katheterschlauches, eines Blutoxigenators, eines Stents oder dergleichen, im Körper plaziert wird oder in Kontakt mit Körperflüssigkeiten gebracht wird, werden zahlreiche unterschiedliche Reaktionen in Bewegung gesetzt, von denen einige in der Gerinnung des Blutes auf der Geräteoberfläche resultieren. Um diesem schwerwiegenden nachteiligen Effekt entgegenzuwirken, wurde seit langem das gut bekannte Antikoagulans Heparin systematisch bei Patienten angewandt, bevor medizinische Geräte in ihrem Körper plaziert oder in Kontakt mit ihren Körperflüssigkeiten gebracht wurden, um einen antithrombotischen Effekt sicherzustellen.
Thrombin ist einer von mehreren Gerinnungsfaktoren, die alle zusammenwirken, um in der Ausbildung eines Thrombus auf einer Fremd-Oberfläche in Kontakt mit Blut zu resultieren. Antithrombin ist der bedeutenste Gerinnungsinhibitor. Er neutralisiert die Wirkung von Thrombin und anderen Gerinnungsfaktoren und beschränkt oder limitiert so die Blutgerinnung. Heparin verstärkt die Rate, in der Antithrombin Gerinnungsfaktoren inhibiert, dramatisch.
Systematische Behandlung mit hohen Heparindosen ist allerdings oft mit schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden, von denen Blutungen die vorherrschenden sind. Eine andere seltene, aber schwerwiegende Komplikation der Heparinbehandlung ist die Entwicklung einer allergischen Reaktion, heparininduzierte Thrombozytopenie genannt, die sowohl zu Blutungen als auch arterieller Thrombose führen kann. Eine Heparinbehandlung erfordert ebenfalls eine häufige Beobachtung des Plasmaspiegels und entsprechende Anpassungen der Dosis. Inaktivierung des Heparins durch Protamin ist eine weitere Komplikation.
Deshalb wurden Lösungen gesucht, durch die die Notwendigkeit für eine systematische Heparinisierung des Patienten unnötig wird. Es wurde als wahrscheinlich angesehen, dass dies durch eine Oberflächenmodifikation erreicht werden kann, die die antikoagulativen Eigenschaften von Heparin nutzt. So wurden unterschiedliche Verfahren entwickelt, in denen eine Heparinschicht auf der Oberfläche des medizinischen Geräts angebracht ist, wodurch die Oberfläche nicht-thrombogen gemacht wird.
Heparin ist eine Polysaccharidverbindung, die negativ geladene Sulfatgruppen an den Saccharideinheiten trägt. Deshalb wurde eine ionische Bindung von Heparin auf polykationischen Oberflächen versucht, aber diese modifizierten Oberflächen litten unter einem Stabilitätsverlust, der in einem Funktionsverlust resultierte, weil das Heparin von der Oberfläche ausgewaschen wurde.
Danach wurden unterschiedliche Oberflächenmodifikationen hergestellt, bei denen Heparin kovalent an die Oberflächengruppen gebunden war.
STAND DER TECHNIK:
Einer der erfolgreichsten Prozesse, um ein medizinisches Gerät nicht-thrombogen zu machen, wird durch kovalente Bindung eines Heparinfragments an eine oberflächenmodifizierte Oberfläche eines medizinischen Geräts erreicht. Die allgemeine Methode und Verbesserungen davon sind in den folgenden europäischen Patenten beschrieben: EP-B-0 086 186, EP-B-0 086 187 und EP-B-0 495 820.
Diese Patente beschreiben die Herstellung von oberflächenmodifizierten Substraten, die erhalten werden durch erstens eine selektive Spaltung der Heparinpolysaccharidkette durch Oxidation mit salpetriger Säure, die zur Ausbildung von terminalen Aldehydgruppen führt. Zweitens die Einführung einer oder mehrerer die Oberfläche modifizierender Schichten, die Aminogruppen tragen, auf der Oberfläche des medizinischen Geräts und danach werden die Aldehydgruppen auf der Polysaccharidkette mit den primären Aminogruppen auf den oberflächenmodifizierten Schichten reagiert, gefolgt von einer Reduktion der intermediären Schiff'schen Basen zu stabilen sekundären Aminbindungen mit z. B. Cyanoborhydrid.
Dieses Verfahren machte es möglich, stabile und gut definierte antithrombogene, modifizierte Oberflächen für medizinische Geräte herzustellen.
Es sind viele andere Oberflächenmodifikationen bekannt, die beanspruchen, ähnliche oder sogar bessere Resultate zu erreichen, wie z. B. in EP-A-0 200 295 ( US 4 600 652 , US 6 642 242) beschrieben, basierend auf Substraten, die eine Schicht aus Polyurethanharnstoff besitzen, an die Heparin, das durch Oxidation mit salpetriger Säure oder Periodat modifiziert wurde, um Aldehydgruppen zu enthalten, durch kovalente Bindungen gebunden werden kann.
Ein ähnliches Verfahren wird in EP-A-0 404 515 beschrieben, bei dem die Substratoberfläche mit einem aminreichen fluorierten Polyurethanharnstoff vor der Immobilisierung eines antithrombogenen Wirkstoffs, wie z. B. Aldehyd-aktiviertes Heparin, beschichtet wird.
Eine andere antithrombogene Oberflächenmodifikation, die erwähnt werden kann, ist in EP-B-0 309473 beschrieben. Die Oberfläche des Geräts ist durch die Beschichtung mit einer Schicht aus Lysozym oder einem Derivat davon modifiziert, an die Heparin gebunden ist.
Eine weitere Oberflächenmodifikation für die Herstellung antithrombogener Gegenstände wird in US-PS 4 326 532 beschrieben. In diesem Fall umfasst die geschichtete antithrombogene Oberfläche ein Polymersubstrat, ein an das Polymersubstrat gebundenes Chitosan und einen antithrombogenen Wirkstoff, gebunden an die Chitosanbeschichtung. JP-OS 04-92673 bezieht sich auf antithrombogene Blutfilter, bei denen für die Heparinbindung ebenfalls eine Chitosanschicht verwenden wird.
In EP-A-0 481 160 wird ein antithrombogenes Material beschrieben, das sich für die Beschichtung medizinischer Gegenstände eignet, wobei das Material ein Antikoagulans, gebunden an prozessiertes Kollagen, umfasst. Ein anderes Verfahren zur Herstellung antithrombogener Oberflächen ist in WO97/07843 beschrieben, nach welchem dem Heparin ausreichend Periodat beigemischt wird, um mit nicht mit mehr als zwei Zuckereinheiten pro Heparinmolekül zu reagieren, und diese Mischung zu einem oberflächenmodifizierten Substrat eines medizinischen Geräts gegeben wird, dessen Oberflächenmodifikation Aminogruppen enthält.
Diese Auflistung bekannter Verfahren zur Herstellung antithrombogener Oberflächen ist bei weitem nicht vollständig und ist ein klarer Hinweis darauf, dass es schwierig ist, solche beschichteten medizinischen Gegenstände herzustellen, welche die für eine erfolgreiche Anwendung am Patienten notwendigen Eigenschaften zeigen, nämlich eine ausreichende und lang anhaltende, hohe, antithrombogene Aktivität, Stabilität des Überzugs und keine nachteiligen Änderungen der Eigenschaften der zu beschichtenden Substrate.
Deshalb besteht in der Wissenschaft immer noch ein Bedarf an Verbesserungen antithrombogener Beschichtungen, welche die damit beschichteten medizinischen Gegenstände auf eine stabile, verlässliche und reproduzierbare Art und Weise und mit einem starken und anhaltenden antithrombogenen Effekt nicht-thrombogen machen.
DEFINITION DER ERFINDUNG:
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die antithrombogene Wirkung von oberflächenimmobilisiertem Heparin zu verbessern. Diese und andere Aufgaben werden durch die in den nachstehenden Ansprüchen definierte Erfindung gelöst.
Es wurde jetzt überraschend gefunden, dass es möglich ist, die antithrombogene Wirkung bekannter Oberflächenmodifikationen durch ein einfaches und günstiges Verfahren weiter zu verbessern. Die Verbesserung kann als eine erhöhte Heparinbioaktivität gemessen werden, wenn das entsprechend der Erfindung behandelte Heparin an einer Oberfläche befestigt wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von oberflächenmodifizierten Substraten, die eine verbesserte antithrombogene Wirkung haben, wobei die Verbesserung erreicht wird durch Behandlung von Heparin bei erhöhter Temperatur oder bei erhöhtem pH oder in Kontakt mit nukleophilen Katalysatoren, wie z. B. Aminen, Alkoholen, Thiolen der immobilisierten Amino-, Hydroxyl- oder Thiolgruppen, bevor besagtes Heparin an der zu modifizierenden Oberfläche befestigt ist.
Wie aus dem erwähnten Stand der Technik ersichtlich, sind viele unterschiedliche Methoden zur Herstellung einer oberflächenmodifizierenden Schicht bekannt, die aktive Gruppen trägt, an die ein Heparin gebunden oder befestigt werden kann, und das erfindungsgemäß hergestellte Heparin, das verbesserte antithrombogene Eigenschaften zeigt, kann in Verbindung mit jeder beliebigen Methode aus dem Stand der Technik zur Herstellung von Schichten, an die Heparin gebunden werden kann, verwendet werden.
Gegebenenfalls kann das medizinische Gerät, auf dem die Oberflächenmodifikation eingeführt werden soll, aus einem Material oder Materialien hergestellt werden, bei dem aktive funktionelle Gruppen auf der Oberfläche direkt verfügbar sind, ohne dass es der Einführung einer weiteren Schicht auf der Oberfläche bedarf, die funktionelle Gruppen trägt, an die Heparin gebunden werden kann. Das erfindungsgemäss hergestellte Heparin mit vorteilhaften antithrombogenen Eigenschaften kann ebenfalls in Verbindung mit solchen Materialien verwendet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann genereller dadurch beschrieben werden, dass es unterschiedliche, funktionelle Gruppen tragende Materialien einschliesst, oder unterschiedliche bekannte Methoden zur Behandlung der Oberfläche, um Gruppen bereitzustellen, durch die Heparin, das gegebenenfalls behandelt ist um z. B. Aldehyd-, Carbonsäure- oder Aminogruppen zu enthalten, an dieser Oberfläche befestigt werden kann, bevorzugt durch kovalente Bindung.
Ein solches Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Oberfläche eines Substrats mit verbesserter nicht-thrombogener Aktivität umfasst zumindest
Reagieren von

(A) funktionellen Gruppen auf einer Oberfläche, die nicht-thrombogen werden soll, mit
(B) Heparin, so verändert, dass es komplementäre funktionelle Gruppen enthält, um kovalente Bindungen zu bilden, wobei das Heparin in einem Schritt vor der Umsetzung von (A) und (B) aktiviert wird, damit dessen Aktivität verbessert ist, wenn es an die Oberfläche gebunden ist, durch ein Verfahren, ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Verfahren:
(i) Erwärmen auf einen Bereich von 40°C bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels,
(ii) Behandeln bei einem erhöhten pH, d. h. im Bereich von pH 9 bis 14;
(iii) Behandeln mit mindestens einem nukleophilen Katalysator. Einige der Verfahren können kombiniert werden, um dieselbe oder sogar eine verbesserte Aktivität des oberflächengebundenen Heparins zu ergeben. So kann das Verfahren (i) vorteilhaft entweder mit Verfahren (ii) oder (iii) kombiniert werden.

Die Bezeichnung "nukleophiler Katalysator" wird verwendet, um auszudrücken, dass keine wirkliche chemische Reaktion zwischen dem Heparin und dem in dem Verfahren verwendeten, nukleophilen Katalysator stattfindet. Beispiele von Verbindungen, die als "nukleophile Katalysatoren" entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, sind Amine, wie z. B. Ammoniumacetat (NH₄Ac), oder andere stickstoffhaltige Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren und aliphatische oder cyclische organische Verbindungen; hydroxylhaltige Verbindungen, wie z. B. Alkohole; und sulfhydrylhaltige Verbindungen, wie z. B. Thiole. Andere mögliche, erfindungsgemässe, nukleophile Katalysatoren sind polymere Verbindungen, die eine Amino-, Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppe tragen, wie z. B. Polyethylenimin. Andere Beispiele möglicher erfindungsgemässer, nukleophiler Katalysatoren umfassen dem Fachmann wohlbekannte immobilisierte Aminogruppen, Hydroxylgruppen oder Thiole, wie sie in Ionenaustauschersubstraten oder substituierten Chromatografiegelen vorliegen. Es ist am stärksten bevorzugt, stickstoffhaltige nukleophile Katalysatoren zu verwenden, wie z. B. freie Amine oder oberflächenimmobilisierte Amine.
Die komplementären Gruppen in (B) beziehen sich auf die funktionellen Gruppen, die unter (A) beschrieben wurden, mit dem Verständnis, dass diese zwei Gruppen geeignet sein müssen, unter Bildung einer kovalenten Bindung zu reagieren. Ein Beispiel von Gruppen, die kovalente Bindungen bilden, sind Amino- und die Aldehydgruppen, und in diesem Fall muss dem obigen Reaktionsschema ein weiterer Schritt zur Stabilisierung der dadurch gebildeten Schiff'schen Base folgen. Dem Fachmann sind andere solcher Paare funktioneller Gruppen bekannt, die kovalente Bindungen bilden können.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von modifizierten Substratoberflächen auf medizinischen Substraten, die keine funktionellen Gruppen auf ihrer Oberfläche tragen, kann wie folgt detaillierter beschrieben werden:

(a) Behandeln der zu modifizierenden Oberfläche, so dass eine Schicht gebildet wird, die funktionelle Gruppen auf der Oberfläche umfasst,
(b) Behandeln von Heparin, gemäß dem Stand der Technik modifiziert, um komplementäre funktionelle Gruppen zu enthalten, in einem weiteren Schritt, ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Verfahren:
(i) Erwärmen auf einen Bereich von 40°C bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels,
(ii) Behandeln bei einem erhöhten pH, d. h. im Bereich von 9 bis 14;
(iii) Behandeln mit mindestens einem nukleophilen Katalysator, um die Aktivität des Katalysators zu verbessern, wenn es an die Oberfläche gebunden ist, und
(c) Reagieren der aus Schritt (a) resultierenden Schicht mit Heparin, das gemäss Schritt (b) modifiziert wurde, um das Heparin durch kovalente Bindungen auf der Oberfläche zu immobilisieren.

Die Schicht aus obigem Schritt (a) kann durch Verwendung unterschiedlicher Verbindungen gebildet werden, wie z. B. polymerer Verbindungen, wie Polyurethanharnstoff, Polyaminen, wie z. B. Polyethylenimin, Chitosan oder anderer Polysaccharide oder Polymere, die reaktive funktionelle Gruppen enthalten. Alternativ ist es möglich, unterschiedliche Schichten polymerer Verbindungen zu verwenden, z. B. zwei mit entgegengesetzter Ladung, um eine Schicht bestimmter Dicke oder Struktur zu erhalten. In diesem Fall muss die letzte Schicht freie aktive Gruppen tragen, die man mit den komplementären Gruppen des Heparins reagieren lassen kann. Die Polymere können gegebenenfalls in den ersten Schichten vernetzt sein.
Verschiedene Beispiele von Methoden, durch die eine Oberfläche eines Substrats modifiziert werden kann, sind ebenfalls aus anderen Dokumenten aus dem Stand der Technik ersichtlich, und bezüglich detaillierter Arbeitsanweisungen für die Herstellung solcher Oberflächenmodifikationen wird auf die Beschreibungen und Beispiele solcher Patente und anderer Publikationen verwiesen.
Die Substrate, die am ehesten von dem Heparin, das nach den erfindungsgemässen Verfahren modifiziert wurde, profitieren, sind medizinische Geräte, wie z. B. Oxigenatoren, Blutfilter und Blutpumpen, Katheter und Schläuche und Implantate, wie z. B. Stents, Gefässtransplantate und Herzklappen.
So können die Oberflächen, die behandelt werden, Polymere, Glas, Metall, Naturfasermaterialien, Keramik oder jegliches andere Material sein, welche die richtigen Eigenschaften für die beabsichtigte Verwendung besitzen, die dem Fachmann bekannt sind.
In einer besonders bevorzugten Weise wird der erste Teil des Verfahrens wie in EP-B-0 086 186, EP-B-0 086 187 oder EP-B-0 495 820 oder WO97/07834 beschrieben ausgeführt und umfasst im Allgemeinen die folgenden Schritte:

(A):
(a) Zufügen einer Polymerschicht, umfassend Aminogruppen, auf die zu modifizierende Oberfläche,
(b) gegebenenfalls Vernetzen der Schicht aus Schritt (a) mit einem bifunktionellen Vernetzungsmittel,
(c) Zufügen einer Schicht eines anionischen Polymers auf die Schicht von Schritt (b),
(d) gegebenenfalls mindestens einmaliges wiederholen der Schritte (a), (b) und (c),
(e) gefolgt von einem abschliessenden Schritt (a), und
(B):
(f) Modifizieren des Heparins durch salpetrige Säure- oder Periodatoxidation, damit es Aldehydgruppen enthält.

Weiterhin ist das Verfahren gekennzeichnet durch den folgenden Schritt, der neu und im Vergleich zum Stand der Technik deutlich unterschiedlich ist:

(g) Behandeln des Aldehyd enthaltenden Heparins in einer wässrigen Lösung in einem weiteren Schritt, ausgewählt aus der folgenden Gruppe von Verfahren:
(i) Erwärmen auf einen Bereich von 40°C bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels;
(ii) Behandeln bei einem erhöhten pH, d. h. im Bereich von pH 9 bis 14;
(iii) Behandeln mit mindestens einem nukleophilen Katalysator, um die Aktivität des Heparins im oberflächengebundenen Zustand zu erhöhen.

Das Verfahren wird dann bevorzugt wie im oben beschriebenen Stand der Technik fortgesetzt durch:

(h) Reagieren der resultierenden Schicht aus Schritt (a) oder (e) mit dem weiterbehandelten, Aldehyd enthaltenden Heparin aus Schritt (g).

Die erfindungsgemäss hergestellten, oberflächenmodifizierten Substrate werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die Verfahren (i), (ii) und (iii) können in jedem Lösungsmittel durchgeführt werden, aber es ist am stärksten bevorzugt, sie in wässriger Lösung durchzuführen, jedoch kann es unter besonderen Umständen geeignet sein, organische Lösungsmittel, gegebenenfalls zusammen mit Komplexbildnern, oder Mischungen von wässrigen und organischen Lösungen zu verwenden.
Die benötigte Zeit für das Erwärmungsverfahren (i) ist nicht entscheidend. Vermutlich hängt die erreichbare Aktivierung von der Kombination der Zeit und der Temperatur ab. Somit ist die Temperatur in einer Ausführungsform im Bereich von 40 bis 80°C und besonders bevorzugt von 50 bis 70°C. In einer zweiten Ausführungsform wird sie bei 60°C gehalten.
Das Verfahren (ii) wird bei pH 9 bis 14 durchgeführt, besonders bevorzugt bei pH 9 bis 12. Es ist noch geeigneter, den pH-Bereich von 9 bis 11 zu verwenden.
VORTEILE:
Durch die vorliegende Erfindung können die folgenden Vorteile erreicht werden:
verbesserte nicht-thrombogene Aktivität und als ein Ergebnis daraus

– ausreichende Nicht-Thrombogenität kann durch geringere Mengen an immobilisiertem Heparin erreicht werden. Dies ist besonders wichtig für Materialien und Geräte, bei denen es Schwierigkeiten gibt, grosse Heparinmengen zu immobilisieren.
– höhere Nicht-Thrombogenität kann durch dieselbe Menge an immobilisiertem Heparin erreicht werden. Dies ist besonders wichtig bei Anwendungen mit starkem thrombogenen Stimulus, z. B. in Situationen mit geringem Blutfluss, und Anwendungen, wie Kathetern und Gefässimplantaten mit engem Lumen, oder in Fällen, in denen der Patient ansonsten zusätzliche systemische Heparinisierung benötigen würde.

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen detaillierter beschrieben.
BEISPIEL 1
Heparin mit Arzneibuchqualität wurde mit salpetriger Säure behandelt, im wesentlichen wie in EP-B-0 086 186 beschrieben. Nach der Oxidation wurde die Reaktionslösung in vier Teile geteilt (jeweils 60 ml), die gemäss einem der folgenden Schritte behandelt wurden:

1. Neutralisiert mit 4 M NaOH bei pH 7.
2. Eingestellt auf pH 2,5 mit 2 M HCl und für 1 Stunde bei 40°C gehalten, dann neutralisiert mit 4 M NaOH auf pH 7.
3. Eingestellt auf pH 10 mit 4 M NaOH und für 1 Stunde bei 40°C gehalten. Danach wurde mit 4 M HCl auf pH 7 neutralisiert.
4. Neutralisiert mit 4 M NaOH auf pH 7. Die Lösung wurde auf 0,1 M NH4Ac eingestellt und für 1 Stunde bei 40°C gehalten. Die Lösung wurde dann eingedampft, um NH4Ac zu entfernen. Der Rückstand wurde in 60 ml Wasser gelöst und auf pH 7 eingestellt.

Die Heparinpräparationen wurden auf antikoagulative Aktivität getestet (Antithrombin-vermittelte Thrombininhibierung):
Polyethylenschläuche (2 mm innerer Durchmesser) wurden im wesentlichen gemäss EP-B-0 086 186 heparinisiert und auf Antithrombinbindung getestet.
Schlussfolgerungen:

– Erfindungsgemässe Behandlung von mit salpetriger Säure oxidiertem Heparin in alkalischer Umgebung bei pH 10 führt zu stark erhöhter (mehr als 3-fach höherer) Heparinaktivität nach Immobilisierung auf einer Oberfläche im Vergleich zu mit salpetriger Säure oxidiertem Heparin, behandelt bei pH 7 gemäss dem Stand der Technik. Die Aktivität des Heparins vor der Immobilisierung wird nicht beeinflusst.
– Behandlung von mit salpetrige Säure oxidiertem Heparin mit Ammoniumacetat vor der Immobilisierung resultiert in einer etwas erhöhten Aktivität, wohingegen Behandlung bei niedrigem pH keinen Einfluss hat.

BEISPIEL 2
Heparin mit Arzneibuchqualität wurde mit salpetriger Säure behandelt, im wesentlichen wie in EP-B-0 086 186 beschrieben, und dann mit 4 M NaOH auf pH 7 neutralisiert und gefriergetrocknet.
Polyethylenschläuche wurden mit Lösungen des mit salpetriger Säure oxidierten Heparins heparinisiert, das einer der folgenden Behandlungen unterworfen worden war.

1. Keine Vorbehandlung.
2. Auflösen in Wasser und vor Verwendung für 16 Stunden bei 50°C halten.
3. Halten bei pH 10 und 50°C.
4. Auflösen in Wasser und vor dem Einsatz für 16 Stunden bei 50°C über eine aminierte Oberfläche (aminierte Schläuche) zirkulieren.

Die Heparinisierung wurde im wesentlichen wie in EP-B-0 086 186 beschrieben durchgeführt. Die heparinisierten Teile des Schlauchs wurden im Hinblick auf die Antithrombinbindung analysiert.
Schlussfolgerung:

– Zusätzlich zu den in Beispiel 1 beobachteten Effekten führt die Behandlung von mit salpetriger Säure oxidiertem Heparin durch verlängertes Erwärmen oder durch Kontakt mit oberflächenimmobilisierten Nukleophilen, wie z. B. Aminogruppen, zu stark erhöhter Heparinaktivität bei Immobilisierung auf einer Oberfläche.

BEISPIEL 3
In diesem Beispiel wird gezeigt, dass die Oxidation von Heparin unter Verwendung von zwei unterschiedlichen, dem Fachmann bekannten Methoden, beide zu einer überraschend erhöhten AT-Absorption führen, wenn erfindungsgemäss aktiviertes Heparin verwendet wird.
PVC-Schläuche mit einem inneren Durchmesser von 3 mm wurden entweder:

(a) heparinisiert mit durch salpetrige Säure oxidiertem Heparin, hergestellt gemäss EP-B-0 086 186, und nicht weiter behandelt,
(b) heparinisiert mit durch salpetrige Säure oxidiertem Heparin, hergestellt gemäss EP-B-0 086 186, und dann mit Alkali behandelt (pH 10, 1 Stunde bei 40°C),
(c) heparinisiert mit durch Periodat oxidiertem Heparin, hergestellt gemäss PCT WO97/07384 und nicht weiterbehandelt, oder
(d) heparinisiert mit durch Periodat oxidiertem Heparin, hergestellt gemäss PCT WO97/07384, und dann einer Behandlung mit Alkali unterworfen (pH 10, 1 Stunde bei 40°C).

Claims

Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Oberfläche eines Substrats mit verbesserter nicht-thrombogener Aktivität, umfassend mindestens den folgenden Schritt: Reagieren von (A) funktionellen Gruppen auf einer Oberfläche, die nicht-thrombogen werden soll, mit (B) Heparin, so verändert, dass es komplementäre funktionelle Gruppen enthält, um kovalente Bindungen zu bilden, dadurch gekennzeichnet, dass das Heparin vor dem Umsetzen von (A) und (B) aktiviert wird, damit dessen Aktivität verbessert ist, wenn es an der Oberfläche gebunden ist, durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe von Verfahren: (i) Erwärmen auf einen Bereich von 40°C bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels; (ii) Behandeln bei einem erhöhten pH, d. h. im Bereich von pH 9 bis 14; (iii) Behandeln mit mindestens einem nukleophilen Katalysator.
Verfahren gemäss Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte: Behandeln der zu modifizierenden Oberfläche in ein oder mehreren Schritten, um eine Schicht mit funktionellen Gruppen auf der Oberfläche zu bilden.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der pH im Bereich von 9 bis 11 ist.
Verfahren gemäss Anspruch 3, wobei der pH 10 ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der nukleophile Katalysator NH4Ac ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei der nukleophile Katalysator immobilisierte Aminogruppen enthält.
Verfahren gemäss Anspruch 7, umfassend das Bilden einer Schicht auf der Oberfläche durch (A): (a) Zufügen einer Polymerschicht, umfassend Aminogruppen, auf die zu modifizierende Oberfläche, (b) gegebenenfalls Vernetzen der Schicht aus Schritt (a) mit einem bifunktionellen Vernetzungsmittel, (c) Zufügen einer Schicht eines anionischen Polymers auf die Schicht von Schritt (b), (d) gegebenenfalls mindestens einmaliges wiederholen der Schritte (a), (b) und (c), (e) gefolgt von einem abschliessenden Schritt (a), und (B): (f) Modifizieren des Heparins durch salpetrige Säure- oder Peroxidatoxidation, damit es Aldehydgruppen enthält, gekennzeichnet durch (g) Aktivieren des Aldehyd enthaltenden Heparins in einem weiteren Schritt, um die Aktivität im oberflächengebundenen Zustand zu erhöhen, dieser Aktivierungsschritt (g) ist ausgewählt aus der Gruppe von Verfahren: (i) Erwärmen auf einen Bereich von 40°C bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels; (ii) Behandeln bei einem erhöhten pH, d. h. im Bereich von pH 9 bis 14; (iii) Behandeln mit mindestens einem nukleophilen Katalysator, und schliesslich Umsetzen der in Schritt (a) oder (b) erhaltenen Schicht mit dem weiterbehandelten Aldehydheparin aus Schritt (g).
Oberflächenmodifiziertes Substrat, hergestellt gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7.