DE10004884A1

DE10004884A1 - Verfahren zum Anbringen von Biomolekülen an Oberflächen mittels funktioneller Amin-Gruppen

Info

Publication number: DE10004884A1
Application number: DE10004884A
Authority: DE
Inventors: Edouard Koulik; Patrick Cahalan; Michel Verhoeven; Linda Cahalan; Judith Vincent
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 2000-02-04
Publication date: 2000-08-24
Also published as: US6303179B1

Abstract

Ein Verfahren zum Modifizieren der Oberflächeneigenschaften eines Substrates mit einer Oberfläche mit einem Polymer mit funktionellen Amid-Gruppen darauf. Das Verfahren beinhaltet ein in Kontakt bringen des funktionelle Amid-Gruppen aufweisenden Polymers mit einer Quelle für Hydroxid-Ionen und einer Quelle für Hypohalit-Ionen bei einer Temperatur von mindestens etwa 20 DEG C für eine Zeitspanne, die ausreicht, zumindest einen Teil der funktionellen Amid-Gruppen in funktionelle Amin-Gruppen umzuwandeln, um eine Substratoberfläche zu bilden, die ein Polymer mit funktionellen Amin-Gruppen aufweist, wobei die Hydroxid-Ionen gegenüber den Hypohalit-Ionen in einem molaren Überschuß und in einer Konzentration von nicht mehr als etwa 0,1 M, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung, vorhanden sind. Ein Biomolekül wird an dem so erhaltenen Polymer mit funktionellen Amin-Gruppen angebracht.

Description

Bereich der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zum Präparieren von Materialien, vorzugsweise von biokompatiblen Materialien, und typischerweise von mit Blut verträglichen Materialien. Speziell betrifft diese Erfindung ein Verfahren zum Anbringen von Biomolekülen, wie bspw. Heparin, an die Oberfläche eines Substrates über funktionelle Amin-Gruppen, welche aus funktionellen Amid-Gruppen gebildet werden.

Hintergrund der Erfindung

Die Entwicklung von Gefäßtransplantaten und medizinischen Geräten, die mit Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, in Kontakt kommen, stellt ein sich schnell entwickelndes Gebiet der Medizin dar. Dies wurde jedoch gehemmt durch das Fehlen von geeigneten synthetischen Materialien, die stabil sind, wenn sie mit solchen Flüssigkeiten in Kontakt gebracht werden.

Abwehrreaktionen zwischen den Materialien und Blutbestandteilen sind die entscheidenden Faktoren, die die Verwendung synthetischer Materialien, die mit Körperflüssigkeiten in Kontakt kommen, limitieren. Beispielsweise neigen Katheter, Gefäßtransplantate und dergleichen dazu, als Brutstätten oder Brennpunkte für die Bildung von Thromben (Blutverklumpungen) zu dienen. Ein Erstkontakt derartiger Materialien mit Blut führt zu der Ablagerung von Plasmaproteinen, wie z. B. Albumin, Fibrinogen, Immunoglobulin, Coagulations-Faktoren und ergänzenden Komponenten. Die Adsorption von Fibrinogen auf der Oberfläche des Materials verursacht Thrombozyten-Adhäsion, -aktivierung und -anhäufung. Andere zelladhäsive Proteine, wie z. B. Fibronectin, Vitronectin und der von Willebrand Faktor (vWF) fördern ebenfalls eine Thrombozyten-Adhäsion. Im Ergebnis ist oftmals die kontinuierliche Anwendung von Antikoagulantien in Verbindung mit dem Einbringen solcher Materialien in den Körper notwendig.

Darüber hinaus tritt eine zusätzliche Aktivierung auf, wenn Materialien in Blut eingeführt werden. Adsorption großer Mengen von IgG, IgM und C3b auf Oberflächen verursacht eine Aktivierung. Daran anschließend können Komplexe gebildet werden, die zu unerwünschten Immunreaktionen führen, wie z. B. Proteolysis, Zell-Lysis, Opsonisation, Anaphylaxis und Chemotaxis. Als ein Ergebnis begründen solche Reaktionen, daß solche Materialien mit einem lebenden Körper nicht kompatibel sind.

Es sind eine Vielzahl von Vorgehensweisen vorgeschlagen worden, die Biokompatibilität, und auch die Blutkompatibilität, von medizinischen Geräten zu verbessern. Heparinisation von Polymeren stellt eine solche Vorgehensweise dar. Bei einem Verfahren wird Heparin mit einem quaternären Amin zu einem Komplex verbunden, bevor eine Polymeroberfläche mit dem Komplex beschichtet wird. Heparin kann auch auf segmentierte Polyurethan-Urea Oberflächen durch Verwendung von hydrophilen Poly(Ethylenoxid)-Zwischenmolekülen mit verschiedenen Kettenlängen festgelegt werden, wie dies in dem Artikel von K.D. Park et. al. in J. Biomed. Mater. Res., 22, 977-992 (1988) offenbart ist.

Ein anderes Heparinisationsverfahren, welches in dem US-Patent 5,229,172 (Cahalan et. al.) offenbart ist, beinhaltet ein anfängliches Bestrahlen einer Polymer-Oberfläche in der Gegenwart einer Sauerstoffquelle und anschließend ein Aufbringen eines Graftpolymers aus Acrylamid auf die bestrahlte Oberfläche unter Verwendung von Acrylamid-Monomeren und Zer-Ionen. Die graftpolymerisierte Acrylamid-Oberfläche, welche optional so modifiziert werden kann, daß sie daraus vorstehende funktionelle Gruppen, wie bspw. Amin- und Carboxyl-Gruppen, enthält, bietet eine geeignete Oberfläche, an der Biomoleküle ionisch oder kovalent gebunden werden können. Z. B. kann das Graftpolymer unter Verwendung von Cyanamid einer Hydrolyse unterzogen werden, um so Carboxyl- Gruppen einzubringen, an welche Zwischenmoleküle wie Ethylendiamin angelagert werden können. An das aminierten Graftpolymer können unter Verwendung eines Anbindungsmittels, wie bspw. Cyanamid, Biomoleküle, wie z. B. Heparin, gebunden werden.

Obwohl solche gängigen Verfahren zum Anbringen von Biomolekülen, insbesondere Heparin, auf Trägeroberflächen signifikante Vorteile aufweisen, gibt es nach noch immer einen Bedarf nach zusätzlichen Verfahren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bietet Verfahren zum Anbringen von Biomolekülen, wie z. B. Heparin, auf Substrat-Oberflächen. Vorzugsweise bietet die vorliegende Erfindung Verfahren zum Herstellen medizinischer Geräte mit auf einer Trägeroberfläche angebrachten (bspw. daran festgelegten) Biomolekülen. Das Substrat kann aus Metall oder einem organischen Polymer (d. h. einem festen Polymermaterial) gefertigt sein.

Tatsächlich bietet die vorliegende Erfindung effiziente Verfahren, mit denen Biomoleküle auf einer Substratoberfläche mit funktionellen Amid-Gruppen angebracht werden können ohne die Notwendigkeit von Zwischenmolekülen, wie z. B. Ethylendiamin, und Anbindungsmitteln, wie z. B. Cyanamid. Statt dessen bieten die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine direkte Umwandlung von Amid- (-C(O)NH₂) Gruppen in Amin- (-NH₃) Gruppen, welche ein direktes Anbringen von Biomolekülen erlauben.

Insbesondere bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines medizinischen Gerätes mit einem auf einer Substratoberfläche festgelegten Biomolekül. Das Verfahren umfaßt: Bereitstellen eines Substrates mit einer Oberfläche, die ein Polymer mit funktionellen Amid-Gruppen beinhaltet; in Kontakt Bringen des funktionellen Amid-Gruppen enthaltenden Polymers mit einer Reaktionsmischung mit einer Quelle für Hydroxid-Ionen und einer Quelle für Hypohalit-Ionen bei einer Temperatur von mindestens etwa 20°C über einen Zeitraum, der ausreicht, um zumindest einen Teil der funktionellen Amid-Gruppen in funktionelle Amin-Gruppen umzuwandeln, um eine Substratoberfläche zu bilden, die ein Polymer mit funktionellen Amin-Gruppen beinhaltet, wobei die Hydroxid- Ionen in einem molaren Überschuß relativ zu den Hypohalit-Ionen und in einer Konzentration von nicht mehr als etwa 0,1 M, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung, vorhanden sind; und in Kontakt Bringen der ein Polymer mit funktionellen Amin-Gruppen enthaltenden Substratoberfläche mit einem Biomolekül unter Bedingungen, die eine Festlegung des Biomoleküls auf der Substratoberfläche bewirken.

Die vorliegende Erfindung bietet zudem ein Verfahren zum Modifizieren der Oberflächeneigenschaften eines festen Polymermaterials, welche ein Teil eines medizinischen Gerätes bilden können oder auch nicht. Das Verfahren umfaßt:

Bestrahlen einer Oberfläche des festen Polymermaterials; in Kontakt Bringen der bestrahlten Oberfläche mit einem hinsichtlich des Ethylens ungesättigten Monomers mit funktionellen Amid-Gruppen und einer Quelle eines oxidierenden Metall-Ions unter Bedingungen, die eine Graftpolymerisation des Monomers auf der bestrahlten Oberfläche bewirken, um ein Graftpolymer mit funktionellen Amid- Gruppen darauf zu bilden; in Kontakt Bringen des Graftpolymers mit funktionellen Amid-Gruppen mit einer Reaktionsmischung, die eine Quelle für Hydroxid-Ionen und eine Quelle für Hypohalit-Ionen enthält, unter Bedingungen, die eine Umwandlung zumindest eines Teils der funktionellen Amid-Gruppen in funktionelle Amin-Gruppen bewirken, um ein festes Polymermaterial mit einer Oberfläche mit einem Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen darauf zu bilden; und in Kontakt Bringen des festen, eine Oberfläche mit einem Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen darauf aufweisenden Polymermaterials mit einem Biomolekül unter Bedingungen, die ein Festlegen des Biomoleküls auf der Oberfläche bewirken.

Eine "Substratoberfläche mit einem Polymer mit funktionellen Amid-Gruppen" im Sinne dieser Erfindung ist eine Oberfläche eines aus einem festen organischen Polymermaterial oder einem Metall gefertigten Substrat, die mit einem organischen Polymer mit zumindest funktionellen Amid-Gruppen beschichtet oder graftpolymerisiert ist oder auf die ein solches Polymer auf andere Weise aufgebracht ist. Eine "Substratoberfläche mit einem Polymer mit funktionellen Amin-Gruppen" ist eine Oberfläche eines aus einem festen organischen Polymer oder aus einem Metall gefertigten Substrates, die mit einem Polymer mit zumindest funktionellen Amin-Gruppen beschichtet oder graftpolymerisiert ist oder auf die ein solches Polymer auf andere Weise aufgebracht ist. Diese Polymere können auch andere funktionelle Gruppen aufweisen. Die Polymere mit solchen funktionellen Gruppen (Amid-Gruppen, Amin-Gruppen etc.) werden hierin als "funktionalisierte" Polymere bezeichnet. Vorzugsweise ist das funktionalisierte Polymer ein Graftpolymer, und insbesondere wird ein Graft-Hydrogel-Polymer bevorzugt. Allgemein unterscheidet sich ein Hydrogel-Polymer von einem festen Polymermaterial hinsichtlich der darin enthaltenen Wassermenge. Typischerweise beinhaltet ein festes Polymermaterial weniger als 10 Gew.-% Wasser.

Ein "medizinisches Gerät" kann als ein Gerät definiert werden, das Oberflächen aufweist, die im Verlaufe ihres Betriebes mit Gewebe, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten in Kontakt kommen, wobei die Flüssigkeiten darauffolgend in Patienten verwendet werden. Dies kann bspw. extrakorporale Geräte zur Verwendung in der Chirurgie, wie z. B. Sauerstoffanreicherer für Blut, Blutpumpen, Blutsensoren, Schläuche zum Transportieren von Blut oder andere Geräte, die mit Blut in Kontakt kommen, welches dann an den Patienten zurückgeführt wird, enthalten. Dies kann auch mit Blutkontakt in einen Menschen- oder Tierkörper implantierte Endoprothesen, wie z. B. Gefäßtransplantate, Aufweiter (stents), Schrittmacher-Leitungen, Herzklappen und dergleichen, die in Körpergefäße oder in das Herz implantiert werden, umfassen. Dies kann auch Geräte zur temporären intravaskulären Verwendung beinhalten, wie z. B. Katheter, Führungsdrähte und dergleichen, welche in die Blutgefäße oder in das Herz zum Zwecke eines Überwachens oder einer Reparatur eingebracht werden.

Ein "Biomolekül" wird als biologisch aktives Molekül definiert. Dies kann eine Vielzahl von Medikamenten (d. h. biologisch aktiven Wirkstoffen) beinhalten.

Ein "biokompatibles" Material ist ein solches, das allgemein keine signifikanten Abwehrreaktionen (z. B. toxische oder Antigenreaktionen) in dem Körper verursacht, egal ob es innerhalb des Körpers abgebaut wird, dort für einen längeren Zeitraum verbleibt oder als ganzes ausgeschieden wird. Im Idealfall wird ein biokompatibles Material als Ergebnis eines Kontaktes mit Körperflüssigkeiten oder Gewebe keine unerwünschten Reaktionen in dem Körper, wie z. B. Gewebesterben, Tumorbildung, allergische Reaktionen, Fremdkörperreaktion (Abstoßung), Entzündungsreaktionen oder Blutverklumpungen, hervorrufen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Biokompatibilität von in medizinischen Geräten verwendeten Materialien, welche implantierbare Materialien oder Materialien, die nicht notwendigerweise implantiert sind, jedoch mit Körpergewebe oder -flüssigkeiten in Berührung kommen mit einschließen, kann durch - vorzugsweise kovalentes - Anbringen von zumindest einem Typ eines Biomoleküls, vorzugsweise Heparin, an einer Oberfläche über funktionelle Amin-Gruppen, die aus funktionellen Amid-Gruppen gebildet sind, verbessert werden. Bevorzugtermaßen besteht die Oberfläche entweder aus Metall oder aus einem festen Polymermaterial und ist derart modifiziert, daß sie ein funktionalisiertes Polymer enthält, das von zumindest einem Typ eines hinsichtlich Ethylen ungesättigten Monomers mit funktionellen Amid-Gruppen, wie z. B. Acrylamid, abstammt. Das funktionalisierte Polymer ist vorzugsweise ein Graftpolymer und noch weiter bevorzugt ein Graft-Hydrogel- Polymer.

Dieses Polymer mit funktionellen Amid-Gruppen wird durch eine Reaktion mit Hydroxid-Ionen und Hypohalit-Ionen unter Bedingungen, die das Substrat nicht degradieren, obwohl die Ketten des funktionalisierten Polymers degradiert werden können, in ein Polymer mit funktionellen Amin-Gruppen umgewandelt. Diese Bedingungen sind ähnlich denen einer Hoffmann-Degradations-Reaktion (Hoffmann Degradation reaction), obwohl höhere Temperaturen (mindestens etwa 20°C) und geringere Konzentrationen von Hydroxid-Ionen (nicht mehr als etwa 0,1 M) bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, als bisher als möglich für eine ausreichende Umwandlung von Amid-Gruppen zu Amin- Gruppen ohne signifikante Polymerdegradation angenommen worden sind.

Temperaturen von etwa 0°C wurden typischerweise dazu verwendet, um bei funktionalisierten Polymeren Amid-Gruppen zu Amin-Gruppen umzuwandeln, um dabei Ketten-Spaltungsreaktionen zu reduzieren. Es wurde jedoch gefunden, daß höhere Temperaturen ohne signifikanten schädlichen Einfluß auf die Beladungskapazität mit Biomolekülen verwendet werden können. Derartige höhere Temperaturen ermöglichen kürzere Reaktionszeiten, was zu geringeren Herstellungskosten führen kann. Demnach bieten die Verfahren der vorliegenden Erfindung, auch wenn eine Degradation des funktionalisierten Polymers auftreten kann, dennoch einen akzeptablen Ausgleich zwischen der Anzahl der Amid- Gruppen, die zu Amin-Gruppen umgewandelt werden, und der Menge des degradierten funktionalisierten Polymers. Typischerweise kann eine geeignete Anzahl von Biomolekülen auf dem Substrat angebracht werden, so lange diese homogen mit einem funktionalisierten Polymer bedeckt ist (und vorzugsweise mindesten etwa 20 Gew.-% funktionalisertes Polymer beinhaltet).

Darüber hinaus wird angenommen, daß eine Degradation des funktionalisierten Polymers, die als ein Ergebnis der Verfahren der vorliegenden Erfindung auftritt, einen zusätzlichen Vorteil bieten kann. Typischerweise können an einem Graftpolymer angebrachte Biomoleküle in ein sie umgebendes Umfeld einsickern, was nicht immer erwünscht sein muß. Folglich können die Verfahren der vorliegenden Erfindung "einsickerbare" Moleküle, wie z. B. "einsickerbare" Abschnitte des funktionalisierten Polymers, entfernen, was dadurch in einer modifizierten Substratoberfläche resultiert, die mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit während der Verwendung in die Umgebung einsickert.

Signifikanterweise benötigt dieses Verfahren keine Verwendung von Anbindungsmitteln (d. h. von Aktivierungsmitteln), wie z. B. Cyanamid, oder Zwischenmoleküle, wie z. B. Ethylendiamin, um die Biomoleküle anzubringen, auch wenn diese verwendet werden können, wenn dies erwünscht ist. Durch die Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Ausdehnung und die Schwere von Abwehrreaktionen zwischen dem Substrat und Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, vermindert aufgrund von möglichen hohen Ladekapazitäten für Biomoleküle und möglichen hohen Bioaktivitäten.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Substratoberfläche zunächst so modifiziert, daß sie ein funktionalisiertes Polymer, vorzugsweise ein Graftpolymer, aufweist. Dies kann unter Anwendung einer Vielzahl von Verfahren geschehen. Vorzugsweise wird dies unter Verwendung der in den US-Patenten 5,607,475 (Cahalan et al.) und 5,229,172 (Cahalan et al.) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Diese Verfahren beschreiben, wie ein Graftpolymer auf aus Metall oder einem festen Polymermaterial gebildeten Substraten gebildet werden kann.

Wenn das Substrat vor dem Bilden eines Graftpolymers auf der Oberfläche ein Metall beinhaltet, wird es vorzugsweise mit einer Silan-Verbindung mit einer angehängten funktionellen Vinyl-Gruppe (having pendant vinyl functionality) beschichtet. Solche Vinylsilane sind vorzugsweise gemäß der Formel H₂C=CH-R- Si-X₃, wobei R optional ist und eine kurzkettige Alkyl-Gruppe sein kann und X eine Halogen-, eine Methoxy- oder eine Äthoxy-Gruppe ist. Anschließend wird auf der Vinylsilan-Beschichtung ein Graftpolymer gebildet, so daß die angehängte Vinyl- Funktionalität (pendant vinyl functionality) des Vinylsilans in das Graftpolymer eingebaut ist. Dieses Graftpolymer wird vorzugsweise aus einem hinsichtlich des Ethylens ungesättigten Monomer mit funktioneller Amid-Gruppe, wie z. B. Acrylamid, dargestellt. Die Polymerisation wird durch eine Quelle von oxidierenden Metall-Ionen, wie z. B. Zer-Ionen, ausgelöst.

Wenn das Substrat ein festes Polymermaterial enthält, wird es vorzugsweise zuerst mit einer ionisierenden Strahlung bestrahlt, und anschließend so modifiziert, daß es ein Graftpolymer enthält. Wie oben beschrieben wird dieses Graftpolymer vorzugsweise aus einem hinsichtlich des Ethylens ungesättigten Monomer mit funktioneller Amid-Gruppe, wie z. B. Acrylamid, dargestellt, und die Polymerisation wird durch eine Quelle von oxidierenden Metall-Ionen, wie bspw. Zer-Ionen, ausgelöst.

Eine Oberflächenmodifikation von Polymersubstraten, um ein Graftpolymer einzubeziehen (durch zunächst Bestrahlen des Polymersubstrates, z. B. unter Verwendung einer Corona-Behandlung) wird näher beschrieben in dem US-Patent 5,229,172 (Calahan et al.). Die Oberflächenmodifikation eines Metallsubstrates, um ein Graftpolymer einzubeziehen (durch zuerst Beschichten des Metalls mit Vinylsilan) ist näher beschrieben in dem US-Patent 5,607,475 (Calahan et. al.). Kurz gesagt, wird die Oberflächenmodifikation von Substraten, um ein Graftpolymer mit angehängten funktionellen Vinylgruppen einzubeziehen, wird durch in Kontakt Bringen des Substrates (z. B. des bestrahlten Polymermaterials bzw. des mit einem Vinylsilan beschichteten Metalls) mit einer wäßrigen Lösung eines oxidierenden Metalls (bspw. Ce⁴⁺) und eines hinsichtlich Ethylens ungesättigten Monomers mit funktioneller Amid-Gruppe (z. B. Acrylamid) durchgeführt.

Die oxidierenden Metall-Ionen (z. B. Ce⁴⁺, Fe³⁺, V⁵⁺, Co³⁺, Cr⁶⁺, Fe²⁺, Mg³⁺ und Ni²⁺) werden typischerweise in die Reaktionsmischung in Form eines Salzes eingebracht. Zum Beispiel werden Zer-Ionen vorzugsweise in die Reaktionsmischung in Form von einem oder mehreren Zer-Salzen, wie bspw. Zernitrat, Zersulfat, Zerammoniumnitrat, Zerammoniumsulfat, Zerammoniumpyrophosphat, Zeriodat, Zer-Salzen organischer Säuren, wie z. B. Zernaphthenat und Zerlinoleat und dergleichen eingebracht. Die oxidierenden Metall-Ionen können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden.

Die hinsichtlich Ethylens ungesättigten, amidhaltigen Monomere weisen vorzugsweise eine oder zwei C=C-Doppelbindungen, und besonders bevorzugt eine C=C-Doppelbindung auf. Beispiele von hinsichtlich Ethylens ungesättigten, amidhaltigen Monomeren beinhalten Acrylamide, wie z. B. Acrylamid und N,N- Methylendiacrylamide, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese können in Kombination verwendet werden.

Bei der anfänglichen Bildung des funktionalisierten Polymers ist das hinsichtlich des Ethylens ungesättigte Monomer mit funktioneller Amid-Gruppe in der Reaktionsmischung in einer Menge von mindestens etwa 10 Gew.-% und nicht mehr als etwa 50 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht der Reaktionsmischung vorhanden. Typischerweise liegt die Konzentration der oxidierenden Metall-Ionen, welche vorzugsweise Zer-Ionen [Ce⁴⁺] sind, in der Reaktionsmischung in einer Höhe, die ausreicht, die Reaktion auszulösen und den einen gewünschten Grad des Graftpolymers liefert. Vorzugsweise ist die Konzentration mindestens etwa 0,001 molar (M) und liegt nicht über etwa 0,1 M, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das funktionalisierte Polymer mit Amid- Funktionalität so modifiziert, daß es Amin-Funktionalität beinhaltet, indem mindestens eine Quelle von Hydroxid-Ionen und mindestens eine Quelle von Hypohalit-Ionen in einer Reaktionsmischung verwendet werden. Die Reaktionsmischung beinhaltet typischerweise zudem eine Trägerflüssigkeit, wie z. B. Wasser, obwohl auch organische Lösungsmittel, wie bspw. Ethanol oder andere Alkohole, allein oder in Kombination miteinander oder mit Wasser verwendet werden können. Vorzugsweise beinhaltet die Reaktionsmischung Wasser, und die Quellen für Hydroxid-Ionen und Hypohalit-Ionen sind wasserlöslich. Die Trägerflüssigkeit wird so ausgesucht, daß die Hydroxid-Ionen und die Hypohalit-Ionen hinreichend löslich sind, um eine effektive Umwandlung von Amid zu Amin zu ergeben.

Vorzugsweise umfaßt eine Quelle für Hydroxid-Ionen eine oder mehrere Hydroxid- Basen, und eine Quelle für Hypohalit-Ionen umfaßt eine oder mehrere hypohalogene Säuren und/oder ein oder mehrere Hypohalit-Salz(e). Beispiele geeigneter Hydroxid-Basen beinhalten Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid. Beispiele geeigneter hypohalogener Säuren und Hypohalitsalze beinhalten HOCl, HOBr, HOl sowie Hypohalite von Lithium, Natrium und Kalium der Formel M(OX), ebenso wie Hypohalite von Calcium, Strontium und Barium der Formel M(OX)₂. Ein besonders bevorzugtes Hypohalit-Salz stellt Natriumhypochlorit dar. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Reaktionsmischung Natriumhydroxid und Natriumhypohalit. Verschiedene Kombinationen von Quellen für Hydroxid-Ionen und für Hypohalit-Ionen können zur Umwandlung von Amid- Gruppen zu Amin-Gruppen nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Bei dieser Reaktion sind die Hydroxid-Ionen in der Reaktionsmischung vorzugsweise in einem molaren Überschuß bezüglich der Menge der Hypohalit- Ionen vorhanden. Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis von den Hydroxid- Ionen zu den Hypohalit-Ionen mindestens etwa 3 : 1, und insbesondere bevorzugt mindestens etwa 5 : 1. Vorzugsweise beträgt das molare Verhältnis von Hydroxid lonen zu den Hypohalit-Ionen nicht mehr als etwa 20 : 1, und noch insbesondere bevorzugt nicht mehr als etwa 10 : 1.

Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen beinhaltet die Reaktionsmischung mindestens eine Quelle für Hydroxid-Ionen mit einer Konzentration von mindestens etwa 0,01 M Hydroxid-Ionen, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung, und mindestens eine Quelle für Hypohalit-Ionen mit einer Menge von mindestens etwa 0,001 M Hypohalit-Ionen, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung. Vorzugsweise sind die Hydroxid-Ionen in einer Konzentration von nicht mehr als etwa 0,1 M vorhanden, und die Hypohalit- Ionen sind in einer Konzentration von nicht mehr als etwa 0,03 M, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung vorhanden.

Die Substratoberfläche mit einem Graftpolymer mit funktionellen Amid-Gruppen darauf wird mit der Reaktionsmischung bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitspanne in Kontakt gebracht (z. B. darin eingetaucht oder mit ihr gespült), um die Reaktion zu vervollständigen (d. h. Umwandlung von zumindest einem Teil der funktionellen Amid-Gruppen in funktionelle Amin-Gruppen). Vorzugsweise beträgt die Reaktionsdauer mindestens etwa 15 Minuten, stärker bevorzugt mindestens etwa 30 Minuten und insbesondere bevorzugt mindestens etwa 60 Minuten. Bevorzugtermaßen tritt eine ausreichende Umwandlung innerhalb von 3 Stunden auf und insbesondere bevorzugt innerhalb von 1,5 Stunden. Signifikanterweise beträgt die bevorzugte Temperatur der Reaktionsmischung mindestens etwa 20°C und oftmals nicht mehr als 30°C. Somit kann die Umwandlung bei Raumtemperatur (d. h. etwa von 22°C bis etwa 28°C) vollzogen werden. Diese Temperatur ist deutlich höher als die bei herkömmlichen Verfahren verwendete, was kürzere Reaktionszeiten ermöglicht.

Nach der Umwandlung von zumindest einem Teil der funktionellen Amid-Gruppen in funktionelle Amin-Gruppen, können Biomoleküle auf der Substratoberfläche angebracht werden. Für die Verfahren der vorliegenden Erfindung nützliche Biomoleküle sind solche, die Bestandteile enthalten, die mit funktionellen Amin- Gruppen reaktiv sind (typischerweise Aldehyd-Gruppen), oder so modifiziert werden können, daß sie mit funktionellen Amin-Gruppen reaktive Bestandteile enthalten. Allgemein können gemäß dieser Erfindung verwendete Biomoleküle z. B. sein: Antibakterielle und antimikrobische Wirkstoffe; Antikoagulantien und antithrombotische Wirkstoffe; Antithrombozyten-Wirkstoffe; Antientzündungs- Stoffe; Enzyme; Katalysatoren; Hormone; Wachstumsfaktoren; Medikamente; Vitamine; Antikörper; Antigene; Nukleinsäuren; Farbstoffe (welche als biologische Liganden fungieren); DNA und RNA; sowie Proteine und Peptide. Die Biomoleküle können synthetisch gewonnen sein oder natürlich vorkommen. Diese Biomoleküle beinhalten z. B. Heparin, Heparinsulfat, Dermatansulfat, Prostaglandin E₁ (PGE1), Ticlopidin, Plasmin, Urokinase und TPA. Andere Beispiele sind in den US- Patenten 5,229,172 (Calahan et al.) und 5,607,475 (Calahan et al.) offenbart. Verschiedene Kombinationen von Biomolekülen können verwendet werden, wenn dies gewünscht wird. Heparin und Salze des Heparin, wie z. B. Heparinsulfat werden insbesondere bevorzugt, da von ihnen angenommen wird, daß sie die Koagulation des Blutes durch Zusammenwirken mit Antithrombin III und Thrombin unterbinden um die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin zu verhindern.

Biomoleküle, die keine mit funktionellen Amin-Gruppen reaktiven Gruppen aufweisen, können mit einer Vielzahl von einem Fachmann bekannten Verfahren modifiziert werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist ein Oxidationsverfahren unter Verwendung von Periodat. Das Biomolekül, vorzugsweise Heparin, wird mit einem Periodat in einer gepufferten wäßrigen Lösung in Kontakt gebracht, und es wird ihm ermöglicht, zu reagieren. Diese kontrollierte Oxidation führt zu einer begrenzten Anzahl reaktiver Aldehyd-Gruppen pro Molekül. Das Periodat ist ein wasserlösliches Periodat, vorzugsweise ein Alkalimetallperiodat, wie z. B. Natriumperiodat. Wenn das Biomolekül Heparin ist, ist die Menge des verwendeten Periodats ausreichend, um mit nicht mehr als zwei der Zuckereinheiten in dem Heparinmolekül zu reagieren (d. h. mit den basischen Disaccharid-Resten, die die Struktur des Glycosaminoglycans bilden). Wenn das verwendete Periodat Natriumperiodat ist und wenn das verwendete Heparin eine kommerziell erhältliche, spritzbare Form von Heparin (d. h. sein Natriumsalz mit einer Aktivität von 160 Einheiten/Milligramm) ist, dann sollte das Gewichtsverhältnis von Heparin zu Periodat etwa 30 : 1 oder weniger betragen, um mit nicht mehr als zwei der Zuckereinheiten in dem Heparinmolekül zu reagieren. Es wird von einem Fachmann gewürdigt werden, daß die Menge des benötigten Periodats für andere Periodatverbindungen und andere Formen von Heparin über herkömmliche Rechnungen und empirische Versuche bestimmt werden kann.

Typischerweise findet die Reaktion zwischen dem Biomolekül, z. B. Heparin, und dem Periodat in einer wäßrigen Pufferlösung statt. Allgemein können gepufferte Lösungen mit einem pH im neutralen bis leicht sauren Bereich von etwa 4,5 bis etwa 8 verwendet werden. Ein niedrigerer pH-Wert (z. B. ein Acetat-Puffer bei 4, 5) wird bevorzugt, wenn eine schnelle Reaktion gewünscht ist, während für eine langsamere Reaktion mit einer längeren Speicher-Lebensdauer ein mehr neutraler pH-Wert (z. B. ein Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,88) bevorzugt wird.

Mit dem Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 4, 5 sollte die Reaktion für etwa 3 Stunden andauern, während die Reaktion mit einem Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 6,88 für etwa 16 Stunden andauern sollte. Wenn es gewünscht wird, dann kann die reagierte Mischung vor der Verwendung bei etwa 5°C gelagert werden.

Das Biomolekül kann mittels mehrerer dem Fachmann bekannter Verfahren an dem Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen angebracht werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren für Biomoleküle mit daran angehängten Aldehyd-Gruppen ist ein Reduktionsverfahren, welches die Verwendung von Cyanborhydrid mit einschließt. Z. B. wird die obenbeschriebene reagierte Mischung verdünnt, und der pH-Wert wird so eingestellt, daß der pH-Wert der Mischung auf einen pH-Wert gebracht wird, der für eine Verbindungsreaktion zwischen dem Biomolekül und dem Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen zu bevorzugen ist. Ein schwaches Reduktionsmittel, wie bspw. Natriumcyanborhydrid, wird zu der verdünnten Mischung hinzugefügt, um die Reduktion der zwischen den reaktiven Aldehyd-Gruppen an dem oxidierten Biomolekül und dem Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen auf der Substratoberfläche gebildeten Bindungen zu bewirken. Die behandelte Substratoberfläche wird dann mit der verdünnten Mischung bei einer geeigneten Temperatur und über einen geeigneten Zeitraum in Kontakt gebracht (z. B. darin eingetaucht oder damit gespült), um die Reaktion zu vervollständigen (d. h. das Biomolekül anzubringen). Diese Zeitspanne kann von etwa 30 Sekunden zu etwa 24 Stunden liegen bei Temperaturen zwischen etwa 20°C bis etwa 60°C. Z. B. kann das mit dem Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen beschichtete Substrat bei Raumtemperatur (d. h. von etwa 20°C bis etwa 25°C) für eine effektive Anbringung eines Biomoleküls mit einer Lösung des Biomoleküls über eine Zeitspanne von 30 Minuten bis zu 24 Stunden gespült werden.

Die Substrate, die mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können, beinhalten Metalle oder feste Polymermaterialien, die im wesentlichen in Körperflüssigkeiten unlöslich sind und die allgemein dazu entworfen und gestaltet sind, in oder auf dem Körper plaziert zu werden oder mit Körperflüssigkeiten in Kontakt zu kommen. Die Substrate weisen vorzugsweise physikalische Eigenschaften, wie z. B. Festigkeit, Elastizität, Permeabilität und Flexibilität, auf, die nötig ist, damit sie für den angestrebten Zweck funktionieren; sie können einfach gereinigt, hergestellt und sterilisiert werden; sie werden ihre physikalischen Eigenschaften und ihre Funktion währen der Zeit, in der sie implantiert im oder in Kontakt mit dem Körper verbleiben, im wesentlichen behalten. Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendeten Substrate können eine Vielzahl von Konturen oder Formen aufweisen, wie z. B. Puder, Platten, Streifen, Filme, Folien, Fasern, Gewebe, Fäden, Röhren sowie gegossene, extrudierte oder komprimierte Gegenstände und dergleichen.

Bevorzugte Substrate beinhalten ein festes Polymermaterial und können eine große Vielzahl von natürlichen oder synthetischen Polymeren beinhalten. Beispiele umfassen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein: Polyolefine, beinhaltend Polyethylen, Polypropylen, Polyisobutylen und Ethylen-Alpha-Olefin-Kopolymere; Silikone, wie z. B. Polydimethylsiloxan; Acryl-Polymere und -Kopolymere, wie z. B. Polyacrylat, Polymethylmethacrylat (PMMA) und Polyethylacrylat; Vinylhalid- Polymere und -Kopolymere, wie z. B. Polyvinylchlorid; Fluor-Polymere, wie z. B. Polytetrafluorethylen, Chlortrifluorethylen, fluoriertes Ethylenpropylen, Polyvinylidenfluorid (PVDF) und Ethylentetrafluorethylen-Kopolymer (ETFE); Polyvinylether, wie z. B. Polyvinylmethylether; Polyvinylidenhalide, wie z. B. Polyvinylidenfluorid und Polyvinylidenchlorid; Polyacrylnitril; Polyvinylketone; Polyvinylaromaten, wie bspw. Polystyren; Polyvinylester, wie z. B. Polyvinylacetat; Kopolymere von Vinylmonomeren untereinander und mit Olefinen, wie bspw. Ethylen-Methyl Methylacrylat Kopolymere, Acrylnitril-Styren Kopolymere, ABS- Harze und Ethylen-Vinyl Acetat Kopolymere; natürliche und synthetische Gummis, wie z. B. Butadien-Styren Kopolymere, Polyisopren, synthetisches Polyisopren, Polybutadien, Butadien-Acrylnitril Kopolymere, Polychloropren Gummis, Polyisobutylen Gummis, Ethylen-Propylendien Gummis, Isobutylen-Isopren Kopolymere und Polyurethan Gummi; Polyamide, wie z. B. Nylon 66 und Polycaprolactam; Polyester, wie z. B. Polyethylenterephthalat; Alkyd-Harze; formaldehydhaltige Harze, wie z. B. Phenol-Formaldehyd Harze, Urea- Formaldehyd Harze und Melamin-Formaldehyd Harze; Polycarbonate; Polyoxymethylene; Polyimide; Polyether; Epoxy-Harze; Polyurethane; Wolle; Baumwolle; Seide; Reyon; Reyon-Triacetat; Zellulosederivate, wie z. B. Zelluloseacetat, Zellulosebutyrat, Zelluloseacetatbutyrat, Zellulosenitrat, Zellulosepropionat, Zelluloseether und Carboxymethylzellulose; Polyether Blockamide; Polycarbonate; Polyvinylpyrrolidone; n-Butyl-Cyanacrylate; Polyvinyl- Alkohole; Acrylnitrilbutadienethylen; Styrenacrylnitril; und dergleichen. Unter Verwendung dieser Materialien hergestellte Substrate können beschichtet oder unbeschichtet und derivatisiert oder underivatisiert sein, bevor sie mit einem oder mehreren Biomolekülen behandelt werden. Eine bevorzugte Gruppe von Polymeren beinhaltet diejenigen, die aus der Gruppe eines Polyurethans, eines Polyolefins, eines Silikons, eines Fluorpolymers, eines Polyesters, eines Polyvinylhalids, eines Polyethers, eines Polyamids und Mischungen und Kopolymeren davon ausgesucht sind. Ein Kopolymer, wie es in dieser Schrift verwendet wird, beinhaltet Terpolymere, Tetrapolymere etc. Besonders bevorzugte Polymere beinhalten Polyurethan oder ein Polyvinylchlorid.

Obwohl Polymermaterialien bevorzugt werden, beinhalten andere geeignete Substrate Metalle, wie z. B. Titan/Titan-Legierungen, TiNi (Gedächtniseffekt (shape memory)/superelastisch), Aluminiumoxid, Platin/Platin-Legierungen, rostfreie Stähle, MP35N, Elgiloy, Haynes 25 und Stellit.

Die Materialien der vorliegenden Erfindung beinhalten ein Substrat und ein mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung (über ein Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen, ohne die Notwendigkeit von anderen Zwischengruppen oder Anbindungsmitteln) in einer Mengen und einer Orientierung angebrachtes Biomolekül, die eine verbesserte nicht-thrombogene Oberfläche bezogen auf das Substrat ohne das Biomolekül bieten. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung bieten vergleichsweise hohe Ladekapazitäten für Biomoleküle (oftmals bis zu 50 µg Biomoleküle pro Quadratzentimeter modifizierter Oberfläche) und hohe Bioaktivitäten (oftmals bis zu 1,0 Internationale Einheiten (IU) deaktiviertes Thrombin (IIa) pro Quadratzentimeter modifizierter Oberfläche). Bspw. kann Polyurethan mit Heparin auf einem Niveau von bis zu etwa 35 µg/cm² modifiziert werden und kann eine Bioaktivität von bis zu etwa 0,7 IU deaktiviertes IIa/cm² zeigen.

Der Kontakt zwischen Blut und einer fremden Oberfläche initiiert einen komplexen Vorgang einer Thrombogenese, der eine Thrombozyten-Anziehung, eine Aggregation und ein Loslassen von Körnchen; Thrombinerzeugung; und Fibrinbildung mit einschließt. Als eine Folge daraus existieren eine Reihe von Parametern, die als ein Meßwert für die Thrombogenizität eines Materials gewählt werden können. Folglich beinhaltet die Untersuchung der Reaktionen an der Blut- Material-Grenzfläche deshalb typischerweise eine Multi-Parameter (d. h. Multi- Untersuchungs) Vorgehensweise. Diese Untersuchungen beinhalten bspw. elektronenmikroskopische Untersuchungen nach Thrombozytenadhäsion, Thrombozytenverbreitung und Thrombin-Antithrombin (TAT) Untersuchungen, sowie andere. Jede dieser Untersuchungen kann ausreichen, die aus den Verfahren der vorliegenden Erfindung herrührenden Verbesserungen zu zeigen.

Die Blutkompatibilität des Materials der vorliegenden Erfindung kann durch verringerte Thrombin-Antithrombin-(TAT) Bildung auf ein Zusammentreffen mit Blut hin gezeigt werden, verglichen mit dem Material ohne das angebrachte Biomolekül. Hiermit ist gemeint, daß bei einem Substrat, an welchem ein Biomolekül, wie z. B. Heparin, angebracht ist, eine Verringerung der Anzahl der gebildeten Thrombin-Antithrombin-(TAT) Komplexe bezogen auf das gleiche Substrat ohne das daran angebrachte Biomolekül auftritt, wenn diese mit menschlichem Blut in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise liegt diese Verringerung in einer Größenordnung von mindestens etwa 90%, insbesondere bevorzugt bei zumindest etwa 95%.

Medizinische Geräte, in die das biokompatible Material der vorliegenden Erfindung integriert werden kann, beinhalten chirurgische Implantate, Prothesen und jegliches andere künstliche Teil oder Gerät, welches einen Teil eines lebenden Körpers ersetzt oder vergrößert bzw. mit Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut in Kontakt kommt, ohne auf diese beschränkt zu sein. Die Substrate können von jeder Form bzw. Gestalt sein, mit einbeziehend Schläuche/Rohre, Blätter, Stäbe und Artikel mit angemessener Form. Im Stand der Technik sind verschiedene medizinische Geräte und Zubehör bekannt, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Beispiele von Geräten umfassen Katheter, Nähmaterial, Schläuche und Fasermembranen. Beispiele von Kathetern beinhalten Zentralvenenkatheter, Entwässerungskatheter für den Thorax, angioplastische Ballonkatheter. Beispiele für Schläuche beinhalten in extrakorporalen Kreisläufen verwendete Schläuche, wie z. B. einem Gesamtblut- Sauerstoffanreicherer. Beispiele für Membranen beinhalten Polycarbonat- Membranen, Haemodialyse-Membranen und in diagnostischen oder biosensorischen Geräten verwendete Membranen. Ebenfalls mit eingeschlossen sind bei der Diagnostik verwendete Geräte ebenso wie Polyestergarn-Nähmaterial, wie z. B. Polyethylenfaden, und Polypropylen-Hohlfasermembranen.

Weitere Ausführungen medizinischer Geräte beinhalten die folgenden: Autotransfusionsgeräte, Blutfilter, Blutpumpen, Bluttemperaturüberwachungs geräte, Knochenwachstumsstimulatoren, Atmungskreislaufanschlüsse, Klammern (bulldog clamps), Kanülen, Transplantate, implantierbare Pumpen, Impotenz- und Inkontinenzimplantate, Intraokkular-Linsen, Leitungen, Leitungsübergänge, Leitungsanschlüsse, Nasenknöpfe (nasal buttons), Augenhöhlenimplantate, Herzisolationskissen (cardiac insulation pads), Herzmäntel (cardiac jackets), Clips, Abdeckungen, Dialatoren, Dialyser, Einweg-Temperatursonden, Kuppeln (domes), Drainageprodukte, Hüllen (drapes), Ohrstopfen (ear wicks), Elektroden, Emboliegeräte, Speiseröhren-Stethoskope, Knochenbruch-Fixierungsgeräte, Handschuhe, Führungsdrähte, Blutfiltergeräte, Trichter, intraarterielle Blutgassensoren, intrakardielle Sauggeräte, intrauterielle Druckgeräte, Nasen- Spetalstifte (nasal spetal splints), Nasentamponaden, Nadeln, Geräte für die Augen, PAP Pinsel, periodontale Faserkleber, Pessare, Haltemanschetten, Tücher (sheetings), Heftklammern, Magenanschlüsse, chirurgische Instrumente, Umwandler Schutzgeräte (transducer protectors), Harnleiteraufweiter (ureteral stents), vaginale Verhütungsmittel, Ventile, Gefäßschlaufen, Wasser- und Salzlösungsblasen (water and saline bubbles), achtabulare Becher (achtabular cups), annuloplastische Ringe (annuloplasty ring), Aorta-/Coronar-Lokatoren, künstliche Bauchspeicheldrüsen, Batterien, Knochenzement, Brustimplantate, Herzmaterialien (cardiac materials), wie z. B. Gewebe, Filze, Maschengeflechte, Flicken/Pflaster, Zementzwischenstücke, Ohrschneckenimplantat (cochlear implant), Defibrillatoren, Generatoren, orthopädische Implantate, Schrittmacher, Patellarknöpfe (patellar buttons), Penisimplantate, Tupfer, Stecker, Steckeranschlüsse, Herzklappenprothesen, Baumwollgazen (sheetings), medizinisch hergestellten Umlenkungen von Blutbahnen (shunts), Nabelklebeband, mit Ventilen versehene Flüssigkeitsleitungen und Geräte zum Vordringen in Körperhohlräume.

Obwohl die unten beschriebenen Beispiele die Behandlung von Polymerfilmen betreffen, ist damit nicht beabsichtigt, die Erfindung darauf zu beschränken.

Experimentelle Beispiele Beispiel 1 Heparinisierung eines Polyurethan-(PU) Films A) Reinigen und versehen mit einem Graftpolymer

Polyurethan-(PU) Filme (PELLETHANE, Bayer, Deutschland) oder Schlauchproben (PELLETHANE) wurden durch Tränken in Isopropylalkohol für 10 Minuten gereinigt. Nach dem Trocknen bei 50°C für 30 Minuten wurden die PU- Proben in eine Wasserlösung mit Acrylamid in einem Gehalt von etwa 30 Gew.-% bis zu etwa 40 Gew.-%, Ammoniumzernitrat in einer Konzentration von etwa 0,003 M bis zu etwa 0,01 M und salpetriger Säure in einer Konzentration von etwa 0,03 M bis zu etwa 0,1 M getränkt. Für jede Probe wurde für einige Minuten Stickstoff durch die Lösungen geblasen, und dann wurden die Reaktionsgefäße dicht verschlossen. Nach etwa 45 Minuten bis etwa 75 Minuten bei Raumtemperatur wurden die PU-Filme aus den Reaktionsgefäßen genommen und für einige Minuten mit Wasser gespült.

B) Aminierung

Nach dem Spülen wurde jede mit einem Graftpolymer versehene Probe bei Raumtemperatur in eine Wasserlösung mit Natriumhydroxid in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis zu etwa 0,1 M und Natriumhypochlorid in einer Konzentration von etwa 0,001 M bis zu etwa 0,01 M gelegt. Nach etwa 45 Minuten bis etwa 75 Minuten wurden die PU-Proben für einige Minuten mit Wasser gespült.

C) Heparinanbindung

Nach dem Spülen wurde jede Probe in eine Periodat-Heparin-Lösung (typischerweise 1 oder 2 mg/ml, pH = 4,7; 0,2 M Acetat-Puffer) gelegt, zu der 0,01 Gew.-% Natriumcyanborhydrid hinzugefügt wurde. Die Reaktion wurde für etwa 30 Minuten bis etwa 120 Minuten bei einer Temperatur von etwa 20°C bis etwa 50°C durchgeführt. Die Periodat-Heparin-Lösung wurde durch Reaktion zwischen Heparin (5 mg/ml) und Natriumperiodat (0,16 mg/ml) bei Raumtemperatur über 16 Stunden bereitet.

Beispiel 2 Heparinisierung eines Polyvinylchlorid-(PVC) Schlauches A) Reinigen und versehen mit einem Graftpolymer

Proben eines Polyvinylchlorid-Schlauches (TIGON, Cole-Parmer Instr., Co., USA) wurden durch Tränken in Isopropylalkohol für 2 Minuten gereinigt. Nach dem Trocknen bei 50°C für 15 Minuten wurde jede Probe des PVC-Schlauches in eine Wasserlösung mit Acrylamid in einem Gehalt von etwa 30 Gew.-% bis zu etwa 40 Gew.-%, Zerammoniumnitrat in einer Konzentration von etwa 0,003 M bis zu etwa 0,01 M und salpetriger Säure in einer Konzentration von etwa 0,03 M bis zu etwa 0,1 M getränkt. Stickstoff wurde für einige Minuten durch die Lösungen geblasen, und dann wurden die Reaktionsgefäße dicht verschlossen. Nach etwa 45 Minuten bis etwa 75 Minuten bei 50°C wurden die Proben aus den Reaktionsgefäßen genommen und für einige Minuten mit Wasser gespült.

B) Aminierung

Nach dem Spülen wurde jede Probe bei in eine Wasserlösung mit Natriumhydroxid in einer Konzentration von 0,1 M und Natriumhypochlorid in einer Konzentration von 0,01 M gelegt. Nach etwa 75 Minuten wurde jede mit Acrylamid gegraftete PVC-Probe für einige Minuten mit Wasser gespült.

C) Heparinanbindung

Tests

Antithrombin und Thrombin wurden nach wohl bekannten Verfahren gewonnen (Lindhout et al., J. Biomed. Mater. Res., 29, 1255-1256). Der 4. internationale Standard für Heparin wurde von dem National Bureau of Standards and Control, London, UK bezogen. Chromogene Substrate S2765 und S2238 wurden von Chromogenix, Schweden bezogen. Ein Hepes-Puffer bestand aus 20 mM Hepes, 0,19 M NaCl, 1,0 mg/ml Rinderserum Albumin, pH 7,5. Ein Hepes-EDTA-Puffer war der gleiche wie der Hepes-Puffer mit 20 mM EDTA.

Dichte des fest gebundenen Heparin (Heparinanbindung)

Eine Probe eines modifizierten Polyurethan-Films mit einer Oberfläche von 5 cm² wurde gemäß des oben beschriebenen Verfahrens präpariert. Eine Lösung salpetriger Säure (500 µl einer 0,025 M Lösung) und 250 µl Wasser wurden zu der Probe gegeben und die Reaktion wurde für 30 Minuten durchgeführt. Eine Ammoniumsulfamat-Lösung (250 µl mit 12,5% Gewicht/Volumen) wurde zu der Probe gegeben und mit der Lösung salpetriger Säure vermischt. Eine Probe von 800 µl der Mischung wurde genommen, zu der 500 µl MBTH (3-Methyl-2- Benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid, 0,25% Gewicht/Volumen) gegeben wurde. Nach 15 Minuten bei 50°C wurden 500 µl einer FeCl₃-Lösung hinzugefügt und die Reaktion wurde für weitere 20 Minuten bei 50°C durchgeführt. Nach einem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 2,5 ml Dichlormethan hinzugefügt und das Absorptionsvermögen für Licht bei 660 nm wurde bestimmt.

Nichtmodifiziertes PU als Vergleichsprobe zeigte keine feste Anbindung von Heparin, wohingegen das gemäß dem oben beschriebenen Verfahren modifizierte PU fest gebundenes Heparin in einer Menge von 35 µg/cm² aufwies.

Thrombozytenadhäsion

Blut wurde aus der Unterarmvene von gesunden Versuchspersonen entnommen und in 0,1 vol eines 3,8%igen Natriumcitrats gegeben. Citratisiertes, thrombozytenreiches Plasma (PRP) wurde durch Zentrifugieren für 15 Minuten bei 250 × g bei Raumtemperatur präpariert.

Proben von PU-Schlauch (ID = 0,5 cm, Länge = 10 cm) mit gemäß dem oben beschriebenen Verfahren auf der Oberfläche fest angebundenen Heparin wurde dem citratisierten, thrombozytenreichen Plasma (364 × 10⁹ Thrombozyten/l) bei 37°C für 30 Minuten bei einer Flußrate von 250 µl/Minute ausgesetzt. Die nicht gebundenen Thrombozyten wurden durch einen Waschschritt mit Hepes-Puffer bei derselben Durchlaufgeschwindigkeit entfernt. Das Material wurde dann 1000 µl einer 1% Triton-Lösung ausgesetzt, um die Thrombozyten zu lysieren. Die Zahl der Thrombozyten wurde über die LDH-(Lactatdehydrogenase) Aktivität in dem Lysat gemäß des Verfahrens von T. Lindhout et al., J. Mater. Sci. Mater. Med., 6, 367 (1995) bestimmt.

Eine Kalibrierungskurve wurde aus citratisierten, thrombozytenreichen Plasma, verdünnt mit 1% Triton-Lösung aufgebaut. Die Zahlen wurden auf den LDH- Gehalt des Plasmas hin korrigiert. Diese Ergebnisse zeigten 50-80% Thrombozytenbedeckung für nicht-modifiziertes Polyurethan, wohingegen gemäß des oben beschriebenen Verfahrens modifiziertes Polyurethan eine Thrombozytenbedeckung von 2-20% zeigte.

Thrombinbildungszeit

PU-Schlauch mit gemäß dem oben beschriebenen Verfahren auf der Oberfläche fest angebundenen Heparin wurde citriertem, thrombozytenreichem Plasma (präpariert wie oben beschrieben) für 15 Minuten bei 37°C ausgesetzt. Eine kleine Menge von 1,0 M CaCl₂ wurde zugesetzt, um die Koagulationsreaktion in Gang zu setzen. Die Konzentration freien Calciums des recalcifizierten Plasmas war 4 mM. Proben (3 µl) wurden nach bestimmten Zeitintervallen entnommen und gemäß dem Verfahren nach T. Lindhout et al. J. Mater. Sci. Mater. Med., 6, 367 (1995) auf Thrombinaktivität hin untersucht. Die Thrombinbildungszeit für nicht-modifiziertes Polyurethan betrug 5-7 Minuten, wohingegen die Thrombinbildungszeit für nach dem oben geschilderten Verfahren modifiziertes Polyurethan 30-40 Minuten betrug.

Heparin-Bioaktivität

Proben von PU mit einer Oberfläche von 2 cm² wurden in eine Vertiefungsplatte (well plate) gelegt und für 10 Minuten mit einer 0,1 M Natriumchlorid-Lösung hydriert, gefolgt von einer Inkubation der Proben für 15 Minuten mit einer Antithrombin III Lösung in Tris-Puffer (pH = 7). Nach einem Spülen wurde Thrombin-Lösung zu den Proben in den Tris-Puffer hinzugefügt und die Inkubation wurde für 10 Minuten vorgenommen. Die verbleibende Thrombinaktivität in der Lösung wurde mit dem chromagenen SubstratS-2238 gemäß dem Standardverfahren nach T. Lindhout et al., J. Mater. Sci. Mater. Med., 6, 367 (1995) analysiert. Dieser Test zeigte 0,4-0,7 IU IIa deaktiviertes Thrombin/cm².

Fachleute werden zu erkennen wissen, daß, während die Erfindung oben im Zusammenhang mit speziellen Ausführungsformen und Beispielen beschrieben worden ist, die Erfindung nicht notwendigerweise dahingehend beschränkt ist und daß eine Vielzahl anderer Ausführungsformen, Beispiele, Anwendungen, Abänderungen und Abweichungen von den Ausführungsformen, Beispielen und Anwendungen von den anhängenden Patentansprüchen mit einbezogen werden sollen. Der gesamte Offenbarungsgehalt eines jeden hierin zitierten Patents oder Veröffentlichung ist durch den Verweis darauf hierin mit eingeschlossen, als wenn jeder einzeln durch Bezugnahme mit eingeschlossen wäre.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines medizinischen Gerätes mit einem fest auf einer Substratoberfläche gebundenen Biomolekül mit folgenden Schritten:
Bereitstellen eines Substrates mit einer ein Polymer mit funktionellen Amid-Gruppen enthaltenden Oberfläche;
in Kontakt Bringen des mit funktionellen Amid-Gruppen versehenen Polymers mit einer eine Quelle für Hydroxid-Ionen und eine Quelle für Hypohalit-Ionen enthaltenen Reaktionsmischung bei einer Temperatur von mindestens etwa 20°C für eine Zeitspanne, die ausreicht, um zumindest einen Teil der funktionellen Amid-Gruppen in funktionelle Amin-Gruppen umzuwandeln, um eine ein Polymer mit funktionellen Amin-Gruppen aufweisende Substratoberfläche zu bilden, wobei die Hydroxid-Ionen bezüglich der Hypohalit-Ionen in einem molaren Überschuß vorhanden sind und wobei die Hydroxid-Ionen in einer Konzentration von nicht mehr als etwa 0,1 M, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung, vorhanden sind; und
in Kontakt Bringen der ein Polymer mit funktionellen Amin-Gruppen enthaltenden Substratoberfläche mit einem Biomolekül unter Bedingungen, die geeignet sind, das Biomolekül fest an die Substratoberfläche zu binden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des in Kontakt Bringens des mit funktionellen Amid-Gruppen versehenen Polymers ein Eintauchen des Substrates in die Reaktionsmischung beinhaltet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für Hydroxid-Ionen eine oder mehrere Hydroxid-Basen beinhaltet und daß die Quelle für Hypohalit-Ionen eine oder mehrere hypohalische Säuren, ein oder mehrere Hypohalit-Salze oder Mischungen daraus beinhaltet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von Hydroxid-Ionen zu Hypohalit-Ionen mindestens etwa 3 : 1 beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von Hydroxid-Ionen zu Hypohalit-Ionen nicht mehr als 20 : 1 beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsmischung eine oder mehrere Hydroxid-Basen mit einer Gesamtkonzentration von mindestens etwa 0,01 M Hydroxid-Ionen, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung, und eine oder mehrere hypohalische Säuren, ein oder mehrere Hypohalit-Salze oder Mischungen daraus mit einer Gesamtkonzentration von mindestens etwa 0,001 M bis zu etwa 0,03 M Hypohalit-Ionen, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung, aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des in Kontakt Bringens des mit funktionellen Amid-Gruppen versehenen Polymers ein in Kontakt Bringen desselben mit einer Reaktionsmischung mit einer Quelle für Hydroxid-Ionen und einer Quelle für Hypohalit-Ionen in Wasser bei einer Temperatur von etwa 20°C bis etwa 30°C für mindestens 15 Minuten beinhaltet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur im Bereich von etwa 20°C bis etwa 30°C liegt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül aus folgender Gruppe gewählt wird: ein antibakterieller Wirkstoff, ein antimikrober Wirkstoff, ein Antikoagulant, ein antithrombotischer Wirkstoff, ein Anti-Thrombozyten-Wirkstoff, ein Anti-Entzündungsmittel, ein Enzym, ein Katalysator, ein Hormon, ein Wachstumsfaktor, ein Medikament, ein Vitamin, ein Antikörper, ein Antigen, eine Nukleinsäure, ein Farbstoff, eine DNA, eine RNA, ein Protein, ein Peptit und Mischungen daraus.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül synthetisch dargestellt ist oder natürlich vorkommt.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül Heparin oder ein Salz davon beinhaltet.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein festes organisches Polymer oder ein Metall beinhaltet.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein festes organisches Polymer aus der folgenden Gruppe aufweist: ein Polyurethan, ein Polyolefin, ein Silikon, ein Fluorpolymer, ein Polyester, ein Polyvinylhalid, ein Polyether, ein Polyamid und Mischungen sowie Kopolymere davon.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Polyurethan oder ein Polyvinylchlorid aufweist.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat Oberfläche aus einem festen organischen Polymer mit einem darauf angeordneten Graftpolymer mit funktionellen Amid-Gruppen aufweist.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat eine mit einem Vinylsilan beschichtete Metalloberfläche aufweist, die mit einem funktionelle Amid-Gruppen aufweisenden Graftpolymer bedeckt ist.

17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für Hydroxid-Ionen Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder eine Mischung davon aufweist.

18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für Hypohalit-Ionen HOCl, LiOCl, NaOCl, KOCl, HOBr, LiOBr, NaOBr, KOBr, HOl, LiOl, NaOl, KOl, Ca(OCl)₂, Sr(OCl)₂, Ba(OCl)₂, Ca(OBr)₂, Sr(OBr)₂, Ba(OBr)₂, Ca(Ol)₂, Sr(Ol)₂, Ba(Ol)₂ oder eine Mischung daraus enthält.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gebildete Oberfläche biokompatibel geformt wird.

20. Verfahren zum Modifizieren der Oberflächeneigenschaften eines festen Polymermaterials mit folgenden Schritten:
Bestrahlen der Oberfläche des festen Polymermaterials;
in Kontakt Bringen der bestrahlten Oberfläche mit einem hinsichtlich des Ethylens ungesättigten, funktionelle Amid-Gruppen aufweisenden Monomer und einer Quelle für oxidierende Metall-Ionen unter Bedingungen, die das Monomer auf die bestrahlte Oberfläche graften, um ein Graftpolymer mit funktionellen Amid-Gruppen darauf zu bilden;
in Kontakt Bringen des Graftpolymers mit funktionellen Amid- Gruppen mit einer eine Quelle für Hydroxid-Ionen und eine Quelle für Hypohalit-Ionen aufweisenden Reaktionsmischung bei einer Temperatur von mindestens etwa 20°C für eine Zeitspanne, die ausreicht, mindestens einen Teil der funktionellen Amid-Gruppen in funktionelle Amin-Gruppen umzuwandeln, um ein festes Polymermaterial mit einer Oberfläche mit einem Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen darauf zu bilden, wobei die Hydroxid-Ionen verglichen zu den Hypohalit-Ionen in einem molaren Überschuß vorhanden sind und wobei die Hydroxid-Ionen in einer Konzentration von nicht mehr als etwa 0,1 M, basierend auf dem Gesamtvolumen der Reaktionsmischung vorhanden sind; und
in Kontakt Bringen des festen, eine Oberfläche mit einem darauf befindlichen Graftpolymer mit funktionellen Amin-Gruppen aufweisenden Polymermaterials mit einem Biomolekül unter Bedingungen, die geeignet sind, das Biomolekül fest an der Oberfläche zu binden.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für Hydroxid-Ionen eine oder mehrere Hydroxid-Basen enthält und daß die Quelle für Hypohalit-Ionen eine oder mehrere hypohalische Säuren, ein oder mehrere Hypohalit-Salze oder Mischungen davon aufweist.

22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis von Hydroxid-Ionen zu Hypohalit-Ionen zumindest etwa 3 : 1 und nicht mehr als etwa 20 : 1 beträgt.

23. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur in einem Bereich von etwa 20°C bis 30°C liegt.

24. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül Heparin oder ein Salz davon ist und daß das hinsichtlich Ethylen ungesättigte Monomer Acrylamid ist.

25. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche mit bis zu 50 µg des Biomoleküls pro Quadratzentimeter modifiziert wird.

26. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche biokompatibel geformt wird.

27. Modifiziertes Polymer, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 20.

28. Medizinisches Gerät, herstellbar nach dem Verfahren nach Anspruch 1.