JP2003180352A - Ｅｒｗｉｎｉａタイプクレアチナーゼバリアント - Google Patents
ＥｒｗｉｎｉａタイプクレアチナーゼバリアントInfo
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】臨床的又は工業的用途において安定かつ効率よ
く用いうるクレアチナーゼ、試料中のクレアチニン及び
／又はクレアチン濃度の測定のためのそれらの使用を提
供すること。 【解決手段】特定の配列の選ばれた位置で少なくとも１
つのアミノ酸置換を含有する、クレアチナーゼ活性を有
する、改変Ｅｒｗｉｎｉａタイプクレアチナーゼバリア
ント；該バリアントを含有した、クレアチン測定用試
薬；対象試料を、該バリアントとサルコシンオキシダー
ゼとペルオキシダーゼと過酸化水素検出用試薬とを含有
した試薬とインキュベートし、生成した過酸化水素と、
試料中のクレアチン濃度とを関連付けるクレアチン検出
方法；対象試料を、該バリアントとクレアチニナーゼと
サルコシンオキシダーゼとペルオキシダーゼと過酸化水
素検出用試薬とを含有した試薬とインキュベートすし、
生成した過酸化水素と、試料中のクレアチニン濃度とを
関連付けるクレアチニン検出方法。
く用いうるクレアチナーゼ、試料中のクレアチニン及び
／又はクレアチン濃度の測定のためのそれらの使用を提
供すること。 【解決手段】特定の配列の選ばれた位置で少なくとも１
つのアミノ酸置換を含有する、クレアチナーゼ活性を有
する、改変Ｅｒｗｉｎｉａタイプクレアチナーゼバリア
ント；該バリアントを含有した、クレアチン測定用試
薬；対象試料を、該バリアントとサルコシンオキシダー
ゼとペルオキシダーゼと過酸化水素検出用試薬とを含有
した試薬とインキュベートし、生成した過酸化水素と、
試料中のクレアチン濃度とを関連付けるクレアチン検出
方法；対象試料を、該バリアントとクレアチニナーゼと
サルコシンオキシダーゼとペルオキシダーゼと過酸化水
素検出用試薬とを含有した試薬とインキュベートすし、
生成した過酸化水素と、試料中のクレアチニン濃度とを
関連付けるクレアチニン検出方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｅｒｗｉｎｉａタ
イプクレアチナーゼ (EC 3.5.3.3、別名：クレアチンア
ミジノヒドロラーゼ) のバリアントをコードする変異遺
伝子、これらの遺伝子にコードされるクレアチナーゼバ
リアント及びこれらのクレアチナーゼバリアントの種々
の応用、特に、試料中のクレアチニン及び／又はクレア
チン濃度の測定のためのそれらの使用に関する。
イプクレアチナーゼ (EC 3.5.3.3、別名：クレアチンア
ミジノヒドロラーゼ) のバリアントをコードする変異遺
伝子、これらの遺伝子にコードされるクレアチナーゼバ
リアント及びこれらのクレアチナーゼバリアントの種々
の応用、特に、試料中のクレアチニン及び／又はクレア
チン濃度の測定のためのそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】クレアチン及びクレアチニンは、通常、
血液及び尿に見出され、***、慢性腎炎、急性腎炎、
巨人症、持続強直性筋ジストロフィー及びいくつかの他
の関連疾患を診断するための非常に重要なパラメーター
として用いられ得る。このような日常の診断目的のため
に、血液及び尿中のクレアチニン及びクレアチン濃度
は、迅速かつ正確に測定される必要がある（非特許文献
１、非特許文献２及び非特許文献３を参照のこと）
血液及び尿に見出され、***、慢性腎炎、急性腎炎、
巨人症、持続強直性筋ジストロフィー及びいくつかの他
の関連疾患を診断するための非常に重要なパラメーター
として用いられ得る。このような日常の診断目的のため
に、血液及び尿中のクレアチニン及びクレアチン濃度
は、迅速かつ正確に測定される必要がある（非特許文献
１、非特許文献２及び非特許文献３を参照のこと）
【０００３】一般的に、クレアチナーゼは、クレアチン
から尿素及びサルコシンへの加水分解を触媒する (例え
ば、クレアチニナーゼを介して、クレアチニンから生成
される) 。サルコシンオキシダーゼの存在下、サルコシ
ンは、酸化され、過酸化水素が生成される。形成された
前記過酸化水素は、過酸化水素の測定の標準手法、例え
ば、西洋ワサビペルオキシダーゼにより触媒される比色
分析法により測定される。これらの共役反応を介して、
試料中のクレアチニン及び／又はクレアチンは、迅速か
つ定量的に測定されうる (非特許文献４及び非特許文献
５を参照のこと) 。
から尿素及びサルコシンへの加水分解を触媒する (例え
ば、クレアチニナーゼを介して、クレアチニンから生成
される) 。サルコシンオキシダーゼの存在下、サルコシ
ンは、酸化され、過酸化水素が生成される。形成された
前記過酸化水素は、過酸化水素の測定の標準手法、例え
ば、西洋ワサビペルオキシダーゼにより触媒される比色
分析法により測定される。これらの共役反応を介して、
試料中のクレアチニン及び／又はクレアチンは、迅速か
つ定量的に測定されうる (非特許文献４及び非特許文献
５を参照のこと) 。
【０００４】クレアチナーゼ活性を有する酵素は、アリ
スロバクター(Arthrobacter) (非特許文献６、非特許文
献７及び非特許文献８を参照のこと) 、バチルス(Bacil
lus)(非特許文献９を参照のこと) 、アルカリジェネス
(Alcaligenes)(非特許文献１０を参照のこと) 、シュー
ドモナス(Pseudomonas)(非特許文献１１を参照のこと)
、フラボバクテリウム(Flavobacterium) (非特許文献
１２を参照のこと) 等の種々の微生物に見出されてい
る。
スロバクター(Arthrobacter) (非特許文献６、非特許文
献７及び非特許文献８を参照のこと) 、バチルス(Bacil
lus)(非特許文献９を参照のこと) 、アルカリジェネス
(Alcaligenes)(非特許文献１０を参照のこと) 、シュー
ドモナス(Pseudomonas)(非特許文献１１を参照のこと)
、フラボバクテリウム(Flavobacterium) (非特許文献
１２を参照のこと) 等の種々の微生物に見出されてい
る。
【０００５】種々の微生物から得られたいくつかのクレ
アチナーゼ酵素は、臨床試験のための試薬として工業的
に生産され、使用されている。しかしながら、クレアチ
ナーゼ酵素の分野の実情及び／又はクレアチンアッセイ
の実情においては、前記クレアチナーゼ酵素は、一般
に、かかるアッセイにとって、あるいはかかるアッセイ
における主要な限定因子である。
アチナーゼ酵素は、臨床試験のための試薬として工業的
に生産され、使用されている。しかしながら、クレアチ
ナーゼ酵素の分野の実情及び／又はクレアチンアッセイ
の実情においては、前記クレアチナーゼ酵素は、一般
に、かかるアッセイにとって、あるいはかかるアッセイ
における主要な限定因子である。
【０００６】広い産業、特に診断への応用性の重要な基
準は、溶解性、伝導性 (電気シグナル生成及び測定の場
合) 、安定性及びクレアチンを基質とする酵素活性を含
む。明らかに、安定性 (例えば、短期熱安定性又は長期
熱安定性) 及び酵素活性は、日常の応用に、特に関連
し、あるいは重要である。シューマン(Schumann)ら (非
特許文献１３を参照のこと) は、DTE 、ウシ血清アルブ
ミン(BSA) 、グリセロール等の「非本質的な因子(extri
nsic factor)」は、P. putida のクレアチナーゼの安定
性を向上させうることを示した。しかし、これらの非本
質的な因子は、一般に、クレアチニナーゼ、クレアチナ
ーゼ、サルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを
用いる共役クレアチニン及び／又はクレアチンアッセイ
系の条件と相性がよくないという欠点がある。
準は、溶解性、伝導性 (電気シグナル生成及び測定の場
合) 、安定性及びクレアチンを基質とする酵素活性を含
む。明らかに、安定性 (例えば、短期熱安定性又は長期
熱安定性) 及び酵素活性は、日常の応用に、特に関連
し、あるいは重要である。シューマン(Schumann)ら (非
特許文献１３を参照のこと) は、DTE 、ウシ血清アルブ
ミン(BSA) 、グリセロール等の「非本質的な因子(extri
nsic factor)」は、P. putida のクレアチナーゼの安定
性を向上させうることを示した。しかし、これらの非本
質的な因子は、一般に、クレアチニナーゼ、クレアチナ
ーゼ、サルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを
用いる共役クレアチニン及び／又はクレアチンアッセイ
系の条件と相性がよくないという欠点がある。
【０００７】当該分野で公知の全てのネイティブ又は野
生型クレアチナーゼ酵素は、熱安定性及びクレアチンに
対するKm値に関して特定の限定を呈する。例えば、バチ
ルス(Bacillus)由来の酵素は、40℃を超える温度では、
不安定である (特許文献１を参照のこと) 。シュードモ
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来のクレアチナー
ゼは、低めの保存安定性 (前記非特許文献１３) 及び高
めのKm値 (特許文献２を参照のこと) の両方を有し、結
果的に、前記酵素は、サルコシンオキシダーゼとペルオ
キシダーゼとを助剤としてさらに用いる前記共役クレア
チンアッセイに必要とされる液体処方でのクレアチン測
定に不適である。
生型クレアチナーゼ酵素は、熱安定性及びクレアチンに
対するKm値に関して特定の限定を呈する。例えば、バチ
ルス(Bacillus)由来の酵素は、40℃を超える温度では、
不安定である (特許文献１を参照のこと) 。シュードモ
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)由来のクレアチナー
ゼは、低めの保存安定性 (前記非特許文献１３) 及び高
めのKm値 (特許文献２を参照のこと) の両方を有し、結
果的に、前記酵素は、サルコシンオキシダーゼとペルオ
キシダーゼとを助剤としてさらに用いる前記共役クレア
チンアッセイに必要とされる液体処方でのクレアチン測
定に不適である。
【０００８】コリネバクテリウム(Corynebacterium)
(特許文献３を参照のこと) 、ミクロコッカス(Micrococ
cus) 又はバチルス(Bacillus) (特許文献４を参照のこ
と) から単離されたクレアチナーゼは、高い温度で不安
定であることがわかっており、それゆえ、いずれも、長
期安定な液体アッセイ試薬の処方に不適である。アルカ
リンジェネス(Alcalingenes)由来のクレアチナーゼは、
Km値が13 mM であり、３０分間40℃の温度で安定である
ことが報告されている (特許文献５を参照のこと) 。
(特許文献３を参照のこと) 、ミクロコッカス(Micrococ
cus) 又はバチルス(Bacillus) (特許文献４を参照のこ
と) から単離されたクレアチナーゼは、高い温度で不安
定であることがわかっており、それゆえ、いずれも、長
期安定な液体アッセイ試薬の処方に不適である。アルカ
リンジェネス(Alcalingenes)由来のクレアチナーゼは、
Km値が13 mM であり、３０分間40℃の温度で安定である
ことが報告されている (特許文献５を参照のこと) 。
【０００９】改変された安定性プロファイルを有する変
異体を創出するためにP. putida クレアチナーゼへの点
変異を導入するためのランダム変異及び部位特異的変異
を用いた遺伝子工学的に作製されたクレアチナーゼにつ
いての文献報告は、ほんのわずかである (非特許文献１
４を参照のこと) 。P. putida のクレアチナーゼにおい
てA109V, V355M又はV182I を有する3 つの点変異体、P.
putida のクレアチナーゼにおいてA109V とV355M とを
有する1 つの二重変異体及びP. putida のクレアチナー
ゼにおいて全３つの置換を有する1 つの三重変異体を生
成し、それらの物理学的性質及び酵素学的性質に関して
野生型酵素と比較した。物理化学測定は、前記変異が、
全体の安定性をわずかに増加させることを示した。しか
しながら、最もよい変異体でさえ、高い温度、例えば、
45℃以上の温度等で不安定である。触媒特性は、野生型
酵素の範囲であるか、あるいは野生型酵素に及ばないの
が現状である。
異体を創出するためにP. putida クレアチナーゼへの点
変異を導入するためのランダム変異及び部位特異的変異
を用いた遺伝子工学的に作製されたクレアチナーゼにつ
いての文献報告は、ほんのわずかである (非特許文献１
４を参照のこと) 。P. putida のクレアチナーゼにおい
てA109V, V355M又はV182I を有する3 つの点変異体、P.
putida のクレアチナーゼにおいてA109V とV355M とを
有する1 つの二重変異体及びP. putida のクレアチナー
ゼにおいて全３つの置換を有する1 つの三重変異体を生
成し、それらの物理学的性質及び酵素学的性質に関して
野生型酵素と比較した。物理化学測定は、前記変異が、
全体の安定性をわずかに増加させることを示した。しか
しながら、最もよい変異体でさえ、高い温度、例えば、
45℃以上の温度等で不安定である。触媒特性は、野生型
酵素の範囲であるか、あるいは野生型酵素に及ばないの
が現状である。
【００１０】E. coli XL1-Red 株(Stratagene, Cat. N
r. 200 129)中において、イン・ビボ変異アプローチを
用いて、野生型酵素に比較して、より低いKm値のアルカ
リジェネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)由来ク
レアチナーゼバリアントを生成する方法が報告されてい
る (特許文献６を参照のこと) 。前記クレアチナーゼバ
リアントのKm値は、4.5mM 〜9.0mM の範囲であった。
r. 200 129)中において、イン・ビボ変異アプローチを
用いて、野生型酵素に比較して、より低いKm値のアルカ
リジェネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)由来ク
レアチナーゼバリアントを生成する方法が報告されてい
る (特許文献６を参照のこと) 。前記クレアチナーゼバ
リアントのKm値は、4.5mM 〜9.0mM の範囲であった。
【００１１】例えば、上記で論議したように、種々の微
生物由来クレアチナーゼの単離及び精製又はかかる酵素
の遺伝子的改変のいずれかをねらいとする当該分野で公
知の試みは、これまで、重要な工業的性質を欠く酵素を
いまだにもたらしていることが要約されうる。
生物由来クレアチナーゼの単離及び精製又はかかる酵素
の遺伝子的改変のいずれかをねらいとする当該分野で公
知の試みは、これまで、重要な工業的性質を欠く酵素を
いまだにもたらしていることが要約されうる。
【００１２】したがって、特に、向上した安定性及び／
又はその基質であるクレアチンに対するより低いKm値に
関する向上した性質を有する変異体型のクレアチナーゼ
について多大な要求及び臨床的必要性がある。
又はその基質であるクレアチンに対するより低いKm値に
関する向上した性質を有する変異体型のクレアチナーゼ
について多大な要求及び臨床的必要性がある。
【００１３】
【特許文献１】米国特許第4,420,562 号明細書(US 4,42
0,562)
0,562)
【特許文献２】欧州特許第0 291 055 号明細書(EP 0 29
1 055)
1 055)
【特許文献３】独国特許発明第2 659 878 号明細書(DE
2 659 878)
2 659 878)
【特許文献４】独国特許発明第3 024 915 号明細書(DE
3 024 915)
3 024 915)
【特許文献５】米国特許第5,451,520 号明細書(US 5,45
1,520)
1,520)
【特許文献６】欧州特許第0 790 303 号明細書(EP 0 79
0 303)
0 303)
【非特許文献１】シューマッハー(Schumacher, G.)ら,
Ann Biol Clin 51 (1993) 815-819
Ann Biol Clin 51 (1993) 815-819
【非特許文献２】フジタ(Fujita, T.)ら, Clin Chem 39
(1993) 2130-2136
(1993) 2130-2136
【非特許文献３】スペンサー(Spencer, K.), Ann Clin
Biochem 23 (1986) 1-25
Biochem 23 (1986) 1-25
【非特許文献４】コペッツキー(Kopetzki, E.)ら, Clin
Chem 40 (1994) 688-704
Chem 40 (1994) 688-704
【非特許文献５】ベイエル(Beyer, C.) ら, Clin Chem
39 (1993) 1743-1744
39 (1993) 1743-1744
【非特許文献６】カプラン(Kaplan, A.)，スザボ(Szab
o, L. L.), Mol Cell Biochem 3(1974) 17-25
o, L. L.), Mol Cell Biochem 3(1974) 17-25
【非特許文献７】カプラン(Kaplan, A.), ナウラー(Nau
gler, D.), Mol Cell Biochem3 (1974) 9-15
gler, D.), Mol Cell Biochem3 (1974) 9-15
【非特許文献８】ニシヤ(Nishiya, Y.) ら, Mol Gen Ge
net 257 (1998) 581-586
net 257 (1998) 581-586
【非特許文献９】スズキ(Suzuki, K.)ら, Journal of F
ermentation & Bioengineering76 (1993) 77-81
ermentation & Bioengineering76 (1993) 77-81
【非特許文献１０】マツダ(Matsuda, Y.) ら, Chem. Ph
arm. Bull. 34 (1986) 2155-2160
arm. Bull. 34 (1986) 2155-2160
【非特許文献１１】ホング(Hong, M. C.) ら, Biochem
Genet 36 (1998) 407-415
Genet 36 (1998) 407-415
【非特許文献１２】コヤマ(Koyama, Y.)ら, Agric Biol
Chem 54 (1990) 1453-1457
Chem 54 (1990) 1453-1457
【非特許文献１３】シューマン(Schumann, J.)ら, Biol
Chem Hoppe Seyler 374 (1993)427-434
Chem Hoppe Seyler 374 (1993)427-434
【非特許文献１４】シューマン(Schumann, J.)ら, Prot
ein Sci 2 (1993) 1612-1620
ein Sci 2 (1993) 1612-1620
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、顕著により
低いKm値若しくは顕著に向上した安定性又はこれらの両
方を有する新規な変異体又はバリアントのクレアチナー
ゼを提供することを目的とする。また、本発明は、少な
い操作により実施することができ、測定を容易にし、誤
操作の機会を減らすことができるクレアチン測定用試薬
を提供することを目的とする。さらに、本発明は、測定
を容易にし、誤操作の機会を減らすことができ、効率よ
く検出できる、クレアチンの検出方法を提供することを
目的とする。また、本発明は、測定を容易にし、誤操作
の機会を減らすことができ、効率よく検出できる、クレ
アチニンの検出方法を提供することを目的とする。
低いKm値若しくは顕著に向上した安定性又はこれらの両
方を有する新規な変異体又はバリアントのクレアチナー
ゼを提供することを目的とする。また、本発明は、少な
い操作により実施することができ、測定を容易にし、誤
操作の機会を減らすことができるクレアチン測定用試薬
を提供することを目的とする。さらに、本発明は、測定
を容易にし、誤操作の機会を減らすことができ、効率よ
く検出できる、クレアチンの検出方法を提供することを
目的とする。また、本発明は、測定を容易にし、誤操作
の機会を減らすことができ、効率よく検出できる、クレ
アチニンの検出方法を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明は、配列番号：2
に示されるアミノ酸配列におけるN130位、M203位、I278
位、I304位及びF395位からなる群より選ばれた位置に対
応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含有す
ることを特徴とする、クレアチナーゼ活性を有する野生
型クレアチナーゼに対して改変されたＥｒｗｉｎｉａタ
イプクレアチナーゼのバリアントに関する。
に示されるアミノ酸配列におけるN130位、M203位、I278
位、I304位及びF395位からなる群より選ばれた位置に対
応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換を含有す
ることを特徴とする、クレアチナーゼ活性を有する野生
型クレアチナーゼに対して改変されたＥｒｗｉｎｉａタ
イプクレアチナーゼのバリアントに関する。
【００１６】本発明のバリアントクレアチナーゼは、そ
れぞれの野生型酵素と比較して向上した性質を呈する。
より低い伝導性、向上した安定性又はクレアチンに対す
るより低いKm値のような改変された性質を別々又は組合
せのいずれかで発揮する改変バリアントが言及される。
れぞれの野生型酵素と比較して向上した性質を呈する。
より低い伝導性、向上した安定性又はクレアチンに対す
るより低いKm値のような改変された性質を別々又は組合
せのいずれかで発揮する改変バリアントが言及される。
【００１７】また、本発明は、上述の本発明のクレアチ
ナーゼを含有したクレアチン測定用試薬に関する。それ
は、特に、前記クレアチナーゼバリアントと、さらにサ
ルコシンオキシダーゼと過酸化水素検出用試薬とを含有
した試薬に関する。
ナーゼを含有したクレアチン測定用試薬に関する。それ
は、特に、前記クレアチナーゼバリアントと、さらにサ
ルコシンオキシダーゼと過酸化水素検出用試薬とを含有
した試薬に関する。
【００１８】当該技術分野で公知の野生型若しくは変異
酵素に比べて顕著に改良された性質のため、本発明のバ
リアントクレアチナーゼは、クレアチンの検出方法にお
いて非常に有利に用いられる。
酵素に比べて顕著に改良された性質のため、本発明のバ
リアントクレアチナーゼは、クレアチンの検出方法にお
いて非常に有利に用いられる。
【００１９】すなわち、本発明は、〔１〕 配列番号：
2 に示されるアミノ酸配列におけるN130位、M203位、I2
78位、I304位及びF395位からなる群より選ばれた位置に
対応する位置での少なくとも1 つのアミノ酸置換を含有
することを特徴とする、クレアチナーゼ活性を有する、
野生型クレアチナーゼに対して改変されたＥｒｗｉｎｉ
ａタイプのクレアチナーゼバリアント、〔２〕 N130位
又はI278位に対応するアミノ酸位置での少なくとも1 つ
の置換を含有することをさらに特徴とする、前記〔１〕
記載のクレアチナーゼバリアント、〔３〕 56℃におけ
る向上した安定性を呈することをさらに特徴とする、前
記〔２〕記載のクレアチナーゼバリアント、〔４〕 I3
04位又はF395位に対応するアミノ酸位置における少なく
とも1 つのアミノ酸置換を含有することをさらに特徴と
する、前記〔１〕記載のクレアチナーゼバリアント、
〔５〕 クレアチンの酵素的切断におけるより低いKm値
を示すことをさらに特徴とする、前記〔４〕記載のクレ
アチナーゼバリアント、〔６〕 配列番号：2 に示され
るアミノ酸配列におけるN130位及びI278位から選ばれた
位置に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換
と、I304位及びF395位から選ばれた少なくとも１つの置
換とを含有することをさらに特徴とする、前記〔１〕〜
〔５〕いずれか１項に記載のクレアチナーゼバリアン
ト、〔７〕 56℃における向上した安定性と、クレアチ
ンの酵素的切断における向上した触媒活性との両方を示
すことをさらに特徴とする、前記〔６〕記載のクレアチ
ナーゼバリアント、〔８〕 前記〔１〕〜〔７〕いずれ
か１項に記載のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼ
バリアントを含有してなる、クレアチン測定用試薬、
2 に示されるアミノ酸配列におけるN130位、M203位、I2
78位、I304位及びF395位からなる群より選ばれた位置に
対応する位置での少なくとも1 つのアミノ酸置換を含有
することを特徴とする、クレアチナーゼ活性を有する、
野生型クレアチナーゼに対して改変されたＥｒｗｉｎｉ
ａタイプのクレアチナーゼバリアント、〔２〕 N130位
又はI278位に対応するアミノ酸位置での少なくとも1 つ
の置換を含有することをさらに特徴とする、前記〔１〕
記載のクレアチナーゼバリアント、〔３〕 56℃におけ
る向上した安定性を呈することをさらに特徴とする、前
記〔２〕記載のクレアチナーゼバリアント、〔４〕 I3
04位又はF395位に対応するアミノ酸位置における少なく
とも1 つのアミノ酸置換を含有することをさらに特徴と
する、前記〔１〕記載のクレアチナーゼバリアント、
〔５〕 クレアチンの酵素的切断におけるより低いKm値
を示すことをさらに特徴とする、前記〔４〕記載のクレ
アチナーゼバリアント、〔６〕 配列番号：2 に示され
るアミノ酸配列におけるN130位及びI278位から選ばれた
位置に対応する位置での少なくとも１つのアミノ酸置換
と、I304位及びF395位から選ばれた少なくとも１つの置
換とを含有することをさらに特徴とする、前記〔１〕〜
〔５〕いずれか１項に記載のクレアチナーゼバリアン
ト、〔７〕 56℃における向上した安定性と、クレアチ
ンの酵素的切断における向上した触媒活性との両方を示
すことをさらに特徴とする、前記〔６〕記載のクレアチ
ナーゼバリアント、〔８〕 前記〔１〕〜〔７〕いずれ
か１項に記載のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼ
バリアントを含有してなる、クレアチン測定用試薬、
〔９〕 サルコシンオキシダーゼと過酸化水素検出用試
薬とをさらに含有することをさらに特徴とする、前記
〔８〕記載の試薬、〔１０〕 ａ）解析対象の試料をb)
前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載のＥｒｗｉｎｉ
ａタイプのクレアチナーゼバリアントと、サルコシンオ
キシダーゼと、ペルオキシダーゼと、過酸化水素検出用
試薬とを含有した試薬とともにインキュベートするステ
ップ、及びｂ）生成した過酸化水素と、試料中のクレア
チンの濃度とを関連付けるステップ、を含む、クレアチ
ンの検出方法、〔１１〕 ａ）解析対象の試料を、前記
〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載のＥｒｗｉｎｉａタ
イプのクレアチナーゼバリアントと、クレアチニナーゼ
と、サルコシンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、
過酸化水素検出用試薬とを含有した試薬とともにインキ
ュベートするステップ、及びｂ）生成した過酸化水素
と、試料中のクレアチニンの濃度とを関連付けるステッ
プ、を含む、クレアチニンの検出方法、並びに〔１２〕
野生型酵素をクローニングする工程、クローン化され
た野生型酵素遺伝子に変異を導入する工程、野生型酵素
に比べて、向上した熱安定性又は向上したクレアチナー
ゼ活性を有するバリアントを選択する工程、及びバリア
ントを組換え的に生産する工程を含む、Ｅｒｗｉｎｉａ
タイプのクレアチナーゼバリアントの生産方法、に関す
る。
薬とをさらに含有することをさらに特徴とする、前記
〔８〕記載の試薬、〔１０〕 ａ）解析対象の試料をb)
前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載のＥｒｗｉｎｉ
ａタイプのクレアチナーゼバリアントと、サルコシンオ
キシダーゼと、ペルオキシダーゼと、過酸化水素検出用
試薬とを含有した試薬とともにインキュベートするステ
ップ、及びｂ）生成した過酸化水素と、試料中のクレア
チンの濃度とを関連付けるステップ、を含む、クレアチ
ンの検出方法、〔１１〕 ａ）解析対象の試料を、前記
〔１〕〜〔７〕いずれか１項に記載のＥｒｗｉｎｉａタ
イプのクレアチナーゼバリアントと、クレアチニナーゼ
と、サルコシンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、
過酸化水素検出用試薬とを含有した試薬とともにインキ
ュベートするステップ、及びｂ）生成した過酸化水素
と、試料中のクレアチニンの濃度とを関連付けるステッ
プ、を含む、クレアチニンの検出方法、並びに〔１２〕
野生型酵素をクローニングする工程、クローン化され
た野生型酵素遺伝子に変異を導入する工程、野生型酵素
に比べて、向上した熱安定性又は向上したクレアチナー
ゼ活性を有するバリアントを選択する工程、及びバリア
ントを組換え的に生産する工程を含む、Ｅｒｗｉｎｉａ
タイプのクレアチナーゼバリアントの生産方法、に関す
る。
【００２０】
【発明の実施の形態】本発明は、顕著により低いKm値若
しくは顕著に向上した安定性又はこれらの両方を有する
新規な変異体又はバリアントのクレアチナーゼ（クレア
チナーゼバリアント）を提供する。
しくは顕著に向上した安定性又はこれらの両方を有する
新規な変異体又はバリアントのクレアチナーゼ（クレア
チナーゼバリアント）を提供する。
【００２１】驚くべきことに、そのようなクレアチナー
ゼ酵素は、正確に決められた位置においてＥｒｗｉｎｉ
ａタイプのクレアチナーゼの１若しくは複数のアミノ酸
を変異させることにより、提供することが可能であるこ
とが本発明者らにより見出された。かかる関連位置は、
エルビニア・スピーシーズ(Erwinia sp.) DSM 97-934か
ら単離された野生型クレアチナーゼのアミノ酸位置に対
応するアミノ酸位置として決められ、示される。
ゼ酵素は、正確に決められた位置においてＥｒｗｉｎｉ
ａタイプのクレアチナーゼの１若しくは複数のアミノ酸
を変異させることにより、提供することが可能であるこ
とが本発明者らにより見出された。かかる関連位置は、
エルビニア・スピーシーズ(Erwinia sp.) DSM 97-934か
ら単離された野生型クレアチナーゼのアミノ酸位置に対
応するアミノ酸位置として決められ、示される。
【００２２】第１の態様において、本発明は、配列番
号：2 に示されたアミノ酸配列のN130位、M203位、I278
位、I304位及びF395位からなる群より選ばれた位置に対
応する位置での少なくとも1 つのアミノ酸置換を含有す
ることを特徴とする、クレアチナーゼ活性を有する野生
型クレアチナーゼに対して改変されたＥｒｗｉｎｉａタ
イプのクレアチナーゼバリアントに関する。本発明のＥ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントによれ
ば、向上した安定性及び／又は基質であるクレアチンに
対してより低いKm値を示し、臨床的又は工業的用途にお
いて安定かつ効率よく用いることができるという優れた
効果を発揮する。
号：2 に示されたアミノ酸配列のN130位、M203位、I278
位、I304位及びF395位からなる群より選ばれた位置に対
応する位置での少なくとも1 つのアミノ酸置換を含有す
ることを特徴とする、クレアチナーゼ活性を有する野生
型クレアチナーゼに対して改変されたＥｒｗｉｎｉａタ
イプのクレアチナーゼバリアントに関する。本発明のＥ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントによれ
ば、向上した安定性及び／又は基質であるクレアチンに
対してより低いKm値を示し、臨床的又は工業的用途にお
いて安定かつ効率よく用いることができるという優れた
効果を発揮する。
【００２３】本発明は、Ｅｒｗｉｎｉａタイプのクレア
チナーゼの向上したバリアントに関する。「Ｅｒｗｉｎ
ｉａタイプのクレアチナーゼ」は、配列番号：2 と比較
してアミノ酸レベルで少なくとも85% 配列同一性である
ことにより定義される。
チナーゼの向上したバリアントに関する。「Ｅｒｗｉｎ
ｉａタイプのクレアチナーゼ」は、配列番号：2 と比較
してアミノ酸レベルで少なくとも85% 配列同一性である
ことにより定義される。
【００２４】用いられる用語、例えば、N130は、配列番
号：2 の130 位のアミノ酸アスパラギン(N) を意味する
ことを示す。アミノ酸位置が、１以上のアミノ酸（一文
字表記により記載）を後ろに付けられた場合、例えば、
N130D 又はN130E の場合、これは、野生型の130 位に見
出されるアミノ酸アスパラギンが、アスパラギン酸(D)
又はグルタミン酸(E) に置換されていることを示す。
号：2 の130 位のアミノ酸アスパラギン(N) を意味する
ことを示す。アミノ酸位置が、１以上のアミノ酸（一文
字表記により記載）を後ろに付けられた場合、例えば、
N130D 又はN130E の場合、これは、野生型の130 位に見
出されるアミノ酸アスパラギンが、アスパラギン酸(D)
又はグルタミン酸(E) に置換されていることを示す。
【００２５】クレアチナーゼ (クレアチンアミジノヒド
ロラーゼ、EC3.5.3.3)は、サルコシン及び尿素へのクレ
アチンの加水分解的な切断を触媒する。本触媒活性を有
する酵素は、クレアチナーゼ活性を有するものとして、
当該技術分野で定義される。
ロラーゼ、EC3.5.3.3)は、サルコシン及び尿素へのクレ
アチンの加水分解的な切断を触媒する。本触媒活性を有
する酵素は、クレアチナーゼ活性を有するものとして、
当該技術分野で定義される。
【００２６】クレアチナーゼ酵素は、クレアチニン及び
クレアチン濃度を評価するのに用いられるので、クレア
チナーゼ酵素の使用は、医療診断にきわめて重要であ
る。特に、腎機能をモニターするのに用いられるクレア
チニンクリアランスの評価は重要である。前記酵素クレ
アチナーゼは、このような共役クレアチニン- クレアチ
ンアッセイにおける第2 ステップを触媒する[Siedel,
J., et al., Clinical Chemistry 30 (1984) 968-96
9]。
クレアチン濃度を評価するのに用いられるので、クレア
チナーゼ酵素の使用は、医療診断にきわめて重要であ
る。特に、腎機能をモニターするのに用いられるクレア
チニンクリアランスの評価は重要である。前記酵素クレ
アチナーゼは、このような共役クレアチニン- クレアチ
ンアッセイにおける第2 ステップを触媒する[Siedel,
J., et al., Clinical Chemistry 30 (1984) 968-96
9]。
【００２７】
【化１】
【００２８】前記反応スキームから明らかなように、ク
レアチナーゼは、クレアチン単独の検出又はクレアチニ
ンとクレアチンとを組合わせた検出に用いられるであろ
う。サルコシダーゼの作用で生成される過酸化水素(H20
2)が測定される。好ましくは、−共役試薬 (例えば、4-
AA = 4- アミノ-2,3- ジメチル-1- フェニル-3- ピロゾ
リン-5- オン) と、−ペルオキシダーゼの作用により、
解析対象の試料中において、過酸化物濃度に比例し、そ
れゆえ、クレアチニンとクレアチンとの濃度に比例した
発色シグナル(ベンゾキノン) を生成する発色物質 (例
えば、TBMB = 2,4,6- トリブロモ-3-ヒドロキシ安息香
酸) とを含有した色素系が用いられる。
レアチナーゼは、クレアチン単独の検出又はクレアチニ
ンとクレアチンとを組合わせた検出に用いられるであろ
う。サルコシダーゼの作用で生成される過酸化水素(H20
2)が測定される。好ましくは、−共役試薬 (例えば、4-
AA = 4- アミノ-2,3- ジメチル-1- フェニル-3- ピロゾ
リン-5- オン) と、−ペルオキシダーゼの作用により、
解析対象の試料中において、過酸化物濃度に比例し、そ
れゆえ、クレアチニンとクレアチンとの濃度に比例した
発色シグナル(ベンゾキノン) を生成する発色物質 (例
えば、TBMB = 2,4,6- トリブロモ-3-ヒドロキシ安息香
酸) とを含有した色素系が用いられる。
【００２９】本発明は、対応する野生型酵素に比べて顕
著な向上を示す、野生型クレアチナーゼのバリアントが
提供されうるという驚くべき知見に基づく。本発明によ
る前記向上は、Erwinia sp. DSM 97-934から単離された
クレアチナーゼ酵素のアミノ酸組成とナンバリングに基
づき記載される。本Erwinia sp. 由来の野生型酵素をコ
ードする遺伝子は、クローン化され、シークエンスされ
ている (配列番号：1)。また、Erwinia sp. 由来の野生
型酵素のタンパク質配列は、配列番号：2 に対応するこ
とが見出されている。
著な向上を示す、野生型クレアチナーゼのバリアントが
提供されうるという驚くべき知見に基づく。本発明によ
る前記向上は、Erwinia sp. DSM 97-934から単離された
クレアチナーゼ酵素のアミノ酸組成とナンバリングに基
づき記載される。本Erwinia sp. 由来の野生型酵素をコ
ードする遺伝子は、クローン化され、シークエンスされ
ている (配列番号：1)。また、Erwinia sp. 由来の野生
型酵素のタンパク質配列は、配列番号：2 に対応するこ
とが見出されている。
【００３０】配列番号：２のF59 位、N113位、N203位、
I278位、I304位及びF395位のアミノ酸位置におけるアミ
ノ酸置換は、特に、向上した性質を有する酵素バリアン
トを生産することに関連する。それらの中央における前
記同定された重要なアミノ酸位置を含有した7 アミノ酸
長のアミノ酸配列モチーフ(motives) を用いた比較配列
解析は、対応する位置が、種々の他の生物から単離され
たクレアチナーゼにおいて同定されうる。明らかに、本
発明において述べられる変異は、他の公知及びいまだ同
定されていないクレアチナーゼの対応配列位置を改変す
るためにも用いられうる。用語「位置に対応する」は、
配列番号：２に対する配列アラインメントに基づき、異
なる絶対数の対応配列位置又は対応モチーフ(motive)を
もたらす付加的なアミノ酸を含有又はアミノ酸を欠損し
たクレアチナーゼ酵素とそのバリアントが、さらに見出
され、創出されることを示す。
I278位、I304位及びF395位のアミノ酸位置におけるアミ
ノ酸置換は、特に、向上した性質を有する酵素バリアン
トを生産することに関連する。それらの中央における前
記同定された重要なアミノ酸位置を含有した7 アミノ酸
長のアミノ酸配列モチーフ(motives) を用いた比較配列
解析は、対応する位置が、種々の他の生物から単離され
たクレアチナーゼにおいて同定されうる。明らかに、本
発明において述べられる変異は、他の公知及びいまだ同
定されていないクレアチナーゼの対応配列位置を改変す
るためにも用いられうる。用語「位置に対応する」は、
配列番号：２に対する配列アラインメントに基づき、異
なる絶対数の対応配列位置又は対応モチーフ(motive)を
もたらす付加的なアミノ酸を含有又はアミノ酸を欠損し
たクレアチナーゼ酵素とそのバリアントが、さらに見出
され、創出されることを示す。
【００３１】Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼと他の関連
クレアチナーゼとの間の多重アラインメント及び比較
は、GCG Package Version 10.2のPileUpプログラム〔ジ
ェネティックス コンピュータ グループインコーポレ
ーティッド(Genetics ComputerGroup, Inc.) 〕で行な
われている。PileUpは、Feng, D. F. Doolittle, R.
F., J Mol Evol 25 (1987) 351-60 のプログレッシブア
ラインメント法の単純化を用いた多重配列アラインメン
トを作り出し、したがって、同一、類似又は異種アミノ
酸残基のスコアマトリックスが定義される。本プロセス
は、2 つの整列化配列のクラスターを生成する2 つの最
も類似した (クレアチナーゼ) 配列のペアワイズアライ
ンメントではじめる。ついで、本クラスターは、整列化
配列の次に最も関連した配列又は該整列化配列のクラス
ターに整列化されうる。配列の2 つのクラスターは、2
つの別々の配列のペアワイズアラインメントの単純拡大
により整列化されうる。最終的なアラインメントは、全
配列が最終ペアワイズアラインメントに含まれるまで、
だんだん異なる配列及びクラスターを含む一連のプログ
レッシブ、ペアワイズアラインメントにより達成され
る。
クレアチナーゼとの間の多重アラインメント及び比較
は、GCG Package Version 10.2のPileUpプログラム〔ジ
ェネティックス コンピュータ グループインコーポレ
ーティッド(Genetics ComputerGroup, Inc.) 〕で行な
われている。PileUpは、Feng, D. F. Doolittle, R.
F., J Mol Evol 25 (1987) 351-60 のプログレッシブア
ラインメント法の単純化を用いた多重配列アラインメン
トを作り出し、したがって、同一、類似又は異種アミノ
酸残基のスコアマトリックスが定義される。本プロセス
は、2 つの整列化配列のクラスターを生成する2 つの最
も類似した (クレアチナーゼ) 配列のペアワイズアライ
ンメントではじめる。ついで、本クラスターは、整列化
配列の次に最も関連した配列又は該整列化配列のクラス
ターに整列化されうる。配列の2 つのクラスターは、2
つの別々の配列のペアワイズアラインメントの単純拡大
により整列化されうる。最終的なアラインメントは、全
配列が最終ペアワイズアラインメントに含まれるまで、
だんだん異なる配列及びクラスターを含む一連のプログ
レッシブ、ペアワイズアラインメントにより達成され
る。
【００３２】本発明の意味において、Ｅｒｗｉｎｉａタ
イプのクレアチナーゼバリアントは、その野生型配列に
比べて、配列が、配列番号：2 のN130位、N203位、I278
位、I304位及びF395位からなる群より選ばれた位置に対
応する位置での少なくとも1つのアミノ酸置換を含有す
るものである改変クレアチナーゼ酵素である。
イプのクレアチナーゼバリアントは、その野生型配列に
比べて、配列が、配列番号：2 のN130位、N203位、I278
位、I304位及びF395位からなる群より選ばれた位置に対
応する位置での少なくとも1つのアミノ酸置換を含有す
るものである改変クレアチナーゼ酵素である。
【００３３】野生型酵素が59位にトリプトファン(W) 残
基を含有しない場合、好適なクレアチナーゼバリアント
は、59位にＷを含むように付加的に改変してもよい。し
たがって、本発明の好適なＥｒｗｉｎｉａタイプのクレ
アチナーゼバリアントは、 −アミノ酸置換F59Wと、 −配列番号：2 のN130位に対応する位置、N203位に対応
する位置、I278位に対応する位置、I304位に対応する位
置及びF395位に対応する位置からなる群より選ばれた少
なくとも1 つのさらなるアミノ酸置換とを含む。
基を含有しない場合、好適なクレアチナーゼバリアント
は、59位にＷを含むように付加的に改変してもよい。し
たがって、本発明の好適なＥｒｗｉｎｉａタイプのクレ
アチナーゼバリアントは、 −アミノ酸置換F59Wと、 −配列番号：2 のN130位に対応する位置、N203位に対応
する位置、I278位に対応する位置、I304位に対応する位
置及びF395位に対応する位置からなる群より選ばれた少
なくとも1 つのさらなるアミノ酸置換とを含む。
【００３４】関連のクレアチナーゼ酵素の配列番号：2
の前記位置に対応する位置は、下記配列モチーフ(motiv
es) ：56〜62 (配列番号：3)、127 〜133(配列番号：
4)、200 〜206(配列番号：5)、275 〜281(配列番号：
6)、301 〜307(配列番号：7)、及び392 〜398(配列番
号：8)を用いた配列アラインメントにより簡単に見出さ
れうる。これらの位置は、７アミノ酸のうち６アミノ酸
が同一である場合に対応する。
の前記位置に対応する位置は、下記配列モチーフ(motiv
es) ：56〜62 (配列番号：3)、127 〜133(配列番号：
4)、200 〜206(配列番号：5)、275 〜281(配列番号：
6)、301 〜307(配列番号：7)、及び392 〜398(配列番
号：8)を用いた配列アラインメントにより簡単に見出さ
れうる。これらの位置は、７アミノ酸のうち６アミノ酸
が同一である場合に対応する。
【００３５】本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチ
ナーゼの好適なバリアントは、配列番号：2 のN130位に
対応するアミノ酸位置における変異を含有する。好まし
くは、置換により導入されたアミノ酸残基は、極性残基
又は荷電残基である。置換N130E 又はN130D を含有した
クレアチナーゼバリアントが好適であり、N130D を含有
したバリアントが最も好ましい。
ナーゼの好適なバリアントは、配列番号：2 のN130位に
対応するアミノ酸位置における変異を含有する。好まし
くは、置換により導入されたアミノ酸残基は、極性残基
又は荷電残基である。置換N130E 又はN130D を含有した
クレアチナーゼバリアントが好適であり、N130D を含有
したバリアントが最も好ましい。
【００３６】本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチ
ナーゼの好適なバリアントは、配列番号：2 のM203位に
対応するアミノ酸位置における変異を含有する。好まし
くは、置換により導入されたアミノ酸残基は、脂肪族残
基である。置換M203V 、M203I 又はM203L を含有したク
レアチナーゼバリアントが好ましく、M203V を含有した
バリアントが最も好ましい。
ナーゼの好適なバリアントは、配列番号：2 のM203位に
対応するアミノ酸位置における変異を含有する。好まし
くは、置換により導入されたアミノ酸残基は、脂肪族残
基である。置換M203V 、M203I 又はM203L を含有したク
レアチナーゼバリアントが好ましく、M203V を含有した
バリアントが最も好ましい。
【００３７】Ｅｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼの
好適なバリアントは、配列番号：2のI278位に対応する
アミノ酸位置における変異を含有する。好ましくは、置
換により導入されるアミノ酸残基は、小さい極性残基又
は小さい疎水性残基である。置換I278T 、I278S 、I278
V 又はI278G を含有したクレアチナーゼバリアントが好
ましく、I278T を含有したバリアントが最も好ましい。
好適なバリアントは、配列番号：2のI278位に対応する
アミノ酸位置における変異を含有する。好ましくは、置
換により導入されるアミノ酸残基は、小さい極性残基又
は小さい疎水性残基である。置換I278T 、I278S 、I278
V 又はI278G を含有したクレアチナーゼバリアントが好
ましく、I278T を含有したバリアントが最も好ましい。
【００３８】本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチ
ナーゼの好適なバリアントは、配列番号：2 のI304位に
対応するアミノ酸位置における変異を含有する。好まし
くは、置換により導入されるアミノ酸残基は、脂肪族残
基である。置換I304L 又はI304V を含有したクレアチナ
ーゼバリアントが好ましく、I304L を含有したバリアン
トが最も好ましい。
ナーゼの好適なバリアントは、配列番号：2 のI304位に
対応するアミノ酸位置における変異を含有する。好まし
くは、置換により導入されるアミノ酸残基は、脂肪族残
基である。置換I304L 又はI304V を含有したクレアチナ
ーゼバリアントが好ましく、I304L を含有したバリアン
トが最も好ましい。
【００３９】本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチ
ナーゼの好適なバリアントは、配列番号：2 のF395位に
対応するアミノ酸位置での変異を含有する。好ましく
は、置換により導入されるアミノ酸残基は、脂肪族残基
である。置換F395L 、F395I 又はF395V を含有したクレ
アチナーゼバリアントが好ましく、F395L を含有したバ
リアントが最も好ましい。
ナーゼの好適なバリアントは、配列番号：2 のF395位に
対応するアミノ酸位置での変異を含有する。好ましく
は、置換により導入されるアミノ酸残基は、脂肪族残基
である。置換F395L 、F395I 又はF395V を含有したクレ
アチナーゼバリアントが好ましく、F395L を含有したバ
リアントが最も好ましい。
【００４０】さらに好ましい態様において、本発明のＥ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、配
列番号：2 のN130位、N203位、I278位、I304位及びF395
位からなる群より選ばれた位置に対応する少なくとも2
つの置換を含有する。
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、配
列番号：2 のN130位、N203位、I278位、I304位及びF395
位からなる群より選ばれた位置に対応する少なくとも2
つの置換を含有する。
【００４１】好ましい態様において、本発明のＥｒｗｉ
ｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、N130位又
はI278位に対応する少なくとも1 つのアミノ酸の置換を
含有する。
ｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、N130位又
はI278位に対応する少なくとも1 つのアミノ酸の置換を
含有する。
【００４２】配列番号：2 の130 位又は278 位に対応す
る位置のアミノ酸の置換は、Ｅｒｗｉｎｉａタイプのク
レアチナーゼバリアントの安定性を増加させるのにきわ
めて重要であることが見出されている。
る位置のアミノ酸の置換は、Ｅｒｗｉｎｉａタイプのク
レアチナーゼバリアントの安定性を増加させるのにきわ
めて重要であることが見出されている。
【００４３】さらに好適なＥｒｗｉｎｉａタイプのクレ
アチナーゼバリアントは、130 位に対応するアミノ酸位
置でのD 若しくはE(アスパラギン酸若しくはグルタミン
酸）又は278 位に対応するアミノ酸位置におけるスレオ
ニン(T) による少なくとも1つの置換を含有する。上記
で議論された両方のアミノ酸位置における置換を含有し
たバリアントは、さらに好ましい態様を示す。
アチナーゼバリアントは、130 位に対応するアミノ酸位
置でのD 若しくはE(アスパラギン酸若しくはグルタミン
酸）又は278 位に対応するアミノ酸位置におけるスレオ
ニン(T) による少なくとも1つの置換を含有する。上記
で議論された両方のアミノ酸位置における置換を含有し
たバリアントは、さらに好ましい態様を示す。
【００４４】用語「安定性」は、一般的に、pH耐性、耐
塩性又は熱不活性化などの種々の多くの性質を述べるの
に用いられる。本発明によれば、安定性は、熱又は保存
安定性に関する。熱又は保存安定性は、適切なモデル系
を用いて簡単に解析される。
塩性又は熱不活性化などの種々の多くの性質を述べるの
に用いられる。本発明によれば、安定性は、熱又は保存
安定性に関する。熱又は保存安定性は、適切なモデル系
を用いて簡単に解析される。
【００４５】さらに好ましい態様において、本発明のＥ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、向
上した長期安定性を示すことに特徴がある。
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、向
上した長期安定性を示すことに特徴がある。
【００４６】保存安定性は、試薬の長期安定性、例え
ば、数ヶ月又は数年の保存下での安定性に関する。長期
保存安定性は、35℃で21日間、クレアチナーゼを含む溶
液を処理することにより評価される。本モデル系におけ
る安定性は、4 〜8 ℃の間の保存温度を用いた少なくと
も18ヶ月の保存安定性に対応することが知られている。
クレアチナーゼバリアントは、本モデルによる保存後
で、元の酵素活性の少なくとも90% がまだ見出される場
合に安定であると考えられる。本発明の改変バリアント
により、元の酵素活性の少なくとも90% が残っており、
日常の手法で測定されうる。
ば、数ヶ月又は数年の保存下での安定性に関する。長期
保存安定性は、35℃で21日間、クレアチナーゼを含む溶
液を処理することにより評価される。本モデル系におけ
る安定性は、4 〜8 ℃の間の保存温度を用いた少なくと
も18ヶ月の保存安定性に対応することが知られている。
クレアチナーゼバリアントは、本モデルによる保存後
で、元の酵素活性の少なくとも90% がまだ見出される場
合に安定であると考えられる。本発明の改変バリアント
により、元の酵素活性の少なくとも90% が残っており、
日常の手法で測定されうる。
【００４７】熱安定性は、短期ストレスモデル、例え
ば、56℃で20分間での酵素のインキュベーションにより
評価される。このような短期ストレスモデルは、試薬が
室温で出荷されてもよいかどうか、あるいは冷却が必要
であるかどうかを決定するのに非常に重要である。クレ
アチナーゼ又はそのバリアントは、56℃で20分後、元の
クレアチナーゼ活性の少なくとも30% が残っている場
合、任意の安定性基準( すなわち、短期熱ストレス安定
性基準) に適合するとして決められる。本発明のクレア
チナーゼの好適なバリアントは、56℃での向上した安定
性を示す。すなわち、56℃で20分のインキュベーション
の後、元の活性の少なくとも30% が残る。
ば、56℃で20分間での酵素のインキュベーションにより
評価される。このような短期ストレスモデルは、試薬が
室温で出荷されてもよいかどうか、あるいは冷却が必要
であるかどうかを決定するのに非常に重要である。クレ
アチナーゼ又はそのバリアントは、56℃で20分後、元の
クレアチナーゼ活性の少なくとも30% が残っている場
合、任意の安定性基準( すなわち、短期熱ストレス安定
性基準) に適合するとして決められる。本発明のクレア
チナーゼの好適なバリアントは、56℃での向上した安定
性を示す。すなわち、56℃で20分のインキュベーション
の後、元の活性の少なくとも30% が残る。
【００４８】短期熱ストレス、すなわち、熱安定性と、
長期保存安定性との両方に関して、両方の向上を示すＥ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントが見出
された。熱ストレスと長期保存条件との両方の下、向上
した安定性を示すかかるバリアントは、本発明のさらに
好ましい態様を示す。
長期保存安定性との両方に関して、両方の向上を示すＥ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントが見出
された。熱ストレスと長期保存条件との両方の下、向上
した安定性を示すかかるバリアントは、本発明のさらに
好ましい態様を示す。
【００４９】本発明のさらに好ましい態様において、Ｅ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、配
列番号：2 のI304位又はF395位に対応する位置の少なく
とも1 つにおけるアミノ酸置換を含有することを特徴と
する。
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、配
列番号：2 のI304位又はF395位に対応する位置の少なく
とも1 つにおけるアミノ酸置換を含有することを特徴と
する。
【００５０】当該技術の状態( 上記参照のこと) から公
知のように、これまで、すぐに使える種々のクレアチナ
ーゼによるクレアチンの切断の触媒性質は、重要である
と考えられる。これらの触媒性質の1 つは、Km値の点に
関して最も簡単に表現される。
知のように、これまで、すぐに使える種々のクレアチナ
ーゼによるクレアチンの切断の触媒性質は、重要である
と考えられる。これらの触媒性質の1 つは、Km値の点に
関して最も簡単に表現される。
【００５１】酵素のKm値は、酵素と基質との間の結合親
和性と、酵素- 結合基質が対応の反応産物に変換される
速度との両方を反映する。Km値が高くなればなるほど、
酵素の触媒効率は、より低くなる。驚くべきことに、配
列番号：2 の304 位と395 位とに対応するアミノ酸位置
が、改変された、すなわち、より低いKm値を有するクレ
アチナーゼバリアントを創出するために非常に重要であ
ることが見出された。好ましい態様において、Ｅｒｗｉ
ｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、304 位に
対応するアミノ酸位置でのアミノ酸L 若しくはV 、又は
395 位に対応するアミノ酸位置でのアミノ酸L 、I 又は
V の少なくとも1 つのアミノ酸置換を含有する。
和性と、酵素- 結合基質が対応の反応産物に変換される
速度との両方を反映する。Km値が高くなればなるほど、
酵素の触媒効率は、より低くなる。驚くべきことに、配
列番号：2 の304 位と395 位とに対応するアミノ酸位置
が、改変された、すなわち、より低いKm値を有するクレ
アチナーゼバリアントを創出するために非常に重要であ
ることが見出された。好ましい態様において、Ｅｒｗｉ
ｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントは、304 位に
対応するアミノ酸位置でのアミノ酸L 若しくはV 、又は
395 位に対応するアミノ酸位置でのアミノ酸L 、I 又は
V の少なくとも1 つのアミノ酸置換を含有する。
【００５２】クレアチンに対してより低いKm値を有す
る、配列番号：2 の304 位と395 位に対応する両方のア
ミノ酸位置における置換を含有したＥｒｗｉｎｉａタイ
プのクレアチナーゼバリアントは、さらに好ましい態様
を示す。
る、配列番号：2 の304 位と395 位に対応する両方のア
ミノ酸位置における置換を含有したＥｒｗｉｎｉａタイ
プのクレアチナーゼバリアントは、さらに好ましい態様
を示す。
【００５３】クレアチニンの酵素的切断におけるより低
いKm値を有することを特徴とするバリアントクレアチナ
ーゼは、さらに好ましい態様を示す。クレアチナーゼバ
リアントのKm値は、対応の野生型酵素に比べて評価され
るか、あるいは、Km値として絶対値で与えられる。Km値
は、日常の手法により、例えば、実施例７に記載の試薬
を用いて、決定される。
いKm値を有することを特徴とするバリアントクレアチナ
ーゼは、さらに好ましい態様を示す。クレアチナーゼバ
リアントのKm値は、対応の野生型酵素に比べて評価され
るか、あるいは、Km値として絶対値で与えられる。Km値
は、日常の手法により、例えば、実施例７に記載の試薬
を用いて、決定される。
【００５４】本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチ
ナーゼは、好ましくは、対応の野生型酵素に比べたKm値
が、対応の野生型酵素について決定されたKm値の80% 以
下、より好ましくは65% 以下、最も好ましくは50% 以下
である。
ナーゼは、好ましくは、対応の野生型酵素に比べたKm値
が、対応の野生型酵素について決定されたKm値の80% 以
下、より好ましくは65% 以下、最も好ましくは50% 以下
である。
【００５５】本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチ
ナーゼは、絶対値で、好ましくは、10mM未満、より好ま
しくは4mM 未満、最も好ましくは2.5mM 未満のKm値を呈
する。
ナーゼは、絶対値で、好ましくは、10mM未満、より好ま
しくは4mM 未満、最も好ましくは2.5mM 未満のKm値を呈
する。
【００５６】安定性の点での一部の向上が、Km値の減少
まで進むことを見出した( 表4 を参照のこと) 。興味深
く、驚くべきことに、向上した安定性性質を示すバリア
ントに上記で議論した適切な「触媒性質変異」を含ませ
ることにより、クレアチナーゼバリアントは、両方の観
点で有利な性質で設計されうることも見出した。好まし
い態様において、Ｅｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナー
ゼバリアントは、配列番号：1 に示されるアミノ酸配列
におけるN130位及びI278位より選ばれた位置に対応する
位置での少なくとも1 つのアミノ酸置換と配列番号：2
のI304位及びF395位より選ばれた位置に対応する位置で
の少なくとも1 つの置換とを含有することを特徴とす
る。
まで進むことを見出した( 表4 を参照のこと) 。興味深
く、驚くべきことに、向上した安定性性質を示すバリア
ントに上記で議論した適切な「触媒性質変異」を含ませ
ることにより、クレアチナーゼバリアントは、両方の観
点で有利な性質で設計されうることも見出した。好まし
い態様において、Ｅｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナー
ゼバリアントは、配列番号：1 に示されるアミノ酸配列
におけるN130位及びI278位より選ばれた位置に対応する
位置での少なくとも1 つのアミノ酸置換と配列番号：2
のI304位及びF395位より選ばれた位置に対応する位置で
の少なくとも1 つの置換とを含有することを特徴とす
る。
【００５７】配列番号：2 のN130、M203及びI278に対応
する位置での置換を含有したＥｒｗｉｎｉａタイプのク
レアチナーゼバリアントは、本発明のさらに好ましい態
様を示す。好ましくは、本バリアントは、N130D 、M203
V 及びI278T を含有する。
する位置での置換を含有したＥｒｗｉｎｉａタイプのク
レアチナーゼバリアントは、本発明のさらに好ましい態
様を示す。好ましくは、本バリアントは、N130D 、M203
V 及びI278T を含有する。
【００５８】好ましい態様において、本発明のバリアン
トクレアチナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａスピーシーズ(DSM
97-934) から得られた野生型クレアチナーゼに比べて、
向上した安定性及びクレアチンの酵素的切断におけるよ
り低いKm値を示す。
トクレアチナーゼは、Ｅｒｗｉｎｉａスピーシーズ(DSM
97-934) から得られた野生型クレアチナーゼに比べて、
向上した安定性及びクレアチンの酵素的切断におけるよ
り低いKm値を示す。
【００５９】本発明のクレアチナーゼバリアントは、例
えば、ＥｒｗｉｎｉａスピーシーズDSM 97-934 から単
離されたクレアチナーゼ遺伝子から開始すること及び相
同的な配列から開始することにより生産されうる。本願
に照らして、用語「相同的な」とは、配列番号：2 に比
べて配列同一性が少なくとも85% であるものであれば、
他の微生物から単離された野生型クレアチナーゼを含有
することを意味する。いいかえれば、PileUpプログラム
を用いた適切なアラインメントの後、前記クレアチナー
ゼの少なくとも85% のアミノ酸が、配列番号：2 に記載
のアミノ酸に同一である。
えば、ＥｒｗｉｎｉａスピーシーズDSM 97-934 から単
離されたクレアチナーゼ遺伝子から開始すること及び相
同的な配列から開始することにより生産されうる。本願
に照らして、用語「相同的な」とは、配列番号：2 に比
べて配列同一性が少なくとも85% であるものであれば、
他の微生物から単離された野生型クレアチナーゼを含有
することを意味する。いいかえれば、PileUpプログラム
を用いた適切なアラインメントの後、前記クレアチナー
ゼの少なくとも85% のアミノ酸が、配列番号：2 に記載
のアミノ酸に同一である。
【００６０】DNA 及びアミノ酸配列の変異が天然に存在
するか、あるいは当該技術分野で公知の方法を用いて意
図的に導入されてもよいことが理解されるであろう。こ
れらの変異は、配列番号：2 に比べて該配列における１
以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、逆位又は付加
により、全配列において15% までのアミノ酸相違をもた
らしてもよい。かかるアミノ酸置換が、例えば、関与す
る残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性及び／又
は両親媒性における類似性に基づきなされてもよい。例
えば、陰性荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸及び
グルタミン酸が挙げられ、陽性荷電アミノ酸としては、
リジン及びアルギニンが挙げられ、類似の親水性値をも
つ非荷電極性基若しくは非極性基を有するアミノ酸とし
ては、下記ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシ
ン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、ス
レオニン、フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。
他の予期された変異としては、前記ポリペプチドの塩及
びエステル、並びに前記ポリペプチドの前駆体、例え
ば、リーダー配列として用いられるメチオニン、N-ホル
ミルメチオニンなどのN-末端置換を有する前駆体が挙げ
られる。かかる変異は、本発明の範囲及び精神から逸脱
せずになされるであろう。
するか、あるいは当該技術分野で公知の方法を用いて意
図的に導入されてもよいことが理解されるであろう。こ
れらの変異は、配列番号：2 に比べて該配列における１
以上のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、逆位又は付加
により、全配列において15% までのアミノ酸相違をもた
らしてもよい。かかるアミノ酸置換が、例えば、関与す
る残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性及び／又
は両親媒性における類似性に基づきなされてもよい。例
えば、陰性荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸及び
グルタミン酸が挙げられ、陽性荷電アミノ酸としては、
リジン及びアルギニンが挙げられ、類似の親水性値をも
つ非荷電極性基若しくは非極性基を有するアミノ酸とし
ては、下記ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシ
ン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、ス
レオニン、フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。
他の予期された変異としては、前記ポリペプチドの塩及
びエステル、並びに前記ポリペプチドの前駆体、例え
ば、リーダー配列として用いられるメチオニン、N-ホル
ミルメチオニンなどのN-末端置換を有する前駆体が挙げ
られる。かかる変異は、本発明の範囲及び精神から逸脱
せずになされるであろう。
【００６１】微生物からクレアチナーゼ遺伝子を単離す
る手法並びに精製、キャラクタリゼーション及び関連DN
A のクローニングに用いられる操作及び方法は、当該技
術分野で公知である〔例えば、欧州特許第0 790 303 号
明細書(EP 0 790 303)及びAusubel, F. ら、"Current P
rotocols in Molecular Biology" (1994) Wiley Verla
g〕。
る手法並びに精製、キャラクタリゼーション及び関連DN
A のクローニングに用いられる操作及び方法は、当該技
術分野で公知である〔例えば、欧州特許第0 790 303 号
明細書(EP 0 790 303)及びAusubel, F. ら、"Current P
rotocols in Molecular Biology" (1994) Wiley Verla
g〕。
【００６２】本発明で述べられた非常に重要なアミノ酸
位置の同定に基づき、当業者は、目下、クレアチナーゼ
のさらに適切なバリアントを容易に生産できる。
位置の同定に基づき、当業者は、目下、クレアチナーゼ
のさらに適切なバリアントを容易に生産できる。
【００６３】本発明は、宿主細胞においてその発現を支
配しうるプロモーター配列に作動的に連結した本発明の
核酸配列を含有した発現ベクターをさらに含む。好まし
いベクターは、pKK177-3HBなどのプラスミドである。野
生型Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼ遺伝子を含むベクタ
ー(pCT-WT)を図1 に示す。
配しうるプロモーター配列に作動的に連結した本発明の
核酸配列を含有した発現ベクターをさらに含む。好まし
いベクターは、pKK177-3HBなどのプラスミドである。野
生型Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼ遺伝子を含むベクタ
ー(pCT-WT)を図1 に示す。
【００６４】本発明に有用な発現ベクターは、一般的
に、複製開始起点、DNA 配列の前 (すなわち、上流) に
位置したプロモーター及びその後ろにクレアチナーゼバ
リアントの全部又は一部をコードするDNA 配列を含む。
前記クレアチナーゼバリアントの全部又は一部をコード
するDNA 配列は、その後に転写終結配列及び残りのベク
ター部分がつづく。発現ベクターは、当該技術分野で公
知の他のDNA 配列、例えば、発現産物の安定性を提供す
る安定性リーダー配列、発現産物の分泌を提供する分泌
リーダー配列、調節対象の構造遺伝子の発現を (例え
ば、生育培地中における栄養因子若しくは他のインデュ
ーサーの有無により) 可能にする配列、形質転換宿主細
胞における表現型選択を提供することを可能にするマー
カー配列及び制限酵素による切断部位を提供する配列を
さらに含んでもよい。用いられる実際の発現ベクターの
性質は、利用対象の宿主細胞と適合しなければならな
い。例えば、E. coli 細胞系におけるクローニングの場
合、発現ベクターは、E. coli 細胞のゲノムから単離さ
れたプロモーター (例えば、tac 、lac 又はtrp)を含む
べきであろう。E. coli の種々の宿主における適切な複
製開始起点としては、例えば、ColE1 プラスミド複製開
始起点などが挙げられる。適切なプロモーターとして
は、例えば、tac 、lac 、trp などが挙げられる。発現
ベクターが、選択可能なマーカーをコードした配列を含
むことも好ましい。前記選択可能なマーカーは、好まし
くは、抗生物質耐性である。選択可能なマーカーとし
て、アンピシリン耐性又はカナマイシン耐性が都合よく
利用されるであろう。これらの物質の全ては、当該技術
分野で公知であり、市販されている。
に、複製開始起点、DNA 配列の前 (すなわち、上流) に
位置したプロモーター及びその後ろにクレアチナーゼバ
リアントの全部又は一部をコードするDNA 配列を含む。
前記クレアチナーゼバリアントの全部又は一部をコード
するDNA 配列は、その後に転写終結配列及び残りのベク
ター部分がつづく。発現ベクターは、当該技術分野で公
知の他のDNA 配列、例えば、発現産物の安定性を提供す
る安定性リーダー配列、発現産物の分泌を提供する分泌
リーダー配列、調節対象の構造遺伝子の発現を (例え
ば、生育培地中における栄養因子若しくは他のインデュ
ーサーの有無により) 可能にする配列、形質転換宿主細
胞における表現型選択を提供することを可能にするマー
カー配列及び制限酵素による切断部位を提供する配列を
さらに含んでもよい。用いられる実際の発現ベクターの
性質は、利用対象の宿主細胞と適合しなければならな
い。例えば、E. coli 細胞系におけるクローニングの場
合、発現ベクターは、E. coli 細胞のゲノムから単離さ
れたプロモーター (例えば、tac 、lac 又はtrp)を含む
べきであろう。E. coli の種々の宿主における適切な複
製開始起点としては、例えば、ColE1 プラスミド複製開
始起点などが挙げられる。適切なプロモーターとして
は、例えば、tac 、lac 、trp などが挙げられる。発現
ベクターが、選択可能なマーカーをコードした配列を含
むことも好ましい。前記選択可能なマーカーは、好まし
くは、抗生物質耐性である。選択可能なマーカーとし
て、アンピシリン耐性又はカナマイシン耐性が都合よく
利用されるであろう。これらの物質の全ては、当該技術
分野で公知であり、市販されている。
【００６５】所望のコード配列と調節配列とを含む発現
ベクターは、当該技術分野で公知であり、その多くがSa
mbrookら(Sambrook, J. ら., "Molecular Cloning: A L
aboratory Manual" (1989), Cold Spring Harbour, NY,
Cold Spring Harbour Laboratory Press)に記載された
ものである標準組換えDNA 技術を用いて構築されるであ
ろう。
ベクターは、当該技術分野で公知であり、その多くがSa
mbrookら(Sambrook, J. ら., "Molecular Cloning: A L
aboratory Manual" (1989), Cold Spring Harbour, NY,
Cold Spring Harbour Laboratory Press)に記載された
ものである標準組換えDNA 技術を用いて構築されるであ
ろう。
【００６６】さらに、本発明は、変異体クレアチナーゼ
の全部又は一部をコードするDNA 配列を含有した前記発
現ベクターを含む宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、
好ましくは、１以上の変異を有するDNA 配列の全部又は
一部を含有した発現ベクターを含む。変異体クレアチナ
ーゼの全部又は一部の複製及び／又は発現を支配し得、
変異体クレアチナーゼの全部又は一部をコードしたDNA
に作動的に連結された１以上の調節DNA 配列を含有した
発現ベクターを含む宿主細胞がさらに好ましい。適切な
宿主細胞としては、例えば、プロメガ社〔Pomega (2800
Woods HollowRoad, Madison, WI, USA) 〕から入手可
能なE. coli HB101 (ATCC 33694)、ストラタジーン社
〔Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jol
la, CA, USA)〕から入手可能なXL1-Blue MRF等が挙げら
れる。
の全部又は一部をコードするDNA 配列を含有した前記発
現ベクターを含む宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、
好ましくは、１以上の変異を有するDNA 配列の全部又は
一部を含有した発現ベクターを含む。変異体クレアチナ
ーゼの全部又は一部の複製及び／又は発現を支配し得、
変異体クレアチナーゼの全部又は一部をコードしたDNA
に作動的に連結された１以上の調節DNA 配列を含有した
発現ベクターを含む宿主細胞がさらに好ましい。適切な
宿主細胞としては、例えば、プロメガ社〔Pomega (2800
Woods HollowRoad, Madison, WI, USA) 〕から入手可
能なE. coli HB101 (ATCC 33694)、ストラタジーン社
〔Stratagene (11011 North Torrey Pine Road, La Jol
la, CA, USA)〕から入手可能なXL1-Blue MRF等が挙げら
れる。
【００６７】発現ベクターは、当該技術分野に公知の種
々の方法により宿主細胞に導入されてもよい。例えば、
発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、ポリエチレ
ングリコール媒介プロトプラスト形質転換法 (上述Samb
rookら、 1989)により行なわれうる。しかしながら、宿
主細胞に発現ベクターを導入する他の方法、例えば、エ
レクトロポレーション、微粒子銃インジェクション又は
プロトプラスト融合なども利用され得る。
々の方法により宿主細胞に導入されてもよい。例えば、
発現ベクターによる宿主細胞の形質転換は、ポリエチレ
ングリコール媒介プロトプラスト形質転換法 (上述Samb
rookら、 1989)により行なわれうる。しかしながら、宿
主細胞に発現ベクターを導入する他の方法、例えば、エ
レクトロポレーション、微粒子銃インジェクション又は
プロトプラスト融合なども利用され得る。
【００６８】クレアチナーゼバリアントを含む発現ベク
ターが、適切な宿主細胞に導入されると、該宿主細胞
は、所望のクレアチナーゼバリアントの発現を可能にす
る条件下に培養されるであろう。変異体クレアチナーゼ
の全部又は一部をコードしたDNA 配列を含む発現ベクタ
ーを含む宿主細胞も、１以上の下記一般的アプローチ：
DNA ハイブリダイゼーション、マーカー遺伝子機能の有
無、宿主細胞におけるクレアチナーゼmRNA転写産物の生
産により測定される転写レベルの評価及び遺伝子産物の
免疫学的であるが、好ましくは、酵素アッセイ (発色検
出など) を介した同定による検出により同定されるであ
ろう。
ターが、適切な宿主細胞に導入されると、該宿主細胞
は、所望のクレアチナーゼバリアントの発現を可能にす
る条件下に培養されるであろう。変異体クレアチナーゼ
の全部又は一部をコードしたDNA 配列を含む発現ベクタ
ーを含む宿主細胞も、１以上の下記一般的アプローチ：
DNA ハイブリダイゼーション、マーカー遺伝子機能の有
無、宿主細胞におけるクレアチナーゼmRNA転写産物の生
産により測定される転写レベルの評価及び遺伝子産物の
免疫学的であるが、好ましくは、酵素アッセイ (発色検
出など) を介した同定による検出により同定されるであ
ろう。
【００６９】また、本発明は、適切なクレアチナーゼバ
リアントのスクリーニング方法を教示する。酵素的活性
を評価するために選ばれたアッセイ条件は、例えば、単
独アミノ酸置換により、期待された小さい増強が測定さ
れ得ることを確保するように適合される。これは、野生
型( 若しくは親の) 酵素活性が低い検出限界に近づくよ
うなアッセイ条件を調節することにより達成されてい
る。より低いKm値を有する適切な変異体の選抜又はスク
リーニングの１態様は、実施例3 に与えられる。野生型
酵素に比べたこのようないかなる変化又は改変も明確に
検出され得る。長期保存安定性及び短期熱ストレス安定
性を評価する方法も実施例のセクションで詳細に述べら
れる。
リアントのスクリーニング方法を教示する。酵素的活性
を評価するために選ばれたアッセイ条件は、例えば、単
独アミノ酸置換により、期待された小さい増強が測定さ
れ得ることを確保するように適合される。これは、野生
型( 若しくは親の) 酵素活性が低い検出限界に近づくよ
うなアッセイ条件を調節することにより達成されてい
る。より低いKm値を有する適切な変異体の選抜又はスク
リーニングの１態様は、実施例3 に与えられる。野生型
酵素に比べたこのようないかなる変化又は改変も明確に
検出され得る。長期保存安定性及び短期熱ストレス安定
性を評価する方法も実施例のセクションで詳細に述べら
れる。
【００７０】アッセイ対象のクローンのレプリカプレー
トを作ることにより、前記クローンは、生存性の損失な
く、アレイ手法に供されうる。例えば、多くの細胞内酵
素は、それらをアッセイしうる前に、細胞溶解を必要と
する。本手法は、スクリーニングで行なわれ得、陽性が
見出されるとき、前記レプリカプレートから再生育され
うる。
トを作ることにより、前記クローンは、生存性の損失な
く、アレイ手法に供されうる。例えば、多くの細胞内酵
素は、それらをアッセイしうる前に、細胞溶解を必要と
する。本手法は、スクリーニングで行なわれ得、陽性が
見出されるとき、前記レプリカプレートから再生育され
うる。
【００７１】さらに、多重測定は、タンパク質発現レベ
ルの可変性を考慮し、他の主要な酵素の性質をチェック
するために、それぞれの試料において行なわれうる。さ
らに、これらのアッセイは、しばしば、前記酵素が伝統
的にアッセイされるのと同様に (例えば、吸光光度的
に) 多量に行なわれ、該アッセイを迅速に実施され得る
簡単な技術にさせる。
ルの可変性を考慮し、他の主要な酵素の性質をチェック
するために、それぞれの試料において行なわれうる。さ
らに、これらのアッセイは、しばしば、前記酵素が伝統
的にアッセイされるのと同様に (例えば、吸光光度的
に) 多量に行なわれ、該アッセイを迅速に実施され得る
簡単な技術にさせる。
【００７２】もちろん、全ての発現ベクター及びDNA 調
節配列が、同等によく機能して、本発明のDNA 配列を発
現するとはかぎらないことが理解されるべきであろう。
全宿主細胞が、同じ発現系により同等によく機能するわ
けでもないであろう。しかしながら、当業者は、過度の
実験をすることなく、かつ本発明の範囲を逸脱すること
なく、本明細書で提供されたガイダンスを用いて、発現
ベクター、DNA 調節配列及び宿主細胞の選抜を行なうで
あろう。
節配列が、同等によく機能して、本発明のDNA 配列を発
現するとはかぎらないことが理解されるべきであろう。
全宿主細胞が、同じ発現系により同等によく機能するわ
けでもないであろう。しかしながら、当業者は、過度の
実験をすることなく、かつ本発明の範囲を逸脱すること
なく、本明細書で提供されたガイダンスを用いて、発現
ベクター、DNA 調節配列及び宿主細胞の選抜を行なうで
あろう。
【００７３】本発明のポリペプチドは、変異体クレアチ
ナーゼをコードするDNA 配列を発現する宿主細胞におけ
る生産により得られることが好ましい。しかしながら、
本発明のポリペプチドは、変異体クレアチナーゼをコー
ドしたDNA 配列によりコードされたmRNAのインビトロ翻
訳により得られるであろう。例えば、DNA 配列を、前記
したように、インビトロ転写／翻訳系に用いられる代わ
りに、PCR を用いて合成し、適切な発現ベクターに挿入
してもよい。
ナーゼをコードするDNA 配列を発現する宿主細胞におけ
る生産により得られることが好ましい。しかしながら、
本発明のポリペプチドは、変異体クレアチナーゼをコー
ドしたDNA 配列によりコードされたmRNAのインビトロ翻
訳により得られるであろう。例えば、DNA 配列を、前記
したように、インビトロ転写／翻訳系に用いられる代わ
りに、PCR を用いて合成し、適切な発現ベクターに挿入
してもよい。
【００７４】好ましい態様において、本発明は、野生型
酵素をクローニングする工程、変異を導入する工程、野
生型酵素と比べて、向上した熱安定性又は向上したクレ
アチナーゼ活性を有するバリアントを選択する工程、及
び該バリアントを組換えにより生産する工程を含む、Ｅ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントの生産
方法に関する。
酵素をクローニングする工程、変異を導入する工程、野
生型酵素と比べて、向上した熱安定性又は向上したクレ
アチナーゼ活性を有するバリアントを選択する工程、及
び該バリアントを組換えにより生産する工程を含む、Ｅ
ｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントの生産
方法に関する。
【００７５】ついで、これらの様式で生産されたポリペ
プチドを、単離し、種々のタンパク質精製技術を用い
て、ある程度精製してもよい。例えば、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー
法が用いられてもよい。
プチドを、単離し、種々のタンパク質精製技術を用い
て、ある程度精製してもよい。例えば、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー
法が用いられてもよい。
【００７６】本発明のポリペプチドは、決定されたDNA
配列及び推定アミノ酸配列により定義されている。アミ
ノ酸残基及び終止シグナルの多くに対して１コドン以上
をもたらす遺伝コードの縮重性により、配列番号：2 に
示されるアミノ酸配列と同じ配列をコードする他のDNA
配列を本発明のポリペプチドの生産に用いてもよい。
配列及び推定アミノ酸配列により定義されている。アミ
ノ酸残基及び終止シグナルの多くに対して１コドン以上
をもたらす遺伝コードの縮重性により、配列番号：2 に
示されるアミノ酸配列と同じ配列をコードする他のDNA
配列を本発明のポリペプチドの生産に用いてもよい。
【００７７】本発明は、本発明の変異体クレアチナーゼ
(クレアチナーゼバリアント) の生産に適した条件下に
本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明のクレ
アチナーゼバリアントの生産方法をも意図する。細菌の
宿主細胞について、一般的な培養条件は、適切な抗生物
質と誘導剤とを含む液体培地である。培地は、酵素の至
適生産に適した温度、例えば、約25℃〜約37℃で振盪又
は攪拌される。一般的な、適切な抗生物質としては、ア
ンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テ
トラサイクリンなどが挙げられる。一般的な誘導剤とし
ては、IPTG、グルコース、ラクトースなどが挙げられ
る。
(クレアチナーゼバリアント) の生産に適した条件下に
本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明のクレ
アチナーゼバリアントの生産方法をも意図する。細菌の
宿主細胞について、一般的な培養条件は、適切な抗生物
質と誘導剤とを含む液体培地である。培地は、酵素の至
適生産に適した温度、例えば、約25℃〜約37℃で振盪又
は攪拌される。一般的な、適切な抗生物質としては、ア
ンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テ
トラサイクリンなどが挙げられる。一般的な誘導剤とし
ては、IPTG、グルコース、ラクトースなどが挙げられ
る。
【００７８】論議したように、クレアチナーゼの改変さ
れたバリアントは、例えば、臨床診断ルーチンに用いら
れる、クレアチニン及び／又はクレアチンアッセイに適
切な試薬を生産するためにきわめて重要である。特に、
向上した安定性基準に合致する改変されたクレアチナー
ゼを含有した液体試薬が、非常に重要である。好ましい
態様において、本発明は、本発明のＥｒｗｉｎｉａタイ
プのクレアチナーゼバリアントを含有した、クレアチン
の測定用 (あるいは、クレアチニンの測定用又はクレア
チンとクレアチニンとの両方の解析対象物の同時測定
用) 試薬に関する。
れたバリアントは、例えば、臨床診断ルーチンに用いら
れる、クレアチニン及び／又はクレアチンアッセイに適
切な試薬を生産するためにきわめて重要である。特に、
向上した安定性基準に合致する改変されたクレアチナー
ゼを含有した液体試薬が、非常に重要である。好ましい
態様において、本発明は、本発明のＥｒｗｉｎｉａタイ
プのクレアチナーゼバリアントを含有した、クレアチン
の測定用 (あるいは、クレアチニンの測定用又はクレア
チンとクレアチニンとの両方の解析対象物の同時測定
用) 試薬に関する。
【００７９】解析対象物の測定におけるこれまでの臨床
ルーチンにおいて、できるかぎり少ない操作しか必要と
しないできるかぎり少ない試薬が、カスタマーの測定を
容易にし、誤操作の機会を減らすことを提供しなければ
ならない。したがって、さらに好ましい態様において、
本発明は、本発明のクレアチナーゼバリアントを含有
し、かつサルコシンオキシダーゼと過酸化水素検出用試
薬とをさらに含有した試薬に関する。
ルーチンにおいて、できるかぎり少ない操作しか必要と
しないできるかぎり少ない試薬が、カスタマーの測定を
容易にし、誤操作の機会を減らすことを提供しなければ
ならない。したがって、さらに好ましい態様において、
本発明は、本発明のクレアチナーゼバリアントを含有
し、かつサルコシンオキシダーゼと過酸化水素検出用試
薬とをさらに含有した試薬に関する。
【００８０】本発明における改変されたクレアチナーゼ
バリアントの主要な応用の1 つは、臨床試料中のクレア
チニン及び／又はクレアチンの測定である。それらの増
大した全体の安定性とクレアチンに対する相対的に小さ
いKm値により、これらの改変されたクレアチナーゼバリ
アントを用いるアッセイ系、例えば、液体試薬は、より
経済的であり、より丈夫である。さらに好ましい態様に
おいて、本発明は、 ａ）解析対象の試料を、本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプ
のクレアチナーゼバリアントと、サルコシンオキシダー
ゼと、過酸化水素検出用試薬とを含有した試薬とともに
インキュベートするステップ、及び ｂ）生成した過酸化水素と、該試料中のクレアチニンの
濃度とを関連付けるステップを含む、クレアチンの検出
方法に関する。また、本発明は、ａ）解析対象の試料
を、本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバ
リアントと、クレアチニナーゼと、サルコシンオキシダ
ーゼと、ペルオキシダーゼと、過酸化水素検出用試薬と
を含有した試薬とともにインキュベートするステップ、
及びｂ）生成した過酸化水素と、試料中のクレアチニン
の濃度とを関連付けるステップ、を含む、クレアチニン
の検出方法にも関する。 本発明のクレアチンの検出方
法によれば、少ない操作により実施することができ、カ
スタマーの測定を容易にし、誤操作の機会を減らすこと
ができ、より経済的であり、より丈夫であるという優れ
た効果を発揮する。また、本発明のクレアチニンの検出
方法によれば、少ない操作により実施することができ、
カスタマーの測定を容易にし、誤操作の機会を減らすこ
とができ、より経済的であり、より丈夫であるという優
れた効果を発揮する。
バリアントの主要な応用の1 つは、臨床試料中のクレア
チニン及び／又はクレアチンの測定である。それらの増
大した全体の安定性とクレアチンに対する相対的に小さ
いKm値により、これらの改変されたクレアチナーゼバリ
アントを用いるアッセイ系、例えば、液体試薬は、より
経済的であり、より丈夫である。さらに好ましい態様に
おいて、本発明は、 ａ）解析対象の試料を、本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプ
のクレアチナーゼバリアントと、サルコシンオキシダー
ゼと、過酸化水素検出用試薬とを含有した試薬とともに
インキュベートするステップ、及び ｂ）生成した過酸化水素と、該試料中のクレアチニンの
濃度とを関連付けるステップを含む、クレアチンの検出
方法に関する。また、本発明は、ａ）解析対象の試料
を、本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバ
リアントと、クレアチニナーゼと、サルコシンオキシダ
ーゼと、ペルオキシダーゼと、過酸化水素検出用試薬と
を含有した試薬とともにインキュベートするステップ、
及びｂ）生成した過酸化水素と、試料中のクレアチニン
の濃度とを関連付けるステップ、を含む、クレアチニン
の検出方法にも関する。 本発明のクレアチンの検出方
法によれば、少ない操作により実施することができ、カ
スタマーの測定を容易にし、誤操作の機会を減らすこと
ができ、より経済的であり、より丈夫であるという優れ
た効果を発揮する。また、本発明のクレアチニンの検出
方法によれば、少ない操作により実施することができ、
カスタマーの測定を容易にし、誤操作の機会を減らすこ
とができ、より経済的であり、より丈夫であるという優
れた効果を発揮する。
【００８１】本発明のクレアチンの測定用試薬は、適切
な量でそれぞれの成分を含む。好ましい範囲は、クレア
チナーゼ0.01〜100U/ml 、サルコシンオキシダーゼ1 〜
50U/ml、ペルオキシダーゼ0.01〜30U/ml、共役試薬0.1
〜10mM、及び発色基質0.1 〜50mMである。さらに好まし
い範囲は、クレアチナーゼ1 〜50U/ml、サルコシンオキ
シダーゼ1 〜50U/ml、ペルオキシダーゼ0.1 〜10U/ml、
共役試薬0.1 〜10mM、及び発色基質1 〜30mMである。用
いられる緩衝液系は、好ましくは、0.1 M で pH7.5〜8.
0 のリン酸カリウム緩衝液又はpH8.0 〜8.5 の0.05M TA
P 緩衝液(TAP =3-[ (トリス (ヒドロキシメチル) メチ
ル) アミノ] プロパンスルホン酸) である。本発明のク
レアチン測定用試薬によれば、解析対象物の測定におけ
るこれまでの臨床ルーチンにおいて、少ない操作により
実施することができ、カスタマーの測定を容易にし、誤
操作の機会を減らすことができるという優れた効果を発
揮する。
な量でそれぞれの成分を含む。好ましい範囲は、クレア
チナーゼ0.01〜100U/ml 、サルコシンオキシダーゼ1 〜
50U/ml、ペルオキシダーゼ0.01〜30U/ml、共役試薬0.1
〜10mM、及び発色基質0.1 〜50mMである。さらに好まし
い範囲は、クレアチナーゼ1 〜50U/ml、サルコシンオキ
シダーゼ1 〜50U/ml、ペルオキシダーゼ0.1 〜10U/ml、
共役試薬0.1 〜10mM、及び発色基質1 〜30mMである。用
いられる緩衝液系は、好ましくは、0.1 M で pH7.5〜8.
0 のリン酸カリウム緩衝液又はpH8.0 〜8.5 の0.05M TA
P 緩衝液(TAP =3-[ (トリス (ヒドロキシメチル) メチ
ル) アミノ] プロパンスルホン酸) である。本発明のク
レアチン測定用試薬によれば、解析対象物の測定におけ
るこれまでの臨床ルーチンにおいて、少ない操作により
実施することができ、カスタマーの測定を容易にし、誤
操作の機会を減らすことができるという優れた効果を発
揮する。
【００８２】Ｅｒｗｉｎｉａ由来クレアチナーゼ及びそ
のバリアントは、さらに重要な性質、すなわち、いっそ
う低い伝導性を呈する。また、これらのクレアチナーゼ
は、試料中又はリアクター中のクレアチニン／クレアチ
ン濃度のオンラインモニターについて、Kim ら[Kim, E.
J. ら、Anal. Chim. Acta 394 (1999) 、225-231]及び
Khanら [Khan, G. F. Wernet, W.、Anal. Chim. Acta 3
51 (1997) 、151-158]により記載されたものに類似した
バイオセンサーに用いられうる。
のバリアントは、さらに重要な性質、すなわち、いっそ
う低い伝導性を呈する。また、これらのクレアチナーゼ
は、試料中又はリアクター中のクレアチニン／クレアチ
ン濃度のオンラインモニターについて、Kim ら[Kim, E.
J. ら、Anal. Chim. Acta 394 (1999) 、225-231]及び
Khanら [Khan, G. F. Wernet, W.、Anal. Chim. Acta 3
51 (1997) 、151-158]により記載されたものに類似した
バイオセンサーに用いられうる。
【００８３】本発明の改変されたクレアチナーゼバリア
ントは、配列番号：2 、Erwinia sp. DSM 97-934から単
離されたクレアチナーゼのアミノ酸の置換に参照するこ
とにより記載される。
ントは、配列番号：2 、Erwinia sp. DSM 97-934から単
離されたクレアチナーゼのアミノ酸の置換に参照するこ
とにより記載される。
【００８４】他の既知のクレアチナーゼに対する配列比
較は、アクチノバチルス(Actinobacillus)又はアルカリ
ジェネス(Alcaligenes) の菌株から単離された対応の酵
素が、配列番号：2 に対して90% 超同一であることを示
した。なおさら驚くべきことに、本発明者らは、配列番
号：4 、配列番号：5 、配列番号：6 、配列番号：7、
及び配列番号：8 の7 マーペプチド配列モチーフ(motiv
es) がこれらのクレアチナーゼと同一であることを見出
した。本発明で述べられた同じタイプの置換は、これら
の酵素を改変するのに用いられる。
較は、アクチノバチルス(Actinobacillus)又はアルカリ
ジェネス(Alcaligenes) の菌株から単離された対応の酵
素が、配列番号：2 に対して90% 超同一であることを示
した。なおさら驚くべきことに、本発明者らは、配列番
号：4 、配列番号：5 、配列番号：6 、配列番号：7、
及び配列番号：8 の7 マーペプチド配列モチーフ(motiv
es) がこれらのクレアチナーゼと同一であることを見出
した。本発明で述べられた同じタイプの置換は、これら
の酵素を改変するのに用いられる。
【００８５】好ましい態様において、本発明は、DSM (9
7-934)から単離された対応の野生型酵素に比べ、配列番
号：2 に示されるアミノ酸配列のF59 位、N130位、M203
位、I278位、I304位、及びF395位からなる群より選ばれ
た位置に対応する位置における少なくとも1 つのアミノ
酸置換を含有することを特徴とするＥｒｗｉｎｉａクレ
アチナーゼバリアントに関する。
7-934)から単離された対応の野生型酵素に比べ、配列番
号：2 に示されるアミノ酸配列のF59 位、N130位、M203
位、I278位、I304位、及びF395位からなる群より選ばれ
た位置に対応する位置における少なくとも1 つのアミノ
酸置換を含有することを特徴とするＥｒｗｉｎｉａクレ
アチナーゼバリアントに関する。
【００８６】さらに好ましい態様において、本発明は、
対応の野生型酵素に比べ、配列番号：2 に示されるアミ
ノ酸配列のN130位、M203位、I278位、I304位及びF395位
からなる群より選ばれた位置に対応する位置における少
なくとも1 つのアミノ酸置換を含有することを特徴とす
るアルカリジェネス(Alcaligenes) のクレアチナーゼバ
リアントに関する。
対応の野生型酵素に比べ、配列番号：2 に示されるアミ
ノ酸配列のN130位、M203位、I278位、I304位及びF395位
からなる群より選ばれた位置に対応する位置における少
なくとも1 つのアミノ酸置換を含有することを特徴とす
るアルカリジェネス(Alcaligenes) のクレアチナーゼバ
リアントに関する。
【００８７】さらに好ましい態様において、本発明は、
対応の野生型酵素に比べ、配列番号：2 に示されるアミ
ノ酸配列のN130位、M203位、I278位、I304位及びF395位
からなる群より選ばれた位置に対応する位置における少
なくとも1 つのアミノ酸置換を含有することを特徴とす
るアクチノバチルス(Actinobacillus)のクレアチナーゼ
バリアントに関する。
対応の野生型酵素に比べ、配列番号：2 に示されるアミ
ノ酸配列のN130位、M203位、I278位、I304位及びF395位
からなる群より選ばれた位置に対応する位置における少
なくとも1 つのアミノ酸置換を含有することを特徴とす
るアクチノバチルス(Actinobacillus)のクレアチナーゼ
バリアントに関する。
【００８８】好ましくは、Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナー
ゼ、アルカリジェネス(Alcaligenes) クレアチナーゼ又
はアクチノバチルス(Actinobacillus)クレアチナーゼの
前記バリアントは、対応の野生型配列に比べ、20アミノ
酸以下の置換、より好ましくは、15アミノ酸以下の置
換、よりさらに10アミノ酸以下の置換、最も好ましくは
6 アミノ酸以下の置換を含有する。
ゼ、アルカリジェネス(Alcaligenes) クレアチナーゼ又
はアクチノバチルス(Actinobacillus)クレアチナーゼの
前記バリアントは、対応の野生型配列に比べ、20アミノ
酸以下の置換、より好ましくは、15アミノ酸以下の置
換、よりさらに10アミノ酸以下の置換、最も好ましくは
6 アミノ酸以下の置換を含有する。
【００８９】
【実施例】下記実施例において、全ての試薬、制限酵素
及び他の物質については、他の市販の供給源に特定され
たものを除き、Roche Diagnostics から得、供給者によ
る指示に従って用いられた。精製、キャラクタリゼーシ
ョン及びDNA のクローニングに用いられた操作は、当該
技術分野で周知であり、刊行物からアレンジされる。
及び他の物質については、他の市販の供給源に特定され
たものを除き、Roche Diagnostics から得、供給者によ
る指示に従って用いられた。精製、キャラクタリゼーシ
ョン及びDNA のクローニングに用いられた操作は、当該
技術分野で周知であり、刊行物からアレンジされる。
【００９０】下記実施例、参考文献、配列表、及び図面
は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範
囲は、添付の請求項に示される。本発明の精神から逸脱
することなく、示された手法に改変がなされることが理
解される。
は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範
囲は、添付の請求項に示される。本発明の精神から逸脱
することなく、示された手法に改変がなされることが理
解される。
【００９１】実施例１：E. coli におけるErwinia sp.
DSM97-934 のクレアチナーゼ遺伝子のクローニング及び
発現 クレアチナーゼ遺伝子は、PCR でErwinia sp. DSM97-93
4 ゲノムから増幅された。増幅DNA 断片及びpKK177-3HB
プラスミドの両方を制限酵素 EcoRIとHindIIIとで消化
した。消化産物をゲル精製し、連結した。アリコートの
ライゲーション反応混合物を用い、コンピテントE. col
i 細胞、例えば、E. coli HB101 細胞を形質転換した。
ついで、形質転換体を、アンピシリンを含むLBプレート
で選別した。アッセイに対して、個々のコロニーを選別
し、アンピシリンを含むLB培地(上記Sambrookら, 1989
を参照のこと) で一晩生育させ、スクリーニングに供し
た。
DSM97-934 のクレアチナーゼ遺伝子のクローニング及び
発現 クレアチナーゼ遺伝子は、PCR でErwinia sp. DSM97-93
4 ゲノムから増幅された。増幅DNA 断片及びpKK177-3HB
プラスミドの両方を制限酵素 EcoRIとHindIIIとで消化
した。消化産物をゲル精製し、連結した。アリコートの
ライゲーション反応混合物を用い、コンピテントE. col
i 細胞、例えば、E. coli HB101 細胞を形質転換した。
ついで、形質転換体を、アンピシリンを含むLBプレート
で選別した。アッセイに対して、個々のコロニーを選別
し、アンピシリンを含むLB培地(上記Sambrookら, 1989
を参照のこと) で一晩生育させ、スクリーニングに供し
た。
【００９２】実施例２：Ｅｒｗｉｎｉａスピーシーズ由
来の野生型クレアチナーゼへの変異導入 酵素性質を改変するため、下記変異導入法：変異PCR 、
飽和(saturation)変異導入及び部位特異的変異導入を用
いて、クレアチナーゼバリアントを生成させた。
来の野生型クレアチナーゼへの変異導入 酵素性質を改変するため、下記変異導入法：変異PCR 、
飽和(saturation)変異導入及び部位特異的変異導入を用
いて、クレアチナーゼバリアントを生成させた。
【００９３】変異PCR は、ランダム点変異を選ばれたDN
A に導入する方法である。本方法は、Cadwell 及びJoyc
e [Cadwell, R. C. Joyce, G. F., PCR Methods Appl 3
(1994) 136-140]により記載されたプロトコールを幾分
改変した方法にしたがって、行なった。
A に導入する方法である。本方法は、Cadwell 及びJoyc
e [Cadwell, R. C. Joyce, G. F., PCR Methods Appl 3
(1994) 136-140]により記載されたプロトコールを幾分
改変した方法にしたがって、行なった。
【００９４】変異PCR を下記のように設定した：
鋳型DNA 61fmol (= 40ng pCT-WT
フォワードプライマー 40pmol
リバースプライマー 40pmol
10 x Taq緩衝液 10μl (Mg2+不含; Roche Ｎｏ． 1 699 105)
MgCl2 7mM
MnCl2 0 〜0.8mM
dATP, dGTP 0.2mM (Roche Ｎｏ． 1 969 064)
dCTP, dTTP 1mM (Roche Ｎｏ． 1 969 064)
Taq DNA ポリメラーゼ 5U (Roche Ｎｏ． 1 418 432)
H2O 全容量 100μl まで添加
【００９５】PCR サイクルは、下記条件：
− 95℃、5 分
− ついで、95℃、１分と46/70 ℃、１分と72℃、2 分
とを１サイクルとする３０サイクル、 − その後、4 ℃ (時間の範囲は、変更可能であり、適
切に設定される)で行なわれた。
とを１サイクルとする３０サイクル、 − その後、4 ℃ (時間の範囲は、変更可能であり、適
切に設定される)で行なわれた。
【００９６】2 つのジェネレーションの変異PCR を行な
った。第１のジェネレーションは、プラスミドpCT-WT、
プライマーECF21 (5'-CAG GAA ACA GAA TTC ATG ACT-
3') /HIR21 (5'-CCA AAA CAG CCA AGC TTT CAG-3') を
用い、アニーリング温度46℃で行なわれた。変異PCR の
第２のジェネレーションは、プラスミドpCT1m24 、プラ
イマーCtextF (5'-CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG G-3')
/ CtextR (5'-GCC AAAACA GCC AAG CTT TCA G-3') を
用い、70℃のアニーリング温度で行なわれた。変異PCR
の各ジェネレーションは、異なる変異率を得、それゆ
え、異なる変異率の不活性クローンを得るためにいくつ
かのMnCl2 濃度で行なわれた。
った。第１のジェネレーションは、プラスミドpCT-WT、
プライマーECF21 (5'-CAG GAA ACA GAA TTC ATG ACT-
3') /HIR21 (5'-CCA AAA CAG CCA AGC TTT CAG-3') を
用い、アニーリング温度46℃で行なわれた。変異PCR の
第２のジェネレーションは、プラスミドpCT1m24 、プラ
イマーCtextF (5'-CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG G-3')
/ CtextR (5'-GCC AAAACA GCC AAG CTT TCA G-3') を
用い、70℃のアニーリング温度で行なわれた。変異PCR
の各ジェネレーションは、異なる変異率を得、それゆ
え、異なる変異率の不活性クローンを得るためにいくつ
かのMnCl2 濃度で行なわれた。
【００９７】変異PCR 産物を、イオン交換技術(Roche H
igh PureTM PCR Product Purification Kit Ｎｏ． 281
04)を用いて精製し、H2O で溶出した。前記精製PCR 産
物及びプラスミドpKK177-3HBを制限酵素EcoRI とHindII
I とで消化し、それぞれ、調製用ゲル電気泳動 (1%アガ
ロース/TAE) に供し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qu
iagen Cat.Ｎｏ． 28706) でゲルから抽出した。EcoRI/
HindIII-消化PCR 産物を、T4 DNAリガーゼ (Roche Ｎ
ｏ． 481 220)を用いて、マニュアルに従って、EcoRI/H
indIII-消化プラスミドベクターpKK177-3HBに連結し
た。エレクトロポレーションによる高効率形質転換のマ
ニュアル(Current protocols in molecular biology, c
hapter 1.8.4) に従い、ライゲーション反応産物をE. c
oli HB101に導入又は供給者マニュアルに従ってEpicuri
an Coli（登録商標）XL1-Blueスーパーコンピテントセ
ル(Stratagene Ｎｏ． 200236) に導入した。形質転換
体を100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地にプレー
ティングし、37℃、14時間生育させた。約50% 活性クロ
ーンのプールをスクリーニングのために選んだ。各進化
ジェネレーション(evolution generation)において、約
3000クローンをスクリーニングした。
igh PureTM PCR Product Purification Kit Ｎｏ． 281
04)を用いて精製し、H2O で溶出した。前記精製PCR 産
物及びプラスミドpKK177-3HBを制限酵素EcoRI とHindII
I とで消化し、それぞれ、調製用ゲル電気泳動 (1%アガ
ロース/TAE) に供し、QIAquick Gel Extraction Kit(Qu
iagen Cat.Ｎｏ． 28706) でゲルから抽出した。EcoRI/
HindIII-消化PCR 産物を、T4 DNAリガーゼ (Roche Ｎ
ｏ． 481 220)を用いて、マニュアルに従って、EcoRI/H
indIII-消化プラスミドベクターpKK177-3HBに連結し
た。エレクトロポレーションによる高効率形質転換のマ
ニュアル(Current protocols in molecular biology, c
hapter 1.8.4) に従い、ライゲーション反応産物をE. c
oli HB101に導入又は供給者マニュアルに従ってEpicuri
an Coli（登録商標）XL1-Blueスーパーコンピテントセ
ル(Stratagene Ｎｏ． 200236) に導入した。形質転換
体を100μg/mlアンピシリンを含むLB寒天培地にプレー
ティングし、37℃、14時間生育させた。約50% 活性クロ
ーンのプールをスクリーニングのために選んだ。各進化
ジェネレーション(evolution generation)において、約
3000クローンをスクリーニングした。
【００９８】飽和変異導入は、20天然アミノ酸のいずれ
かを、ランダムな３塩基ストレッチを含む決められたプ
ライマーを用いたPCR 様方法を用いて、タンパク質の決
められた位置にランダムに導入する方法である。全プラ
スミドを2 つの相補的プライマーを用いて増幅する。親
のプラスミド (変異無し）をDpn I を用いた酵素的切断
により、除去する。クレアチナーゼ遺伝子の変異導入の
ために、供給者のマニュアルに従い、QuikChangeTM Sit
e-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Ｎｏ．20051
8)を用いた。変異導入されたクレアチナーゼ遺伝子を有
するプラスミドを、上記のように、E. coli HB101 又は
E. coli XL1-Blueに導入した。約200クローンを、十分
な統計学的多様性を確保するために、各飽和変異源(mut
agen)実験毎にスクリーニングした。
かを、ランダムな３塩基ストレッチを含む決められたプ
ライマーを用いたPCR 様方法を用いて、タンパク質の決
められた位置にランダムに導入する方法である。全プラ
スミドを2 つの相補的プライマーを用いて増幅する。親
のプラスミド (変異無し）をDpn I を用いた酵素的切断
により、除去する。クレアチナーゼ遺伝子の変異導入の
ために、供給者のマニュアルに従い、QuikChangeTM Sit
e-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Ｎｏ．20051
8)を用いた。変異導入されたクレアチナーゼ遺伝子を有
するプラスミドを、上記のように、E. coli HB101 又は
E. coli XL1-Blueに導入した。約200クローンを、十分
な統計学的多様性を確保するために、各飽和変異源(mut
agen)実験毎にスクリーニングした。
【００９９】1 つのクレアチナーゼ変異体におけるいく
つかの有用な変異を組み合わせるために、部位特異的変
異導入法も用いた。原理及びプロトコールは、変異され
たトリプレットを含む決められたプライマーを用いたこ
とを除き、飽和変異導入に似ている。
つかの有用な変異を組み合わせるために、部位特異的変
異導入法も用いた。原理及びプロトコールは、変異され
たトリプレットを含む決められたプライマーを用いたこ
とを除き、飽和変異導入に似ている。
【０１００】実施例３：Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼ
及びそのバリアントのスクリーニング及びアッセイ クレアチナーゼ及びそのバリアントの活性アッセイを、
グダー(Guder, W. G.) ら [J Clin Chem Clin Biochem
24 (1986) 889-902] に従い、クレアチンを基質とし、
共役酵素反応を用いることにより行なった。
及びそのバリアントのスクリーニング及びアッセイ クレアチナーゼ及びそのバリアントの活性アッセイを、
グダー(Guder, W. G.) ら [J Clin Chem Clin Biochem
24 (1986) 889-902] に従い、クレアチンを基質とし、
共役酵素反応を用いることにより行なった。
【０１０１】反応混合物を下記試薬を組み合わせること
により構成した： 0.1M リン酸カリウム緩衝液, pH7.8 中90mM クレアチン 2.5ml 30mM 4-アミノ-2,3- ジメチル-1- フェニル-3- ピロゾリン-5- オン 0.05ml 143.5mM 2,4,6-トリブロム-3- ヒドロキシ安息香酸 0.1ml サルコシンオキシダーゼ (150U/ml) 0.1ml ペルオキシダーゼ (500U/ml) 0.02ml クレアチナーゼ溶液 (粗抽出液) 0.01ml
により構成した： 0.1M リン酸カリウム緩衝液, pH7.8 中90mM クレアチン 2.5ml 30mM 4-アミノ-2,3- ジメチル-1- フェニル-3- ピロゾリン-5- オン 0.05ml 143.5mM 2,4,6-トリブロム-3- ヒドロキシ安息香酸 0.1ml サルコシンオキシダーゼ (150U/ml) 0.1ml ペルオキシダーゼ (500U/ml) 0.02ml クレアチナーゼ溶液 (粗抽出液) 0.01ml
【０１０２】クレアチナーゼのアッセイは、25℃で10分
間、546nm の波長で行なわれた。ΔE は、6 〜10分の測
定点から算出された。
間、546nm の波長で行なわれた。ΔE は、6 〜10分の測
定点から算出された。
【０１０３】クレアチナーゼ及びそのバリアントのクロ
ーンのスクリーニングを前記アッセイ手法により行なっ
た。
ーンのスクリーニングを前記アッセイ手法により行なっ
た。
【０１０４】各スクリーニング工程を、96- ウェルマイ
クロタイタープレート中で行なった。コロニーをこれら
のプレートから取り、200 μl のLB培地(Sambrook ら、
1989, 上記を参照のこと) 中２４時間生育させた。１ウ
ェルあたり5 μl の界面活性剤(B-PERTM Bacterial Pro
tein Extraction Reagent; PIERCE Ｎｏ．78248) の添
加による細胞溶解の後、粗抽出液の10μl アリコートを
アッセイした。
クロタイタープレート中で行なった。コロニーをこれら
のプレートから取り、200 μl のLB培地(Sambrook ら、
1989, 上記を参照のこと) 中２４時間生育させた。１ウ
ェルあたり5 μl の界面活性剤(B-PERTM Bacterial Pro
tein Extraction Reagent; PIERCE Ｎｏ．78248) の添
加による細胞溶解の後、粗抽出液の10μl アリコートを
アッセイした。
【０１０５】より低いKm値を有するクレアチナーゼバリ
アントをスクリーニングするため、得られた粗酵素抽出
液のクレアチナーゼ活性を測定した。前記クレアチン基
質濃度の15番目の部分のみを有する活性測定試薬を用
い、同じ試料のクレアチナーゼ活性を再び測定した。野
生型クレアチナーゼのものを超えて２種の活性指標( 慣
用の方法により得られた1/15基質濃度/ 活性を有する活
性) の割合が増加した任意のクローンを、より低いKm値
を有する候補変異体として選んだ。例えば、活性スクリ
ーニングを、至適クレアチン濃度(90mM)と低いクレアチ
ン濃度(6mM) とを用いて行なった。前記2 つの活性割合
と、野生型クレアチナーゼを用いて得られた活性割合と
の比較は、より低いKm値を有する潜在的に陽性なクレア
チナーゼバリアントの同定をもたらす。
アントをスクリーニングするため、得られた粗酵素抽出
液のクレアチナーゼ活性を測定した。前記クレアチン基
質濃度の15番目の部分のみを有する活性測定試薬を用
い、同じ試料のクレアチナーゼ活性を再び測定した。野
生型クレアチナーゼのものを超えて２種の活性指標( 慣
用の方法により得られた1/15基質濃度/ 活性を有する活
性) の割合が増加した任意のクローンを、より低いKm値
を有する候補変異体として選んだ。例えば、活性スクリ
ーニングを、至適クレアチン濃度(90mM)と低いクレアチ
ン濃度(6mM) とを用いて行なった。前記2 つの活性割合
と、野生型クレアチナーゼを用いて得られた活性割合と
の比較は、より低いKm値を有する潜在的に陽性なクレア
チナーゼバリアントの同定をもたらす。
【０１０６】熱安定性クレアチナーゼバリアントをスク
リーニングするために、各クレアチナーゼバリアントの
粗抽出液を用いて、熱処理 (例えば、56℃、30分) の前
後で、開始及び残存クレアチナーゼ活性を測定した。前
記2 つの実験の活性割合と野生型クレアチナーゼを用い
て得られた活性割合との比較は、増大した熱安定性を有
する潜在的に陽性なクレアチナーゼバリアントを導く。
リーニングするために、各クレアチナーゼバリアントの
粗抽出液を用いて、熱処理 (例えば、56℃、30分) の前
後で、開始及び残存クレアチナーゼ活性を測定した。前
記2 つの実験の活性割合と野生型クレアチナーゼを用い
て得られた活性割合との比較は、増大した熱安定性を有
する潜在的に陽性なクレアチナーゼバリアントを導く。
【０１０７】実施例４：向上した性質を有するＥｒｗｉ
ｎｉａクレアチナーゼの変異体 前記スクリーニングの成果は、増大した熱安定性、向上
した溶解性、より低いKm値及び／又はより低い伝導性を
有するいくつかのクレアチナーゼバリアントを導いた。
これらのバリアントを表１に示す。各ジェネレーション
に用いられたプライマーの配列を表２に示す。
ｎｉａクレアチナーゼの変異体 前記スクリーニングの成果は、増大した熱安定性、向上
した溶解性、より低いKm値及び／又はより低い伝導性を
有するいくつかのクレアチナーゼバリアントを導いた。
これらのバリアントを表１に示す。各ジェネレーション
に用いられたプライマーの配列を表２に示す。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
【表２】
【０１１０】実施例５：向上した性質を有するＥｒｗｉ
ｎｉａクレアチナーゼ変異体の遺伝学的キャラクタリゼ
ーション 向上した性質を有するクレアチナーゼ変異体を遺伝学的
にキャラクタライズし、それらのDNA 及び対応のアミノ
酸配列を、配列番号：9 〜22に示す。表３は、これらの
クレアチナーゼ変異体のそれぞれについて同定された変
異を要約したものである。
ｎｉａクレアチナーゼ変異体の遺伝学的キャラクタリゼ
ーション 向上した性質を有するクレアチナーゼ変異体を遺伝学的
にキャラクタライズし、それらのDNA 及び対応のアミノ
酸配列を、配列番号：9 〜22に示す。表３は、これらの
クレアチナーゼ変異体のそれぞれについて同定された変
異を要約したものである。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】実施例６：Ｅｒｗｉｎｉａタイプのクレア
チナーゼの精製 精製クレアチナーゼと、細胞培養物から上記のように選
ばれたクレアチナーゼバリアントとを得る方法は、下記
のような任意の公知の方法であってもよい。栄養培地で
培養することにより得られた細胞を回収した後、高圧細
胞破砕を用いて、20mM Tris-HCl (pH 8.0)中、900 バー
ルの圧力で細胞ペレットを破砕して粗細胞抽出液を得
た。ついで、抽出に0.1 〜0.35M NaClグラジェントを用
いたＤＥＡＥ−セファロース ファスト フローでのイ
オン交換クロマトグラフィーに、得られた酵素抽出液を
供した。本分離ステップの後、得られたクレアチナーゼ
画分は、例えば、フェニルセファロースカラムクロマト
グラフィー (Pharmacia Biotech)により、さらに分離及
び精製され、標準精製酵素産物を得るであろう。通常、
このように得られた最終産物は、少なくとも90％純粋で
あり、クレアチナーゼに対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥの1
つの顕著なバンドを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、時
折、低純度であることが示される場合、精製ステップを
繰り返す。
チナーゼの精製 精製クレアチナーゼと、細胞培養物から上記のように選
ばれたクレアチナーゼバリアントとを得る方法は、下記
のような任意の公知の方法であってもよい。栄養培地で
培養することにより得られた細胞を回収した後、高圧細
胞破砕を用いて、20mM Tris-HCl (pH 8.0)中、900 バー
ルの圧力で細胞ペレットを破砕して粗細胞抽出液を得
た。ついで、抽出に0.1 〜0.35M NaClグラジェントを用
いたＤＥＡＥ−セファロース ファスト フローでのイ
オン交換クロマトグラフィーに、得られた酵素抽出液を
供した。本分離ステップの後、得られたクレアチナーゼ
画分は、例えば、フェニルセファロースカラムクロマト
グラフィー (Pharmacia Biotech)により、さらに分離及
び精製され、標準精製酵素産物を得るであろう。通常、
このように得られた最終産物は、少なくとも90％純粋で
あり、クレアチナーゼに対応するＳＤＳ−ＰＡＧＥの1
つの顕著なバンドを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、時
折、低純度であることが示される場合、精製ステップを
繰り返す。
【０１１３】実施例７：Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼ
及びそのバリアントのキャラクタリゼーション Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼ及びそのバリアントのキ
ャラクタリゼーションは、Km測定及び短期熱ストレス測
定並びにCreaPlus緩衝液中35℃で21日間のインキュベー
ションの後の残存活性の測定を含んだ。
及びそのバリアントのキャラクタリゼーション Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼ及びそのバリアントのキ
ャラクタリゼーションは、Km測定及び短期熱ストレス測
定並びにCreaPlus緩衝液中35℃で21日間のインキュベー
ションの後の残存活性の測定を含んだ。
【０１１４】a) Km 測定
Km測定のために、6 種のクレアチン基質濃度：90mM、45
mM、22.5mM、11.3mM、5.6mM 及び2.8mM を用いて、実施
例３に記載されたアッセイ手法に従い、クレアチナーゼ
活性を測定した。
mM、22.5mM、11.3mM、5.6mM 及び2.8mM を用いて、実施
例３に記載されたアッセイ手法に従い、クレアチナーゼ
活性を測定した。
【０１１５】b)短期熱ストレス安定性の評価
精製酵素又は酵素変異体を用いて、クローン化された野
生型Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼ及びその熱安定変異
体の熱不活性化を行なった。酵素に0.1M リン酸カリウ
ム緩衝液(pH 7.8)中30U/mlの酵素濃度で濃縮した形態
で、ストレスをかけた。Guder ら、上述に記載のよう
に、本ストック溶液から作られた適切な希釈を用いて、
（残存）クレアチナーゼ活性を測定した。クレアチナー
ゼアッセイを以下のように設定した： 0.1M リン酸カリウム緩衝液、pH7.8 中、0.1M クレアチン 2.5ml 30mM 4-アミノ-2,3- ジメチル-1- フェニル-3- ピロゾリン-5- オン 0.05ml 143.5mM 2,4,6- トリブロモ-3- ヒドロキシ安息香酸 0.1ml サルコシンオキシダーゼ (150U/ml) 0.1ml ペルオキシダーゼ(500U/ml) 0.02ml クレアチナーゼ (0.01〜5.0U/ml の範囲の希釈) 0.01ml
生型Ｅｒｗｉｎｉａクレアチナーゼ及びその熱安定変異
体の熱不活性化を行なった。酵素に0.1M リン酸カリウ
ム緩衝液(pH 7.8)中30U/mlの酵素濃度で濃縮した形態
で、ストレスをかけた。Guder ら、上述に記載のよう
に、本ストック溶液から作られた適切な希釈を用いて、
（残存）クレアチナーゼ活性を測定した。クレアチナー
ゼアッセイを以下のように設定した： 0.1M リン酸カリウム緩衝液、pH7.8 中、0.1M クレアチン 2.5ml 30mM 4-アミノ-2,3- ジメチル-1- フェニル-3- ピロゾリン-5- オン 0.05ml 143.5mM 2,4,6- トリブロモ-3- ヒドロキシ安息香酸 0.1ml サルコシンオキシダーゼ (150U/ml) 0.1ml ペルオキシダーゼ(500U/ml) 0.02ml クレアチナーゼ (0.01〜5.0U/ml の範囲の希釈) 0.01ml
【０１１６】アッセイを546nm の波長で、25℃、10分間
で行なった。ΔE を6 〜10分の測定点から算出した。
で行なった。ΔE を6 〜10分の測定点から算出した。
【０１１７】開始酵素活性を測定した後、全試料を、0.
1Mリン酸カリウム緩衝液中、56℃で20分間インキュベー
トすることによる熱不活性化に供した。各熱処理試料の
残存活性を前記のように測定した。酵素熱安定性評価の
ために、各試験試料のサーモインデックス (開始活性/
残存活性) を用いた。表４（又は図４）に示されるよう
に、全変異体CT1m24、CT2m10、CT2m28、CTsd2 、CTqc2
、CT2m9 及びCTsd7 は、野生型Ｅｒｗｉｎｉａクレア
チナーゼよりもより熱安定である。
1Mリン酸カリウム緩衝液中、56℃で20分間インキュベー
トすることによる熱不活性化に供した。各熱処理試料の
残存活性を前記のように測定した。酵素熱安定性評価の
ために、各試験試料のサーモインデックス (開始活性/
残存活性) を用いた。表４（又は図４）に示されるよう
に、全変異体CT1m24、CT2m10、CT2m28、CTsd2 、CTqc2
、CT2m9 及びCTsd7 は、野生型Ｅｒｗｉｎｉａクレア
チナーゼよりもより熱安定である。
【０１１８】表4 は、Ｅｒｗｉｎｉａスピーシーズ由来
のネイティブクレアチナーゼに比べて、新規なクレアチ
ナーゼ変異体のKm及びTm値のキャラクタリゼーションの
結果を要約する。
のネイティブクレアチナーゼに比べて、新規なクレアチ
ナーゼ変異体のKm及びTm値のキャラクタリゼーションの
結果を要約する。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】前記表に示されるように、本発明の新規ク
レアチナーゼ変異体CTsd2 及びCTsd7 は、野生型Ｅｒｗ
ｉｎｉａクレアチナーゼに比べて、いっそう低いKm値及
び一層増強された熱安定性を有する。
レアチナーゼ変異体CTsd2 及びCTsd7 は、野生型Ｅｒｗ
ｉｎｉａクレアチナーゼに比べて、いっそう低いKm値及
び一層増強された熱安定性を有する。
【０１２１】実施例８：クレアチニン／クレアチン濃度
の測定への改変されたクレアチナーゼバリアントの応用 本発明の改変されたクレアチナーゼバリアントは、標準
手法に従って、サクロシンオキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ及び過酸化水素の検出のための他の組成物と組み合
わせて、クレアチン濃度を測定することに用いられる。
の測定への改変されたクレアチナーゼバリアントの応用 本発明の改変されたクレアチナーゼバリアントは、標準
手法に従って、サクロシンオキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ及び過酸化水素の検出のための他の組成物と組み合
わせて、クレアチン濃度を測定することに用いられる。
【０１２２】さらに、クレアチニナーゼも用いられる場
合、クレアチニンの濃度は、本発明の改変されたクレア
チナーゼバリアントを用いて決定され得る。調べた試料
に、クレアチン及びクレアチニンが存在する場合、両方
の解析対象物の合計が測定される。
合、クレアチニンの濃度は、本発明の改変されたクレア
チナーゼバリアントを用いて決定され得る。調べた試料
に、クレアチン及びクレアチニンが存在する場合、両方
の解析対象物の合計が測定される。
【０１２３】本発明のクレアチン測定用試薬は、至適濃
度で成分をそれぞれ含む。例示は、16U/ml クレアチナ
ーゼと9.8U/ml サルコシンオキシダーゼと、0.81U/ml
ペルオキシダーゼと、0.65mM 共役試薬と、 7.0mM 発
色物質とを含有した試薬である。本実施例で用いられた
緩衝液系は、0.1M リン酸カリウムpH7.8 である。アッ
セイは、通常、25℃で行なわれ、発色は、546nm の波長
で、110 分間で測定されるΔE は、直線領域の測定点か
ら算出され、クレアチン濃度を測定するために用いられ
る。
度で成分をそれぞれ含む。例示は、16U/ml クレアチナ
ーゼと9.8U/ml サルコシンオキシダーゼと、0.81U/ml
ペルオキシダーゼと、0.65mM 共役試薬と、 7.0mM 発
色物質とを含有した試薬である。本実施例で用いられた
緩衝液系は、0.1M リン酸カリウムpH7.8 である。アッ
セイは、通常、25℃で行なわれ、発色は、546nm の波長
で、110 分間で測定されるΔE は、直線領域の測定点か
ら算出され、クレアチン濃度を測定するために用いられ
る。
【０１２４】配列表フリーテキスト
配列番号：３は、ペプチド１の配列である。配列中、第
４位のXaa は、任意のアミノ酸残基である。
４位のXaa は、任意のアミノ酸残基である。
【０１２５】配列番号：４は、ペプチド２の配列であ
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
【０１２６】配列番号：５は、ペプチド３の配列であ
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
【０１２７】配列番号：６は、ペプチド４の配列であ
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
【０１２８】配列番号：７は、ペプチド５の配列であ
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
【０１２９】配列番号：８は、ペプチド６の配列であ
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
る。配列中、第４位のXaa は、任意のアミノ酸残基であ
る。
【０１３０】配列番号：９は、バリアントＣＴ１ｍ２４
の配列である。
の配列である。
【０１３１】配列番号：１０は、バリアントＣＴ１ｍ２
４の配列である。
４の配列である。
【０１３２】配列番号：１１は、バリアントＣＴ２ｍ９
の配列である。
の配列である。
【０１３３】配列番号：１２は、バリアントＣＴ２ｍ９
の配列である。
の配列である。
【０１３４】配列番号：１３は、バリアントＣＴ２ｍ１
０の配列である。
０の配列である。
【０１３５】配列番号：１４は、バリアントＣＴ２ｍ１
０の配列である。
０の配列である。
【０１３６】配列番号：１５は、バリアントＣＴ２ｍ２
８の配列である。
８の配列である。
【０１３７】配列番号：１６は、バリアントＣＴ２ｍ２
８の配列である。
８の配列である。
【０１３８】配列番号：１７は、バリアントＣＴｑｃ２
の配列である。
の配列である。
【０１３９】配列番号：１８は、バリアントＣＴｑｃ２
の配列である。
の配列である。
【０１４０】配列番号：１９は、バリアントＣＴｓｄ２
の配列である。
の配列である。
【０１４１】配列番号：２０は、バリアントＣＴｓｄ２
の配列である。
の配列である。
【０１４２】配列番号：２１は、バリアントＣＴｓｄ７
の配列である。
の配列である。
【０１４３】配列番号：２２は、バリアントＣＴｓｄ７
の配列である。
の配列である。
【０１４４】配列番号：２３は、プライマーＥＣＦ２１
の配列である。
の配列である。
【０１４５】配列番号：２４は、プライマーＨＩＲ２１
の配列である。
の配列である。
【０１４６】配列番号：２５は、プライマーＣＴｅｘｔ
Ｆの配列である。
Ｆの配列である。
【０１４７】配列番号：２６は、プライマーＣＴｅｘｔ
Ｒの配列である。
Ｒの配列である。
【０１４８】配列番号：２７は、プライマーＣＴｆ３９
５１Ｆの配列である。
５１Ｆの配列である。
【０１４９】配列番号：２８は、プライマーＣＴｆ３９
５１Ｒの配列である。
５１Ｒの配列である。
【０１５０】配列番号：２９は、プライマーＣＴ５９Ｆ
の配列である。配列中、２１位、２２位、２３位のｎ
は、任意のヌクレオチド残基である。
の配列である。配列中、２１位、２２位、２３位のｎ
は、任意のヌクレオチド残基である。
【０１５１】配列番号：３０は、プライマーＣＴ５９Ｒ
の配列である。配列中、２２位、２３位、２４位のｎ
は、任意のヌクレオチド残基である。
の配列である。配列中、２２位、２３位、２４位のｎ
は、任意のヌクレオチド残基である。
【０１５２】配列番号：３１は、プライマーＣＴｆ５９
ｗＦの配列である。
ｗＦの配列である。
【０１５３】配列番号：３２は、プライマーＣＴｆ５９
ｗＲの配列である。
ｗＲの配列である。
【０１５４】
【発明の効果】本発明のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレア
チナーゼバリアントによれば、向上した安定性及び／又
は基質であるクレアチンに対してより低いKm値を示し、
臨床的又は工業的用途において安定かつ効率よく用いる
ことができるという優れた効果を奏する。また、本発明
のクレアチン測定用試薬によれば、解析対象物の測定に
おけるこれまでの臨床ルーチンにおいて、少ない操作に
より実施することができ、カスタマーの測定を容易に
し、誤操作の機会を減らすことができるという優れた効
果を奏する。さらに、本発明のクレアチンの検出方法に
よれば、少ない操作により実施することができ、カスタ
マーの測定を容易にし、誤操作の機会を減らすことがで
き、より経済的であり、より丈夫であるという優れた効
果を奏する。また、本発明のクレアチニンの検出方法に
よれば、少ない操作により実施することができ、カスタ
マーの測定を容易にし、誤操作の機会を減らすことがで
き、より経済的であり、より丈夫であるという優れた効
果を奏する。
チナーゼバリアントによれば、向上した安定性及び／又
は基質であるクレアチンに対してより低いKm値を示し、
臨床的又は工業的用途において安定かつ効率よく用いる
ことができるという優れた効果を奏する。また、本発明
のクレアチン測定用試薬によれば、解析対象物の測定に
おけるこれまでの臨床ルーチンにおいて、少ない操作に
より実施することができ、カスタマーの測定を容易に
し、誤操作の機会を減らすことができるという優れた効
果を奏する。さらに、本発明のクレアチンの検出方法に
よれば、少ない操作により実施することができ、カスタ
マーの測定を容易にし、誤操作の機会を減らすことがで
き、より経済的であり、より丈夫であるという優れた効
果を奏する。また、本発明のクレアチニンの検出方法に
よれば、少ない操作により実施することができ、カスタ
マーの測定を容易にし、誤操作の機会を減らすことがで
き、より経済的であり、より丈夫であるという優れた効
果を奏する。
【０１５５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<120> Erwinia-Type Creatinase Variants
<130> ROC-02-006
<160> 32
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1215
<212> DNA
<213> Erwinia sp.
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1215)
<400> 1
atg act gac gac atg ttg cac gtg atg aaa tgg cac aat ggt gag aag 48
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
gaa tat tcc ccc ttt tcc gat gcc gag atg acg cgc cgc cag agt gac 96
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
gtg cgg cgc tgg atg gcc gaa aac gac gtc gac gct gcg ctg ttc acc 144
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
tcc tat cat tgc atc aat tac tac tct gga ttc ctg tac tgc tat ttc 192
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Phe Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
ggc cgc aaa tac ggc atg gtc atc gac cag gac cat gcc acg acc atc 240
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
tcg gcc ggc atc gat ggc ggt cag ccc tgg cgc cgt agc ttc ggc gac 288
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
aac atc acc tat acg gac tgg cgc cgc gac aac ttc tac cag gcc gtc 336
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
cgc caa ctc acc ccc ggc gcc agg cgc atc ggt atc gag ttc gat cac 384
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
gtg aac ctt gac ttc cgc cgc acg ctc gaa gag gcg ctg ccc ggc gtc 432
Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
gag ttc gtc gat atc ggt caa ccg tcg atg tgg atg cgc acg gtc aag 480
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
tcg ctc gaa gag cag aag ctg atc cgc gag ggt gcc cgt atc tgc gac 528
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
gtc ggc ggt gcc gcc tgc gtt gcc gcc gtc aag gcc ggc gtt ccg gag 576
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
cac gag gtc gcg atc gcc aca acc aat gcg atg gtc cgc gag atc gcc 624
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
aag tcg ttc ccc ttc gtc gaa ctg atg gac acc tgg acc tgg ttc cag 672
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
tcg ggc atc aac acc gac ggc gcc cac aat ccg gtg acc aac cgc atc 720
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
gtg caa tcg ggc gat atc ctg tcg ctc aac acg ttc ccg atg atc ttc 768
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
ggc tac tac acg gcg ctg gag cga acg ctg ttc tgc gac cac gtc gac 816
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
gat gcc agc ctt gac atc tgg gag aag aac gtc gcc gtg cac cgc cgc 864
Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
ggc ctc gaa ctc atc aag ccg ggt gcg cgc tgc aag gat atc gcc atc 912
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
gaa ctc aac gag atg tac cgg gag tgg gat ctg ctg aag tac cgc tcc 960
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
ttc ggc tac ggc cac tcc ttc ggc gtg ctc tcc cac tac tac ggc cgc 1008
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
gag gcg ggc gtg gaa ctg cgc gag gac atc gat acc gtg ctg cag ccc 1056
Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
ggc atg gtg gtc tcc atg gag ccg atg gtg atg ttg cca gaa ggc gct 1104
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
ccc ggc gcg ggc ggc tac cgc gag cac gac atc ctg atc gtg ggg gaa 1152
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
gac ggc gca gag aac att acc gga ttc ccc ttc ggg cct gag cac aac 1200
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
atc atc cgc aac tga 1215
Ile Ile Arg Asn
405
<210> 2
<211> 404
<212> PRT
<213> Erwinia sp.
<400> 2
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Phe Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
Val Asn Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
Asp Ala Ser Leu Asp Ile Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
Ile Ile Arg Asn
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<222> 4
<223> Xaa is any amino acid residues.
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide 1
<400> 3
Tyr Ser Gly Xaa Leu Tyr Cys
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide 2
<220>
<222> 4
<223> Xaa is any amino acid residues.
<400> 4
Asp His Val Xaa Leu Asp Phe
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide 3
<220>
<222> 4
<223> Xaa is any amino acid residues.
<400> 5
Thr Asn Ala Xaa Val Arg Glu
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide 4
<220>
<222> 4
<223> Xaa is any amino acid residues.
<400> 6
Ser Leu Asp Xaa Trp Glu Lys
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide 5
<220>
<222> 4
<223> Xaa is any amino acid residues.
<400> 7
Asp Ile Ala Xaa Glu Leu Asn
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide 6
<220>
<222> 4
<223> Xaa is any amino acid residues.
<400> 8
Gly Phe Pro Xaa Gly Pro Glu
1 5
<210> 9
<211> 1215
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:variant CT1m24
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1215)
<400> 9
atg act gac gac atg ttg cac gtg atg aaa tgg cac aat ggt gag aag 48
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
gaa tat tcc ccc ttt tcc gat gcc gag atg acg cgc cgc cag agt gac 96
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
gtg cgg cgc tgg atg gcc gaa aac gac gtc gac gct gcg ctg ttc acc 144
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
tcc tat cat tgc atc aac tac tac tct gga ttc ctg tac tgc tat ttc 192
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Phe Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
ggc cgc aaa tac ggc atg gtc atc gac cag gac cat gcc acg acc atc 240
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
tcg gcc ggc atc gat ggc ggt cag ccc tgg cgc cgt agc ttc ggc gac 288
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
aac atc acc tat acg gac tgg cgc cgc gac aac ttc tac cag gcc gtc 336
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
cgc caa ctc acc ccc ggc gcc agg cgc atc ggt atc gag ttc gat cac 384
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
gtg gac ctt gac ttc cgc cgc acg ctc gaa gag gcg ctg ccc ggc gtc 432
Val Asp Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
gag ttc gtc gat atc ggt caa ccg tcg atg tgg atg cgc acg gtc aag 480
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
tcg ctc gaa gag cag aag ctg atc cgc gag ggt gcc cgt atc tgc gac 528
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
gtc ggc ggt gcc gcc tgc gtt gcc gcc gtc aag gcc ggc gtt ccg gag 576
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
cac gag gtc gcg atc gcc aca acc aat gcg atg gtc cgc gag atc gcc 624
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
aag tcg ttc ccc ttc gtc gaa ctg atg gac acc tgg acc tgg ttc cag 672
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
tcg ggc atc aac acc gac ggc gcc cac aat ccg gtg acc aac cgc atc 720
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
gtg caa tcg ggc gat atc ctg tcg ctc aac acg ttc ccg atg atc ttc 768
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
ggc tac tac acg gcg ctg gag cga acg ctg ttc tgt gac cac gtc gac 816
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
gat gcc agc ctt gac acc tgg gag aag aac gtc gcc gtg cac cgc cgc 864
Asp Ala Ser Leu Asp Thr Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
ggc ctc gaa ctc atc aag ccg ggt gcg cgc tgc aag gat atc gcc atc 912
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
gaa ctc aac gag atg tac cgg gag tgg gat ctg ctg aag tac cgc tcc 960
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
ttc ggc tac ggc cac tcc ttc ggc gtg ctc tcc cac tac tac ggc cgc 1008
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
gag gcg ggc gtg gaa ctg cgc gag gac atc gat acc gtg ctg cag ccc 1056
Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
ggc atg gtg gtc tcc atg gag ccg atg gtg atg ttg cca gaa ggc gct 1104
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
ccc ggc gcg ggc ggc tac cgc gag cac gac atc ctg atc gtg ggg gaa 1152
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
gac ggc gca gag aac att acc gga ttc ccc ttc ggg cct gag cac aac 1200
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
atc atc cgc aac tga 1215
Ile Ile Arg Asn
405
<210> 10
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:variant CT1m24
<400> 10
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Phe Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
Val Asp Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
Asp Ala Ser Leu Asp Thr Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
Ile Ile Arg Asn
<210> 11
<211> 1212
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:variant CT2m9
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1212)
<400> 11
atg act gac gac atg ttg cac gtg atg aaa tgg cac aat ggt gag aag 48
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
gaa tat tcc ccc ttt tcc gat gcc gag atg acg cgc cgc cag agt gac 96
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
gtg cgg cgc tgg atg gcc gaa aac gac gtc gac gct gcg ctg ttc acc 144
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
tcc tat cat tgc atc aac tac tac tct gga ttc ctg tac tgc tat ttc 192
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Phe Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
ggc cgc aaa tac ggc atg gtc atc gac cag gac cat gcc acg acc atc 240
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
tcg gcc ggc atc gat ggc ggt cag ccc tgg cgc cgt agc ttc ggc gac 288
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
aac atc acc tat acg gac tgg cgc cgc gac aac ttc tac cag gcc gtc 336
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
cgc caa ctc acc ccc ggc gcc agg cgc atc ggt atc gag ttc gat cac 384
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
gtg gac ctt gac ttc cgc cgc acg ctc gaa gag gcg ctg ccc ggc gtc 432
Val Asp Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
gag ttc gtc gat atc ggt caa ccg tcg atg tgg atg cgc acg gtc aag 480
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
tcg ctc gaa gag cag aag ctg atc cgc gag ggt gcc cgt atc tgc gac 528
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
gtc ggc ggt gcc gcc tgc gtt gcc gcc gtc aag gcc ggc gtt ccg gag 576
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
cac gag gtc gcg atc gcc aca acc aat gcg gtg gtc cgc gag atc gcc 624
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Val Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
aag tcg ttc ccc ttc gtc gaa ctg atg gac acc tgg acc tgg ttc cag 672
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
tcg ggc atc aac acc gac ggc gcc cac aat ccg gtg acc aac cgc atc 720
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
gtg caa tcg ggc gat atc ctg tcg ctc aac acg ttc ccg atg atc ttc 768
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
ggc tac tac acg gcg ctg gag cga acg ctg ttc tgt gac cac gtc gac 816
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
gat gcc agc ctt gac acc tgg gag aag aac gtc gcc gtg cac cgc cgc 864
Asp Ala Ser Leu Asp Thr Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
ggc ctc gaa ctc atc aag ccg ggt gcg cgc tgc aag gat atc gcc atc 912
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
gaa ctc aac gag atg tac cgg gag tgg gat ctg ctg aag tac cgc tcc 960
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
ttc ggc tac ggc cac tcc ttc ggc gtg ctc tcc cac tac tac ggc cgc 1008
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
gag gcg ggc gtg gaa ctg cgc gag gac atc gat acc gtg ctg cag ccc 1056
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:variant CTqc2
<400> 18
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
Val Asp Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Met Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
Asp Ala Ser Leu Asp Thr Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Phe Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
Ile Ile Arg Asn
<210> 19
<211> 1212
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:variant CTsd2
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1212)
<400> 19
atg act gac gac atg ttg cac gtg atg aaa tgg cac aat ggt gag aag 48
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
gaa tat tcc ccc ttt tcc gat gcc gag atg acg cgc cgc cag agt gac 96
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
gtg cgg cgc tgg atg gcc gaa aac gac gtc gac gct gcg ctg ttc acc 144
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
tcc tat cat tgc atc aac tac tac tct gga ttc ctg tac tgc tat ttc 192
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Phe Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
ggc cgc aaa tac ggc atg gtc atc gac cag gac cat gcc acg acc atc 240
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
tcg gcc ggc atc gat ggc ggt cag ccc tgg cgc cgt agc ttc ggc gac 288
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
aac atc acc tat acg gac tgg cgc cgc gac aac ttc tac cag gcc gtc 336
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
cgc caa ctc acc ccc ggc gcc agg cgc atc ggt atc gag ttc gat cac 384
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
gtg gac ctt gac ttc cgc cgc acg ctc gaa gag gcg ctg ccc ggc gtc 432
Val Asp Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
gag ttc gtc gat atc ggt caa ccg tcg atg tgg atg cgc acg gtc aag 480
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
tcg ctc gaa gag cag aag ctg atc cgc gag ggt gcc cgt atc tgc gac 528
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
gtc ggc ggt gcc gcc tgc gtt gcc gcc gtc aag gcc ggc gtt ccg gag 576
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
cac gag gtc gcg atc gcc aca acc aat gcg gtg gtc cgc gag atc gcc 624
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Val Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
aag tcg ttc ccc ttc gtc gaa ctg atg gac acc tgg acc tgg ttc cag 672
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
tcg ggc atc aac acc gac ggc gcc cac aat ccg gtg acc aac cgc atc 720
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
gtg caa tcg ggc gat atc ctg tcg ctc aac acg ttc ccg atg atc ttc 768
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
ggc tac tac acg gcg ctg gag cga acg ctg ttc tgt gac cac gtc gac 816
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
gat gcc agc ctt gac acc tgg gag aag aac gtc gcc gtg cac cgc cgc 864
Asp Ala Ser Leu Asp Thr Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
ggc ctc gaa ctc atc aag ccg ggt gcg cgc tgc aag gat atc gcc atc 912
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
gaa ctc aac gag atg tac cgg gag tgg gat ctg ctg aag tac cgc tcc 960
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
ttc ggc tac ggc cac tcc ttc ggc gtg ctc tcc cac tac tac ggc cgc 1008
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
gag gcg ggc gtg gaa ctg cgc gag gac atc gat acc gtg ctg cag ccc 1056
Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
ggc atg gtg gtc tcc atg gag ccg atg gtg atg ttg cca gaa ggc gct 1104
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
ccc ggc gcg ggc ggc tac cgc gag cac gac atc ctg atc gtg ggg gaa 1152
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
gac ggc gca gag aac att acc gga ttc ccc ctg ggg cct gag cac aac 1200
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Leu Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
atc atc cgc aac 1212
Ile Ile Arg Asn
<210> 20
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:variant CTsd2
<400> 20
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Phe Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
Val Asp Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Val Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
Asp Ala Ser Leu Asp Thr Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Leu Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
Ile Ile Arg Asn
<210> 21
<211> 1212
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:variant CTsd7
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1212)
<400> 21
atg act gac gac atg ttg cac gtg atg aaa tgg cac aat ggt gag aag 48
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
gaa tat tcc ccc ttt tcc gat gcc gag atg acg cgc cgc cag agt gac 96
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
gtg cgg cgc tgg atg gcc gaa aac gac gtc gac gct gcg ctg ttc acc 144
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
tcc tat cat tgc atc aat tac tac tct gga tgg ctg tac tgc tat ttc 192
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
ggc cgc aaa tac ggc atg gtc atc gac cag gac cat gcc acg acc atc 240
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
tcg gcc ggc atc gat ggc ggt cag ccc tgg cgc cgt agc ttc ggc gac 288
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
aac atc acc tat acg gac tgg cgc cgc gac aac ttc tac cag gcc gtc 336
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
cgc caa ctc acc ccc ggc gcc agg cgc atc ggt atc gag ttc gat cac 384
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
gtg gac ctt gac ttc cgc cgc acg ctc gaa gag gcg ctg ccc ggc gtc 432
Val Asp Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
gag ttc gtc gat atc ggt caa ccg tcg atg tgg atg cgc acg gtc aag 480
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
tcg ctc gaa gag cag aag ctg atc cgc gag ggt gcc cgt atc tgc gac 528
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
gtc ggc ggt gcc gcc tgc gtt gcc gcc gtc aag gcc ggc gtt ccg gag 576
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
cac gag gtc gcg atc gcc aca acc aat gcg gtg gtc cgc gag atc gcc 624
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Val Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
aag tcg ttc ccc ttc gtc gaa ctg atg gac acc tgg acc tgg ttc cag 672
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
tcg ggc atc aac acc gac ggc gcc cac aat ccg gtg acc aac cgc atc 720
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
gtg caa tcg ggc gat atc ctg tcg ctc aac acg ttc ccg atg atc ttc 768
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
ggc tac tac acg gcg ctg gag cga acg ctg ttc tgt gac cac gtc gac 816
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
gat gcc agc ctt gac acc tgg gag aag aac gtc gcc gtg cac cgc cgc 864
Asp Ala Ser Leu Asp Thr Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
ggc ctc gaa ctc atc aag ccg ggt gcg cgc tgc aag gat atc gcc atc 912
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
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Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
ttc ggc tac ggc cac tcc ttc ggc gtg ctc tcc cac tac tac ggc cgc 1008
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
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Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
ggc atg gtg gtc tcc atg gag ccg atg gtg atg ttg cca gaa ggc gct 1104
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
ccc ggc gcg ggc ggc tac cgc gag cac gac atc ctg atc gtg ggg gaa 1152
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
gac ggc gca gag aac att acc gga ttc ccc ctg ggg cct gag cac aac 1200
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Leu Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
atc atc cgc aac 1212
Ile Ile Arg Asn
<210> 22
<211> 404
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Description of Artificial Sequence:variant CTsd7
<400> 22
Met Thr Asp Asp Met Leu His Val Met Lys Trp His Asn Gly Glu Lys
1 5 10 15
Glu Tyr Ser Pro Phe Ser Asp Ala Glu Met Thr Arg Arg Gln Ser Asp
20 25 30
Val Arg Arg Trp Met Ala Glu Asn Asp Val Asp Ala Ala Leu Phe Thr
35 40 45
Ser Tyr His Cys Ile Asn Tyr Tyr Ser Gly Trp Leu Tyr Cys Tyr Phe
50 55 60
Gly Arg Lys Tyr Gly Met Val Ile Asp Gln Asp His Ala Thr Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ala Gly Ile Asp Gly Gly Gln Pro Trp Arg Arg Ser Phe Gly Asp
85 90 95
Asn Ile Thr Tyr Thr Asp Trp Arg Arg Asp Asn Phe Tyr Gln Ala Val
100 105 110
Arg Gln Leu Thr Pro Gly Ala Arg Arg Ile Gly Ile Glu Phe Asp His
115 120 125
Val Asp Leu Asp Phe Arg Arg Thr Leu Glu Glu Ala Leu Pro Gly Val
130 135 140
Glu Phe Val Asp Ile Gly Gln Pro Ser Met Trp Met Arg Thr Val Lys
145 150 155 160
Ser Leu Glu Glu Gln Lys Leu Ile Arg Glu Gly Ala Arg Ile Cys Asp
165 170 175
Val Gly Gly Ala Ala Cys Val Ala Ala Val Lys Ala Gly Val Pro Glu
180 185 190
His Glu Val Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Val Val Arg Glu Ile Ala
195 200 205
Lys Ser Phe Pro Phe Val Glu Leu Met Asp Thr Trp Thr Trp Phe Gln
210 215 220
Ser Gly Ile Asn Thr Asp Gly Ala His Asn Pro Val Thr Asn Arg Ile
225 230 235 240
Val Gln Ser Gly Asp Ile Leu Ser Leu Asn Thr Phe Pro Met Ile Phe
245 250 255
Gly Tyr Tyr Thr Ala Leu Glu Arg Thr Leu Phe Cys Asp His Val Asp
260 265 270
Asp Ala Ser Leu Asp Thr Trp Glu Lys Asn Val Ala Val His Arg Arg
275 280 285
Gly Leu Glu Leu Ile Lys Pro Gly Ala Arg Cys Lys Asp Ile Ala Ile
290 295 300
Glu Leu Asn Glu Met Tyr Arg Glu Trp Asp Leu Leu Lys Tyr Arg Ser
305 310 315 320
Phe Gly Tyr Gly His Ser Phe Gly Val Leu Ser His Tyr Tyr Gly Arg
325 330 335
Glu Ala Gly Val Glu Leu Arg Glu Asp Ile Asp Thr Val Leu Gln Pro
340 345 350
Gly Met Val Val Ser Met Glu Pro Met Val Met Leu Pro Glu Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Ala Gly Gly Tyr Arg Glu His Asp Ile Leu Ile Val Gly Glu
370 375 380
Asp Gly Ala Glu Asn Ile Thr Gly Phe Pro Leu Gly Pro Glu His Asn
385 390 395 400
Ile Ile Arg Asn
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer ECF21
<400> 23
caggaaacag aattcatgac t 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer HIR21
<400> 24
ccaaaacagc caagctttca g 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer CTextF
<400> 25
catcggctcg tataatgtgt gg 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer CTextR
<400> 26
gccaaaacag ccaagctttc ag 22
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer CTf3951F
<400> 27
cattaccgga ttccccctgg ggcctgagca caac 34
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer CTf3951R
<400> 28
gttgtgctca ggccccaggg ggaatccggt aatg 34
<210> 29
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer CT59F
<220>
<221> misc feature
<222> 21, 22, 23
<223> n is any nucleotide residues.
<400> 29
gcatcaatta ctactctgga nnnctgtact gctatttcgg ccgc 44
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer CT59R
<220>
<221> misc feature
<222> 22, 23, 24
<223> n is any nucleotide residues.
<400> 30
gcggccgaaa tagcagtaca gnnntccaga gtagtaattg atgc 44
<210> 31
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer CTf59wF
<400> 31
gcatcaatta ctactctgga tggctgtact gctatttcgg ccgc 44
<210> 32
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer CTf59wR
<400> 32
gcggccgaaa tagcagtaca gccatccaga gtagtaattg atgc 44
【図１】図１は、配列番号：２の全長クレアチナーゼを
コードする配列番号：１の遺伝子を含有した発現ベクタ
ーを示す。前記発現ベクターは、pCT として当該技術分
野で公知である。
コードする配列番号：１の遺伝子を含有した発現ベクタ
ーを示す。前記発現ベクターは、pCT として当該技術分
野で公知である。
【図２】図２は、Erwinia sp. DSM 97-934から単離され
た野生型クレアチナーゼの短期熱ストレス安定性及び本
発明のバリアントの短期熱ストレス安定性を示す。安定
性は、 "サーモインデックス" を算出することにより評
価される。本指標は、熱ストレスなしの活性に対して短
期熱ストレス後の残存酵素活性を算出することにより得
られる。
た野生型クレアチナーゼの短期熱ストレス安定性及び本
発明のバリアントの短期熱ストレス安定性を示す。安定
性は、 "サーモインデックス" を算出することにより評
価される。本指標は、熱ストレスなしの活性に対して短
期熱ストレス後の残存酵素活性を算出することにより得
られる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
//(Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｒ 1:18
Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 ライナー シュムック
ドイツ連邦共和国 ベーネディクトボイア
ーン 83671 アム クロースターヴァイ
アー ７
(72)発明者 ペーター クラッツシュ
ドイツ連邦共和国 アントドルフ 82387
ドルフシュトラーセ ５
(72)発明者 ヤーネト ケンクリース
ドイツ連邦共和国 ペンツベルク 82377
アム アルテン バーンホフ １
(72)発明者 ハラルト ヴァイサー
ドイツ連邦共和国 ベルンリート 82347
アイヒェンシュトラーセ 14
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA11 CA03 DA06 EA04
GA14 HA01
4B050 CC03 DD02 FF09E FF11E
KK02 LL03
4B063 QA01 QQ03 QR02 QR03 QR10
QR66 QS36 QX01
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号：2 に示されるアミノ酸配列に
おけるN130位、M203位、I278位、I304位及びF395位から
なる群より選ばれた位置に対応する位置での少なくとも
１つのアミノ酸置換を含有することを特徴とする、クレ
アチナーゼ活性を有する、野生型クレアチナーゼに対し
て改変されたＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバ
リアント。 - 【請求項２】 N130位又はI278位に対応するアミノ酸位
置での少なくとも１つの置換を含有することをさらに特
徴とする、請求項１記載のクレアチナーゼバリアント。 - 【請求項３】 配列番号：2 に示されるアミノ酸配列に
おけるN130位及びI278位から選ばれた位置に対応する位
置での少なくとも１つのアミノ酸置換と、I304位及びF3
95位から選ばれた少なくとも１つの置換とを含有するこ
とをさらに特徴とする、請求項１又は２記載のクレアチ
ナーゼバリアント。 - 【請求項４】 請求項１〜３いずれか１項に記載のＥｒ
ｗｉｎｉａタイプのクレアチナーゼバリアントを含有し
てなる、クレアチン測定用試薬。 - 【請求項５】 サルコシンオキシダーゼと過酸化水素検
出用試薬とをさらに含有することをさらに特徴とする、
請求項４記載の試薬。 - 【請求項６】 ａ）解析対象の試料を、請求項１〜３い
ずれか１項に記載のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナ
ーゼバリアントと、サルコシンオキシダーゼと、ペルオ
キシダーゼと、過酸化水素検出用試薬とを含有した試薬
とともにインキュベートするステップ、及び ｂ）生成した過酸化水素と、試料中のクレアチンの濃度
とを関連付けるステップ、を含む、クレアチンの検出方
法。 - 【請求項７】 ａ）解析対象の試料を、請求項１〜３い
ずれか１項に記載のＥｒｗｉｎｉａタイプのクレアチナ
ーゼバリアントと、クレアチニナーゼと、サルコシンオ
キシダーゼと、ペルオキシダーゼと、過酸化水素検出用
試薬とを含有した試薬とともにインキュベートするステ
ップ、及び ｂ）生成した過酸化水素と、試料中のクレアチニンの濃
度とを関連付けるステップ、を含む、クレアチニンの検
出方法。
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