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Die
vorliegende Erfindung betrifft Oligonucleotide zur Beurteilung der
Fähigkeit
zum Bierverderb von Milchsäure-Bakterien,
die die Bierqualität
beeinflusst, sowie ein Verfahren zur Beurteilung der Fähigkeit
zum Bierverderb mit diesen Oligonucleotiden.
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Bier
ist wirksam bei der Steuerung des Bakterienwachstums, da es Alkohol
enthält,
eine Kohlenstoff-Quelle verbraucht, niedrigen pH und anaerobe Bedingungen
aufweist, und zudem Hopfen mit antibiotischer Wirkung enthält. Da jedoch
Bakterien, etwa die Lactobacillus-Gattungen, zum Teil gegen Iso-α-säure resistent
sind, die ein Bestandteil im Hopfen ist, mischen sich die Bakterien
in die Bierprodukte und verleihen den Produkten eine Trübung.
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Untersucht
wurde bislang der Nachweis und die Beurteilung von Bakterien, die
Einfluss auf die Qualität von
Bier haben; zum Beispiel gibt es ein Verfahren zum Nachweisen schädlicher
Bakterien beim Bierbrauen unter Anwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion (japanische
Patentveröffentlichung
Kokai Nr. 57-59166), ein Verfahren zum Nachweisen mit monoklonalen
Antikörpern
für Bier-Milchsäurebakterien
(japanische Patentveröffentlichung
Kokai Nr. 06-105698) sowie ein Verfahren, umfassend die Extraktion
von DNA aus Milchsäure-Bakterien,
Durchführen
einer PCR mit Primern, die auf der Grundlage einer bestimmten Sequenz
ausgewählt
sind, Amplifizieren der Sequenz und Beurteilen hinsichtlich Gegenwart
oder Abwesenheit von Milchsäure-Bakterien
(japanische Patentveröffentlichung
Kokai Nr. 06-141899).
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Diese
Verfahren sind jedoch im Wesentlichen Verfahren zur Beurteilung
bestimmter Bakterien wie etwa Lactobacillus brevis. Werden Lactobacillus
brevis ohne die Fähigkeit
zum Bierverderb oder andere Bakterien mit der Fähigkeit zum Bierverderb im
Bier oder in anderen halbfertigen Produkten während der Bierherstellung nachgewiesen,
so bestehen aus diesem Grund insofern Probleme, als die Fähigkeit
zum Bierverderb fehlerhaft beurteilt wird, so dass es schwierig
ist, zu beurteilen, ob die nachgewiesenen Bakterien die Fähigkeit zum
Bierverderb haben oder nicht.
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WO
95/07289 betrifft Nucleinsäure-Sequenzen,
die bevorzugt an die rRNA oder rDNA von Mikroorganismen binden,
die Verderb von Bier hervorrufen.
JP
09000260 (Zusammenfassung) betrifft ein hopfenresistentes
Plasmid aus einem Milchsäure-Bakterium,
mit dem ein Biertrübung
bildendes Milchsäure-Bakterium nachgewiesen
werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur schnellen Beurteilung
verfügbar,
ob nachgewiesene Milchsäure-Bakterien
die Fähigkeit
zum Bierverderb aufweisen, indem ein Teil der Sequenz des Hopfenresistenz-Gens
auf ein Plasmid, das in Lactobacillus brevis von bierverderbenden
Milchsäure-Bakterien
enthalten ist (japanische Patentveröffentlichung Nr. 8-186621),
und das Nucleotid in der Sequenz eingegrenzt und eine Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) mit dem Nucleotid als Primer durchgeführt wird.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ein Oligonucleotid zur Beurteilung
der Fähigkeit
zum Bierverderb von Milchsäüre-Bakterien,
wobei dieses wenigstens 10 fortlaufende Basen oder die gesamte Nucleotid-Sequenz
SEQ ID NO. 1 oder die entsprechende Komplementärsequenz aufweist. Die vorliegende
Erfindung umfasst des Weiteren ein Oligonucleotid zur Beurteilung
der Fähigkeit zum
Bierverderb von Milchsäure-Bakterien, dadurch
gekennzeichnet, dass die vorstehend erwähnte Nucleotid-Sequenz 5'-ATCCGGCGGTGGCAAATCA-3' oder 5'-AATCGCCARTCGTTGGCG-3' ist.
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Das
Oligonucleotid der vorliegenden Erfindung enthält wenigstens 10 fortlaufende
Basen in der vorstehend erwähnten
Nucleotid-Sequenz.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst zudem ein Verfahren zum Amplifizieren
eines Ziel-Nucleotids, wobei die obige Nucleotid-Sequenz als Primer bei der Polymerase-Kettenreaktion
fungiert.
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Des
Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung
der Fähigkeit
zum Bierverderb von Milchsäure-Bakterien,
umfassend die Abtrennung des mit Hilfe des obigen Verfahrens amplifizierten
Nucleotids mittels Elektrophorese und Beurteilen hinsichtlich Gegenwart
oder Abwesenheit des Nucleotids, das die Sequenz aufweist, die im
resultierenden Nucleotid erkannt werden soll.
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Unter
Berücksichtigung
der Tatsache, dass der wichtigste Faktor für die Bestimmung der Fähigkeit zum
Bierverderb der Milchsäure-Bakterien die Hopfenresistenz
ist, ist es mit der vorliegenden Erfindung möglich – da sie durch die Verwendung
der die Hopfenresistenz betreffenden Gensequenzen eine Beurteilung
gestattet, ob die nachgewiesenen Milchsäure-Bakterien ein Hopfenresistenz-Gen aufweisen oder
nicht – schnell im
Voraus über
die Fähigkeit
zum Bierverderb von Bakterien ohne die Bestätigung durch Bakterien-Wachstum in
Bier und dergleichen Bescheid zu wissen.
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Werden
Milchsäure-Bakterien
im Bier oder in den während
der Bierherstellung produzierten halbfertigen Produkten nachgewiesen,
so werden bei der vorliegenden Erfindung die Milchsäure- Bakterien kultiviert. Zur
Vermehrung der Milchsäure-Bakterien
kann irgendein Kulturmedium verwendet werden, zum Beispiel können die
Bakterien in einem MRS-Flüssigmedium
wachsen. Die Kulturbedingungen sind anaerobe Bedingungen bei Normaltemperatur,
um die Milchsäure-Bakterien
zu vermehren. Die Kultivierungszeit beträgt 1-2 Tage.
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Die
kultivierten und vermehrten Bakterien werden eingesammelt, und die
DNA wird mit Hilfe eines bekannten DNA-Extraktionsverfahrens extrahiert,
beispielsweise mit dem Verfahren von D.G. Anderson und L.L. Mackay
et al. (App. Env. Microbiol. 46, S. 549, 1983), und für die Beurteilung
der vorliegenden Erfindung genutzt.
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Um
zwei Oligonucleotide zur Verwendung als Primer einzusetzen, wird
ein Teil der Sequenz aus dem in der japanischen Patentanmeldung
Nr. 8-186621 beschriebenen Hopfenresistenz-Gen bestimmt und chemisch
synthetisiert, um zwei gegensinnige Primer zu erhalten. Besonders
bei Verwendung der im Sequenzprotokoll beschriebenen Nucleotid-Sequenz
als Primer für
eine Polymerase-Kettenreaktion
werden DNA-Fragmente mit 342 bp durch das Beurteilungsverfahren
der vorliegenden Erfindung amplifiziert, wenn die Milchsäure-Bakterien
das Hopfenresistenz-Gen aufweisen.
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Überdies
ist Temperaturverträglichkeit
bei 90°C
oder mehr ausreichend für
die Verwendung der DNA-Polymerase. Die Temperaturbedingungen einer
PCR-Reaktion sind 90-98°C
bei einer thermischen Denaturierungsreaktion zur Umwandlung einer
doppelsträngigen
DNA in eine einzelsträngige
DNA, 37-68°C beim
Annealing von Primern an eine Matrizen-DNA und 50-75°C bei einer
Kettenverlängerungsreaktion
mit Polymerase. Unter Anwendung eines Zyklus dieser Reaktionen werden
die Zyklen einige zehnmal durchgeführt, um die Fragmente des Hopfenresistenz-Gens
zu amplifizieren.
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Nach
der PCR-Reaktion werden die Reaktionsprodukte durch Elektrophorese
aufgetrennt, eine Nucleinsäure-Anfärbung mit
Ethidiumbromid oder dergleichen wird durchgeführt, und es wird bestätigt, ob
eine Amplifikation der DNA-Fragmente stattgefunden hat oder nicht.
Bei Vorliegen von DNA-Fragmenten mit einer für den konstruierten Primer
spezifischen Kettenlänge
erfolgt eine Beurteilung dahingehend, dass die Bakterien das Hopfenresistenz-Gen und die Fähigkeit
zum Bierverderb aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand der Arbeitsbeispiele
beschrieben. Nach den Lactobacillus-Bakterienstämmen wurden die 95 in Tabelle
1 beschriebenen Stämme,
genauer gesagt Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus collinoides und dergleichen
in MRS-Flüssigmedium
24 Stunden lang kultiviert, und die DNA wurde mit Hilfe der Methode
von Anderson und MacKay extrahiert.
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Mit
der DNA als Matrize und mit einem Teil der im Sequenzprotokoll beschriebenen
Nucleotid-Sequenz, den beiden Primern 5'-ATCCGGCGGTGGCAAATCA-3' oder 5'-AATCGCCAATCGTTGGCG-3' wurde eine PCR mit
TAKARA Ex Taq und Program Temp Control System PC-800 (ASTEC) durchgeführt.
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Was
das PCR-Verfahren anbetrifft, so kann eine bekannte Technik angewandt
werden (Science 230, S. 13, 1995).
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Fünf μl des PCR-Produkts
wurden durch Elektrophorese auf Agarose-Gel (NuSieve GTG, TAKARA), worin
TAE-Puffer (0,04 M, Tris-acetat, 0,01 M EDTA, pH 8,0) auf 3% gelöst wurde,
und einen Satz MUPID-Minigel-Elektrophorese (ADVANCE CO.) aufgetrennt,
und das PCR-Produkt wurde mit Ethidiumbromid angefärbt. Als
Molekulargewichtsmarker wurde eine mit HincII geschnittene ΦX174-DNA
(TAKARA) verwendet.
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Die
Temperaturbedingungen des Beurteilungsverfahrens der vorliegenden
Erfindung sind 3 Minuten 94°C
als ein Zyklus, 30 Sekunden 98°C,
eine Minute 55°C
und 0,5 Minuten 72°C
als 25 Zyklen.
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Zudem
wurde an den in Tabelle 1 beschriebenen 95 Stämmen die Fähigkeit zum Bierverderb mit
Hilfe der folgenden Schritte geprüft.
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Nach
dem Kultivieren in MRS-Flüssigmedium
wurde zunächst
jedes Bakterium zu 106 Zellen/ml in entgastes
Bier mit einem Bitterwert von 20 geimpft, das auf pH 4,6 eingestellt
war, und bei 25°C
zwei Monate lang unter anaeroben Bedingungen kultiviert. Nach dem
Kultivieren wurde der Stamm, bei dem augenscheinlich die Fähigkeit
zum Bierverderb vorhanden war, dahingehend beurteilt, dass er die
Fähigkeit
zum Bierverderb innehatte.
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Wie
in den Ergebnissen von Tabelle 1 gezeigt, beliefen sich die Stämme, bei
denen mit Hilfe des Beurteilungsverfahrens (horA-PCR) der vorliegenden Erfindung spezifische
Amplifikation von 342 bp-DNA-Fragmenten beobachtet wurde, auf 61
von 95 Stämmen,
und es waren 34 Stämme,
bei denen keine spezifische Amplifikation beobachtet wurde. Tatsächlich wurden
beim Vergleich der Ergebnisse, bei denen eine Trübung nach Einimpfen der Bakterien
in Bier mit pH 4,6 erkannt wurde, zwei Stämme ohne die Fähigkeit
zum Bierverderb durch das horA-PCR-Verfahren als positiv beurteilt,
während
ein Stamm mit der Fähigkeit
zum Bierverderb durch das horA-PCR-Verfahren als negativ beurteilt
wurde. Demgemäß ist erkennbar,
dass das Verfahren sehr genau ist.
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Die
Vorzüge
der Erfindung sind wie folgt: werden Bakterien, bei denen hohe Wahrscheinlichkeit
besteht, dass sie die Fähigkeit
zum Bierverderb aufweisen, etwa Lactobacillus brevis und Lactobacillus
lindneri, durch viele herkömmliche
bekannte Verfahren als bierverderbende Bakterien beurteilt, so kommt
es zu vielen fehlerhaften Beurteilungen, Wird des Weiteren die Fähigkeit
zum Bierverderb durch Einimpfen von Bakterien getestet, so braucht
dies mehrere Wochen bis mehrere Monate.
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Durch
Verwendung des Oligonucleotids der vorliegenden Erfindung und des
Verfahrens zur Beurteilung der Fähigkeit
zum Bierverderb mit diesem Oligonucleotid ist es möglich, die
Fähigkeit
zum Bierverderb in wenigen Stunden zu beurteilen.
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