JP3057552B2 - 乳酸菌のホップ耐性プラスミド及びホップ耐性判定法 - Google Patents

乳酸菌のホップ耐性プラスミド及びホップ耐性判定法

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幸司 依田
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ホップ耐性を有する乳
酸菌の判定法に関し、さらに詳しくは、ビールの品質に
影響するラクトバチルス属乳酸菌のホップ耐性判定法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】ビール
は、アルコールの含有、炭素源の枯渇、低ｐＨ、嫌気状
態という条件であることに加えて、抗菌活性をもつホッ
プを含むことから、微生物の生育抑制効果がある。しか
し、ある種のラクトバチルス（Lactobacillus）属菌
は、ホップ中の成分であるisoα酸に対して耐性を持つ
ことから、ビール製品に混入し生育することがある。
【０００３】このビールの品質に影響するラクトバチル
ス属菌の検出、判定については従来から検討されてお
り、例えば、抗原抗体反応を利用したビール醸造有害細
菌の検出法（特開昭５７−５９１６６）、ビール乳酸菌
に対するモノクローナル抗体を用いた検出法（特開平０
６−１０５６９８）、乳酸菌からＤＮＡを抽出して特定
のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行い
配列を増幅させた後乳酸菌の有無を判定する方法（特開
平０６−１４１８９９等）がある。
【０００４】しかしながら、これらの方法は、主として
ラクトバチルス ブレビスのような特定の乳酸菌の判定
を行う手法であり、このため、ホップ耐性のないブレビ
スの検出が行われる一方、ホップ耐性のある他の種の菌
を検出できないので、ビール混濁乳酸菌を確実に検出で
きないという問題点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで本発明では、ビー
ル混濁乳酸菌のホップ耐性に関係するプラスミドを特定
し、そのプラスミドをプローブとして利用してホップ耐
性乳酸菌を迅速に検出するものである。また、ビール混
濁乳酸菌を徐々にホップエキス濃度を高めた培地で培養
を繰り返しホップ耐性を強化した該乳酸菌からホップ耐
性プラスミドを取得する方法に関するものである。
【０００６】本発明は、次の行程によって実施されるホ
ップ耐性プラスミドの取得方法および得られたホップ耐
性プラスミドである。すなわち、（１）ビール混濁乳酸
菌を徐々にホップ濃度の高い培地に植え継いで行き馴化
し、ビール混濁乳酸菌のホップ耐性を強化する。（２）
この馴化操作を繰り返していくことによって、ビール混
濁乳酸菌の中に増加したホップ耐性に関係するプラスミ
ドを確認する。（３）確認されたプラスミドの一部また
は全部のＤＮＡを標識して判定用プローブをつくる。
（４）ホップ耐性乳酸菌か否かを判定したい乳酸菌を
（３）で得たプローブで判定する。
【０００７】また、本発明はこれらの行程で得られたホ
ップ耐性プラスミドも含む。ビール混濁乳酸菌は、ビー
ル製造において耐酸性と耐アルコール性を有する有害菌
であり、具体的には、ラクトバチルス ブレビス（Lact
obacillus brevis)、ラクトバチルス プランタラム（L
actobacillus plantarum)、ラクトバチルスカゼイ（Lac
tobacillus casei) 等がある。
【０００８】以下に、本発明をさらに詳しく説明する。
ビール混濁乳酸菌のホップ馴化を行う培地は乳酸菌が生
育できる培地であればいずれでもよいが、例えばＭＲＳ
液体培地等が使用できる。培地に添加するホップエキス
としては、イソ化ホップエキスが利用できる。ホップエ
キスを添加する濃度は、試験に供するビール混濁乳酸菌
が生育できる最大濃度から開始し、その濃度から５０〜
１００マイクロモル（イソα酸換算）ずつ上昇し、最大
濃度の３倍以上まで達成させる。
【０００９】培養条件は、ビール混濁乳酸菌が生育でき
る通常の適温で嫌気条件であればよい。培養時間は、各
ホップエキス含有培地で生育するまでであるが、最大５
日程度内である。ホップエキス馴化したビール混濁乳酸
菌からホップ耐性プラスミドを取得する方法は以下のと
おりである。
【００１０】培養したビール混濁乳酸菌を公知のアルカ
リＳＤＳ法（文献：D. G. Ardersen& L. L. Mckay, App
l. Env. Microbiol., 46, 549 (1983))で乳酸菌内の全
プラスミドを得る。得られた各プラスミドをアガロース
ゲル電気泳動にかけ、馴化前に比べて馴化後にコピー数
の増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、アガロ
ースを除去する。得られたプラスミドが、本発明のホッ
プ耐性プラスミドである。
【００１１】この得られたホップ耐性プラスミドをプロ
ーブに利用するには、プラスミド全体を用いてもよく、
あるいはこのうちの一部を用いても良い。このプローブ
は通常これらを利用して検出することができる公知の方
法によって標識するのが好ましく、例えば、ビオチン−
アビジン、ジゴキシゲニン等の標識、あるいは放射性標
識等が利用できる。
【００１２】この標識されたホップ耐性プローブを用
い、ビール混濁乳酸菌を判定する方法としては、一般に
利用されているコロニーハイブリダイゼーション法、サ
ザンハイブリダイゼーション法等が利用できる。場合に
より、ＰＣＲ法により判定する乳酸菌のプラスミドをあ
らかじめ増幅しておいてもよい。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により本発明を説明する。 （１）ラクトバチルス ブレビス（Lactobacillus brev
is）ＡＢＢＣ４５株のホップ耐性プラスミドの取得 ラクトバチルス ブレビスＡＢＢＣ４５株をイソ化ホッ
プエキスを１５０マイクロモル含有したＭＲＳ液体培地
５ｍｌに１０6 セル／ｍｌの割合で添加し、３０℃で３
日間培養した。
【００１４】その後、ホップ馴化をすすめるために、５
０マイクロモルずつイソ化ホップエキスを増加してい
き、最終濃度が９００マイクロモルになるまで上記の条
件で同様の操作を行った。馴化前後の乳酸菌を集菌、洗
浄し、次いでアルカリＳＤＳ法によって全プラスミドを
取得した。馴化前後の乳酸菌から得られた全プラスミド
をそれぞれアガロースゲル電気泳動にかけ、馴化後にコ
ピー数が増加したプラスミドのバンド部分を切り出し、
アガロースを除去した。
【００１５】得られたプラスミド（以下、ｐＲＨ４５と
いう）は１４．５ｋｂｐであり、制限酵素地図は図１の
とおりである。ｐＲＨ４５のBamHI-BamHI ２kb断片を、
大腸菌と乳酸菌のシャトルベクター上にクローニングす
ることにより増幅させ、ベーリンガーマンハイム社製Ｄ
ＩＧＤＮＡ標識及び検出キットを使用し、ジゴキシゲニ
ン−ｄＵＴＰを用いたランダムプライムシステムによる
ＤＮＡ標識を行った。
【００１６】表１に示した乳酸菌から前記の方法で、同
様にしてそれぞれプラスミドを分離し、アガロース電気
泳動にかけた後、ナイロンメンブランに転写した。次に
標識したプローブをハイブリダイズさせ、前記キットを
用いたELISAによる検出を行った。
【００１７】
【表１】
【００１８】（２）標識されたホップ耐性プローブを用
いたビール混濁乳酸菌の判定 表２に示した乳酸菌をそれぞれ102cells/mlを懸濁し
た、ビール500ml をメンブラン濾過し、MRS平板培地上
にのせ、25℃で嫌気培養した。出現したコロニーをナイ
ロンメンブランにうつしとり、溶菌させＤＮＡをメンブ
ラン上に固定した。次に実施例（１）で得られた標識し
たプローブをハイブリダイズさせ前記キットを用いたEL
ISAによる検出を行った。
【００１９】
【表２】
【００２０】
【発明の効果】本発明は、ビール混濁乳酸菌のホップ耐
性に関係するプラスミドを特定し、このプラスミドをプ
ローブとして利用するため、ホップ耐性乳酸菌を迅速に
検出することができる。これによりビールの品質に影響
するラクトバチルス属菌の検出、判定を確実に迅速に行
うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例において得られたプラスミド
（ｐＲＨ４５）の制限酵素地図を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北本 勝ひこ 東京都文京区弥生１−１−１ 東京大学 大学院農学生命科学研究科応用生命工学 専攻内 (72)発明者 佐見 学 東京都大田区大森北２−13−１ アサヒ ビール株式会社酒類開発研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/74 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ビール混濁乳酸菌を検出することができる
    ホップ耐性プラスミドであって、 【化１】 で示される制限酵素地図を有し、ラクトバチルス ブレ
    ビス由来のプラスミド。
  2. 【請求項２】 乳酸菌がラクトバチルス属乳酸菌である
    請求項１記載のホップ耐性プラスミド。
  3. 【請求項３】 ビール混濁乳酸菌を、徐々にホップエキ
    ス濃度を高めた培地で培養を繰り返し、ホップ耐性を強
    化した該乳酸菌からホップ耐性プラスミドを取得するこ
    とを特徴とするホップ耐性プラスミドの取得方法。
  4. 【請求項４】 乳酸菌がラクトバチルス属乳酸菌である
    請求項３記載の取得方法。
  5. 【請求項５】 請求項３または４記載の取得方法により
    取得した請求項１記載のホップ耐性プラスミド。
  6. 【請求項６】 ビール混濁乳酸菌のホップ耐性に関係す
    るプラスミドを特定し、そのプラスミドをプローブとし
    て利用してホップ耐性乳酸菌を検出することを特徴とす
    る乳酸菌のホップ耐性判定法。
  7. 【請求項７】 乳酸菌がラクトバチルス属乳酸菌である
    請求項６記載の判定法。
  8. 【請求項８】 請求項６または７記載の判定法において
    得られた請求項１記載のホップ耐性プラスミド。
  9. 【請求項９】 （１）ビール混濁乳酸菌を徐々にホップ
    濃度の高い培地に植え継いで行き馴化し、ビール混濁乳
    酸菌のホップ耐性を強化し、（２）この馴化操作を繰り
    返していくことによって、ビール混濁乳酸菌の中に増加
    したホップ耐性に関係するプラスミドを確認し、（３）
    確認されたプラスミドの一部または全部のＤＮＡを標識
    して判定用プローブをつくり、（４）ホップ耐性乳酸菌
    か否かを判定したい乳酸菌を（３）で得たプローブで判
    定することを特徴とする乳酸菌のホップ耐性判定法。
  10. 【請求項１０】 乳酸菌がラクトバチルス属乳酸菌であ
    る請求項９記載の判定法。
  11. 【請求項１１】 請求項９または１０記載の判定法にお
    いて得られた請求項１記載のホップ耐性プラスミド。
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