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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft chemolumineszente Verfahren und Zusammensetzungen
zur Erzeugung von Chemolumineszenz. Die vorliegende Erfindung betrifft
insbesondere Verfahren zur Erzeugung von Chemolumineszenz, die das
Umsetzen einer dihydroxyaromatischen Verbindung und einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung
in der Anwesenheit von Sauerstoff umfassen. Die vorliegende Erfindung
betrifft auch chemolumineszente Verfahren und Zusammensetzungen
zur Erzeugung von Chemolumineszenz durch die Wirkung einer Hydrolase.
Die Verfahren zur Erzeugung von Chemolumineszenz umfassen das Umsetzen
der Hydrolase mit einer geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen
mit einer Enzym-spaltbaren Gruppe geschützt ist, um die dihydroxyaromatische
Verbindung zur Reaktion mit einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung
freizusetzen, um Chemolumineszenz zu erzeugen. Die Erfindung betrifft
außerdem
die Verwendung der erfindungsgemäßen chemolumineszenten
Verfahren in Assays zur Detektion von Analyten, die Hydrolasen und
Enzym-markierte, spezifische Bindungspartner in spezifischen Bindungspaar-Assays, die Immun-Assays
und Nukleinsäure-Sonden-Assays
einschließen,
einschließen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Chemolumineszente Detektion
von Hydrolasen
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Hydrolasen,
wie alkalische Phosphatase und β-Galaktosidase
werden häufig
als Marker oder Markierungen in Enzym-gekoppelten Assays für biologische
Moleküle
oder andere Analyten von Interesse, wie Medikamente, Hormone, Steroide
und Krebsmarker verwendet. Außerdem
sind Phosphataseenzyme, z. B. alkalische Phosphatase (AP) und saure
Phosphatase (= Säurephosphatase)
(AcP), selber in Human- und Veterinärdiagnostik klinisch signifikant.
Die chemolumineszente Detektion dieser Enzyme bietet ein sicheres,
bequemes und sensitives Hilfsmittel, um ein quantitatives Maß für die Enzym-Menge
in einer Probe oder für
die Menge an Enzym-markiertem Analyten oder markiertem spezifischen
Bindungspartner für
einen Analyten bereitzustellen. Zahlreiche chemolumineszente Reaktionsschemata
sind im Stand der Technik zur Quantifizierung der Menge von bestimmten
Hydrolasen bekannt. Viele dieser Schemata sind komplex und teuer,
und sie benötigen
mehrere Enzyme oder verschiedene Reagenzien. Die kommerzielle Akzeptanz
solcher Verfahren zur Testung großer Mengen ist gering.
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a. Chemolumineszente Reaktion
von Acridanverbindungen mit alkalischer Phosphatase.
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Die
WO-A-9726245 beschreibt eine chemolumineszente Reaktion zwischen
einem Phosphataseenzym und einer Verbindung, die eine heterozyklische
Ringgruppe und eine Enolphosphatgruppe umfasst. Außerdem ist
die Verbesserung beschrieben, die durch das Einbeziehen einer kationischen
aromatischen Verbindung in die chemolumineszente Reaktion zwischen
einer Phosphatase und der heterozyklischen Enolphosphatverbindung
ermöglicht
wird. Im Gegensatz zu den Verfahren des Standes der Technik, beruhen
die Verfahren, die in diesen Anmeldungen offenbart werden, auf der
Reaktion eines Phosphataseenzyms mit dieser heterozyklischen Enolphosphatverbindung
zur Spaltung der Phosphatgruppe. In den vorliegenden Verfahren wird
kein Enzym zur Spaltung der Phosphatgruppe verwendet.
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b. Reaktionen die die
Erzeugung reduzierender Agentien einschließen.
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Chemolumineszente
Verfahren, die die Erzeugung eines reduzierenden Agens aus einem
Phosphatester, katalysiert durch alkalische Phosphatase, einschließen, wurden
beschrieben. (M. Maeda, A. Tsuji, K.H. Yang, S. Kamada, Biolum.
and Chemilum. Current Status, 119–22 (1991); M. Kitamura, M.
Maeda, A. Tsuji, J. Biolumin. Chemilumin., 10, 1–7 (1995); H. Sasamoto, M.
Maeda, A. Tsuji, Anal. Chim. Acta, 306, 161–6 (1995)). Das reduzierende
Agens reagiert mit Sauerstoff und Lucigenin, um Licht herzustellen.
Repräsentative reduzierende
Agentien schließen
Ascorbinsäure,
Glycerin, NADH, Dihydroxyaceton, Cortisol und Phenacylalkohol ein.
Eine PCT-Anmeldung, die WO 96/04400, und eine Veröffentlichung
(H. Arakawa, M. Maeda, A. Tsuji, Anal. Biochem., 199, 238–242 (1991))
beschreiben ebenfalls Analysen von alkalischer Phosphatase, die
Indoxylphosphatverbindungen und andere verwandte Phosphatverbindungen
verwenden, die bei Dephosphorylierung reduzierende Formen herstellen.
Chemolumineszenz wird in der Anwesenheit von Lucigenin oder anderen
Lumineszenzverstärkenden
Agentien aufgrund ihrer Reaktion mit H2O2 oder dem Superoxidion hergestellt.
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Das
U.S.-Patent 5,589,328 von Mahant offenbart eine chemolumineszente
Reaktion, bei der Indoxylester, Thioindoxylester und Benzofuranester
durch ein Enzym hydrolysiert werden und dadurch Superoxid erzeugen.
Die Lumineszenz wird durch das Hinzufügen eines Chemolumineszenz-erzeugenden
Reagenz, wie Lucigenin, verstärkt.
Lucigenin erzeugt durch die Reaktion mit Superoxid Chemolumineszenz.
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c. Enzymatisch triggerbare
Dioxetane.
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Stabile
1,2-Dioxetane, die eine geschützte
Phenol-Trigger-Gruppe tragen, durchlaufen bei der Entfernung der
Schutzgruppe einen chemolumineszenten Abbau (A. P. Schaap, T.S.
Chen, R.S. Handley, R. DeSilva, und B.P. Giri, Tetrahedron Lett.,
1155 (1987); A.P. Schaap, R.S. Handley, und B.P. Giri, Tetrahedron
Lett., 935 (1987); A.P. Schaap, M.D. Sandison, und R.S. Handley,
Tetrahedron Lett., 1159 (1987); und A.P. Schaap, Photochem. Photobiol.,
47S, 50S (1988)). Solche enzymatisch triggerbaren Dioxetane werden
durch die Reaktion mit einer Hydrolase getriggert, um dadurch die
chemolumineszente Abbaurate des Dioxetans um ein Vielfaches zu beschleunigen.
Zahlreiche Beispiele für
solche triggerbaren Dioxetane sind im Stand der Technik bekannt.
Ein innewohnender Nachteil der meisten triggerbaren Dioxetane ist
jedoch ihre Tendenz, Hintergrund-Chemolumineszenz in Abwesenheit
von Enzym durch langsamen, thermischen Abbau oder nicht-enzymatische
Hydrolyse zu erzeugen.
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d. Luciferin-Derivate.
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Phosphat-
und Galactosid-Derivate des Glühwürmchen-Luciferins sind bekannt
(N. Ugarova, Y. Vosny, G. Kutuzova, I. Dementieva, Biolum. and Chemilum.
New Perspectives, P. Stanley und L.J. Kricka, Hrsg., Wiley Chichester,
511–4
(1981); W. Miska, R. Geiger, J. Biolumin. Chemilumin., 4, 119–28 (1989)).
Die Behandlung des Glühwürmchen-Luciferin-Derivats
mit dem angemessenen Enzym setzt das Glühwürmchen-Luciferin frei, welches
in einem zweiten Schritt mit Luciferase und ATP umgesetzt wird,
um Licht herzustellen.
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e. Luminol-Derivate.
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Ein
Phosphat und ein NAG-Derivat des Luminol sind bekannt (K. Sasamoto,
Y. Ohkura, Chem. Pharm. Bull., 38, 1323–5 (1991); M. Nakazono, H.
Nohta, K. Sasamoto, Y. Ohkura, Anal. Sci., 8, 779–83 (1992)).
Die Behandlung des Luminol-Derivats mit dem angemessenen Enzym setzt
Luminol frei, welches in einem nachfolgenden Schritt mit Ferricyanid
umgesetzt wird, um Licht herzustellen.
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f. Gekoppelte Enzymverfahren.
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Die
PCT-Anmeldung WO 96/07911 der Anmelder offenbart die enzymatische
Erzeugung eines phenolischen Verstärkers aus einer geschützten Phenolverbindung
unter Verwendung von Hydrolase. Die Phenolverbindung verstärkt die
chemolumineszente Oxidation der Acridancarboxylsäure-Derivate mit einem Peroxidaseenzym.
Das U.S.-Patent 5,306,621 offenbart eine ähnliche gekoppelte Enzymreaktion,
in der ein Dihydrophthalazindion als chemolumineszentes Peroxidasesubstrat
verwendet wird. Geschützte
dihydroxyaromatische Verbindungen, in denen eine der Hydroxylgruppen
mit einer Gruppe geschützt
ist, die durch eine Hydrolase spaltbar ist, sind nicht in diesen
Verfahren verwendbar, da dihydroxyaromatische Verbindungen keine
Peroxidase-Verstärker
sind. Zahlreiche andere chemolumineszente Verfahren und Assays zur
Bestim mung von Hydrolasen, wie Phosphataseenzyme durch gekoppelte
Enzymreaktionen, sind bekannt. Eine Zusammenstellung solcher Verfahren
befindet sich in A. Tsuji, M. Maeda, H. Arakawa, Anal. Sci., 5,
497–506
(1989). Alle diese gekoppelten Enzymverfahren benötigen zwei
oder mehr Enzyme und verwenden entweder Luminol oder ein Luminolanalog,
Lucigenin oder bakterielles Luciferin als die chemolumineszente
Form.
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Viele
der zuvor erwähnten
Verfahren haben den Nachteil, dass sie zur Erzeugung des lumineszenten Signals
mehrere Reagenzien oder Enzyme benötigen. Die zusätzlichen
Kosten oder die Komplexität
der Handhabung haben die kommerzielle Akzeptanz dieser Verfahren
trotz ihrer gezeigten außergewöhnlichen
Detektionssensitivität
behindert. Chemolumineszente-Verfahren zur Detektion und Quantifizierung
von Hydrolasen, die diesen Grad an Sensitivität erreichen, aber keine zusätzlichen
Enzyme oder Hilfsreagenzien zusätzlich zum
Enzymsubstrat benötigen,
wären vorteilhaft.
Die vorliegende Erfindung stellt solche Verfahren und Verbindungen
bereit.
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2. Enzymatische Freisetzung
von Elektronentransfer-Agentien (ETA)
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a. Colorimetrische und
fluorimetrische Detektion
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Das
U.S.-Patent 4,952,495 offenbart und beansprucht Verfahren zur Bestimmung
von Hydrolasen durch die enzymatische Bildung einer Substanz, die
in der Lage ist, eine Elektronentransfer-Reaktion zu vermitteln,
die zur Herstellung einer detektierbaren Form führt. In einer Ausführungsform
kann das ETA eine reduzierende Substanz, wie eine substituierte
Hydrochinonverbindung, umfassen. Die detektierbaren Formen bilden
ein farbiges oder fluoreszentes Produkt. Es wird weiterhin gelehrt,
dass die detektierbare Form eine shiftbare, detektierbare Form sein
kann, die ein Chinon umfasst, das durch eine Verbindungsgruppe an
eine chromogene, fluorogene oder chemoluminogene Form gebunden ist.
Es gibt keine Lehre oder keinen Hinweis auf irgendeine andere chemoluminogene,
detektierbare Form, als auf die shiftbare Verbindung. Es gibt keinen Hinweis
oder keine Lehre über
die erfindungsgemäß beschriebenen
heterozyklischen Enolphosphatverbindungen.
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b. Amperometrische Detektion
von alkalischer Phosphatase (AP)
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Es
ist ein Verfahren für
die amperometrische Detektion von alkalischer Phosphatase bekannt,
welches die enzymatische Erzeugung von Hydrochinon aus seinem Monophosphat
durch AP, die Oxidation des Hydrochinons an der Oberfläche einer
Elektrode, um Benzochinon herzustellen, und die Regeneration des
Hydrochinons durch das zweite Enzym Glucoseoxidase, welche Elektronen
von seinem Substrat Glucose transferiert, umfasst. Die AP-Menge
wird als Zunahme der elektrischen Stromstärke detektiert.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Erzeugung
von Chemolumineszenz durch das Umsetzen einer dihydroxyaromatischen
Verbindung mit einer zweiten Verbindung bereitzustellen, die eine heterozyklische
Ringgruppe und eine Enolphosphatgruppe enthält, die in Anwesenheit von
Sauerstoff eine Reaktion durchläuft,
um Chemolumineszenz zu erzeugen. Das erfindungsgemäße Verfahren
wird in Anspruch 15 definiert.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur
Erzeugung von Chemolumineszenz durch die Wirkung einer Hydrolase
bereitzustellen, welches
- a) das Umsetzen der
Hydrolase mit einer geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen
durch eine durch die Hydrolase spaltbare Gruppe geschützt ist,
um eine dihydroxyaromatische Verbindung herzustellen; und
- b) das Umsetzen der dihydroxyaromatischen Verbindung mit einer
heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur Herstellung von Chemolumineszenz,
umfasst.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, chemolumineszente
Zusammensetzungen bereitzustellen, die eine dihydroxyaromatische
Verbindung und eine heterozyklische Enolphosphatverbindung enthalten.
Die Zusammensetzungen werden in Anspruch 1 definiert.
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Ein
noch weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Zusammensetzungen
bereitzustellen, die Chemolumineszenz durch die Reaktion mit einer
Hydrolase erzeugen, wobei die Zusammensetzung eine geschützte dihydroxyaromatische
Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen durch eine Gruppe geschützt ist, die
durch eine Hydrolase spaltbar ist, und eine heterozyklische Enolphosphatverbindung
umfasst.
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Ein
anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Verfahren zur Durchführung von
Assays eines Analyten bereitzustellen, die das Umsetzen einer dihydroxyaromatischen
Verbindung mit einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur
Erzeugung von Chemolumineszenz, das Messen der Chemolumineszenz
und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zur Menge des Analyten
umfassen. Dieses Verfahren wird in Anspruch 32 definiert.
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Ein
weiteres Ziel ist, ein Verfahren zur Durchführung eines Assays eines Analyten
bereitzustellen, welches das Umsetzen einer dihydroxyaromatischen
Verbindung und einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur
Chemolumineszenz-Erzeugung,
das Messen der Chemolumineszenz und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz
zur Menge des Analyten umfasst, wobei die heterozyklische Enolphosphatverbindung als
Markierung an einem spezifischen Bindungspaarelement bereitgestellt
wird.
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Ein
weiteres Ziel ist, ein Verfahren zur Durchführung eines Assays eines Analyten
bereitzustellen, welches das Umsetzen einer Hydrolase, einer geschützten dihydroxyaromatischen
Verbindung und einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur
Erzeugung von Chemolumineszenz, das Messen der Chemolumineszenz
und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zur Menge des Analyten
umfasst.
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Es
ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Detektion einer Hydrolase in einer Probe bereitzustellen, welches
das Umsetzen der Probe, die die Hydrolase enthält oder vermeintlich enthält, in Anwesenheit
einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung mit einer geschützten dihydroxyaromatischen
Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen durch eine Enzym-spaltbare
Gruppe geschützt
ist, um Chemolumineszenz herzustellen und das Inbeziehungsetzen
der Chemolumineszenz zur Menge der Hydrolase in der Probe, umfasst.
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Ein
noch weiteres Ziel ist, ein Verfahren zur Durchführung eines Assays eines Analyten
bereitzustellen, welches das Umsetzen einer Hydrolase, einer geschützten dihydroxyaromatischen
Verbindung und einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung zur
Erzeugung von Chemolumineszenz, das Messen der Chemolumineszenz
und das Inbeziehungsetzen der Chemolumineszenz zur Menge des Analyten
umfasst, wobei die Hydrolase als Markierung eines spezifischen Bindungspaarelementes
bereitgestellt wird.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Diagramm, das die schnelle Erzeugung von Chemolumineszenz aus
der Reaktion von Acridanphosphat 1 mit Hydrochinon bei Raumtemperatur
zeigt. Das Reaktionsgemisch umfasste 0,66 mM Acridanphosphat 1 und
4 μM Hydrochinon
in 2-Mehyl-2-amino-1-propanol-(221)-Puffer, 0,2 M, pH-Wert 9,6,
mit ebenfalls 0,88 mM MgCl2.
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2 ist
ein Graph, der die Intensität
der Chemolumineszenz zur Menge des Acridanphosphat 2 in Beziehung
setzt. Die durch die Reaktion von 100 μl einer Reagenzzusammensetzung,
die aus unterschiedlichen Mengen Acridanphosphat 2 (Verdünnungen
enthielten zwischen 6,6 × 10–11 und
6,6 × 10–17 mol)
in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2,
0,1 % SDS bestand, mit 100 μl
einer 0,01 mM 2-Chlorhydrochinon-(DHA-1)-Lösung in Wasser, emittierte
Chemolumineszenz, wurde nach 2,5 min gemessen.
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3 ist
ein Diagramm, das das Zeitprofil der Chemolumineszenz-Intensität zeigt,
welches von 100 μl
eines Reagenz emittiert wurde, welches aus einer 0,33 mM Acridanphosphat-1-Lösung und
1 mM 4-Hydroxyphenylphosphat in 0,1 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6 bestand
und durch die Zugabe von 8 × 10–17 mol
alkalischer Phosphatase (AP) bei 25 °C getriggert wurde.
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4 ist
ein Diagramm, das das Zeitprofil der Chemolumineszenz-Emission als
eine Funktion der 4-Hydroxyphenylphosphat-Konzentration zeigt. Eine
Reagenz-Zusammensetzung,
die aus einer 0,33 mM Acridanphosphat-1-Lösung und 0,88 mM MgCl2 in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6 bestand,
und verschiedene 4- Hydroxyphenylphosphat-Konzentrationen
enthielt (in mg/ml a, 1; b, 3,3; c, 0,66; d, 0,83; e, 10; f, 0,1;
g, 0) wurde mit 8 × 10–17 mol
AP bei 25 °C
umgesetzt.
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5 ist
ein Graph, der die AP-Menge in Beziehung zur Chemolumineszenz-Intensität setzt,
die durch 100 μl
einer Reagenz-Zusammensetzung emittiert wurde, die 0,66 mM Acridanphosphat
1, 0,66 mM 4-Hydroxyphenylphosphat und 0,88 mM MgCl2 in
0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, umfasst. Die Zusammensetzung (100 μl), wurde
bei Umgebungstemperatur in den Vertiefungen einer schwarzen Mikroplatte
mit 10 μl
einer AP-Lösung
umgesetzt, die zwischen 8 × 10–15 und
8 × 10–20 mol
des Enzyms oder 10 μl
Wasser als Blindprobe enthielt. Die Lichtintensität wurde
nach 25 min gemessen. Weniger als 0,1 amol AP wurde detektiert.
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6 ist
ein Graph, der die β-Galactosidase-Menge
zur Chemolumineszenz-Intensität in Beziehung setzt.
Lösungen
aus 4-Hydroxyphenyl-β-galactosid
(1 mM) in 0,05 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,01 M NaCl, 3 mM
MgCl2, wurden bei 37 °C für 35 min mit Verdünnungen
von β-Galactosidase
inkubiert. Teile wurden mit gleichem Volumen einer Acridanphosphat-3-Lösung, die
die folgenden Zusammensetzung aufwies, umgesetzt: 0,2 M 221-Puffer,
pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Acridanphosphat
3 und 0,1 % SDS. Die Enzymmenge in den Vertiefungen betrug zwischen
4,9 × 10–15 bis
1,6 × 10–18 mol β-Galactosidase.
Die Chemolumineszenz-Intensität
wurde nach 5 min gemessen.
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7 ist
ein Graph, der die Menge an β-Glucuronidase
zur Chemolumineszenz-Intensität in Beziehung
setzt. Lösungen
aus 4-Hydroxyphenyl-β-glucuronid
(1 mM) in 0,05 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,01 M NaCl, wurden
bei 37 °C
für 30
min mit Verdünnungen
von β-Glucuronidase
inkubiert. Teile wurden mit einem gleichen Volumen einer Acridanphosphat-4-Lösung, die
die folgenden Zusammensetzung aufwies, umgesetzt: 0,2 M 221-Puffer,
pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Acridanphosphat-4
und 0,1 % SDS. Die Enzymmenge in den Vertiefungen betrug zwischen
3,3 × 10–14 bis
3,3 × 10–18 mol β-Glucuronidase.
Die Chemolumineszenz-Intensität
wurde nach 11 min gemessen.
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8 ist
ein Bild einer Dot-Blot-Analyse von DNA-Verdünnungen, die eine Reagenz-Zusammenfassung
verwendet, die 0,66 mM Acridanphosphat 4, 0,66 mM 4-Hydroxyphenylphosphat,
0,1 % SDS und 0,88 mM MgCl2 in 0,1 M 221-Puffer,
pH-Wert 9,6, enthält. Das
Bild ist das Ergebnis einer 1 min Exponierung, aufgenommen 3 h nach
Kontaktieren der Membran mit dem DetektionsReagenz.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Definitionen:
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Alkyl – eine verzweigte,
geradkettige oder zyklische Kohlenwasserstoffgruppe, die 1-20 Kohlenstoffe enthält. So wie
hier verwendet, bezeichnet niedrigwertiges Alkyl jene Alkylgruppen,
die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.
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Alkenyl – eine verzweigte,
geradkettige oder zyklische Kohlenwasserstoffgruppe, die mindestens
eine C-C-Doppelbindung enthält
und 2-20 Kohlenstoffe enthält.
So wie hier verwendet, bezeichnet niedrigwertiges Alkenyl jene Alkenylgruppen,
die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.
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Alkinyl – eine verzweigte
oder geradkettige Kohlenwasserstoffgruppe, die mindestens eine C-C-Dreifachbindung
enthält
und 2-20 Kohlenstoffe enthält.
So wie hier verwendet, bezeichnet niedrigwertiges Alkinyl jene Alkinylgruppen,
die bis zu 8 Kohlenstoffe enthalten.
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Analyt – eine Substanz,
deren Anwesenheit oder Menge in einer Probe durch einen Assay gemessen werden
soll. Analyten schließen
organische und biologische Moleküle,
zu denen ein spezifischer Bindungspartner mit einer spezifischen Bindungsaffinität existiert,
ein. Exemplarische Analyten schließen, ohne Einschränkung, einzelsträngige oder
doppelsträngige
DNA, RNA, DNA-RNA-Komplexe,
Oligonukleotide, Antikörper,
Antikörperfragmente,
Antikörper-DNA-Chimäre, Antigene,
Haptene, Proteine, Lectine, Avidin, Streptavidin und Biotin ein.
Weitere exemplarische Analyten schließen Hydrolasen, Hydrolase-Inhibitoren
und dihydroxyaromatische Verbindungen ein.
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Aryl – eine aromatische
Ring-enthaltende Gruppe, die 1 bis 5 carbozyklische aromatische
Ringe enthält,
die mit einem oder mehreren Substituenten, die nicht H sind, substituiert
werden können.
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Biomedizinische
Analyse – Analysen
von Proben biologischen Ursprungs auf Analyten von Interesse. Die
Analysen können
Immunassays, Western Blots, Northern Blots, Southern Blots, DNA-Hybridisierungsassays,
DNA-Sequenzanalyse, Kolonie-Hybridisierungen, Genexpressionsanalyse,
High throughput-Arzneimittel-Screening
oder Detektion von infektiösen
Agentien oder Pathogenen sein.
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Dihydroxyaromatische
Verbindung – eine
aromatische Ringverbindung, die ein aromatisches Ringsystem umfasst,
welches wiederum mindestens einen carbozyklischen Ring und bis zu
fünf Ringe
umfasst, und welches mit zwei Hydroxylgruppen substituiert ist,
die durch eine gerade Anzahl von Ringkohlenstoffatomen getrennt
sind. Dieses Substitutionsmuster wird durch das Ortho- und Parasubstitutionsmuster
an einem Benzolring und durch z. B. das 1,2-, 1,4- oder 2,6-Substitutionsmuster
an einem Naphthalinring dargestellt. Dihydroxysubstituierte Biaryl-Ringsysteme
wie Biphenyl und Binaphthyl werden als im Schutzumfang der Definition liegend
erachtet, mit der Einschränkung,
dass eine gerade Zahl an Ringkohlenstoffatomen vorhanden ist, die die
beiden Hydroxylgruppen trennt. Eine dihydroxyaromatische Verbindung
kann mit zusätzlichen
Hydroxylgruppen, d.h. Trihydroxyl, Tetrahydroxyl, usw. substituiert
sein und weiterhin im Schutzumfang der Definition liegen, vorausgesetzt,
dass mindestens ein Hydroxylgruppen-Paar durch eine gerade Anzahl
an Ringkohlenstoffatomen getrennt ist.
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Halogen – Fluor-,
Chlor-, Brom- oder Iodatome.
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Probe – eine Flüssigkeit,
die einen oder mehrere zu analysierende Analyten enthält oder
vermutlich enthält.
Typische Proben, die mit dem chemolumineszenten Reaktionsverfahren
analysiert werden, sind biologische Proben, die Körperflüssigkeiten
wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Samen, Speichel, Zelllysate und Gewebeextrakte
einschließen.
Andere Probentypen schließen
Nahrungsmittelproben und Umweltproben wie Boden oder Wasser ein.
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Spezifisches
Bindungspaar – zwei
Substanzen, die eine wechselseitige Bindungsaffinität besitzen. Beispiele
schließen
Antigen-Antikörper,
Hapten-Antikörper
oder Antikörper-Antikörperpaare,
komplementäre Oligonukleotide
oder Polynukleotide, Avidin-Biotin, Streptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor,
Lectin-Kohlenhydrat, IgG-Protein
A, Nukleinsäure-Nukleinsäure-Bindungsprotein
und Nukleinsäure-Antinukleinsäuren-Antikörper ein.
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Es
sollte erwähnt
werden, dass bei Bezugnahme auf „eine heterozyklische Enolphosphatverbindung" oder „eine dihydroxyaromatische
Verbindung" oder „eine geschützte dihydroxyaromatische
Verbindung" gemeint
ist, dass mehr als eine der beschriebenen Formen eingeschlossen
ist, außer
es ist eindeutig nur der Einzelfall bezeichnet.
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Unenrwarteterweise
wurde herausgefunden, dass bestimmte dihydroxyaromatische Verbindungen, die
ein aromatisches Ringsystem umfassen, welches mit mindestens zwei
Hydroxylgruppen substituiert ist, die durch eine gerade Anzahl an
Ringkohlenstoffatomen getrennt sind, in der Anwesenheit von Sauerstoff
mit einer zweiten Verbindung reagieren, die eine heterozyklische
Enolphosphatverbindung ist, die eine heterozyklische Ringgruppe
und eine Enolphosphatgruppe enthält,
um einfach detektierbare Chemolumineszenz zu erzeugen. Exemplarische
aromatische Ringsysteme, die in den erfindungsgemäßen dihydroxyaromatischen Verbindungen
enthalten sind, umfassen Benzol-, Biphenyl-, Naphthalin-, Anthracen-,
Phenanthren-, Pyren-, Benzopyren- und Naphthacen-Ringsysteme.
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Eine
bevorzugte Gruppe dihydroxyaromatischer Verbindungen weist die Formel
I,
auf, wobei mindestens eines
von R
1 und R
3 eine
OH-Gruppe ist, das andere von R
1 oder R
3 und R
2, R
4 und R
5 jeweils
unabhängig
aus Wasserstoff-, Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-,
Amino-, Aminoalkyl-, Carboxyl- -C(=O)OH, Carboxylester- -C(=O)OR
6, Formyl- -C(=O)H, Alkylcarboxy- -OC(=O)R
6, Arylcarboxy- -OC(=O)R
9 und
Halogengruppen ausgewählt
sind, wobei Paare benachbarter Gruppen, wenn zusammengenommen, einen
fünf- oder
sechsgliedrigen aliphatischen oder aromatischen Ring vervollständigen können, und wobei
R
6 eine niedrigwertige Alkylgruppe ist,
wobei R
7 und R
8 jeweils
H oder eine niedrigwertige Alkylgruppe sind und wobei R
9 eine
Arylringgruppe ist.
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Weiter
bevorzugte Verbindungen der Formel I sind diejenigen Verbindungen,
in denen R3 die OH-Gruppe ist, und R1, R2, R4 und
R5 unabhängig
aus Wasserstoff-, Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Aryl- und Aralkylgruppen
ausgewählt
sind. Noch weiter bevorzugt sind R2, R4 und R5 jeweils
Wasserstoff, und R1 ist ausgewählt aus
Wasserstoff-, Alkyl-, Alkoxy-, Halogen-, Aryl- und Aralkylgruppen.
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Es
wird erkannt, dass andere dihydroxyaromatische Verbindungen zusätzlich zu
denen mit den am selben sechsgliedrigen Ring substituierten zwei
Hydroxylgruppen innerhalb des Schutzumfangs der dihydroxyaromatischen
Verbindungen liegen und in den erfindungsgemäßen Verfahren wirksam sind.
Dihydroxyaromatische Verbindungen, die ein biaromatisches Ringsystem
enthalten, in dem die Hydroxylgruppen an verschiedenen sechsgliedrigen
Ringen liegen, sind exemplarisch. Einige bestimmte Beispiele dihydroxyaromatischer
Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden
können,
sind in Tabelle 1 zum Zweck der Darstellung und nicht zur Definition
des Schutzumfangs der Erfindung aufgelistet.
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Tabelle
1. Dihydroxyaromatische Verbindungen
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Heterozyklische
Enolphosphatverbindungen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, und Zusammensetzungen zur Herstellung von Chemolumineszenz,
weisen die Formel
auf, wobei R
10 eine
organische Gruppe ist, die bis zu 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus
C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthält, jedes von R
11–R
18 unabhängig
aus Wasserstoff, Alkyl-, substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten
Aryl-, Aralkyl-, substituierten Aralkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-,
Aryloxy-, Halogen, Amino-, substituierten Amino-, Carboxyl-, Carboalkoxy-,
Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen ausgewählt ist, und wobei Paare benachbarter
Gruppen einen benzo-kondensierten Ring vervollständigen können, R
19 eine
organische Gruppe ist, die bis zu 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus
C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthält, Z aus O- und S-Atomen ausgewählt ist,
jedes M unabhängig
aus H und einem kationischen Zentrum ausgewählt ist und n eine Zahl ist,
die Elektroneutralität
genügt,
und mit der Maßgabe,
dass jegliches von R
11–R
18 oder
ein Substituent an jeglichem von R
10–R
19 eine Gruppe -A-Q sein kann, wobei A eine Spacergruppe,
ausgewählt
aus C
1-C
10 Alkylen-
und C
2-C
10 Oxyalkylengruppen
ist, und Q eine zur Bildung einer kovalenten Bindung fähige Verbindungsgruppe,
ausgewählt
aus Halogen, Diazo-, -NCO-, -NCS-, -CHO-, Säureanhydrid-, Oxiranyl-, Succinimidoxycarbonyl-,
Maleimid-, Cyano-, Triazol-, Tetrazol-, Hydroxyl-, -COOH-, Thiol-,
primären
Amino- und sekundären
Aminogruppen ist. In Verbindungen der Formel III können, dort
wo Doppelbindungsisomere möglich
sind, Gemische der Doppelbindungsisomere verwendet werden.
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Unter
erneuter Bezugnahme auf Formel III, schließen exemplarische Ringstrukturen
die unten aufgeführten
Strukturen ein, in denen der Stern die Position der exozyklischen
Doppelbindung markiert. Ohne explizit alle möglichen Substitutionsmuster
zu zeigen, ist es so zu verstehen, dass jede Ringposition andere
Substituenten als Wasserstoff enthalten kann.
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Die
Gruppe R19 ist vorzugsweise aus Alkyl-,
substituierten Alkyl-, Aryl-, substituierten Aryl-, Aralkyl- und substituierten
Aralkylgruppen ausgewählt.
Weiter bevorzugte Gruppen für
R19 schließen substituierte und unsubstituierte
niedrigwertige Alkylgruppen und substituierte und unsubstituierte
Benzylgruppen ein.
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In
allen der oben genannten Verbindungen, sind die Gruppen R11–R18 jeweils unabhängig H oder eine Substituentengruppe,
die die Lichtherstellung erlaubt und allgemein 1 bis 50 Atome, ausgewählt aus
C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthalten. Repräsentative
Substituentengruppen, die vorhanden sein können, schließen, ohne
Einschränkungen,
Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl-,
Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-, substituierte
Amino-, Carboxyl-, Carboalkoxy-, Carboxamid-, Cyano- und Sulfonatgruppen
ein. Paare von benachbarten Gruppen, z.B. R11–R12, können
zusammengefügt
werden, um einen benzo-kondensierten Ring zu bilden. Spezifische
Substituenen und ihre Wirkungen sind in den unten aufgeführten, spezifischen
Beispielen dargestellt, die aber nicht dahingehend erachtet werden,
den Schutzumfang der Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
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Jede
der Gruppen M ist unabhängig
ein Wasserstoffatom oder ein kationisches Zentrum. Ein kationisches
Zentrum bedeutet ein positiv geladenes Atom, wie ein Natriumion
Na+, eine Gruppe von Atomen, wie ein Ammoniumion
NH4 + oder ein Teil
eines Moleküls
mit einer oder mehreren positiv geladenen Stellen. Beispiele zu
Letzterem schließen
die kationischen Verbindungen, die in dem U.S.-Patent 5,451,347
des Anmelders beschrieben sind und polymerische Verbindungen mit
multiplen kationischen Gruppen, wie im U.S.-Patent 5,393,469 des
Anmelders beschrieben, ein. Die positive Ladung eines kationischen
Zentrums kann jeden Einheitswert annehmen, d.h. 1, 2, 3, usw. Exemplarische
kationische Zentren schließen,
ohne Einschränkung, Alkalimetallionen,
Erdalkaliionen, vierwertige Ammoniumionen und vierwertige Phosphoniumionen
ein, und sie sind in der Zahl anwesend, die bei ihrer Valenz benötigt wird.
Wenn zur Elektroneutralität
in der Verbindung von Formel I zwei Gruppen anwesend sein müssen, können sie
gleich oder verschieden sein. Bevorzugte Gegenionen sind die Alkalimetallionen.
Weiter bevorzugt sind Natrium- und Kaliumionen.
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Die
organische Gruppe R10 kann jede Gruppe sein,
die Lichtherstellung erlaubt. Das bedeutet, dass die Anwesenheit
jeder Gruppe als R10-Gruppe nicht die Fähigkeit
der Verbindung aus Formel III verhindert, letztendlich Chemolumineszenz
herzustellen. Letzteres bedeutet, dass, wenn eine Verbindung der
Formel III mit der dihydroxyaromatischen Verbindung in Anwesenheit
von Sauerstoff umgesetzt wird, sofort Chemolumineszenz hergestellt
wird, und diese die Herstellung von einem oder mehreren chemolumineszenten
Intermediaten einschließen
kann.
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Die
Gruppe R10 enthält 1 bis 50 Atome, die aus
C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen ausgewählt sind, ohne die nötige Zahl
an Wasserstoffatomen, die benötigt
werden, um den Valenzen der Atome in der Gruppe zu entsprechen.
Gruppen, die eine Funktion als R10-Gruppe
haben können,
schließen,
ohne Einschränkungen, Alkyl-,
substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl- und substituierte
Aral kylgruppen ein. Substituenten-Gruppen, anders als H-Atome, wie
ionische Gruppen oder polare Gruppen, können in verschiedener Zahl und
an ausgewählten
Positionen in die Kohlenstoffkette oder den Ring von R10 eingefügt werden,
um die Eigenschaften der Verbindung zu modifizieren, oder um eine
Erleichterung der Synthese der endgültigen Phosphatverbindung bereitzustellen.
Solche Eigenschaften schließen
zum Beispiel die chemolumineszente Quantenausbeute, die Reaktionsgeschwindigkeit
mit dem Enzym, die maximale Intensität der Lichtemission, die Dauer
der Lichtemission, die Wellenlänge
der Lichtemission und die Löslichkeit
im Reaktionsmedium ein. Spezifische Substituenten und ihre Wirkungen
sind in den spezifischen Beispielen unten dargestellt, die in keiner Art
und Weise gedacht sind, den Schutzumfang der Erfindung einzuschränken.
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Eine
bevorzugte Klasse von Verbindungen weist die unten gezeigte Formel
IIIa auf, wobei Z ein O- oder S-Atom ist, wobei R19 eine
niedrigwertige Alkylgruppe ist und wobei Ar eine Arylringgruppe
ist, die mindestens einen carbozyklischen aromatischen Ring enthält und die
weiter substituiert werden kann.
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-
Die
Gruppen R11 bis R18,
die gleich oder verschieden sein können, sind jeweils ein Substituent,
der 1 bis 50 Atome enthalten kann, ausgewählt aus C-, H-, N-, O-, S-,
P- und Halogenatomen und welcher die Lichtherstellung erlaubt und
Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl-, substituierte Aryl-, Aralkyl-
wie Benzyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryloxy-, Halogen-, Amino-,
substituierte Aminogruppen, Carboxyl-, Carboal koxy-, Carboxamid-, Cyano-
und Sulfonatgruppen einschließt.
In einem bevorzugten Satz von Verbindungen sind die Gruppen R11 bis R18 aus Wasserstoff
und niedrigwertigen Alkoxygruppen wie Methoxy, Ethoxy und t-Butoxy
ausgewählt.
Andere bevorzugte Verbindungen weisen die Formel IIIb auf, wobei
Z O oder S ist und Ar aus einer Phenylgruppe, einer substituierten
Phenylgruppe oder einer Naphthylgruppe ausgewählt ist.
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-
Ein
anderer bevorzugter Satz heterozyklischer Enolphosphatverbindungen
enthält
eine Gruppe -A-Q, die die Verwendung der Verbindung als Markierung
erlaubt. Bevorzugte Markierungsverbindungen enthalten die Gruppe
-A-Q als Substituent an R10 oder R19 oder an irgendeiner der Positionen R11–R18. Beispiele von heterozyklischen Enolphosphat-Markierungs-Verbindungen
weisen die Formeln IIIc, d oder e auf.
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In
der Gruppe -A-Q ist A eine Spacer-Gruppe, ausgewählt aus C1-C10-Alkylengruppen
und C2-C10-Oxalkylengruppen,
und Q ist eine Verbindungsgruppe, die fähig ist, eine kovalente Bindung
mit einem Molekül,
das wie ein Analyt oder ein spezifischer Bindungspartner konjugiert
werden kann, zu bilden. Die Verbindungsgruppen Q können elektrophile
Reste, wie Halogen, Diazo-, -NCO-, -NCS-, -CHO-, Säureanhydrid-, Oxiranyl-,
Succinimidoxycarbonyl-, Maleimid-, Cyano-, Triazol- und Tetrazolgruppen
sein, wie sie allgemein im Stand der Technik bekannt sind. Alternativ
können
die Verbindungsgruppen Q nukleophile Reste, wie Hydroxyl-, -COOH-,
Thiol-, primäre
Amino-, sekundäre
Aminogruppen sein. Es ist beabsichtigt, dass in einer Verbindung
der Formel IIIe die Gruppe A-Q auf jeder der beiden Benzolringe
anwesend sein kann.
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Die
folgenden spezifischen Verbindungen sind besonders bevorzugt zur
Verwendung in den hier beschriebenen, neuen, chemolumineszenten
Verfahren:
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Die
Umsetzung einer Verbindung der Formel III mit einer dihydroxyaromatischen
Verbindung einer wässrigen
Pufferlösung
stellt helle Chemolumineszenz her, die bei Raumtemperatur schnell
die maximale Intensität
erreicht.
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Da
wir an dieser Stelle nicht wünschen,
eine spezifische, mechanistische Erklärung für diese Erfindung einzubringen,
wird angenommen, dass die Chemolumineszenz von dem elektronisch
angeregten Zustand einer Ketonverbindung IV emittiert wird, der
formal aus der Oxidation der Doppelbindung der heterozykli schen
Enolphosphatverbindung abgeleitet wurde. Eine für die Herstellung von Chemolumineszenz
nötige Bedingung
ist, dass die Reaktion ausreichend Energie erzeugt, um den angeregten
Zustand von IV zu erzeugen, und dass IV fluoreszent ist. Das aktive
Oxidationsmittel kann Sauerstoff sein, eine reduzierte Form des Sauerstoffs
wie das Superoxidion, das Peroxidion oder ein Peroxidradikal, oder
das aktive Oxidationsmittel kann ein oxidiertes Produkt der dihydroxyaromatischen
Verbindung sein, wie die Chinon- oder Semichinon-Form.
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Chemolumineszenz-Emission
durch die erfindungsgemäßen Reaktionen
und Verfahren wird typischerweise als ein 100–200 nm breites Emissionsband
hergestellt und zeigt ein maximale Intensität bei Wellenlängen des
nahen Ultravioletts bis zur sichtbaren Region des elektromagnetischen
Spektrums. Typische Wellenlängen
der maximalen Intensität, λmax,
liegen im Bereich von 350–500
nm. Es wird in Betracht gezogen, dass Phosphatverbindungen der Formel
III, die ein kovalent verbundenes Fluorphor tragen, einen intramolekularen
Energietransfer durchlaufen könnten,
der in der Emission bei längeren
Wellenlängen
aus dem angeregten Zustand des Fluorphors resultiert.
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Chemolumineszentes
Licht, das durch die vorliegenden Verfahren emittiert wird, kann
visuell oder mit jedem anderen bekannten, geeigneten Hilfsmittel,
wie mit einem Luminometer, einem Röntgenfilm, einem photographischen
Hochgeschwindigkeitsfilm, einer CCD-Kamera, einem Szintillationszähler oder
einem chemischen Aktionometer detektiert werden. Jedes Detektionshilfsmittel
weist eine unterschiedliche spektrale Sensitivität auf. Das menschliche Auge
ist optimal sensitiv für
grünes
Licht, CCD-Kameras zeigen maximale Sensitivität für rotes Licht, Röntgenfilme
sind mit einer maximalen Antwort auf entweder UV-, blaues Licht
oder grünes
Licht verfügbar.
Die Wahl des Detektionsapparates wird durch die Anwendung und Kostenüberlegungen, Bequemlichkeit,
und die Tatsache, ob eine permanente Aufzeichnung benötigt wird,
bestimmt.
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Die
erfindungsgemäßen chemolumineszenten
Reaktionen, die die Reaktion von Verbindungen der Formel I und III
in der Anwesenheit von Sauerstoff umfassen, können Verwendung als chemische
Lichtquellen finden, ein Beispiel dafür ist der bekannte Leuchtstab
und verwandte Neuheiten, oder Notfallbeleuchtung. Eine andere Verwendung
liegt in Verfahren zur Detektion einer Verbindung der Formel I in
einer Probe in einer biomedizinischen Analyse, einer Nahrungsmittelanalyse
oder einer Umweltanalyse auf Schadstoffe.
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Die
erfindungsgemäßen chemolumineszenten
Reaktionen können
auch in einem Verfahren zur Durchführung eines Assays eines Analyten
in einer Probe mit dem Hilfsmittel detektierbarer, markierter, spezifischer
Bindungspaare, verwendet werden. In einer Ausführungsform eines solchen Assay-Verfahrens
wird entweder Verbindung I oder Verbindung III als Markierungsverbindung
bereitgestellt. Die Markierungsverbindung enthält einen Substituenten, der
eine reaktive Markierungsgruppe trägt, wobei die reaktive Gruppe
fähig ist,
eine kovalente Bindung zu einem Element eines spezifischen Bindungspaares
zu bilden, um ein detektierbares, markiertes, spezifisches Bindungspaarelement
zu bilden. Das Assay-Verfahren
umfasst außerdem
das Umsetzen des markierten, spezifischen Bindungspaarelementes
und seines Partners zur Detektion des Analyten, um ein markiertes,
spezifisches Bindungspaar zu bilden und das markierte spezifische
Bindungspaar, je nach dem wie benötigt, mit entweder Verbindung
I oder Verbindung III umzusetzen, um Chemolumineszenz zur Detektion
des Analyten zu erzeugen. Vorzugsweise wird das heterozyklische
Enolphosphat als Markierung bereitgestellt. In einer anderen Ausführungsform
eines Assay-Verfahrens wird entweder Verbindung I oder Verbindung
III als detektierbare Form, eingeschlossen in ein Liposom, welches
an ein spezifisches Bindungspaarelement konjugiert ist, bereitgestellt.
Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die detektierbare Formen enthalten
und ihre Verwendung als detektierbare Markierungen in chemolumineszenten
Assays werden im U.S.-Patent Nr. 5,595,875 beschrieben.
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In
einer anderen Ausführungsform
eines Assayverfahrens werden sowohl Verbindung I als auch Verbindung
III, jeweils eingeschlossen in separate Latex-Teilchen, an denen
komplementäre,
spezifische Bindungspaarelemente befestigt sind, bereitgestellt.
Verfahren zur Herstellung von Latex-Teilchen, die detektierbare
Formen enthalten und ihre Verwendung als detektierbare Markierungen
in chemolumineszenten Assays, werden im U.S.-Patent Nr. 5,578, 498
beschrieben.
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Wenn
Chemolumineszenz in einem Assayverfahren gemessen wird, kann die
Messung das Messen der Lichtintensität zu einem festen Zeitpunkt
relativ zum Ereignis in dem Assayverfahren, oder das Messen in einer
Serie von Zeitpunkten oder das Messen der maximalen, unmittelbaren
Intensität
oder das Messen der Gesamtmenge des Lichts oder des Zeitraums, bis
eine spezifizierte Lichtintensität
erreicht ist, umfassen.
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Bei
der Durchführung
der erfindungsgemäßen Verfahren
wird Sauerstoff typischerweise gelöst in einer Lösung aus
Reaktionspartnern in Gleichgewicht mit der Atmosphäre bereitgestellt.
Die Atmosphäre über der Lösung kann
mit Sauerstoff angereichert oder durch Sauerstoff ersetzt werden,
um die Konzentration gelösten Sauerstoffs
zu erhöhen.
Die Lösung
kann auch in ein geschlossenes Gefäß gebracht werden, welches
unter Druck gesetzt werden kann, und der Gasraum in dem Gefäß kann mit
Sauerstoff unter Druck gesetzt werden. Andere Arten der Sauerstoffbereitstellung,
zum Beispiel Durchblasen von Luft oder Sauerstoff, oder Sauerstofferzeugung
durch chemische Reaktionen, werden als in den Schutzumfang der hier
beschriebenen und beanspruchten Verfahren fallend erachtet.
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In
einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Reagenzzusammensetzungen
zur Herstellung von Chemolumineszenz, die einen wässrigen
Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 7–10,5, eine Verbindung der
Formel I in einer Konzentration von 0,001–20 mM und eine Verbindung
der Formel III in einer Konzentration von 0,001–20 mM umfassen. Vorzugsweise
liegt der pH-Wert im Bereich von 8–10 und weiter bevorzugt liegt
der pH-Wert im Bereich von 9–10.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfassst die Zusammensetzung zusätzlich
ein anionisches, grenzflächenaktives
Mittel in einer bevorzugten Konzentration zwischen 0,001 und 5 mg/ml
in der endgültigen Reaktionslösung, weiter
bevorzugt zwischen 0,01 und 2,5 mg/ml.
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Eine
bevorzugte Reagenzzusammensetzung zur Herstellung von Chemolumineszenz
umfasst einen wässrigen
Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 8–10, eine dihydroxyaromatische
Verbindung der Formel I in einer Konzentration von ungefähr 0,05–5 mM, ein
Acridanphosphat der Formel IIIc in einer Konzentration von ungefähr 0,05–5 mM und
gegebenenfalls, ein anionisches, grenzflächenaktives Mittel in einer
Konzentration von vorzugsweise zwischen 0,01 und 2,5 mg/ml. In einer
weiter bevorzugten Zusammensetzung wird die dihydroxyaromatische
Verbindung der Formel I aus Hydrochinon, 2-Chlorhydrochinon, 2-Phenylhydrochinon und
2,3,5,6-Tetrafluorhydrochinon ausgewählt.
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Chemolumineszente
Detektion von Hydrolasen
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Die
erfindungsgemäße chemolumineszente
Reaktion kann als Basis für
eine enzymatische chemolumineszente Reaktion dienen, wobei eine
dihydroxyaromatische Verbindung durch die Reaktion einer Hydrolase
mit einer geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung, in der eine der Hydroxylgruppen
mit einer Enzym-spaltbaren Gruppe geschützt ist, um die Enzym-spaltbare
Gruppe zu entfer nen, hergestellt wird. Die dihydroxyaromatische
Verbindung durchläuft
in Anwesenheit von Sauerstoff eine Reaktion mit einer heterozyklischen
Enolphosphatverbindung, um Chemolumineszenz zu erzeugen.
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Bevorzugte,
geschützte
dihydroxyaromatische Verbindungen weisen die Formel II auf, wobei
eine der Hydroxylgruppen einer dihydroxyaromatischen Verbindung,
I, mit einer Hydrolase-spaltbaren Gruppe geschützt ist. Geschützte dihydroxyaromatische
Verbindungen, die in diesen Verfahren geeignet sind, umfassen Verbindungen
der Formel II:
wobei eines von R
1 oder R
3 eine OX-Gruppe
ist, wobei X eine Gruppe ist, die durch eine Hydrolase entfernbar ist,
die anderen von R
1 oder R
3 und
R
2, R
4 und R
5 sind jeweils unabhängig aus Wasserstoff, Alkyl-,
Alkoxy-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Amino-, Aminoalkyl-,
Carboxyl- -C(=O)OH, Carboxylester- -C(=O)OR
6,
Formyl- -C(=O)H, Alkylcarboxy- -OC(=O)R
6,
Arylcarboxy- -OC(=O)R
9 und Halogengruppen
ausgewählt,
wobei Paare benachbarter Gruppen, wenn zusammengenommen, einen fünf- oder
sechsgliedrigen, aliphatischen oder aromatischen Ring vervollständigen können, und
wobei R
6 eine niedrigwertige Alkylgruppe
ist, wobei R
7 und R
8 jeweils
H oder eine niedrigwertige Alkylgruppe sind und wobei R
9 eine
Arylringgruppe ist.
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Die
X-Gruppe in den erfindungsgemäßen geschützten dihydroxyaromatischen
Verbindungen, kann jede Gruppe sein, die durch eine Hydrolase gespalten
werden kann. Hydrolasen sind jene Enzyme, die in der Klasse E.C.
3.1 oder 3.2 des Enzymklassifikationssystems klassifiziert sind,
und schließen
allgemein Phosphatase-, Phosphodiesterase-, Nuklease-, Glycosidase-,
Lipase- und Esteraseenzyme ein. Spezifische Beispiele schließen saure
Phosphatase, alkalische Phosphatase, Phosphodiesterase, Phospholipase, β-D-Galactosidase, β-Glucuronidase, β-Glucosidase, Lactase,
Carboxylesterase und Acetylcholinesterase ein. Mögliche O-X-Gruppen schließen jede
chemische Spaltungsgruppe, die unter den verwendeten Bedingungen
stabil ist und durch die Reaktion mit einem Enzym, einschließlich ohne
Einschränkungen
Alkyl- oder Arylcarboxyester-, anorganisches Oxyacidsalz-, Phosphate
und Sulfate, und einschließlich
Sauerstoffpyranosid-, α-
und β-D-Galactosid-, α- und β-Glucuronid-
und α- und β-Glucosidgruppen,
gespalten werden kann, ein. Bevorzugte Hydrolasen sind alkalische
Phosphatase, saure Phosphatase, β-D-Galactosidase, β-Glucuronidase
und β-Glucosidase.
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Die
Bildung der dihydroxyaromatischen Verbindung durch die Reaktion
der Verbindung aus Formel II mit einer Hydrolase, kann in der Anwesenheit
oder Abwesenheit der heterozyklischen Enolphosphatverbindung (III)
durchgeführt
werden, so dass die Bildung von I und die Erzeugung der Chemolumineszenz
gleichzeitig oder nacheinander ablaufen können.
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In
einem Verfahren zur Herstellung von Chemolumineszenz wird die geschützte dihydroxyaromatische Verbindung
mit einer geeigneten Hydrolase in Anwesenheit einer heterozyklischen
Enolphosphatverbindung in einem Puffer umgesetzt. Der pH-Wert wird
bei einem Wert gehalten, der förderlich
für die
Enzymaktivität
und die chemolumineszente Reaktion ist, gewöhnlich zwischen ungefähr pH-Wert
8 und 10 und bevorzugt zwischen ungefähr pH-Wert 9 und 10. Die Durchführung der
Reaktion in dieser Art und Weise ergibt ein kontinuierliches Chemolumineszenz-Signal.
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In
einer alternativen Art der Durchführung der erfindungsgemäßen chemolumineszenten
Reaktionen, wird die geschützte
dihydroxyaromatische Verbindung mit einer Hydrolase in einem Puffer
oder an einer festen Oberfläche
umgesetzt, bei einem ersten pH-Wert vorzugsweise im Bereich 5,0–9,5, für einen
ersten Zeitraum, vorzugsweise im Bereich von wenigen Sekunden bis
mehreren Minuten. Anschließend
wird diese Lösung
oder ein abgemessener Teil davon mit einer zweiten Lösung, die
die heterozyklische Enolphosphatverbindung und optional ein anionisches,
grenzflächenaktives
Mittel enthält,
umgesetzt, und das Licht wird entweder durch Messung der Scheitelpunkt-Intensität oder durch
Integration über
einen festgesetzten Zeitraum oder bis die Lichtemission verschwunden
ist, gemessen. Der pH-Wert der zweiten Lösung sollte ≥ 8 und vorzugsweise
zwischen 9 und 10 betragen, und ist typischerweise eine Pufferlösung.
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Diese
Art der Chemolumineszenz-Erzeugung kann vorteilhaft in Assays sein,
in denen eine große
Probenzahl gleichzeitig bearbeitet wird, zur Messung zu einem späteren Zeitpunkt.
Diese Zweischrittart ist auch geeignet, um Hydrolasen mit einem
Aktivitätsoptimum
bei saurem bis neutralem pH-Wert (5-8) wie β-Galactosidase oder saure Phosphatase
zu messen. Ein optionaler Schritt, der auch in solch eine chemolumineszente Reaktion
oder einen Assay eingefügt
werden kann, ist das Hinzufügen
eines Enzyminhibitors zum Reaktionssystem nach dem ersten Zeitraum,
um alle weiteren Enzymwirkungen zu stoppen.
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Es
wird erwartet, dass die Auswahl zwischen diesen beiden Reaktionsarten
durch verschiedene Faktoren und die bestimmte Verwendung oder Anwendung
bestimmt wird. Nichtsdestotrotz sind beide Arten wirksam. Für Enzyme
mit einem sauren pH-Optimum kann es vorteilhaft sein, die Reaktion
in zwei getrennten Schritten auszuführen, jeden bei einem/r Optimal-pH-Wert,
-Temperatur, -Ionenkonzentration, -Puffersalz, usw.
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Bei
der Herstellung von Chemolumineszenz durch die Reaktion von Verbindung
II mit einer Hydrolase in der Anwesenheit eines heterozyklischen
Enolphosphats, wird die Reaktion allgemein bei einer Temperatur zwischen
5 °C und
50 °C, vorzugsweise
zwischen 20 °C
und 40 °C
in einer wässrigen
Pufferlösung
bei einem pH-Wert zwischen 7 und 10,5, vorzugsweise zwischen 8,5
und 10, durchgeführt.
Die Verbindung III wird bei einer Konzentration zwischen 1 μM und 20
mM, vorzugsweise zwischen 50 μM
und 5 mM verwendet. Die Verbindung II wird bei einer Konzentration
zwischen 1 μM
und 20 mM, vorzugsweise zwischen 50 μM und 5 mM verwendet.
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Ein
anionisches, grenzflächenaktives
Mittel kann ebenfalls in der erfindungsgemäßen chemolumineszenten Reaktion
eingesetzt werden. Anionische, grenzflächenaktive Mittel wirken, indem
sie die Hintergrundchemolumineszenz des heterozyklischen Enolphosphats
in Abwesenheit der dihydroxyaromatischen Verbindung verringern.
Wenn sie verwendet werden, werden anionische, grenzflächenaktive
Mittel in einer Menge zwischen 0,01 und 5 mg/ml in der endgültigen Reaktionslösung eingesetzt,
weiter bevorzugt zwischen 0,1 und 2,5 mg/ml. Verstärker von
anionischen, grenzflächenaktiven
Mitteln umfassen Alkylsulfate und Alkylsulfonate. Ausführlichere
Listen exemplarischer Strukturen jeder Kategorie von grenzflächenaktiven
Mitteln können
in jeder Standardabhandlung über
grenzflächenaktive
Mittel gefunden werden. Bevorzugte grenzflächenaktive Mittel sind C10-C20-Alkylsulfate wie Natriumdodecylsulfat,
SDS.
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Eine
wichtige Verwendung der enzymatischen, chemolumineszenten Verfahren
ist die Detektion der Anwesenheit oder der Menge eines Analyten
durch eine chemolumineszente Reaktion in einem Assay-Verfahren.
Das Verfahren umfasst die Schritte des Inkontaktbringens einer Probe,
die voraussichtlich den Analyten enthält, mit einer erfindungsgemäßen chemolumineszenten
Verbindung und einer Hydrolase, die Detektion des hergestellten
Lichts in einem qualitativen Verfahren, und, wenn Quantifizierung
gewünscht
ist, das Inbeziehungsetzen der hergestellten Lichtmenge zur Menge
des Analyten. Die Beziehung zwischen Lichtintensität und Menge
des Analyten kann einfach durch die Erstellung einer Eichkurve mit
bekannten Mengen des Analyten erkannt werden. Die chemolumineszente
Verbindung wird typischerweise in einer Konzentration von ungefähr 10–5 M
bis ungefähr
10–2 M,
vorzugsweise zwischen ungefähr
10–4 M
und ungefähr
10–3 M
verwendet. Die Hydrolase liegt vorzugsweise unter ungefähr 10–9 M,
wenn sie in einer Lösung
detektiert wird.
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Es
gibt verschiedene Kategorien von Analyten, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren
analysiert werden können.
Diese umfassen Hydrolasen, in deren Fall es unnötig wäre, zusätzliche Hydrolase hinzuzufügen. Wenn
die Hydrolase zum Beispiel eine alkalische Phosphatase ist, kann
so eine Bestimmung Verwendung z. B. bei der Messung der Menge an
alkalischer Phosphatase im Blutserum als eine Indikation des Status der
Leberfunktion eines Patienten oder als ein Index bestimmter Erkrankungsbedingungen
finden. Die Messung von sauren Phosphatasen der Prostata ist ebenfalls
als ein klinischer Diagnostikindex für Prostatakrebs geeignet.
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Die
Detektion und Messung von Enzymaktivität durch einen erfindungsgemäßen chemolumineszenten
Assay wird Verwendung in Genexpressionsassays finden. β-Galactosidase, β-Glucuronidase
und alkalische Phosphatase, besonders ein in der Plazenta produziertes
Isozym, welches ausgeschieden wird, sind als Reportergene geeignet
(J. Alam, J. Cook, Anal. Biochem. 188, 245–54 (1990). In diesem Assay-Typ
wird ein für
die Expression eines Reporterenzyms verantwortliches Gen über ein
Plasmid in das genetische Material eines Organismus in die Nähe einer
Promotor- oder Verstärkersequenz
kloniert. Die Wirkung der Promotor- oder Verstärkersequenz auf die Transkriptionsaktivität wird durch
die Messung der hergestellten Reporterenzymmenge gemessen.
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Ein
in diesem Zusammenhang verwendeter Analyt schließt ebenfalls Hydrolaseinhibitoren
ein. Inhibitoren schließen
Verbindungen, die reversibel durch die Konkurrenz mit einem zweiten
Substrat, wie einer geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung wirken, genauso wie jene Inhibitoren,
die irreversibel durch Deaktivierung des Enzyms wirken, ein. Zum
Beispiel schließen
Inhibitoren der alkalischen Phosphatase anorganisches Phosphat,
Levamisol, Tetramisol und andere Imidazo[1,2-b]thiazole, L-Phenylalanin
und L-Homoarginin ein und sind in R.B. McComb, G.N. Bowers, S. Posen
in Alkaline Phosphatase, Plenum Press, New York 1979, Seiten 268–275, 332–334, 394–397, 410–413 beschrieben.
Inhibitoren anderer Hydrolasen sind dem Fachmann von Enzymassays
allgemein bekannt. Wenn zur Detektion eines Enzyminhibitors die
erfindungsgemäße chemolumineszente
Reaktion verwendet wird, wird die geeignete Hydrolase mit einer
Verbindung der Formel II umgesetzt, um eine dihydroxyaromatische
Verbindung I zu bilden, die mit einem heterozyklischen Enolphosphat
III in der Anwesenheit und Abwesenheit der Inhibitorsubstanz umgesetzt
wird, und die Ergebnisse werden verglichen, um die Anwesenheit oder
die Menge der Inhibitorsubstanz zu bestimmen. Die Differenz der
emittierten Chemolumineszenz weist auf die Anwesenheit des Inhibitors
hin.
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Ein
in diesem Zusammenhang verwendeter Analyt schließt weiterhin verschiedene Klassen
von organischen und biologischen Molekülen, die mit einer Hydrolase
markiert werden können,
oder die spezifisch mit Enzym-markierten spezifischen Bindungspartnern
detektiert werden können,
ein. Das Enzym kann direkt als Markierung an der Analyten-Bindungsverbindung
eingefügt
werden. Alternativ kann die Analyten-Bindungsverbindung an mindestens
eine Enzym-markierte, spezifische Bindungssubstanz für die Analyten-Bindungsverbindung
gebunden werden. Exemplarisch für
dieses Format würde
ein Nukleinsäure-Hybridisationsassay sein,
der ein Enzym-markiertes Detektions-Oligonukleotid verwendet. Alternativ
kann die Analyten-Bindungsverbindung mit mindestens einer zweiten
spezifischen Bindungssubstanz markiert werden, z. B. Biotin, welches
dann an einen Enzymmarkierten Bindungspartner für die zweite spezifische Bindungssubstanz,
z. B. Avidin, gebunden wird.
-
Biologische
Moleküle,
die mit einem oder mehreren Hydrolase-Molekülen konjugiert werden können, schließen DNA,
RNA, Oligonukleotide, Antikörper,
Antikörperfragmente,
Antikörper-DNA-Chimäre, Antigene, Haptene,
Proteine, Lectine, Avidin, Streptavidin und Biotin ein. Komplexe,
die Hydrolasen einschließen
oder enthalten, wie Liposomen, Micellen, Vesikel und Polymere, die
zur Anheftung biologischer Moleküle
funktionalisiert sind, können
ebenfalls in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden.
-
Techniken
zur Durchführung
von Enzymassays sind gut bekannt. Mit der hier gelehrten, durch
die Beispiele bereitgestellten Anleitung, wird es für den Fachmann
im Rahmen der Fähigkeiten
liegen, als eine Angelegenheit des routinemäßigen Experimentierens, Variationen
der Herstellungsverfahren von Proben, die Bestimmung geeigneter
Mengen und Anteile von Reagenzien und Reaktionszeiten und die Erstellung
von Eichkurven zu entwickeln.
-
Da
die Reaktion durch die Hydrolase katalysiert wird, sind äußerst kleine
Enzymmengen ausreichend, um eine detektierbare Lichtmenge herzustellen.
Sensitivitäten
von < 1 amol (1 × 10–18 mol)
wurden erreicht. Die Fähigkeit,
solche kleinen Mengen Hydrolase zu detektieren, macht die vorliegende
chemolumineszente Technologie, durch Verwendung Enzym-gekoppelter
Assays, geeignet für
Analysen von vielen Analytentypen. Solche Analysen und Assays erfordern
aufgrund geringen Vorkommens des Analyten in der Probe, die zu analysieren
ist, oder aufgrund der begrenzten Probenmenge die Fähigkeit,
kleine Mengen Hydrolase zu detektieren. In diesem Assaytyp wird
alkalische Phosphatase an ein Element eines spezifischen Bindungspaares
konjugiert. Ein Beispiel sind chemolumineszente, Enzym-gekoppelte
Immunassays, wie der so genannte Enzym-gekoppelte Immunadsorptionsassay
oder ELISA. Solche Assays werden üblicherweise sowohl bei manueller
Anwendung, als auch in automatisierten Multitest-Immunassay-Systemen verwendet. In einem
typischen Immunassay wird der Hapten-, Antigen- oder Antikörperanalyt
durch die Detektion der Anwesenheit oder der Menge eines Enzym-markierten,
spezifischen Bindungspartners des Analyten oder eines Enzym-markierten Analogen
des Analyten analysiert. Verschiedene Assayformate und die Protokolle
zur Durchführung
der immunchemischen Schritte sind im Stand der Technik gut bekannt.
Diese Assays fallen allgemein in zwei Kategorien. Kompetitive Assays
weisen eine immunologische Bindung eines spezifischen Antikörpers mit
dem Analyten und einem Analytenanalogen, z. B. einem detektierbaren,
markierten Analytenmolekül
auf. Sandwichassays ergeben sich aus der sequenziellen oder simultanen
Bindung zweier Antikörper
mit dem Analyten, wobei einer davon detektierbar markiert ist. Das
so gebildete, detektierbare, Enzym-markierte Bindungspaar kann mit
den erfindungsgemäßen Verbindungen
und Verfahren analysiert werden. Die Messung kann mit Enzym-markierten
Formen durchgeführt
werden, die auf eine feste Oberfläche oder auf einen Träger, der
Perlen bzw. Kügelchen,
Röhren,
Mikrovertiefungen, magnetische Teilchen, Teststreifen, Membranen
und Filter einschließt,
aufgebracht wurden, wie sie im Stand der Technik allgemein verwendet
werden. Die detektierbaren, Enzymmarkierten Formen können auch
frei in Lösung
oder eingeschlossen in einer organisierten Anordnung, wie einem
Liposom, in dessen Fall ein lytisches Agens zur Lyse des Liposoms
und zur Freisetzung des detektierbaren Enzyms verwendet wird, vorliegen.
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Eine
andere exemplarische Verwendung ist die Detektion von Proteinen
mit der Technik des Western Blottens. Eine Probe, die ein Protein
von Interesse als Analyt enthält,
ist Gegenstand elektrophoretischer Trennung. Die getrennten Proteine werden
durch Kapillarwirkung oder mit Hilfe eines elektrischen Feldes auf
die Blot-Membran übertragen.
So transferiertes Protein wird typischerweise mit einem spezifischen
primären
Antikörper
und einem Enzym-markierten sekundären Antikörper, der den primären Antikörper erkennt
und an ihn bindet, detektiert.
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Die
Sichtbarmachung der Markerenzym-Aktivität spiegelt die Anwesenheit
des Analyten-Proteins wider. Um die erfindungsgemäßen Verfahren
an das Western Blotten anzupassen, kann ein sekundärer Antikörper, der
an eine Hydrolase, wie eine alkalische Phoshatase oder β-Galactosidase
konjugiert ist, sowie die Messung der Enzymaktivität mit Chemolumineszenz
unter Verwendung einer Verbindung der Formel II als Enzymsubstrat
und einer Verbindung der Formel III als chemolumineszentes Reagenz,
eingesetzt werden. Variationen dieser Technik, wie die Verwendung
von biotinylierten Antikörpern
und Avidin-Enzym-Konjugaten, werden als innerhalb des Schutzumfangs
der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
durchführbaren
Assays liegend erachtet.
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Zusätzlich zu
den vorher genannten Antigen-Antikörper-, Hapten-Antikörper- oder
Antikörper-Antikörperpaaren,
können
spezifische Bindungspaare auch komplementäre Oligonukleotide oder Polynukleotide,
Avidin-Biotin, Streptavidin-Biotin, Hormon-Rezeptor, Lectin-Kohlenhydrat,
IgG-Protein A, Nukleinsäure-Nukleinsäuren-Bindungsprotein
und Nukleinsäure-Anti-Nukleinsäuren-Antikörper einschließen.
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Eine
besonders geeignete Anwendung der erfindungsgemäßen Detektionsverfahren ist
die Detektion von Nukleinsäuren
durch die Verwendung von Enzymmarkierten Nukleinsäuresonden.
Verfahren zur Analyse und chemolumineszenten Detektion von Nukleinsäuren unter
Verwendung von Enzym-Markierungen, zum Beispiel Lösungshybridisations-Assays,
DNA-Detektion durch Southern Blotten, RNA durch Northern Blotten, DNA-Sequenzierung,
DNA-Fingerprinting, Kolonie hybridisierungen und Plaque-Lifts sind
alles gut bewährte Techniken.
Die Enzym-Markierung
(z. B. AP oder β-gal)
kann als direktes Konjugat mit einem Sonden-Oligonukleotid oder Fänger-Oligonukleotid
vorliegen, oder sie kann über
indirekte Kopplungshilfsmittel, unter Verwendung von Verfahren des
Standes der Technik, eingebracht werden. Beispiele indirekter Kopplungshilfsmittel
schließen
die Verwendung von Hapten-markierten Oligonukleotiden und Antihapten-Enzymkonjugaten oder biotinylierten
Oligonukleotiden oder Avidin-Enzymkonjugaten
ein. Solche Nukleinsäureassays
können
auf einer Blot-Membran
oder in Lösung
durchgeführt
werden, unter Verwendung von Oligonukleotiden, die auf feste Oberflächen, einschließlich Perlen,
Röhren,
Mikrovertiefungen, magnetische Teilchen und Teststreifen, wie sie im
Stand der Technik bekannt sind, aufgebracht wurden.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Reagenzzusammensetzung
zur Herstellung von Chemolumineszenz durch die Reaktion mit einer
Hydrolase, die eine geschützte
dihydroxyaromatische Verbindung der Formel II umfasst, um die dihydroxyaromatische
Verbindung der Formel I herzustellen, die in der Anwesenheit einer
Verbindung der Formel III und Sauerstoff Chemolumineszenz herstellt.
Die Reagenzzusammensetzung umfasst einen wässrigen Puffer mit einem pH-Wert
im Bereich 7–10,5,
eine Verbindung der Formel II in einer Konzentration von 0,001–20 mM und
eine Verbindung der Formel III in einer Konzentration von 0,001–20 mM.
Formulierungen für
chemolumineszente Reaktionen mit einer Hydrolase können außerdem ein
Metallsalz wie ein Magnesium oder Zink in einer Konzentration von
0,01–10
mM umfassen, um die Enzymaktivität
zu verstärken
oder zu unterstützen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die Zusammensetzung zusätzlich
ein grenzflächenaktives
Mittel in einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 0,01 und
5 mg/ml in der endgültigen
Reaktionslösung,
weiter bevorzugt zwischen 0,1 und 2,5 mg/ml.
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Eine
bevorzugte Reagenzzusammensetzung zur Herstellung von Chemolumineszenz
in einem Einschrittverfahren durch die Reaktion mit einer Hydrolase
umfasst einen wässrigen
Puffer mit einem pH-Wert im Bereich von 8-10, eine geschützte dihydroxyaromatische
Verbindung der Formel II in einer Konzentration von ungefähr 0,05–5 mM, ein
Acridanphosphat der Formel IIIc in einer Konzentration von ungefähr 0,05–5 mM und gegebenenfalls,
ein anionisches, grenzflächenaktives
Mittel in einer Konzentration von vorzugsweise zwischen 0,1 und
2,5 mg/ml. In einer weiter bevorzugten Zusammensetzung weist die
geschützte
dihydroxyaromatische Verbindung der Formel II die Formel
auf, wobei X die Gruppe ist,
die durch die Hydrolase entfernbar ist.
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Um
die verschiedenen erfindungsgemäßen Aspekte
ausführlicher
zu beschreiben, werden die folgenden Beispiele, die Verbindungen,
Verfahren zur Herstellung, Zusammensetzungen und verwendete Verfahren beschreiben,
aufgeführt.
Die Beispiele werden als darstellend angesehen und beschränken den
Schutzumfang der Erfindung nicht.
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BEISPIELE
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1.
Synthese des Acridan-Derivats 1.
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a. Phenylacridin-9-carboxylat.
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Acridin-9-carboxylsäure (1 g,
4,1 mmol) wurde in Thionylchlorid suspendiert (5 ml), und das Reaktionsgemisch
wurde 3 h unter Rückflusskühlung erhitzt.
Nach Entfernung des Lösungsmittels
unter reduziertem Druck blieb ein gelber Feststoff zurück, der
unter Argon in CH2Cl2 und
Pyridin (350 μl)
gelöst
wurde. Diese Lösung
wurde in einem Eisbad gekühlt,
und eine Lösung
aus Phenol (0,78 g, 8,2 mmol) in CH2Cl2 wurde tropfenweise hinzugefügt. Das
Reaktionsgemisch wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Nach der Verdampfung des Lösungsmittels
wurde der Rest in Ethylacetat wieder gelöst und mit Wasser gewaschen.
Die organische Schicht wurde über
MgSO4 getrocknet und konzentriert, um ein
Rohmaterial zu erhalten, das mit einem Kieselsäuregel (30 % Ethylacetat/Hexan)
chromatographiert wurde, um das reine Produkt als gelben Feststoff zu
erhalten. 1H NMR (CDCl3) δ 7,35-7,57
(m, 5H), 7,63-8,37 (m, 8H).
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b. Phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylattrifluormethansulfonat.
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Phenylacridin-9-carboxylat
(530 mg, 1,7 mmol) wurde unter Argon in CH2Cl2 (5 ml) gelöst, und Methyltrifluormethansulfonat
(1 ml, 8,8 mmol) wurde hinzugefügt.
Die Lösung
wurde über
Nacht bei Raumtemperatur gerührt,
um einen dicken, gelben Niederschlag zu erhalten. Dieser Niederschlag
wurde gefiltert, mit Ether gewaschen und getrocknet, um das Produkt
in Form gelber Kristalle zu erhalten. 1H
NMR (Aceton- d6) δ 5,22
(s, 3H), 7,47-7,71 (m, 5H), 8,23-9,07 (m, 8H).
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c. Phenyl-10-methylacridan-9-carboxylat.
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Phenyl-10-methylacridinium-9-carboxylat-trifluormethansulfonat
(10 mg, 0,0216 mmol) wurde in absolutem Ethanol (10 ml) suspendiert,
und das Gemisch wurde für
15 min unter Rückflusskühlung erhitzt,
um eine klare Lösung
zu erhalten. Ammoniumchlorid (88 mg, 1,6 mmol) wurde portionsweise
zur Lösung
hinzugefügt, gefolgt
von Zink (108 mg, 1,6 mmol). Das Hinzugeben von Zink bewirkte ein
sofortiges Verschwinden der gelben Farbe der Lösung. Die farblose Lösung wurde
für 2 h
unter Rückflusskühlung erhitzt.
Eine TLC des Reaktionsgemisches zeigte eine vollständige Konversion
in ein nicht-polares Material. Die Lösung wurde gefiltert, und der
Niederschlag wurde mit Ethanol (3 × 20 ml) gewaschen. Das Filtrat
wurde konzentriert, um einen cremefarbenen Feststoff zu erhalten,
der in CH2Cl2 wieder
gelöst
und mit Wasser gewaschen wurde (2 × 15 ml). Die organische Schicht
wurde über
Na2SO4 getrocknet
und konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten, welches durch präparative
TLC unter Verwendung von (30 % Ethylacetat:Hexan) gereinigt wurde.
Das reine Produkt wurde als cremefarbener Feststoff erhalten. 1H NMR (CDCl3) δ 3,38 (s,
3H), 5,16 (s, 1H), 6,89-7,37 (m, 13H); 13C
NMR (CDCl3) δ 33,29, 49,72, 112,93, 120,19,
121,36, 125,73, 128,67, 129,16, 129,26, 142,37, 151,04, 170,22.
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d. 9-(Phenoxyphosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan,
Bis(cyanoethyl)ester.
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Ein
dreihalsiger Kolben wurde mit Argon durchspült und mit 5 ml wasserfreiem
THF und Diisopropylamin (0,04 ml, 0,29 mmol) beladen. Der Kolben
wurde in einem Trockeneis-Aceton-Bad gekühlt. Zu dieser Lösung wurde
n-Butyllithium (0,116 ml, 0,29 mmol) hinzugefügt. Nach 20 min wurde zu dieser
Lösung
eine Lösung
des Acridanesters aus Schritt (c) (70 mg, 0,22 mmol) in 5 ml THF
hinzugefügt
und für
30 min bei –78 °C weitergerührt. Schließlich wurde
eine Lösung
aus POCl3 (0,027 ml, 0,29 mmol) und Pyridin
(0,023 ml, 0,29 mmol) in 3 ml THF hinzugefügt, und das Trockeneisbad wurde
entfernt. Nach 45 min wurden Pyridin (0,039 ml, 0,58 mmol) und 3-Hydroxypropionitril
(0,094 ml, 1,16 mmol) hinzugefügt
und über
Nacht gerührt.
Anschließend wurde es gefiltert, und das Lösungsmittel
wurde aus dem Filtrat entfernt. Der Rest wurde einer präparativen
TLC (80 % Ethylacetat/Hexan) unterzogen, um das reine Produkt zu
erhalten; 1H NMR (CDCl3) δ 2,35-2,54
(m, 4H), 3,47 (s, 3H), 3,79-3,90 (m, 2H), 3,98-4,08 (m, 2H), 6,825-7,45
(m, 12H), 7,80-7,83 (dd, 1H); 13C NMR (CDCl3) δ 19,12,
19,24, 33,63, 62,19, 62,49, 88,72, 92,82, 112,40, 112,52, 115,83,
116,07, 119,68, 120,44, 120,71, 123,81, 126,69, 128,03, 128,27,
128,58, 130,09, 142,39, 143,06, 165,73, 202,09.
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e. 9-(Phenoxyphosphoryloxymethyliden)-10-methyl-acridan,
Dinatriumsalz (1).
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Eine
Lösung
der Bis(cyanoethyl)phosphat-Verbindung (2,897 g, 5,77 mmol) in 50
ml Aceton wurde mit Ar für
30 min durchspült.
Eine Ar-durchspülte
Lösung
aus 479 mg (12 mmol) NaOH in 7,5 ml Wasser wurde tropfenweise hinzugefügt, und
die Lösung
wurde über
Nacht gerührt.
Der gebildete Niederschlag wurde gefiltert, mit 50 ml Ar-durchspültem Aceton
gewaschen und luftgetrocknet. Die Ausbeute betrug 3,473 g 1 als
ein weißer
Feststoff, der etwas Wasser enthielt. 1H
NMR (D2O) δ 3,326 (s, 3H), 6,825-7,45 (m,
13H), 7,80-7,83 (d, 1H); 13C NMR (D2O) δ 32,95,
102,86, 102,92, 112,30, 115,85, 120,68, 121,01, 122,35, 122,41,
122,62, 127,48, 127,66, 128,23, 129,66, 143,17, 143,32, 144,66,
156,01; 31P NMR (D2O) δ 0,581 (rel.
zu ext. H3PO4).
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2.
Synthese des Acridan-Derivats 2.
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a. 9-(Phenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methyl-acridan,
Bis(cyanoethyl)ester.
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Wie
in der PCT-Anmeldung WO 95/28495 des Anmelders beschrieben hergestelltes
Phenyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat (70, mg, 0,2 mmol) wurde
zu einer Lösung
aus LDA (0,24 mmol) in THF hinzugefügt. Nach 30 min Rühren bei –78 °C wurde eine
Lösung
aus POCl3 (25 μl) und Pyridin (21 μl) in 4 ml
THF hinzugefügt.
Das Trockeneisbad wurde entfernt und das Rühren für 30 min fortgesetzt. Die TLC
(30 % Ethylacetat/Hexan) zeigte, dass das Ausgangsmaterial vollständig umgesetzt
war. Die Lösung
wurde in einem Eisbad gekühlt
und mit Pyridin (210 μl)
und 3-Hydroxypropionitril (44 μl)
in 4 ml THF behandelt. Nach dem über Nacht
Rühren
bei Raumtemperatur wurde das ausgefallene Pyridin-HCL abgefiltert,
und das Reaktionslösungsmittel
wurde im Vakuum verdampft. Der Rest wurde einer präparativen
TLC (Ethylacetat) unterzogen, aus der das Produkt isoliert wurde; 1H NMR (CDCl3) δ 2,4-2,6
(m, 4H), 3,521 (s, 3H), 3,8-4 (m, 2H), 4,0-4,1 (m, 2H), 6,9-7,2 (m, 4H), 7,22-7,5
(m, 7H), 7,75-8 (dd, 2H).
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b. 9-(Phenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methyl-acridan,
Dinatriumsalz (5)
-
Eine
Lösung
der Bis(cyanoethyl)phosphat-Verbindung (0,59 g, 1,21 mmol) in 50
ml Aceton wurde für 30
min mit Argon durchspült.
Eine Ar-durchspülte
Lösung
aus 104 mg (2,6 mmol) NaOH in 10 ml Wasser wurde tropfenweise hinzugefügt, und
die Lösung
wurde über
Nacht unter Argon gerührt.
Der gebildete Niederschlag wurde mit Unterdruck gefiltert, mit 50
ml Ar-durchspültem
Aceton gewaschen und luftgetrocknet. Die Ausbeute betrug 0,50 g
5 als ein leicht gelber Niederschlag, der eine geringe Menge Aceton
enthielt. 1H NMR (D2O) δ 3,36 (s,
3H), 6,9-7,4 (m, 11H), 7,75-7,8 (d, 1H), 8,2-8,22 (d, 1H); 31P NMR (D2O) δ 1,85.
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Beispiel
3. Synthese des Acridan-Derivats 3.
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a. 4'-Chlorphenylacridin-9-thiocarboxylat.
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4-Chlorthiophenol
(4,75 g) und 7,2 g Acridin-9-carbonylchlorid wurden in 100 ml CH2Cl2, gefolgt von 12,1
ml Pyridin, gelöst.
Das Reaktionsgemisch wurde orange-braun. Das Gemisch wurde unter
Argon über Nacht
bei Raumtemperatur gerührt.
Nach Verdampfung des Lösungsmittels
wurden die Feststoffe mit 100 ml Hexan gewaschen, gefiltert, mit
weiteren 100 ml Hexan gewaschen, gefiltert, und anschließend mit
500 ml Wasser gefiltert und luftgetrocknet. Der Thioester (8,71
g) wurde als leicht bräunlich-gelber
Feststoff erhalten. 1H NMR (CDCl3) δ 7,47-7,50
(m, 2H), 7,58-7,67 (m, 4H), 7,81-7,86
(m, 2H), 8,12 (d, 2H), 8,29 (d, 2H).
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b. 4'-Chlorphenylacridan-9-thiocarboxylat.
-
4'-Chlorphenylacridin-9-thiocarboxylat
(2,0 g) wurde in CH2Cl2 (25
ml) gelöst.
Die Lösung
wurde mit Argon durchspült,
und anschließend
wurden 3,72 g Zinkpulver, gefolgt von 0,45 ml Essigsäure hinzugefügt. Die
TLC zeigte, dass das Ausgangsmaterial in 20 min verbraucht war.
Das Gemisch wurde gefiltert, und die Feststoffe wurden mit CH2Cl2 gewaschen. Die
kombinierten CH2Cl2-Lösungen wurden
mit Wasser gewaschen (3 × 50
ml) und getrocknet. Eine kleine Menge des Produktes wurde mit einer
präparativen
TLC zur analytischen Charakterisierung aufgereinigt. Das übrige Produkt
wurde ohne weitere Aufreinigung verwendet. 1H NMR
(CDCl3) δ 5,22
(s, 1H), 6,28 (s, 1H), 6,79-7,31 (m, 12H).
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c. 4'-Chlorphenol-10-methylacridan-9-thiocarboxylat.
-
4'-Chlorphenylacridan-9-thiocarboxylat
(2,0 g) wurde unter Argon in CH2Cl2 (30 ml) gelöst, und Methyltriflat (6,5
g) wurde hinzugefügt
und über
Nacht gerührt.
Die braune Lösung
wurde verdampft und das Rohmaterial über eine Säulenchromatographie unter Verwendung
von 30 % Ethylacetat/Hexan aufgereinigt. Dadurch wurde das reine
Produkt (1,8 g) erhalten. 1H NMR (CDCl3) δ 3,47
(s, 3H), 5,09 (s, 1H), 7,02-7,39 (m, 12H).
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d. 9-(4-Chlorphenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan,
Bis(cyanoethyl)ester.
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4-Chlorphenyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat
(0,70 g) in 10 ml wasserfreiem THF wurden tropfenweise zu einer
Lösung
aus LDA (1,4 äq.)
in THF bei –78 °C hinzugefügt. Nach
60 min Rühren
bei –78 °C wurde die
gelbe Lösung
mit einer Lösung
aus POCl3 (0,517 g) und Pyridin (1,52 ml)
in 4 ml THF langsam behandelt. Das Trockeneisbad wurde nach 30 min
entfernt und das Rühren
für 1 h
fortgesetzt. Die Lösung
wurde gelb und bildete einen Niederschlag.
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Das
Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und mit 3-Hydroxypropionitril
(0,89 g) und 1,0 ml Pyridin behandelt. Nach vollständiger Zugabe
wurde das Eisbad entfernt. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur
wurde das ausgefallene Pyridin-HCl abgefiltert und mit THF gewaschen.
Die vereinigten Filtrate wurden in einem Vakuum verdampft, und das
erhaltene braune Material wurde in Ethylacetat gelöst und mit
4 × 25
ml Wasser gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde ge trocknet und konzentriert.
Der Rest, aus dem die 0,325 g des Produkts isoliert wurden, wurde über eine
Säulenchromatographie
unter Verwendung von 80–100
% Ethylacetat/Hexan getrennt; 1H NMR (CDCl3) δ 2,48-2,64
(m, 4H), 3,53 (s, 3H), 3,86-4,16 (m, 4H), 6,94-7,94 (m, 12H), 31P NMR (D2O) δ – 9,48 (p).
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e. 9-(4-Chlorphenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan,
Dinatriumsalz (3).
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Eine
Lösung
der Bis(cyanoethyl)phosphat-Verbindung (0,325 g) in 10 ml Aceton
wurde mit Argon durchspült.
Eine 2,5 M NaOH-Lösung
(473 μl)
wurde hinzugefügt,
gefolgt von weiteren 500 μl
Wasser. Die Lösung
wurde unter Argon über
Nacht gerührt.
Der Niederschlag, der sich gebildet hatte, wurde mit Unterdruck gefiltert
und luftgetrocknet. Es wurde gefunden, dass die Stammlauge die mono(cyanoethyl)-geschützte Verbindung
(140 mg) enthielt. Ein zweiter Ertrag des Dinatriumsalzes wurde
durch die Wiederholung der NaOH-Entschützung erhalten. 1H
NMR (D2O) δ 3,35 (s, 3H), 6,92-7,36 (m,
10H), 7,78 (d, 1H), 8,20 (d, 1H); 31P NMR
(D2O) δ 1,22
(s).
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Beispiel
4. Synthese des Acridan-Derivats 4.
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a. Naphthylacridin-9-thiocarboxylat.
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2-Naphthalinthiol
(48,81 g) und das Acridin-9-carbonylchlorid, das aus 65,17 g Acridin-9-carboxylsäure hergestellt
wurde, wurden in 100 ml CH2Cl2 gelöst, gefolgt
von der Zugabe von 120 ml Pyridin. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur
unter Argon über
Nacht gerührt.
Nach Verdampfung des Lösungsmittels
wurden die Feststoffe mit 500 ml Hexanen gewaschen, gefiltert, mit
weiteren 500 ml Hexanen gewaschen, gefiltert, und anschließend mit
600 ml Wasser gewaschen, gefiltert und über Nacht luftgetrocknet. Der
Thioester wurde in 1500 ml CH2Cl2 gelöst, über Natriumsulfat
getrocknet, gefiltert und in einem Vakuum getrocknet. Der Thioester
wurde in Form eines braunen Feststoffes erhalten (94,67 g). 1H NMR (CDCl3) δ 7,54-8,00
(m, 11H), 8,17-8,31 (m, 4H).
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b. Naphthyl-10-methylacridinium-9-thiocarboxylattriflat.
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Naphthylacridin-9-thiocarboxylat
(26,38 g) wurde in CH2Cl2 (200
ml) suspendiert. Methyltrifluormethansulfonat (24,5 ml) wurde hinzugefügt, und
das Gemisch wurde über
Nacht gerührt.
Das Gemisch wurde gefiltert, und die Feststoffe wurden mit CH2Cl2 (300 ml) und
Hexanen (500 ml) gewaschen. Nach Lufttrocknung wurde das Produkt
(28,83 g) in Form eines gelben Feststoffes erhalten. 1H
NMR (Aceton-d6) δ 5,20 (s, 3H), 7,66-7,75 (m, 2H), 7,88-7,92
(m, 1H), 8,03-8,09 (m, 2H), 8,15 (d, 1H), 8,26 (t, 2H), 8,48 (s,
1H), 8,61-8,68 (m, 2H), 8,80 (d, 2H), 9,03 (d, 2H).
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c. Naphthyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat.
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Naphthyl-10-methylacridinium-9-thiocarboxylattriflat
(65,50 g) wurde in CH2Cl2 (1000
ml) unter Argon suspendiert, und Eisessig (21,2 ml) und Zink (40,43
g) wurden hinzugefügt.
Nach Rühren über Nacht
zeigte die TLC das Verschwinden des Ausgangsmaterials und die Bildung
eines neuen Produkts. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Kieselsäuregelbett
gefiltert, und das CH2Cl2 wurde
in einem Vakuum entfernt. Der so erhaltene, leicht gelbe Feststoff
wurde in Isopropanol (500 ml) eingerührt, gefiltert, mit weiteren
500 ml Isopropanol gewaschen und zum Lufttrocknen stehengelassen.
Dadurch wurde das reine Produkt erhalten (46,36 g). 1H
NMR (CDCl3) δ 3,47 (s, 3H), 5,13 (s, 1H),
7,00-7,06 (m, 4H), 7,25-7,49 (m, 7H), 7,70-7,79 (m, 4H).
-
d. 9-(Naphthylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan,
Bis(cyanoethyl)ester.
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Naphthyl-10-methylacridan-9-thiocarboxylat
(17,32 g) in 600 ml wasserfreiem THF wurde tropfenweise zu einer
Lösung
aus LDA (1,25 äq.)
in THF bei –78 °C hinzugegeben.
Nach 90 min Rühren
bei –78 °C wurde die
orange-braune Lösung mit
einer Lösung
aus POCl3 (20,80 g) und Pyridin (50 ml)
in 150 ml THF langsam behandelt. Das Trockeneisbad wurde nach 60
min entfernt und das Rühren
für 1 h
fortgesetzt. Die Lösung. wurde
braun und bildete einen Niederschlag.
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Das
Gemisch wurde mit 3-Hydroxypropionitril (27,8 ml) behandelt. Nach
Rühren über Nacht
bei Raumtemperatur wurde das ausgefallene Pyridin-HCl abgefiltert
und mit THF gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden in einem
Vakuum verdampft, und das erhaltene, braune Öl wurde über eine Säulenchromatographie unter Verwendung
von 50–100
% Ethylacetat/Hexane getrennt, wovon das Produkt isoliert wurde.
Das gelbe Öl
wurde in CH2Cl2 (300
ml) gelöst,
mit Wasser (450 ml) gewaschen, über
Natriumsulfat getrocknet, gefiltert und in einem Vakuum getrocknet.
Dies ergab das Produkt (17,76 g) in Form eines gelben Feststoffes. 1H NMR (CDCl3) δ 2,33-2,53
(m, 4H), 3,53 (s, 3H), 3,82-4,06 (m, 4H), 6,93 (t, 1H), 7,03 (d,
1H), 7,10-7,18 (m, 2H), 7,25-7,55 (m, 5H), 7,79-7,92 (m, 5H), 8,02
(d, 1H); 31P NMR (CDCl3) δ -9,69(p)
(rel. zu ext. H3PO4).
-
e. 9-(Naphthylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan,
Dinatriumsalz (4).
-
Eine
Lösung
der Bis(cyanoethyl)phosphat-Verbindung (17,28 g) in 200 ml Aceton
wurde mit Argon durchspült.
Eine Lösung
aus NaOH (2,76 g) in 50 ml Wasser wurde hinzugefügt, und die Lösung wurde
unter Argon über
Nacht gerührt.
Der Niederschlag, der sich gebildet hatte, wurde mit Unterdruck
gefiltert, mit 20 % Wasser in Aceton (300 ml) gewaschen und in einem
Vakuum getrocknet. Das Produkt (15,07 g) wurde in Form eines leicht
gelben Feststoffes erhalten. 1H NMR (D2O) δ 3,22
(s, 3H), 6,67 (d, 1H), 6,87 (t, 1H), 7,01 (t, 1H), 7,08-7,15 (m, 2H),
7,23 (d, 1H), 7,31-44 (m, 3H), 7,51 (s, 1H), 7,59 (d, 2H), 7,73
(d, 1H), 7,86 (d, 1H), 8,25 (d, 1H); 31P
NMR (D2O) δ 1,30 (s).
-
Beispiel 5. Weitere, hergestellte
heterozyklische Enolphosphate.
-
Die
folgenden Verbindungen der Formel IV wurden ebenfalls hergestellt
und erfüllen
ihre Funktion in den erfindungsgemäßen chemolumineszenten Reaktionen.
-
-
R
11-R
18 sind H, wenn
nicht anders angegeben. Die Verbindungen 6–8 werden als ein Gemisch aus Doppelbindungsisomeren
erhalten. Jede der Verbindungen 5–14 wurden entsprechend der
allgemeinen Syntheseverfahren, die in den Beispielen 1–4 beschrieben
sind, hergestellt. Zusätzlich
wurden sowohl Verbindungen mit den Formeln:
wobei V t-Butyl, CH
3, OCH
3, F, Cl, Br,
I, COCH
3, CN und NO
2 ist,
als auch Verbindungen mit der Formel:
wobei U p-I, p-CH
3, m-OCH
3, o-Cl,
m-Cl, o-Br, m-Br, p-Br und p-NO
2 ist, genauso
wie Verbindungen dieser Formel, die eine 3,4-Dichlor-, 2,5-Dichlor-
und 2,6-Dichlorphenylgruppe
aufweisen, hergestellt, und sie stellen Chemolumineszenz her, wenn
sie mit einer dihydroxyaromatischen Verbindung umgesetzt werden.
-
Beispiel 6. Herstellung
der geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung 4-Hydroxyphenylphosphat, Dinatriumsalz.
-
Hydrochinon
wurde als Monobenzoatester mit 62 % Ausbeute durch das Umsetzen
mit Benzoylchlorid und Pyridin in CH2Cl2 bei 0 °C
geschützt.
Der Ester wurde mit überschüssigem POCl3 in Pyridin bei 0 °C phosphoryliert. Das Dichlor phosphat-Derivat
wurde mit 10 äq.
3-Hydroxypropionitril umgesetzt, um das Bis(cyanoethyl)phosphat
mit einer Ausbeute von 89 % herzustellen. Die Cyanoethyl- und Benzoyl-Schutzgruppen
wurden bei Raumtemperatur über
Nacht mit wässrigem
NaOH/Aceton hydrolysiert. Das ausgefallene Produkt wurde in Methanol
gelöst
und mit Aceton gefällt,
um 4-Hydroxyphenylphosphat als Dinatriumsalz herzustellen. 1H NMR (D2O) δ 6,56 (d,
1H), 6,92 (t, 1H).
-
Beispiel 7. Herstellung
der geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung 2-Hydroxyphenylphosphat, Dinatriumsalz.
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Catechin
wurde als Monobenzoatester mit einer Ausbeute von 62 % durch das
Umsetzen mit Benzoylchlorid und Pyridin in CH2Cl2 bei 0 °C
geschützt.
Der Ester wurde mit überschüssigem POCl3 und Pyridin in CH2Cl2 bei 0 °C
phosphoryliert. Das Dichlorphosphat-Derivat wurde mit 10 äq. 3-Hydroxypropionitril
umgesetzt, um das Bis(cyanoethyl)phosphat mit einer Ausbeute von
90 % herzustellen. Die Cyanoethyl- und Benzoyl-Schutzgruppen wurden
bei Raumtemperatur über
Nacht mit wässrigem
NaOH/Aceton hydrolysiert. Das ausgefallene Produkt wurde in Methanol
gelöst,
mit Aceton gefällt,
und der Feststoff wurde erneut mit Methanol gewaschen, um 2-Hydroxyphenylphosphat
als Dinatriumsalz herzustellen. 1H NMR (D2O) δ 6,56-6,61
(m, 1H), 6,68-6,71 (d, 1H), 6,82-6,87 (m, 1H), 7,19-7,22 (d, 1H).
-
Beispiel 8. Herstellung
der geschützen
dihydroxyaromatischen Verbindung 4-Hydroxy-2,3,5,6-tetrafluorphenylphosphat,
Dinatriumsalz.
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2,3,5,6-Tetrafluorhydrochinon
wurde als der Mono(t-butyldimethylsilyl)ether mit einer Ausbeute
von 46 % durch das Umsetzen mit t-Butyldimethylsilylchlorid und
Imidazol in DMF über
Nacht bei Raumtemperatur geschützt.
Nach chromatographischer Aufreinigung (10 % Ethylacetat/Hexan) wurde
der Silylether mit überschüssigem POCl3 in Pyridin bei 0 °C phosphoryliert. Das Dichlorphosphat-Derivat wurde mit
10 äq.
3-Hydroxypropionitril umgesetzt, um das Bis(cyanoethyl)phosphat-Derivat
herzustellen, das ebenfalls in einer Ausbeute von 55 % nach Säulenchromatographie
(75–100
% Ethylacetat in Hexan) desilyliert wurde. Die Cyanoethyl-Schutzgruppe
wurde mit wassrigem NaOH/Aceton bei Raumtemperatur für 2 Tage
hydrolysiert. Das ausgefallene Produkt wurde in Methanol gelöst und mit
Aceton ausgefällt,
um das Dinatriumphosphatsalz herzustellen. 31P
NMR (CD3OD) δ 4,244; 19F
MNR (CD3OD) δ -169,02 (d, 2F), -161,16 (d,
2F).
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Beispiel 9. Herstellung
der geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindungen 2- und 3-Chlor-4-hydroxyphenylphosphat,
Dinatriumsalz.
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20
g (Aldrich, Milwaukee, Wisconsin) 2-Chlorhydrochinon wurden durch
Lösen in
350 ml warmem 10 % Ethylacetat/CH2Cl2 umkristallisiert, gefiltert und zu 1,5
l Hexan hinzugefügt.
Nach Kühlung
bei 4 °C über Nacht
wurden 11 g eines cremefarbenen Feststoffes gesammelt. Das gereinigte
2-Chlorhydrochinon wurde mit Acetylchlorid/Pyridin in CH2Cl2 bei Eistemperatur
monoacetyliert, um ein Gemisch aus den isomeren Monoacetaten und
dem Diacetat herzustellen. Das Gemisch wurde mit überschüssigem POCl3 in Pyridin bei 0 °C phosphoryliert. Das Reaktionsprodukt
wurde mit überschüssigem 2-Cyanoethanol
umgesetzt, um ein 4:1-Gemisch aus isomeren Bis(cyanoethyl)phosphat-Derivaten
herzustellen, die durch Säulenchromatographie
(30 % Ethylacetat/Hexan) von dem Diacetat getrennt wurden. Die Acetat-
und Cyanoethyl-Schutzgruppen wurden mit wässrigem NaOH/Aceton (3 äq. von NaOH)
bei 0 °C
für 19
h hydrolysiert. Das ausgefallene Produkt wurde in Methanol gelöst und mit
Aceton ausgefällt,
um die isomeren Dinatriumphosphatsalze herzustellen. 1H
NMR (D2O) δ 6,56-7,19 (m, 3H); 31P NMR (D2O) δ 1,36, 1,39.
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Beispiel 10. Herstellung
der geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung 4-Hydroxyphenyl-β-D-galactopyranosid.
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Hydrochinon
wurde mit α-Bromgalactosetetraacetat
(1,5 äq.)
in Ethanol/wässriges
NaOH bei Raumtemperatur für
2 Tage in einem lichtgeschützten
Behälter
umge setzt. Natriumethoxid (5 äq.)
wurde hinzugefügt,
und die Lösung
wurde nach 1 Stunde konzentriert. Der Rest wurde zwischen Wasser
und Ethylacetat aufgeteilt. Die wässrige Schicht wurde verdampft,
und das Produkt wurde auf Kieselgel chromatographisch gereinigt
(30 % Methanol/CH2Cl2). 1H NMR (CD2OD) δ 3,57-3,88 (m, 6H), 4,68
(d, 1H), 6,68 (d, 2H), 6,96 (d, 2H).
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Beispiel 11. Herstellung
der geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung 4-Hydroxyphenyl-β-D-glucuronid.
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Hydrochinon
(10 g) wurde in den Monobenzoatester durch das Umsetzen mit Benzoylchlorid
und Pyridin in CH2Cl2 umgewandelt.
Die Ausbeute betrug 7 g Ester. 1H NMR (CDCl3) δ 4,880
(s, 1H), 6,87 (d, 2H), 7,08 (d, 2H), 7,52 (t, 2H), 7,64 (t, 1H),
8,20 (d, 2H).
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Der
Letztere (200 mg) wurde mit wässrigem
NaOH in Aceton deprotoniert und durch das Umsetzen mit Ethyl-α-D-Bromglucuronat
in absolutem Ethanol in das β-Glucuronidethylester-Derivat
umgewandelt. Die Reinigung durch präparative TLC erforderte 50
mg der doppelt geschützten
Verbindung. 1H NMR (CD3OD) δ 1,290 (t,
3H), 3,601-3,780 (m, 3H), 4,146-4,258 (m, 3H), 4,64 (br s, 2H),
4,86 (br s, 1H), 5,192 (d, 1H), 7,187-7,285 (m, 4H), 7,635 (t, 2H),
7,767 (t, 1H), 8,208 (d, 2H).
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Eine
50 mg Probe der letzteren Verbindung wurde mit wässriger NaOH in Aceton hydrolysiert,
um den Benzoatester und die Ethylestergruppen zu verseifen. Das
ausgefallene Produkt (16 mg) wurde gefiltert und getrocknet. 1H NMR (CD3OD) δ 3,4-3,5
(m, 3H), 3,64 (d, 1H), 4,65 (d, 1H), 6,53 (d, 2H), 6,87 (d, 2H).
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Beispiel 12. Bewertung
der dihydroxyaromatischen Verbindungen.
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Verschiedene
dihydroxyaromatische Verbindungen wurden gescreent, um ihre allgemeine
Wirksamkeit bei der Induzierung der chemolumineszenten Reaktion
von 1 zu bestimmen. Es wurden Stammlösungen der Testverbindungen
(2 × 10–4 M
in Ethanol/10 % DMSO oder DMSO) hergestellt. Ein 5 μl Aliquot
von jeder wur de in eine Vertiefung einer 96-Vertiefungsmikroplatte
gegeben. Zu jeder Vertiefung wurden 95 μl einer Lösung, die 0,66 mM der Verbindung
1, in 0,2 M 2-Methyl-2-amino-1-propanol-Puffer,
pH-Wert 9,6, 0,88 mM Mg2+ und 0,1 % SDS
enthielt, hinzugefügt.
Die Lichtintensität
wurde für
30 min in allen Vertiefungen gescannt. Für jede Testvertiefung wurden
die maximale Intensität
und die Zeit bis zum Maximum bestimmt.
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-
Beispiel 13. Kinetisches
Profil der Chemolumineszenz-Intensität.
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Die
schnelle Erzeugung von Chemolumineszenz aus einer Zusammensetzung,
die Acridanphosphat 1 und Hydrochinon (DHA-2) enthält, wird
in 1 gezeigt. Das Reaktionsgemisch umfasste 0,66
mM Acridanphosphat 1 und 4 μM
Hydrochinon in 2-Methyl-2-amino-1-propanol-(221)-Puffer, 0,2 M,
pH-Wert 9,6, der auch 0,88 mM MgCl2 enthielt.
-
Beispiel 14: Chemolumineszenz
Detektion von Acridanphosphat 2 mit DHA-1.
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Das
folgende Beispiel stellt die Fähigkeit
dar, sehr kleine Mengen einer heterozyklischen Enolphosphatverbindung
durch die Verwendung der chemolumineszenten Reaktion mit einer dihydroxyaromatischen Verbindung
zu detektieren.
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In
jede von 3 weißen
Mikrovertiefungen wurde ein 100 μl
Aliquot einer Lösung
aus Acridanphosphat 2 (Verdünnungen
enthielten zwischen 6,6 × 10–11 und
6,6 × 10–17 mol)
in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, 0,88 mM MgCl2,
0,1 % SDS gebracht. Ein 100 μl
Aliquot einer 0,01 mM Lösung
aus 2-Chlorhydrochinon (DHA-1) in Wasser wurde in jede Vertiefung
injiziert, und die Lichtintensität
wurde nach 2,5 min gemessen. Die Ergebnisse, die in 2 gezeigt
werden, zeigen, dass die Lichtintensität eine direkte Funktion der
Menge der Phosphatverbindung über
den gesamten, getesteten Bereich ist.
-
Dieses
Beispiel demonstriert, dass das heterozyklische Enolphosphat bei
Konzentrationen detektiert werden kann, die niedrig genug sind,
dass ein geeignet funktionalisiertes Derivat mit einer koppelbaren
Gruppe als eine signalerzeugende Markierung in einem spezifischen
Bindungs-Assay wirken kann.
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Beispiel 15. Reagenz zur
chemolumineszenten Detektion von alkalischer Phosphatase.
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Eine
wirksame Reagenzzusammensetzung für die chemolumineszente Detektion
von alkalischer Phosphatase umfasste 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6,
0,88 mM MgCl2, 0,33 mM Acridanphosphat 1
und 1 mM 4-Hydroxyphenylphosphat.
Das Umsetzen von 100 μl
dieser Zusammensetzung mit 8 × 10–17 mol
AP bei 25 °C
in einem Reagenzglas, das in einem Turner TD-20e Luminometer platziert
wurde, stellte einfach messbare, blaue Chemolumineszenz her. Das
Zeitprofil einer typischen Reaktion wird in 3 gezeigt.
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Beispiel 16. Chemoluminineszente
Detektion mit anderen heterozyklischen Enolphosphatverbindungen.
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In
der Art und Weise des vorigen Beispiels wurden Zusammensetzungen,
die jedes der Acridanphosphate 2-4 anstelle von Verbindung 1 enthielten,
mit AP bei 25 °C
umgesetzt. Jede stellte einfach messbare Chemolumineszenz, erkennbar über dem
Hintergrund in Abwesenheit von AP, her.
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Beispiel 17. Wirkung der
Konzentration der geschützten
dihydroxyaromatischen Verbindung.
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Es
wurde eine Studie durchgeführt,
um den Bereich der Konzentrationen der geschützten dihydroxyaromatischen
Verbindung zu bestimmen, die für
chemolumineszente Assays einer Hydrolase geeignet sind. Ein Reagenz,
bestehend aus einer 0,33 mM Lösung
Acridanphosphat 1 und 0,88 mM MgCl2 in 0,2
M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, die 4-Hydroxyphenylphosphat-Konzentrationen,
die von 0 bis 10 mM variierten, enthielt, wurde mit 8 × 10–17 mol
AP bei 25 °C
(in mg/ml: a, 1; b, 3,3; c, 0,66; d, 0,83; e, 10; f, 0,1; g, 0)
umgesetzt. 4 stellt die verschiedenen kinetischen
Profile der Chemolumineszenz-Emission dar. Die Tatsache, dass die
Lösung, die
kein 4-Hydroxyphenylphosphat enthält, annähernd keine Chemolumineszenz
herstellt, demonstriert, dass die Lichtemission nicht einfach aufgrund
des Entfernens der Phosphat-Schutzgruppe von 1 durch AP, gefolgt durch
Autooxidation des Enolats, erfolgt.
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Beispiel 18. Linearität der AP-Detektion
mit Acridanphosphat 1 in einem Einschritt-Assay.
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Ein
chemolumineszentes Assay von AP wurde durch das Umsetzen verschiedener
AP-Mengen mit 100 μl
Anteilen einer Reagenzzusammensetzung, die 0,66 mM Acridanphosphat
1, 0,66 mM 4-Hydroxyphenylphosphat und 0,88 mM MgCl2 in
0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6 umfasste, platziert in einer 96- Vertiefungsplatte,
die in einem Labsystems Luminoskan Luminometer untergebracht war,
bei 25 °C
durchgeführt.
Die bei 25 min gemessene Lichtintensität korrelierte mit der Enzymmenge
im Bereich von 8 × 10–17–8 × 10–20 mol,
wie in 5 gezeigt wird.
-
Beispiel 19. Chemolumineszente
Detektion von β-Galactosidase.
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Eine β-Galactosidase-Stammlösung (Grade
VIII, Kat. Nr. G 5635, Sigma Chemical Co.) wurde in 0,01 M Phosphatpuffer,
pH-Wert 7,0, 0,01 M NaCl, 0,01 M MgCl2 in
einer Reihe verdünnt,
um zwischen 4,9 × 10–15 und
1,6 × 10–18 mol
Enzym/μl
zu enthalten. 130 μl
Aliquots einer 1 mM Lösung
von 4-Hydroxyphenyl-β-D-galactosid
in 0,05 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 0,01 M NaCl, 3 mM MgCl2 wurden bei 37 °C für 35 min mit 2,6 μl jeder der
Enzymverdünnungen
inkubiert. Doppelte 50 μl-Anteile wurden in
schwarze Mikrovertiefungsstreifen übertragen und auf Raumtemperatur
gekühlt.
Ein 50 μl-Anteil
einer Acridanphosphat-3-Lösung,
die die folgende Zusammensetzung aufwies: 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert
9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Acridanphosphat 3
und 0,1 % SDS, wurde in jede Vertiefung injiziert. Die Enzymmenge
in den Vertiefungen reichte von 4,9 × 10–15 und
1,6 × 10–18 mol β-Galactosidase.
-
Die
Chemolumineszenz-Intensität,
gemessen bei 5 min im Vergleich zur β-Galactosidase-Menge, wird in 6 gezeigt.
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Beispiel 20. Chemolumineszente
Detektion von β-Glucuronidase.
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Eine β-Glucuronidase-Stammlösung (Typ
X-A, Kat. Nr. G 7896, Sigma Chemical Co., MW = 290.000) wurde in
einer Reihe in 0,01 M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,15 M NaCl verdünnt, um
zwischen 3,3 × 10–14 und
3,3 × 10–18 mol
Enzym/μl
zu enthalten. 130 μl
Aliquots einer 1 mM Lösung
von 4-Hydroxyphenyl-β-D-glucuronid in 0,05
M Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, 0,01 M NaCl, wurden mit 2,6 μl jeder der
Enzymverdünnungen bei
37 °C für 30 min
inkubiert. Doppelte 50 μl- Anteile wurden in
schwarze Mikrovertiefungsstreifen übertragen und auf Raumtemperatur
gekühlt.
Ein 50 μl-Anteil
einer Acridanphosphat-4-Lösung,
die die folgende Zusammensetzung aufwies: 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert
9,6, 0,88 mM MgCl2, 0,66 mM Acridanphosphat
4 und 0,1 % SDS wurde in jede Vertiefung injiziert. Die Chemolumineszenz-Intensität, gemessenen
bei 11 min im Vergleich zur β-Glucuronidase-Menge,
wird in 7 gezeigt.
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Beispiel 21. Western-Blot-Assay
mit Verwendung eines alkalischen Phosphatase-Konjugats.
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Erfindungsgemäße Zusammensetzungen
wurden verwendet, um ein Proteinantigen, β-Galactosidase in einem Western
Blot mit einem AP-markierten Antikörper auf einer Nitrocellulose-Membran
zu detektieren und zu quantifizieren. β-Galactosidase-Verdünnungen,
die jeweils 5.000, 1.000, 180, 30 und 5 pg Protein enthielten, wurden
einer Elektrophorese unterzogen und auf Nitrocellulose-Membranen (Hybond
ECL, Amersham, Arlington Heights, Illinois) übertragen. Die Membranen wurden
für 1 h
bei Raumtemperatur mit 1 % fettfreier Milch (NFM) in T-TBS (0,05
% Tween 20 in TBS; TBS ist 50 mmol/l Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 0,15 mol/l
NaCl) blockiert und dann nacheinander mit einer 1:1.500-Verdünnung einer
3,3 μg/ml-Lösung Maus-anti-β-Galactosidase
in Blockierungs-Puffer, T-TBS-Waschpuffer
und anschließend
einer 1:600-Verdünnung
einer 416 mU/ml-Lösung
eines Schaf-anti-Maus-IgG-AP-Konjugats behandelt. Nach dem Waschen
mit T-TBS, wurden
die Membranen kurz mit einem Detektionsreagenz eingeweicht, das
0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6, der 0,88 mM MgCl2,
0,66 mM Hydrochinonphosphatdinatriumsalz, 0,66 mM Acridanphosphat
3 und 0,1 % SDS enthielt, umfasste. Die Membranen wurden zwischen
transparente Plastikfolien gebracht und auf einen Röntgenfilm
exponiert. Alle fünf
Banden der β-Galactosidase
wurden nach 15 min mit einer 1 min-Exponierung detektiert. Das unter
Verwendung dieser Zusammensetzungen hergestellte Licht führte zu
starker Emission, die für
mindestens 1 Tag abgebildet werden konnte.
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Beispiel 22. Dot-Blot-Assay.
-
Ein
repräsentatives
Beispiel der Verwendung eines erfindungsgemäßen Reagenz in einem Dot-Blot-Assay
wird in dem folgenden Beispiel demonstriert.
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Digoxigenin-markierte
DNA (pBR328), Anti-Digoxigenin-AP-Konjugat wurden als Kit zur Verfügung gestellt
(Genius 3, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana), Blockierungs-Puffer
und positiv geladene Nylonmembran wurden von Boehringer-Mannheim bezogen.
Der Waschpuffer bestand aus 0,1 M Maleinsäure, pH-Wert 7,5, 0,15 M NaCl,
0,05 % SDS. Das Detektionsreagenz umfasste 0,66 mM Acridanphosphat
2, 0,66 mM 4-Hydroxyphenylphosphat, 0,88 mM MgCl2,
0,1 % SDS in 0,2 M 221-Puffer, pH-Wert 9,6.
-
DNA-Verdünnungen
(10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 pg) wurden auf Nylonmembranen gedotblottet,
blockiert, gewaschen und gemäß des Herstellerprotokolls
mit Antikörper-AP-Konjugat
umgesetzt. Überschüssiger Puffer
wurde abgegossen, und die Blots wurden in einem beschriebenen Detektionsreagenz
für 3 min
eingeweicht. Überschüssiges Reagenz
wurde abgegossen, und die Blots wurden zwischen transparente Folien gebracht
und auf einen Röntgenfilm
für verschiedene
Zeiträume
exponiert. Eine sofortige 1 min-Exponierung detektierte die 10 pg-0,3
pg Punkte. Nach 30 min, wurden alle 7 Punkte mit einer 20 min-Exponierung
detektiert. Mehrfache Exponierungen konnten für einige Tage durchgeführt werden.
Zum Beispiel wurden nach 5 Tagen alle 7 Punkte mit einer 1-5 min-Exponierung
detektiert. Detektionsreagentien, die 0,66 mM Acridanphosphat 3,
oder 0,66 mM Lösung
eines Gemisches von 2- und 3-Chlor-4-hydroxyphenylphosphat enthielten,
stellten vergleichbare Ergebnisse her.
-
Die
vorangehende Beschreibung und die Beispiele sind nur darstellend
und dürfen
nicht als restriktiv angesehen werden. Es wird erkannt, dass Modifikationen
der spezifischen Verbindungen und Verfahren, die nicht spezifisch
offenbart wurden, gemacht werden können, ohne den Schutzumfang
der vorliegenden Erfindung zu verlassen, der nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt wird.