DE10158517A1

DE10158517A1 - Verfahren zur Analyse der translationskontrollierten Genexpression

Info

Publication number: DE10158517A1
Application number: DE2001158517
Authority: DE
Inventors: Christoph Charle
Original assignee: FOCUSGENOMICS GmbH
Current assignee: FOCUSGENOMICS GmbH
Priority date: 2001-11-29
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2003-06-12
Also published as: AU2002358532A1; US20050037357A1; EP1453976A2; JP2005510247A; CN1615369A; WO2003046214A3; CA2468409A1; WO2003046214A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der Genexpression, das unter Berücksichtigung des in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus vorliegenden Translationszustandes eine zuverlässige Korrelation der von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Menge mit der von dieser mRNA translatierten Proteinmenge ermöglicht. Die Bestimmung der Translationseffizienz aller von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten, die für ein bestimmtes Protein kodieren, ermöglicht unter anderem die Identifizierung der in einem bestimmten Zelltyp, Gewebe oder Organismus präferentiell translatierten mRNA-Variante. Anhand der Menge und der Translationseffizienz der präferentiell translatierten, für ein zu untersuchendes Protein kodierenden mRNA-Variante kann eine zuverlässige Vorhersage der in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus exprimierten Menge des Proteins erstellt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren auf dem Gebiet der Transkriptionsanalyse und umfasst insbesondere Verfahren und Kits zur Analyse der translationskontrollierten Genexpression. Das Verfahren basiert auf der Analyse der Translationseffizienz des 5'-NTR der von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribierten mRNA-Varianten. Die Daten zur Translationseffizienz der verschiedenen von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribierten mRNA-Varianten sind vorzugsweise Teil eines Datenbanksystems, das zusammen mit einem speziell gestalteten Werkzeug zur Transkriptionsanalyse eine präzise Vorhersage von Proteinmengen in einem zu untersuchenden Zelltyp, Gewebe oder Organ durch Identifizierung und Quantifizierung der verschiedenen, von einem oder mehreren Genen transkribierten mRNA-Varianten ermöglicht.
Die Produkte der Genexpression, Proteine, sind Träger der zellulären Funktionen. Es konnte gezeigt werden, daß die Regulation der Genexpression eine wesentliche Rolle in biologischen Prozessen wie der Embryogenese, der Gewebereparatur, dem Altern oder der neoplastischen Transformation spielt. Die Genexpression wird in Eukaryonten auf der Transkriptionsebene, posttranskriptionell (Polyadenylierung der RNA, mRNA-Spleißen, Export der reifen mRNA aus dem Kern ins Zytoplasma oder gezielter Abbau der RNA), auf Ebene der Translation oder posttranslational kontrolliert [0]. Die Kontrolle der Expression auf Ebene der Translation stellt einen neuen regulatorischen Schlüsselmechanismus für die Steuerung der Genexpression [1] dar. Für verschiedene Wachstumsfaktoren, Cytokine, Hormonrezeptoren, Proteinkinasen, Transkriptionsfaktoren, Komponenten des Translationsapparates und für Regulatoren des Zellzyklus und der Apoptose [2, 3, 4, 5 und 6] wurde eine translationskontrollierte Expression nachgewiesen. Die mRNAs, die für Gene kodieren, deren Expression unter Translationskontrolle steht, zeichnen sich durch eine auffällige Struktur aus. Der 5'-nicht-translatierte Bereich (5-NTR) der meisten mRNAs ist normalerweise zwischen 10 Nucleotide (N) und 200 N lang [7, 8]. Etwa zwei Drittel der mRNAs, die für Protoonkogene oder Faktoren kodieren, die an der Zellteilung beteiligt sind, haben 5'-NTRs, die länger als 200 N sind und/oder mehr als ein Startkodon enthalten. Die bisher bekannten Mechanismen, die mit Hilfe des 5'-NTR einer mRNA die Initiation der Proteinbiosynthese kontrollieren, sind im folgenden genauer beschrieben.

Regulation der Translation durch lange, strukturierte 5'-NTRs

Stabile Sekundärstrukturen und Sequenzabschnitte, die einen hohen Anteil an Guanin- und Cytosinbasen enthalten, können, wenn diese im 5'-NTR einer mRNA vorliegen, sehr effizient die CAP-abhängige Initiation der Proteinbiosynthese nach dem "ribosome scanning" Modell inhibieren [1]. In vitro Untersuchungen haben gezeigt, daß eine Haarnadelstruktur im 5'-NTR einer mRNA, die eine freie Energie von 30-70 kcal./mol hat, die Translation wirksam inhibieren kann. So konnte auch gezeigt werden, daß für ein bestimmtes Protein kodierende mRNAs mit einem derart strukturierten 5'-NTR nur sehr schwach translatiert werden, während für das selbe Protein kodierende mRNAs mit einem kürzeren, schwächer strukturierten 5'-NTR erheblich effizienter translatiert werden [5, 9].

Regulation der Translation durch strangaufwärts gelegene offene Leserahmen (uORFs)

Das "ribosome scanning" Modell der Translationsinitiation besagt, daß die Proteinsynthese am 5'-proximalen Startkodon beginnt [10, 11]. Es existiert eine Reihe von mRNAs mit langen 5'-NTRs, die ein oder mehrere zusätzliche Startkodons stromaufwärts vom ersten Startkodon des kodierenden Bereichs, oder ein oder mehrere uORFs enthalten, die auf die Translation des strangabwärts liegenden kodierenden Region inhibierend wirken [6]. Für ein bestimmtes Protein kodierende mRNAs, deren 5-NTR vergleichsweise kurz ist und keine zusätzliche Startkodons oder uORFs enthält, werden erheblich effizienter translatiert, als für dasselbe Protein kodierende mRNAs, die einen langen 5'-NTR, der ein oder mehrere zusätzliche Startkodons oder uORFs enthält [1, 2, 3, 6, 12 und 13].

Regulation der Translation durch interne Ribosomeneintrittsstellen (IRES)

Ursprünglich wurde die interne Initiation der Translation bei Picornaviren entdeckt, deren mRNAs keine 5'-CAP Struktur tragen und einen ca. 1000 N langen, strukturierten 5'-NTR haben, der zudem eine hohe Anzahl an uORFs enthält. Trotz der Struktur des 5'-NTR, der eine Initiation der Translation nach dem "ribosome scanning" Modell wirksam inhibiert [11], wird die RNA von Picorna Viren in vitro und in vivo effizient translatiert. Die Sekundärstrukturen im 5'-NTR der Picorna Virus RNA begünstigen die Bindung der ribosomalen Untereinheiten und die CAP-unabhängige Initiation der Translation (internal ribosome entry sites → IRES). Ähnlich strukturierte 5'-NTRs wurden auch in der RNA verschiedener anderer Viren entdeckt [14, 15]. Im 5'-NTR verschiedener zellulärer mRNAs, die in Eukaryonten transkribiert werden, konnten ebenfalls eine oder mehrere IRES nachgewiesen werden [16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 und 24]. mRNAs, deren 5'-NTR eine IRES enthält, können in Zellen, die den eukaryontischen Initiationsfaktor eIF 4E überexprimieren, unabhängig von einer 5'-⁷Methyl-G-Cap-Struktur translatiert werden [6, 11]. Auch in diesem Zusammenhang konnte nachgewiesen werden, daß eine für ein bestimmtes Protein kodierende mRNA, die einen kurzen, schwach strukturierten 5'-NTR trägt, erheblich effizienter translatiert wird, als eine für das selbe Protein kodierende mRNA, deren 5'-NTR eine IRES enthält [24]. Ein oder mehrere IRES Elemente im 5'-NTR einer mRNA ermöglicht die effiziente Translation dieser mRNA nach einer Virusinfektion oder in eIF4E überexprimierenden Zellen. Unter normalen Bedingungen verhindern derartig lange, strukturierte 5'-NTRs die CAP-abhängige Initiation der Translation.
Es konnte gezeigt werden, daß von Genen, deren Expression auf Ebene der Translation reguliert wird, mehrere mRNA-Varianten transkribiert werden. Die Sequenz der kodierenden Region aller mRNA Varianten, die von einem bestimmten Gen transkribiert werden, ist identisch. In den meisten untersuchten Fällen trägt das Haupttranskript einen langen strukturierten 5'-NTR, während die Nebentranskripte kürzere, schwächer strukturierte 5'-NTRs tragen. Die Entstehung dieser mRNA-Varianten ist auf die Benutzung verschiedener Transkriptionsstartstellen sowie alternatives Spleißen der prä-mRNA zurückzuführen [2, 12, 24].
Vom bcl-2 Gen werden z. B. zwei mRNA Varianten transkribiert. Das Haupttranskript des bcl-2 Gens hat einen mehr als 1.000 N langen 5-NTR, der mehrere uORFs enthält. Das bcl-2 Nebentranskript trägt einen ca. 80 N langen, schwach strukturierten 5'-NTR und wird präferentiell translatiert. Der Anteil des Nebentranskripts beträgt etwa 5% der Gesamtmenge an bcl-2 mRNA [2, 12]. Eine Verdoppelung der Transkriptionsrate des präferentiell translatierten bcl-2 Transkripts, ausgelöst durch äußere Einflüsse wie Strahlung, Chemikalien, Cytostatika, Hormone, Cytokine, Wachstumsfaktoren oder Stress, führt zu einer Verdoppelung der Proteinkonzentration. Die Gesamtmenge der bcl-2 mRNA erhöht sich insgesamt um 5%. Mit herkömmlichen Methoden der Transkriptionsanalyse [26, 29] sind diese Änderungen nicht exakt genug zu bestimmen, um eine Änderung der Proteinmenge vorhersagen zu können.
Proteine wie Wachstumsfaktoren, Cytokine, Hormonrezeptoren, Proteinkinasen, Transkriptionsfaktoren, Komponenten des Translationsapparates sowie Regulatoren des Zellzyklus und der Apoptose spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen oder Krebs. Die Entstehung mehrfach chemoresistenter Tumorzellen und einige Teilbereiche des sogenannten Immun-"escapes" werden ebenfalls durch die oben genannten Proteine beeinflußt [25]. Die Expression vieler der Gene, die für diese Proteine kodieren, wird auf Ebene der Translation reguliert [1, 6]. Die Änderung in der Menge dieser Proteine kann mit Hilfe der unter dem Begriff "Proteomics" zusammengefassten Methoden analysiert werden [30]. Allerdings unterliegen sämtliche bekannten Methoden zur Analyse und/oder Quantifizierung von Proteinen Einschränkungen, die z. B. das limitierte Auflösungsvermögen von 2D-Gelen, die Selektivität von Methoden zur Anfärbung von Proteinen oder die Verfügbarkeit von Antikörpern umfassen. Außerdem sind fast alle Methoden zur Analyse von Proteinen zeitintensiv, umständlich in der Handhabung und zum Teil mit einem erheblichen apparativen Aufwand verbunden, so daß sie nicht ohne weiteres in der klinischen Routine oder in Hochdurchsatzprozeduren eingesetzt werden können.
Um die mit den Proteomics verbundenen Probleme zu umgehen, wird im allgemeinen die Änderung der Menge eines bestimmten Proteins mit Hilfe der Änderung der Menge an mRNA, die für dieses Protein kodiert, vorhergesagt. Die Verfahren, mit deren Hilfe die mRNA-Menge, die von einem oder mehreren Genen transkribiert wird, bestimmt werden kann, umfassen den Northernblot, Slot- und Dot-Blots, Nuklease Protektion Assays, PCR und DNA-Arrays [26]. Vor allem die PCR-basierten Methoden und DNA-Arrays zur Transkriptionsanalyse ermöglichen die Analyse großer Mengen an Proben, da ihre Handhabung relativ unkompliziert ist und automatisiert werden kann. In der gängigen Laborpraxis wird die von einem Gen transkribierte mRNA-Menge durch Detektion der kodierenden Region dieser mRNA bestimmt. Es konnte gezeigt werden, daß die Menge an mRNA, die für ein bestimmtes Protein kodiert, kein ausreichend exakter Indikator für die tatsächlich vorliegende Menge des entsprechenden Proteins ist, da in mehr als 50% der untersuchten Gene die nachgewiesene Proteinmenge nicht mit der nachgewiesenen RNA- Menge korreliert ist [29]. Wenn die Expression eines bestimmtes Gens auf Translationsebene reguliert wird, kann mit den oben aufgeführten Methoden ausschließlich die Summe aller von diesem Gen transkribierten mRNA-Varianten bestimmt werden.
Eine relativ präzise Einschätzung der in einem Gewebe oder Zelltyp vorliegenden Proteinmenge kann durch die Analyse der an Polysomen gebundenen Transkripte erreicht werden, da diese die aktiv translatierte mRNA repräsentieren [29, 31, 32 und 33]. Die Anzahl der polysomengebundenen mRNA-Moleküle ist ein sicherer Indikator für die Translationsrate der korrespondierenden Proteine, da allgemein akzeptiert ist, daß die Kontrolle der Translation hauptsächlich während der Initiationsphase stattfindet [29, 34]. Zur Isolierung von polysomengebundener mRNA muß cytoplasmatische RNA unter Bedingungen isoliert werden, die eine Dissoziation von RNA-Proteinkomplexen bzw. RNA- Ribosomenkomplexen verhindern. Anschließend werden Polysomen von Monosomen und ungebundener mRNA durch Ultrazentrifugation über einen Sucrosegradienten getrennt [29, 31, 32 und 33]. Die Trennung von Kern-RNA und cytoplasmatischer RNA [36] und der nachfolgende Ultrazentrifugationsschritt erschweren die Automatisierung der Methode und damit die parallele Bearbeitung einer hohen Anzahl von Proben.
In Bereichen wie der klinischen Diagnostik oder der industriellen Wirkstoff-Forschung, die auf automatisierte Methoden angewiesen sind, um eine hohen Probendurchsatz zu gewährleisten, besteht ein Bedarf an Methoden zur Durchführung von vorteilhaften Expressionsanalysen, die eine zuverlässige Vorhersage der exprimierten Proteinmenge ermöglichen. Eine präzise Vorhersage von Proteinmengen durch Transkriptionsanalysen ermöglicht die Darstellung funktioneller Zusammenhänge in Zellen, Geweben oder Organismen, welche die Bestimmung von Effekten, Nebeneffekten und Zielmolekülen von Wirkstoffen ermöglichen. Die dem Stand der Technik entsprechenden Methoden zur Expressionsanalyse, die in automatisierte Systeme oder Hochdurchsatzroutinen integriert werden können, berücksichtigen aber nicht den Translationszustand der Zelle, da für ein oder mehrere zu untersuchende Proteine kodierende mRNAs nur an Hand ihres kodierenden Bereiches nachgewiesen werden. Diese Systeme ermöglichen daher keine zuverlässige Vorhersage von Proteinmengen bzw. die Darstellung funktioneller Zusammenhänge in den zu untersuchenden Zellen, Geweben oder Organismen. Methoden zur Expressionsanalyse, die den Translationszustand der zu untersuchenden Zellen, Gewebe oder Organismen berücksichtigen, wie z. B. die vergleichende Analyse polysomaler und nichtpolysomaler RNA, erlauben zwar eine zuverlässige Vorhersage von Proteinmengen, sind aber aufgrund ihrer umständlichen Handhabung nicht geeignet, um in Highthroughput Prozeduren oder in der klinischen Routinediagnostik eingesetzt zu werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein vorteilhaftes Verfahren zur Expressionsanalyse eines Gens zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse der Genexpression, das unter Berücksichtigung des in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus vorliegenden Translationszustandes eine zuverlässige Korrelation der von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Menge mit der von dieser mRNA translatierten Proteinmenge ermöglicht. Die Bestimmung der Translationseffizienz aller von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten, die für ein bestimmtes Protein kodieren, ermöglicht unter anderem die Identifizierung der in einem bestimmten Zelltyp, Gewebe oder Organismus präferentiell translatierten mRNA-Variante. Anhand der Menge und der Translationseffizienz der präferentiell translatierten, für ein zu untersuchendes Protein kodierenden mRNA-Variante, kann eine zuverlässige Vorhersage der in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus exprimierten Menge des Proteins erstellt werden. Das Verfahren ermöglicht die simultane Analyse der translationskontrollierten Expression einer Vielzahl von Genen und damit die Analyse funktioneller Zusammenhänge in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus. Das Verfahren ermöglicht die Vorhersage der Menge eines oder mehrerer zu untersuchender Proteine in einem Gewebe oder Zelltyp durch Bestimmung der Transkriptionsrate der präferentiell translatierten mRNA.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Expressionsanalyse wenigstens eines für ein Protein kodierenden Gens in einer Probe, das umfasst, dass man gegebenenfalls die Anzahl und Identität verschiedener mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens ermittelt, die in der Probe vorhanden sind; die jeweiligen Mengen der verschiedenen mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens ermittelt, die in der Probe vorhanden sind; und anhand der ermittelten Mengen und der jeweiligen Translationseffizienz der verschiedenen mRNA-Varianten die Menge an von dem zu analysierenden Gen kodierten Protein ermittelt, die in der Probe vorliegt.
Die Probe ist in der Regel eine Zusammensetzung, die Zellen, ein Gewebe oder Teile eines Organs umfasst. Es kann sich beispielsweise um eine Biopsie oder um Zellen in Zellkultur handeln. Vorzugsweise stammt die Probe aus einer Kultur von Säugerzellen, aus einem Gewebe oder einem Organ eines Säugetiers.
In der Regel wird die Probe nicht unmittelbar selbst analysiert, sondern es wird daraus eine Zusammensetzung gewonnen oder hergestellt, die Nukleinsäure, welche mRNA ist oder davon abgeleitet ist, enthält. Diese Zusammensetzung ist vorzugsweise eine aus der Probe gewonnene bzw. hergestellte Präparation von Gesamt-RNA oder PolyA+-RNA. Es kann sich bei der in der Zusammensetzung enthaltenen Nukleinsäure ebenfalls um cRNA oder cDNA handeln. Derartige Präparationen können einfach aus einer Zusammensetzung, die mRNA enthält, hergestellt werden. Die Zusammensetzung wird analysiert und aus den Werten für Anzahl, Identität und/oder Menge der verschiedenen Nukleinsäurevarianten der zu analysierenden Gene in der Zusammensetzung kann auf die Anzahl, Identität und/oder Menge der verschiedenen Nukleinsäurevarianten des zu analysierenden Gens in der Probe geschlossen werden.
Vorzugsweise wird zunächst eine feste Matrix bereitgestellt, auf der an verschiedenen Stellen der Matrix wenigstens 2 verschiedene einzelsträngige Nukleinsäuren immobilisiert sind (= Sonden). Diese Sonden enthalten vorzugsweise je 10 bis 40 aufeinanderfolgende Nukleotide oder bestehen aus 10 bis 40 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, welche jeweils Teil der Nukleotidsequenz des zu analysierenden Gens sind, wobei eine erste Sonde komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz einer ersten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist, diese erste Sonde aber nicht komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz einer zweiten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist. Weiter ist eine zweite Sonde komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz der ersten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens, und diese zweite Sonde ist ebenfalls komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz der zweiten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens. Das bedeutet, dass die erste Sonde spezifisch für die erste mRNA- bzw. cDNA-Variante ist, die zweite Sonde aber mit der ersten und der zweiten mRNA- bzw. cDNA-Variante hybridisieren kann.
In einem weiteren Schritt kann die feste Matrix mit der Zusammensetzung, die aus der Probe gewonnen oder hergestellt wurde, in Kontakt gebracht werden, wobei eine Hybridisierung von Nukleinsäuremolekülen in der Zusammensetzung mit einer oder mehreren Sonden stattfinden kann. In einem weiteren Schritt werden dann gegebenenfalls die Anzahl und Identität der in der Zusammensetzung vorhandenen verschiedenen Varianten von Nukleinsäuren, die von dem zu analysierenden Gen kodiert werden, ermittelt. Ebenso werden die jeweiligen Mengen der in der Zusammensetzung vorhandenen verschiedenen Varianten von Nukleinsäuren, die von dem zu analysierenden Gen kodiert werden, ermittelt. In einem letzten Schritt wird anhand der derart ermittelten Mengen und der jeweiligen Translationseffizienz der verschiedenen mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens die Menge an von dem Gen kodierten Protein ermittelt, die in der Probe, aus der die Zusammensetzung gewonnen oder hergestellt wurde, vorliegt.
Die feste Matrix kann auch eine dritte Sonde enthalten, die mit einer dritten mRNA- Variante oder der entsprechenden cDNA hybridisieren kann, weil sie komplementär zu ihr ist. Sie kann aufgrund Komplementarität auch mit der ersten und der zweiten mRNA- Variante oder der entsprechenden cDNA hybridisieren. Die dritte mRNA-Variante oder die entsprechende cDNA wird aber nicht von der ersten und der zweiten Sonde erkannt. Die Sonden sind also so ausgebildet, dass die erste mRNA-Variante von allen drei Sonden erkannt wird, die zweite mRNA-Variante nur von der zweiten und der dritten Sonde, und die dritte mRNA-Variante nur von der dritten Sonde. Die Anzahl der Sonden, die notwendig sind, um noch mehr verschiedene mRNA-Varianten zu unterscheiden, ist entsprechend höher. Dem Fachmann ist klar, dass mehr Sonden eingesetzt werden können, als theoretisch zur Unterscheidung der verschiedenen mRNA-Varianten notwendig ist.
Üblicherweise enthält wenigstens eine der auf der festen Matrix immobilisierten Sonden eine Nukleotidsequenz, die Teil der kodierenden Region des zu analysierenden Gens ist. Die auf der Matrix immobilisierten Sonden können in verschiedenen Ausführungsformen die gesamte genomische Nukleotidsequenz der 3'-nicht-kodierenden Region, der 5'-nicht- kodierenden Region oder der gesamten nicht-kodierenden Region des zu analysierenden Gens "abdecken". Schließlich kann durch die Sonden auch die gesamte genomische Nukleotidsequenz des zu analysierenden Gens erfasst sein. Die Nukleotidsequenzen der einzelnen Sonden können dabei überlappen.
Es ist auch bevorzugt, dass auf der festen Matrix eine oder mehrere Sonden immobilisiert sind, die jeweils Teile der Nukleotidsequenz von bakteriellen Genen, pflanzlichen Genen und/oder housekeeping Genen des Organismus, aus dem die Probe stammt, enthalten. Üblicherweise haben diese Sonden eine Länge von 10 bis 40 Nukleotiden. Beispiele für housekeeping Gene sind z. B. Gene, die für β-Aktin, GAPDH oder L32 kodieren.
Besonders bevorzugt ist, dass die feste Matrix als DNA-Array ausgebildet ist, auf dem die Sonden in Form von Spots immobilisiert sind.
Von dem zu analysierenden Gen können 2 verschiedene mRNA-Varianten transkribiert werden, es ist aber auch möglich, dass 3 oder mehr verschiedene Varianten transkribiert werden. Die verschiedenen Varianten können sich am 5'-Ende und/oder am 3'-Ende unterscheiden und/oder verschiedene Spleißformen des Gens darstellen.
Die Erfindung betrifft auch eine feste Matrix, wie sie für das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben wurde.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit zur Expressionsanalyse wenigstens eines Gens in einer Probe. Das Kit umfasst als Komponente 1 eine feste Matrix, wie sie bereits beschrieben wurde, sowie als Komponente 2 ein Speichermedium, auf dem die jeweiligen Translationseffizienzen der verschiedenen mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens gespeichert sind. Weiterhin kann es eine Einrichtung zur Bestimmung der jeweiligen Mengen an Nukleinsäure, die nach in-Kontakt-Bringen einer Nukleinsäure enthaltenden Zusammensetzung mit der festen Matrix an die jeweiligen Sonden gebunden sind, umfassen. Bevorzugte Ausführungsformen der festen Matrix von Komponente 1 entsprechen bevorzugten Ausführungsformen der Matrix in dem beschriebenen Verfahren. In der Komponente 2 können weitere Transkriptionsprofile enthalten sein. Dabei kann es sich um Transkriptionsprofile handeln, die von durch eine Krankheit veränderten Zellen, Geweben oder Organismen stammen. Beispiele für solche Krankheiten sind Krebs, neurodegenerative Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, chronische Erkrankungen des Alters, Herz-Kreislauferkrankungen, Viruserkrankungen und Wirkstoffresistenzen.
Insbesondere kann es sich um Transkriptionsprofile handeln, die von Tumorzellen stammen, die mit einem oder mehreren Therapeutika behandelt worden sind. Die weiteren Transkriptionsprofile in Komponente 2 können auf demselben Speichermedium wie die Translationseffizienzen gespeichert sein, sie könne aber auch auf einem oder mehreren separaten Speichermedien gespeichert sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der beschriebenen festen Matrix zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Probe, zur Bestimmung oder Analyse von Erkrankungen, zur Bestimmung oder Analyse der Effekte äußerer Einflüsse auf zu untersuchende Zellen oder zur Bestimmung der Sekundärstruktur von RNA-Molekülen.
Das System zur Durchführung des Verfahrens besteht üblicherweise aus zwei Komponenten. Komponente 1 ist in der Regel ein DNA-Array zur Identifikation und Quantifizierung aller mRNA-Varianten, die von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribiert werden. Mit Hilfe des in Komponente 1 enthaltenen, speziell gestalteten DNA-Arrays, werden neben der quantitativen Bestimmung der Transkription verschiedener Gene alternativ genutzte Transkriptionsstartstellen dieser Gene und Spleißvarianten im 5'-NTR bzw. im 3'-NTR der von diesen Genen transkribierten mRNA- Varianten analysiert und quantitativ bestimmt. Durch den DNA-Array können die Aussagen einer Kombination aus Nuklease Protektion Assay, Northernblot und quantitativer RT-PCR [26] ermöglicht werden. Komponente 2 kann ein Softwarepaket sein, das aus einem Datenbank- und einem Analysemodul besteht. In der Datenbank, gegebenenfalls auf einem Speichermedium, sind Werte zur Translationseffizienz aller von den zu untersuchenden Genen transkribierten mRNA-Varianten unter verschiedenen Bedingungen organisiert. Die Datenbank enthält alle notwendigen Daten, um anhand eines Transkriptionsprofils die Menge eines in einem bestimmten Zelltyp, Gewebe oder Organismus translatierten Proteins zuverlässig Vorhersagen zu können. Das in Komponente 2 eingebettete Analysemodul ermittelt anhand der mit Komponente 1 erstellten Transkriptionsmuster und der Datenbank die Menge der präferentiell translatierten mRNA-Variante bzw. mRNA-Varianten, die von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus unter bestimmten Bedingungen transkribiert werden.
In einer Ausführungsform bezieht sich das System auf Methoden zur Bestimmung bzw. Analyse der Effekte und Nebeneffekte verschiedener äußerer Einflüsse auf zu untersuchende Zelltypen, Gewebe oder Organismen. Diese äußeren Einflüsse können unter anderem Wirkstoffe (Pharmaka), Cytokine, Hormone, Wachstumsfaktoren, Umwelteinflüsse (Temperatur, Luftdruck, Chemikalien) oder die Nahrungsmittelversorgung umfassen. Poly A⁺-mRNA, zelluläre gesamt-RNA oder aus diesen RNA-Populationen hergestellte cDNA aus Zellen, Geweben oder Organismen, die einem oder mehreren der oben genannten Einflüsse ausgesetzt wurden, werden mit Komponente 1 analysiert. Diese Transkriptionsprofile werden mit Transkriptionsprofilen von gleichen oder ähnlichen Zellen, Geweben oder Organismen verglichen, die nicht den obengenannten äußeren Einflüssen ausgesetzt waren. Im Bereich der Wirkstoff-Forschung kann das System eingesetzt werden, um zum Beispiel bei der Entwicklung neuer Tumortherapeutika die Wirkung auf Zellen und das Potenzial zur Ausbildung eines multipel chemoresistenten Phänotyps zu analysieren.
Das System kann des weiteren Methoden zur Analyse von Krankheitsbildern umfassen, die unter anderem neurodegenerative Syndrome, Krebs, Autoimmunerkrankungen, chronische Erkrankungen des Alters, Herz-Kreislauferkrankungen, Viruserkrankungen und/oder Wirkstoffresistenzen umfassen. Im Bereich der Diagnostik von Tumorerkrankungen soll das System zur Analyse und Bewertung des Metastasierungspotentials und der Aggressivität eines Tumors sowie zur Analyse und Bewertung der multiplen Chemoresistenz von Tumoren eingesetzt werden, um eine Verbesserung der Therapieleistungen zu erreichen und um die Gestaltung individueller Therapieformen zu ermöglichen. Das Datenbankmodul von Komponente 2 wird hier um Datensätze erweitert, welche mit Komponente 1 erstellte Transkriptionsprofile von Tumorzellen sowie klinische Daten zu diesen Tumorzellen umfaßt. Des weiteren beinhalten diese Datensätze mit Komponente 1 erstellte Transkriptionsprofile von kultivierten Tumorzellen, die mit verschiedenen Tumortherapeutika behandelt wurden sowie Daten (z. B. Teilungsrate, Apoptoserate und andere) zur Reaktion dieser Zellen auf die Therapeutika (Reaktionsprofile).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Methoden zur Ermittlung der Sekundärstruktur von mRNA-Molekülen. Insbesondere die Sekundärstruktur von katalytisch wirksamen RNAs, sogenannten Ribozymen, oder regulatorischen Bereichen von mRNAs, wie zum Beispiel internen Ribosomen Eintrittsstellen (IRES), können zuverlässig ermittelt werden. Die spezielle Gestaltung des DNA-Arrays (Komponente 1) stellt einen vollständigen Ersatz für den in der gängigen Laborpraxis verwendeten Nuklease Protektion Assay [26] dar. Bei konventionellen Nuklease Protektion Assays ist nicht immer eindeutig zu ermitteln, welcher Bereich der Sonden-Target Duplex doppelsträngig, also gegen Nukleasen geschützt ist. Ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die genaue Sequenz der "geschützten" Bereiche angezeigt wird. Die zu untersuchenden RNA-Moleküle werden einem partiellen RNAse-Verdau ausgesetzt und anschließend mit den DNA-Arrays hybridisiert. Der DNA-Array (Komponente 1) ermöglicht die Identifizierung doppelsträngiger Bereiche in einem zu untersuchenden RNA-Molekül. In Verbindung mit gängigen Algorithmen zur Berechnung von Sekundärstrukturen von Nukleinsäuren [24] kann mit diesen Daten ein zuverlässiges Modell der Faltung des zu untersuchenden RNA-Moleküls erstellt werden. Die Erstellung dreidimensionaler Modelle von IRES-Elementen, enzymatisch wirksamen RNAs (Ribozyme) oder anderen RNA- Strukturen ohne den Einsatz spektroskopischer Methoden oder der Röntgenstrukturanalyse wird damit erstmals ermöglicht.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung

Komponente 1 (DNA-Array)

Komponente 1 ist vorzugsweise ein speziell auf die Erfordernisse des Systems abgestimmter und gestalteter DNA-Array, mit dessen Hilfe in einer Menge von Proben- Nukleinsäuren, die gesamt-RNA, polyA⁺-mRNA, oder cDNA sein kann, jede mRNA- Variante, die von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribiert wird, identifiziert und quantifiziert werden kann. Der DNA-Array wird Sonden-Nukleinsäuren zum Nachweis sämtlicher mRNA-Varianten enthalten, die zur Analyse, Diagnose bzw. Interpretation der Wirkung eines oder mehrerer bestimmter äußerer Einflüsse auf einen zu untersuchenden Zelltyp, Gewebe oder Organismus notwendig sind. Diese äußeren Einflüsse können unter anderem eine Änderung des Sauerstoffpartialdrucks, der Nahrungsmittelzufuhr, der Temperatur, des Luftdrucks sowie die Wirkung von Cytokinen, Hormonen, Cytostatika oder anderen Wirkstoffe sowie pathologische Veränderungen wie Krebs, neurodegenerative Syndrome, Autoimmunerkrankungen, Herz- Kreislauferkrankungen, Virusinfektionen und Wirkstoffresistenzen umfassen.

Gestaltung und Interpretation des DNA-Arrays

In einer Ausführungsform wird eine einzelsträngige Nukleinsäure, die DNA, RNA oder ein Nukleinsäurenanalog wie PNA (Peptide Nucleic Acid) [27] sein kann, und deren Basensequenz identisch mit der Basensequenz des 5'-nichtkodierenden Bereiches (5'- NCR), des kodierenden Bereiches (CR) und gegebenenfalls des 3'-nichtkodierenden Bereiches (3'-NCR) eines zu untersuchenden Gens ist, in Oligonukleotide einer Länge L_x von mindestens 10 und höchstens 40 Nukleotiden aufgeteilt. Die Gleichgewichts- Schmelztemperatur aller Oligonukleotide soll gleich sein (T_m = const.). Die exakte Länge L_x der einzelnen Oligonukleotide ist eine Funktion der vorgegebenen Gleichgewichts- Schmelztemperatur (T_m) und ihrer Basenzusammensetzung (%GC), also L_x(_{Tm = const.}) = f(_{Tm;
%GC}) [37, 38, 39, 40, 41 und 42] und beträgt

L_x(_{Tm = const.}) = 10 + n Nukleotide.
Das Auflösungsvermögen der Methode ist von der Länge L_x der Segmente, im folgenden als Sonden-Nukleinsäuren bezeichnet, abhängig. Je nach Gehalt an GC-Nukleotiden innerhalb der zu untersuchenden Sequenz variiert die Länge L_x der Sonden-Nukleinsäuren und damit das Auflösungsvermögen entlang der zu untersuchenden Sequenz. Das Auflösungsvermögen A des Verfahrens kann durch überlappende Segmente, die parallel zu einem ersten Satz von Segmenten auf einer festen Matrix immobilisiert werden bis auf ein Nukleotid gesteigert werden (A = L_x/n, wobei n = 1 → L_x).
Die der Basensequenz des zu untersuchenden Gens entsprechenden synthetischen Oligonukleotide (im folgenden als Sonden-Nukleinsäuren bezeichnet) werden an eine feste Matrix gebunden, vorzugsweise kovalent. Diese feste Matrix kann eine Fläche (DNA- Array), eine Faser oder die Oberfläche eines Micropartikels [45] sein, die aus Kunststoff (z. B. Polypropylen, Nylon), Polyacrylamid, Nitrocellulose oder Glas besteht. Die kovalente Verknüpfung der Oligonukleotidsonden mit der festen Matrix kann einerseits durch in situ Oligonukleotidsynthese [46, 47, 48 und 49] oder das Aufbringen modifizierter Oligonukleotide, die DNA, RNA oder PNA sein können, auf eine aktivierte Oberfläche [50, 51] erfolgen. Geräte zum Drucken von DNA-Arrays werden von einer Reihe von Anbietern hergestellt und vertrieben [57]. Die Synthese der Sonden-Nukleinsäuren erfolgt nach Protokollen, die im Bereich der Biotechnologie Laborstandard sind [52]. Die kovalent gebundenen Sonden-Nukleinsäuren sind in einer Reihenfolge entsprechend der Basensequenz des zu untersuchenden Gens in einer Weise angeordnet, daß ein DNA- Strang, der die Basensequenz des zu untersuchenden Gens trägt in 5'-3'-Richtung auf der Matrix nachgebildet (remodelliert) wird ("tiled array"). Die so auf der Matrix fixierten Sonden-Nukleinsäuren sind in drei Bereich aufgeteilt.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Sonden, von verschiedenen von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten, den festphasergebundenen Sonden (Array) und eine Auswertung der Hybridisierungsdaten.
Bereich A, Bereich B oder Bereich C enthält alle Sonden-Nukleinsc uren, deren Basensequenz identisch mit der Basensequenz des 5'-nichtkodierenden B ereiches (5'- NCR), des kodierenden Bereiches (CR) bzw. des 3'-nichtkodierenden Bereiches (3'-NCR) des zu untersuchenden Gens ist.
Die matrixgebundenen Sonden-Nukleinsäuren werden unter Bedingungen, die eine Duplexbildung durch Hybridisierung von komplementären, einzelsträngigen Nukleinsäuren ermöglichen, mit einzelsträngiger Proben-Nukleinsäure, die mRNA, cRNA oder cDNA [26] sein kann, in Kontakt gebracht. Wird als Proben-Nukleinsäure cDNA eingesetzt, ist die Basensequenz der Sonden-Nukleinsäuren identisch mit der des kodogenen Stranges (Sense-Strang) des zu untersuchenden Gens. Werden als Proben-Nukleinsäure mRNA oder cRNA eingesetzt, ist die Basensequenz der Sonden-Nukleinsäuren identisch mit der des nicht-kodogenen Stranges (Antisense-Strang) des zu untersuchender Gens. Zum Nachweis der Hybridisierungsereignisse können entweder die Proben-Nukleinsäuren radioaktiv, mit Fluorophoren oder Teilen eines Bindungspaares (Biotin, Streptavidin) [26] oder die Sonden-Nukleinsäuren mit Fluorophoren oder Teilen eines Bindungspaares (Biotin, Streptavidin) [27, 28] markiert werden.
Sequenzabschnitte des zu untersuchenden Gens, die nicht in der Basensequenz der von diesem Gen transkribierten mRNA-Varianten enthalten sind, hybridisieren nicht mit den festphasengebundenen Sonden-Nukleinsäuren (siehe Fig. 1). Diese Sequenzabschnitte umfassen Intron-Sequenzen, strangaufwärts vom individuellen Transkriptionsstart einer bestimmten mRNA-Variante gelegene Sequenzabschnitte des 5-NCR (Sondenbereich A) des zu untersuchenden Gens sowie Sequenzabschnitte im 3'-NCR (Sondenbereich C) des zu untersuchenden Gens, die strangabwärts vom 3'-Ende einer bestimmten mRNA- Variante liegen. Der kodierende Bereich aller mRNA-Varianten, die vom zu untersuchenden Gen transkribiert werden, hybridisiert mit den Sonden-Nukleinsäuren, deren Basensequenz identisch mit der des kodierenden Bereichs (Sondenbereich B) des zu untersuchenden Gens ist.
Die Signalintensität der in Sondenbereich B detektierbaren Hybridisierungs-Signale (I_B(CR)) sind gleich der Summe der Signalintensitäten der detektierbaren Hybridisierungs-Signale (Σ(I_(RNA1), I_(RNA2), . . ., I_(RNAn)) der einzelnen mRNA-Varianten, die von einem zu untersuchenden Gen transkribiert werden.

I_B(CR) = Σ(I_(RNA1), I_(RNA2), . . ., I_(RNAn))
In Sondenbereich A oder Sondenbereich C detektierbare Hybridisierungs-Signale (I_A(5'-NTR) oder I_C(3'-NTR)), welche die gleiche Signalintensität aufweisen, wie die in Sondenbereich B detektierbaren Hybridisierungs-Signale (I_B(CR)), entsprechen Sequenzmotiven außerhalb des kodierenden Bereiches, die in allen mRNA-Varianten, die von einem zu untersuchenden Gen transkribiert werden, enthalten sind.
Der Transkriptionsstart, der am weitesten strangaufwärts (in 5-Richtung) von der kodierenden Region entfernt liegt, wird durch die erste Sonden-Nukleinsäure in Sondenbereich A, die nach Hybridisierung mit Proben-Nukleinsäure ein detektierbares Hybridisierungs-Signal aufweist, angezeigt (¹I_A(1)). Wenn von diesem Transkriptionsstart aus nur eine mRNA-Variante transkribiert wird, dann ist

¹I_A(1) = I_B(CR),

wobei alle Sonden-Nukleinsäuren in Sondenbereich A Hybridisierungs-Signale der gleichen Intensität aufweisen, die gleich der Signalintensität der Hybridisierungs-Signale in Sondenbereich B sind. Es gilt:

¹I_A(1) = ¹I_A(2) = ¹I_A(3) = . . . = ¹I_A(n) = I_B(CR).
Um Schwankungen in der Intensität der Hybridisierungs-Signale in Sondenbereich A, B bzw. C auszugleichen und eine Fehlerbetrachtung (Standardabweichung, Mittelwertabweichung) der Meßwerte zu ermöglichen, wird der Durchschnittswert bzw. der Median der gemessenen Signalintensitäten berechnet:
(¹I_A(1) + ¹I_A(2) + ¹I_A(3) + . . . + ¹I_A(n))/n = ∅¹I_A = I_B(CR) = ∅I_B(n) = (I_B(1) + I_B(2) + I_B(3) + . . . + I_B(n))/n
Werden zusätzliche mRNA-Varianten von Startstellen transkribiert, die strangabwärts vom ersten Transkriptionsstart liegen, ist die Intensität der Hybridisierungssignale der vom ersten Transkriptionsstart transkribierten mRNA-Variante 1 in Sondenbereich A kleiner als die Signalintensitäten der Hybridisierungssignale in Sondenbereich B. Es gilt:

¹I_A(1) = ¹I_A(2) = ¹I_A(3) = . . . = ¹I_A(n) < I_B(CR), bzw.

(¹I_A(1) + ¹I_A(2) + ¹I_A(3) + . . . + ¹I_A(n))/n = ∅¹I_A < I_B(CR) = ∅I_B(n)
Die Position des nächsten (Transkriptionsstart 2), stromabwärts vom ersten Transkriptionsstart (Transkriptionsstart 1) gelegene Transkriptionsstarts wird durch die erste Sonden-Nukleinsäure in Sondenbereich A angezeigt (²I_A(1)), die nach Hybridisierung mit Proben-Nukleinsäure ein Hybridisierungs-Signal höherer Intensität aufweist, als die Sonden, die spezifisch mit der von Transkriptionsstart 1 aus transkribierten mRNA- Variante (RNA 1) hybridisieren. Werden von einem zu untersuchenden Gen zwei mRNA- Varianten von unterschiedlichen Transkriptionsstarts, also mit unterschiedlichen langen 5'- NTRs transkribiert, so ist:

²I_A(1) = I_B(CR),

wobei alle Sonden-Nukleinsäuren in Sondenbereich A, die spezifisch mit RNA 2 hybridisieren, Hybridisierungs-Signale der gleichen Intensität aufweisen, die gleich der Signalintensität der Hybridisierungs-Signale in Sondenbereich B sind. Es gilt:

²I_A(1) = ²I_A(2) = ²I_A(3) = . . . = ²I_A(n) = I_B(CR), bzw.

(²I_A(1) + ²I_A(2) + ²I_A(3) + . . . + ²I_A(n))/n = ∅²I_A = I_B(CR) = ∅I_B(n)
Da die Signalintensität der in Sondenbereich B detektierbaren Hybridisierungs-Signale (I_B(CR)) gleich der Summe der Signalintensitäten der detektierbaren Hybridisierungs-Signale (Σ(I_(RNA1), I_(RNA2), . . ., I_(RNAn)) der einzelnen von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten ist, gilt:

I_B(CR) = Σ(I_(RNA1), I_(RNA2), . . . , I_(RNAn))
Bezogen auf die Hybridisierungssignale in Sondenbereich A und B ergibt sich daraus:

I_B(CR) = ∅I_B(n) = ∅²I_A = Σ(I_(RNA1), I_(RNA2)), wobei

I_(RNA1) = (¹I_A(1)+ ¹I_A(2)+ ¹I_A(3)+ . . . + ¹I_A(n))/n = ∅¹I_A und

I_(RNA2) = [(²I_A(1) + ²I_A(2) + ²I_A(3) + . . . + ²I_A(n)) - (¹I_A(1) + ¹I_A(2) + ¹I_A(3) + . . . + ¹I_A(n))]/n = ∅²I_A - ∅¹I_A
Werden von einem zu untersuchenden Gen n mRNA-Varianten von n - 1 Startstellen transkribiert, die strangabwärts von einem ersten Transkriptionsstart liegen, ist die Intensität der Hybridisierungssignale der von allen Startstellen außer der letzten vor dem ersten Startkodon des kodierenden Bereiches transkribierten mRNA-Varianten in Sondenbereich A kleiner als die Signalintensitäten der Hybridisierungssignale in Sondenbereich B (siehe oben). Es gilt:

∅¹I_A, ∅²I_A, ∅³I_A, . . ., ∅^(n-1)I_A < ∅ⁿI_A = I_B(CR) = ∅I_B(n) = Σ(I_(RNA1), I_(RNA2), I_(RNA3), . . ., I_(RNAn)), wobei

I_(RNA1) = (¹I_A(1)+ ¹I_A(2)+ ¹I_A(3)+ . . . + ¹I_A(n))/n = ∅¹I_A,

I_(RNA2) = [(²I_A(1)+ ²I_A(2)+ ²I_A(3)+ . . . + ²I_A(n)) - (¹I_A(1)+ ¹I_A(2)+ ¹I_A(3)+ . . . + ¹I_A(n))]/n = ∅²I_A -∅¹I_A,

I_(RNA3) = [(³I_A(1)+ ³I_A(2)+ ³I_A(3)+ . . . + ³I_A(n)) - (²I_A(1)+ ²I_A(2)+ ²I_A(3)+ . . . + ²I_A(n))]/n = ∅³I_A - ∅²I_A

I_(RNAn) = [(ⁿI_A(1)+ ⁿI_A(2)+ ⁿI_A(3)+ . . . + ⁿI_A(n)) - (^n-1I_A(1)+ ^n-1I_A(2)+ ^n-1I_A(3)+ . . . + ^n-1I_A(n))]/n = ∅ⁿI_A - ∅^n-1I_A
Anhand der Hybridisierungsintensitäten kann der Anteil jeder mRNA-Variante an der Gesamtmenge der verschiedenen, von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten bestimmt werden.
Werden von einem zu untersuchenden Gen von einer Transkriptionsstartstelle aus zwei mRNA-Varianten transkribiert, die durch alternatives Spleißen der prä-mRNA entstehen, wird der Transkriptionsstart beider mRNA-Varianten durch die erste Sonden-Nukleinsäure in Sondenbereich A, die nach Hybridisierung mit Proben-Nukleinsäure ein detektierbares Hybridisierungs-Signal aufweist, angezeigt (¹I_A(1)). Die Intensität der Hybridisierungssignale entspricht der Summe der Intensitäten der beiden mRNA-Varianten (gespleißt: mRNAs und ungespleißt: mRNA) und ist gleich der Intensität der Hybridisierungssignale in Sondenbereich B.

¹I_A(1) = (¹I_A(1) + ¹I_A(2) + ¹I_A(3) + . . . + ¹I_A(n))/n = ∅¹I_A = I_B(CR) = Σ(I_(RNAS), I_(RNA))
Im Bereich der Spleißstelle ist die Intensität der Hybridisierungssignale (^1sI_A(1)) niedriger als die

(^1sI_A(1) + ^1sI_A(2) + ^1sI_A(3) + . . . + ^1sI_A(n))/n = ∅^1sI_A < ∅¹I_A = I_B(CR) = Σ(I_(RNAS), I_(RNA))

I_(RNAS) = (^1sI_A(1) + ^1sI_A(2) + ^1sI_A(3) + . . . + ^1sI_A(n))/n = ∅^1sI_A

I_(RNA) = [(¹I_A(1)+ ¹I_A(2)+ ¹I_A(3)+ . . . + ¹I_A(n)) - (^1sI_A(1) + ^1sI_A(2) + ^1sI_A(3) + . . . + ^1sI_A(n))]/n = ∅¹I_A- ∅^1sI_A
Ob in den Sondenbereichen A bzw. C die gesamte zu untersuchende genomische Sequenz durch Sonden-Nukleinsäuren repräsentiert/remodelliert werden muß, oder nur die Sequenzbereiche, die Transkriptionsstarts und Spleißstellen flankieren, hängt vom Einsatzbereich von Komponente 1 ab. Soll die Expression bekannter mRNA-Varianten, die von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribiert werden, gemessen werden, muß in Sondenbereich A bzw. C nur die zur Identifizierung und Quantifizierung der einzelnen mRNA-Varianten notwendige Anzahl von Sonden-Nukleinsäuren immobilisiert werden. Sollen mit Hilfe von Komponente 1 neue mRNA-Varianten identifiziert werden oder die Sekundärstruktur einer mRNA aufgeklärt werden, müssen Sondenbereich A bzw. C die gesamte zu untersuchenden genomische Sequenz repräsentieren. Der DNA-Array kann noch einen weiteren Bereich enthalten, der Sonden- Nukleinsäuren enthält, die spezifisch mit einer Auswahl von mRNAs von Housekeeping Genen und mit einer Auswahl von Plasmiden, bakteriellen oder pflanzlichen RNAs hybridisieren. Dieser Sondenbereich dient zum einen zur Normierung der Hybridisierungssignale in Sondenbereich A, B, und C und zur Kontrolle der Stringenz der Hybridisierung.

Hybridisierung des DNA-Arrays

In einer weiteren Ausführungsform wird aus gesamt-RNA oder polyA⁺-mRNA markierte cDNA unter Verwendung von Oligo-dT oder p(dN)₆ als Starteroligonukleotid durch reverse Transkription synthetisiert. Die enzymatische Synthese von cDNA durch Reverse Transkriptase ist im Bereich der Biotechnologie Laborstandard [26]. Die Reverse Transkription von Proben-RNA wird in Anwesenheit von dNTPs durchgeführt, die mit einer nachweisbaren Gruppe, vorzugsweise einer Fluorophore oder einem Teil eines Bindungspaares, konjugiert sind. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, isolierte mRNA durch reverse Transkription in doppelsträngige cDNA zu konvertieren und aus dieser durch in vitro Transkription in Anwesenheit von rNTPs, die mit nachweisbaren Gruppen konjugiert sind, markierte cRNA zu synthetisieren [26, 53].
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die auf dem DNA-Array immobilisierten Sonden markiert. Diese Markierung kann eine- oder mehrere Fluorophoren oder Teil eines Bindungspaares sein. Nach der Hybridisierung des Arrays mit unmarkierter gesamt-RNA, polyA⁺-mRNA, cRNA oder cDNA und den anschließenden Waschschritten werden nicht hybridisierte (einzelsträngige) Sonden-Nukleinsäuren enzymatisch vom Array entfernt und die Menge der auf dem Array verbliebenen Sonden-Nukleinsäuren wird gemessen [28].
Zur Fluoreszenzmarkierung der Proben- bzw. Sonden-Nukleinsäuren können eine Reihe von Fluorophoren, wie z. B. Fluorescein, Lissamin, Phycoerythrin, Rhodamin (Perkin Elmer Cetus), Cy2, Cy3, Cy 3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX (Amersham), eingesetzt werden [53]. Neben den hier aufgeführten Fluorophoren können auch andere, hier nicht aufgeführte Fluorophoren, zur Markierung eingesetzt werden. Diese umfassen sämtliche Fluorophoren, die kovalent mit Nukleinsäuren verknüpft werden können und deren Anregungs- und Emissionsmaxima im Infrarotbereich, im sichtbaren Bereich oder im UV- Bereich des Spektrums liegen. Werden Proben- bzw. Sonden Nukleinsäure mit Teilen eines Bindungspaares wie Biotin oder Digoxigenin markiert, wird nach Hybridisierung der mit einer detektierbaren Markierung konjugierte zweite Teil des Bindungspaares (Streptavidin oder anti-Digoxigenin AK) mit den Hybriden inkubiert. Die detektierbare Markierung des zweiten Teils des Bindungspaares kann eine Fluorophore oder ein Enzym (alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase u. a.) sein, das ein Substrat unter Lichtemission (Chemiluminseszenz oder Chemifluoreszenz) umsetzt [54, 55].
Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen werden so eingestellt, daß die Proben- Nukleinsäuren an eine bestimmte, an eine feste Matrix immobilisierte Sonden- Nukleinsäure spezifisch binden, bzw. mit dieser Sonden-Nukleinsäure spezifisch hybridisieren kann. Das heißt, die Proben-Nukleinsäure bindet, hybridisiert oder bildet eine Duplex mit einer immobilisierten Sonden-Nukleinsäure, die eine zur Proben-Nukleinsäure komplementäre Sequenz hat und nicht an eine immobilisierte Sonden-Nukleinsäure die eine nicht komplementären Basensequenz hat. Eine Polynukleotidsequenz wird in diesem Zusammenhang als komplementär zu einer anderen bezeichnet, wenn ein Hybrid aus zwei Polynukleotiden, von denen das kürzere (die Sonden-Nukleinsäure) maximal 25 N lang ist, über die gesamte Länge des kürzeren Polynukleotids nach den Standardregeln für die Basenpaarung keine Basenfehlpaarungen (Mismatches) aufweist. Des weiteren darf ein Hybrid aus zwei Polynukleotiden, in dem das kürzere der beiden Polynukleotide länger als 25 N ist, nach den Standardregeln für die Basenpaarung nicht mehr als 5% Mismatches enthalten. Vorzugsweise sind die Polynukleotide perfekt zueinander komplementär; Das Hybrid enthält keine Mismatches. Die optimalen Hybridisierungsbedingungen sind zum einen von Länge und Typ der auf einer festen Matrix immobilisierten Sonden (DNA, RNA, PNA) sowie vom Typ der eingesetzten Proben-Nukleinsäuren (DNA oder RNA) abhängig. Allgemein gültige Parameter für eine spezifische (d. h. stringente) Hybridisierung werden in gängigen Handbüchern und Protokollen zu Hybridisierung von Nukleinsäuren beschrieben [26, 56].

Signaldetektion

Werden zum Nachweis von Hybridisierungsereignissen auf dem DNA-Array aus Komponente 1 mit Fluorophoren markierte Sonden- bzw. Proben-Nukleinsäuren eingesetzt, kann die Fluoreszenzemission an jedem Probenpunkt (Spot) vorzugsweise durch konfokale Laser scanning Mikroskopie gemessen werden. Der Nachweis von Hybridisierungsereignissen in Nukleinsäuren durch Chemolumineszenz bzw. Chemofluoreszenz kann unter Verwendung geeigneter Filter und Detektoren ebenfalls mit Geräten, die nach dem Prinzip des konfokalen Laser scanning Mikroskops funktionieren, durchgeführt werden. Geräte zur Signaldetektion auf Biochips werden von einer Reihe von Herstellern entwickelt und vertrieben [57].

Komponente 2

Datenbank & Analyse

Komponente 2 des Systems besteht vorzugsweise aus einem Datenbank- und einem Analysemodul. Die Datenbank enthält Daten zur Translationseffizienz sämtlicher mRNA- Varianten, die von Genen, deren Expression auf Ebene der Translation reguliert wird, transkribiert werden. Die im Datenbankmodul organisierten Daten beschreiben beispielsweise den Einfluß des 5'-NTR, den Einfluß des kodierenden Bereiches und des 3'-NTR, sowie den Einfluß des Zelltyps, Gewebes oder Organismus auf die Translationseffizienz verschiedener von einem oder mehreren Genen transkribierten mRNA-Varianten. Weitere Datensätze können die Wirkung von äußeren Einflüssen auf die Translationseffizienz der zu untersuchenden mRNA-Varianten beschreiben. Diese äußeren Einflüsse können unter anderem eine Änderung des Sauerstoffpartialdrucks, der Nahrungsmittelzufuhr, der Temperatur, des Luftdrucks sowie die Wirkung von Cytokinen, Hormonen, Cytostatika oder anderen Wirkstoffe umfassen. Die von translationskontrolliert exprimierten Genen transkribierte, in verschiedenen Zelltypen, Geweben oder Organismen präferentiell translatierte mRNA-Variante ist ebenfalls Bestandteil des Datenbankmoduls von Komponente 2.

Datenaquisition

Identifikation von Genen, die translationskontrolliert exprimiert werden

Von translationskontrolliert exprimierten Genen werden mehrere mRNA-Varianten mit identischen kodierenden Regionen transkribiert, die sich in Länge und Basensequenz ihrer 5'-NTRs bzw. 3'-NTRs unterscheiden. Um die jeweilige Menge der von einem Gen transkribierten unterschiedlichen mRNA-Varianten und die in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus präferentiell translatierte mRNA-Variante bestimmen zu können, müssen die Transkriptionsstartstellen, Spleißvarianten, die Anzahl der von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten, die in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus transkribierte Menge der mRNA-Varianten sowie die Translationseffizienz der einzelnen mRNA-Varianten bekannt sein.
Die in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus genutzten Transkriptionsstarts in der 5'- nichtkodierenden Region eines zu untersuchenden Gens werden mit Hilfe von Nuklease Protektion Assays, PCR-Verfahren oder Hybridisierung mit DNA-Arrays (Komponente 1) [26] identifiziert und lokalisiert. Die Kartierung von Spleißstellen, also Intron-Exon- Übergängen im Bereich des 5'-NTR bzw. des 3'-NTR der zu untersuchenden mRNA erfolgt durch Nuklease Protektion Assays, PCR-Verfahren oder Hybridisierung mit DNA Arrays (Komponente 1) [26]. Die Basensequenz der Hybridisierungssonden, die in einem Nuklease-Protection Assay zur Untersuchung des bzw. der Transkriptionsstarts sowie der Spleißvarianten eines zu untersuchenden Gens eingesetzt werden, entspricht der Basensequenz des zu untersuchenden Gens. Aus zu untersuchenden Zelltypen, Geweben bzw. Organismen wird zelluläre gesamt-RNA [26, 36] bzw. polyA⁺-mRNA isoliert [26, 43] und mit den markierten Sonden, die cDNA oder cRNA sein können, hybridisiert. Der Verdau einzelsträngiger Bereiche in den Hybriden sowie die gelelekirophoretische Auftrennung der enstehenden Fragmente [26, 44] erfolgen nach Protokollen, die im Bereich der Biotechnologie Laborstandard sind. Zur Kartierung von Transkriptionsstarts und Spleißstellen im 5'-nichtkodierenden Bereich bzw. im 3'-nichtkodierenden Bereich eines zu untersuchenden Gens durch PCR-Verfahren (RT-PCR) wird aus zu untersuchenden Zelltypen, Geweben bzw. Organismen zelluläre gesamt-RNA [26, 36] bzw. polyA⁺-mRNA isoliert [26, 43] und durch reverse Transkription in cDNA umgeschrieben [26]. Die PCR-Primer sind Oligodesoxynukleotide, mit denen spezifisch Fragmente amplifiziert werden, die den 5'-Anteil des kodierenden Bereiches und den 5'- Nichtkodierenden Bereiches des zu untersuchenden Gens sowie den kodierenden Bereich und den 5'-NTR der von diesem Gen transkribierten mRNA-Varianten repräsentieren. Soll der 3'-NTR der von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten kartiert werden, werden PCR-Primer eingesetzt, mit denen Fragmente amplifiziert werden können, die den 3'-Anteil der kodierenden Region und den 3'-nichtkodierenden Bereich des zu untersuchenden Gens bzw. der von diesem Gen transkribierten mRNA-Varianten repräsentieren. Zur Bestimmung von mRNA-Varianten, die sich in der Basensequenz des 5'-NTR unterscheiden, werden ein oder mehrere 3'-Primer (3'-Primer binden an das 3'- Ende des zu amplifizierenden DNA-Fragments) in den 5'-Bereich der kodierenden Region des zu untersuchenden Gens gelegt. Die Population von 5'-Primern (5'-Primer binden an das 5'-Ende des zu amplifizierenden DNA-Fragments) erstreckt sich vom Beginn des kodierenden Bereiches bis über den ersten Transkriptionsstartpunkt des zu untersuchenden Gens. Positionen und Sequenz der 5'-Primer sind so gewählt, daß zusammen mit einem 3'-Primer jeweils Fragmente amplifiziert werden, deren Länge vom ersten Primerpaar im kodierenden Bereich an, immer um jeweils 30-60 bp zunimmt. Um mit einem 3'-Primer die Transkriptionsstartpunkte und eventuell vorhandene Spleißstellen im 5'-Bereich eines zu untersuchenden Gens über einen Bereich von 2.000 bp kartieren zu können, werden, je nach Auflösung, zwischen 35 und 70 korrespondierende 5'-Primer benötigt. Die Reaktionen werden mit genomischer DNA bzw. Plasmiden die die notwendigen Bereiche des Gens enthalten, sowie mRNA aus zu untersuchenden Zellen, Geweben oder Organismen durchgeführt. Durch Vergleich der Fragmentgröße- und Menge können Transkriptionsstartpunkte sowie Spleißstellen identifiziert werden.
Quantitative Bestimmung der von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA- Varianten.
Der Anteil jeder einzelnen mRNA-Variante an der Gesamtmenge der von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA Varianten wird durch quantitative PCR- Verfahren (TaqMan® oder Molecular Beacons [58, 59]), Multiprobe Nuklease Protektion Assays, oder DNA-Arrays (Komponente 1) [26] bestimmt. Die PCR-Primer entsprechen denen, die zur Identifikation der von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribierten mRNA-Varianten eingesetzt werden. Zur quantitativen Bestimmung werden TaqMan®-Sonden oder Molecular Beacons [58, 59] eingesetzt, mit denen die verschiedenen mRNA-Varianten an Hand ihrer jeweiligen 5'-NTRs spezifisch nachgewiesen und quantifiziert werden. Des weiteren werden PCR-Primer und TaqMan®- Sonden bzw. Molecular Beacons eingesetzt, mit denen spezifisch eine Auswahl von Housekeeping Genen nachgewiesen wird. Als Matrize wird cDNA eingesetzt, die durch reverse Transkription von zellulärer gesamt-RNA [26, 36] bzw. polyA⁺-mRNA synthetisiert wird [26]. Die in einem Multiprobe-Nuklease Protektionsassay eingesetzten Hybridisierungssonden, die cDNA oder cRNA sein können, sind unterschiedlich lang, so daß sie durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese [26] gut voneinander zu unterscheiden sind. Die Nukleotidsequenz der Hybridisierungssonden ist komplementär zur Nukleotidsequenz des 5'-NTR der verschiedenen zu untersuchenden mRNA-Varianten sowie zur kodierenden Sequenz der mRNA einer Auswahl von Housekeeping-Genen. Die quantitativen PCRs und die Multiprobe-Nuklease-Protektionsassays werden nach Protokollen durchgeführt, die im Bereich der Biotechnologie Laborstandard sind. Vorzugsweise wird die Transkriptionsrate der von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribierten mRNA-Varianten durch Hybridisierung zellulärer gesamt-RNA, polyA⁺-mRNA oder markierter cDNA mit Komponente 1 (DNA-Array) des Systems durchgeführt (siehe oben). Die mit den genannten Methoden ermittelten Transkriptionsraten der von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribierten mRNA-Varianten werden gegen die Transkriptionsrate eines oder mehrerer Housekeeping Gene, wie z. B. β-Actin, GAPDH, L32 normiert. Die quantitative Bestimmung der mRNA-Varianten, die in verschiedenen Zelltypen, Geweben oder Organismen von translationskontrolliert exprimierten Genen transkribiert werden, erfolgt vorzugsweise mit dem DNA-Array von Komponente 1 des Systems. Der DNA Array wird mit zellulärer gesamt-RNA, polyA⁺-mRNA bzw. markierter cDNA hybridisiert, die aus zu untersuchenden Zellen isoliert wurde. Als Basis dienen hier die im NCl-60 Panel [35] enthaltenen Zellinien, die sehr umfassend charakterisiert sind. Des weiteren wird in klinischen Proben und anderen etablierten Zellinien die Transkription der mRNA-Varianten von translationskontrolliert exprimierten Genen bestimmt.

Bestimmung der in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus präferentiell translatierten MRNA-Varianten

Die Änderung der Transkriptionsrate der von einem oder mehreren Genen transkribierten mRNA-Varianten und die Änderung der Expressionsrate der entsprechenden Proteine werden üblicheweise in Abhängigkeit von verschiedenen äußeren Einflüssen gemessen. Diese äußeren Einflüsse umfassen unter anderem eine Änderung des Sauerstoffpartialdrucks, der Nahrungsmittelzufuhr, der Temperatur, des Luftdrucks sowie die Wirkung von Cytokinen, Hormonen, Cytostatika oder anderen Wirkstoffen. Durch Vergleich der Transkriptions- bzw. Expressionsrate eines oder mehrerer zu untersuchender Gene in Zellen, Geweben oder Organismen, die unter idealen Wachstumsbedingungen kultiviert wurden, mit der in Zellen, die einem oder mehreren der oben genannten äußeren Einflüsse ausgesetzt waren, wird die Änderung der Transkriptions- bzw. Expressionsrate in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen bestimmt. Zelluläre gesamt-RNA bzw. polyA⁺-mRNA wird aus zu untersuchenden Zelltypen, Geweben oder Organismen isoliert. Die Transkriptionsrate der von einem oder mehreren zu untersuchenden mRNA-Varianten wird durch quantitative RT-PCR. Multiprobe- Nuklease-Protektionsassays oder vorzugsweise mit Hilfe des oben beschriebenen DNA- Arrays (Komponente 1) bestimmt (siehe oben). Die Expressionsrate der entsprechenden Gene erfolgt durch Messung der Konzentration der entsprechenden Proteine durch Immunchemische Verfahren wie Westernblot, Immunpräzipitation oder ELIZA [65, 66 und 67]. Da allgemein akzeptiert ist, daß die Kontrolle der Translation hauptsächlich während der Initiationsphase stattfindet [29, 34], ist die in einem Zelltyp, Gewebe oder Organismus nachweisbare Proteinmenge direkt zur Menge der entsprechenden mRNA-Varianten proportional. Die mRNA-Variante, deren Transkriptionsrate in Abhängigkeit von äußeren Einflüssen mit der Expressionsrate des entsprechenden Proteins übereinstimmt, ist die in einem bestimmten Zelltyp, Gewebe oder Organismus präferentiell translatierte mRNA. Welche der von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten präferentiell translatiert wird, ist neben der Sequenz des 5'-NTR der mRNA-Varianten abhängig von zell-, gewebe- oder organismusspezifisch exprimierten Faktoren, welche die Initiation der Translation beeinflussen. Die quantitative Bestimmung der mRNA-Varianten, die in verschiedenen Zelltypen, Geweben oder Organismen von translationskontrolliert exprimierten Genen transkribiert werden, erfolgt vorzugsweise mit dem DNA-Array von Komponente 1 des Systems. Der DNA Array wird mit zellulärer gesamt-RNA, polyA⁺- mRNA bzw. markierter cDNA hybridisiert, die aus zu untersuchenden Zellen isoliert wurde. Die Menge der von den mRNA-Varianten translatierten Proteine wird mit Hilfe immunchemischer Standardmethoden bestimmt. Als Basis dienen hier die im NCl-60 Panel [35] enthaltenen Zellinien, die sehr umfassend charakterisiert sind. Des weiteren wird in klinischen Proben und anderen etablierten Zellinien die Transkription der mRNA- Varianten von translationskontrolliert exprimierten Genen sowie die Expression dieser Gene bestimmt.

Bestimmung der Translationseffizienz der verschiedenen, von einem zu untersuchenden Gen transkribierten mRNA-Varianten

Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Proteinsynthese ist die Initiation. Die Anlagerung von Initiationsfaktoren, der ribosomalen Untereinheiten und die Migration des vollständigen Ribosoms zum ersten Startkodon des Offenen Leserahmens ist im wesentlichen von Länge und Struktur, also letztendlich von der Basensequenz des 5'-NTR der zu untersuchenden mRNA abhängig. Die Bestimmung der Translationseffizienz der verschiedenen, von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen transkribierten mRNA-Varianten erfolgt durch Reportergen Assays. Die 5'-NTRs der verschiedenen von einem oder mehreren zu untersuchenden Genen translatierten mRNAs werden mit Hilfe der reverse Transkriptase PCR [26] aus gesamt-RNA oder polyA⁺-mRNA oder mit Hilfe einer PCR aus cDNA-Banken [26] amplifiziert und isoliert. Die PCR-Primer werden so gewählt, daß das 5'-Nukleotid des 3'-Primers dem letzten Nukleotid des 5'-NTR vor dem Startkodon des kodierenden Bereiches entspricht. Der korrespondierende 5'-Primer liegt so nah wie möglich am Transkriptionsstart der zu untersuchenden mRNA-Variante. In den 5'-Bereich der PCR-Primer können Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen integriert sein, um die Ligation der Fragmente in einen geeigneten Reportergenvektor (pGL3 basic u. a.; Promega) zu erleichtern [26]. Es werden verschiedene Systeme eingesetzt, mit deren Hilfe unter anderem auch der Einfluß der kodierenden Region auf die Translationseffizienz der zu untersuchenden mRNA-Varianten bestimmt werden kann.

Messung der Translationseffizienz in Kaninchenretikulozytenlysat

Die verschiedenen zu untersuchenden 5'-NTRs werden mit Hilfe der PCR amplifiziert und in einen Plasmidvektor (pGL-3/T7) zwischen das 3'-Ende des T7-Promoters und das 5'-Ende des für photinas pyralis Luciferase kodierenden Gens ligiert [68, 69]. Protokolle zur Transfektion und Vermehrung von Plasmidvektoren in geeigneten E.coli Wirtsstämmen sowie zur Isolierung der Plasmid-DNA aus den Wirtsorganismen sind im Bereich der Biotechnologie Laborstandard [26]. Der Plasmidvektor wird am 3'-Ende Luciferasegens mit Hilfe einer geeigneten Restriktionsendonuklease aufgeschnitten. Die linearisierte Plasmid-DNA wird als Matrize in einer in vitro Transkriptionsreaktion eingesetzt, die von einer phagenkodierten RNA-Polymerase katalysiert wird (T7-, T3- oder SP6-RNA-Polymerase) [26]. Durch Zugabe eines Cap-Analogons [Boehringer Mannheim] zur in vitro Transkriptionsreaktion kann eine mRNA synthetisiert werden, die eine 5'-cap Struktur trägt. Aus den in vitro synthetisierten photinas pyralis Luciferase-mRNA-Varianten wird mit Hilfe eines in vitro Translationssystems (Rabbit Reticulocyte Lysate) das Enzym photinas pyrelis Luciferase synthetisiert. Es werden äquimolare Mengen der verschiedenen photinas pyrelis Luciferase-mRNA, die die zu untersuchenden 5'-NTRs tragen, in die in vitro Translation eingesetzt. Die Luciferaseaktivität in den verschiedenen Ansätzen wird in einem Luminometer bestimmt [26, 70]. Als Basiswert (100%) für alle Messungen dient die Luciferaseaktivität von in vitro-Translationsansätzen, in denen photinas pyralis LuciferasemRNA translatiert wurde, deren 5'-NTR ausschließlich eine Kozak-Konsensus-Sequenz beinhaltet [7, 8]. Durch diese Messungen wird der Einfluß der verschiedenen zu untersuchenden 5'-NTRs auf die Translation einer mRNA in vitro bestimmt. Durch Variation der Versuchsparameter kann ermittelt werden, ob eine zu untersuchende mRNA unabhängig von einer 5'-cap-Struktur translatiert werden kann, also ob der 5'-NTR dieser mRNA ein IRES Element enthält. Zur Untersuchung der Abhängigkeit der Translationseffizienz von einer 5'-cap Struktur wird die Translationseffizienz einer mRNA, die einen bestimmten 5-NTR und eine 5'-Cap-Struktur trägt mit der Translationseffizienz einer mRNA, die den gleichen 5-NTR aber keine 5'-cap Struktur trägt, verglichen. Um ein mögliches IRES-Element im 5'-Bereich einer zu untersuchenden mRNA zu identifizieren, wird in die oben genannten Reportergenvektoren zwischen das 3'-Ende des T7-Promoters und das 5'-Ende des zu untersuchenden 5'-NTRs ein DNA-Fragment ligiert, das eine stabile Haarnadelschleife ausbilden kann. Setzt man diese Plasmid-DNA als Matrize in einer in vitro Transkriptionsreaktion ein, so wird eine mRNA synthetisiert, die eine stabile Haarnadelstruktur am 5'-Ende trägt. Diese Struktur verhindert sehr effektiv die Initiation der Translation gemäß dem ribosome scanning model [1]. Es wird das Verhältnis der Translationseffizienz von mRNAs, die einen bestimmten 5-NTR und eine 5'- Haarnadelstruktur tragen zur Translationseffizienz von mRNAs, die diesen 5'-NTR aber keine 5'-Haarnadelstruktur tragen, gebildet. Ist dieses Verhältnis größer als 1, kann die Translation dieser mRNA durch internen Ribosomeneintritt initiiert werden. Die Ermittlung der Translationseffizienz bestimmter mRNAs durch in vitro Translation und anschließende Bestimmung eines Reportergens liefert die Basisdaten zu Translationseffizienz einer oder mehrerer zu untersuchender mRNA-Varianten. In diesem Meßsystem wird nicht der spezifischen Einfluß verschiedener Zelltypen, Gewebe oder Organismen, auf die Translationseffizienz zu untersuchender mRNAs berücksichtigt.

Messung der Translationseffizienz in vivo

Um den Einfluß zellulärer Faktoren auf die Translationseffizienz einer oder mehrerer zu untersuchender mRNAs in Abhängigkeit von Zelltyp, Gewebe oder Organismus zu untersuchen, werden eukaryonte Expressionsvektoren, die den 5'-NTR der zu untersuchenden mRNA-Variante am 5'-Ende eines Markergens enthalten, in kultivierte Zellen, Gewebeproben oder Organismen transfiziert. Soll die Translationseffizienz von Reportergen-mRNAs, die unterschiedliche 5'- NTRs tragen, in Abhängigkeit von verschiedenen Zelltypen, Geweben oder Organismen untersucht werden, sind die Reportergenkonstrukte wie folgt gestaltet. Zwischen das 3'- Ende eines viralen Promoters (CMV, RSV oder SV40 Promoter) und das 5'-Ende des kodierenden Bereichs eines Reportergens (photinas pyralis Luciferase, renilla reniformis Luciferase, Chloramphenico) Transferase (CAT), β-Galactosidase, GFP oder andere) wird der 5'-NTR einer zu untersuchenden mRNA ligiert. Dieses Expressionskonstrukt wird in kultivierten Zellen, Gewebeproben oder Organismen exprimiert. Um Schwankungen in der Transfektionseffizienz auszugleichen, wird ein weiteres Reportergenkonstrukt kotransfiziert. Hier bietet sich das Dual-Luciferase System (Promega) an, da mit diesem System sowohl die eigentliche Messung (photinas pyralis Luciferase) als auch die Expression des Kontrollkonstruktes (renilla reniformis Luciferase) in einem Ansatz durchgeführt werden kann [71, 72]. Die Luciferaseaktivität in den verschiedenen Ansätzen wird in einem Luminometer bestimmt [Luciferase Assay, Promega, 26]. Als Basiswert (100%) für alle Messungen dient die Luciferaseaktivität in Ansätzen, die Lysate von Zellen, Geweben oder Organismen enthalten, die mit einem Reportergenvektor transfiziert wurden, der für eine photinas pyralis Luciferase-mRNA kodiert, deren 5'-NTR ausschließlich eine Kozak-Konsensus-Sequenz beinhaltet [7, 8]. Durch Vergleich der Translationseffizienz einer oder mehrerer zu untersuchender mRNAs in vitro und in vivo wird der Einfluß zellulärer Faktoren, die in einem bestimmten Zelltyp, Gewebe oder Organismus exprimiert werden, auf die Translation einer zu untersuchenden mRNA bestimmt. Faktoren, welche die CAP-abhängige und die CAP-unabhängige Translation verschiedener mRNAs beeinflussen, umfassen Translations-Initiationsfaktoren [60, 61], Tumorsuppressoren wie p53 [62, 63] und eine Reihe anderer Proteine [64, 65].
Der gemeinsamen Einfluß des 5'-NTR und der kodierenden Region auf die Translationseffizienz einer zu untersuchenden mRNA kann nicht durch Reportergen Assays bestimmt werden, in denen die Expressionsrate an Hand der enzymatischen Aktivität eines Reporterproteins gemessen wird. Ein Fusionsprotein, dessen aminoterminale Hälfte aus einem zu untersuchenden Protein und dessen carboxyterminale Hälfte aus einem Reporterprotein besteht, ist oft anders gefaltet, als die beiden nichtfusionierten Proteine. Daher ist die enzymatische Aktivität des Reporterproteinanteils in Fusionsproteinen von dem Protein abhängig, mit dem das Reporterprotein fusioniert ist. Um diese Probleme zu umgehen wird das zu untersuchende Protein am Carboxyterminus mit einem kurzen Markerpeptid fusioniert. Dieses Markerpeptid kann unter anderem ein CBP-Tag (Calmodulin bindendes Peptid; Stratagene), FLAG-Tag (Sigma-Aldrich) oder ein His-Tag (5-7 Histidinreste hintereinander) [73, 74] sein. Die zu untersuchenden mRNA- Varianten, die von einem oder mehreren Genen transkribiert werden, werden mit Hilfe der RT-PCR [26] amplifiziert und isoliert. Das 5'-Ende der verwendeten 5'-Primer entspricht dem 5'-Ende der verschiedenen 5'-NTRs und die verwendeten 3'-Primer entsprechen dem 3'-Ende, also dem letzten Kodon in der kodierenden Region der zu untersuchenden mRNA (das Stop-Kodon wird weggelassen). Die PCR-Produkte werden in ein Expressionsplasmid zwischen das 3'-Ende eines viralen Promoters (CMV, RSV, SV40 und andere) und das 5'-Ende der für das Markerpeptid kodierenden Sequenz ligiert, so daß die kodierende Region der zu untersuchenden mRNA mit der für das Markerpeptid kodierenden Sequenz fusioniert wird. Die Plasmidvektoren zur Expression der oben beschriebenen Fusionsproteine sind kommerziell erhältlich (Qiagen. Clontech, Stratagene). Die Transfektion von E.coli Wirtsstämmen mit den Plasmiden, die Vermehrung der Plasmide sowie die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgt nach Protokollen die im Bereich der Biotechnologie Laborstandard sind [26]. Verschiedene zu untersuchende Zelltypen, Gewebe oder Organismen werden mit den oben beschriebenen Expressionskonstrukten, welche die cDNA-Sequenz des 5'-NTR und der kodierenden Region der verschiedenen, von einem oder mehreren Genen transkribierten mRNA- Varianten enthalten, transfiziert. Zur Bestimmung der Transfektionseffizienz wird ein Reportergenplasmid, das photinas pyralis Luciferase oder renilla reniformis Luciferase exprimiert, kotransfiziert. Die Translationseffizienz der verschiedenen, von Expressionsplasmiden exprimierten mRNA-Varianten wird durch Westernblot oder Slotblot Verfahren bestimmt [65, 66].
Die Fusionsproteine werden mit Hilfe eines Antikörpers oder Proteins, das spezifisch das Markerpeptid bindet, nachgewiesen. Der quantitative Nachweis von Proteinen erfolgt nach Protokollen, die im Bereich der Biotechnologie Laborstandard sind. Als Basiswert (100%) für alle Messungen dient die nachweisbare Menge an Fusionsprotein in Ansätzen, die Lysate von Zellen, Geweben oder Organismen enthalten, die mit einem Expressionskonstrukt transfiziert wurden, das die cDNA-Sequenz einer zu untersuchenden mRNA-Variante trägt, deren 5'-NTR ausschließlich eine Kozak-Konsensus-Sequenz beinhaltet [7, 8]. Durch Vergleich der Translationseffizienz von Reportergen-mRNAs, die den 5'-NTR von zu untersuchenden mRNA-Varianten tragen, die von einem oder mehreren Genen transkribiert werden, mit der Translationseffizienz der vollständigen mRNA-Varianten wird neben dem Einfluß des 5'-NTR und zellulärer Faktoren auf die Translation einer zu untersuchenden mRNA zusätzlich der Einfluß der Sequenz des kodierenden Bereiches auf die Translation der zu untersuchenden mRNA-Variante bestimmt. Um die Translationseffizienz der zu untersuchenden mRNA-Varianten unter verschiedenen äußeren Einflüssen zu bestimmen, werden die gleichen Expressionskonstrukte wie oben beschrieben verwendet. Der Nachweis der Translationseffizienz der zu untersuchenden mRNA Varianten erfolgt über die Messung der enzymatischen Aktivität eines Reportergens oder den immunchemischen Nachweis eines mit einem Markerpeptid fusionierten Proteins (siehe oben). Die mit Expressionsplasmiden transfizierten Zellen werden verschiedenen äußeren Einflüssen ausgesetzt, die unter anderem eine Änderung des Sauerstoffpartialdrucks, der Nahrungsmittelzufuhr, der Temperatur, des Luftdrucks sowie die Wirkung von Cytokinen, Hormonen, Cytostatika oder anderen Wirkstoffen umfassen können. Die hier beschriebenen Messungen werden in den im NCl-60 Panel [35] enthaltenen Zellinien durchgeführt, die sehr umfassend charakterisiert sind. Des weiteren wird in klinischen Proben und anderen etablierten Zellinien die Translationseffizienz zu untersuchender mRNA-Varianten bestimmt.

Messung der Wirkung von äußeren Einflüssen auf Zelluläre Funktionen wie Wachstum, Apoptose oder Proliferation

Die Wirkung äußerer Einflüsse auf zu untersuchende Zellen, Gewebe oder Organismen wird an Hand einer Reihe von Parametern bestimmt, die unter anderem die Apoptoserate, die Proliferationsrate und das Zellwachstum umfassen können. Die hier genannten äußeren Einflüsse können unter anderem eine Änderung des Sauerstoffpartialdrucks, der Nahrungsmittelzufuhr, der Temperatur, des Luftdrucks sowie die Wirkung von Cytokinen, Hormonen, Cytostatika oder anderen Wirkstoffen umfassen. Zu untersuchende Zellen, Gewebe oder Organismen werden in Kultur gehalten und einem oder mehreren bestimmten äußeren Einflüssen 24 h-48 h ausgesetzt. Zur Bestimmung der Wirkung unterschiedlich hoher Dosen des zu untersuchenden äußeren Einflusses werden unter anderem Zellwachstum, Apoptoserate und/oder Proliferationsrate in den behandelten Zellen bestimmt. Die Bestimmung der Wachstums-, Proliferations- und/oder Apoptoserate in Kulturzellen erfolgt nach Protokollen, die im Bereich der Biotechnologie bzw. Zellbiologie Laborstandard sind [75, 76, 77, 78 und 79] Durch Extrapolation Wachstums-, Apoptose- bzw. Proliferationsrate bei verschieden hohen Dosen eines oder mehrerer äußerer Einflüsse auf ein oder mehrere Zelltypen, Gewebes oder Organismen wird die Menge eines äußeren Einflusses ermittelt, die beispielsweise das Zellwachstum um 50% inhibiert (Gl₅₀-Wert → Growth Inhibition) [35]. Bezogen auf die Apoptoserate oder die Proliferation wird die Dosis eines äußeren Einflusses ermittelt, bei der in 50% der untersuchten Zellen die Apoptose ausgelöst wird (Al₅₀-Wert → Apoptosis Induction) bzw. die Proliferation um 50% inhibiert wird (Pl₅₀-Wert → Proliferation Inhibition).

Integration von klinischen Daten

Soll das System zur Diagnostik im Bereich der Tumorerkrankungen eingesetzt werden, kann das Datenbankmodul von Komponente 2 Daten zur Therapieform, die den eingesetzten Wirkstoff, die Dosierung der Wirkstoffe, die Verträglichkeit bzw. Wirkung der zur Therapie eingesetzten Wirkstoffe, die Zeitspanne zwischen Primärerkrankung und Auftreten von Rezidiven bzw. Metastasen sowie ein oder mehrere mit Komponente 1 des Systems erstellte Expressionsprofile der untersuchten Tumore umfassen. Sollen Krankheitsbilder wie neurodegenerative Syndrome, Autoimmunerkrankungen, Herz- Kreislauferkrankungen, Virusinfektionen oder Wirkstoffresistenzen analysiert werden, wird das Datenbankmodul von Komponente 2 vorzugsweise Daten zur Therapieform, die den eingesetzten Wirkstoff, die Dosierung der Wirkstoffe, die Verträglichkeit bzw. Wirkung der eingesetzten Wirkstoffe sowie ein oder mehrere mit Komponente 1 des Systems erstellte Expressionsprofile von diagnostisch relevanten Gewebeproben enthalten.

Analyse & Interpretation

Die Analyse und Interpretation der mit Komponente 1 (DNA-Array) erstellten Expressionsdaten wird mit Hilfe der in Komponente 2 enthaltenen Datenbank- und Analysemodule auf zwei Ebenen durchgeführt. Auf der ersten Interpretationsebene wird jeder mit Hilfe von Komponente 1 identifizierten und quantifizierten mRNA-Variante eine Translationseffizienz zugeordnet. Auf der zweiten Interpretationsebene wird das vollständige mit Komponente 1 erstellte Expressionsprofil mit anderen, in der Datenbank von Komponente 2 enthaltenen Expressionsprofilen verglichen und einem bestimmten Expressionstyp zugeordnet. Diese Zuordnung zu einem bestimmten Expressionstyp ermöglicht die Bestimmung der Translationseffizienz aller auf Interpretationsebene 1 identifizierten und quantifizierten mRNA-Varianten in Abhängigkeit von zellulären Faktoren, sowie die Identifizierung der im untersuchten Zelltyp, Gewebe oder Organismus präferentiell translatierten mRNA.

Vorhersage der Proteinkonzentration

Die Meßwerte, die zur Vorhersage der in einem zu untersuchenden Zelltyp, Gewebe oder Organismus vorliegenden Menge eines oder mehrerer Proteine benötigt werden, umfassen die Gesamttranskriptionsrate der für ein oder mehrere bestimmte Proteine kodierenden mRNA-Varianten, sowie die Transkriptionsrate der einzelnen für diese Proteine kodierenden mRNA-Varianten und werden mit Komponente 1 des Systems (DNA-Array) bestimmt. Die Transkriptionsrate einer oder mehrerer bestimmter mRNAs wird an Hand der Intensität der für die zu untersuchende mRNA spezifischen Hybridisierungssignale in Komponente 1 (DNA-Array) bestimmt. Zur Normierung der Hybridisierungssignale der zu untersuchenden mRNA-Varianten mit den entsprechenden Sonden-Nukleinsäuren in Komponente 1 wird die Intensität der Hybridisierungssignale von mRNAs gemessen, die in allen Zelltypen, Geweben oder Organismen transkribiert werden (sogenannte Housekeeping-Gene). Die Expression der zur Normierung der Hybridisierungssignale eingesetzten Housekeeping Gene darf nicht auf Ebene der Translation kontrolliert werden. Jeder Sonden-Nukleinsäure von Komponente 1 (DNA-Array) bzw. jeder Gruppe von Sonden-Nukleinsäuren, die eine bestimmte mRNA- Variante repräsentiert, wird ein Datensatz zugeordnet, der die Translationseffizienz dieser mRNA-Variante im Vergleich mit mRNA-Varianten die von demselben und/oder anderen Genen transkribiert werden, die Abhängigkeit der Translationseffizienz von zellulären Faktoren sowie die in einem bestimmten Zelltyp, Gewebe oder Organismus präferentiell translatierte mRNA-Variante beinhaltet. Der Vergleich eines von einer Gewebeprobe erstellten Expressionsprofils mit den im Datenbankmodul von Komponente 2 enthaltenen Expressionsprofilen ermöglicht eine Zuordnung der untersuchten Probe zu einem bestimmten Zell- bzw. Gewebetyp und damit eine Beurteilung des Translationszustandes des untersuchten Zelltyps bzw. Gewebes. Das Produkt aus zelltyp- bzw. gewebespezifischer Translationseffizienz (P_(RNA-Var.1x)) einer oder mehrerer zu untersuchender mRNA Varianten und der mit Hilfe von Komponente 1 gemessenen Transkriptionsrate (T_(RNA-Var.1x)) der zu untersuchenden mRNA-Varianten ergibt einen Wert (C_Prot.x), welcher der in dem untersuchten Gewebe vorliegende Menge des bzw. der den mRNA-Varianten entsprechenden Proteine entspricht. Es gilt daher:
(I_(RNAVar.1x))/(I_{(Housekeeping)}) = T_(RNA-Var.1x)
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[80] Cory, A. H. et al.: "Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture", 1991, Cancer Commun., Vol. 3

Claims

1. Feste Matrix, auf der an verschiedenen Stellen wenigstens 2 verschiedene einzelsträngige Nukleinsäuren (= Sonden) mit 10 bis 40 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die Teil der genomischen Nukleotidsequenz eines bestimmten Gens sind, immoblisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass
eine erste Sonde komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz einer ersten mRNA- Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist,
die erste Sonde nicht komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz einer zweiten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist,
eine zweite Sonde komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz der ersten mRNA- Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist, und
die zweite Sonde komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz der zweiten mRNA- Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist.

2. Feste Matrix nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine dritte Sonde enthält, die
komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz der ersten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist,
komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz der zweiten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist, und
komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz einer dritten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens ist, wobei
die erste und die zweite Sonde nicht komplementär zu einem Teil der Nukleotidsequenz der dritten mRNA-Variante oder einer dieser Variante entsprechenden cDNA des Gens sind.

3. Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der auf der festen Matrix immobilisierten Sonden eine Nukleotidsequenz enthält, die Teil der kodierenden Region des zu analysierenden Gens ist.

4. Feste Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden auf der festen Matrix im wesentlichen die gesamte genomische Nukleotidsequenz der 5'- oder 3'-nicht-kodierenden Region des zu analysierenden Gens umfassen.

5. Feste Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden auf der festen Matrix im wesentlichen die gesamte genomische Nukleotidsequenz der nicht-kodierenden Region des zu analysierenden Gens umfassen.

6. Feste Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonden auf der festen Matrix im wesentlichen die gesamte genomische Nukleotidsequenz des zu analysierenden Gens umfassen.

7. Feste Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf der festen Matrix eine oder mehrere weitere Sonden mit jeweils 10 bis 40 aufeinanderfolgenden Nukleotiden immobilisiert sind, die jeweils Teile der Nukleotidsequenz eines Gens sind, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus housekeeping-Genen des Organismus, aus dem die Probe stammt, bakteriellen Genen und pflanzlichen Genen.

8. Feste Matrix nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die feste Matrix als DNA-Array ausgebildet ist.

9. Verfahren zur Expressionsanalyse wenigstens eines für ein Protein kodierenden Gens in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) gegebenenfalls die Anzahl und Identität verschiedener mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens ermittelt, die in der Probe vorhanden sind;

b) die jeweiligen Mengen der verschiedenen mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens ermittelt, die in der Probe vorhanden sind;

c) anhand der in Schritt b) ermittelten Mengen und der jeweiligen Translationseffizienz der verschiedenen mRNA-Varianten die Menge an von dem zu analysierenden Gen kodierten Protein ermittelt, die in der Probe vorliegt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) eine aus der Probe gewonnene oder daraus hergestellte Zusammensetzung bereitstellt, die Nukleinsäure, welche mRNA ist oder davon abgeleitet ist, enthält;

b) eine feste Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8 bereitstellt;

c) die Zusammensetzung aus aa) mit der festen Matrix in Kontakt bringt,

d) gegebenenfalls die Anzahl und Identität der in der Zusammensetzung aus aa) vorhandenen verschiedenen Varianten von Nukleinsäuren, die von dem zu analysierenden Gen kodiert werden, ermittelt;

e) die jeweiligen Mengen der in der Zusammensetzung aus aa) vorhandenen verschiedenen Varianten von Nukleinsäuren, die von dem zu analysierenden Gen kodiert werden, ermittelt;

f) anhand der in Schritt ee) ermittelten Mengen und der jeweiligen Translationseffizienz der verschiedenen mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens die Menge an von dem Gen kodierten Protein ermittelt, die in der Probe, aus der die Zusammensetzung gewonnen oder hergestellt wurde, vorliegt.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus einer Kultur von Säugerzellen, aus einem Gewebe oder einem Organ eines Säugetiers stammt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die aus der Probe gewonnene oder hergestellte Zusammensetzung nach Schritt aa) Gesamt-RNA, polyA⁺-RNA, cRNA und/oder cDNA enthält.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Zusammensetzung nach aa) enthaltenen Nukleinsäuren vor der Durchführung von Schritt cc) markiert werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass von dem zu analysierenden Gen wenigstens 2 verschiedene RNA-Varianten transkribiert werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen mRNA-Varianten sich am 5'-Ende unterscheiden, am 3'-Ende unterscheiden und/oder verschiedene Spleißformen des Gens darstellen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt ff) mittels eines Datenbankmoduls und eines Analysemoduls durchgeführt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Datenbankmodul ein Speichermedium, auf dem die jeweiligen Translationseffizienzen der verschiedenen mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens gespeichert sind, umfasst.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Analysemodul einen Prozessor und einen Speicher umfasst.

19. Kit zur Expressionsanalyse wenigstens eines Gens in einer Probe umfassend

a) als Komponente 1 eine feste Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8;

b) als Komponente 2 ein Speichermedium, auf dem die jeweiligen Translationseffizienzen der verschiedenen mRNA-Varianten des zu analysierenden Gens gespeichert sind.

20. Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin eine Einrichtung zur Bestimmung der jeweiligen Mengen an Nukleinsäure, die nach in-Kontakt-Bringen einer Nukleinsäure enthaltenden Zusammensetzung mit der festen Matrix an die jeweiligen Sonden gebunden sind, umfasst.

21. Kit nach einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass in Komponente 2 weiterhin Transkriptionsprofile enthalten sind, die von Zellen, Geweben, oder Organismen stammen, von dem auch die Probe stammt.

22. Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass in Komponente 2 weiterhin Transkriptionsprofile enthalten sind, die von durch eine Krankheit veränderten Zellen, Geweben oder Organismen stammen.

23. Kit nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs, Autoimmunerkrankungen, chronischen Erkrankungen des Alters, Herz- Kreislauferkrankungen, Viruserkrankungen und Wirkstoffresistenzen.

24. Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass in Komponente 2 weiterhin Transkriptionsprofile enthalten sind, die von Tumorzellen stammen, die mit einem oder mehreren Therapeutika behandelt worden sind.

25. Verfahren zur Bestimmung oder Analyse von Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein mittels einer festen Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erstelltes Transkriptionsprofil mit Transkriptionsprofilen von krankhaft veränderten Zellen, Geweben oder Organismen vergleicht.

26. Verfahren zur Bestimmung oder Analyse der Effekte äußerer Einflüsse auf zu untersuchende Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein mittels einer festen Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erstelltes Transkriptionsprofil, das von Zellen, einem Gewebe oder Organismus erstellt wurde, mit Transkriptionsprofilen der gleichen Zellen bzw. des gleichen Gewebes oder Organismus nach Einwirkung eines äußeren Einflusses vergleicht.

27. Verfahren zur Bestimmung der Sekundärstruktur einer RNA, dadurch gekennzeichnet, dass man die RNA einem partiellen RNAse-Verdau aussetzt und anschließend mit einer festen Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in Kontakt bringt.

28. Verwendung einer festen Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Probe.

29. Verwendung einer festen Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Bestimmung oder Analyse von Erkrankungen.

30. Verwendung einer festen Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Bestimmung oder Analyse der Effekte äußerer Einflüsse auf zu untersuchende Zellen.

31. Verwendung einer festen Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Bestimmung der Sekundärstruktur von RNA-Molekülen.