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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren für die Analyse
von Proben, die vom Menschen erhalten wurden, das Informationen,
die bei der Therapie von Osteoporose nützlich sind, zur Verfügung stellen kann.
Im Speziellen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Analyse
des genetischen Polymorphismus der genomischen DNA in den von Menschen
stammenden Proben, um zu antizipieren, welches das wirksamste Heilmittel
für Osteoporose
unter Vitamin D, Östrogen
und Vitamin K2 ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls
ein Verfahren zum Antizipieren auf der Basis einer Kombination der
genetischen Polymorphismen der genomischen DNA in einer vom Menschen
stammenden Probe, dass die Probe von einem Individuum stammt, das
eine spezifische Priorität
der Sensitivität
für das
vorstehende Medikament hat.
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Die
Osteoporose ist das Stadium einer Erkrankung, in der die Knochenmasse
(die Menge der Mineralien, hauptsächlich im Knochen enthaltenes
Calcium) abnimmt und sich die Feinstruktur des Knochengewebes verändert, so
dass der Knochen spröde
wird und eine Tendenz zum Knochenbruch aufweist. Dies tritt hauptsächlich bei
Frauen nach der Menopause und bei älteren Männern auf. Es wird berichtet,
dass die Anzahl der Patienten mit Osteoporose wahrscheinlich 10.000.000
beträgt.
Weil der Anteil der älteren
Personen in der Population steigt, wird erwartet, dass die Anzahl
der Patienten in Zukunft unvermeidlich steigen wird.
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Zur
Zeit werden verschiedene Medikamente wie z. B. Aktivatoren der Knochen,
z. B. Calciumpräparate,
Vitamin D, etc., die Knochenresorption vermindernde Mittel, z. B. Östrogen,
etc., und Beschleuniger der Knochenbildung, z. B. Vitamin K, etc.,
für die
Behandlung von Osteoporose verwendet. Ihre therapeutischen Wirkungen
schwanken jedoch zufällig
in Abhängigkeit
von dem Patienten und es wurden fast keine Studien durchgeführt, wie
ein geeignetes Medikament für
einen geeigneten Patienten verwendet wird. Weil es als Regel festgelegt
wurde, das diese Heilmittel einzeln verabreicht werden, gibt es
zur Zeit keine andere Möglichkeit als
tatsächlich
ein einzelnes Medikament den Patienten für mehrere Jahre zu verabreichen
und Ergebnisse zu erhalten, bevor auf der Basis der Ergebnisse beurteilt
werden kann, welches Medikament das wirksamste ist. Dies ist äußerst ineffizient.
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Andererseits
deuteten neue Studien an Genen auf eine Beziehung zwischen einigen
genetischen Polymorphismen und der Sensitivität eines Patienten gegenüber Heilmitteln
für die
Osteoporose. Zum Beispiel gibt es einen Bericht, dass der Genotyp
A, der nicht durch ApaI in der Intronregion zwischen Exon 8 und
Exon 9 des Gens des Vitamin D-Rezeptors (nachfolgend als VDR bezeichnet)
gespalten wird, sensitiver für
Vitamin D ist als der Genotyp a, der mit dem gleichen Restriktionsenzym
gespalten wird [vergl. zum Beispiel
JP-A-8-126497 und
JP-A-8-126500 ].
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Shiraki
et al. [Zusammenfassung der 1997 Conference of Japanese Society
for Bone and Mineral Research, Seite 52] beschreiben ebenfalls,
dass in Übereinstimmung
mit den Ergebnissen von Untersuchungen der Beziehungen zwischen
dem Polymorphismus des VDR-Gens und der Sensitivität für Vitamin
D, zwischen dem Polymorphismus des Gens des Östrogenrezeptors (estrogen
receptor, nachfolgend als ER bezeichnet) und der Sensitivität für Östrogen
und zwischen dem Polymorphismus des Gens des Apolipoproteins E (nachfolgend
als ApoE bezeichnet) und der Sensitivität für Vitamin K2 der VDR-Genotyp
AAB (wobei B ein Genotyp ist, der nicht mit BsmI in der Intronregion
zwischen Exon 8 und Exon 9 gespalten wird), eine deutlich niedrigere Sensitivität für Vitamin
D als aabb besitzt. Und auch der ER-Genotyp PpXx (wobei P und X
Genotypen sind, die nicht mit PvuII oder beziehungsweise XbaI gespalten
werden) besitzt eine deutlich höhere
Sensitivität
für Östrogen
als andere Genotypgruppen und die ApoE4 (+)-Gruppe besitzt eine
deutlich geringere Sensitivität für Vitamin
K2 als die ApoE4 (–)-Gruppe.
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Des
weiteren wurde beschrieben, dass die Genotypgruppe, deren Muster
des RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus),
das durch die Spaltung des Gens des Vitamin D bindenden Proteins
(DBP) mit HaeIII und StyI erhalten wird, vom GC2-2-Typ ist und dass
sie eine höhere
Sensitivität
für Vitamin
D als die anderen Gruppen besitzt [
JP-A-8-201373 ].
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Jedes
dieser Ergebnisse wird jedoch verwendet, um die Sensitivität für ein Medikament
auf der Basis des Polymorphismus von einem Gen zu antizipieren,
und es ermöglicht
nichts anderes als das Antizipieren, ob ein Genotyp eine höhere Sensitivität als die
anderen Genotypen in Bezug auf ein Medikament besitzt. Mit anderen
Worten, es wird antizipiert, dass solche Personen, deren VDR-Genotyp
aabb ist und deren ApoE-Genotyp ApoE4 (–) ist, eine je weils höhere Sensitivität für Vitamin
D beziehungsweise Vitamin K2 besitzen als solche Personen, die andere
VDR- und ApoE-Genotypen besitzen. Es kann jedoch nicht antizipiert
werden, welches von Vitamin D und Vitamin K2 an Patienten verabreicht
werden sollte, die einen solchen Genotyp besitzen, um eine höhere therapeutische
Wirkung zu erhalten. Um zu erfahren, für welches der unterschiedlichen Medikamente
ein Patient eine höhere
Sensitivität
besitzt, gab es daher letztendlich keine andere Möglichkeit, als
dem Patienten ein einzelnes Medikament nach dem anderen in einem
Zeitraum von mehreren Jahren für jedes
Medikament zu verabreichen, und die Ergebnisse auszuwerten. Insbesondere Östrogen
besitzt nicht nur eine hohe therapeutische Wirkung, sondern ebenfalls
hohe Nebenwirkungen, so dass eine Befürchtung besteht, dass eine
langfristige Verabreichung davon an Patienten ihre QOL (quality
of life, Lebensqualität)
deutlich verschlechtert.
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Die
nachfolgenden Dokumente zeigen Korrelationen der Polymorphismen
in dem Vitamin D-Rezeptorgen, dem Östrogenrezeptorgen oder dem
Apolipoprotein-E-Gen mit der Sensitivität gegenüber der Behandlung mit Vitamin
D, Östrogen
oder beziehungsweise Vitamin K. Es wird jedoch keine gleichzeitige
Bewertung von allen drei (VDR, ER, ApoE) Genotypen offenbart: Deng
Hong-Wen et al: "Change
of bone mass in postmenopausal Caucasian women with and without
hormone replacement therapy is associated with vitamin D receptor
and estrogen receptor genotypes",
Human Genetics, Bd. 103, Nr. 5, November 1998 (1998-11), Seiten
576–585,
XP002264986 ISSN: 0340-6717; Kohlmeier et al.: "Bone fracture history and prospective
bone fracture risk of hemodialysis patients are related to apolipoprotein
E genotype", Calcified
Tissue International, Bd. 62, Nr. 3, März 1998 (1998-03), Seiten 278–281, XP002264987
ISSN: 0171-967X; Fujita Takuo: "Vitamin D
in the treatment of osteoporosis revisited", Proceedings of the Society for Experimental
Biology and Medicine, Bd. 212, Nr. 2, 1996, Seiten 110–115, XP009022917
ISSN: 0037-9727.
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Daher
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zum Antizipieren
zur Verfügung
zu stellen, für
welches von einer Vielzahl von Heilmitteln für Osteoporose ein Patient,
der unter Osteoporose leidet, oder eine Person, für welche
die Möglichkeit
besteht, in der Zukunft an Osteoporose zu erkranken, eine höhere Sensitivität besitzt,
wodurch das Forstschreiten der Erkrankung vermieden wird, welches
durch eine langfristige Verabreichung eines Medikaments hervorgerufen
wird, das eine niedrige therapeutische Wirkung besitzt, so dass
der QOL der Patienten verbessert werden kann.
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Die
hier genannten Erfinder haben intensive Untersuchungen mit dem Ziel
durchgeführt,
die vorstehende Aufgabe zu erfüllen,
und als ein Ergebnis haben sie gezeigt, dass die Analyse einer vom
Menschen stammenden Probe, die genomische DNA enthält, bezüglich der
Polymorphismen des VDR-Gens, des ER-Gens und des ApoE-Gens auf der
Basis der Kombinationen der so erhaltenen Polymorphismen ermöglicht zu
antizipieren, dass die Sensitivität für eines der Medikamente, Vitamin
D, Östrogen
und Vitamin K2, höher als
die Sensitivität
für die
anderen beiden Medikamente ist.
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Das
heißt,
sie haben eine Tendenz nachgewiesen, dass in dem Fall, in dem eine
Person sowohl einen VDR-Genotypen, der eine höhere Sensitivität für Vitamin
D als die anderen Genotypen hat, als auch einen ER-Genotypen besitzt,
der eine höhere
Sensitivität
für Östrogen
als die anderen Genotypen hat, die Person sensitiver für Östrogen
als für
Vitamin D ist.
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Des
weiteren wurde gezeigt, dass in dem Fall, in dem eine Person einen
ER-Genotypen, der eine höhere
Sensitivität
für Östrogen
als die anderen Genotypen hat, und einen ApoE-Genotypen besitzt, der eine höhere Sensitivität für Vitamin
K2 als die anderen Genotypen hat, die Person sensitiver für Östrogen
als für
Vitamin K2 ist und in dem Fall, in dem eine Person einen VDR-Genotypen,
der eine höhere
Sensitivität
für Vitamin D
hat, und einen ApoE-Genotypen
besitzt, der eine höhere
Sensitivität
für Vitamin
K2 hat, die Person sensitiver für
Vitamin K2 als für
Vitamin D ist, wodurch folglich die vorliegende Erfindung erreicht
wurde. In dieser Ausführungsform
wird ein ApoE-Genotyp als Apolipoprotein E4-Allel (+), welches 2/4,
3/4 und 4/4 einschließt,
und als Apolipoprotein E4-Allel (–) klassifiziert, welches 2/2,
2/3 und 3/3 einschließt,
und der ApoE-Genotyp, der eine höhere
Sensitivität
für Vitamin
K2 besitzt, bezieht sich auf die letztere Gruppe.
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Des
weiteren haben die hier genannten Erfinder gezeigt, dass in dem
Fall, in dem eine Person ein Apolipoprotein E3-Allel (+) 3/3-Typ
besitzt, die Person eine höhere
Sensitivität
für Vitamin
K2 besitzt im Vergleich zu einem Fall, in dem die Person ein Apolipoprotein
E3-Allel (–) (welches
Allel alle außer
dem 3/3-Typ einschließt)
besitzt. Unter den Apolipoprotein E3-Allelen ist der Grad der Sensitivität der Allele
für Vitamin
K2 3/3 (Gruppe 1) > 2/3
oder 3/4 (Gruppe 2) > 2/2,
2/4 oder 4/4 (Gruppe 3).
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Es
wurde gezeigt, dass in dem Fall, in dem eine Person einen ER-Genotypen,
der eine höhere
Sensitivität
für Östrogen
als die anderen Genotypen hat, und einen ApoE-Genotypen besitzt,
der eine höhere
Sensitivität
für Vitamin
K2 als die anderen Genotypen hat, die Person sensitiver für Östrogen
als für
Vitamin K2 ist, und in dem Fall, in dem eine Person einen VDR-Genotypen
besitzt, der eine höhere
Sensitivität
für Vitamin
D hat, und einen ApoE-Genotypen,
der eine höhere
Sensitivität
für Vitamin
K2 hat, die Person sensitiver für
Vitamin K2 als für
Vitamin D ist, wodurch folglich die vorliegende Erfindung erreicht
wurde. In dieser Ausführungsform
wird ein ApoE-Genotyp als Apolipoprotein E3-Allel (+), welches den
3/3-Typen einschließt,
und als Apolipoprotein E3-Allel (–) klassifiziert, welches die
2/2-, 2/3-, 3/4- und 4/4-Typen einschließt, und der ApoE-Genotyp, der
eine höhere
Sensitivität
für Vitamin
K2 besitzt, bezieht sich auf die erstere Gruppe.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Das
heißt,
die Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist, wie nachfolgend beschrieben wird:
Ein
Verfahren zum Antizipieren der Sensitivität für ein Medikament, ausgewählt aus
Vitamin D, Östrogen
und Vitamin K2, zur Behandlung von Osteoporose, gekennzeichnet durch
das Analysieren der jeweiligen genetischen Polymorphismen eines
Vitamin D-Rezeptorgens, eines Östrogenrezeptorgens
und eines Apolipoprotein-E-Gens aus einer genomischen DNA, die in
einer Probe, die vom Menschen erhalten wurde, enthalten ist, und
auf der Basis einer Kombination der genetischen Polymorphismen Antizipieren,
dass die Probe von einem Individuum stammt, das eine spezifische
Priorität
der Sensitivitäten
für die
Mehrheit der Heilmittel für
Osteoporose zeigt, wobei eine Kombination der genetischen Polymorphismen
des Vitamin D-Rezeptorgens, des Östrogenrezeptorgens
und des Apolipoprotein-E-Gens eine ist, die aus der Gruppe, bestehend
aus [B(–)
X(–) 4(–)], [B(–) X(–) 4(+)],
[B(–)
X(+) 4(–)],
[B(–)
X(+) 4(+)], [B(+) X(–)
4(–)],
[B(+) X(–)
4(+)], [B(+) X(+) 4(–)]
und [B(+) X(+) 4(+)], ausgewählt
ist (wobei "B" ein Vitamin D-Rezeptorallel
darstellt, das nicht mit BsmI in einer Intronregion zwischen Exon
8 und Exon 9 gespalten wird, "X" ein Östrogenrezeptorallel
darstellt, das nicht mit XbaI in einer Intronregion zwischen Exon
1 und Exon 2 gespalten wird, und "4" ein
Apolipoprotein-E4-Allel darstellt und (+) und (–) das Vorliegen bzw. das Nichtvorliegen
des Allels anzeigen), oder wobei
die Kombination der genetischen
Polymorphismen des Vitamin D-Rezeptorgens, des Östrogenrezeptorgens und des
Apolipoprotein-E-Gens eine ist, die aus der Gruppe, bestehend aus
[B(–)
X(–) 3(–)], [B(–) X(–) 3(+)], [B(–) X(+)
3(–)],
[B(–)
X(+) 3(+)], [B(+) X(–)
3(–)],
[B(+) X(–)
3(+)], [B(+) X(+) 3(–)]
und [B(+) X(+) 3(+)], ausgewählt
ist (wobei "B" ein Vitamin D-Rezeptorallel darstellt,
das mit BsmI nicht in einer Intronregion zwischen Exon 8 und Exon
9 gespalten wird, "X" ein Östrogenrezeptorallel
darstellt, das mit XbaI nicht in einer Intronregion zwischen Exon
1 und Exon 2 gespalten wird, und "3" ein
Apolipoprotein-E3-Allel darstellt und 3(+) einen 3/3-Typen anzeigt
und 3(–)
andere Genotypen als den 3/3-Typen des Allels anzeigt).
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Insbesondere
stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Antizipieren
der Sensitivität
für ein Medikament
bereit, ausgewählt
aus Vitamin D, Östrogen
und Vitamin K2, zur Behandlung von Osteoporose, gekennzeichnet durch
Analysieren der jeweiligen genetischen Polymorphismen eines Vitamin
D-Rezeptorgens, eines Östrogenrezeptorgens
und eines Apolipoprotein-E-Gens aus einer Genom-DNA, die in einer
Probe, die vom Menschen erhalten wurde, enthalten ist, und auf der
Basis einer Kombination der in den Genen analysierten genetischen
Polymorphismen Antizipieren, dass die Probe von einem Individuum
stammt, das eine spezifische Priorität der Sensitivitäten für Vitamin
D, Östrogen
und Vitamin K2 zur Behandlung von Osteoporose zeigt, wobei eine
Kombination der genetischen Polymorphismen eine ist, die entweder
aus der Gruppe, bestehend aus [B(–) X(–) 4(–)], [B(–) X(–) 4(+)], [B(–) X(+)
4(–)],
[B(–)
X(+) 4(+)], [B(+) X(–)
4(–)],
[B(+) X(–) 4(+)],
[B(+) X(+) 4(–)]
und [B(+) X(+) 4(+)], oder der Gruppe, bestehend aus [B(–) X(–) 3(–)], [B(–) X(–) 3(+)], [B(–) X(+)
3(–)],
[B(–)
X(+) 3(+)], [B(+) X(–)
3(–)],
[B(+) X(–)
3(+)], [B(+) X(+) 3(–)]
und [B(+) X(+) 3(+)], ausgewählt
ist, wobei "B" ein Vitamin D-Rezeptorallel
darstellt, das mit BsmI in einer Intronregion zwischen Exon 8 und
Exon 9 nicht gespalten wird, "X" ein Östrogenrezeptorallel
darstellt, das mit XbaI in einer Intronregion zwischen Exon 1 und
Exon 2 nicht gespalten wird, und "4" ein
Apolipoprotein-E4-Allel darstellt, "3" ein
Apolipoprotein-E3-Allel darstellt und (+) und (–) das Vorliegen bzw. das Nichtvorliegen
des Allels anzeigen, und wobei
in einem Fall, in dem die Kombination
der genetischen Polymorphismen des Vitamin D-Rezeptorgens, eines Östrogenrezeptorgens und eines
Apolipoprotein-E-Gens [B(+) X(–)
4(–)],
[B(–)
X(–) 4(–)], [B(+)
X(+) 3(+)] oder [B(+) X(–)
3(+)] ist, antizipiert wird, dass die Probe von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Vitamin
K2 hat, die höher
ist als eine Sensitivität
für Vitamin
D oder eine Sensitivität
für Östrogen;
in
einem Fall, in dem die Kombination der genetischen Polymorphismen
der genannten Gene [B(–)
X(–) 4(+)], [B(–) X(–) 3(+)],
[B(–)
X(–) 3(–)] oder
[B(+) X(–)
3(–)]
ist, antizipiert wird, dass die Probe von einem Individuum stammt,
das eine Sensitivität
für Vitamin
D hat, die höher
ist als eine Sensitivität
für Vitamin
K2 oder eine Sensitivität
für Östrogen;
in
einem Fall, in dem die Kombination der genetischen Polymorphismen
der genannten Gene [B(–)
X(+) 4(–)], [B(–) X(+)
4(+)], [B(+) X(+) 4(–)],
[B(+) X(+) 4(+)], [B(–)
X(+) 3(+)], [B(–)
X(+) 3(–)]
oder [B(+) X(+) 3(–)]
ist, antizipiert wird, dass die Probe von einem Individuum stammt,
das eine Sensitivität
für Östrogen
hat, die höher ist
als eine Sensitivität
für Vitamin
D oder eine Sensitivität
für Vitamin
K2; und
in einem Fall, in dem die Kombination der genetischen
Polymorphismen der genannten Gene [B(+) X(–) 4(+)] ist, antizipiert wird,
dass die Probe von einem Individuum stammt, das keine Sensitivität für eines
der drei Mittel hat.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein schematisches Diagramm, das die Ergebnisse in dem Fall darstellt,
bei dem die VDR-, ApoE- und ER-Gene auf einem Festphasenträger nachgewiesen
werden, um die genetischen Polymorphismen der jeweiligen Gene zu
zeigen.
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2 ist
ein Elektrophoretogramm an Stelle von einer Zeichnung, wobei die
Ergebnisse der Elektrophorese der mit den Primern der vorliegenden
Erfindung amplifizierten Gene darstellt.
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3 ist
ein Diagramm, das die Ergebnisse des Nachweises der genetischen
Polymorphismen von VDR, ApoE und ER auf einem Festphasenträger in den
Proben, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung amplifiziert
wurden, darstellt.
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4 ist
ein Elektrophoretogramm an Stelle von einer Zeichnung, wobei die
Ergebnisse der Elektrophorese der Proben von Beispiel 5 dargestellt
werden, die durch die Amplifizierung ausschließlich des VDR-Gens durch ein
PCR-Verfahren und durch die Unterscheidung der genetischen Polymorphismen
des VDR-Gens gemäß der Restriktionsenzymfragmentlänge in Bezug
auf das Restriktionsenzym BsmI erhalten werden.
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5 ist
ein Diagramm, das die Ergebnisse der Unterscheidung der genetischen
Polymorphismen von den Proben von Beispiel 5 darstellt, wobei ein
kommerziell erhältliches
ApoE-Gen-Nachweisreagenz (Handelsname: INNO-LIPA ApoE, hergestellt
von Innogenetics Corp.) ausschließlich für das ApoE-Gen verwendet wurde.
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6 ist
ein Elektrophoretogramm an Stelle von einer Zeichnung, wobei die
Ergebnisse der Elektrophorese von den Proben von Beispiel 6 dargestellt
werden, die durch die Amplifizierung ausschließlich des ER-Gens durch ein
PCR-Verfahren und durch die Unterscheidung der genetischen Polymorphismen
des ER-Gens gemäß der Restriktionsenzymfragmentlänge in Bezug
auf das Restriktionsenzym XbaI erhalten werden.
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Ausführungsformen
der Erfindung
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Wie
er hierin verwendet wird, soll der Fachausdruck "Antizipieren" die Fähigkeit Vorherzusagen oder zu
Diagnostizieren, für
welches von bestimmten Medikamenten zur Behandlung von Osteoporose,
wenn überhaupt,
ein Mensch die höchste
Sensitivität
im Vergleich zu der Sensitivität
des Menschen für
die anderen der Medikamente besitzt, bedeuten.
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Die
vom Menschen stammende Probe, mit der das analytische Verfahren
der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann, ist nicht
besonders eingeschränkt,
so fern sie menschliche genomische DNA enthält. Vorzugsweise werden die
genomischen DNAs, die von verschiedenen menschlichen Zellen isoliert
werden, beispielhaft erläutert.
Die Extraktion der genomischen DNA kann durch herkömmliche
Verfahren wie z. B. ein SDS/Phenol-Verfahren, ein Guanidinthiocyanat-Verfahren
und ein CTAB-Verfahren durchgeführt
werden. Es können
ebenfalls vorzugsweise solche Zellen und Gewebearten verwendet werden,
die leicht erhältlich
sind und die bisher als Proben für
die Matrizen-DNA für
ein PCR-Verfahren verwendet wurden, wie z. B. Gesamtblut, fraktionierte
Blutzellen, epidermale Zellen und Schleimhautzellen, die als Abstrichmaterial
verwendet wurden, oder Haare. In diesem Fall werden die Zellen durch
das Kochen der Zellen/der Gewebe in Wasser oder durch das Erhitzen
von ihnen in einer alkalischen Lösung
homogenisiert, um eine Probe der Genom-DNA zu erhalten.
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Das
analytische Verfahren der vorliegenden Erfindung ist durch das Untersuchen
der genetischen Polymorphismen eines VDR-Gens, eines ER-Gens und
eines ApoE-Gens gekennzeichnet.
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Das
VDR-Gen liegt auf dem 12. Chromosom. Einer der Polymorphismen des
VDR-Gens wird dadurch nachgewiesen, dass es mit dem Restriktionsenzym
BsmI möglich
ist, in einer Intronregion zwischen Exon 8 und Exon 9 zu spalten
oder nicht. Angenommen, dass "B" das Allel darstellt,
das nicht mit BsmI gespalten wird, und "b" das
Allel darstellt, das mit diesem Restriktionsenzym gespalten wird,
können
die genetischen Polymorphismen von VDR einer von drei Genotypen
sein, das heißt
BB, Bb und bb. In der vorliegenden Erfindung werden die genetischen
Polymorphismen von VDR als ein Genotyp B(+) klassifiziert, der das
Allel B besitzt (das heißt,
BB und Bb) und als ein Genotyp B(–), der kein Allel B besitzt
(das heißt
bb). Die Stelle des Polymorphismus des VDR-Gens bedeutet, dass die
Restriktionsstelle von BsmI (GAATGC) in der Intronregion zwischen Exon
8 und Exon 9 des Allels b und die Stelle des Allels B (GAATGT) sich
entsprechen.
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Das
ER-Gen liegt auf dem 6. Chromosom. Einer der Polymorphismen des
ER-Gens wird dadurch nachgewiesen, dass es mit dem Restriktionsenzym
XbaI möglich
ist, in einer Intronregion zwischen Exon 1 und Exon 2 zu spalten
oder nicht. Angenommen, dass "X" das Allel darstellt,
das nicht mit XbaI gespalten wird, und "x" das
Allel darstellt, das mit diesem Restriktionsenzym gespalten wird,
können
die genetischen Polymorphismen von ER einer von drei Genotypen sein,
das heißt
XX, Xx und xx. In der vorliegenden Erfindung werden die genetischen
Polymorphismen von ER als ein Genotyp X(+) klassifiziert, der das
Allel X besitzt (das heißt, XX
und Xx) und als ein Genotyp X(–),
der kein Allel X besitzt (das heißt xx). Die Stelle des Polymorphismus des
ER-Gens bedeutet, dass die Restriktionsstelle von XbaI (TCTAGA)
in der Intronregion zwischen Exon 1 und Exon 2 des Allels x und
die Stelle des Allels X (TCCAGA) sich entsprechen.
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Das
Apo-Gen liegt auf dem 19. Chromosom und besteht aus vier Exons und
drei Introns, wobei es für ein
Protein codiert, das aus 299 Aminosäuren besteht. Das ApoE-Protein
ist bei dem Transport von Triglyceriden oder Cholesterinen durch
Lipoproteine beteiligt und es ist ein Transferprotein für Vitamin
K2. Es ist bekannt, dass das ApoE-Protein drei Isoformen (E2, E3
und E4) besitzt. Unter diesen wird E3 als der Wildtyp (die 112.
Aminosäure
ist Cystein und die 158. Aminosäure
ist Arginin) betrachtet. E4 ist die Isoform, bei der die 112. Aminosäure Cystein
(Codon: TGC) durch Arginin (Codon: CGC) substituiert wurde. E2 ist
die Isoform, bei der das 158. Arginin durch Cystein substituiert
wurde. Daher wird das ApoE4-Allel mit dem Restriktionsenzym HhaI in
der Mutationsstelle gespalten, während
die ApoE2- und ApoE3-Allele mit diesem Restriktionsenzym nicht an
dieser Stelle (112. Aminosäure)
gespalten werden. Das heißt,
das ApoE4-Allel wird in dem Codon, welches das 112. Arginin codiert,
gespalten, welches die Mutationsstelle für HhaI ist, aber das ApoE2-
oder das ApoE3-Allel wird nicht in dem Codon, welches das 112. Cystein
codiert, gespalten. Des Weiteren wird das ApoE3- oder das ApoE4-Allel
in dem Codon, welches das 158. Arginin codiert, mit HhaI gespalten,
aber das ApoE2-Allel wird in dem Codon, welches das 158. Cystein
codiert, das eine Mutationsstelle ist, nicht gespalten. Sie werden
im Folgendem zusammengefasst.
| | 112.
Aminosäure | 158.
Aminosäure |
| ApoE2-Allel | nicht
gespalten | nicht
gespalten |
| ApoE3-Allel | nicht
gespalten | gespalten |
| ApoE4-Allel | gespalten | gespalten |
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Wenn
die ApoE2-, ApoE3- und ApoE4-Allele durch 2, 3 beziehungsweise 4
ausgedrückt
werden, kann der genetische Polymorphismus von ApoE die Genotypen
2/2, 2/3, 2/4, 3/3, 3/4 und 4/4 annehmen. In der vorliegenden Erfindung
werden die genetischen Polymorphismen von ApoE als ein Genotyp 4(+),
der ein Allel 4 besitzt (das heißt, 2/4, 3/4 oder 4/4), und
als ein Genotyp 4(–)
der kein Allel 4 besitzt (das heißt, 2/2, 2/3 oder 3/3) klassifiziert.
Und die genetischen Polymorphismen von ApoE werden als ein Genotyp
3(+), der ein Allel des 3/3-Typs
besitzt (das heißt,
3/3), und als ein Genotyp 3(–),
der alle außer
dem 3/3-Typen einschließt
(das heißt,
2/2, 2/3, 2/4, 3/4 und 4/4), klassifiziert.
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Das
Verfahren zur Messung der genetischen Polymorphismen ist nicht besonders
eingeschränkt,
so fern es den Polymorphismus B(+) von dem Polymorphismus B(–) des VDR-Gens, den Polymorphismus
X(+) von dem Polymorphismus X(–)
des ER-Gens und den Polymorphismus 4(+) von dem Polymorphismus 4(–) des ApoE-Gens
oder den Polymorphismus 3(+) von dem Polymorphismus 3(–) des ApoE-Gens
unterscheiden kann. Es können
verschiedene Verfahren einschließlich geeigneter Kombinationen
von Nachweis/Analyse-Verfahren
von genomischer DNA, die üblicherweise
verwendet werden, wie z. B. das Southern-Hybridisierungsverfahren,
ein Sequenzierungsverfahren und ein PCR-Verfahren, verwenden werden.
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Die
Verfahren zur Messung dieser genetischen Polymorphismen werden auf
der Basis ihrer Prinzipien als drei Typen klassifiziert. Das heißt, (1)
ein Verfahren, in dem ein Genfragment, das die Stelle des Polymorphismus
enthält,
isoliert wird und die Rasensequenz dieser Stelle bestimmt wird oder
die Stelle des Polymorphismus direkt durch die Verwendung einer spezifischen
Sonde oder eines Primers nachgewiesen wird, (2) ein Verfahren, in
dem ein Unterschied in einer Struktur einer höheren Ordnung eines Genfragments,
das die Stelle des Polymorphismus enthält, verwendet wird, wobei die
Polymorphismen auf der Basis der elektrophoretischen Mobilität unterschieden
werden, und (3) ein Verfahren, in dem die Möglichkeit der Spaltung an der
Stelle des Polymorphismus mit einem Restriktionsenzym verwendet
wird, wobei die Polymorphismen auf der Basis der elektrophoretischen
Mobilität
unterschieden werden. Als spezifische Beispiele für (1) können zum
Beispiel ein Sequenzierungsverfahren, ein sequenzspezifisches Oligonucleotidsonden
(SSOP)-Verfahren, ein spezifisches Amplifikationsverfahren für ein mutiertes
Allel (MASA), etc. erwähnt
werden.
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In
dem Sequenzierungsverfahren werden zunächst spezifische Primerpaare
synthetisiert, welche die entsprechenden Genfragmente von geeigneter
Länge amplifizieren
können,
welche die entsprechenden Stellen der Polymorphismen des VDR-Gens,
des ER-Gens und des ApoE-Gens
enthalten. Die Primerpaare sind nicht besonders eingeschränkt, so
fern sie etwa 15 bis etwa 40 Basen besitzen und den bevorzugten
Bedingungen genügen,
die für
gewöhnliche
PCR-Primer benötigt
werden. Unter Verwendung der Paare der Primer wird anschließend die
PCR durchgeführt,
wobei eine vom Menschen stammende Probe als eine Matrize verwendet
wird, um die jeweiligen bestimmten Genfragmente zu amplifizieren.
Die Reaktionsbedingungen für
die PCR können
passend aus dem Bereich, der üblicherweise
verwendet wird, ausgewählt
werden. Die so erhaltenen amplifizierten Fragmente können in
einen geeigneten Vektor subkloniert werden und die Rasensequenz von
jeder Stelle des Polymorphismus kann durch eine gewöhnliche
Sequenz unter Verwendung eines Maxam-Gilbert-Verfahrens oder eines
Dideoxy-Verfahrens bestimmt werden. In einer anderen Ausführungsform kann
die Sequenz direkt ohne die Subklonierung durch ein zyklisches Sequenzierungsverfahren
bestimmt werden.
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Das
SSOP-Verfahren ist ein Verfahren, das die Herstellung einer Sonde,
die zu der Sequenz eines Allels vollständig komplementär ist, die
Durchführung
einer Southern-Hybridisierung
der genomischen DNA, die aus einer vom Menschen stammenden Probe
mit der Sonde extrahiert wurde, während die Hybridisierungstemperatur
strikt kontrolliert wurde, und das Unterscheiden der genetischen
Polymorphismen durch die Anwesenheit oder Abwesenheit der Erzeugung
von Hybriden einschließt.
Die Hybridisierung kann entweder getrennt für jedes Gen oder gleichzeitig
durchgeführt
werden, vorausgesetzt, dass die Hybridisierungs bedingungen sehr
präzise
kontrolliert werden, um Kreuzreaktionen, einschließlich Fehlpaarungen,
mit der Sonde zu verhindern, da die Polymorphismen der drei Gene,
die in der vorliegenden Erfindung gemessen werden, Substitutionen
von jeweils einzelnen Basen sind. Es ist wünschenswert, dass die Sonde
so aufgebaut ist, dass die Stelle des Polymorphismus in der Nähe der Mitte
der Sonde liegt, um die Stabilisierung aufgrund von Fehlpaarungen
zu maximieren. Als eine bevorzugte Variation kann ein PCR-SSOP-Verfahren
erwähnt
werden, in dem das Fragment, das die Stelle des Polymorphismus enthält, durch
die PCR vor der Hybridisierung amplifiziert wird.
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Das
MASA-Verfahren ist ein Verfahren, umfassend die Synthese einer Oligo-DNA
von etwa 15 bis 45 Basen, die eine Stelle des Polymorphismus enthält und die
vollständig
homolog (oder vollständig
komplementär)
zu einer Allelsequenz wie zu einem der Primer ist, das Durchführen der
PCR unter Verwendung einer vom Menschen stammenden Probe als eine
Matrize und unter der strikten Kontrolle der Annealing-Temperatur
und die Unterscheidung der genetischen Polymorphismen durch die
Anwesenheit oder Abwesenheit von Amplifikationsprodukten. In diesem
Verfahren, ähnlich
zu den vorstehend beschriebenen Verfahren, müssen die Bedingungen für die PCR
sehr präzise
kontrolliert werden, um Kreuzreaktionen zu verhindern. Das Durchführen der
Reaktion in einem automatisierten Thermozykler ermöglicht eine
akkurate Unterscheidung auf eine relativ einfache Weise.
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Wie
das vorstehende Verfahren (2) kann ein PCR-SSCP (single-strand conformation
polymorphism, Einzelstrang-Konformationspolymorphismus)-Verfahren,
ein PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis, denaturierende
Gradientengelelektrophorese)-Verfahren,
ein PCR-CFLP (cleavase fragment length polymorphism, Cleavasefragmentlängenpolymorphismus)-Verfahren
etc. erwähnt
werden. Jedes dieser Verfahren schließt als den ersten Schritt die
Amplifikation der jeweiligen Genfragmente, die geeignete Längen haben und
die innerhalb davon eine Stelle des Polymorphismus enthalten, in
der gleichen Art wie in dem vorstehenden Sequenzierungsverfahren
(1) ein.
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In
dem PCR-SSCP-Verfahren werden die amplifizierten Produkte durch
Hitze, Behandlung mit einem Alkali oder dergleichen in Einzelstränge denaturiert.
Die DNA-Fragmente, die in einzelne Stränge zerfallen sind, erzeugen
in Abhängigkeit
von den Rasensequenzen ihre eigenen einzigartigen Strukturen in
einer hohen Ordnung, so dass die Polymorphismen der Substitution
einer Base als ein Unterschied in der Mobilität durch Elektrophorese auf
einem nichtdenaturierten Gel wie z. B. einem Polyacrylamidgel nachgewiesen
werden können.
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In
dem PCR-DGGE-Verfahren werden die amplifizierten Produkte auf einem
denaturierten Gel mit einem Konzentrationsgradienten unter Verwendung
eines denaturierenden Mittels (SDS, Harnstoff, Formamid oder dergleichen)
durch Elektrophorese getrennt, nachdem sie denaturiert und erneut
assoziiert wurden. Weil der Polymorphismus einer Substitution von
einer Base den Schmelzpunkt (Tm) der Domäne, die diese enthält, verändert, dissoziiert
es teilweise an der Position, wo die Konzentration des denaturierenden
Mittels sich unterscheidet und als ein Ergebnis zeigt es eine unterschiedliche
Mobilität.
Insbesondere in dem Fall einer heterokonjugierten DNA werden Homoduplexe
vom Wildtyp und vom mutierten Typ und zwei Typen von Heteroduplexen,
die Fehlpaarungen besitzen, durch die Denaturierung und die erneute
Assoziation hergestellt. Daher werden vier Banden nachgewiesen.
In dem Fall, in dem die Mutation in der Domäne enthalten ist, welche den höchsten Tm
besitzt, erscheint jedoch keine Veränderung in der Mobilität. In diesem
Fall wird dieser Anteil mit der Zugabe einer GC-reichen Sequenz
von etwa 20 bis etwa 50 bp, dem so genannten GC-Haken, zu der 5'-Seite der DNA zu
einer Domäne,
die den höchsten
Tm besitzt, so dass es als eine Veränderung in der Mobilität nachgewiesen
werden kann.
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Das
PCR-CFLP-Verfahren denaturiert das amplifizierte Produkt in einzelne
Stränge
durch die Erhitzung oder durch eine Behandlung mit Alkali und anschließend werden
sie mit einem Enzym behandelt, das Cleavase genannt wird, das eine
Haarnadelstruktur erkennt und spaltet, und danach wird eine Gelelektrophorese
durchgeführt.
Die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Haarnadelstruktur aufgrund
eines Polymorphismus oder ein Unterschied in der Stelle, welche
die Haarnadel erzeugt, können
als ein Unterschied in der Anzahl der Banden und/oder der Mobilität nachgewiesen
werden.
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Das
vorstehende Verfahren (3) ist vorzuziehen, da es die genetischen
Polymorphismen schnell und leicht messen kann. Als ein solches Verfahren
kann ein RFLP-Verfahren, ein PCR-RFLP-Verfahren und dergleichen
erwähnt
werden.
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Das
RFLP-Verfahren ist ein Verfahren, das die Spaltung der genomischen
DNA, die aus einer vom Menschen stammenden Probe isoliert wurde,
mit einem Restriktionsenzym, das eines der genetischen Polymorphismen
an der Stelle des Polymorphismus spaltet (und gegebenenfalls mit
einem anderen Enzym, das die genomische DNA an geeigneten Stellen
stromaufwärts
beziehungsweise stromabwärts
der Stelle des Polymorphismus spaltet), das Durchführen einer
Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Teilsequenz oder
der gesamten Sequenz des Gens, das als eine Sonde betroffen ist,
und das Unterscheiden der Polymorphismen auf der Basis der Länge und
der Anzahl der Banden einschließt.
In der vorliegenden Erfindung wird BsmI für die Analyse des VDR-Gens
verwendet, XbaI wird für
die Analyse des ER-Gens verwendet und HhaI wird für die Analyse
des ApoE-Gens verwendet.
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Das
PCR-RFLP-Verfahren ist ein Verfahren, das die Synthese von spezifischen
Primerpaaren, welche die jeweiligen Genfragmente mit einer geeigneten
Länge amplifizieren
können,
die innerhalb davon die jeweiligen Stellen des Polymorphismus des
VDR-Gens, ER-Gens
und ApoE-Gens enthalten, das Durchführen der PCR unter Verwendung
der Primerpaare und einer von einem Menschen stammenden Probe als
eine Matrize, um die jeweiligen bestimmten Genfragmente zu amplifizieren,
das Durchführen
der Behandlung der amplifizierten Produkte mit einem Restriktionsenzym, ähnlich zu
dem vorstehenden RFLP-Verfahren, das Durchführen der Gelelektrophorese
und das Unterscheiden der Polymorphismen auf der Basis der Länge und
der Anzahl der Banden einschließt.
Wenn die Behandlung mit dem Restriktionsenzym vor der PCR durchgeführt wird, wird
die DNA, die mit dem Restriktionsenzym gespalten wurde, nicht amplifiziert,
so dass die Polymorphismen durch die Anwesenheit oder Abwesenheit
von Banden unterschieden werden können.
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Durch
die Analyse der Polymorphismen der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend
beschrieben wurde, werden die vom Menschen stammenden Proben auf
der Basis der Kombinationen der genetischen Polymorphismen des VDR-Gens,
des ER-Gens und des ApoE-Gens als [B(–) X(–) 4(–)], [B(–) X(–) 4(+)], [B(–) X(+) 4(–)], [B(–) X(+)
4(+)], [B(+) X(–)
4(–)],
[B(+) X(–)
4(+)], [B(+) X(+) 4(–)]
und [B(+) X(+) 4(+)] klassifiziert. Andererseits werden die vom
Menschen stammenden Proben auf der Basis der Kombinationen der genetischen
Polymorphismen des VDR-Gens, des ER-Gens und des ApoE-Gens als [B(–) X(–) 3(–)], [B(–) X(–) 3(+)],
[B(–) X(+)
3(–)],
[B(–)
X(+) 3(+)], [B(+) X(–)
3(–)],
[B(+) X(–)
3(+)], [B(+) X(+) 3(–)]
und [B(+) X(+) 3(+)] klassifiziert.
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Die
vorliegende Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass auf der Basis
einer Kombination der genetischen Polymorphismen antizipiert wird,
dass eine vom Menschen stammende Probe von einem Individuum stammt,
das eine spezifische Priorität
der Sensitivitäten
für eine
Vielzahl von Heilmitteln für
die Osteoporose zeigt. In der vorliegenden Erfindung ist die Vielzahl
der Heilmittel für
Osteoporose Vitamin D, Östrogen
und Vitamin K2. Hier bedeutet die Sensitivität für ein Heilmittel für Osteoporose
das Maß der
therapeutischen Wirkung des Heilmittels auf die Osteoporose. Das
heißt,
in dem Fall, in dem ein Medikament A eine höhere therapeutische Wirkung
als ein Medikament B für
einen Patienten besitzt, dann ist "die Sensitivität des Patienten für das Medikament
A höher
als die Sensitivität
für das
Medikament B". Unter
Verwendung einer Veränderung in
der Dichte der Knochenmineralien vor und nach der Verabreichung
eines Medikaments als einen Index der Sensitivität, wird in der vorliegenden
Erfindung definiert, dass je höher
der "Index der Veränderung
in der Dichte der Knochenmineralien" „Index
der Veränderung
in der antizipierten Dichte der Knochenmineralien" ist, desto höher ist
die Sensitivität
für das
Medikament.
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Das
analytische Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet,
dass in dem Fall, in dem die Kombination der genetischen Polymorphismen
des Vitamin D-Rezeptorgens,
des Östrogenrezeptorgens
und des Apolipoprotein-E-Gens [B(–) X(–) 4(–)] und [B(+) X(–) 4(–)] lautet,
antizipiert werden kann, dass die Probe von einem Individuum stammt,
das eine Sensitivität
für Vitamin
K2 besitzt, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Östrogen
ist, in dem Fall, in dem die Kombination der genetischen Polymorphismen
des Vitamin D-Rezeptorgens, des Östrogenrezeptorgens
und des Apolipoprotein-E-Gens
[B(–)
X(–) 4(+)]
ist, antizipiert werden kann, dass die Probe von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Vitamin
D besitzt, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
K2 und die Sensitivität
für Östrogen ist,
und in dem Fall, in dem die Kombination der genetischen Polymorphismen
des Vitamin D-Rezeptorgens, des Östrogenrezeptorgens
und des Apolipoprotein-E-Gens [B(–) X(+) 4(–)], [B(–) X(+) 4(+)], [B(+) X(+) 4(–)] und
[B(+) X(+) 4(+)] lautet, dass antizipiert werden kann, dass die
Probe von einem Individuum stammt, das eine Sensitivität für Östrogen
besitzt, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Vitamin K2
ist, und
in dem Fall, in dem die Kombination der genetischen
Polymorphismen des Vitamin D-Rezeptorgens,
des Östrogenrezeptorgens
und des Apolipoprotein-E-Gens [B(+) X(+) 3(+)] und [B(+) X(–) 3(+)]
lautet, antizipiert werden kann, dass die Probe von einem Individuum stammt,
das eine Sensitivität
für Vitamin
K2 besitzt, die höher als
die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Östrogen
ist, in dem Fall, in dem die Kombination der genetischen Polymorphismen
des Vitamin D-Rezeptorgens, des Östrogenrezeptorgens
und des Apolipoprotein-E-Gens [B(–) X(–) 3(+)], [B(–) X(–) 3(–)] oder
[B(+) X(–)
3(–)]
ist, antizipiert werden kann, dass die Probe von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Vitamin
D besitzt, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin K2
und die Sensitivität
für Östrogen
ist, und in dem Fall, in dem die Kombination der genetischen Polymorphismen
des Vitamin D-Rezeptorgens,
des Östrogenrezeptorgens
und des Apolipoprotein-E-Gens [B(–) X(+) 3(+)], [B(–) X(+)
3(–)]
oder [B(+) X(+) 3(–)]
lautet, antizipiert werden kann, dass die Probe von einem Individuum stammt,
das eine Sensitivität
für Östrogen
besitzt, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Vitamin
K2 ist, und
in dem Fall, in dem die Kombination der genetischen
Polymorphismen der Gene [B(+) X(–) 4(+)] ist, antizipiert werden
kann, dass die Probe von einem Individuum stammt, das keine Sensitivität für eines
der drei Mittel besitzt. Tabelle 1
| Vitamin K2 > Vitamin D oder Östrogen | [B(–) X(–) 4(–)] | [B(+)
X(+) 3(+)] |
| [B(+)
X(–) 4(–)] | [B(+)
X(–) 3(+)] |
| Vitamin D > Vitamin
K2 oder Östrogen | [B(–) X(–) 4(+)] | [B(–) X(–) 3(+)] |
| | [B(–) X(–) 3(–)] |
| | [B(+)
X(–) 3(–)] |
| Östrogen > Vitamin K2 oder Vitamin
D | [B(–) X(+)
4(–)] | [B(–) X(+)
3(+)] |
| [B(–) X(+)
4(+)] | [B(–) X(+)
3(–)] |
| [B(+)
X(+) 4(–)] | [B(+)
X(+) 3(–)] |
| [B(+)
X(+) 4(+)] | |
- [B(+) X(–) 4(+)] gilt als nicht sensitiv
für eines
der drei Mittel.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls einen Kit zum Analysieren
der genetischen Polymorphismen einer Probe, die menschliche genomische
DNA enthält,
der für
die Ausführung
des vorstehenden analytischen Verfahrens nützlich ist. Der Kit umfasst
ein Paar von Primern, das spezifisch ein Vitamin D-Rezeptorgen amplifizieren
kann, ein Paar von Primern, das spezifisch ein Östrogenrezeptorgen amplifizieren kann,
ein Paar von Primern, das spezifisch ein Apolipoprotein-E-Gen amplifizieren
kann und/oder eine Nucleinsäuresonde,
die spezifisch mit dem Vitamin D-Rezeptorgen hybridisieren kann,
eine Nucleinsäureson de,
die spezifisch mit dem Östrogenrezeptorgen
hybridisieren kann und eine Nucleinsäuresonde, die spezifisch mit dem
Apolipoprotein-E-Gen hybridisieren kann.
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In
dem Fall, in dem ein PCR-SSOP-Verfahren, ein PCR-SSCP-Verfahren,
ein PCR-DGGE-Verfahren, ein
PCR-CFLP-Verfahren, etc. bei der Analyse der Polymorphismen verwendet
werden, sind die jeweiligen verwendeten Primerpaare Oligonucleotide,
welche die gleiche Rasensequenz wie die Sequenz stromaufwärts der
Stelle des Polymorphismus von jedem Gen und die Sequenz stromabwärts der
Stelle des Polymorphismus von jedem Gen und eine Sequenz besitzen,
so dass die jeweiligen Genfragmente davon, welche die Stelle des Polymorphismus
enthalten, amplifiziert werden können.
Andererseits ist in dem Fall, in dem das MASA-Verfahren verwendet
wird, einer der Primer ein Primer, der eine Rasensequenz besitzt,
die vollständig
homolog (= sense) oder vollständig
komplementär
(= antisense) zu der Region ist, welche die Stelle des Polymorphismus
von jedem Gen enthält.
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In
dem Fall, in dem das RFLP-Verfahren bei der Analyse der Polymorphismen
verwendet wird, ist die Nucleinsäuresonde
nicht besonders eingeschränkt,
so fern sie einen Teil der Sequenz von jedem Gen enthält. Andererseits
ist in dem Fall, in dem das SSOP-Verfahren oder das PCR-SSOP-Verfahren
bei der Analyse der Polymorphismen verwendet wird, die Nucleinsäuresonde
eine, die eine Rasensequenz besitzt, die vollständig komplementär zu der
Sequenz der Region ist, welche die Stelle des Polymorphismus von
jedem Gen enthält.
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Der
Primer, der spezifisch für
das VDR-Gen ist, ist unter solchen Oligonucleotiden, die entwickelt
wurden, um durch Polymerasekettenreaktion (nachfolgend als PCR bezeichnet)
die Region des VDR-Gens zu amplifizieren, welche die Polymorphismen
des Restriktionsenzyms BsmI von Intron 8 von VDR als die Zielstelle des
Nachweises der vorliegenden Erfindung durch eine PCR enthält, wobei
sie einen Tm besitzen, der ähnlich zu
solchen der Primer zur Amplifikation des ApoE-Gens und des ER-Gens
ist. Insbesondere können
die nachfolgenden Primer zur Amplifikation als Beispiele für solche
dienen, die eine Annealing-Temperatur für die PCR von 50°C haben.
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Die
Primer, die spezifisch für
das ApoE-Gen sind, sind unter solchen Oligonucleotiden, die entwickelt wurden,
um die Region des ApoE-Gens zu amplifizieren, welche die Polymorphismen
von ApoE als die Zielstelle des Nachweises der vorliegenden Erfindung
durch eine PCR enthält,
wobei sie eine Tm besitzen, die ähnlich
zu solchen Primern der Amplifikation des ApoE-Gens und des ER-Gens
ist. Insbesondere können
die nachfolgenden Primer zur Amplifikation als Beispiele für solche
dienen, die eine Annealing-Temperatur für die PCR von 50°C haben.
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Die
Primer, die spezifisch für
das ER-Gen sind, sind unter solchen Oligonucleotiden, die entwickelt wurden,
um die Region des ER-Gens zu amplifizieren, welche die Polymorphismen
des Restriktionsenzyms XbaI von Intron 1 von ER als die Zielstelle
des Nachweises der vorliegenden Erfindung durch eine PCR enthält, wobei
sie einen Tm besitzen, der ähnlich
zu solchen Primer der Amplifikation des VDR-Gens und des ApoE-Gens
ist. Insbesondere können
die nachfolgenden Paare der Primer zur Amplifikation als Beispiele
für solche
dienen, die eine Annealing-Temperatur für die PCR von 50°C haben.
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Die
Sonde zum Nachweis des VDR-Gens ist unter solchen Oligonucleotiden,
welche den Typ B oder den Typ b an der Stelle des Polymorphismus
von BsmI des VDR-Gens binden, wobei sie einen TM besitzen, der ähnlich zu
solchen der Nachweissonden für
das ApoE-Gen und das ER-Gen ist. Insbesondere in dem Fall, in dem
die Temperatur bei der Hybridisierung 45°C beträgt, können die nachfolgenden Nachweissonden
als Beispiele dienen.
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Die
Sonde zum Nachweis des ApoE-Gens ist unter solchen Oligonucleotiden,
welche den Typ E4 (+) oder den Typ E4 (–) an der Stelle des Polymorphismus
des ApoE-Gens binden, wobei sie einen Tm besitzen, der ähnlich zu
solchen der Nachweissonden für
das VDR-Gen und das ER-Gen ist. Insbesondere in dem Fall, in dem
die Temperatur bei der Hybridisierung 45°C beträgt, können die nachfolgenden Nachweissonden
als Beispiele dienen.
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Um
das ApoE-Gen als 2/2-, 2/3-, 2/4-, 3/3-, 3/4- oder 4/4-Allel zu
klassifizieren, können
die nachfolgenden vier Sonden verwendet werden.
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Die
Sonde zum Nachweis des ER-Gens ist unter solchen Oligonucleotiden,
welche den Typ X oder den Typ x an der Stelle des Polymorphismus
von XbaI des ER-Gens binden, wobei sie einen Tm besitzen, deer ähnlich zu
solchen der Nachweissonden für
das VDR-Gen und das ApoE-Gen ist. Insbesondere in dem Fall, in dem
die Temperatur bei der Hybridisierung 45°C beträgt, können die nachfolgenden Nachweissonden
als Beispiele dienen.
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Das
Reagenz zum Amplifizieren der VDR-, ApoE- und ER-Gene schließen die
vorstehenden Primer zum Amplifizieren (1), (2), (3), (4), (7) und
(8) oder (1), (2), (5), (6), (7) und (8) oder (1), (2), (3), (4),
(7) und (9) oder (1), (2), (5), (6), (7) und (9) ein.
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Das
Reagenz zum Amplifizieren umfasst des weiteren hitzeresistente DNA-Polymerasen,
dNTPs und Puffer. Für
die hitzeresistenten DNA-Polymerasen können als Beispiele die Taq-DNA-Polymerase, die Tth-DNA-Polymerase,
die Pfu-DNA-Polymerase, etc. genannt werden. Die dNTPs bedeuten
ein Gemisch aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Des weiteren kann der
Puffer in Abhängigkeit
zu der verwendeten hitzeresistenten DNA-Polymerase ausgewählt werden.
Zum Beispiel werden Tris-Pufferlösungen,
die Mg-Ionen, Glycerin, etc. enthalten, für die Taq-Polymerase verwendet.
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Das
Reagenz für
das gleichzeitige Nachweisen der genetischen Polymorphismen der
VDR-, ApoE4-Arten- und ER-Gene schließt die vorstehenden Nachweissonden
(10), (11), (12), (13), (14) und (15) oder (10), (11), (12), (13),
(16) und (17) oder (10), (11), (12), (13), (18), (19), (14) und
(15) oder (10), (11), (12), (13), (18), (19), (16) und (17) ein.
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Die
Primer zur Amplifikation oder die Nachweissonden können an
eine markierte Substanz direkt oder indirekt gebunden sein. Als
markierte Substanzen können
radioaktive Substanzen, Enzyme, fluoreszierende Substanzen oder
Biotin als Beispiele genannt werden.
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Wenn
die markierte Substanz eine radioaktive Substanz ist, wird ihre
Dosis gemessen. Wenn die markierte Substanz ein Enzym ist, zum Beispiel
die alkalische Phosphatase, wird 5-Brom-4-chlor-3-indol-phosphorsäure-p-toluidin-Salz
(BCIP) und Nitrotetrazoliumblau (NBT) von ihr umgesetzt und die
Intensität
der Farbentwicklung des Produkts wird gemessen. Eine lumineszierende
Substanz wie z. B. eine 1,2-Dioxethan-Verbindung kann durch die
alkalische Phosphatase umgesetzt werden und die Menge der Lumineszenz,
die durch den Abbau der Verbindung hergestellt wird, kann gemessen
werden. Andere Enzyme als die alkalische Phosphatase wie z. B. die
Peroxidase können
ebenfalls in herkömmlichen
Verfahren verwendet werden. Wenn die Markierungssubstanz Biotin
ist, wird zum Beispiel an alkalische Phosphatase gebundenes Avidin
nach der PCR damit umgesetzt und die alkalische Phosphatase wird
durch ein herkömmliches
Verfahren nach der Reaktion gemessen.
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Das
Reagenz für
den gleichzeitigen Nachweis der genetischen Polymorphismen der VDR-,
ApoE4-Typen- und ER-Gene kann des weiteren die vorstehenden Primer
zur Amplifikation (1), (2), (3), (4), (7) und (8) oder (1), (2),
(5), (6), (7) und (8) oder (1), (2), (3), (4), (7) und (9) oder
(1), (2), (5), (6), (7) und (9) und die vorstehenden Nachweissonden
(10), (11), (12), (13), (14) und (15) oder (10), (11), (12), (13),
(16) und (17) oder (10), (11), (12), (13), (18), (19), (14) und
(15) oder (10), (11), (12), (13), (18), (19), (16) und (17) enthalten.
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In
dem vorstehenden Amplifikationsreagenz beträgt die endgültige Konzentration der Primer
bei der PCR 0,1 bis 1,0 μM.
Des weiteren wird bevorzugt, dass die Sonde eine Konzentration von
0,1 bis 1,0 pmol/μl in
den vorstehenden Nachweisreagenzien besitzt.
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Die
Proben von Organismen, die in dem Verfahren zum Nachweisen der vorstehenden
genetischen Polymorphismen verwendet werden, sind nicht besonders
eingeschränkt,
so fern sie Genome haben, die von Organismen erhalten werden, welche
die vorstehenden Proteine (VDR, ApoE und ER) herstellen. Zum Beispiel
gibt es Genome (DNAs), die von Komponenten der menschlichen Blutzellen
mit Phenol oder dergleichen extrahiert und gegebenenfalls gereinigt
wurden.
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Das
Verfahren zum Nachweisen der genetischen Polymorphismen der VDR-,
ApoE- und ER-Gene ist übereinstimmend
mit herkömmlichen
Verfahren für
das Nachweisen von Genen. Das heißt, es ist ein Verfahren, bei
dem die DNA in einer Probe mit einem Amplifikationsreagenz, das
Primer zur Amplifikation spezifisch für die VDR-, ApoE und ER-Gene
enthält,
amplifiziert wird, die genetischen Polymorphismen der VDR-, ApoE- und
ER-Gene anschließend
in der Probe unter Verwendung eines Nachweisreagenz, das die Nachweissonden zum
Nachweisen der genetischen Polymorphismen der VDR-, ApoE- und ER-Gene
enthält,
nachgewiesen werden.
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Insbesondere
ist es ein Verfahren, bei dem die DNA in der Probe, zum Beispiel
DNA, die aus menschlichem Blut gereinigt wurde, amplifiziert wird,
wobei ein Amplifikationsreagenz verwendet wird, das die vorstehenden
Primer zur Amplifikation enthält,
und die genetischen Polymorphismen der VDR-, ApoE- und ER-Gene in
der Probe von der amplifizierten Probe unter Verwendung der vorstehenden
Nachweissonden nachgewiesen werden.
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Eines
der Amplifikationsverfahren ist ein Verfahren, das im Allgemeinen
als Verfahren der Polymerasekettenreaktion (nachfolgend PCR) bezeichnet
wird, bei dem doppelsträngige
Proben-DNA erhitzt wird, um sie in einzelne Stränge umzuformen, ein Primer
zur Amplifikation angelagert wird, wobei die Einzelstränge als Matrizen
verwendet werden, und anschließend
die Temperatur erhöht
wird, um dNTPs von den Primern durch DNA-Polymerasen zu synthetisieren
und ihre Länge
zu vergrößern. Der
so erhaltene Doppelstrang wird in einzelne Stränge getrennt und die Wiederholung
der vorstehenden Reaktionen kann die DNA, welche die Zielregion
besitzt, effizient amplifizieren. Im Allgemeinen betragen die Reaktionsbedingungen
92 bis 95°C
für 30
Sekunden bis 1 Minute, 50 bis 65°C
für 20
Sekunden bis 1 Minute, 70–75°C für 20 Sekunden
bis 5 Minuten, wobei dieser Zyklus 20 bis 40 mal wiederholt wird.
In dem Bereich von 50 bis 65°C
erfolgt das vorstehende Annealing. Die Annealing-Temperatur, bei der die Reaktion erfolgreich
stattfinden wird, wird hauptsächlich
durch die Zusammensetzung der Primer reguliert. In dem Bereich von
70 bis 75°C
erfolgt die Extension und die Länge
der Zielregion, die amplifiziert werden soll, reguliert die Zeitspanne,
in der die Reaktion erfolgreich stattfinden wird.
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Das
Nachweisverfahren bedeutet ein Verfahren, bei dem die DNA, die durch
das vorstehende Amplifikationsverfahren amplifiziert wurde, durch
eine Nachweissonde nachgewiesen wird. Es wird bevorzugt, dass der
Amplifikationsprimer an einer markierten Substanz gebunden ist.
Mehrfach markierte Substanzen können an
den Primer gebunden sein.
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Das
Immobilisieren von drei Arten der Nachweissonden an einen Festphasenträger und
das Binden der amplifizierten Proben-DNA an die Sonde ermöglicht zum
Beispiel, die genetischen Polymorphismen der VDR-, ApoE- und ER-Gene
auf dem Festphasenträger
nachzuweisen. Als Festphasenträger
kann eine Nylonmembran, eine Mikrotiterplatte, etc. verwendet werden.
Um die Nachweissonden an den Festphasenträger zu immobilisieren, wird
zum Beispiel ein Verfahren verwendet, bei dem dTTP linear zu dem
Ende der Nachweissonde durch die terminale Deoxynucleotidyltransferase
(TdT) (polyT-Zugabe) zugegeben und sie von dem vorstehenden Träger äußerlich
adsorbiert wird. Drei genetische Polymorphismen können in
einer amplifizierten Probe gleichzeitig beurteilt werden, indem
die Nachweissonden für
die VDR-, ApoE- und ER-Gene in einer festen Phase zur Verfügung gestellt
werden oder indem sie zum Beispiel auf getrennten Stellen auf einer
Nylonmembran oder in individuellen Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte
immobilisiert werden.
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Die
amplifizierte DNA, die mit der Nachweissonde auf dem Festphasenträger hybridisiert,
kann durch das Messen der markierten Substanz, die daran bindet,
gemessen werden. Wie in 1 gezeigt wird, wird zum Beispiel
die Probe, die mit der Nachweissonde (10) reagiert, beurteilt, dass
sie vom Typ B(+) ist, das heißt sie
ist nicht bb. Die Nachweissonde (11) ist eine Kontrolle, um die
Amplifikation des VDR-Gens zu identifizieren. Die Probe, die mit
der Nachweissonde (12) reagiert, wird beurteilt, dass sie vom Typ
ApoE4 (+) ist. Aber die Probe, die nicht mit der Nachweissonde (12)
reagiert, wird beurteilt, dass sie vom Typ ApoE4 (–) ist.
Die Nachweissonde (13) ist eine Kontrolle, um die Amplifikation
des ApoE-Gens zu identifizieren. Die Probe, die mit der Nachweissonde
(14) reagiert, wird beurteilt, dass sie vom Typ ER X(+) ist. Die
Probe, die nicht mit der Nachweissonde (14) reagiert, wird beurteilt,
dass sie der Typ ER (–)
ist. Die Nachweissonde (15) ist eine Kontrolle, um die Amplifikation
des ER-Gens zu identifizieren. Von diesen Kombinationen können die
genetischen Polymorphismen der drei Gene in der Probe nachgewiesen
werden.
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Der
Kit kann des weiteren verschiedene Reagenzien und/oder Laborgeräte enthalten,
die für
die Durchführung
des analytischen Verfahrens der vorliegenden Erfindung geeignet
sind.
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Das
Verfahren zur Auswahl eines knochenassoziierten Heilmittels kann
die Kombinationen der genetischen Polymorphismen der VDR-, ApoE-
und ER-Gene betreffen, die durch das Verfahren zum Nachweisen der
genetischen Polymorphismen der VDR-, ApoE- und ER-Gene, das vorstehend
beschrieben wurde, für Heilmittel
für knochenassoziierte
Erkrankungen nachgewiesen wurde. Das heißt, die menschliche Probe,
deren genetischer Polymorphismus von VDR vom Typ B(–) ist,
wird beurteilt, eine hohe Sensitivität für Vitamin D zu haben. Die menschliche
Probe, deren genetischer Polymorphismus von VDR vom Typ B(+) ist
und deren genetischer Polymorphismus von ApoE vom Typ E4 (–) ist,
wird beurteilt, eine hohe Sensitivität für Vitamin K2 zu haben. Die
menschliche Probe, deren genetischer Polymorphismus von VDR vom
Typ B(+) ist, deren genetischer Polymorphismus von ApoE vom Typ
E4 (+) ist und deren genetischer Polymorphismus von ER vom Typ X(+)
ist, wird beurteilt, eine hohe Sensitivität für Östrogen zu besitzen. Des weiteren
wird die menschliche Probe, deren genetischer Polymorphismus von
VDR vom Typ B(+) ist, deren genetischer Polymorphismus von ApoE
vom Typ E4 (+) ist und deren genetischer Polymorphismus von ER vom
Typ (–)
ist, beurteilt, eine niedrige Sensitivität für Vitamin D, Vitamin K2 und Östrogen zu
haben, so dass es möglich
ist, die Verabreichung von einem anderen Medikament als die drei
Medikamente zu untersuchen.
-
Die
nachfolgenden Sonden können
für das
Nachweisen des Polymorphismus des Typs ApoE 3 anstelle der Nachweissonden,
die vorstehend erwähnt
wurden, verwendet werden. Nachweissonden
zum Nachweisen des Polymorphismus des ApoE-Gens:
-
Der
Polymorphismus von Typ ApoE 2 kann mit den Nachweissonden (13) und
(19), der Polymorphismus von Typ ApoE 3 mit den Nachweissonden (13)
und (18) und der Polymorphismus von Typ ApoE 4 mit den Nachweissonden
(12) und (18) reagieren. Der Polymorphismus, der mit den Nachweissonden
(12), (13) und (18), nicht aber mit (19) reagiert, ist der Typ ApoE
3/4. Der Polymorphismus, der nur mit den Nachweissonden (13) und
(18) reagiert, ist der Typ 3(+) (= 3/3 Typ) und der andere Polymorphismus
ist der Typ 3(–).
-
Der
Kit zum Nachweisen kann ebenfalls geeignete Mittel und/oder Laborgeräte umfassen,
um das vorliegende Verfahren zum Nachweisen durchzuführen.
-
Beispiele
-
Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung detailliert durch Referenzbeispiele
und Beispiele erklärt.
-
Referenzbeispiel 1
-
Blut
wurde von 177 japanischen Frauen nach der Menopause, die nach dem
Zufallsprinzip ausgewählt wurden,
entnommen und die Blutzellen wurden fraktioniert und die genomische
DNA wurde durch herkömmliche
Verfahren extrahiert und gereinigt. Ein VDR-Genfragment, ein ER-Genfragment und
ein ApoE-Genfragment wurden getrennt amplifiziert, wobei die genomische
DNA als eine Matrize und die nachfolgenden Primerpaare verwendet
wurden. Primer
für das
Amplifizieren des VDR-Genfragments:
Primer
für das
Amplifizieren des ER-Genfragments:
Primer
für das
Amplifizieren des ApoE-Genfragments:
-
Die
Bedingungen der PCR waren für
die Denaturierung 94°C,
60 Sekunden; Annealing: 62°C,
60 Sekunden; Verlängerung:
72°C, 60
Sekunden (30 Zyklen) für
das VDR-Gen; Denaturierung: 94°C,
30 Sekunden; Annealing: 65°C,
30 Sekunden; Verlängerung:
72°C, 30
Sekunden (30 Zyklen) für
das ER-Gen und Denaturierung: 94°C,
30 Sekunden; Annealing: 61°C,
40 Sekunden; Verlängerung:
72°C, 90
Sekunden (30 Zyklen) für
das ApoE-Gen. Diese PCR-Amplifikation ergab ein VDR-Genfragment
von 7,2 kbp, ein ER-Genfragment von 1,3 kbp und ein ApoE-Genfragment
von 244 bp, welche die jeweiligen Stellen des Polymorphismus enthielten.
Nach der Behandlung eines Reaktionsgemisches der Amplifikation des
VDR-Gens mit BsmI,
eines Reaktionsgemisches der Amplifikation des ER-Gens mit XbaI
und eines Reaktionsgemisches der Amplifikation des ApoE-Gens mit
HhaI, wurden die Reaktionsgemische für eine Agarosegelelektrophorese
verwendet. In dem Fall, in dem jedes Ampli fikationsprodukt mit dem
Restriktionsenzym an der Stelle des Polymorphismus gespalten wurde,
wurden Banden mit einer Länge
von 4,6 kbp und 2,6 kbp für
das Amplifikationsprodukt von VDR nachgewiesen, Banden mit einer
Länge von
900 bp und 400 bp für
das Amplifikationsprodukt von ER nachgewiesen und Banden mit einer
Länge von
72, 48, 38, 35, 19, 17 und 15 bp für das Amplifikationsprodukt von
ApoE nachgewiesen.
-
Die
Bande mit einer Länge
von 72 bp wurde in dem Fall nicht nachgewiesen, wenn kein Typ E4
(das heißt,
4(–))
vorlag. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit Ethidiumbromid
gefärbt
und die Polymorphismen der VDR-, ER- und ApoE-Gene wurden auf der
Basis der Bandenmuster unterschieden und in 8 Polymorphismengruppen
klassifiziert (Tabelle 3).
-
Die
Dichte der Knochenmaterialien der 177 japanischen Frauen wurde nach
der Analyse der Polymorphismen gemessen, wie vorstehend beschrieben
wurde. Anschließend
wurde den Patienten für
6 Monate entweder Vitamin D, Östrogen
oder Vitamin K2 verabreicht. Die Menge der Verabreichung betrug
1 μg/Tag
für Vitamin
D, 0,312 mg/Tag für Östrogen
und 45 mg/Tag für
Vitamin K2. Nach 6 Monaten wurde die Dichte der Knochenmineralien
erneut gemessen und ein Index der Veränderung in der Dichte der Knochenmineralien
vor und nach der Verabreichung eines Medikaments wurde erhalten.
Ein Wert, der durch das Subtrahieren eines antizipierten Werts der
therapeutischen Wirkung von jedem Medikament (Gesamtdurchschnitt
der therapeutischen Wirkung auf zufällig ausgewählte Patienten; Tabelle 3)
von einem durchschnittlichen Index der Veränderung in der Dichte der Knochenmineralien
für jeden
Genotyp erhalten wurde, wurde als die Sensitivität für ein Medikament für jeden
Genotypen definiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 2 Der Wert der antizipierten therapeutischen
Wirkung (Index der Veränderung
in der Dichte der Knochenmineralien) nach 6 Monaten der Verabreichung
eines Medikaments (Einheit: %).
| | Vitamin
D | Östrogen | Vitamin
K2 |
| N
Durchschnitt | 104
1.15 | 38
3.26 | 27
0.59 |
Tabelle 3 Die durchschnittliche therapeutische Wirkung
(%) – antizipierte
therapeutische Wirkung (%) für
jeden Genotypen. | Genotyp | | Vitamin
D | Östrogen | Vitamin
K2 |
| B(–)
X(–) 4(–) | n | 42 | 22 | 11 |
| Durchschnitt | 0.05 | –0.94 | 0.68 |
| B(–)
X(–) 4(+) | n | 14 | 4 | 6 |
| Durchschnitt | 0.56 | –2.52 | –2.68 |
| B(–)
X(+) 4(–) | n | 16 | 7 | 5 |
| Durchschnitt | 0.37 | 2.78 | 0.60 |
| B(–)
X(+) 4(+) | n | 8 | 2 | |
| Durchschnitt | 0.34 | 7.87 | |
| B(+) X(–)
4(–) | n | 14 | 5 | 3 |
| Durchschnitt | –0.66 | –0.93 | 1.08 |
| B(+) X(–)
4(+) | n | 4 | 3 | 1 |
| Durchschnitt | –0.27 | –1.07 | –0.59 |
| B(+) X(+) 4(–) | n | 5 | 2 | 2 |
| Durchschnitt | –1.75 | 1.74 | 1.46 |
| B(+) X(+) 4(+) | n | 1 | 0 | 0 |
| Durchschnitt | 0.46 | | |
-
Wie
von Tabelle 3 offensichtlich sein wird, war die Sensitivität in dem
Fall, in dem die Genotypen [B(–) X(–) 4(–)] und
[B(+) X(–)
4(–)]
einschließen,
für Vitamin
K2 höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Östrogen.
In dem Fall, in dem die Genotypen [B(–) X(–) 4(+)] einschließen, war
die Sensitivität
für Vitamin
D höher
als die Sensitivität
für Vitamin
K2 und die Sensitivität
für Östrogen.
In dem Fall, in dem die Genotypen [B(–) X(+) 4(–)], [B(–) X(+) 4(+)], [B(+) X(+) 4(–)] und
[B(+) X(+) 4(+)] einschließen,
war die Sensitivität
für Östrogen
höher als
die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Vitamin
K2.
-
Beispiel 1
-
Blut
wird von einem japanischen Patienten entnommen, der unter Osteoporose
litt, und die Blutzellen werden fraktioniert und die DNA wird durch
herkömmliche
Verfahren extrahiert und gereinigt. Die Polymorphismen des VDR-Gens,
des ER-Gens und des ApoE-Gens werden in der gleichen Weise wie im
Referenzbeispiel 1 analysiert. In dem Fall, in dem der Genotyp [B(–) X(–) 4(–)] und
[B(+) X(–)
4(–)]
einschließt,
kann antizipiert werden, dass die genomische DNA von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Vitamin
K2 hat, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Östrogen
ist, und in dem Fall, in dem der Genotyp [B(–) X(–) 4(+)] einschließt, kann
antizipiert werden, dass die genomische DNA von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Vitamin
D hat, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
K2 und die Sensitivität
für Östrogen
ist. Des weiteren kann antizipiert werden, dass in dem Fall, in
dem der Genotyp [B(–)
X(+) 4(–)],
[B(–) X(+)
4(+)], [B(+) X(+) 4(–)]
und [B(+) X(+) 4(+)] einschließt,
die genomische DNA von einem Individuum stammt, das eine Sensitivität für Östrogen
hat, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Vitamin K2
ist.
-
Referenzbeispiel 2
-
Blut
wurde von 167 japanischen Frauen, die nach dem Zufallsprinzip ausgewählt wurden,
nach der Menopause entnommen und die Blutzellen wurden fraktioniert
und die genomische DNA wurde durch herkömmliche Verfahren extrahiert
und gereinigt. Ein VDR-Genfragment, ein ER-Genfragment und ein ApoE-Genfragment
wurden getrennt amplifiziert, wobei die genomische DNA als eine
Matrize und die gleichen Primerpaare wie in Referenzbeispiel 1 unter
den gleichen Bedingungen für
die Amplifikation verwendet wurden.
-
Nach
dem Behandeln der Reaktionsgemische der Genamplifikation mit den
jeweiligen Restriktionsenzymen, wurden die Reaktionsgemische für eine Agarosegelelektrophorese
verwendet. In dem Fall, in dem jedes Amplifikationsprodukt mit dem
Restriktionsenzym an der Stelle des Polymorphismus gespalten wurde, wurden
Banden mit einer Länge
von 4,6 kbp und 2,6 kbp für
das Amplifikationsprodukt von VDR nachgewiesen, Banden mit einer
Länge von
900 bp und 400 bp wurden für
das Amplifikationsprodukt von ER nachgewiesen und Banden mit einer
Länge von
72, 48, 38, 35, 19, 17 und 15 bp wurden für das Amplifikationsprodukt von
ApoE nachgewiesen.
-
Um
die Allele des Typs ApoE 3 nachzuweisen, wurden die Amplifikationsprodukte
mit HhaI behandelt und auf ein Gel für die Agarosegelelektrophorese
aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid
gefärbt
und die Polymorphismen des ApoE-Gens wurden auf der Basis des Bandenmusters unterschieden
und die ApoE 3-Typen wurden als eine Kombination von Banden identifiziert,
wie nachfolgend beschrieben wird.
| 2/2-Typ: | 16,
18, 38, 81, 91 bp |
| 2/3-Typ: | 16,
18, 33, 38, 48, 81, 91 bp |
| 2/4-Typ: | 16,
18, 19, 33, 38, 48, 72, 81, 91 bp |
| 3/3-Typ: | 16,
18, 33, 38, 48, 91 bp |
| 3/4-Typ: | 16,
18, 19, 33, 38, 48, 72, 91 bp |
| 4/4-Typ: | 16,
18, 19, 33, 38, 48, 72 bp |
-
Die
8 Polymorphismengruppen wurden klassifiziert (Tabelle 4). Tabelle 4 Durchschnittliche therapeutische Wirkung
(%) – antizipierte
therapeutische Wirkung (%) für
jeden Genotypen.
| Genotyp | | Vitamin
D | Östrogen | Vitamin
K2 |
| B(+) X(+) 3(+) | n | 6 | 3 | 1 |
| Durchschnitt | –0.69271 | 0.414441 | 3.247953 |
| B(+) X(–)
3(+) | n | 14 | 6 | 2 |
| Durchschnitt | 0.020422 | –0.89605 | 1.85249 |
| B(–)
X(+) 3(+) | n | 13 | 6 | 6 |
| Durchschnitt | 1.643171 | 3.74052 | –0.20826 |
| B(–)
X(–) 3(+) | n | 36 | 14 | 10 |
| Durchschnitt | 0.401685 | –0.07099 | –0.84426 |
| B(+) X(+) 3(–) | n | 1 | 0 | 0 |
| Durchschnitt | 0.461047 | | |
| B(+) X(–)
3(–) | n | 4 | 3 | 0 |
| Durchschnitt | 2.234264 | 0.03227 | |
| B(–)
X(+) 3(–) | n | 10 | 1 | 0 |
| Durchschnitt | –3.11426 | 4.513852 | |
| B(–)
X (–)
3(–) | n | 16 | 10 | 5 |
| Durchschnitt | 1.498286 | –1.15117 | –2.85484 |
-
Von
Tabelle 4 kann antizipiert werden, dass die Probe von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Vitamin
K2 hat, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Östrogen
ist, in dem Fall, in dem die Kombination der genetischen Polymorphismen
des Vitamin D-Rezeptorgens, des Östrogenrezeptorgens
und des Apolipoprotein- E-Gens
[B(+) X(–)
3(+)] und [B(+) X(+) 3(+)] einschließt. Und es kann antizipiert
werden, dass die Probe von einem Individuum stammt, das eine Sensitivität für Vitamin
D hat, die höher als
die Sensitivität
für Vitamin
K2 und die Sensitivität
für Östrogen
ist, in dem Fall, in dem die Kombination [B(–) X(–) 3(+)], [B(–) X(–) 3(–)] und
[B(+) X(+) 4(+)] einschließt.
Des weiteren kann antizipiert werden, dass die Probe von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Östrogen
hat, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Vitamin
K2 ist, in dem Fall, in dem die Kombination [B(–) X(+) 3(+)], [B(–) X(+) 3(–)] und
[B(+) X(+) 3(–)]
einschließt.
-
Beispiel 2
-
Blut
wird von einem japanischen Patienten entnommen, der unter Osteoporose
litt, und die Blutzellen werden fraktioniert und die DNA wird durch
herkömmliche
Verfahren extrahiert und gereinigt. Die Polymorphismen des VDR-Gens,
des ER-Gens und des ApoE-Gens werden in der gleichen Weise wie im
Referenzbeispiel 2 analysiert. In dem Fall, in dem der Genotyp [B(+)
X(+) 3(+)] und [B(+) X(–)
3(+)] einschließt,
kann antizipiert werden, dass die genomische DNA von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Vitamin
K2 hat, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Östrogen
ist, und in dem Fall, in dem der Genotyp [B(–) X(–) 3(+)], [B(–) X(–) 3(–)] und
[B(+) X(–)
3(–)]
einschließt,
kann antizipiert werden, dass die genomische DNA von einem Individuum
stammt, das eine Sensitivität
für Vitamin
D hat, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
K2 und die Sensitivität
für Östrogen
ist. Des weiteren kann antizipiert werden, dass in dem Fall, in
dem die Genotypen [B(–)
X(+) 3(+)], [B(–)
X(–) 3(–)] und
[B(+) X(+) 3(–)]
einschließen,
die genomische DNA von einem Individuum stammt, das eine Sensitivität für Östrogen
hat, die höher
als die Sensitivität
für Vitamin
D und die Sensitivität
für Vitamin
K2 ist.
-
Beispiel 3
-
Die
nachfolgenden vier Arten von Reagenzien (1) bis (4) wurden hergestellt.
| Reagenz
(1) | 50% | Glycerin |
| Reagenz
(2) | 5
mM | Magnesiumchlorid |
| Reagenz
(3) | 0,25
M | Nariumchlorid |
| | 0,05
M | Tris-Salzsäurepuffer |
| | 0,05% | Gelatine |
| | 1
mM | dNTPs |
| Reagenz
(4) | 3 μM | VDR-Primer
(SEQ Nr. 1), der mit einem Biotin am 5'-Ende kombiniert wurde |
| | 3 μM | VDR-Primer
(SEQ ID Nr. 2) |
| | 3 μM | ApoE-Primer
(SEQ Nr. 3), der mit einem Biotin am 5'-Ende kombiniert wurde |
| | 3 μM | ApoE-Primer
(SEQ ID Nr. 4) |
| | 3 μM | ER-Primer
(SEQ Nr. 7), der mit einem Biotin am 5'-Ende kombiniert wurde |
| | 3 μM | ER-Primer
(SEQ Nr. 8) |
-
Zu
5 μl (n
= 8) DNA, die aus menschlichem Blut gereinigt wurde, wurden 10 μl von jedem
der Reagenzien (1) und (4) zugegeben und des weiteren wurden 4,8 μl sterilisiertes
gereinigtes Wasser und 0,2 μl
hitzeresistente DNA-Polymerase (ToYoBo Taq-Polymerase) zugegeben.
Die so erhaltene Lösung
wurde auf 95°C für 5 Minuten
erhitzt [95°C
für 30
Sekunden, 50°C
für 20
Sekunden oder 72°C
für 20
Sekunden], wobei der Zyklus 30 mal wiederholt wurde, und die PCR
wurde unter der Bedingung von 72°C
für 10
Minuten durchgeführt.
Das amplifizierte Produkt wurde für eine Agarosegelelektrophorese
verwendet. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
-
Wie
von 2 offensichtlich sein wird, wurden die Banden,
die den VDR-, ApoE- und ER-Genen zugeschrieben werden können, von
jedem der drei Proben nachgewiesen.
-
Beispiel 4
-
Anstelle
der ApoE-Primer von Beispiel 3, welche die Oligonucleotide der SEQ
Nr. 3 und SEQ Nr. 4 haben, wurden neue Primer, welche die Oligonucleotide
SEQ Nr. 5 und SEQ Nr. 6 haben, und anstelle der ER-Primer von Beispiel
3, welche die Oligonucleotide mit der SEQ Nr. 7 und SEQ Nr. 8 haben,
wurden die neuen Primer, welche die Oligonucleotide mit der SEQ
Nr. 8 und SEQ Nr. 9 haben, verwendet, um die gereinigte DNA aus
dem menschlichen Blut in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 zu
reinigen. Die amplifizierten Produkte wurden für eine Agarosegelelektrophorese
verwendet. Die Ergebnisse sind ähnlich
zu denen in Beispiel 3.
-
Beispiel 5
-
Eine
PolyT-Zugabe wurde für
sechs Sonden, das heißt,
die VDR-Sonden (SEQ Nr. 10) und (SEQ Nr. 11), die ApoE-Sonden (SEQ
Nr. 12) und (SEQ Nr. 13) und die ER-Sonden (SEQ Nr. 14) und (SEQ
Nr. 15), unter Verwendung der TaKaRa terminalen Deoxynucleotidyl-Transferase
und dTTP durchgefürt.
Ein einzelnes Blatt einer Nylonmembran (4 × 0,4 cm) wurde an getrennten
Stellen mit den Sonden, denen polyT zugegeben wurde, jeweils mit
einer Menge von 0,5 μl
beschichtet. Sie wurde mit ultravioletten Strahlen bei 312 nm für 2 Minuten
bestrahlt, um sie zu immobilisieren, um einen Nachweisstreifen herzustellen.
-
Anschließend wurden
die nachfolgenden zwei Arten von Reagenzien hergestellt.
| Reagenz
(5) | 5
M | Natriumhydroxid |
| | 0,05
M | EDTA |
| Reagenz
(6) | 0,01% | SDS |
| | 1,8% | Natriumchlorid |
| | 1% | Natriumcitrat |
-
Zu
10 μl der
Probe, die in Beispiel 3 amplifiziert wurde, wurden 10 μl des Reagenz
(5) zugegeben und das Gemisch wurde gut gerührt und anschließend für 5 Minuten
ruhen gelassen. Zu der Probenlösung
wurden 1 ml des Reagenz (6) zugegeben und ein Teil des oben genannten
Nachweisstreifens zugegeben, gefolgt durch das Schütteln bei
einer Reaktionstemperatur von 45°C
für 30
Minuten, um zu ermöglichen,
dass die Reaktion stattfindet. Anschließend wurde an Streptavidin
gebundene alkalische Phosphatase zugegeben. Des weiteren wurden
BCIP und NBT zugegeben. Dieses führte
zu einer Farbentwicklung durch die alkalische Phosphatase, die an
den Proben gebunden war, die an den entsprechenden Sonden auf dem
Nachweisstreifen gebunden waren. Die Ergebnisse, die von den Intensitäten der
Farbentwicklung erhalten wurden, werden in 3 gezeigt.
-
Von
3 wurden
die Proben Nr. 1 bis Nr. 8 beurteilt, dass sie die genetischen Polymorphismen
besitzen, wie nachfolgend in Tabelle 5 gezeigt wird. Tabelle 5
| | Genetischer
Polymorphismus von VDR | Genetischer
Polymorphismus von ApoE | Genetischer
Polymorphismus von ER |
| Probe
Nr. 1 | Bb | 4(+) | xx |
| Probe
Nr. 2 | BB | 4(–) | Xx |
| Probe
Nr. 3 | bb | 4(+) | XX |
-
Von
den Proben, die in Beispiel 4 verwendet wurden, wurden getrennt
die genetischen Polymorphismen auf der Basis der Fragmentlängen der
Restriktionsenzymspaltung für
das Restriktionsenzym BsmI für
das VDR-Gen beurteilt. Für
das ApoE-Gen wurde eine Beurteilung durchgeführt, wobei ein Reagenz verwendet wurde,
das nur den Genotyp von ApoE (Handelsname: INNO-LiPA ApoE, hergestellt
von Innogenetics Corp.) nachweist. Des weiteren wurde eine Beurteilung
des ER-Gens auf der Basis der Fragmentlängen der Restriktionsspaltung
durch das Restriktionsenzym XbaI vorgenommen. Die Ergebnisse werden
im
4 bis
6 und in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6
| | Genetischer
Polymorphismus von VDR | Genetischer
Polymorphismus von ApoE | Genetischer
Polymorphismus von ER |
| Probe
Nr. 1 | Bb | 3/4 | xx |
| Probe
Nr. 2 | BB | 3/3 | Xx |
| Probe
Nr. 3 | bb | 4/4 | XX |
-
Wie
von den Tabellen 5 und 6 offensichtlich sein wird, stimmen die Ergebnisse
miteinander überein.
-
Unter
Verwendung des Nachweisreagenz können
die drei Gene, das heißt,
die VDR-, ApoE und ER-Gene, gleichzeitig amplifiziert werden und
die drei genetischen Polymorphismen können durch einen einzelnen
Arbeitvorgang unter Verwendung der amplifizierten Produkte nachgewiesen
werden. Da die Gene mit Osteoporose assoziiert sind, können des
weiteren wirksame Heilmittel für
die Osteoporose durch die Verwendung der Nachweisreagenzien auf
der Basis einer Kombination der genetischen Polymorphismen der Gene durch
die Ergebnisse des Nachweises der genetischen Polymorphismen ausgewählt werden.
-
Beispiel 6
-
Eine
PolyT-Zugabe wurde in acht Sonden, das heißt die VDR-Sonden (SEQ Nr.
10) und (SEQ Nr. 11), die ApoE-Sonden (SEQ Nr. 12) und (SEQ Nr.
13), (SEQ Nr. 18) und (SEQ Nr. 19) und die ER-Sonden (SEQ Nr. 14)
und (SEQ Nr. 15), unter Verwendung der TaKaRa terminalen Deoxynucleotidyl-Transferase
und dTTP durchgeführt.
Ein einzelnes Blatt einer Nylonmembran (4 × 0,4 cm) wurde an getrennten
Stellen mit den Sonden, denen polyT zugegeben wurde, jeweils mit
einer Menge von 0,5 μl
beschichtet. Sie wurde mit ultravioletten Strahlen bei 312 nm für 2 Minuten
bestrahlt, um sie zu immobilisieren, um einen Nachweisstreifen herzustellen.
-
Anschließend wurden
die nachfolgenden zwei Arten von Reagenzien hergestellt.
| Reagenz
(5) | 5
M | Natriumhydroxid |
| | 0,05
M | EDTA |
| Reagenz
(6) | 0,01% | SDS |
| | 1,8% | Natriumchlorid |
| | 1% | Natriumcitrat |
-
Zu
10 μl der
Probe, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 amplifiziert
wurde, wurden 10 μl
des Reagenz (5) zugegeben und das Gemisch wurde gut gerührt und
anschließend
für 5 Minuten
ruhen gelassen. Zu der Probenlösung
wurden 1 ml des Reagenz (6) zugegeben und ein Teil des oben genannten
Nachweisstreifens zugegeben, gefolgt durch das Schütteln bei
einer Reaktionstemperatur von 45°C
für 30
Minuten, um zu ermöglichen,
dass die Reaktion stattfindet. Anschließend wurde an Streptavidin
gebundene alkalische Phosphatase zugegeben. Des weiteren wurden
BCIP und NBT zugegeben. Dieses führte
zu einer Farbentwicklung durch die alkalische Phosphatase, die an
den Proben gebunden war, die an den entsprechenden Sonden auf dem
Nachweisstreifen gebunden waren. Die Proben Nr. 1 bis 8 wurden beurteilt,
dass sie die genetischen Polymorphismen haben, wie sie nachfolgend
in Tabelle 7 gezeigt werden. Tabelle 7
| | Genetischer
Polymorphismus von VDR | Genetischer
Polymorphismus von ApoE | Genetischer
Polymorphismus von ER |
| Probe
Nr. 1 | Bb | 3/4 | xx |
| Probe
Nr. 2 | BB | 4/4 | XX |
| Probe
Nr. 3 | bb | 3/3 | XX |
-
Wirkung der Erfindung
-
Gemäß der analytischen
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Bestimmung, für welches Heilmittel
für Osteoporose
ein bestimmter Patient eine höhere
Sensitivität
hat, vor der Verabreichung des Medikaments mit einer hohen Wahrscheinlichkeit
getroffen werden, so dass die Auswahl eines geeigneten Medikaments
möglich
ist. Daher kann eine nicht wirksame Therapie, bei der ein Medikament,
das eine geringe therapeutische Wirkung besitzt, für einen
langen Zeitraum verabreicht wird, vermieden werden, so dass das
Verfahren der Erfindung sehr nützlich
für die
Verbesserung der QOL des Patienten ist.
-
Unter
Verwendung des Nachweisreagenz können
die drei Gene, das heißt,
die VDR-, ApoE- und ER-Gene, gleichzeitig amplifiziert und die drei
genetischen Polymorphismen können
durch einen einzelnen Arbeitsvorgang unter Verwendung der amplifizierten
Produkte nachgewiesen werden. Weil die Gene mit Osteoporose assoziiert
sind, können
des weiteren wirksame Heilmittel für die Osteoporose durch die
Verwendung der Nachweisreagenzien auf der Basis einer Kombination
der genetischen Polymorphismen der Gene durch die Ergebnisse des
Nachweises der genetischen Polymorphismen ausgewählt werden, wie beansprucht
wird.
-
Freier Text des Sequenzprotokolls
-
SEQ
ID Nr. 1 und 2: Oligonucleotide, die entwickelt wurden, um als ein
Primer für
das Amplifizieren eines Fragments des VDR-Gens zu wirken, das eine
Stelle des Polymorphismus enthält.
-
SEQ
ID Nr. 3, 4, 5 und 6: Oligonucleotide, die entwickelt wurden, um
als ein Primer für
das Amplifizieren eines Fragments des ApoE-Gens zu wirken, das eine
Stelle des Polymorphismus enthält.
-
SEQ
ID Nr. 7, 8 und 9: Oligonucleotide, die entwickelt wurden, um als
ein Primer für
das Amplifizieren eines Fragments des ER-Gens zu wirken, das eine
Stelle des Polymorphismus enthält.
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SEQ
ID Nr. 10 und 11: Oligonucleotide, die entwickelt wurden, um als
eine Sonde für
das Nachweisen eines Fragments des VDR-Gens zu wirken, das eine
Stelle des Polymorphismus enthält.
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SEQ
ID Nr. 12, 13, 18 und 19: Oligonucleotide, die entwickelt wurden,
um als eine Sonde für
das Nachweisen eines Fragments des ApoE-Gens zu wirken, das eine
Stelle des Polymorphismus enthält.
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SEQ
ID Nr. 14, 15, 16 und 17: Oligonucleotide, die entwickelt wurden,
um als eine Sonde für
das Nachweisen eines Fragments des ER-Gens zu wirken, das eine Stelle
des Polymorphismus enthält. Sequenzprotokoll
Primer für das Amplifizieren des ApoE-Genfragments:
