DE69832606T2

DE69832606T2 - Acrylamidase-enzyme

Info

Publication number: DE69832606T2
Application number: DE69832606T
Authority: DE
Inventors: Jonathan Hughes; Christine Yvonne ARMITAGE
Original assignee: Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd
Current assignee: Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd
Priority date: 1997-08-07
Filing date: 1998-08-06
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: US5962284A; DE69832606D1; AU742259B2; AU8639798A; EP0988375A1; ATE311441T1; ZA987141B; GB9716764D0; WO1999007838A1; EP0988375B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Acrylamidaseenzyme, Mikroorganismen, die solche Enzyme herstellen können, und die Verwendung dieser Enzyme und Mikroorganismen.
Die Umwandlung von Acrylamid in Acrylsäure (oder ein Salz hiervon, zum Beispiel Ammoniumacrylat) unter Verwendung von Amidaseenzymen ist hinreichend bekannt. Amidaseenzyme mit einer solchen Aktivität werden hierin als Acrylamidaseenzyme bezeichnet.
Insbesondere wird in EP-A-329325 über die Behandlung von Acrylamidpolymeren mit Acrylamidaseenzymen berichtet, um den freien Acrylamidgehalt des Polymeren zu verringern. EP-A-329325 beschreibt die Behandlung eines Acrylamidpolymergels mit einem Amidaseenzym, um den freien Acrylamidgehalt zu verringern. Die Internationale Anmeldung WO97/29136 der hierin genannten Erfinder (die nicht vor dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wird) beschreibt Verfahren, worin ein Polyacrylamidgel hergestellt wird, und die Acrylamidmonomeranteile auf sehr geringe Werte verringert werden und/oder während des herkömmlichen Herstellungsprozesses reduziert werden, ohne daß separate und umfangreiche Behandlungsschritte erforderlich sind.
Besondere Probleme ergeben sich aus der Behandlung von Polyacrylamiden, die bei niedrigen pH-Werten (z.B. pH 5 oder darunter) gebildet worden sind. Dies erfolgt zum Beispiel häufig, um die Polymerisationsreaktion zu kontrollieren. Bestimmte Polymerisationsinitiatoren sind bei niedrigen pH-Werten am wirksamsten, so daß die Monomerlösung während der Polymerisationsreaktion auf einen niedrigen pH gepuffert wird.
Dies trifft insbesondere auf kationische Polyacrylamide (d.h. Polymere, welche aus einer Monomermischung, umfassend Acrylamid und ein oder mehrere kationische Monomere, gebildet werden) und im wesentlichen nichtionische Polyacrylamide (d.h. Acrylamidhomopolymere und Polymere, welche aus einer Monomermischung, umfassend Acrylamid, ein oder mehrere nichtionische Monomere und im wesentlichen kein ionisches Monomer, gebildet werden) zu. Einige anionische Polyacrylamide (d.h. Polymere, welche aus Acrylamid und einem oder mehreren anionischen Monomeren gebildet werden) können auch bei einem pH unterhalb 6 gebildet werden, obwohl dies nicht so verbreitet ist wie bei kationischen und nichtionischen Acrylamiden. In solchen Fällen werden die Polyacrylamide im allgemeinen bei niedrigen pH-Werten hergestellt, um die Wirksamkeit der verwendeten Initiatorsysteme zu optimieren. Das Puffersystem, welches den niedrigen pH (etwa pH 4) aufrechterhält, schließt normalerweise eine organische Säure wie Adipinsäure ein. Diese Säure stabilisiert auch kationische Monomere (falls vorhanden) gegen eine Hydrolyse, welche ein Problem darstellen kann, wenn das Polymerprodukt zum Gebrauch zu hartem Wasser zugegeben wird, und ist folglich bei der Herstellung von kationischen Polyacrylamiden in größeren Mengen vorhanden, als wenn zum Beispiel nichtionische Polyacrylamide hergestellt werden.
Daher werden einige Polyacrylamide, insbesondere kationische und nichtionische Polyacrylamide, häufig bei einem niedrigen pH von etwa pH 4 hergestellt.
Jedoch ist allgemein bekannt, daß Acrylamidaseenzyme ihre höchste Aktivität und Wirksamkeit bei einem neutralen pH (etwa pH 6 oder 7) zeigen. Es ist allgemein bekannt, daß, wenn der pH abnimmt und das relevante Medium saurer wird, sich die Wirksamkeit der Acrylamidaseenzyme bei der Umwandlung von Acrylamid in Acrylsäure oder ein Salz hiervon verringert. Viele Acrylamidaseenzyme mit einer guten Effizienz bei pH 6 oder 7 zeigen bei pH 3 oder 4 eine sehr unzureichende Leistungsfähigkeit.
Daher ist es allgemein üblich, den pH-Wert eines Polyacrylamids, das bei einem niedrigen pH von etwa pH 4 bis etwa pH 6 oder 7 gebildet worden ist, vor der Behandlung mit einer Acrylamidase zur Verringerung des freien Acrylamidgehalts einzustellen. EP-A-393,916 erläutert zum Beispiel, daß es üblich ist, den pH-Wert von kationischen Polyacrylamiden vor der Behandlung mit einer Acrylamidase einzustellen. US 4,786,679 und US 4,742,114 beschreiben die Behandlung eines nicht genauer beschriebenen "Polymerlatex" und "Polyacrylamidlatex" bei einem pH von 8,35 bzw. 7.
In EP-A-272026 werden Acrylamidaseenzyme zur Behandlung eines Polymerlatex (d.h. einer Polymeremulsion) aus verschiedenen Polyacrylamiden beschrieben. Es wird die Behandlung von anionischen, nichtionischen und kationischen Polyacrylamiden beschrieben. Jedoch wird der pH-Wert jedes Polymerlatex auf einen Wert von etwa 6 eingestellt, bevor er mit der Acrylamidase behandelt wird. Die Verwendung eines solchen Systems hat Nachteile, da es einen zusätzlichen Behandlungsschritt zwischen der Herstellung und der Behandlung eines kationischen Polyacrylamids erforderlich macht. Falls eine solche Behandlung in einen großtechnischen Prozess eingeführt wird, wäre es notwendig, entweder zusätzliche Behandlungsschritte in den Prozess einzuführen und damit den erforderlichen Zeitraum oder die Komplikationen zu erhöhen, oder eine zusätzliche Apparatur vorzusehen, welche ermöglicht, daß die Behandlung innerhalb des Zeitmaßstabs des Prozesses ausgeführt werden kann.
Die damit verwandte Veröffentlichung EP-A-272,025 beschreibt außerdem die Behandlung eines kationischen Latex bei sowohl pH 4 als auch pH 6. Obwohl die Behandlung bei pH 6 bei der Verringerung des freien Acrylamidgehalts wirksam ist, zeigen die vorgestellten Ergebnisse, daß die Behandlung mit der in diesem Beispiel verwendeten Acrylamidase bei pH 4 unwirksam ist. Es wird keine Verringerung des freien Acrylamidgehalts erreicht.
US 4,687,807 und US 4,786,679 beschreiben ein Verfahren zur Verringerung der Menge des nicht umgesetzten Acrylamids, das in Wasser-in-Öl-Emulsionen von Acryl amidpolymeren vorhanden ist. Dieses Verfahren umfaßt das Behandeln der Emulsion mit einer Amidase, welche in der Lage ist, Acrylamid zu hydrolysieren. Der pH-Wert wird normalerweise vor Zugabe der Amidase auf einen pH innerhalb des Bereiches von 4,5 bis 8,5 eingestellt.
US 4,687,807 erläutert, daß bei einem pH zwischen 6 und 7 eine optimale Amidaseaktivität erhalten wird. Ebenfalls beschrieben wird die Behandlung von kationischen Polyacrylamiden bei einem sauren pH-Wert. In dieser Referenz werden die kationischen Polyacrylamide in Form einer Polymeremulsion hergestellt, und der pH-Wert der Emulsion wird anschließend eingestellt. In beiden Beispielen wird der pH-Wert auf einen pH von 3,8 und einen pH von 5,5 eingestellt. Der Latex wird dann bei dem eingestellten pH-Wert mit einer Amidase behandelt, um den freien Acrylamidgehalt zu verringern. Die Beispiele zeigen, daß die Behandlung nicht besonders wirksam ist. Bei pH 5,5 ist ein Zeitraum von 24 Stunden erforderlich, um den Acrylamidmonomergehalt von 900 ppm auf 200 ppm zu verringern, und nach weiteren 24 Stunden wird der Acrylamidmonomergehalt nur auf 150 ppm verringert. Die Behandlung bei pH 3,8 zeigt, daß sich die Leistungsfähigkeit des Amidaseenzyms wesentlich verringert hat. Nach 24 Stunden wird der Monomergehalt von 900 ppm auf 400 ppm verringert, und nach weiteren 24 Stunden wird er nur auf 380 ppm verringert. Die Erfinder haben berechnet, daß die Aktivität bei pH 5,5 etwa 33% der äquivalenten Aktivität bei pH 7 entspricht, und daß die Aktivität bei pH 3,8 etwa 23% der äquivalenten Aktivität bei pH 7 entspricht. In diesem Dokument beschreibt Beispiel 10 ein Polymer, das eine geringe Menge eines kationischen Monomeren enthält, obgleich es eine viel größere Menge (40%) eines anionischen Monomeren enthält und nicht als ein kationisches Polyacrylamid klassifiziert werden würde. Das Beispiel beschreibt die Behandlung des Polymeren mit einem Amidaseenzym ohne Einstellung des pH-Wertes, aber die Ergebnisse scheinen eher vorhersagbar zu sein als erreicht zu werden.
Langdahl et al., Microbiology, Bd. 142 (1996), Nr. 1,145 bis 154, beschreiben die Isolierung des Stammes Rhodococcus erythropolis BL1 aus Meeresküstensedimenten. Rhodococcus erythropolis BL1 zeigt gegenüber Amid und Nitril eine Hydrolyseaktivität. Zu den Amidsubstraten, die durch Rhodococcus erythropolis BL1 bei pH 7,0 hydrolysiert werden, gehört Acrylamid.
Duran et al., Bioscience Biotechnology Biochemistry, Bd. 57 (1993), Nr. 8, 1323 bis 1328, beschreiben die Isolierung von zwei Rhodococcus erythropolis-Stämmen, JCM2892 und JCM6823, durch eine Southern-Hybridisierungsanalyse. Beide Stämme zeigen eine Nitril-Hydratase- und eine Amidaseaktivität. Acrylamid wird zum Beispiel bei pH 7,5 durch beide Stämme hydrolysiert.
Acharya et al., World Journal of Microbiology and Biotechnology, März 1997, Bd. 13, Nr. 2, 175 bis 178, beschreibt die Isolierung des Stammes Rhodococcus erythropolis A10 aus petrochemischen Abwässern. Zellfreie Extrakte von Rhodococcus erythropolis zeigen eine Nitril-Hydratase- und eine Amidaseaktivität. Die maximale Aktivität der beiden Enzyme wurde bei pH 7 erhalten. Zu den durchmusterten Amiden gehörte Acrylamid.
Es wäre wünschenswert, wenn es möglich wäre, kationische Polyacrylamide und andere Polyacrylamide, die bei einem niedrigen pH hergestellt werden (insbesondere nichtionische Polyacrylamide), zu behandeln, um ihren freien Acrylamidgehalt zu verringern, ohne daß der pH-Wert vor der Behandlung eingestellt werden muß. Es wäre auch wünschenswert, ein wirksameres Verfahren zur Verringerung des Acrylamidmonomergehalts in solchen Polyacrylamiden zu finden.
Die Erfinder stellen ein Acrylamidaseenzym bereit, das eine Acrylamidaseaktivität bei pH 4,0 besitzt, welche mindestens 50% der bei pH 7 gemessenen Acrylamidaseaktivität hiervon entspricht.
Es ist möglich, ein Acrylamidaseenzym bereitzustellen, welches bei pH 4,0 effektiv wirksam sein kann. Ein solches Enzym kann zur direkten Behandlung von Polyacrylamiden, welche bei etwa pH 4,0 hergestellt werden, ohne einen dazwischengeschalteten pH-Behandlungsschritt verwendet werden.
Die Bereitstellung solcher Enzyme wirft jedoch ein weiteres Problem auf. Wie oben erläutert, ist Adipinsäure eine häufig verwendete Puffersäure für die Herstellung von Polyacrylamiden, welche bei der Herstellung von kationischen Polyacrylamiden in wesentlichen Mengen vorhanden ist. Die Erfinder haben festgestellt, daß einige Acrylamidasen in Anwesenheit von Adipinsäure inhibiert werden, obwohl sie unter den meisten Bedingungen bei pH 4,0 aktiv sind. Daher sind solche Enzyme nur wirksam, wenn das Polyacrylamid unter Verwendung einer anderen Puffersäure hergestellt worden ist.
Die Erfinder haben auch festgestellt, daß es möglich ist, Acrylamidaseenzyme bereitzustellen, welche bei einem niedrigen pH in Anwesenheit von Adipinsäure aktiv sind. Genauer stellen die Erfinder gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ein erfindungsgemäßes Acrylamidaseenzym bereit, das weiterhin eine Acrylamidaseaktivität bei etwa pH 4 in Anwesenheit von etwa 15 mM Adipinsäure besitzt, welche mindestens etwa 30% der bei etwa pH 4 gemessenen Acrylamidaseaktivität hiervon in Abwesenheit von Adipinsäure entspricht. Bevorzugte Enzyme sind auch bei einem niedrigen pH in Anwesenheit von Bernsteinsäure aktiv, d.h. sie besitzen eine Acrylamidaseaktivität bei etwa pH 4 in Anwesenheit von etwa 15 mM Bernsteinsäure, welche mindestens etwa 30% der bei etwa pH 4 gemessenen Acrylamidaseaktivität hiervon in Abwesenheit von Bernsteinsäure entspricht.
Die Acrylamidaseenzyme gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind insbesondere zur Behandlung von kationischen Polyacrylamiden nützlich, da sie in Anwesenheit des Standardpuffers aktiv sind.
Bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme besitzen die Eigenschaft, daß sie sowohl mindestens 50% der Acrylamidaseaktivität hiervon bei pH 4 als auch mindestens 30% der Acrylamidaseaktivität hiervon in Anwesenheit von 15 mM Adipinsäure beibehalten.
In dieser Beschreibung kann die Acrylamidaseaktivität durch irgendeine geeignete Methode gemessen werden, zum Beispiel durch das Messen der spezifischen Acrylamidaseaktivität eines Enzyms oder eines Mikroorganismus oder durch das Testen auf die Fähigkeit eines Enzyms oder eines Mikroorganismus, den Acrylamidmonomerrestgehalt in einem Polymeren zu verringern. Jeder Test, welcher bei pH 7 und 4 geeigneterweise ausgeführt und verglichen werden kann, kann verwendet werden. Eine bevorzugte Testmethode ist wie folgt:
Die Amidaseaktivität wird durch die Zugabe einer Zellsuspension mit einer Amidaseaktivität unter den folgenden Standardbedingungen gemessen: bei pH 7 (50 mM Natriumphosphatpuffer) oder pH 4 (60 mM Citronensäure/77 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Puffer) oder pH 5 (48 mM Citronensäure/103 mM Dinatriumhydrogenphosphat-Puffer) und 50 mM (3554 ppm) Acrylamid bei 30°C. Für die Messung des Km-Werts (vgl. nachstehend) können dieselben Bedingungen verwendet werden, außer daß die Acrylamidkonzentration natürlich variiert wird. Eine Einheit (E) der Amidaseaktivität hydrolysiert unter den obigen Bedingungen 1 Mikromol Acrylamid pro Minute. Die spezifische Aktivität entspricht der Anzahl der Aktivitätseinheiten pro Gramm Trockengewicht des Zellmaterials. Die relative Aktivität entspricht der Aktivität in % im Verhältnis zu der Aktivität bei pH 7.
In dieser Beschreibung erfolgt die vergleichende Messung der Acrylamidaseaktivität in Anwesenheit von Adipinsäure und in Abwesenheit von Adipinsäure durch den folgenden Adipinsäure-Aktivitätstest:
Zu einem Testgemisch mit einem pH von 4, so wie zur Messung der Aktivität bei pH 4 und pH 7 beschrieben, wird Adipinsäure bis zum Erhalt der erforderlichen Konzentrationen zugegeben. Anschließend wird eine Zellsuspension zu dem Testgemisch zugegeben. Dann wird die Die Amidaseaktivität jeder Suspension gemessen. Die relative Aktivität entspricht der Aktivität in % im Verhältnis zu der Aktivität in Abwesenheit von Adipinsäure.
Erfindungsgemäß besitzt das Acrylamidaseenzym eine Aktivität bei pH 4,0, welche mindestens 50% der Acrylamidaseaktivität hiervon bei pH 7,0 entspricht. Vorzugsweise behält es bei pH 4,0 mindestens 60%, bevorzugt mindestens 70% und sogar mindestens 90% der Aktivität hiervon bei pH 7,0 bei. Für einige Enzyme kann die Aktivität bei pH 4,0 sogar größer sein als bei pH 7,0.
Bevorzugte Enzyme behalten ihre Aktivität auch in Anwesenheit von Adipinsäure bei. Diese Eigenschaft wird durch das Vergleichen der Acrylamidaseaktivität in Anwesenheit von 15 mM Adipinsäure mit der Acrylamidaseaktivität in Abwesenheit von Adipinsäure untersucht. Vorzugsweise entspricht die Aktivität in Anwesenheit von 15 mM Adipinsäure mindestens 30%, mehr bevorzugt mindestens 35%, der Aktivität hiervon in Abwesenheit von Adipinsäure. Bevorzugte Enzyme behalten ihre Aktivität auch in Anwesenheit höherer Konzentrationen von Adipinsäure bei. Zum Beispiel entspricht die Aktivität in Anwesenheit von 25 mM Adipinsäure vorzugsweise mindestens 25% derjenigen in Abwesenheit von Adipinsäure. Die Aktivität in Anwesenheit von 50 mM Adipinsäure entspricht vorzugsweise mindestens 10% derjenigen in Abwesenheit von Adipinsäure.
Vorzugsweise weist das Enzym dieselben Eigenschaften auf, wenn Bernsteinsäure anstelle von Adipinsäure verwendet wird.
Bevorzugte Amidaseenzyme weisen bei pH 7 eine ausreichende oder geeignete Acrylamidaseaktivität auf. Solche Enzyme sind unter den oben verwendeten Bedingungen für eine Acrylamidaseaktivität zur Behandlung von Polyacrylamiden, welche bei etwa pH 7 hergestellt werden, zum Beispiel einigen anionischen Polyacrylamiden, sowie von Polyacrylamiden, welche bei etwa pH 4 hergestellt werden, nützlich.
Besonders bevorzugte Acrylamidasen weisen einen niedrigen Km-Wert für Acrylamid auf. Eine bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäßen Amidasen ist die Behandlung von Polyacrylamiden, um den Acrylamidrestgehalt zu verringern. Falls das Enzym einen sehr niedrigen Km-Wert besitzt, bedeutet dies, daß es ein sehr gutes Abfangvermögen besitzt und somit ein Polyacrylamid mit einem sehr geringen, zuweilen nicht nachweisbaren Acrylamidmonomeranteil vorsehen kann. Vorzugsweise liegt der Km-Wert unterhalb 20 mM, mehr bevorzugt unterhalb 15 oder 10 mM oder auch unterhalb 5 mM. In dieser Beschreibung entspricht der Km-Wert dem Km-Wert für Acrylamid, gemessen bei pH 4,0.
Besonders bevorzugte Amidasen können durch das Züchten von spezifischen Mikroorganismen hergestellt werden. Einer hiervon ist eine Rhodococcus-Spezies, welche (als Rhodococcus-Spezies) bei den National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland, GB, gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 14. Juli 1995 unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40755 hinterlegt wurde (durch Jonathan Hughes von Allied Colloids, Ltd., PO-Box 38, Low Moor, Bradford, West Yorkshire BD12 0JZ, England, sowie im Namen von Allied Colloids, Ltd.). Die Erfinder nehmen an, daß das Isolat eine Spezies von Rhodococcus erythropolis ist.

Dieses Rhodococcus-Isolat besitzt die folgenden Eigenschaften: Abbau von:

Adenin	+
Tyrosin	+
Harnstoff	+

Wachstum ausschließlich auf der Kohlenstoffquelle:

Inosit	+
Maltose	–
Mannit	+
Rhamnose	–

Sorbit	+
m-Hydroxybenzoesäure	–
Natriumadipat	+
Natriumbenzoat	–
Natriumcitrat	+
Natriumlactat	+
Natriumglutamat	+
L-Tyrosin	+
Glycerin	+
Trehalose	+
p-Hydroxybenzoesäure	+
D-Mannose	+
Acetamid	+
D-Galactose	–

Enzymatische Tests: *

α-Glucosidase	+
Cystein-Arylamidase	–
Valin-Arylamidase	+

* Bioconnections/Rosco Diagnostics. Wachstum in Gegenwart von:

5% NaCl	+
Natriumazid	+

Dieser Mikroorganismus produziert eine Amidase, die eine Aktivität bei pH 4,0 besitzt, welche etwa 65% der Aktivität bei pH 7,0 entspricht. Gemäß dem oben angegebenen bevorzugten Testprotokoll werden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Rhodococcus NCIMB 40755
Dieses Enzym ist zur Behandlung von kationischen Polyacrylamiden, welche nicht in Gegenwart eines Adipinsäure-Puffers hergestellt worden sind, bei pH 4 besonders nützlich, da es in Anwesenheit von Adipinsäure nicht ausreichend wirksam ist. Andere geeignete Puffer für die Herstellung von kationischen Polyacrylamiden schließen Essigsäure, Glutarsäure und Citronensäure sowie Mischungen hiervon ein.
Dieser Mikroorganismus produziert eine Acrylamidase, welche bei pH 4,0 einen Km-Wert für Acrylamid von 6 mM besitzt.
Ein besonders bevorzugtes Acrylamidaseenzym wird durch den Mikroorganismus Rhodococcus erythropolis produziert, der (als Rhodococcus erythropolis) bei NCIMB (vgl. vorstehend für die vollständige Bezeichnung und Anschrift) gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags am 5. August 1997 ebenfalls durch Dr. Jonathan Hughes im Namen von Allied Colloids, Ltd. (vgl. oben) unter der Hinterlegungsnummer NCIMB 40889 hinterlegt wurde.

Dieses Rhodococcus-Isolat besitzt die folgenden Eigenschaften:
Es sind Mycolsäuren vorhanden. Die Zellwanddiaminosäure ist meso-DAP. Die vorhandenen Fettsäuren sind geradkettige, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren zusammen mit einer verzweigtkettigen Säure, worin sich die Methylgruppe an dem Kohlenstoffatom 10 befindet; insbesondere 10-Methyloctadecansäure (Tuberkulostearinsäure). Abbau von:

Adenin	+
Tyrosin	+
Harnstoff	+

Wachstum ausschließlich auf den Energiequellen:

Inosit	–
Maltose	–
Mannit	+
Rhamnose	–
Sorbit	+
m-Hydroxybenzoesäure	–
Natriumadipat	+
Natriumbenzoat	–
Natriumcitrat	+
Natriumlactat	+
Natriumglutamat	(+) 11 Tage
L-Tyrosin	–
Glycerin	+
Trehalose	+
p-Hydroxybenzoesäure	–
D-Mannose	–
Acetamid	+
D-Galactose	–

Enzymatische Tests:

α-Glucosidase	+
Cystein-Acrylamid	+
Valin-Arylamid	ND

ND = Nicht bestimmt. Wachstum in Gegenwart von:

5% NaCl	+
Natriumazid	–

Dieser Mikroorganismus produziert ein Acrylamidaseenzym, welches bei pH 4 etwa 91 % der Acrylamidaseaktivität bei pH 7 beibehält. Gemäß dem oben angegebenen bevorzugten Testprotokoll werden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Rhodococcus NCIMB 40889
Sie ist außerdem besonders vorteilhaft, da sie eine wesentliche Aktivität in Anwesenheit von Adipinsäure und Bernsteinsäure beibehält. Gemäß dem oben angegebenen bevorzugten Testprotokoll werden die folgenden Ergebnisse erhalten:
Dieser Mikroorganismus produziert ein Acrylamidaseenzym, welches bei pH 4,0 einen Km-Wert für Acrylamid von 11,6 mM besitzt.
Die Erfinder stellen auch ein Acrylamidaseenzym bereit, welches durch Züchten des Rhodococcus-Stammes NCIMB 40889 oder des Rhodococcus-Stammes NCIMB 40755 oder einer Mutante von beiden, welche die Fähigkeit besitzt, eine Acrylamidase zu produzieren, hergestellt werden kann.
Die Erfinder stellen auch einen Mikroorganismus bereit, bei dem es sich um den Rhodococcus-Stamm NCIMB 40889 oder den Rhodococcus-Stamm NCIMB 40755 oder eine Mutante von beiden, welche die Fähigkeit besitzt, eine Acrylamidase zu produzieren, handelt.
Die Erfinder stellen auch einen Mikroorganismus bereit, dessen Zellen oder dessen Zellmaterial bei etwa pH 4 eine Acrylamidaseaktivität zeigt, welche mindestens etwa 50% der Acrylamidaseaktivität hiervon bei etwa pH 7 entspricht. Solche Mikroorganismen schließen diejenigen ein, welche nur eine erfindungsgemäße Acrylamidase produzieren, sowie solche, welche mehr als eine Acrylamidase produzieren, wobei eine hiervon eine wesentliche Aktivität bei pH 7 besitzt und eine hiervon eine wesentliche Aktivität bei pH 4 aufweist. Jede der oben besprochenen Eigenschaften der Acrylamidase sind gemäß diesem Aspekt der Erfindung ebenfalls zutreffend.
Die obigen Acrylamidasen und Mikroorganismen sind zur Umwandlung von Acrylamid in Acrylsäure in verschiedenen Umgebungen nützlich. Die Acrylamidasen und Mikroorganismen können verwendet werden, um ein Acrylsäuremonomer oder ein Salz hiervon, insbesondere Ammoniumacrylat, aus dem Acrylamid-Ausgangsmaterial herzustellen. Vorzugsweise werden sie in einem Verfahren zur Verringerung des Acrylamidrestgehalts eines Polyacrylamids durch das Inkontaktbringen des Polyacrylamids mit einer erfindungsgemäßen Acrylamidase oder einem erfindungsgemäßen Mikroorganismus verwendet. In dem Verfahren kann irgendeine der Acrylamidasen und irgendeiner der Mikroorganismen der Erfindung mit irgendeinem der oben besprochenen bevorzugten Merkmale verwendet werden.
Alle Polyacrylamid-Typen, einschließlich anionische, nichtionische und kationische, können behandelt werden. Die Erfindung ist zur Behandlung von Polyacrylamiden, welche bei einem niedrigen pH hergestellt worden sind, insbesondere kationischen und im wesentlichen nichtionischen Polyacrylamiden, besonders geeignet.
Kationische Polyacrylamide sind normalerweise Copolymere oder Terpolymere von Acrylamid mit einem oder mehreren kationischen Monomeren. Die kationischen Monomeren liegen normalerweise in einer Menge von 3 bis 90 Gew.-%, oft unterhalb 70 Gew.-% und vorzugsweise unterhalb 50 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren vor. Jedes der herkömmlichen kationischen Monomeren kann verwendet werden, wie Diallylammoniummonomeren, zum Beispiel DADMAC (Diallyldimethylammoniumchlorid), oder kationische Ester, zum Beispiel Diallylaminoalkyl(meth)acrylate wie DMAEA (Dimethylaminoethylacrylat) oder DMAEMA (Dimethylaminoethylmethacrylat), oft als Säureadditions- oder quaternäre Ammoniumsalze, oder kastionische Amide wie DMAPMA.
Kationische Polyacrylamide können durch den Einschluß einer geringfügigen Menge (welche geringer ist als die Menge des kationischen Monomeren) eines anionischen Monomeren, üblicherweise in einer Menge von nicht mehr als 10 bis 5 Gew.-%, amphoter gemacht werden.
Kationische Polyacrylamide besitzen im allgemeinen eine Strukturviskosität (intrinsic viscosity; IV) von mehr als 8 dl/g und üblicherweise mehr als 10 oder 12 dl/g, typischerweise mehr als 14 dl/g, auf. Im allgemeinen beträgt die IV nicht mehr als 20 oder 25 dl/g. In dieser Beschreibung wird die Strukturviskosität im suspendierten Zustand bei 25°C in 1 M NaCl, gepuffert auf pH 7, unter Verwendung eines Viskosimeters gemessen.
Das Polyacrylamid kann nichtionisch sein; in diesem Fall ist es ein Homopolymer von Acrylamid oder ein Copolymer oder Terpolymer mit anderen nichtionischen Monomeren wie Methacrylamid. Es kann eine geringfügige Menge (weniger als 3 Gew.-% und üblicherweise weniger als 2 oder 1 Gew.-%) eines ionischen Monomeren enthalten. Insbesondere kann es geringfügige Mengen eines hydrolysierten Acrylamidmonomeren (Acrylat oder Acrylsäure) enthalten.
Anionische Polyacrylamide sind im allgemeinen Copolymere oder Terpolymere von Acrylamid mit einem oder mehreren anionischen Monomeren. Die anionischen Monomeren liegen üblicherweise in einer Menge von 3 bis 90 Gew.-%, oft weniger als 70 Gew.-% und vorzugsweise weniger als 50 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Monomeren vor. Jedes der typischen anionischen Monomeren kann verwendet werden, wie ethylenisch ungesättigte Carbonsäure- oder Sulfonsäuremonomeren und insbesondere Acrylsäure (einschließlich wasserlösliche Salze hiervon).
Das Polyacrylamid, falls anionisch oder nichtionisch, besitzt vorzugsweise ein derart hohes Molekulargewicht, daß die Strukturviskosität hiervon mindestens 6 oder 10 dl/g und häufig mindestens 15, 20 oder sogar 30 dl/g beträgt, wobei sie üblicherweise nicht mehr als 50 dl/g beträgt.
Jedes der obigen Polymeren kann in irgendeiner geeigneten Form, einschließlich einer Gel-, Emulsions- und trockenen Dispersionsform, bereitgestellt werden. Gelförmige Polymere werden bevorzugt. Wenn das Polymer in Form einer Dispersion in einer nichtwäßrigen Flüssigkeit, welche trocken ist (enthaltend weniger als 15 Gew.-% und vorzugsweise weniger als 10 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Gewicht der Dispersion), vorliegt, kann das Acrylamid zu der Dispersion derart zugegeben werden, daß es aktiv ist, wie in EP-A-329,324 beschrieben ist, wenn es während 2 Stunden bei 25°C in Wasser dispergiert wird. Alternativ können einige Acrylamidasen eine Verringerung des Acrylamidgehalts selbst bei dem geringen Wasseranteil in der Dispersion selbst herbeiführen. Alle diese Polymerformen können in einer herkömmlichen Weise hergestellt werden.
Das Verfahren ist besonders geeignet, wenn das Polyacrylamid durch irgendeines der Verfahren hergestellt wird, welche in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO97/29136 der Erfinder beschrieben sind.
Es ist insbesondere geeignet als ein Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen trockenen Teilchen eines Polyacrylamids, welches umfaßt:
das Vorsehen wäßriger Polyacrylamid-Gelteilchen, welche mit Acrylamidmonomeren verunreinigt sind,
das Zugeben eines Acrylamidaseenzyms zu den wäßrigen Gelteilchen, während diese bei einer Temperatur von 50 bis 95°C gehalten werden, und
das im wesentlichen unmittelbare Einbringen der wäßrigen Gelteilchen in einen Trocknungsschritt und das Aussetzen der Gelteilchen in diesem Schritt einer Temperatur von mindestens 45°C (vorzugsweise mindestens 50°C oder 60°C), um im wesentlichen trockene Teilchen von Polyacrylamid herzustellen,
wobei das Acrylamidaseenzym ein erfindungsgemäßes Enzym ist.
Der Mikroorganismus NCIMB 40889 und die durch ihn produzierte Acrylamidase sind für dieses Verfahren besonders geeignet, da angenommen wird, daß sie bei einer relativ hohen Temperatur aktiv sind und/oder sehr schnell wirksam sind.
Das Polyacrylamid ist vorzugsweise kationisch oder nichtionisch.
Ein weiteres Verfahren, worin die erfindungsgemäßen Acrylamidaseenzyme verwendet werden können, ist ein Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen trockenen Teilchen eines Polyacrylamids, welches umfaßt:
das Vorsehen wäßriger Polyacrylamid-Gelteilchen, welche mit Acrylamidmonomeren verunreinigt sind,
das Zugeben eines Acrylamidaseenzyms mit einem Km-Wert für Acrylamid von nicht mehr als 10 mM zu den wäßrigen Gelteilchen, während diese bei einer Temperatur von 50 bis 95°C gehalten werden,
das Halten der wäßrigen Gelteilchen, zu denen die Acrylamidase zugegeben worden ist, in einem Halteschritt bei einer Temperatur von 20°C bis 70°C während nicht mehr als 30 Minuten, und anschließend
das Einbringen der Teilchen in einen Trocknungsschritt und das Aussetzen der Teilchen in diesem Schritt einer Temperatur von mindestens 45°C (vorzugsweise mindestens 50°C oder 60°C), um im wesentlichen trockene Teilchen herzustellen;
wobei das Verfahren derart ausgeführt wird, daß der endgültige Acrylamidmonomergehalt in den im wesentlichen trockenen Teilchen unterhalb den meßbaren Anteilen liegt, und
wobei das Amidaseenzym ein erfindungsgemäßes Enzym ist.
Das Polyacrylamid ist vorzugsweise kationisch oder nichtionisch.
Ein weiteres erfindungsgemäßes Verfahren ist ein Verfahren zur Herstellung von im wesentlichen trockenen Teilchen eines Polyacrylamids, welches umfaßt:
das Vorsehen wäßriger Polyacrylamid-Gelteilchen, welche mit Acrylamidmonomeren verunreinigt sind;
das Zugeben eines Acrylamidaseenzyms, welches einen Km-Wert für Acrylamid von nicht mehr als 10 mM, vorzugsweise nicht mehr als 5 mM, besitzt, zu den wäßrigen Gelteilchen, während diese bei einer Temperatur von 50 bis 95°C gehalten werden,
das Halten der wäßrigen Gelteilchen, zu denen die Acrylamidase zugegeben worden ist, in einem Halteschritt in der Kältezone eines Wirbelbetttrockners bei einer Temperatur von 20°C bis 70°C während nicht mehr als 30 Minuten, und anschließend
das Einbringen der Teilchen in einen Trocknungsschritt in der Wärmezone eines Wirbelbetttrockners und das Aussetzen der Teilchen in diesem Schritt einer Temperatur von mindestens 45°C (vorzugsweise mindestens 50°C oder 60°C), um im wesentlichen trockene Teilchen von Polyacrylamid vorzusehen,
wobei das Amidaseenzym ein erfindungsgemäßes Enzym ist.
Das Polyacrylamid ist vorzugsweise kationisch oder nichtionisch.
Der Mikroorganismus NCIMB 40755 ist für diese letzteren zwei Verfahren besonders geeignet, da er einen niedrigen Km-Wert für Acrylamid besitzt. Wenn dieser Mikroorganismus oder die Acrylamidase hiervon verwendet werden, wird das Polyacrylamid (insbesondere falls kationisch) vorzugsweise in Gegenwart eines anderen Puffers als Adipinsäure, zum Beispiel Essig-, Bernstein-, Glutar- oder Citronensäure und Mischungen hiervon, hergestellt. Der Km-Wert in diesen Verfahren entspricht im allgemeinen dem Km-Wert bei pH 4,0.
In bevorzugten Verfahren der Erfindung wird das Polyacrylamid, vorzugsweise ein kationisches oder nichtionisches Polyacrylamid, bei einem sauren pH (zum Beispiel pH 2 bis 5, vorzugsweise pH 3 bis 4,5) hergestellt und mit einer erfindungsgemäßen Acrylamidase ohne Einstellen des pH-Wertes behandelt.
In weiteren bevorzugten Verfahren wird das Polyacrylamid, vorzugsweise ein kationisches Polyacrylamid, in Gegenwart eines Adipinsäure-Puffers, vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 10 Gew.-% der gesamten Feststoffe (d.h. Monomer plus Adipinsäure), mehr bevorzugt 0,5 bis 5 Gew.-%, zum Beispiel 1 bis 2 oder 3 Gew.-%, hergestellt. Die erfindungsgemäße Acrylamidase wird mit dem Polyacrylamid in Gegenwart der Adipinsäure in Kontakt gebracht. Die Adipinsäure kann in Kombination mit anderen Puffern wie Citronen-, Glutar- oder Essigsäure verwendet werden. Alternativ kann Bernsteinsäure verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf solche Verfahren, wie in der früheren Veröffentlichung EP-A-329,325 der Erfinder beschrieben, und insbesondere zur Behandlung von kationischen und nichtionischen Polymeren angewendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Behandlung verschiedener Polyacrylamide angewendet werden. Die Verfahren können insbesondere zur Behandlung eines Polyacrylamids, welches bei einem niedrigen pH, zum Beispiel pH 2 bis 5, vorzugsweise pH 3 bis 4, hergestellt wird, angewendet werden. Beispielsweise sind sämtliche Aspekte der Erfindung auf die Behandlung von nichtionischen Polyacrylamiden, welche bei einem pH von 2 bis 5, vorzugsweise von 3 bis 4, hergestellt worden sind, sowie von kationischen Polyacrylamiden, welche bei einem pH von 2 bis 5, vorzugsweise von 3 bis 4,5, hergestellt worden sind, anwendbar. Jegliche der oben besprochenen bevorzugten Merkmale der Erfindung sind auch für die Behandlung von anionischen Polyacrylamiden, insbesondere, falls sie bei einem pH unterhalb 6, z.B. etwa pH 5, hergestellt werden, zutreffend. Insbesondere ist die Erfindung für Verfahren nützlich, worin das Polyacrylamid bei einem definierten pH hergestellt wird, um die Wirksamkeit des verwendeten Initiatorsystems zu optimieren.
In den erfindungsgemäßen Verfahren kann das Acrylamidaseenzym zu dem Polyacrylamid oder dem Acrylamidmonomeren in irgendeiner geeigneten Form zugegeben werden. Normalerweise wird es in Form einer flüssigen Suspension oder Lösung zugegeben. Zum Beispiel kann es in Form einer wäßrigen Lösung von Acrylamidase oder als eine Umkehrphasenemulsion von Acrylamidase zugegeben werden. Es kann in Form einer wäßrigen Suspension zugegeben werden. In einigen Verfahren wird die Acrylamidase in der reinen (molekularen) Form zugegeben, welche von dem Mikroorganismus, in dem sie produziert wurde, getrennt worden ist.
In einem anderen Verfahren liegt sie in Form von Bakterienzellen und/oder Zelltrümmern vor, häufig als eine Paste, welche ein Acrylamidaseenzym enthalten, das die Acrylamidanteile verringern kann, zum Beispiel in Form ganzer Zellen. Die Zellen und/oder Zelltrümmer können gegebenenfalls in einer immobilisierten Form oder vorzugsweise in der freien Zellform verwendet werden. Die Immobilisierung kann in irgendeiner geeigneten Weise, welche bekannt ist, z.B. in einer Polyacrylamidmatrix, erfolgen. Es können permeabilisierte Zellen oder Zellmaterial verwendet werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen die Erfinder ein Verfahren zur Verringerung des Acrylamidrestgehalts eines Polyacrylamids, vorzugsweise eines kationischen oder nichtionischen Polyacrylamids, durch das Inkontaktbringen desselben mit Zellmaterial aus dem Rhodococcus-Stamm NCIMB 40889 oder dem Rhodococcus-Stamm NCIMB 40755 oder einer Mutante von beiden, welche die Fähigkeit besitzt, eine Acrylamidase zu produzieren, bereit. Vorzugsweise erfolgt der Kontakt bei einem sauren pH, mehr bevorzugt bei pH 2 bis 5,5 und insbesondere bei pH 3,0 bis 4,5. Das Polyacrylamid kann zum Beispiel in Form eines Gels, einer flüssigen Dispersion in einer nichtwäßrigen Flüssigkeit oder einer Emulsion vorliegen.
Wenn irgendeines der erfindungsgemäßen Verfahren angewendet wird, um Polyacrylamide mit einem Acrylamidrestgehalt zu behandeln, kann der Acrylamidrestgehalt vor der Behandlung zum Beispiel mehr als 200 ppm und häufig mehr als 400 ppm oder 500 ppm betragen. Er kann mehr als 1000 ppm und sogar bis zu 2000 ppm oder mehr betragen. Erfindungsgemäß ist es möglich, den Anteil des restlichen Acrylamids auf weniger als 100 ppm und sogar weniger als 50 ppm oder 30 ppm, vorzugsweise weniger als 20 ppm oder 10 ppm, zu verringern. Es kann auch möglich sein, daß die Anteile auf weniger als die nachweisbaren Anteile verringert werden können. Der Acrylamidmonomeranteil nach der Behandlung beträgt vorzugsweise nicht mehr als 50%, mehr bevorzugt nicht mehr als 20% und insbesondere nicht mehr als 10% des Anteils vor der Behandlung. Er kann sogar weniger als 5% oder 1% des Anteils vor der Behandlung betragen.
In dieser Beschreibung ist die Behandlung von Polyacrylamiden und Acrylamidmonomeren besprochen worden. Jedes der erfindungsgemäßen Verfahren kann in gleicher Weise auf Polymere von Methacrylamid und die Verringerung des Methacrylamidmonomerrestgehalts angewendet werden.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele
Beispiele 1 bis 5
a) Gelpolymerisation
Die Gelpolymerisationen wurden unter Verwendung von 400 g des Monomeren ausgeführt.
Die Polymerisation der Monomerlösungen (wie nachstehend ausführlich beschrieben), welche 100 ppm Tetralon B (Natrium-EDTA) enthielten, wurde nach Entgasen mit Stickstoff bei 0°C eingeleitet.
Die Gele wurden vor dem Zerkleinern für 4–5 Stunden bei 80°C ausgehärtet. Das feuchte Gel wurde geeigneterweise behandelt und dann bei 60°C getrocknet.
b) Gelbehandlung
Die Behandlung des feuchten Gels mit dem Enzym erfolgte durch das Inkontaktbringen des Gels mit einer Amidase enthaltenden Zellsuspension in einer 0,9%igen Kochsalzlösung oder in Wasser.
Die Aktivität der Amidase betrug 1250 Einheiten/g. Die zuzugebende Menge der Amidase (d.h. die Anzahl der Einheiten) wurde bezogen auf dem Gewicht des vorhandenen trockenen Polymeren berechnet.
Das behandelte Gel wurde in einem Kunststoffbeutel luftdicht eingeschlossen und vor dem Trocknen während 30 Minuten bei Raumtemperatur liegen gelassen.
Die in diesen Beispielen verwendete Amidase wurde aus dem Isolat NCIMB 40889 erhalten.
Nach der Behandlung wurde jede getrocknete Probe auf ihren freien Acrylamidgehalt untersucht.
Beispiel 1
Polymer A (Homopolymer von Acrylamid, IV = 20 dl/g)
Wirkung der Adipinsäureanteile auf die Behandlung
Polyacrylamidgele mit unterschiedlichen Anteilen an Adipinsäure wurden bei pH 4 hergestellt. Dabei wurden 200 ppm AZDN (Azodiisobutyronitril) und 50 ppm VA044 (2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propan]dichlorwasserstoffsäure) als thermale Initiatoren sowie 12 ppm KBrO₃ und 6 ppm Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren verwendet.
75 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit den nachstehend in Tabelle 1 angegebenen Enzymmengen behandelt.
Die Ergebnisse für den freien ACM-Gehalt (Acrylamid) in den getrockneten Polymeren sind ebenfalls in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt die Abnahme des freien ACM-Gehalts bei einer ansteigenden Menge der Amidase.
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Wirksamkeit der Amidase abnimmt, wenn der in dem Polymeren vorhandene Adipinsäureanteil zunimmt.
Es ist jedoch erkennbar und überraschend, daß die relative Aktivität des Mikroorganismus und des Acrylamidaseenzyms hiervon relativ hoch bleibt, selbst wenn sich die Adipinsäuremenge erhöht. Tatsächlich kann der Acrylamidrestgehalt in dem Gel, welches 5% Adipinsäure enthält, um etwa 50% verringert werden. Dies ist im Hinblick auf die Testergebnisse, welche in den oben beschriebenen bevorzugten Tests auf eine Adipinsäure-Toleranz erhalten wurden, besonders überraschend. Der Mikroorganismus und das Acrylamidaseenzym hiervon scheinen bei der Verringerung des Acrylamidrestgehalts eines Polymergels besser wirksam zu sein, als basierend auf einen einfachen Test zu erwarten wäre.
Beispiel 2
Polymer B (etwa 74 Gew.-% Acrylamid/etwa 22 Gew.-% DMAEAqMeCl, IV = 16,5 dl/g)
Wirkung der Adipinsäureanteile auf die Behandlung
Polymer B-Gele mit unterschiedlichen Anteilen an Adipinsäure wurden bei pH 4 hergestellt. Dabei wurden 100 ppm AZDN und 50 ppm VA044 als thermale Initiatoren sowie 12 ppm KBrO₃ und 6 ppm Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren verwendet.
75 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit den nachstehend in Tabelle 2 angegebenen Enzymmengen behandelt.
Die Ergebnisse für den freien ACM-Gehalt sind ebenfalls in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Tabelle 2 zeigt die Abnahme des freien ACM-Gehalts bei einer ansteigenden Menge der Amidase.
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Behandlung der Polymeren, welche bis zu 2% Adipinsäure enthalten, den ACM-Restgehalt im Verhältnis zu der Dosismenge verringert.
Jedoch wird bei 5% Adipinsäure hinsichtlich des ACM-Restgehalts nur eine geringe Abnahme des Wertes beobachtet.
Wiederum ist jedoch die Wirksamkeit des Mikroorganismus und der Acrylamidase hiervon überraschend hoch. Der Acrylamidrestgehalt wird wesentlich verringert, selbst bei Anteilen von 2% Adipinsäure.
Beispiel 3
Wirkung des pH-Wertes von Polymer B auf die Behandlung
Polymer B-Gele mit 5% Adipinsäure wurden bei unterschiedlichen pH-Werten hergestellt. Dabei wurden 100 ppm AZDN und 50 ppm VA044 als thermale Initiatoren sowie 12 ppm KBrO₃ und 6 ppm Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren verwendet.
75 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit den nachstehend in Tabelle 3 angegebenen Enzymmengen behandelt.
Die Ergebnisse für den freien ACM-Gehalt sind ebenfalls in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
Tabelle 3 zeigt die Abnahme des freien ACM-Gehalts bei einer ansteigenden Amidase-Dosismenge bei unterschiedlichen pH-Werten.
Beispiel 4
Weitere Behandlungen von Polymer B-Gelen
Es wurden Polymer B-Gele mit unterschiedlichen Adipinsäureanteilen hergestellt. Dabei wurden 100 ppm AZDN und 50 ppm VA044 als thermale Initiatoren sowie 12 ppm KBrO₃ und 6 ppm Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren verwendet.
75 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit den nachstehend in Tabelle 4 angegebenen Enzymmengen behandelt.
Die Ergebnisse für den freien ACM-Gehalt sind ebenfalls in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4
Tabelle 4 zeigt die Verringerung des freien ACM-Gehalts bei einem zunehmenden Adipinsäureanteil.
Es ist erkennbar, daß das Amidaseenzym den freien ACM-Gehalt bei einem zunehmenden Adipinsäureanteil um einen geringeren Betrag verringert.
Beispiel 5
c) Polymer C (etwa 35 Gew.-% Acrylamid/etwa 61 Gew.-% DMAEAgMeCl, IV = 13,5 dl/g)
Wirkung der Adipinsäureanteile auf die Behandlung
Polymer C-Gele mit unterschiedlichen Anteilen an Adipinsäure wurden bei pH 4 hergestellt. Dabei wurden 200 ppm AZDN und 50 ppm VA044 als thermale Initiatoren sowie 16 ppm KBrO₃ und 8 ppm Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren verwendet.
75 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit den nachstehend in Tabelle 5 angegebenen Enzymmengen behandelt.
Die Ergebnisse für den freien ACM-Gehalt sind ebenfalls in Tabelle 5 angegeben.
Tabelle 5
Tabelle 5 zeigt die Verringerung des freien ACM-Gehalts bei einem zunehmenden Adipinsäureanteil.
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß bei einem Polymer C-Gel, welches bis zu 4% Adipinsäure enthält, bei der Behandlung mit einer Amidase eine Verringerung des freien ACM-Gehalts erreicht wird.
Wiederum ist erkennbar, daß der Mikroorganismus und die Acrylamidase hiervon den Acrylamidrestgehalt in einem Gel, welches 4% Adipinsäure enthält, um etwa 60% verringern können. Dies ist auch im Hinblick auf die oben beschriebenen Testergebnisse überraschend.
Beispiel 6
Proben von Polymergelen wurden hergestellt und wie in den Beispielen 1 bis 5 mit einem Acrylamidaseenzym behandelt. Die Eigenschaften der Acrylamidase sind nachstehend aufgeführt.
Beurteilung von NCIMB 40889
Sätze von PolyACM-Gelen mit und ohne Adipinsäure wurden bei pH 4 hergestellt. Dabei wurden 200 ppm AZDN und 25 ppm VA044 als thermale Initiatoren sowie 12 ppm KBrO₃ und 6 ppm Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren verwendet.
75 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit den nachstehend in Tabelle 6 angegebenen Enzymmengen behandelt.
Tabelle 6
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Enzym den freien ACM-Gehalt in den Poly-ACM-Gelen in Anwesenheit von Adipinsäure verringert.
Beispiel 7
Beurteilung von NCIMB 40889 (Sekundärkultur)
Mit dem Monomer wurden weitere PolyACM-Gele mit unterschiedlichen Adipinsäureanteilen bei pH 4,0 hergestellt.
Die Initiatormengen entsprachen denjenigen im vorherigen Abschnitt.
75 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit den nachstehend in Tabelle 7 angegebenen Enzymmengen behandelt.
Die Ergebnisse für den freien ACM-Gehalt sind ebenfalls in Tabelle 7 angegeben.
Tabelle 7
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß eine Erhöhung der Menge des Amidaseenzyms eine stärkere Verringerung des ACM-Restgehalts zur Folge hat.
Die Erhöhung des Adipinsäureanteils resultierte in einer Verringerung der Aktivität des Amidaseenzyms, d.h. wenn sich der Adipinsäureanteil erhöht, ist eine größere Menge der Amidase erforderlich, um eine entsprechende Verringerung des ACM-Restgehalts zu erhalten.
Jedoch zeigte das Enzym selbst in Anwesenheit von 2% Adipinsäure eine Aktivität, welche ermöglichte, daß das Enzym den freien Acrylamidgehalt von 2100 ppm auf nur 126 ppm verringern konnte. Obwohl eine größere Menge der Amidase erforderlich ist, weist der verwendete Mikroorganismus eine höchst spezifische Amidaseaktivität auf, und daher sind die erforderlichen Mengen an Bakterienzellen sehr gering. Die Tabelle zeigt auch, daß dieser Mikroorganismus in Abwesenheit von Adipinsäure, aber bei pH 4, den freien Acrylamidgehalt unter den Testbedingungen auf weniger als 100 ppm verringert.
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit der durch den Mikroorganismus NCIMB 40755 produzierten Acrylamidase hinsichtlich der Verringerung des Acrylamidgehalts bei niedrigen pH-Werten.
a) Gelpolymerisation
Gemäß den obigen Beispielen 1 bis 5 wurden herkömmliche Gelpolymerisationen ausgeführt.
Sofern nicht anders angegeben, enthielten die Gele keine Adipinsäure. Die Mengen der thermalen Initiatoren wurden im allgemeinen gering gehalten, um Gele mit "hohen" Anteilen an freiem ACM vorzusehen.
Die Polymerisation der Monomerlösungen (wie im Text ausführlich beschrieben), welche 100 ppm Tetralon B enthielten, wurde nach Entgasen mit Stickstoff bei 0°C eingeleitet.
Die Gele wurden vor dem Zerkleinern für 4–5 Stunden bei 80°C ausgehärtet. Das feuchte Gel wurde geeigneterweise behandelt und dann bei 60°C getrocknet.
b) Polymergel-Verarbeitung-Amidasebehandlung
Die Behandlung des feuchten Gels mit dem Enzym wurde wie in den obigen Beispielen 1 bis 5 ausgeführt. Das zuzugebende Menge der Amidase (d.h. die Anzahl der Einheiten) wurde bezogen auf dem Gewicht des vorhandenen Polymeren berechnet.
Die Amidase-Probe wurde 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt, um eine Aktivität von 48 Einheiten/ml zu erhalten.
Für jede Behandlung wurde eine frische Lösung hergestellt. Das behandelte Gel wurde in einem Kunststoffbeutel luftdicht eingeschlossen und vor dem Trocknen während des erforderlichen Zeitraums bei Raumtemperatur liegen gelassen.
Die verwendete Amidase wurde durch den Mikroorganismus NCIMB 40755 produziert.
Nach der Behandlung wurde jede getrocknete Probe auf den freien Acrylamidgehalt untersucht.
Wirkung des pH-Wertes auf die Amidasebehandlung
Gelförmige Polyacrylamidpolymere wurden bei pH 4, 5 und 6 hergestellt. Die Gele enthielten weder Adipinsäure noch Harnstoff. Die bei pH 4 hergestellten Gele enthielten 25 ppm VA044 als thermalen Initiator sowie unterschiedliche Anteile an KBrO₃ und Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren.
Die bei pH 5 und 6 hergestellten Gele verwendeten das t-BHP/Na₂SO₃-Initiatorsystem. Sämtliche hergestellten Gele enthielten 200 ppm AZDN als thermalen Initiator.
100 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit 10 bzw. 25 Einheiten Amidase/Gramm des trockenen Polymeren behandelt und vor dem Trocknen während 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Die Ergebnisse für den freien ACM-Gehalt sind nachstehend in Tabelle 8 angegeben.
Tabelle 8
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß die Amidase-Probe unabhängig von dem pH-Wert des Gels und dem anfänglichen ACM-Restgehalt in der Lage war, in allen Fällen den freien ACM-Gehalt auf weniger als 300 ppm zu verringern.
Wirkung von Adipinsäure auf die Amidasebehandlung
i) @ pH 4
Ein Satz von Gelen mit unterschiedlichen Adipinsäureanteilen wurde bei pH 4 hergestellt. Dabei wurden 200 ppm AZDN als thermaler Initiator sowie 7 ppm KBrO₃ und 14 ppm Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren verwendet.
Die Ergebnisse für 100 g ACM sind nachstehend in Tabelle 9 angegeben.
Tabelle 9
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß der ACM-Restgehalt in den Adipinsäure enthaltenden Gelen bei pH 4 durch die Behandlung mit dem Amidaseenzym nicht wesentlich verringert wurde. Die Gelprobe ohne Adipinsäure zeigte eine Verringerung, welche mit der zu erwartenden übereinstimmte.
ii) @ pH 6
Mehrere Gele mit unterschiedlichen Adipinsäureanteilen wurde bei pH 6 hergestellt, d.h. die Adipinsäure liegt vorwiegend als Natriumadipat vor. Dabei wurden 200 ppm AZDN als thermaler Initiator sowie 7 ppm t-BHP und 14 ppm Na₂SO₃ als Redoxinitiatoren verwendet.
100 g-Portionen des zerkleinerten feuchten Gels wurden mit 10 Einheiten Amidase/g behandelt und vor dem Trocknen während 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Die Ergebnisse für den freien ACM-Gehalt sind nachstehend in Tabelle 10 angegeben.
Tabelle 10
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, daß alle der mit Amidase behandelten Proben eine Verringerung des ACM-Restgehalts zeigten.
Diese Ergebnisse zeigen, daß dieser Mikroorganismus und die Acrylamidase hiervon sowohl bei pH 6 als auch bei pH 4 bei der Verringerung des freien Acrylamidgehalts wirksam sind, aber dazu neigen, bei pH 4 in Anwesenheit von Adipinsäure weniger wirksam zu sein. Bei pH 6 zeigt die Adipinsäure eine geringere Hemmwirkung. Dies kann darauf hinweisen, daß die Säureform selbst hemmend ist, und daß die bei pH 6 vorliegende Adipatform unproblematisch ist.

Claims

Verfahren zur Verringerung des Acrylamid- oder Methacrylamidrestgehalts eines Polyacrylamids oder Polymethacrylamids, umfassend das Inkontaktbringen des Polyacrylamids oder Polymethacrylamids mit einer Acrylamidase, welche eine Acrylamidaseaktivität bei pH 4,0 besitzt, die mindestens 50% der Acrylamidaseaktivität hiervon bei pH 7,0 entspricht, oder mit einem Mikroorganismus, dessen Zellen oder dessen Zellmaterial eine Acrylamidaseaktivität bei etwa pH 4,0 zeigen, welche mindestens etwa 50% der Acrylamidaseaktivität hiervon bei etwa pH 7,0 entspricht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Acrylamidaseenzym in Anwesenheit von 15 mM Adipinsäure eine Acrylamidaseaktivität bei pH 4,0 besitzt, die mindestens 30% der Acrylamidaseaktivität hiervon entspricht, welche bei pH 4,0 in Abwesenheit von Adipinsäure gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Acrylamidaseenzym durch das Züchten des Rhodococcus-Stammes NCIMB 40889 oder NCIMB 40755 oder von Mutanten hiervon, welche die Fähigkeit besitzen, eine Acrylamidase zu produzieren, hergestellt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Mikroorganismus der Rhodococcus-Stamm NCIMB 40889 oder NCIMB 40755 oder eine Mutante hiervon, welche die Fähigkeit besitzt, eine Acrylamidase zu produzieren, ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Acrylamidase mit dem Polyacrylamid oder Polymethacrylamid in Kontakt gebracht wird, während das Polyacrylamid oder Polymethacrylamid bei einem pH von 3,0 bis 4,5, vorzugsweise einem pH von 3 bis 4, vorliegt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Polyacrylamid oder Polymethacrylamid ein kationisches Polyacrylamid oder Polymethacrylamid ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Polyacrylamid oder Polymethacrylamid ein im wesentlichen nichtionisches Polyacrylamid oder Polymethacrylamid ist.
Verfahren nach Anspruch 7, worin das Polyacrylamid oder Polymethacrylamid in Gegenwart eines Adipinsäure-Puffers aus einem Monomeren oder einer Monomermischung hergestellt wird, und wobei der Adipinsäure-Puffer in dem Polyacrylamid- oder Polymethacrylamidprodukt verbleibt, während es mit dem Acrylamidaseenzym in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, worin das Polyacrylamid oder Polymethacrylamid bei einem pH von 3 bis 4,5 hergestellt wird und ohne Einstellen des pH-Wertes mit dem Amidaseenzym in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, worin das Polyacrylamid oder Polymethacrylamid ein gelförmiges Polymer ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 9, worin das Polyacrylamid oder Polymethacrylamid in Form einer Dispersion von Polyacrylamid- oder Polymethacrylamidteilchen in einer nichtwäßrigen Flüssigkeit, enthaltend nicht mehr als 15 Gew.-% Wasser bezogen auf das Gewicht der Dispersion, vorliegt.
Rhodococcus-Stamm NCIMB 40889.
Rhodococcus-Stamm NCIMB 40755.