DE69828507T2

DE69828507T2 - Triterpene-saponin analoga mit adjuvans und immunostimulierender wirkung

Info

Publication number: DE69828507T2
Application number: DE69828507T
Authority: DE
Inventors: J. Dante MARCIANI
Original assignee: Galenica Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Galenica Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-05-20
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2018-05-21
Also published as: US5977081A; BR9809149A; DE69828507D1; EP0996451B1; CA2290646C; KR20010012802A; ATE286399T1; WO1998052573A9; EP0996451A4; ES2235330T3; DK0996451T3; PT996451E; AU7581898A; AU732856B2; EP0996451A1; NZ500779A; JP4583511B2; CA2290646A1; JP2002504099A; JP2010174031A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung fällt in das Gebiet der Hilfsstoffe und das Immunsystem stimulierender Substanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung neuartige Triterpensaponinlipophil-Konjugate.
Verwandtes Fachwissen
Saponine sind glycosidische Verbindungen, die als sekundäre Metaboliten produziert werden. Sie finden sich verbreitet in höheren Pflanzen und in einigen Meereswirbellosen der Gattung Echinodermata (ApSiman et a., Stud. Org Chem. 17:273-286 (1984). Wegen ihrer antimicrobiellen Wirkung bieten pflanzliche Saponine einen wirksamen chemischen Schutz gegen Mikroorganismen, besonders Pilze (Price et al., CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26:27-135 (1987)). Saponine sind für die toxischen Eigenschaften vieler Meereswirbellose verantwortlich (ApSimon et al., Stud. Org. Chem. 17:273-286 (1984)). Die chemische Struktur von Saponinen ergibt ein breites Spektrum pharmakologischer und biologischer Wirkungen einschließlich einer bestimmten starken immunologischen Wirksamkeit. Außerdem haben Mitglieder dieser Gruppe von Verbindungen schäumende Eigenschaften (ein identifizierendes Merkmal), oberflächenaktive Eigenschaften (die für ihre hämolytische Wirkung verantwortlich sind), cholesterinbindende, fungizide, molluskizide, kontrazeptive, wachstumsverzögernde, schleimlösende, entzündungshemmende, analgetische, antivirale, kardiovaskuläre, enzymhemmende und antitumorige Wirkungen (Hostettmann, K., et al., Methods Plant Biochem. 7:435-471 (1991); Lacaille-Dubois, M.A. & Wagner, H., Phytomedicine 2:363-386 (1996); Price, K.R., et al., CRC Crit. Rev. Sci. Nutr. 26:27-135 (1987)).
Strukturell bestehen Saponine aus Aglukon (Sapogenin), das an eine oder mehrere Zuckerketten angehängt ist. In einigen Fällen kann Saponin mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Malonsäure, Angelikasäure und anderen als Teil ihrer Struktur acyliert sein (Massios, G. & Lavaud, C. Stud. Nat.Prod. Chem. 15:187-224 (1995)). Diese komplexen Strukturen haben Molekulargewichte von 600 bis zu mehr als 2000 Dalton. Die asymmetrische Verteilung ihrer hydrophoben (aglukonen) und hydrophilen (Zucker-)Komponenten verleiht diesen Verbindungen einen amphipathischen Charakter, der im Wesentlichen für ihre waschmittelähnlichen Eigenschaften verantwortlich ist. Folglich können Saponine mit der Cholesterinkomponente von Tierzellmembranen interagieren, wobei sich Poren bilden, die zu Membranzerstörung und Zelltod führen können, wie bei Hämolyse von Blutzellen.
Alkaloidglycosid
Saponine können entsprechend ihrer oben gezeigten aglukonen Zusammensetzung klassifiziert werden:

1. Triterpenglykoside
2. Steroidglykoside
3. Steroidalkaloidglykoside

Die Steroidalkaloidglykoside oder Glykoalkaloide teilen viele physikalische und biologische Eigenschaften mit den Steroidglykosiden, aber Alkaloidglykoside werden normalerweise gesondert betrachtet, weil ihre Steroidstruktur Stickstoff enthält. Häufig haben die Aglukone Methylsubstituenten, die zu Hydroxymethyl-, Aldehyd- oder Carboxylgruppen oxidiert werden können; diese Komponenten können eine Rolle bei einigen der biologischen Wirkungen der Saponine spielen. Umfangreiche Studien der Saponine haben gezeigt, dass die Triterpen-Saponine nicht nur am häufigsten in der Natur vorkommen, sondern auch die mit den interessantesten biologischen und pharmakologischen Eigenschaften sind.
Saponine haben eine oder mehrere lineare oder verzweigten Zuckerketten, die an das Aglykon über eine Glukosidische Äther- oder Esterverbindung angeschlossen ist bzw. sind. In einigen Saponinen wurde auch die Anwesenheit von acylierten Zuckern festgestellt. Entsprechend der Anzahl der Zuckerketten, die dem Aglukon angehängt sind, können Saponine monodesmosidische Saponine (mit einer einzigen Zuckerkette) oder bidesmosidische Saponine (mit zwei Zuckerketten) sein. In monodesmosidischen Saponinen wird die Zuckerkette normalerweise von einer glycosidischen Ätherverbindung an das C-3 des Aglukons angeschlossen. Zusätzlich zu der an C-3 angehängten Zuckerkette haben bidesmosidische Saponine eine zweite Zuckerkette an C-28 (Triterpen-Saponine) oder an C-26 (Steroid-Saponine) durch eine Etterverbindung angebunden. Wegen der typischen Fähigkeit von Estern werden bidesmosidische Saponine leicht in ihre monodesmosidischen Bilden durch milde Hydrolyse umgewandelt (Hostettmann, K. et al., Methods Plant Biochem. 7:435-471 (1991)) (2). Anscheinend sind monodesmosidische Saponine signifikant in Pflanzen biologisch aktiver als ihre bidesmosidischen Formen. Zum Beispiel führt in Hedera helix die enzymatische Transformation des bidesmosidischen Hederasaponin C zu dessen monodesmosidischer Form (α-Hederin) zu einem Produkt von hoher antibiotischer Aktivität (Wagner, H. & Horhammer, L., Pharmacognosy und Phvtochemistry, Springer-Verlag, Berlin (1971)). Generell tendieren monodesmosidische Saponine auch dazu, hämolytischer als bidesmosidische Saponine zu sein. Diese Eigenschaft scheint gut mit ihrer antifungalen Wirkung zu konelieren. Vermutlich verändern Saponine durch Interagieren mit membrangebundenen Sterolen von Pilzen die Durchlässigkeit von Zellmembranen, was zum Tod des Organismus führt (Price, K.R., et al., CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26:27-135 (1987)). Folglich scheint die Auswahl der Wirte für Pflanzenkrankheiten verursachende Pilze funktionell von deren Kapazität bestimmt zu sein, enzymatisch die Saponine des Wirtsorganismus zu entgiften, (Bowyer, P. et al., Science 267: 371-374 (1995)). Die acylierten Quillaja-Saponine scheinen jedoch eine Ausnahme zu sein, da ihre monodesmosidischen Formen signifikant weniger wirksame hämolytische Substanzen sind als ihre acylierten und nicht-acylierten bidesmosidischen Formen, (Pillion. D. J. et al., J. Pharm. Sci. 84; 1276-1279 (1996)). Bidesmosidische Saponine dienen sehr wahrscheinlich als nützliche Formen für die Lagerung und/oder den Transport dieser Verbindungen bis zu der Zeit, in der die biologisch wirksamen monodesmosidischen Formen für die Verteidigung der Pflanze gefordert sind (Hostettmann, K. et al., Methods Plant Biochem. 7:435-471 (1991); Osbourn, A.E. et al., Adv. Exp. Med. Biol, 404:547-555 (1996)). Im Gegensatz dazu können bidesmosidische Saponine in Tieren starke biologische und pharmakologische Wirkungen haben, die mit Aspekten der Pflanzenphysiologie absolut keinen Zusammenhang haben.
Saponin-Adjuvantia aus der Borke des Ouillaja saponaria Molina-Baums (Quillaja-Saponine) sind chemisch und immunologisch gut charakterisierte Produkte (Dalsgaard, K. Arch. Gesamte Virusforsch. 44:243 (1974); Dalsgaard, K., Acta Vet. Scand. 19 (Suppl. 69): 1 (1978); Higuchi, R. et al., Phytochemistry 26:229 (1987); ibid. 26:2357 (1987); ibid. 27:1168 (1988); Kensil, C. et al., J. Intmunol. 146:431 (1991); Kensil et al., U.S. Patent No. 5,057,540 (1991); Kensil et al., Vaccines 92:35 (1992); Bomford, R. et al., Vaccine 10:572 (1992); und Kensil, C. et al., U.S. Patent No. 5,273,965 (1993)).
Diese Saponin-Adjuvantia sind eine Familie von eng verwandten O-acylierten Triterpenglykosid-Strukturen. Sie haben ein Aglukon-Triterpen (Quillasäure), mit verzweigten Zuckerketten an den Positionen 3 und 23 und eine an Position 23 angeschlossene Aldehydgruppe. Ein einzigartiges Merkmal der Quillaja-Saponine ist die Gegenwart von Acyloil-Acyl-Komponenten, die an die C-3-Hydroxygruppe einer Fucopyranose durch eine Esterbindung an Position 28 der Quillasäure angeschlossen ist. Diese Acyl-Komponenten wurden als 3,5-Dihydroxy-6-methyloctan Säure, 3,5-Dihydroxy-6 methyloctan-Säure, 5-O-α-L-rhanmopyranosyl-(1-2)-α-L-arabinofuranosid und 5-O-α-L-arabinofuranosid identifiziert.
Higuchi. R. et al. (Phytochemistry 26:229 (1987); ibid 27:1168 (1988) und Kensil C. et al., (U.S. Patent No. 5,057,540, ibid., Vaccine 92:35 (1992), und U.S. Patent No. 5,273,965 (1993)) haben nachgewiesen, dass sich die 3-O-glycosidische Verbindung zwischen dem Fucosyl-Rest und dem Acyloil-Acyl-Rest durch milde alkalische Hydrolyse aufspalten lässt, um Desacylsaponine zu ergeben. Diese Desacylsaponine aus Quillaja-Saponinen sind hydrophiler als die Original-Saponine. Anscheinend führt Deacylierung von Quillaja-Saponinen zu einem signifikanten Verlust von Adjuvanzwirkung, was sich durch Antikörperproduktion und CTI-Reaktion messen lässt (Kensil et al., U.S. Patent No. 5,057,540, Spalte 22, Zeilen 35 bis 49; Kensil et al., Vaccines 92:35 (1992); und Kensil et al., U.S. Patent No. 5,.273,965, Spalte 7, Zeile 62).
Quillaja-Saponine wurden als eine Mischung aus etwa zwanzig strukturell eng miteinander verwandten Triterpenoidglycosiden mit minimalen Unterschieden zwischen ihnen erkannt (Higuchi, R. et al., Phytochemistry 26:229 (1987); ibid, 26:2357 (1987); ibid., 27:1169 (1988); Kensil et al., U.S. Patent No. 5,057,540 (1991); Kensil et al., Vaccines 92:35 (1992)), was ihre Trennung schwierig macht. Ihre Triterpenoid-Gruppe trägt die Aldehyd-Gruppe, die für das Bewirken der T-Zellmmnunität verantwortlich ist, während ihre Kohlenhydratkomponenten die humorale Immunität auf ähnliche Weise wie bestimmte Polysaccharide zu verbessern scheinen (vielleicht durch Interagieren mit Lymphozytenrezeptoren) (Bohn J. und J. BeMiller, Carbohydrate Polymers 28:3 (1995). Tatsächlich beschreibt die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 90/03.184, dass Saponine mit ihrem zu Alkohol reduzierten Triterpenoidaldehyd immer noch in der Lage sind, eine Antikörperreaktion herbeizuführen. Eine andere Komponente von Quillaja-Saponinen, die Acyloil- Acyl-Gruppen, scheint gleichfalls eine Rolle bei der Adjuvanzwirkung zu spielen. Es gibt auch Gründe zu vermuten, dass ihre durch eine Normoterpen- Carbonsäure gebildete Acyloil-Acyl-Komponente teilweise für einige der bei mehreren gereinigten Quillaja-Saponine beobachteten toxischen Eigenschaften verantwortlich ist (Kensil, C. et al., J. Immunol. 146:431 (1991)). Es wäre daher von kommerziellem Interesse, modifizierte Quillaja-Saponine zu entwickeln, die leichter zu reinigen, potentiell weniger toxisch und chemisch stabiler sind und im Vergleich zu den Original-Saponinen gleiche oder bessere Adjuvanzeigenschaften haben.
Das Immunsystem kann sowohl spezifische als auch unspezifische Immunität zeigen (Klein, J., et al., Immunologie (2nd), Blackwell Science Inc., Boston (1997)). Im Allgemeinen produzieren B- und T-Lymphozyten, die für ein gegebenes Antigen spezifische Rezeptoren auf ihrer Zelloberfläche anzeigen, spezifische Immunität. Das Immunsystem kann auf verschiedene Antigene auf zwei Weisen antworten: 1) humoral vermittelte Immunität, die B-Zellstimulierung und Produktion von Antikörpern oder Immunglobulinen einschließt [andere Zellen werden an der Erzeugung einer Antikörperreaktion ebenfalls beteiligt, z.B. Antigen darstellende Zellen (APCs, einschließlich Makrophagen) und Helfer-T-Zellen (Th1 und Th2)], und 2) zellvermittelte Immunität (CMI), die im Allgemeinen T-Zellen einschließlich zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) betrifft, obwohl auch andere Zellen an der Erzeugung einer CTL-Reaktion beteiligt sind (z.B. Th1- und/oder Th2-Zellen und APCs). Unspezifische Immunität umfasst verschiedene Zellen und Mechanismen, wie Phagozytose (das Verschlingen fremder Partikel oder Antigene) durch Makrophagen oder Granulozyten und natürlicher Killer-(NK)-Zellaktivität und andere. Unspezifische Immunität hängt von evolutionär weniger fortschrittlichem Mechanismen ab (z. B. Phagozytose, die ein wichtiger Wirtsverteidigungsmechanismus ist) und zeigt nicht das erworbene Wesen von Spezifität und Gedächtnis, Kennzeichen einer spezifischen Immunreaktion an. Unspezifische Immunität ist eher den Wirbeltieren angeboren. Außerdem interagieren Zellen, die an unspezifischer Immunität beteiligt sind, wesentlich mit B- und T-Zellen, um eine immune Reaktion zu produzieren. Die entscheidenden Unterschiede zwischen spezifischer und unspezifischer Immunität basieren auf B- und T-Zellspezifität. Diese Zellen erwerben ihre Reaktionsweise vorwiegend nach Aktivierung mit einem spezifischen Antigen und haben Mechanismen, um Gedächtnis zu zeigen, falls sie zukünftig diesem spezifischen Antigen ausgesetzt werden. Als Ergebnis ist Impfung (die Spezifität und Gedächtnis einschließt) ein wirksames Protokoll zum Schutz gegen schädliche Krankheitserreger.
Eine kritische Komponente inaktivierter Impfstoffe, einschließlich Subunit-Vakzine, ist ein Adjuvans. Adjuvantia sind nichtimmunogene Verbindungen, die mit einem Antigen verabreicht (entweder gemischt mit oder vor der Verabreichung des Antigens gegeben) die Immunreaktion auf dieses besondere Antigen verbessert oder modifiziert. Auf diese Art sind humoral und/oder zellulär vermittelte Immunreaktionen wirksamer, wenn ein Antigen mit einem Adjuvans verabreicht wird. Weiterhin kann das Adjuvans die Qualität der Immunreaktion durch Beeinflussung der erzeugten Unterklassen (Isotypen) von Immunglobulinen verändern (IgGI, IgG2.IgG3. und IgG4 für menschliches IgGs; IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 für Mäuse-IgGs), gleichfalls auch ihre Affinitäten. Eine von Th1-Zellen in Mäusen gesteuerte Reaktion induziert IgG1, IgG2a, IgG2b und in geringerem Maße IgG3 und begünstigt auch eine CMI-Reaktion auf ein Antigen. Wenn die IgG-Reaktion durch Zellen des Typs Th2 gesteuert wird, verbessert sich vor Allem die Produktion von IgGI und IgA.
Zu den Adjuvantia, die verwendet worden sind, um eine Immunreaktion zu verbessern, gehören Aluminiumverbindungen (alle generell als "Alaun" bezeichnet), Öl-in-Wasser-Emulsionen (die oft andere Bestandteile enthalten), vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA, eine Öl-in-Wasser- Emulsion, die getrocknete, hitzegetötete Tuberkulosebakterium-Organismen enthält) und Pertussis-Adjuvans (eine salzige Suspension getöteter Bordatella-pertussis-Organismen). Von diesen Adjuvantia wird generell angenommen, dass ihr Aktionsmechanismus darauf beruht, ein Depot von Antigen zu verursachen und eine langsame Freigabe von Antigen in das Immunsystem zu erlauben und eine unspezifische Entzündung zu erzeugen, von der angenommen wird, dass sie für ihre beobachtete Wirkung verantwortlich ist (Cox J.C., et. al., Vaccine 15:248-256 (1997)). Bei einigen Saponinen wurde gezeigt, dass sie verschiedene Arten Immunstimulationswirkungen einschließlich Adjuvanswirkung haben. Diese Wirkungen sind schon früher zusammengestellt worden (Shibata, S., New Nat. Prod. Plant Pharmacol. Biol. Ther. Act., Proc. Int. Congr. 1st, 177-198 (1977); Price, K.R., et al., CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26: 27-135 (1987); Schöpke, Th., & Hiller. K., Pharmazie 45:313-342 (1990); Lacaille-Dubois, M.A. et al., Phylomedicine 2:363-386 (1996)).
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 93/05789 beschreibt Konjugate, bei denen schwach-immunogene Eiweiße kovalent an gereinigte acylierte Ouillaja-Saponinfraktion über die Carboxylgruppe der 3-O-Glukuronsäure gebunden werden. Zusatz von freien Quillaja-Saponinen zu diesen Konjugaten führte eine höhere Immunreaktion herbei, was darauf schließen lässt, dass 1. das kovalent beigefügte Quillaja-Saponin als Verbindungsstelle für zusätzliche Saponinmoleküle dient und 2., dass der Adjuvanseffekt von der Anzahl der Saponine abhängt, die mit dem Eiweißantigen verbunden sind.
Die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 90/03184 beschreibt einen Immunostimulationskomplex (ISCOM), der mindestens ein Lipid und mindestens ein Saponin aufweist und gegebenenfalls Adjuvantia zusätzlich zu dem Saponin einschließen kann. Von diesen Matrizen wird gelehrt, dass sie als immunomodulierende Wirk- und Impfstoffe nützlich sind. Das Lipid und das Saponin sind eher physikalisch miteinander assoziiert als kovalent aneinander gebunden. Quil A (ein Quillaja-Saponin-Extrakt) ist das bevorzugte Saponin. Die Literaturstelle lehrt außerdem, dass es günstig ist, (zusätzlich zu Quil A) der ISCOM-Matrix Adjuvantia hinzuzufügen. Die Literaturstelle lehrt, dass ein Adjuvans, dem geeignete hydrophobe Eigenschaften fehlen, modifiziert werden kann, um einen hydrophoben Bereich für die Integration in die ISCOM-Matrix aufzuweisen.
Bomford, R. et al., Vaccine 10:572-577 (1992) lehrt, dass sich Lipide zur ISCOM-Bildung mit einer Vielfalt von Saponinen mischen lassen. Die Literaturstelle lehrt, dass Quillaja-Saponine, Gypsophila-Saponine und Saponaria-Saponine die einzigen getesteten Saponine waren, die Adjuvanswirkung zeigten.
Es bleibt ein Bedarf nach Adjuvantia, die eine verbesserte Adjuvanswirkung und niedrigere Toxizität haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf neuartige chemische Verbindungen gerichtet, die hierin als Saponin-lipophile Konjugate Bezug bezeichnet werden, bei denen

(1) ein nicht-acyliertes oder deacyliertes Triterpen-Saponin, das einen 3-O-Glukuronsäurerest hat, kovalent gebunden ist an:
(2) eine Verbindung, die einen lipophilen Bereich hat, wie Fettsäure, Fettsäureamin, Phospholipid, Terpen, Polyäthylenglykol und andere; wobei (1) an (2) über das Carboxylkohlenstoffatom am 3-O-Glukuronsäurerest des Triterpen- Saponins gebunden ist.

Die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf pharmazeutische und veterinärmedizinische Gemische, die eines oder mehrere der Saponin-lipophile Konjugate und ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Verdünnungsmittel, Träger oder Vehikel aufweisen. Diese Gemische können als Immunverstärker in Tieren und Menschen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Impfstoffe gerichtet, die ein oder mehrere Antigene und ein Saponin-lipophiles Konjugat aufweisen.
Die vorliegende Erfindung ist auch darauf gerichtet, die Verstärkung einer Immunreaktion in Säugetieren zu verbessern und umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge an einem Saponin-lipophiles Konjugat, um die Immunreaktion von Säugetieren auf ein Antigen oder mehrere Antigene zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Impfverfahren gerichtet und umfasst die Verabreichung einer oder mehrerer Antigene und eines Saponin-lipophiles Konjugats.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
1 illustriert typische chemische Strukturen für Saponine, die von Quillaja, Gypsophila und Saponaria abgeleitet sind.
2 illustriert typische chemische Strukturen für (a) Saponin von Acanthophvllum squarrosum und (b) Lucyosid P.
3 zeigt den Vergleich der durch OVA allein bewirkten Anti-OVA IgG-Primärimmunreaktion und der entsprechenden Reaktion in Gegenwart von Alaun, Quillaja-Saponin und unterschiedlichen Dosen von desacyliertem Quillaja-Saponin und von einem Quillaja-Saponin-lipophiles Konjugat (GPI -0100), Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung.
4 zeigt die typischen Endpunkttiter für Immunisierung mit dem OVA-Antigen in der Gegenwart von Freund'schem vollständigen Adjuvans, Quillaja-Saponin, Quillaja-Saponin-lipophiles Konjugat der vorliegenden Erfindung, Alaun und OVA allein. Die durch die antigenspezifische Antikörperbindung bewirkte Absorption wurde als Funktion des Logarithmus der Serenverdünnung aufgezeichnet.
5 zeigt den Vergleich der protokollierten Endpunkttiter für die sekundäre Anti-OVA-IgG-Immunreaktion, bewirkt durch OVA allein und in Gegenwart von Alaun, Quillaja-Saponin und unterschiedlichen Dosen von Quillaja-Saponin-lipophiles Konjugat (GPI -0100).
6 zeigt die Wirkungen von Alaun, Quillaja-Saponina und unterschiedlichen Dosen von Quillaja-Saponin-lipophiles Konjugat auf die Produktion von IgG-Isotypen (GPI -0100) der vorliegenden Erfindung. Die protokollierten Endpunkttiter wurden unter Verwendung von Antikörpern bestimmt, die für jeden Isotyp spezifisch sind.
7 zeigt den Vergleich der proliferativen Reaktionen in vitro, die durch von Mäusen isolierte zweimal immunisierte T-Lymphozyten herbeigeführt wurden, mit OVA allein oder in Gegenwart von Alaun Quillaja-Saponin, unterschiedlichen Dosen von desacyliertem Quillaja-Saponin und Quillaja-Saponin-lipophiles Konjugat der vorliegenden Erfindung (GPI -0100). Der Grad der Vorbehandlung wurde durch Stimulierung der Spleenozyten entweder mit 2 oder 10 μg OVA und Messung der zunehmenden Änderungen in der ³H-Thymidinintegration (Δ ³H-TdR-Integration, c.p.m.) bestimmt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung ist auf neuartige chemische Verbindungen, auf die hierin als Saponin-lipophilkonjugate Bezug genommen wird, gerichtet und weist auf

(1) ein nicht-acyliertes oder deacyliertes Triterpenesaponin, das einen 3-O-Gukuronäurerest hat, kovalent gebunden an:
(2) eine lipophile Komponente, zum Beispiel eine oder mehrere Fettsäuren, Fettsäureamine, aliphatische Amine, aliphatische Alkohole, aliphatische Mercaptane, Terpen oder Polyäthylenglykol; wobei (2) an (1) über das am 3-O-Glucuronsäurerest des Triterpen-Saponins vorhandene Carboxylkohlenstoffatom entweder direkt oder durch eine geeignete Bindegruppe gebunden wird.

Die Anbindung einer lipophilen Komponente an die 3-O-Gucuronsäure eines Saponins wie Quillaja desacylsaporiins, Silene jenisseenis, Willd'sche Desacylsaponine, Lucyoside P. und Gypsophila Saponaria und Acanthophvlluin squarrosum Saponine verbessern ihre Adjuvanswirkungen auf humorale und zellulär vermittelte Immunität. Außerdem ergibt das Binden einer lipophilen Komponente an den 3-O-Glucuronsäurerest von nicht-acyliertem oder deacyliertem Saponin ein Saponinanalog, das leichter zu reinigen, weniger toxisch, chemisch stabiler ist und gleiche oder bessere Adjuvanzeigenschaften als das Originalsaponin besitzt.
In ihrer breitesten Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein oder mehrere modifizierte Saponine, wobei besagte modifizierte Saponine (a) eine Triterpenaglyconkernstruktur (wie Quillasäure, Gypsogenin und andere) mit verzweigten Zuckerketten, die an die Positionen 3 und 28 gebunden sind, und eine gebundene oder an Position 4 angehängte Aldehydgruppe haben, (b) entweder ursprünglich nicht-acyliert sind oder die Entfernung einer Acyl- oder Acyloilgruppe erfordern, die an ein Saccharid an der Position 28 des Triterpenaglycons gebunden ist, und (c) eine lipophile Komponente haben, die kovalent entweder direkt oder durch eine Bindungskomponente an die Karbonsäure von Glucuronsäure an der Position 3 des Triterpenaglycons gebunden ist.
Die hierin gebrauchten Ausdrücke "lipophile Komponente" und "ein Rest eines lipophilen Moleküls" beziehen Sie sich auf eine Komponente, die durch kovalente Interaktion einer geeigneten funktionellen Gruppe von einer oder mehreren Verbindungen gebunden ist, die nichtpolar sind oder einen nichtpolaren Bereich mit dem 3-O-glcA-Rest eines Saponins haben. Die lipophile Komponente kann Teil einer amphipathischen Verbindung sein. Eine amphipathische Verbindung ist eine Verbindung, deren Moleküle sowohl polare als auch nichtpolare Bereiche enthalten. Oberflächenaktive Substanzen sind Beispiele für amphipathische Verbindungen. Oberflächenaktive Substanzen besitzen normalerweise einen nichtpolaren Teil, der oft eine Alkyl-, Aryl- oder Terpenstruktur ist. Außerdem besitzt eine oberflächenaktive Verbindung einen polaren Teil, der anionisch, kationisch, amphoterisch oder nichtionisch sein kann. Beispiele für anionische Gruppen sind Carboxylat, Phosphat, Sulfonat und Sulfat. Beispiele für kationische Domänen sind Aminsalze und quarternäre Ammoniumsalze. Amphoterische oberflächenaktive Substanzen besitzen sowohl einen anionischen als auch einen kationischen Bereich. Nichtionische Bereiche sind normalerweise Derivate einer fettsauren Carboxygruppe und schließen Saccharid- und Polyoxyethylenderivate ein.
Eine lipophile Komponente kann auch zwei oder mehr Verbindungen aufweisen, die nichtpolare Bereiche besitzen, wobei jede der Verbindungen völlig an eine Verbindungsgruppe gebunden ist, die wiederum kovalent an die 3-O-Glucuronsäure gebunden ist.
Mehrere lipophilhaltige Verbindungen, wie aliphatische Amine und Alkohole, Fettsäuren, Polyäthylenglykol und Terpene, können dem 3-O-glcA-Rest von Deacyl-Saponinen und dem 3-O- glcA-Rest von nicht-acylierten Saponinen zugesetzt werden. Das Lipophil kann eine aliphatische oder eine zyklische Struktur sein, die gesättigt oder ungesättigt sein kann. Zum Beispiels können Fettsäuren, Terpenoide, aliphatische Amine, aliphatische Alkohole, aliphatische Mercaptane, Glykosylfettsäuren, Glykolipide, Phospholipide und Mono- und Diacylglyserole kovalent an nicht-acylierte Saponine oder Desacylsaponine gebunden werden. Die Bindung kann über eine funktionelle Gruppe an eine lipophile Komponente erfolgen, die kovalent entweder mit der sauren Komponente der 3-Glucuronsauren Komponente oder einer aktivierten Säurefunktionalität an dieser Position reagiert. Alternativ kann ein bifunktionaler Linker verwendet werden, um das Lipophil zum 3-O-glcA-Rest des Saponins zu konjugieren.
Zu den nützliche Fettsäuren gehören C₆-C24-Fettsäuren, vorzugsweise C₇-C₁₈-Fettsäuren. Beispiele für nützliche Fettsäuren sind gesättigte Fettsäuren wie Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Behensäure und Lignocerinsäure, sowie ungesättigte Fettsäuren wie Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure.
Zu den nützlichen aliphatischen Aminen, aliphatischen Alkohole und aliphatischen Mercaptanen gehören Amine und Alkohole und Mercaptane (RSH), die eine geradkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte aliphatische Gruppe mit ungefähr 6 bis ungefähr 24 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 6 bis 20 Kohlenstoffatome, besser 6 bis 16 Kohlenstoffatome und am besten 8 bis 12 Kohlenstoffatome haben. Zu den Beispielen für nützliche aliphatische Amine gehören Oktylamin, Nonylamin, Decylamin, Dodecylamin, Hexadecylamin, Sphingosin und Phytosphingosin. Zu den Beispielen für nützliche aliphatische Alkohole gehören Oktanol, Nonanol, Dekanol, Dodekanol, Hexadekanol, Chirnylalkohol und Selachylalkohol.
Zu den nützlichen Terpenoiden gehören Retinol, Retinal, Bisabolol, Citral, Citronellal, Citronellol und Linalool.
Zu den nützlichen Mono- und Diacylglycerinen gehören Mono- und doppelt verestertes Glycerin, wobei die Acylgruppen 8 bis 20 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 8 bis 16 Kohlenstoffatome, einschließen.
Nützliche Polyäthylenglykole haben die Formel H-(O-CH₂-CH₂)_nOH, wobei n, die Anzahl der Äthylenoxideinheiten, von 4 bis 14 ist. Zu den Beispiele für nützliche Polyäthylenglykole gehören PEG 200 (n=4), PEG 400 (n =8-9) und PEG 600 (n=12-14).
Nützliche Polyäthylenglykol-Fettalkoholäther, bei denen die Äthylenoxideinheiten (n) zwischen 1 bis 8 sind und die Alkylgruppe von C₆ bis C₁₈ ist.
Eine Seitenkette mit amphipathischen Merkmalen, d.h. asymmetrischer Verteilung hydrophiler, und hydrophober Gruppen erleichtert (a) die Bildung von Micellen wie auch eine Verbindung mit Antigenen und (b) die Zugänglichkeit des Triterpenaldehyds zu zellulären Rezeptoren. Es ist auch möglich, dass die Gegenwart einer negativ geladenen Carbonylgruppe in solch einer Seitenkette zum Abweisen der Triterpengruppen beitragen kann und ihnen auf diese Art einen größeren Grad an Rotationsfreiheit erlaubt. Dieser letztere Faktor würde die Zugänglichkeit zellulärer Rezeptoren zur iminebildende Carbonylgruppe steigern.
Die Desacylsaponine und Nicht-acylierten Saponine können direkt mit der lipophilen Komponente oder über eine Verbindungsgruppe verbunden werden. Mit dem Ausdruck "Verbindungsgruppe" sind ein oder mehrere bifunktionale Moleküle gemeint, die verwendet werden können, um die Desacylsaponine, nicht-acylierte Saponine oder Mischungen davon mit dem lipophilen Molekül kovalent zu verbinden. Die Verknüpfungsgruppe schließt sich kovalent an die Karbonsäuregruppe der 3-O-Glucuronsäurekomponente an der Triterpenkernstruktur und an eine geeignete funktionelle Gruppe an, die sich am lipophilen Molekül befindet.
Nicht einschränkende Beispiele für Verknüpfungsgruppen, die verwendet werden können, um das Saponin und das lipophile Molekül zu verbinden, sind Alkylendiamine (NH₂-(CH₂)_n-NH₂), wobei n von 2 bis 12 ist, Aminoalcohole (HO-(CH₂)_r-NH₂), wobei r von 2 bis 12 ist, und Aminosäuren, die gegebenenfalls carboxygeschützt sind, Äthylen- und Polyäthylenglykole (H-(O-CH₂-CH₂)_n-OH, wobei n 1-4 ist), Aminomercaptane und Merceaptokarbonsäuren.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich bei jedem Saponin, das die oben genannten beschriebenen strukturellen Anforderungen aus den hierin beschriebenen Gründen erfüllt. Der hierin verwendete Ausdruck "nicht-acyliertes Saponin" oder "Nichtacyl-Saponin" bezieht sich auf ein Saponin, dem eine angeschlossene Acyl- oder Acyloilgruppe fehlt, die an einen oligosacchariden Rest gebunden ist, der wiederum an Position 28 des Triterpens gebunden ist.
Der hierin verwendete Ausdruck "Deacylsaponin" oder "deacyliertes Saponin" bezieht sich auf ein Saponin, das modifiziert worden ist, um eine Acyl- oder Acyloilgruppe von einem oligosacchariden Rest zu entfernen, der selbst an Position 28 des Triterpens gebunden ist.
Quillaja, Gypsophila und Saponaria sind nützliche Saponine, die alle verzweigte Triterpenaglycone mit einer an Position 4 angeschlossenen Aldehydgruppe verbunden oder an diese angeschlossen sind, verzweigte Oligosaccharide, verknüpft durch eine Esterverbindung in Position 28 und eine 3-O-Glucuronsäure (3-O-glcA), die in Quillaja und Gypsophila an verzweigte Oligosaccharide gebunden ist. Saponine von O. saponaria und S. jenisseenis schließen Acylkomponenten ein, wohingegen Saponin von Gypsophila, Saponaria und Acanthophyllum keine Acyl-Komponenten einschließen. Jedes dieser nicht-acylierten oder deacylierten Saponine ist in der vorliegenden Erfindung nützlich.
Anderer Triterpensaponine sind auch für die Herstellung der Lipidconjugate geeignet, die der Gegenstand dieser Anmeldung sind. Diese neuen Saponine haben strukturelle Merkmale ähnlich den Saponinen von Quillaja saponaria Molina, Gypsophila sp. oder Saponaria officinalis, d.h., sie haben einen Aldehyd- und einen Gluconursäurerest, der mit ihren Aglyconen verbunden ist. Diese zusätzlichen Saponine sind das Bidesmosid-Saponin, Squarrosid A, isoliert von Acanthophyllum squarrosum; das Saponin-Lucyosid P und zwei acylierte Saponine, isoliert von Silene jenisseensis Willd. Es folgt eine kurze Beschreibung dieser Verbindungen.
Squarroside A ist ein Bidesmosid-Saponin, das zwei Oligosaccharidketten enthält, die mit C-3 und C-28 seines Aglycongypsogenins verbunden ist. Ähnlich dem Gypsophila-Saponin hat es eine mit C-4 des Aglycon verbundene Aldehydgruppe und einen Glucuronsäurerest an C-3. Außerdem enthält es einen acetylierten Fucoserest an C-28. Es wurde nachgewiesen, dass Squarrosid A immunomodulierende Wirkung hat, wie durch einen lymphoproliferativen Test in vitro gemessen wurde. Diese anscheinend nicht spezifischen immunomodulierenden Wirkungen waren dosisabhängig: eine abschwächende Wirkung bei Konzentrationen im μg-Bereich und eine anregende Wirkung im pg-Bereich.
Lucyoside P ist ein bidesmosidisches Saponin, das einen mit C-3 und C-28 verbundenen Kohlehydratrest seiner Aglycon-Quillasäure und eine Aldehydgruppe an C-4 hat. Lucyosid P hat einen Glucuronsäurerest an C-3.
Zwei acylierte Saponine wurden von Caryophyllacea Silene jenisseensis isoliert. Diese Saponine haben an C-3 und C-28 ihrer Agylcon-Quillasäure gebundene Kohlehydrate. Die mit C-3 und C-28 verbundenen Kohlehydratreste sind Glucuronsäure beziehungsweise Fucose. Der Fucoserest wird mit einer p-Methoxycinnamoylgruppe acyliert, um Trans- und Cis-p-Methoxycinnamoyltritepenglycoside zu ergeben. Obwohl diese Saponine eine Aldehydgruppe haben, haben sie keine erkennbare immunstimulierende Wirkung, wie sich bei einer chemiluminescenz-Granulocytenuntersuchung in vitro gezeigt hat. Es ist jedoch möglich, dass die p-Methoxycinnamoylkomponente die Wirkung des reaktiven Sauerstoffs stört, der gebraucht wird, um Chemiluminescenz zu erzeugen.
Alle zuvor beschriebenen Saponine sind zur Reinheit isoliert worden. Die acylierten Saponine von Silene jenisseensis sind jedoch nur als eine Mischung aus den cis- und den transisomeren Formen erhalten worden. Ähnlich dem Q. saponaria saponin werden diese acylierten Saponine von Silene jenisseensis durch milde alkalische Hydrolyse mit ∼0,2 N KOH 1 Stunde bei Raumtemperatur deacyliert. Das deacylierte Saponin wird dann durch eines der hierin beschriebenen Verfahren modifiziert, um analoge Substanzen mit Immunstimulations- und Adjuvanswirkungen zu ergeben.
Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung sind desacylierte Quillaja-Saponine, die an einer Lipophilkomponente über chemische Reaktion mit der Carboxylgruppe der 3-O-Glucuronsäure konjugiert waren.
Somit bezieht sich eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf Verbindungen der Formel II:
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon; wobei
R' Glucose oder Wasserstoff ist; R² ist Apiose oder Xylose, vorzugsweise Apiose; X ist S, O, NH oder eine Verbindungsgruppe; und R³ ist ein Rest eines Lipophilmoleküls.
Bevorzugte Werte von X schließen O und NH ein. Außerdem wird eine Anzahl bifunktionaler Verbindungsgruppen bevorzugt. Nützliche Beispiele schließen ein:
-NH-CH₂-CH₂-NH-, -NH-CH(COOH)-CH₂-NH-, -NH-CH₂-CH(COOH)-NH-,-NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH-, -O-(CH₂)_r-NH-, -S-(CH₂)_r-NH-, -S-(CH₂)_r-C(O)-, -NH-CH₂-C(O)-, -O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-, -NH-NH-C(O)-CH₂-, -NH-C(CH₃)₂-C(O)- und -NH-NH-C(O)-(CH₂)_r-C(O)-NH-N=, wobei r in jedem Fall von 2-5 ist.
Bevorzugte R³-Gruppen schließen Reste von Fettsäuren, Terpenoiden, aliphatischen Aminen, aliphatischen Alkoholen, aliphatischen Mercaptanen, Polyäthylenglykolen, Glycosylfettsäuren, Mono- und Poly-C₂-C₄-Alkylenoxyderivate von Fettsäuren und Fettalkoholen, Glykolipiden, Phospholipiden und Mono-. Di- und Triacylglyzerolen ein, die geeignet sind, kovalent an die 3-O-gIcA-Carbonylgruppe oder an eine geeignete funktionelle Gruppe an einem bifunktionalen Linker gebunden zu werden.
Nützliche Beispiele für R³-Reste schließen Reste von Arachidonsäure, Caprylsäure, Retinal, Decanal, Carprylaldehyd, Nonylamin, Nonanol, Dodecylamin, Dodecanol, Octylglucopyranosid, Laurinsäure, Laurylmercaptan, Sphingosin, Dihydrosphingosin, 4-Octylbenzaldehyd, Vitamin A und Glucosamin-Ricinolsäurekonjugat ein.
Gleichermaßen lassen sich die Carbonsäurekomponente der 3-Glucuronsäure von Gypsophilia-, Saponaria- und Acanthophyllum-Saponin, das Saponin Lucyoside P und deacyliertes Saponin von S. jenisseenis modifizieren, um Konjugate zu liefern, wobei die Säure mit einem geeigneten Reagens reagiert, um ein Amid- oder Esterverbindung zu einer lipophilen Komponente entweder direkt oder über einen geeigneten Linker, wie hierin eingehender beschrieben ist, zu bilden. Die Glucuronsäure wird dadurch in -C(O)-X-R³ umgewandelt, wobei X und R³ wie oben definiert sind.
Saponin-lipophile Konjugate, die durch reagierende Gypsophilia- und Saponaria-Saponine gebildet werden, lassen sich durch die Formeln III beziehungsweise IV darstellen:
wobei X und R³ wie oben definiert sind.
Milde alkalische Hydrolyse der Quillaja-Saponinmischung führt zum Aufbrechen der 28-O-Esterbindung und zur Deacylierung des Saponins und erzeugt zwei Hauptprodukte, die eng miteinander verwandt sind und sich in einem einzigen Glucopyranosylrest unterscheiden (Higuchi, R. et al., Phytochemistry 26:229 (1987); ibid., 26:2357 (1987); ibid., 27:1169 (1988); Kensil et al., U.S. Patent No. 5,057,540 (1991); Kensil et al., Vaccines 92:35 (1992)). Diese zwei HauptDesacylsaponine, die durch chromatographische Verfahren getrennt werden können, sind hydrophiler und haben weniger Adjuvanswirkung als die Muttersaponine. Die Reduktion von über zwanzig Quillajasaponinarten auf nur zwei Verbindungen bietet jedoch eine praktikable Quelle an Ausgangsmaterialien für die Entwicklung und Produktion semisynthetischer Adjuvantia.
Bevorzugte Ausgangsmaterialien schließen desacylierte Quillaja-Saponine ein, dargestellt durch Formel I:
worin R¹ Glucose oder Wasserstoff ist, und R² Apiose oder Xylose ist. In einer bevorzugten Ausführungsform lassen sich zwei desacylierte Quillaja-Saponine, DS-1 und DS-2, unter Nutzung der hierin beschriebenen Isolierungsverfahren isolieren und entweder einzeln oder als Mischung verwenden. DS-1 bezieht sich auf eine Verbindung der Formel I, wobei R¹ H und R² Apiose oder Xylose ist. DS-2 bezieht sich auf eine Verbindung der Formel I, wobei R¹ Glucose und R² Apiose oder Xylose ist.
Zwischen 60%-70% der gesamten desacylierten Quillaja-Saponine, die die DS-2-Fraktion darstellen, haben einen Glucoserest an R¹. Die anderen 30% bis 40% der desacylierten Quillaja- Saponine (bei denen das von QS-21- abgeleitete Produkt überwiegt), die DS-1 darstellen, haben keine Glucosereste in ihrer Kohlehydratkomponente. Der zusätzliche Glucoserest verleiht DS-2 höhere Hydrophilie, das in der Umkehrphase HPLC früher als DS-1 eluiert. Die meisten Quillaja-Saponine haben Apiose an Position R², außer einem kleinen Teil von QS-21, der Xylose statt Apiose hat. Der Xyloseersatz dürfte sich hauptsächlich in der Fraktion DS-1 finden. Bevorzugt wird, die ganze Mischung aus DS-1 und DS-2 für die Herstellung von Konjugaten zu verwenden.
Weil sich der 3-O-glcA-Rest in Quillaja-Saponinen ohne Veränderung der Adjuvanswirkung modifizieren lässt, bietet diese Carboxylgruppe eine einzigartige Stelle für chemische Modifizierung der Desacylsaponine. Ohne an Theorie gebunden sein zu wollen, ersetzt die Integration einer lipophilen oder amphiphilischen Kette beim 3-O-glcA funktionell die aus Quillaja-Saponinen durch alkalische Hydrolyse entfernte 28-O-Acylgruppe. Diese Modifikation ergibt Neo-Saponine unterschiedlicher physikalisch-chemischer Eigenschaften und Adjuvanswirkung die vergleichbar mit den ursprünglichen Quillaja-Saponinen oder besser als diese sind. Diese Modifikation kann auch für nicht-acylierte Saponine von Gypsophila sp., Saponaria officinalis und das Saponin-Squarrosid und Lucyosid P verwendet werden, um deren Adjuvanswirkung auf die primäre Immunreaktion zu verbessern.
Die Desacylsaponine und nicht-acylierten Saponine lassen sich mit dem lipophilen oder amphiphilischen Molekül durch Herstellung eines aktiven Glucuronsäureesters mit anschließender Reaktion des aktiven Esters mit einer nucleophilischen funktionellen Gruppe am Linker oder lipophilen Molekül verbinden. Zu den Beispielen für aktive Ester, die sich bei der praktischen Anwendung der Erfindung verwenden lassen, gehören N-Hydroxysuccinimid- Glucuronat, Sulfo-N-Hydroxysuccinimid, Hydroxybenzotriazol und p-Nitrophenol. Die aktiven Ester lassen sich durch Reagieren der Carboxygruppe des Saponins mit einem Alkohol in Gegenwart eines Dehydrierungsmittels, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid (EDC) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidmethiodid (EDCI) herstellen. Der Linker oder das lipophile/amphiphilische Molekül wird dann mit dem aktivierten Ester in wässriger Lösung gemischt, um das Konjugat zu ergeben.
Wo eine Verknüpfungsgruppe zwischen dem Saponin und dem lipophilen oder amphiphilischen Molekül gewünscht ist, wird der aktive Ester des Saponin-Glucyronats wie oben beschrieben hergestellt und in Reaktion mit der Verknüpfungsgruppe, z.B. 2-Aminoethanol, einem Alkylendiamin, einer Aminosäure, wie Glycin, oder eine carboxygeschützte Aminosäure wie Glycin-tert-butylester gebracht. Falls der Linker eine geschützte Carboxygruppe enthält, wird die Schutzgruppe entfernt, und der aktive Ester des Linkers wird (wie oben beschrieben) hergestellt. Der aktive Ester wird dann mit dem lipophilen Molekül in Reaktion gebracht, um das Konjugat zu ergeben. Alternativ kann das lipophile Molekül mit Bernsteinanhydrid derivatisiert werden, um ein Lipophil-Succinatkonjugat zu ergeben, das sich in Gegenwart von EDC oder EDCI mit einem Saponinlinker-Derivat kondensieren lässt, das eine freie Amino- oder Hydroxylgruppe am Linker hat.
Es ist auch möglich, ein Saponinlinkerkonjugat herzustellen, der einen Linker mit einer (von einem Alkylendiamin abgeleiteten) freien Aminogruppe aufweist, und die freien Aminogruppen mit einem heterobifunktionalen Kreuzlinker, wie Sulfosuccinimidyl 4-(N-Maleimidocyclohexan)-1-carboxylat querzuvernetzen, der anschließend mit den freien Sulfhydrylgruppen der lipophile Thiolverbindung reagieren wird. Zu den Beispielen für solche Linker gehören Aminoalkohole wie 2-Aminoethanol und Diamine wie Ethylendiamin, 1,2-Propylendiamin, 1,5-Pentandiamin, 1,6-Hexandiamin und dergleichen. Das lipophile Molekül kann dann an den Linker gekoppelt werden, indem zuerst das succinierte Derivat mit Bernsteinanhydrid gebildet wird, worauf eine Kondensierung mit dem Saponin-Linkerkonjugat mit DCC, EDC oder EDCI folgt.
Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf eine Saponin-Analogsubstanz gerichtet, bei der eine Biotinylgruppe dem 3-O-glcA eines deacylierten Saponins oder eines nicht-acylierten Saponins wie Gypsophila und Saponaria saponin hinzugefügt worden ist. Die Einbindung einer Biotinylgruppe gestattet die Bindung von Avidin oder Streptavidin, das mit einer feststellbaren Markierung gekennzeichnet worden ist, z. B. einer radioaktiven, fluoreszierenden, paramagnetischen oder sonstigen Markierung oder Meldegruppe. Die Markierung dieser Verbindungen ermöglicht ihre Feststellung in vivo oder in vitro zu diagnostischen Zwecken. Zum Beispiel kann ein FACS-System für die Feststellung und Bestimmung von T-Zellen mit Zelloberflächenrezeptoren für das Saponinanalogprodukt verwendet werden. Die Anwesenheit dieser Rezeptoren zeigt an, welche Zellen potentiell durch Iminebildende Gruppen dazu stimuliert werden konnten, eine Immunreaktion zu produzieren. Die Bindung des markierten Avidins oder Streptavidins könnte entweder vor oder nachdem sich das biotinylierte Saponinanalogprodukt an die Zelloberflächenrezeptoren gebunden hat erfolgen.
Die Konjugate der vorliegenden Erfindung sowie nützliche Ausgangsmaterialien lassen sich entsprechend den folgenden Verfahren herstellen. Schemata, auf die sich bezogen wird, befinden sich am Ende des Beschreibungsabschnitts vor den Ansprüchen.
Herstellung von Ausgangsmaterialien
Es gibt zwei Verfahren, die auf milder alkalischer Hydrolyse basieren, um das Ouillajadesacyl-Saponin herzustellen. Das erste von Higuchi, R. et al. beschriebene Verfahren (Phytochemistry 26:229 (1987), durch Bezugnahme vollständig hierin eingebracht) beginnt mit einem alkoholischen Auszug durch Quillaja-Rinde, und die beiden Desacylsaponinen (1 und 2) werden durch chromatographische Verfahren getrennt (siehe Schema 1). Dieses Verfahren erbringt schwache Ausbeuten für beide Produkte.
Ein zweites, von Kensil, C. et al. beschriebenes Verfahren (U.S. Patent Nr. 5,057,540, durch Bezugnahme vollständig hierin eingebracht) beginnt mit teilweise durch Ultrafiltration oder Gelchromatographie gereinigten Quillaja-Saponinen (Dalsgaard. Arch. Gesamte Virusforsch, 44:243 (1974); Acta Vet. Scand. 19 (Suppl. 69): 1 (1978)). Die Desacyl-Saponine 1 (DS-1) und 2 (DS-2) werden durch chromatographische Verfahren aufgelöst. Dieses Verfahren erbringt gute Ausbeuten für beide Produkte.
Ein weiteres Schema für die Gewinnung und Isolierung der Desacylsaponine 1 und 2 wird in Schema 2 gezeigt.
Die Desacylsaponine 1 und 2 werden vor ihrer chemischen Modifizierung getrennt. In einigen Fällen wäre es je nach Toxizität, Reproduzierbarkeit, Wirksamkeit und den potentiellen Steuerungsproblemen möglich, die modifizierte Mischung aus 1 und 2 als Adjuvanz zu verwenden.
Deacyliertes Saponin von einem S. jenisseensis-Saponin kann auch durch basische Hydrolyse gebildet werden. Siehe Schema 3. Die Hydrolysereaktion resultiert in der Entfernung einer trans-p-Methoxycinnamoylgruppe.
Fettsäuredesalcylsaponin-Konjugate
Fettsäuren sind geeignet, den 3-O-glcA-Rest von Desacylsaponinen zu modifizieren. Bestimmte ungesättigte Fettsäuren wie Arachidonsäure haben eine Reihe von Doppelbindungen, die eine den Terpenoiden ähnliche starre Struktur auferlegt, und werden bevorzugt. Zu anderen Beispielen für bevorzugte Fettsäuren gehören Caprylsäure, Capronsäure, Caprinsäure, Linolsäure, Palmitinsäure, Ricinolsäure, Ölsäure, Palmitoleinsäure, Pelargonssäure, Laurinsäure und Cicosapentansäure.
Mit Hilfe der Carbodiimid- oder der gemischten Anhydridverfahren lässt sich ein Diamin an eine einzelne Monocarbonsäure mittels einer Amidbindung koppeln, um ein Produkt mit einer freien Aminogruppe zu ergeben. Diese -NH₂-Gruppe wird dann an die -COOH-Gruppe der 3-O-glcA-Desacylsaponine unter Verwendung des Carbodiimidverfahrens gekoppelt. Das Endprodukt ist ein Desacylsaponin mit einer an den 3-O-glcA-Rest hinzugefügten Fettsäure.
Das Folgende sind allgemeine Protokolle für die Bildung von Fettsäuredesacylsaponin-Konjugaten der vorliegenden Erfindung.
i. Bildung des Fettsäure-Aciddiaminprodukts
Eine Fettsäure wie Capryl- oder Arachidonsäure kann zu ihrem N-Hydrosuccinimid (NHS)-Ester durch Reaktion mit NHS und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in einem Alkohol wie Äthanol, Dimethylformamid (DMF) oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel aktiviert werden. Die bei Mischung im Dunklen bei 0 bis 4°C durchgeführte Reaktion hat für jedes Mol Fettsäure ungefähr ein Mol DCC und 1,5 bis 2,0 Mol NHS. Nach einer Reaktionszeit von 4-6 Stunden wird der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird einem organischen Lösungsmittel hinzugegeben, das ein Diamin in einem 5-10-fachen Mol-Überschuss zur Fettsäure enthält. Das Diamin ist vorzugsweise Äthylendiamin oder Propylendiamin. Die Reaktion wird bei Mischung im Dunklen bei 0 bis 4°C weitere 8 Stunden weitergeführt. Das Produkt, ein Diamin, das durch eine stabile Amidbindung an einen einzigen Fettsäurerest gekoppelt ist, lässt sich von den anderen Reaktanten durch selektive Extraktion, Ausfällen und/oder Chromatographie trennen.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung eines Fettsäurediamins ist das gemischte Anhydridverfahren: Arachidonsäure und tri-n-Butylamin werden in Dioxan aufgelöst, wobei ungefähr 2 Mol Amin für jedes Mol Säure eingesetzt werden. Der abgekühlten Lösung wird Isobutylchlorcarbonat (ein Mol pro Mol Fettsäure) unter Rühren zugegeben und der Mischung 0,5 bis 1 Stunde Reaktionszeit gegeben. Die Mischung wird ungeteilt Dioxan zugegeben, das einen 8 bis 10-fachen Überschuss an Diamin enthält und eine Reaktionszeit von 4 Stunden unter Rühren und Kühlen gegeben. Das Fettsäurediamin lässt sich extrahieren und durch Ausfällen und/oder Chromatographie abtrennen. Die modifizierte Fettsäure wird als Zusatz zu den Desacylsaponinen verwendet.
ii. Addition des Fettsäurediaminprodukts an Desacylsaponine:
Das Carboxyl des 3-O-glcA Rests der Desacylsaponine wird durch das oben beschriebene Carbodiimidverfahren aktiviert. Die in DMF, Dioxan oder einem anderen polaren Lösungsmittel durchgeführte Reaktion hat für jedes Mol Desacylsaponin 1 Mol DCC und 1,5 bis 2,0 Mol NHS. Die Reaktion wird 4-6 Stunden in Dunkelheit bei 0 bis 4° C durchgeführt. Der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtrierung entfernt. Das Filtrat wird einer DMF- oder Dioxanlösung hinzugegeben, die das Fettsäurediaminprodukt in einer annähernd gleichmolaren Menge in Bezug auf die Desacylsaponine enthält; und danach wird der Mischung erlaubt, ungefähr 8 Stunden bei 25° C zu reagieren. Das Produkt, ein aus Desacylsaponin bestehendes Konjugat mit einem Fettsäurerest, der an den 3-O-glcA-Rest angeschlossen ist, wird durch Differentialextraktion, Ausfällen und/oder Chromatographie abgetrennt. Das isolierte Konjugat wird in Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet.
Terpenoid-Desacylsaponinkonjugat
Terpene haben strukturelle Merkmale, die den Acyloilacylgruppen von Quillaja-Saponinen ähneln. Daher sind Terpene und Verbindungen, die von Terpenen (Terpenoiden) abgeleitet sind, geeignete lipophile Moleküle zur Konjugierung an den 3-O-gIcA-Rest von Desacylsaponinen. Nützliche Terpenoide schließen eine funktionelle Gruppe ein, die zur Reaktion entweder mit dem Desacylsaponin oder einem bifunktionellen Linker fähig ist. Typische funktionelle Gruppen mit dieser Eigenschaft, die in Terpenoiden gefunden worden sind, schließen Alkohol-, Aldehyd- und Ketonfunktionsgruppen ein. Retinal, ein Vitamin A-Aldehyd, das eine wichtige Rolle bei der Immunität spielt, ist ein Beispiel für eine solche Verbindung. Ein einzelnes Diaminmolekül wird an eines von Retinal gekoppelt und ergibt ein Retinal mit einer freien Aminogruppe. Dieses Produkt wird dem desacylierten Saponin mittels Carbodiimidverfahren hinzugefügt.
i) Bildung des Retinaldiaminprodukts
Zu einer methanolischen Lösung, die Retinal und einen 10-fachen Überschuss an Äthylendiamin enthält, wird in Methanol aufgelöstes Natriumcyanoborhydrid zugegeben. Die Reaktionszeit beträgt etwa 8 Stunden, um die reversiblen Schiff'schen-Basen auf eine stabile Alkylaminbindung zu reduzieren. Der pH-Wert wird nach Bedarf mittels einer organischen Säure wie Essigsäure oder Trifluoressigsäure eingestellt. Das Retianldiaminprodukt wird durch selektive Lösungsmittelextraktion, Ausfällen und/oder Kristallisation gewonnen.
ii) Addition des Retinaldiaminprodukts an Desacyl-Snponinen:
Das Carboxyl des 3-O-glcA-Rests der Desacylsaponine wird durch das oben beschriebene Carbodiimidverfahren aktiviert. Die in DMF, Dioxan oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel durchgeführte Reaktion hat für jedes Mol Desacylsaponin 1 Mol DCC und 1,5 bis 2,0 Mol NHS. Nach 4-6-stündiger Reaktion in der Dunkelheit bei 0 bis 4° C wird der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff durch Filtrierung entfernt. Das Filtrat wird DMF oder Dioxan zugegeben, das Retinaldiaminprodukt in einer äquimolaren Menge in Bezug auf die Desacylsaponine enthält. Die Reaktionszeit für die Mischung beträgt etwa 8 Stunden bei 25° C. Das Produkt, ein Desacylsaponin, das einen Retinalrest enthält, der zum 3-O-glcA-Rest addiert wird, wird durch Lösungsmittelextraktion, Ausfällen und/oder Chromatographie abgetrennt. Das isolierte Neo-Saponin wird in Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet.
Aliphatische AminDesacylsaponinkonjugate
Aliphatische Gruppen eines Amins lassen sich zu Quillaja-Desacylsaponine durch Kopplung der Aminogruppe an das -COOH des 3-O-glcA-Rests unter Bildung einer Amidbindung addieren. Das Carboxyl des 3-O-glcA-Rests der Desacylsaponine wird durch das oben beschriebene Carbodiimidverfahren aktiviert. Die in DMF, Dioxan oder einem anderem Lösungsmittel durchgeführte Reaktion hat für jedes Mol Desacylsaponin etwa ein Mol DCC und 1,5 bis 2,0 Mol NHS. Diese Mischung reagiert 4-6 Stunden in der Dunkelheit bei 0 bis 4° C und der ausgefällte Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtrierung entfernt. Das Filtrat wird einer DMF- oder Dioxanlösung zugegeben, die aliphatisches Amin in einer äquimolaren Menge in Bezug auf die Desacylsaponine enthält, und ungefähr 8 Stunden bei 25° C reagieren gelassen. Das Produkt, ein zu einer aliphatischen Kette über den 3-O-glcA-Rest des Desacylsaponins konjugiertes Desacylsaponin, wird durch Differenzialextraktion, Ausfällen und/oder Chromatographie abgetrennt. Das isolierte Konjugat wird in Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet.
Glycosylfettsäure: Desacylsaponin-Konjugat
Eine der Acyloilacy-Komponenten von Duillaja-Saponinen wird mit einem Disaccharid verbunden, um die Struktur (5-O-α-L-Rhamnopyranosyl-(1-2)-α-L-arabinfuranosyl -3,5-dihydroxy-6- methyl-octanoyl]-3,5-dihydroxy-6-methyl-octanoyl] zu bilden. Diese Struktur wird durch eine Esterbindung an die C3-Hydroxylgruppe des Fucopyranosylrests gebunden (1). Damit ist eine andere chemische Modifikation ein Konjugat, bei dem ein glycosyliertes Lipophil an den 3-O-glcA Rest von Desacylsaponinen angefügt ist.
i. Herstellung von glycosylierter Fettsäure:
Eine Fettsäure, die eine Alkoholgruppe, z. B. die ungesättigte Ricinolsäure enthält, wird in trockenem Aceton aufgelöst und mit in Aceton aufgelöstem Tosylchlorid gemischt. Unter Rühren der Reaktionsmischung wird Pyridin oder Triethylamin hinzugefügt, um das freigesetzte HCl zu neutralisieren. Das Tosylchlorid wandelt die Hydroxylgruppe in ein aktives Sulfonat um. Das Sulfonat wird von den anderen Reaktanten durch Extraktion oder ein anderes adäquates Verfahren getrennt. Das aktive Sulfonat wird mit Glucosamin in DMF oder einem anderem geeigneten Lösungsmittel bei pH-Wert 9,5 gemischt. Sulfonate sind gute Restgruppen, die nach Reaktion mit der Aminogruppe des Glucosamins stabile Verbindungen zwischen dem Amin und dem ursprünglich -OH-Gruppe tragenden Kohlenstoff. Andere im Fachgebiet bekannte gute Restgruppen können durch Sulfonate ersetzt werden. Das Glucosamin-Ricinolsäure-Produkt wird durch Extraktion, Ausfällen oder andere Verfahren gewonnen. Dieses Produkt wird durch das Carbodiimidverfahren aktiviert und mit einem Diamin auf eine äquivalent zur oben für die Bildung von Fettsäurediaminprodukts beschriebenen Weise zur Reaktion gebracht.
ii) Addition von Glucosamin-Ricinolsäureprodukt an Desacylsaponinen:
Das Glucosamin-Ricinolsäurekonjugat, das eine freie Aminogruppe trägt, die durch Reaktion mit einem Diamin mit Hilfe des Carbodiimidverfahrens eingeführt wird, wird mit dem Desacylsaponin erneut mit Hilfe der Carbodiimidreaktion oder dem gemischten Anhydridverfahren – beide Verfahren sind oben für die Addition von Fettsäurediaminprodukt zu Desacylsaponinen beschrieben – zur Reaktion gebracht. Das resultierende Konjugat wird durch Extraktion, Ausfällen und/oder Chromatographie gewonnen. Das Konjugat wird in Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet. Dieses Konjugat besteht aus kovalent an den 3-O-glcA-Rest des Desacylsaponin gebundener Glucosamin-Ricinolsäure.
Synthese von Quillajasaponin-Analogprodukten mit hydrophober/hydrophiler Seitenkette
Eine Seitenkette mit amphipathischen Merkmalen, d.h. asymmetrischer Verteilung hydrophiler und hydrophober Gruppen, erleichtert (a) die Bildung von Micellen sowie eine Verbindung mit Antigenen und (b) die Zugänglichkeit des Triterpenaldehyds zu zellulären Rezeptoren. Es ist auch möglich, dass die Gegenwart einer negativ geladenen Carboxylgruppe in solch einer Seitenkette zum Abstoßen der Triterpengruppe beitragen kann und diesen dadurch einen größeren Grad an Rotationsfreiheit erlaubt. Dieser letzte Faktor würde die Zugänglichkeit zellulärer Rezeptoren zur iminbildenden Carbonylgruppe steigern.
Synthese eines Saponin-Analogprodukts mit einem geladenen hydrophob-hydrophilen Seitenarm
i. Reaktion von N-Octyl-monoxyethylen mit Epichlorhydrin:
Zu 0,05 Mol (9,9 ml) N-Octyl-monooxyethylen, aufgelöst in 50 ml Dimethylformamid (DMF) wird unter Rühren 1 Äquivalent (0,05 Mol) mit Pentan gewaschenes NaH zugegeben, um ein Alkoxid zu bilden. Unter Rühren wird die Alkoxidlösung zu 35 ml DMF plus 0,2 Mol (15,6 ml) Epichlorhydrin zugegeben. Die Reaktion erfolgt bei < 60° C, gefolgt von einer Reaktion durch TLC. Die Reaktion wird durch Zugabe von 250 ml Wasser beendet. Die wässrige Lösung wird 3-mal mit 90 ml Methylenchlorid extrahiert, jedes Mal, um das aktivierte N-Octyl-monooxyethylen zu partitionieren. Die zusammengeführte organische Lösungsmittelphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer entfernt. Der sirupartige Rückstand ist das aktivierte Produkt (11). Die Reinheit ist durch TLC zu prüfen; erforderlichenfalls durch Chromatographie auf Silicagel reinigen (siehe Schema 4).
ii) Addition von 2-Amino-3-mercaptopropionsäure (Cystein) an n-Octyl-monooxyethylen:
Eine frische Lösung von epoxyliertem n-Octyl-monooxyethylen durch Auflösen des sirupartigen Rückstands (11) (< 0,05 Mol) in 30 ml 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,8-8,4, in 50% DMF bereiten. (11) wird in kleinen Aliquoten und unter Rühren zu 0,10 mol(12,10 gm) frisch in 60 ml des 0,2 M Kaliumphosphatpuffers, pH 7,8-8,4, aufgelöstem L-Zystein in 50% DMF hinzugefügt. Erforderlichenfalls wird der pH-Wert der Cysteinlösung entweder mit 1 M KOH oder mit 1 M Phosphorsäure auf pH 7,8-8,4 eingestellt. Über Nacht bei 35-40° C unter mäßigem Rühren unter Stickstoffatmosphäre reagieren lassen. Durch Rotationsverdampfung konzentrieren und das n-Octyl-monooxyethylen-Zysteinylderivat (12) (Mol.-Gewicht 351,34) mit Toluol oder, falls löslich, mit Chloroform extrahieren. Überschüssiges Cystein und die anderen Salze sollten in der wässrigen Phase bleiben oder im organischen Lösungsmittel ausgefällt werden. Die organische Phase filtrieren und den organischen Auszug zweimal mit Wasser extrahieren, um alles Kaliumphosphat zu entfernen. Die organische Phase über Magnesiumsulfat trocknen. Falls überschüssiges Cystein zu entfernen oder das Lösungsmittel zu ändern ist (z. B. von Toluol zu Chloroform) ist Chromatographie auf Silicagel zu verwenden. Das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernen. Das Produkt (12) sollte ein sirupartiger Rückstand sein. Seine Reinheit ist durch TLC auf Silicagel oder HPLC gegen (11) und Cystein zu prüfen (siehe Schema 4).
iii) Aktivierung der Quillaja-Saponiglucuronsäure:
Zu 0,4 g (240 Mol) in 10 ml DMF/Pyridin (60:40 Vol./Vol.) aufgelösten desacylierten Quillajasaponinen werden 480 μMol (100 mg) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 480 μmol (56 mg) N-Hydroxysuccinimid (NHS) zugegeben. Das Gemisch unter Rühren über Nacht bei Raumtemperatur reagieren lassen (vor Luftfeuchtigkeit schützen). Zusätzlich 50 mg DCC und 28 mg NHS hinzugeben und eine weiter Stunde reagieren lassen. Die Reaktion eine Stunde lang auf ∼0-4° C abkühlen und durch ein sehr feines Glasfilter filtrieren, um das unlösliche DCC-Nebenprodukt Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Pyridine in einem Rotationsverdampfer entfernen und 40 ml kaltes Ethylacetat (EtOAc) hinzufügen, um das DS-Saponin:NHS-Derivat (13) auszufällen. Nach 1-2 Stunden in einem Gefrierapparat das ausgefällte Derivat durch Filtration auf feinem Glasfilterpapier sammeln und das Produkt auf dem Filterpapier mit zusätzlichem EtOAc waschen.
Das Produkt (13) kann unter Vakuum auf einem starkem Trocknungsmittel gelagert werden (siehe Schema 5).
iv) Verbinden des aktivierten DS-Saponins mit der hydrophob/hydrophilen Seitenkette:
Das DS-Saponin:NHS-Derivat (13) (angenommen 100% Ausbeute ∼240 μMol) in ∼5 ml DMF/Pyridin (60:40 Vol./Vol.) auflösen. Der Lösung von (13) 0,20 g (∼0,5 Mol) des in 5 ml Pyridin aufgelösten Derivats (12) hinzufügen, um einen ∼2-fachen molaren Überschuss über (13) zu erhalten. Vor Feuchtigkeit schützen und 8-12 Stunden bei Raumtemperatur reagieren lassen, um ein Saponin-Analogprodukt mit einer n-Octyl-monooxyethylencysteinyl-Seitenkette (14) zu erhalten. Den Reaktionsfortschritt durch TLC unter Verwendung von n-Butanol-Pyridin-Wasser im Verhältnis 3:2:1 als Lösungsmittel und Jod oder Verkohlung als Nachweis. In einem Rotationsverdampfer das Pyridin aus der Reaktionsmischung entfernen, ∼30 ml kaltes EtOAc hinzufügen und 3-5 Stunden in einem Gefrierapparat einlagern um (14) auszufällen. Den Niederschlag (14) durch Filtration auf feinem Filterglaspapier sammeln und mit EtOAc waschen, um den Rückstand (12) zu entfernen, der in EtOAc löslich sein sollte. Erforderlichenfalls (14) durch Chromatography auf Kieselerdegel reinigen. Das Saponin-Analogprodukt in Wasser auflösen und gefriertrocknen. (14) durch HPLC analysieren und durch Massenspektrometrie bestätigen (siehe Schema 6).
Synthese von Saponin-Analogprodukt mit einem ungeladenen hydrophob-hydrophilen Seitenarm
Die Synthese eines Quillaja-Saponinanalogprodukt mit einem ungeladen Seitenarm hat die Schritte (1) und (3) gemeinsam mit der oben beschriebenen Synthese. Schritt (2) und (4) sind ziemlich gleichartig und werden hier beschrieben.
Addition von Äthylendiamin an n-Octyl-monooyethylen
Den sirupartigen Rückstand (11, gemäß Schritt (i) oben hergestellt) (> 0,05 Mol) in 30 ml Acetonitril-0,2 N-Kaliumkarbonat auflösen. (11) in kleinen Aliquoten und unter Rühren zu 0,40 Mol (26,7 ml) in 60 ml 0,2 M-Piperazin-0.2.N-Kaliumkarbonat aufgelöstem Äthylenediamin hinzufügen. Bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren reagieren lassen. Mit HCl neutralisieren, durch Rotationsverdampfung konzentrieren und das N-Octyl-monooxyethylen-Äthylendiaminderivat (15) (Mol.-Gew. 332,30) vorzugsweise in Chloroform, ansonsten in Toluol auflösen. (Das Äthylendiamin-HC 1 kann in organischen Lösungsmitteln unlöslich sein, besonders, wenn es hydriert ist. Sollte das Äthylendiamin-HC 1 in organischen Lösungsmitteln unlöslich sein, durch ein feines Glasfilter filtrieren und die organische Phase mit Wasser extrahieren, um das restliche Äthylendiamin zu entfernen. Die organische Phase durch Zugabe von trockenem Magnesiumsulfat trocknen. Falls das Äthylendiamin sich nicht durch Lösungsmittelextraktion entfernen lässt oder falls das Lösungsmittel geändert werden muss (z. B. von Toluol zu Chloroform), ist Chromatographie auf Silicagel zu verwenden. Das Lösungsmittel in einem Rotationsverdampfer entfernen. Das Produkt sollte ein sirupartiger Rückstand sein. Seine Reinheit durch TLC oder HPLC gegen (11) und Äthylendiamin überprüfen (siehe Schema 6).
Verbinden des aktivierten DS-Saponins mit der hydrophoben/hydrophilen Seitenkette
Das DS-Saponin:NHS-Derivat (13, entsprechend Schritt (iii) oben hergestellt) (angenommen ist 100% Ausbeute ∼ 240 μmol) in ∼ 5 ml DMF/Pyridin (60:40 Vol./Vol.) lösen. Zu (13) 0,33 g (1 mMol) in 5 ml Pyridin aufgelöstem Derivat (15) hinzugeben, um ein ∼ 4-fachen molaren Überschuss gegenüber (13) zu erhalten. 8-12 Stunden bei Raumtemperatur (vor Feuchtigkeit schützen) reagieren lassen, um das Saponin-Analogprodukt mit einer N-Octyl-monooxyethylen-Äethylendiaminseitenkette (16) zu erhalten. Den Fortschritt der Reaktion durch TLC oder HPLC prüfen. In einem Rotationsevaporator das Pyridine aus der Reaktionsmischung entfernen, ∼30 ml kaltes EtOAc hinzufügen und 3-5 Stunden in einem Gefrierapparat einlagern, um (16) auszufällen. Den Niederschlag (16) durch Filtrierung auf feinem Glasfilterpapier auffangen und mit EtOAc waschen, um restliches (15) zu entfernen, das in EtOAc löslich sein sollte. Erforderlichenfalls (16) durch Chromatographie auf Silicagel reinigen. Das Saponin-Analogprodukt in Wasser lösen und gefriertrocknen. (16) durch HPLC analysieren und durch Massenspektrometrie bestätigen (siehe Schema 7).
Allgemeines
Toluol lässt sich durch Rotationsverdampfung unter reduziertem Druck (bp_760, 110,6° C) entfernen. DMF lässt sich durch Rotationsverdampfung unter reduziertem Druck (bp₃₉ 76° C, bp₃₇ 25° C) entfernen.
Die N-Octyl-monooxyethylenderivate von 2,3-Diaminopropionsäure und Äthylendiamin sollten in verschiedenen organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, Ketonen und aromatischen Lösungsmittel löslich, aber in Petroläther unlöslich sein. Während der Extraktion organischer Phasen mit Wasser können sich aufgrund der Detergenseigenschaften der N- Octyl-monoethylenderivate Emulsionen bilden. Diese Emulsionen lassen sich entweder durch Erwärmen der Suspension oder Zentrifugieren aufbrechen.
Saponin-Analogprodukte sollten in EtOAc, Alkoholen wie Äthanol und Isopropanol und Aceton unlöslich sein.
Addition von Lipophilgruppen an verwandte Triterpensaponine
Wie bereits aufgezeigt, haben die nicht-acylierten Triterpenoidsaponine von Gypsophila und Saponaria eine signifikante Adjuvanswirkung auf die sekundäre Immunreaktion. Jedoch sind im Unterschied zu Quillaja-Saponinen ihre Wirkungen auf die primäre Immunreaktion geringer. Es wird daran gedacht, dass Addition einer Fettsäurekomponente an diese Saponine deren Adjuvanswirkung während der frühen primären Immunreaktion verbessern wird. Es gibt jedoch starke Indizienbeweise für die vorgeschlagene Rolle der Fettsäuregruppen bei der einzigartigen Adjuvanswirkung von Quillaja-Saponinen durch QS-7, eines dieser Saponine (Kensil, C. et al., J. Immunol. 146:431 (1991); Kensil et al., U.S. Patent No. 5,057,540 (1991)). Dieses Saponin, das sehr hydrophil ist, hat (a) eine Retentionszeit vergleichbar mit der von desacylierten Ouillaja-Saponinen und (b) fehlt eine Arabinose, die der mit der Acyloilacyl-Komponente der Quillaja-Saponinen verbundene Glycosylrest ist. Diese Merkmale lassen stark vermuten, dass QS-7 nicht-acyliert ist. Dieses Saponin hat auch verschiedene Wirkungen von acylierten Quillaja-Saponinen: QS-7 ist ungiftig, nichthämolytisch, ähnelt im Verhalten den desacylierten Quillaja-Saponinen.
Während QS-7 die humorale Immunität verbessert, unterscheiden sich seine Wirkungen auf Antikörperisotypprofil von den bei QS-21 beobachteten. Diese Eigenschaften lassen vermuten, dass die Acyloil-Komponente für die einzigartige Adjuvanswirkung ebenso wie auch für die bei den anderen Quillaja-Saponinen beobachtete Toxizität verantwortlich ist. Somit wird erwartet, dass Addition einer geeigneten lipophilen Komponente an nonacylierte Adjuvans-Saponine deren Adjuvanswirkungen auf die humorale und zellulär vermittelte Immunität verbessert sowie die bei Quillaja-Saponinen beobachtete Toxizität limitiert. Letzteres ist ein entscheidendes Erfordernis für die erfolgreiche Anwendung dieser Adjuvantia in pädiatrischen Impfstoffen.
Die Adjuvans- und Immunstimulationseigenschaften einiger Saponine haben anscheinend bestimmte strukturelle Erfordernisse, einschließlich (a) ein Triterpenaglycon mit einer Aldehydgruppe, verbundenen mit oder angeschlossen an Position 4; und (b) verzweigte Zuckerketten an Position 3 und/oder 28 des Aglycons. Die Rolle der Triterpengruppe könnte darin bestehen, die Bindung an das Cholesterin in Zellmembranen mit einer anschließenden Beteiligung an der Aldehydgruppe zu erleichtern. Verzweigte Zuckerketten scheinen wichtig für die Stimulierung der humoralen Immunität zu sein, wie der Mangel an Adjuvanswirkung bei durch Periodatoxidation modifizierten Quillaja-Saponinen andeutet.
Es ist postuliert worden, dass die Adjuvanswirkung von Quillaja-Saponinen eine engen Saponin: Antigen-Verbindung erfordern kann und dass ihre Acylgruppen diese Verbindung durch Verbesserung ihrer Hydrophobizität erleichtern. Es ist ebenfalls gezeigt worden, dass eine Erhöhung der Anzahl der Quillaja-Saponinmoleküle, die mit einem an ein Eiweiß konjugiertes Saponin verbunden sind, zu einer verbesserten Adjuvanswirkung führt. Anscheinend werden die Quillaja-Saponinmoleküle durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen ihren Acylkomponenten zusammengehalten, die eine micelleartige Struktur bilden. Vergleiche der Adjuvantizität von Quillajasaponinen mit der vom nicht-acylierten Saponinen von Gypsophila oldhamiana und Saponaria officinalis haben etwas ähnliche Wirkungen gezeigt. Quillajasaponine bewirken jedoch eine viel höhere primäre Immunreaktion (Bomford, R. et al., Vaccine 10:572 (1992)). Dieser Befund lässt vermuten, dass die hydrophoben Acylkomponenten von Quillajasaponinen die spezifischen Adjuvanseigenschaften ihrer Desacylsaponine verbessern.
Ein Vergleich der Strukturen der Saponine von Quillaja, Gypsophila, und Saponaria zeigt mehrere Ähnlichkeiten (1). Alle haben Triterpenaglycone mit einer Aldehydgruppe in Position 23, verzweigte Oligosaccharide, die durch eine Esterbindung an Position 28 angeschlossen sind, und eine 3-O-Glucuronsäure (3-O-glcA), die bei Quillaja und Gypsophila an verzweigte Oligosaccharide angeschlossen ist. Jedoch sind Quillajasaponine die einzigen mit Acyloilacyl-Komponenten. Struktur-/Funktionsuntersuchungen an Quillajasaponinen haben gezeigt, dass die Gegenwart der 23-Aldehydgruppe, die Integrität der Oligosaccharidketten und die 28-O-Acylgruppen für volle Adjuvanswirkung entscheidend sind. Der 3-O-glcA-Rest kann anscheinend ohne Verlust an Adjuvanswirkung modifiziert werden. Tatsächlich ist der 3-O-glcA-Glycosidrest ist verwendet worden, um Quillajasaponine an Antigene zu konjugieren (Kensil, C. et al., Vaccines 92:35 (1992)). Ein Vergleich der Adjuvansaktivitäten für diese Saponine zeigt, dass Quillajasaponine eine signifikant bessere primäre Immunreaktion bewirken, aber dass sie alle starke sekundäre Immunreaktionen bewirken (Tabelle 1). Diese differenzielle Wirkung lässt auf eine größere Rolle der Acyloilacylreste in Quillajasaponinen bei der primären Immunreaktion schließen. Die durch die Desacylsaponine von Quillaja bewirkte signifikant niedrigere primäre Immunreaktion im Vergleich zu der von den acylierten Quillajasaponinen bewirkten primären Immunreaktion unterstützt diese vermutete Rolle.
Tabelle 1
Modifizierungen der Saponine von Gypsophilas und Saponaria lassen sich auf ähnliche Weise ausführen, wie zuvor zu Quillaja-Desacylsaponinen beschrieben worden ist, unter Nutzung des Carboxyls des 3-O-gtcA-Rests als Stelle für die Addition neuer Komponenten an die Saponine. Diese Neo-Saponine mit einer neuen lipophilen Komponente in ihren Strukturen sollten bessere Adjuvanseigenschaften als die ursprünglichen Saponinmoleküle besitzen.
Andere nicht-acylierte Triterpensaponine, wie Squarrosid A, Lucyosid P und desacyliertes Saponin S. jenisseensis haben ebenfalls strukturelle Erfordernisse für Adjuvanswirkung und Immunstimulationseigenschaften. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass das Saponin Squarrosid A (2) immunomodulatorische Wirkung hat, wie bei einem Lymphoproliferativtest in vitro gemessen wurde. Mithin können diese Saponine durch Zusatz von lipophilen Ketten zu ihrem 3-O-Glucuronsäurerest modifiziert werden, um Neo-Saponine mit verbesserten Adjuvanseigenschaften zu erzeugen.
Immunadjuvantia sind Verbindungen, die, wenn sie einer Person verabreicht oder in vitro getestet werden, die Immunreaktion auf ein Antigen in einem Subjekt steigern, dem das Antigen verabreicht wurde, oder bestimmte Aktivitäten von Zellen des Immunsystems verbessern. Einige Antigene sind schwach immunogen, falls allein verabreicht, oder toxisch für ein Subjekt in Konzentrationen, die nützliche Immunreaktionen in einem Subjekt hervorrufen. Ein Immunadjuvans kann die Immunreaktion des Subjekts auf das Antigen verbessern, indem sie das Antigen immunogen stärker macht. Die Adjuvanswirkung kann auch dazu führen, dass eine niedrigere Antigendosis verabreicht werden kann, um eine nützliche Immunreaktion in einem Subjekt zu erreichen.
Immunadjuvantia können das Cytokin Netz durch Hochregulieren der Immunreaktion modifizieren oder "immunomodulieren". Mit dieser Immunomodulation geht auch eine Auswahl einher, welche T-Zelle, Th1 oder Th2, diese Immunreaktion trägt. Th1-Reaktionen rufen komplementbindende Antikörper und Hypersensitivitätsreaktionen mit starker Verzögerungstendenz hervor, die mit IL-2, IL-12 und γ-Interferon verknüpft sind. Die Einleitung der CTL-Reaktion scheint mit einer TH1-Reaktion verbunden zu sein. Th2-Reaktionen werden mit hohen Graden von IgE und den Cytokinen IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10 in Verbindung gebracht. Die Aldehyd enthaltenden Saponine rufen eine starke Th1-Reaktion hervor. Einige ihrer Analoga können jedoch eine Th2-Reaktion herbeiführen.
Die immunogen-induzierende Wirkung von Verbindungen und Mischungen der vorliegende Erfindung lässt sich durch eine Anzahl bekannter Verfahren bestimmen. Die Zunahme von Antikörpertiter gegen ein besonderes Antigen bei Verabreichung einer Komposition der vorliegenden Erfindung kann genutzt werden, um immunogene Wirkung zu messen. (Dalsgaard, K. Acta Veterinia Scandinavica 69:1-40 (1978)). Ein Verfahren erfordert, CD-1 Mäusen intradermal eine Testzusammensetzung zu injizieren, die ein oder mehrere exogene Antigene enthält. Seren wird zwei Wochen später von den Mäusen entnommen und durch ELISA auf Antiimmunogen-Antikörper getestet.
Zusammensetzungen der Erfindung sind nützlich als Impfstoffe, um bei Subjekten aktive Immunität gegen Antigene zu bewirken. Jedes Tier, das im Rahmen der Subjekte die nützlichen Wirkungen der Mischungen der vorliegenden Erfindung erfahren kann, kann behandelt werden. Als Subjekte werden Säugetiere und insbesondere Menschen bevorzugt.
Saponin-lipophile Konjugate der vorliegenden Erfindung können als ein einziges Adjuvans verwendet oder alternativ zusammen mit Nicht-Saponinadjuvantia verabreicht werden. Solche Nicht-Saponinadjuvantia, die mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen Öladjuvantia (zum Beispiel Freund's Complete and Incomplete), Liposome, Mineralsalze ein (zum Beispiel AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂ AlNH(SO₄), Kieselerde, Alaun, Al(OH)₃, Ca₃(PO₄)₂, Kaolin und Kohlenstoff), Polynucleotide (zum Beispiel Poly-IC- und Poly-AU-Säuren), Polymere (zum Beispiel nichtionische Blockpolymere, Polyphosphazene, Cyanoacrylate, Polymerase-(DL-Lactid-co-Glycosid) und Andere und bestimmte natürliche Substanzen (zum Beispiel Lipid A und dessen Derivate, Wachs D von Mycobacteriuna tuberkulosis, sowie in Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis und Mitgliedern der Gattung Brucella gefundene Substanzen. Rinderserumalbumin, Diphtherietoxoid, Wundstarrkrampf toxoid, Edestin, Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke, Pseudomonaltoxin A, Choleragenoid, Choleratoxin, Pertussistoxin. Virusproteine und eukaryotische Proteine, wie Interferone, Interleukine oder Tumornekrosefaktor. Solche Proteine lassen sich von natürlichen oder rekombinanten Quellen nach den Fachleuten bekannten Verfahren gewinnen. Werden sie von rekombinanten Quellen gewonnen, so kann das Nicht-Saponinadjuvans ein Proteinfragment aufweisen, das wenigstens den Immunostimulationsteil des Moleküls aufweist. Andere bekannte immunostimulierende Makromoleküle, die bei der praktischen Nutzung der Erfindung verwendet werden können, beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Polysaccharide, tRNA, nichtmetabolisierbare synthetische Polymere wie Polyvinylamin, Polymethacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, Mischpolycondensate (mit relativ hohem Molekulargewicht) von 4',4-Diaminodiphenylmethan-3,3'-dicarbonsäure und 4-Nitro-2-aminobenzoesäure (siehe Sela, M., Science 166:1365-1374 (1969)) oder Glycolipide, Lipide oder Kohlehydrate.
Die chemisch modifizierten Saponine der vorliegenden Erfindung zeigen Adjuvanswirkungen, wenn sie über ein breites Spektrum von Dosierungen verabreicht werden und ein breites Spektrum von Verhältnissen zu einem oder mehreren verabreichten bestimmten Antigenen.
Die chemisch modifizierten Saponine lassen sich auch individuell verabreichen oder können anderen substantiell reinen Adjuvantia beigemengt werden, um eine Verbesserung der Immunreaktion auf ein Antigen zu erreichen. Die chemisch modifizierten Saponine können ein substantiell reines modifiziertes Saponin sein oder die Form einer Mischung aus chemisch modifizierten Saponinen haben.
Das Saponin-lipophiles Konjugat der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um die Immunreaktion auf ein oder mehrere Antigene zu verbessern. Typische Antigene, die für die Immunreaktion auslösenden Mischungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Antigene ein, die von einem der folgenden Krankheitserreger abgeleitet sind: Viren, wie Influenza, Katzenleukämievirus, Katzenimmunschwächevirus, HIV1, HIV-2, Tollwut; Masern, Hepatitis B oder Maul- und Klauenseuche; Bakterien, wie Anthrax, Diphtherie, Lyme-Krankheit oder Tuberkulose; oder Protozoen wie Babeosis bovis oder Plasmodium. Antigen können Proteine, Peptides, Polysaccharide oder Mischungen davon sein. Die Proteine und Peptide können von einer natürlichen Quelle gereinigt, mittels einer Festkörperphasensynthese synthetisch hergestellt oder durch rekombinante Genetik gewonnen werden. Das Antigen kann ein Proteinfragment aufweisen, das eine oder mehrere immunogene Regionen des Moleküls aufweist.
Die Saponinkonjugate der vorliegenden Erfindung lassen sich nutzen, um die Immunreaktion gegen durch die Verwendung von DNA-Impfstoffen produzierte Antigene zu verbessern. Die DNA-Sequenzen in diesen Impfstoffen, die für das Antigen verschlüsseln, können entweder "nackt" oder in einem Liefersystem wie Liposomen enthalten sein. Typische Impfstoffe, die diesen Ansatz verwenden, sind Virusimpfstoffe gegen Influenza, Herpes, Cytomegalovirus, HIV-1, HTLV-1, FIV, Krebsimpfstoffe und Parasitenimpfstoffe. Das Saponinkonjugat lässt sich zusammen mit der DNA oder zu einem früheren und/oder späteren Zeitpunkt als zur DNA-Verabreichung verabreichen.
Krebszellen haben oft unverwechselbare Antigene auf ihren Oberflächen, wie verkürzten epidermalen Wachstumsfaktor, folatbindendes Protein, Epithelmuzine, Melanoferrin, karzinoembryonales Antigen, prostataspezifisches Membranantigen, HER2-neu, die Kandidaten für den Einsatz in therapeutischen Krebsimpfstoffen sind. Weil Tumorantigene normale Bestandteile des Körpers oder mit normalen Körperbestandteilen verwandt sind, schafft es das Immunsystem oft nicht, eine wirksame Immunreaktion gegen solche Antigene zu entwickeln, um die Tumorzellen zu zerstören. Um eine solche Reaktion zu erreichen, lassen sich Quillajasaponin und Saponin-lipophile Konjugate nutzen. Aldehyd enthaltende Triterpenoidsaponinadjuvantia wirken durch Reagieren mit Aminogruppen des auf bestimmten T-Zellen präsenten Rezeptorproteins/der Rezeptorproteine und Bildung von Schiff'schen Basen. Im Ergebnis dieser Reaktion wird exogenen Proteinen erlaubt, auf den Weg zur Verarbeitung endogener Antigene zu gelangen, der zur Produktion von cytolytischen oder cytotoxischen T-Zellen (CTL) führt. Diese einzigartige Adjuvanswirkung bewirkt die Produktion antigenspezifischer CTL, die solche Tumorzellen suchen und zerstören und die auf ihrer Oberfläche das/die für die Immunisierung genutzte(n) Tumorantigen/Tumorantigene tragen. Die Saponinkonjugate der vorliegenden Erfindungsdose lassen sich auch mit Kohlehydrattumorantigenen, wie Gangliosiden, dem Thomsen-Friedenreich-(T)-Antigen und anderen verwenden.
Die Saponinkonjugate der vorliegenden Erfindung können auch allein verabreicht werden, um das Immunsystem für Behandlung von chronischen Infektionskrankheiten, besonders bei immungeschwächten Patienten, zu stärken. Beispiele für Infektionskrankheiten, bei denen Konjugate der vorliegenden Erfindung zur therapeutischen oder prophylaktischen Behandlung eingesetzt werden können, sind im U.S.-Patent Nr. 5,508,310 beschrieben. Stärkung des Immunsystems durch Saponinkonjugate kann auch als vorbeugende Maßnahme nützlich sein, um die Risiken einer nosokomialen und/oder postoperativen Infektion einzuschränken.
Die Verabreichung der im Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Verbindungen kann parenteral, intravenös, intramuskulär, subcutan, intranasal oder auf jegliche sonstige geeignete Weise erfolgen. Die verabreichte Dosis kann vom Alter, Gewicht, gegebenenfalls der Art der gleichzeitig erfolgenden Behandlung und der Art des verabreichten Antigens abhängig gemacht werden. Generell können die Saponin-/Antigenkonjugate über ein breites Spektrum von Dosierungen und ein breites Spektrum von Verhältnissen zum verabreichten Antigen verabreicht werden. Der Anfangsdosis kann nach einem Zeitraum von etwa vier Wochen eine Auffrischungs-Dosis folgen, um die immunogene Reaktion zu verbessern. Es können auch weitere Auffrischungs-Dosen verabreicht werden.
Das Saponin-lipophiles Konjugat der vorliegenden Erfindung lässt sich in solchen Formen wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Emulsionen, Suspensionen oder Elixieren für die orale Verabreichung oder sterilen flüssigen Formen wie Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen verwenden. Jeder inaktive Träger wird vorzugsweise verwendet, wie Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung oder jeglicher Träger, in dem die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen geeignete Löslichkeitseigenschaften für den Gebrauch in den Verfahren für die vorliegende Erfindung haben.
Die lipophilen Saponinkonjugate der vorliegenden Erfindung können gemeinschaftlich mit Liposomen eingesetzt werden, wobei das Saponin in einer oder beiden der molekularen Doppelschicht des Liposoms sein kann und lose mit Lipidsubstanz in einem Liposompräparat verbunden (wobei die Konjugate nicht innerhalb einer molekularen Doppelschicht, sondern anderweitig mit Lipiden verbunden sind), in einigen Fällen innerhalb der molekularen Doppelschichten der Liposome eingeschlossen. Siehe zum Beispiel U.S.-Patent Nr. 4,235,87,7 Fullerton.
Die Erfindung sieht auch eine Zusammenstellung für die Immunisierung eines Individuums vor, das einen in Abteilungen gegliederten Träger aufweist, um eng eingeschlossen darin einen oder mehrere Behältnismittel aufzunehmen, wobei ein erster Behälter ein Saponin-lipophiles Konjugat der Erfindung enthält. Die Zusammenstellung kann auch mindestens ein anderes Behältnismittel einschließen, das ein Saponinadjuvans oder ein anderes wie hierin beschriebenes Adjuvans enthält.
Addition der Biotinylgruppe an verwandte Triterpensaponine
Wie bereits aufgezeigt, sind biotinylierte Saponinanaloga nützliche Reagenzien für den Nachweis und die Bestimmung, welche Zellen des Immunsystems Rezeptoren haben, die in der Lage sind, mit iminbildenden Saponinen zu reagieren. Diese Saponine (wie die von Quillaja, Gypsophila und Saponaria) ersetzen den kostimulierenden Ligand B7.1, der auf APCs ausgedrückt ist und mit dem CD28-Rezeptor auf T-Zellen reagiert. Auf Costimulation mit B7.1 oder einem iminbildenden Saponinadjuvans werden T-Zellen aktiviert, um antigenspezifische CTL zu bilden. Die Verwendung dieser markierten Saponinanalogprodukte erlaubt die Bestimmung des Fortschritts des Immunreaktionprozesses durch qualitative oder quantitative Messung der Gegenwart von T-Zellen, die Zelloberflächenrezeptoren haben, die in der Lage sind, desacylierte oder nicht-acylierte Saponine zu binden.
Die folgenden Beispiele illustrieren, jedoch ohne einzuschränken, das Verfahren und die Mischungen der vorliegenden Erfindung. Andere geeignete Modifikationen und Adaptationen der Vielfalt von Bedingungen und Parametern, die unter normalen Umständen auftreten und die für Fachleute offensichtlich sind, sind innerhalb des Geists und Umfangs der Erfindung.
Beispiel 1
Herstellung von Quillaja-Desacylsaponinen (4)
Die erforderlichen Triterpen-Saponin-Ausgangsstoffe können von handelsüblichen Präparaten von Quillaja saponaria Molina-Saponinen erhalten werden, die acyliert sind. Beispielsweise können zwei Arten handelsüblicher Präparate verwendet werden:

a. Quillaja-Saponine (technische Güte, von Fisher Scientific bezogen) enthalten ca. 25% (Gew./Gew.) Saponine und 75% (Gew./Gew.) wasserlöslicher Verunreinigungen, d.h. Oligosaccharide, Tannine usw.; und
b. Dialysierte Quillaja-Saponine oder Quil A (bezogen von Accurate Chemicals oder Sigma Chemicals Co.) sind zu > 80% (Gew./Gew.) Saponine mit in Methanol unlöslicher Verunreinigung/bzw. unlöslichen Verunreinigungen.

Quillaja-Saponine technischer Güte können weiter wie folgt gereinigt werden:

A. Das technische Saponinpräparat (1) wird in Wasser in einer Konzentration von 20-25 % (Gew./Vol.) gelöst. Der pH-Wert wird mit 1N Essigsäure auf etwa 4 eingestellt, um eine trübe Lösung zu erhalten. Die trübe Lösung wird in einen Standard-Dialysebeutel gegeben und 24 Stunden lang gegen 3-4 Wechsel von 25-50 Volumenteilen des Wassers dialysiert. Während der Dialyse wird das Wasser aller 4-8 Stunden gewechselt. Das Dialysat wird dann gefriergetrocknet, so dass ein weißfarbenes Präparat entsteht. Nach der Dialyse enthält das Saponinpräparat (2) einen verunreinigenden Stoff (möglicherweise Pigmente oder Tannine), der in Methanol unlöslich ist. Ausbeutee:± 25% des Anfangsgewichts des technischen Saponinpräparats, was etwa 95% (Gew./Gew.) der Originalsaponine darstellt.
B. Ein Gramm des trockenen Saponinpräparats (2) wird mit 50 ml Methanol 20-25 Minuten lang bei 60° C extrahiert. Die Suspension wird filtriert und das ungelöste Material mit 30 ml Methanol 20-25 Minuten bei 60° C erneut extrahiert. Die klaren Methanol-Filtrate werden zusammengefasst und mit einem Rotorverdampfer eingetrocknet. Das methanolextrahierte Saponinpräparat (3) ist frei von methanolunlöslichen Verunreinigungen. Die Ausbeuten betragen bis zu 70% des Präparates (2).

Die Acylgruppen der Quillaja-Saponine werden durch milde alkalische Hydrolyse entfernt, um vier deutliche voneinander verschiedene Desacylsaponine (zwei davon sind Isomere) plus 3,5- Dihydroxy-6-methyloctanoidsäure und 3,5-Dihydroxy-6-methyloctanoidsäure 5-O-α-L-Rhamnopyranosyl-(1→2)-α-arabinofuranosid. Beispielsweise sind die folgenden alkalischen Hydrolysemethoden bei der Herstellung dieser desacylierten Saponine nützlich (4).

(i) Methanolextrahierte Saponine (3) (60 mg/ml) werden 1 Stunde lang mit 6% Na₂CO₃ in 50% Methanol gekocht, und das Reaktionsgemisch wird mit Dowex 50W-X8 H' (einem synthetischen, stark sauren Kationenaustauscher, einem sulfonierten Polystyrol-divinylbenzolharz) und anschließend filtriert. Das Filtrat wird mit einem Rotorverdampfer konzentriert und nach Ethylacetat und Wasser getrennt. Die wässrige Phase enthält den größten Teil der Desacylsaponine, während die organische EtOAc-Phase die meisten der Octanoidsäuren enthalten wird. Das EtOAc wird von der wässrigen Phase durch Hinzufügen von Stickstoffgas oder durch Einsatz eines Rotorverdampfers getrennt. Die wässrige Desacylsaponin-Lösung (4) wird gefriergetrocknet.
(ii) Methanolextrahierte Saponine (3. 0,1 g) werden in 3 ml 90%-igem n-Propanol erneut suspendiert. Diese Suspension/Lösung wird durch Hinzufügen von 5N NaOH-Vorratslösung auf 0.5N NaOH eingestellt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (20-25° C) gemischt. Die Suspension wird 5 Minuten bei 50 × g zentrifügiert, um einen leicht gefärbten Flüssigkeitsüberstand, der verworfen wird, sowie einen bräunlichen, körnigen Niederschlag zu erhalten. Der Niederschlag wird dreimal gewaschen, indem er mit 3 ml 90%igem n-Propanol erneut suspendiert und bei 50 × g zentrifugiert wird. Das entstehende Desacylsaponin-Pellet (4) wird in 3 ml Wasser gelöst und gefriergetrocknet.

Alternativ können die mit Methanol extrahierten Saponine (3) in Wasser gelöst werden, um eine Lösung zu bilden, die 20 mg/ml Saponine enthält und die Lösung wird auf eine endgültige Konzentration von 0,15M Triethylamin, pH-Wert 12, eingestellt. Nach einer Stunde bei 40-50° C wird die alkalische Hydrolyse durch Hinzufügen von Essigsäure beendet, bis ein pH-Wert von 7,0 erreicht ist. Das Reaktionsgemisch wird mit Ethylacetat extrahiert, um Triethylamine und einige Hydrolyseprodukte zu entfernen. Die Desacylsaponine (4) sollten in der Wasserphase verbleiben. Ein anderes Verfahren ist das Auflösen (3) (10mg/ml) in konzentriertem Ammoniak, wobei die Lösung 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird und das Ammoniak unter einem Stickstoffstrom entfernt wird. Die wässrige Phase wird mit 80 ml Ethylacetat extrahiert und die organische Phase verworfen. Die wässrige Phase, welche die Desacylsaponine enthält, wird gefrostet und gefriergetrocknet.
Beispiel 2
Reinigung der Saponine von Gypsophyla sp.
Eine 5%-ige Lösung von Roh-Gypsophylasaponin in 10 mM Essigsäure wird in einem Dialysebeutel dialysiert, der ein Molekulargewichttrennschärfe von ∼ 2.000 Dalton gegen 20 Volumenteile von 10 mM Essigsäure bei 4° C hat. Die Essigsäurelösung wird zweimal alle 4 Stunden gewechselt. (Dieser Schritt entfernt Polysaccharide und einige Verunreinigungen von niedrigem Molekulargewicht.) Die dialysierte Lösung wird in einem Rotorverdampfer konzentriert und gefriergetrocknet. Ein Gramm des dialysierten Gypsophylasaponins wird zweimal jeweils 24 Stunden mit 50 ml reinem Methanol (MeOH) bei Raumtemperatur extrahiert und filtriert. Falls es ungelösten Stoff gibt, ist einmal zusätzlich mit 50 ml MeOH: Wasser (40/60) bei Raumtemperatur zu extrahieren und anschließend zu filtrieren, um unlösliche Bestandteile zu entfernen. Die Filtrate werden vermischt und bei 40° C in einem Rotorverdampfer konzentriert, um einen sirupartigen Saponinextrakt (1) zu erhalten. Der Extrakt wird in Wasser gelöst, um eine 5%ige Saponinlösung zu erhalten, und diese Lösung wird anschließend zweimal mit 0,5 Volumenteilen Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wird einer Chromatographie auf Fractogel TSK HW-40 F unterzogen, wobei mit einem Gradienten von 0 bis 50 % (Vol./Vol.) MeOH in Wasser mit 0,05 M Na₂CO₃ eluiert wird. Unter Verwendung von n-Butanol:Essigsäure:Wasser (4/1/5) als Lösungsmittel werden die Proben von TLC auf Silicagel analysiert, und das Saponin wird durch die Liebermann-Burkhard-Reaktion sichtbar gemacht. Alternativ kann das Saponin aus (1) durch Hinzufügen von 5 Volumenteilen Ethylacetat ausgefällt erreicht und durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung von Chloroform:MeOH:Wasser (64:40:8) als Lösungsmittel fraktioniert werden. Analoga von Gypsophyla-Saponinen können mit Hilfe der für desacylierte Quillaja-Saponine entwickelten Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 3
Addition aliphatischer Amine über die Carboxyl-Gruppe der Glucuronsäure
Ein C₆-C₂₀ aliphatisches Amin, vorzugsweise ein C₉-oder C₁₂ aliphatisches Amin, kann dem Carboxyl des Glucuronsäurerests der Desacylsaponine (4) hinzugefügt werden, um konjugierte Desacylsaponine unter Verwendung des Carbodiimidverfahrens zu erhalten. Entweder DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) oder wasserlösliches EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminpropyl) carbodiimid, mit oder ohne NHS (N-Hydroxysuccinimid) oder wasserlösliches Sulfo-NHS können verwendet werden. Die Reaktion erfolgt in einem organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, DMF (Dimethylformamid), THF (Tetrahydrofuran), DMSO (Dimethylsulfoxid), Alkoholen und Pyridin, allein oder in wasserfreien oder wasserhaltigen Gemischen. Das Vorhandensein von Wasser wird durch die wasserlöslichen Eigenschaften des Ouillaja-Desacylsaponins vorgegeben, das in 50%igem Methanol, 50%igem n-Propanol, wässrigem DMSO und DMF löslich sein kann, ebenso in wasserfreiem THF oder Dioxan und anderen Lösungsmitteln mit ähnlichen Eigenschaften.
(i) Ein-Schritt-Verfahren

(a) Zu 100 mg (60 μMol) Desacylsaponin (4), gelöst in 1 ml 50%igem n-Propanol, wird 1 ml einer 0,6M Dodecylaminlösung (600μMol) in 50%igem n-Propanol hinzugefügt. Dann wird der pH-Wert mit 3N Phosphorsäure zwischen pH 5 und 7 eingestellt. 600 μMol trockenes EDC (95 mg) wird in die entstandenen Lösung eingerührt und 6 bis 8 Stunden bei 0 bis 10° C gemischt. Zusätzliche 300μMol EDC werden hinzugefügt, und das Gemisch wird über Nacht bei 0 bis 10° C zur Reaktion gebracht. Die Reaktion kann durch Entfernen der freien aliphatischen Amine mit einem Harz nach Art von Dowex 50 gestoppt werden (das Harz kann auch den Acyl-Harnstoff aus dem EDC entfernen). Das Harz wird durch Filtrierung entfernt. Das Filtrat, welches das konjugierte Desacylsaponin (5) enthält, wird zum Ausfällen mit 5 Volumsanteilen n-Propanol gemischt. Der Niederschlag wird aufgenommen, in Wasser gelöst, dialysiert und gefriergetrocknet.
(b) Falls die Desacyl-Saponine in wasserfreiem Pyridin allein oder mit wasserfreiem THF löslich sind, erfolgt die Reaktion mit DCC. 100 mg von (4) (60 μMol) werden in Pyridin und/oder THF gelöst, wobei mindestens 1 ml und höchstens 5 ml verwendet werden. 1ml einer 0,3M Dodecylaminlösung (300μMol) in Pyridin und/oder THF wird danach dem Reaktionsgemisch zugegeben, anschließend 300μMol trockenes DCC. Das Gemisch wird über Nacht bei 0 bis 10° C unter Rühren zur Reaktion gebracht. Während der Reaktion bildet sich unlöslicher Dicyclohexylharnstoff; dieser wird durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit, die das konjugierte Desacylsaponin (5) enthält, wird zum Ausfällen mit 10 Volumsteilen EtOAc verdünnt. Das EtOAc, das die freien aliphatischen Amine, das restliche DCC und das Pyridin und/oder THF enthält, wird verworfen. Der Niederschlag wird mit EtOAc gewaschen, in Wasser gelöst und vor dem Entfernen des EtOAc mit EtOAc erneut extrahiert und anschließend gefriergetrocknet.

(ii) Zwei-Schritt-Verfahren

(a) Zu 100 mg (60 μMol) Desacylsaponin (4), gelöst in 1 ml 50%igem n-Propanol, werden 0,2 ml einer 0,6M Dodecylaminlösung (120 μMol) in 50%igem n-Propanol hinzugefügt. Der pH-Wert des Gemischs wird mit 3N Phosphorsäure auf pH 5-7 eingestellt (Carboxylsäuren sind zu vermeiden). 120 μMol trockenes EDC (10 mg) und 120 μMol Sulfo-NHS (26 mg) werden dem Reaktionsgemisch unter Rühren hinzugefügt, und das Gesamte über Nacht bei 0 bis 10°C reagieren gelassen. Fünf Volumsteile n-Propanol werden hinzugefügt, um die konjugierten Desacyl-Saponine (5) auszufällen. Der Niederschlag wird aufgenommen, in Wasser gelöst, dialysiert und gefriergetrocknet.
(b) Falls Desacylsaponine in wasserfreien Pyridinen allein oder mit wasserfreiem THF gemischt löslich sind, kann die Reaktion mit DCC erfolgen. 100 mg von (4) (60 μMol) werden in Pyridin und/oder THF gelöst, dabei sollen mindestens 1ml und höchstens 5ml Lösungsmittel verwendet werden. 0,4 ml einer 0,3M Dodecylaminlösung (120 μMol) in Pyridin und/oder THF werden der Desacylsaponin-Lösung hinzugefügt, gefolgt von 120 μMol trockenem DCC und 120 μMol trockenem NHS. Das Gemisch wird über Nacht unter Rühren bei 0° C bis 10° C zur Reaktion gebracht. Dabei bildet sich unlöslicher Dicyclohexylharnstoff, der durch Zentrifugieren entfernt wird. Der Überstand, der die konjugierten Desacyl-Saponine (5) enthält, wird zum Ausfällen und Entfernen der freien Alkyl-Amine, restlichem DCC und NHS mit 10 Volumsteilen EtOAc verdünnt. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und mit EtOAc extrahiert, bevor er mit einem Rotorverdampfer konzentriert und anschließend gefriergetrocknet wird. Die Modifikation wird durch das Massespektrum bestätigt.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist das Addieren einer oder mehrerer hydrophober Ketten an die Carboxyl-Gruppe des 3-0-Glucuronsäurerests des desacylierten oder nicht-acylierten Saponins. Diese Addition mehrerer lipophiler Ketten kann mit Hilfe verschiedener chemischer Herangehensweisen einschließlich der wie folgt beschriebenen erfolgen. Vorzugsweise wird ein Molekül, das zwei oder drei lipophile Seitenketten besitzt, kovalent an 3-O-Glucuronsäure angelagert, entweder direkt oder mittels eines bifunktionalen Linkers.
Beispiel 4
Addition von Phosphatidylethanolamin- dipalmitoyl an Desacyl-Saponin
Zu 0,35 g (210 mMol) Desacylsaponin (4), gelöst bei Raumtemperatur in 3 ml wasserfreiem DMF/Pyridin (60:40 Vol./Vol.), werden 280 mMol Phosphatidylethanolamin-Fettsäurederivat (Dipalmtoyl, Distearoyl und andere) in DMF Pyridin hinzugefügt. Zu diesem Reaktionsgemisch werden unter Rühren 400-600 mMol trockenes DCC (0,08-0,125 g) und 400 mMol trockenes NHS (0,05 g) hinzugefügt und 12-16 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde auf 4° C abgekühlt und filtriert, um unlöslichen Dicyclohexylharnstoff, ein Nebenprodukt des DCC, zu entfernen. Zum Filtrat, das die konjugierten Desacylsaponine enthält, werden 10 Volumsteile kaltes Äthanol hinzugefügt, um das konjugierte Desacylsaponin auszufällen und restliches DCC, NHS sowie das Phosphatidylethanolamin-Fettsäurederivat zu entfernen. Nach 2 bis 4 Stunden bei 4 ° C wird das ausgefällte Saponinkonjugat durch Filtrierung aufgefangen. Der Niederschlag wird auf Filterpapier mit 10-20 ml Ethylacetat gewaschen. Das ausgefällte Saponinkonjugat wird in 10 ml Wasser gelöst und diese Lösung wird dann mit 1 Volumenteil Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wird von der wässrigen Lösung mittels Rotorverdampfer getrennt und die Probe anschließend gefriergetrocknet.
Beispiel 5
Addition von L -2,4-Diaminobutylsäure-Dimyristoyl an Desacylsaponin
Zu 0,63 g (2,5 mMol) Myritoylchlorid, gelöst in 25 ml Acetonitril, werden 2,10 g (11 mMol) 2,4-Diaminobutyl-dihydrochlorid plus 2,00 g Kaliumcarbonat hinzugefügt. Das Gemisch reagiert unter Rühren 12-16 Stunden bei 65° C. Das Reaktionsgemisch wird danach unter reduziertem Druck getrocknet, der Rückstand wird in Ethylacetat aufgelöst, mit Wasser extrahiert und erneut mit Magnesiumsulfat gesättigtem Wasser extrahiert. Die organische Phase wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird unter reduziertem Druck aufgelöst und die Reinheit der Verbindung durch Silicagel TLC überprüft. Erforderlichenfalls wird das Dimyristoylderivat durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt.
Zu 0,40 g (240 mMol) bei Raumtemperatur in 5 ml wasserfreien DMF/Pyridin (60:40 Vol./Vol.) aufgelöstem Desacylsaponin (4) werden 2 ml DMF/Pryidin hinzugefügt, die 0,23 g Dimyristoylderivat enthalten. Danach werden 480-720 mMol trockenes DCC (0,10-0,15 g) und 480 mMol trockenes NHS (0,06 g) unter Rühren hinzugefügt, danach wird das Gemisch bei Raumtemperatur 12-16 Stunden reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei 4° C abgekühlt und filtriert, um unlöslichen Dicyclohexylharnstoff, ein Nebenprodukt des DCC, zu entfernen. Zum Filtrat, welches die konjugierten Desacylsaponine enthält, werden 10 Volumenteile kaltes Äthanol hinzugefügte, um die konjugierten Desacylsaponine auszufällen und restliches DCC, NHS und freie Dimyristoyl-Derivate zu entfernen. Nach 2-4 Stunden bei 0-4 ° C wird das ausgefällte Saponinkonjugat durch Filtrierung gesammelt. Der Niederschlag wird auf Filterpapier mit 20-30 ml Ethylacetat gewaschen. Das ausgefällte Saponinkonjugat wird in 20 ml Wasser aufgelöst und die Lösung mit 1 Volumenteilen Ethylacetat extrahiert. Das Ethylacetat wird von der wässrigen Lösung mittels Rotorverdampfer entfernt und gefriergetrocknet. Die Reinheit der Probe wird mittels Silicagel-TLC geprüft. Erforderlichenfalls kann das konjugierte Desacylsaponin durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt werden.
Beispiel 6
Addition von Zitronensäure-Tripalmitoyl an Desacylsaponin
0,50 g (2,5 mMol) in 20 ml Acetonitril oder Pyridin aufgelöster Zitronensäure wird unter Rühren 3,60 g (15 mMol) 1-Hexadecylamin hinzugeben. Dieser Lösung wird 35 mMol trockenes DCC (7,20 g) und 35 mMol NHS (4,00 g) hinzugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Reaktionsmischung wird eine Stunde lang auf 4° C abgekühlt und filtriert, um den unlöslichen Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Lösungsmittel wird mittels Rotorverdampfer unter vermindertem Druck entfernen. Der trockene Rückstand wird in Alkohol aufgelöst, und das restliche Alkylamin wird mit einem stark sauren Harz (Dowex 50) entfernt. Die Reinheit des Produkts wird mit Silicagel-TLC überprüft. Erforderlichenfalls wird das Produkt durch Chromatographie auf Kieselgel gereinigt. Das Zitronensäure-Tripalmitoylderivat (1,87 g, 2 mMol) wird in 20 ml Acetonitril aufgelöst, 2,5 mMol 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) (0,40 g) wird hinzugefügt und das Gemisch über 4 Stunden unter wasserfreien Bedingungen bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Dann wird ein fünffacher Überschuss an Äthylendiamin (10 mMol ∼ 0,65 ml) dem Reaktionsgemisch hinzugefügt und dieses weitere 2-3 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Danach wird 10% Wasser hinzugefügt, um restliches CDI zu zerstören, und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt. Die Reaktionsprodukte werden in einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. Methanol oder Chloroform, aufgelöst und mittels Silicagel-Chromatographie gereinigt. Fraktionen, die aminiertes Zitronensäure-Tripalmitoylderivat (M. W. 1019.7) enthalten, werden zusammengeführt, und das Lösungsmittel wird unter reduziertem Druck entfernt.
Das desacylierte Saponinkonjugat wird durch Reaktion von 1 mol Desacylsaponin mit 1,5 mol aminiertem Zitronensäure-Tripalmitoylderivat in Pyridin/DMF (40:60 Vol./Vol.) mittels des oben beschriebenen DCC/NHS-Verfahrens hergestellt. Nach der Filtration zwecks Entfernung des unlöslichen Dicyclohexylharnstoffs wird das konjugierte Saponin mit Ethylacetat ausgefällt, erneut in Wasser aufgelöst und gefriergetrocknet.
Beispiel 7
Herstellung von Saponin-Analoga mit steroider oder triterpenoider Komponente
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf lineare hydrophobe Ketten als lipophile Komponente beschränkt. So können auch nichtaromatische, aromatische zyklische und heterozyklische Verbindungen sowie Triterpenoide und Steroide als lipophile Komponente verwendet werden. Als Beispiel wird hier die Herstellung eines Steroidderivats beschrieben. Zu 2 mMol Desoxycholsäure (0,79 g) in 10 ml Pyridin werden unter Rühren 10 mMol(0,67 ml) Ethylenediamin, und danach 4 mMol trockenes DCC (0,82 g) und 4 mMol NHS (0,50 g) hinzugeben. Das Gemisch wird über Nacht bei 25° C zur Reaktion gebracht. Dann wird die Reaktion abgekühlt, das unlösliche DCC-Nebenprodukt filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Die Produkte werden in wenig Chloroformmethanol oder einem ähnlichen Lösungsmittel (3:2 Vol./Vol.) aufgelöst, und das aminierte Produkt wird durch Chromotographie auf Siliciagel vom Ethylenediamin getrennt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt.
Das desacylierte Saponinkonjugat wird durch Reaktion von 1 Mol Desacylsaponin mit 2 Mol des aminiertem Deoxycholsäurederivats mittels des oben beschriebenen DCC/NHS-Verfahrens hergestellt. Das konjugierte Saponin wird mit Alkohol ausgefällt, in Wasser erneut aufgelöst und gefriergetrocknet.
Beispiel 8
Testen auf Adjuvanswirkung unter Verwendung von Ovalbumin (OVA) als Antigen
Die Adjuvanswirkung lässt sich durch Zunahme des antigenspezifischen Antikörpertiters infolge der Addition eines potentiellen Adjuvans in der Immunisierungsformulierung beurteilen. Erhöhte Titer sind das Ergebnis einer erhöhten Konzentration von Antikörpern und/oder einer Zunahme der Antigen-/Antikörperaffinität. Adjuvanswirkungen von Saponin wurden schon früher durch Titererhöhung neutralisierender Antikörpern zu Impfstoffen gegen Maul- und Klauenseuche bei Meerschweinen (Dalsgaard, K., Archiv für die gesamte Virusforschung 44:243-254 (91974)), Titererhöhung von ausgefällten Antikörpern zu BSA (gemessen durch radiale Immundiffusion) bei Meerschweinen, die mit BSA-/Saponinmischungen geimpft wurden (Dalsgaard, K., Acta Veterinaria Scandinavica 69,1-40 (1978)), sowie durch Titererhöhung von Antikörpern gegen Hämocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke (KLH) (gemessen durch ELISA) bei Mäusen, die mit KLH/Saponin immunisiert wurden (Scort et al. Im. Archs. Allergie appl. Immun. 77:409-412 (1985)) gemessen.
Die Beurteilung der Adjuvanswirkung lässt sich durch Zunahme in anti-OVA-Antikörper nach erfolgter Immunisierung mit OVA/Saponinen, OVA/desacylierten Saponinen oder OVA/Saponin-Analoga im Vergleich zu Immunisierung mit OVA in Abwesenheit von Saponin bestimmen. Die Adjuvansaktivität in der Saponinkonjugatfraktion wird folgendermaßen gemessen: CD2F1-Mäuse (8-10 Wochen alt) werden mit folgender Mischung intradermal immunisiert: 20 μg OVA (Sigma) und Adjuvans der vorliegenden Erfindung oder Quillaja-Saponin (Dosen zwischen von 10 und 2500 μg) oder Quillaja-Saponin (in einer Dosis von 10 μg) in 200 μl PBS. Die beiden Immunisierungen erfolgen in einem Abstand von zwei Wochen. Versuchsmäusen wird entweder PBS oder PBS mit OVA sowie 200 μg Aluminiumhydroxid injiziert. Die Sera werden zwei Wochen nach der Immunisierung entnommen. Anti-OVA-Antikörper wird durch ELISA bestimmt: Immulon II-Platten werden über Nacht bei 4° C mit 100 μg einer OVA-Lösung (10 mg/ml in PBS) in Reihen A,C, E und G bestrichen. Die Platten werden zweimal mit PBS gewaschen. Unspezifische Bindung wird durch Inkubation für 1,5 Std. bei 37° C mit 100 μl Verdünner (2% Kaseinsäurehydrolysat (Oxoid. Massevolumenanteile) in PBS pro Vertiefung in allen Vertiefungen verhindert. Die Platten werden viermal mit 0,05% Tween 20-Tensid in destilliertem Wasser gewaschen. Die Seren in Verdünnungen von 1:20, 1:100, 1:500, 1:2500, 1:12.500, 1:62.500, 1:312.500 und 1:1.562.500 werden in Reihen A+B, C+D, E+F bzw. G+H (100μl/Vertiefung) 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten werden wie oben beschrieben gewaschen. Boehringer Mannheim Meerrettich-Peroxidasekonjugat-Ziegen-Antimaus-Antikörper (1/5000 in 5% OVA in Verdünnungsmittel) wird 30 Minuten bei Raumtemperatur (100 μl pro Vertiefung, alle Vertiefungen) inkubiert. Die Platten werden wie oben beschrieben waschen. Der Umfang der Peroxidasereaktion bestimmt sich durch die Reaktion mit 2,2'-Azido-bis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonat (30-minütige Reaktion bei Raumtemperatur, Absorptionsmaß gemessen bei 450 nm) oder mit 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (10-minütige Reaktion von unspezifischer Antikörperbindung zur totalen Antikörperbindung wird durch Subtraktion des Absorptionsmaßes der Antigen-Negativ-Vertiefung vom Absorptionsmaß der Antigen-Positiv-Vertiefungen pro Seraverdünnung beseitigt. Das während der primären Immunreaktion produzierte IgG wird durch Interpolieren der ermittelten Absorptionswerte mit einer 1:20 Serumverdünnung in einer Kalibrierungskurve bestimmt. Die Kalibrierungskurve wird mittels der bekannten Anzahl eines Anti-OVA-IgG-Monoclonalen Antikörpers, der simultan mit den Proben der Immunseren verarbeitet wird, erstellt. Die sekundäre Anti-OVA-IgG-Immunreaktion wird folgendermaßen anhand der Endpunkttiter ermittelt: Das Absorptionsmaß aufgrund der antigenspezifischen Bindung wird als Funktion des Logarithmus der Serumverdünnung graphisch dargestellt, und der Endpunkttiter wird anhand der Serumverdünnung geschätzt und ergibt einen Absorptionsmaß von 0,25). Endpunkttiter von 3,6 oder weniger werden mit Seren aus Immunisierungen ohne Adjuvans, Endpunkttiter nahe 5,0 oder höher als 5,0 mit anderen Adjuvantia erreicht. Dialysierte Ouillaja Saponaria-Molinasaponine erhöhen die Titer bei einer Adjuvansdosis von 10μg um fast das Doppelte, verglichen mit OVA in PBS. Die Hauptimmunreaktion aus Immunisierungen mit OVA plus desacylierten Quillajasaponinen erbringt niedrigere IgG-Werte als solche, die durch OVA in PBS bewirkt werden.
Ein wie in Beispiel 3 beschrieben hergestelltes Konjugat wurde auf Adjuvanswirkung bei Dosen von 10, 50 und 250 μg getestet. Die Konjugate zeigten eine gute, dosisabhängige Adjuvanswirkung bei der Produktion von Anti-OVA-IgG während der primären und sekundären Immunreaktion (3, 4, 5, 6). Dieses Konjugat ergibt Endpunkttiter, die denen des Quillaja-Saponins nahekommen, d.h. 4,70 bis 5,85. Im Gegensatz zu Quillajasaponinen stimuliert dieses Konjugat vorzugsweise die Produktion von IgG1. Im getesteten Dosierungsbereich von 10 bis 250 μg wurden keine negativen Nebenwirkungen beobachtet.
Beispiel 9
Testen der Adjuvanzswirkung an T-Zellen-Immunität mit OVA als Antigen
In vielen viralen Impfstoffen, vor allem in Krebsimpfstoffen sollte das mit den Proteinantigenen verwendete Adjuvans eine starke spezifische zellulärvermittelte Immunität (CMI) oder T-Zellen-Immunreaktion unter Produktion zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) bewirken. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind Quillajasaponine die einzigen Adjuvantia, die in der Lage sind, eine T-Zellenimmunität zu bewirken (Newman et al., J. Immuno. 148:2357 (1992)). Die anderen Adjuvantia einschließlich Muramyldipeptiden, Glucanen, Immunmodulatoren wie IL-2 und andere bewirken lediglich eine humorale Immunreaktion gegen exogene Proteine (Cod, J.C. und Coulter, A.R., Vaccine 15:248 (1997)), was für Impfstoffe gegen Krebs und einige Viruserkrankungen von nur geringem Wert sein würde. Die Desacylierung von Quillajasaponinen ergibt ungiftige Stoffe, jedoch ohne Adjuvanswirkung, wie die Messung von Antikörperproduktion ergibt (Kensil et al Vaccines 92:35 (1992)), und CTL-Reaktion (Kensil et al., in Saponins Used in Traditional and Modern Medicine; Kamasaki, K.,Waller, G.R., Eds. Plenum, N.Y. in Druck). Aufgrund ihrer Stimulierung der humoralen Immunität und der T-Zellenimmunität sowie dank ihrer geringen Toxizität sind die semisynthetischen Analoga oder lipophilen Saponinkonjugate der vorliegenden Erfindung für die Herstellung viraler Impfstoffe oder Impfstoffe gegen Krebs geeignet. Die T-Zellenimmunität, die durch diese Adjuvantia stimuliert wird, lässt sich in vitro mittels (i) Blast-Transformation, die die Wachstumsreaktion der sensibilisierten T-Zellen zu Antigenen misst, oder (ii) durch Messung der Verbesserung des CTL-Primings gegen ein Proteinantigen bestimmen.
Die Adjuvanswirkung auf T-Zellenimmunität wird durch Bestimmung des Zellwachstums entsprechend dem folgenden Protokoll gemessen. Sechs bis acht Wochen alte weibliche C57BL/6-Mäuse werden zweifach subcutan mit der folgenden Formulierung immunisiert: 20 μg OVA (Sigma) und ein Adjuvans der vorliegenden Erfindung oder desacylierte Quillaja-Saponine (in Dosen von 10-250 μg) oder Quillaja-Saponin (in einer Dosis von 10 μg) in 200μg PBS. Die beiden Immunisierungen werden im Abstand von zwei Wochen gegeben. Den Versuchsmäusen wird entweder PBS oder OVA plus 200μg Aluminiumhydroxid injiziert. Zwei Wochen nach der zweiten Immunisierung wird die Milz entfernt und mittels Extrudieren durch ein Nylonnetz zerkleinert. Die Zellen werden in RPMI 1640-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem Kalbsfötusserum, 100 μg/ml Streptomycin, 100 μg/ml Penicillin, 10 μg/ml Gentamycin, 2 mM L-Glutamin und 2 × 10-5 M 2-Mercaptoethanol gewaschen und resuspendiert. Zwei × 10⁵ Milzzellen werden in 100 μl Volumenteilen auf Mikrotiterplatten-Vertiefungen verteilt und in dreifacher Ausführung mit jedem Medium allein kultiviert (zur Nutzung als Hintergrundinformation), 3μg/ml Concavalin A, 2μg/ml OVA oder 10 μg/ml OVA. Nach 72 Stunden in der Kultur werden die Zellen 16 Stunden lang mit 1 μCi tritiummarkiertem Thymidin (³H-Thymidin, Amersham International) pulsiert und dann mit einem halbautomatischem Skatron (Sterling, VA) geerntet. Die in die zelluläre DNA eingebaute Summe an Markierung wird mittels Zählung durch Flüssigszintillation bestimmt. Das Zellwachstum wird ausgedrückt durch das Differential (Δ cpm) in ³H-Thymidin, das zwischen die Milzzellen inkorporiert und jeweils mit 2 oder 10 μg OVA in vitro stimuliert wird. Wie von der ³H-Thymidin-Inkorporation in Gegenwart von OVA bestimmt wurde, zeigen die T-Lymphozyten von mit OVA plus Quillaja-Saponin immunisierten Mäusen ein signifikant höheres Wachstum als bei Versuchen mit Alaun beobachtet werden konnte. T-Zellen von Mäusen die mit OVA und verschiedenen Dosen desacylierter Quillaja-Saponine immunisiert wurden, zeigten eine Wachstumsreaktion, die niedriger war als die mit Alaun beobachtete. T-Lymphozyten von Mäusen, die mit OVA plus 50 oder 250 μg Saponinkonjugat immunisiert wurden, zeigten in vitro eine Wachstumsreaktion (Δ c.p.m.), was gleich oder beträchtlich höher war als das mit Quillaja-Saponinen (7) beobachtete Wachstum.
Beispiel 10
Addition von Biotin an die Carboxylgruppe der Glucuronsäure
Ein C₂-C₆-aliphatisches Diamin wird der Carboxylgruppe des Glucuronsäurerests der Saponine von Gypsophila, Saponaria oder den desacylierten Quillaja-Saponinen unter Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Carbodiimid-Verfahrens hinzugefügt. Die Addition der Biotingruppe wird durch die Bindung eines aktiven Esterderivats (S-NHS) von Biotin (Pierce) an die freie Aminogruppe des C₂-C₆-aliphatischen Diaminderivats des Saponins erreicht.
Beispiel 11
Testen der Bindung biotinylierter Saponine an T-Zellen
Lymphoblaste, weiße Blutzellen oder kultivierte Zellen, werden in PBS bei 37° C mit biotinyliertem Saponin mit oder ohne Na-Cyanoborhydrid inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen mit BSA-haltigem PBS gewaschen und durch Zentrifugieren aufgefangen. Zu den gewaschenen und resuspendierten Zellen wird ein FITC-konjugiertes Avidin oder Strepavidin (xx mg/ml) addiert und das Gemisch xx Minuten bei xx ° C inkubiert. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, das 10% Kalbsfötusserum enthält. Die Proben werden durch Fluoreszenzmikroskopie oder Fließzytometrie analysiert. Mit biotinylierten Saponinen ohne Cyanoborohydrid inkubierte Zellen werden als Hintergrundmaß verwendet. In Gegenwart von Cyanoborohydrid inkubierte Zellen liefern ein Maß an T-Zellen mit CD28-Zelloberflächenrezeptoren, die in der Lage sind, iminbildende Saponine (einschließlich biotinylierte Saponine) zu binden. Diese Zellen sind empfänglich für Kostimulation durch B7.1 und mithin für Aktivierung.
Schema 1
Schema 2 Herstellung von desacylierten Quillaja-Saponinen
Schema 3
Schema 4 Synthese der hydrophob-hydrophilen Seitenkette
Schema 5 Aktivierung von Glucuronsäure in DS-Quillajasaponin
Schema 6 Addition der hydrophob-hydrophilen Seitenkette an DS-Saponin
Schema 7 Synthese der hydrophob-hydrophilen Seitenkette
Schema 8 Addition der hydrophob-hydrophilen Seitenkette an DS-Saponin

Claims

Triterpen-Saponin-lipophiles Konjugat, welches ein nicht-acyliertes oder desacyliertes Triterpen-Saponin, welches einen 3-Glukuronsäurerest enthält, und eine lipophile Komponente aufweist; wobei das Saponin und die lipophile Komponente entweder direkt oder über eine Linkergruppe kovalent aneinander angelagert sind, und wobei die direkte Anlagerung oder die Anlagerung an den Linker über eine kovalente Bindung zwischen dem Carboxylkohlenstoff des 3-Glukuronsäurerestes und einer geeigneten Funktionsgruppe auf dem lipophilen Rest oder der Linkergruppe erfolgt.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Triterpen-Saponin (a) eine Triterpen-Aglykon-Kernstruktur mit verzweigten Zuckerketten angelagert an Position 3 und 28, und eine Aldehydgruppe verknüpft mit oder angelagert an Position 4 aufweist; und (b) entweder ursprünglich nicht-acyliert ist, oder das Entfernen einer Acyl- oder Acyloingruppe erfordert, welche an ein Saccharid an der 28-Position des Triterpen-Aglykons gebunden ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Triterpen-Saponin eine Quillajasäure- oder Gypsogenin-Kernstruktur aufweist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Desacyl-Saponin oder nicht-acylierte Saponin aus der Gruppe bestehend aus Quillaja-Desacyl-Saponin, S. jenisseensis-Desacyl-Saponin, Gypsophila-Saponin, Saponaria-Saponin, Acanthophyllum-Saponin und Lucyosid-P-Saponin ausgewählt ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die lipophile Komponente einen oder mehrere Reste einer Fettsäure, Terpenoid, aliphatisches Amin, aliphatischen Alkohol, Mono- oder Poly-C₂-C₄-Alkylenoxy-Derivat einer Fettsäure, Mono- oder Poly-C₂-C₄-Alkylenoxy-Derivat eines Fettalkohols, Glykosyl-Fettsäure, Glykolipid, Phospholipid, Mono- oder Diacylglycerol, aliphatische Mercaptane oder Phosphoglycerid aufweist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 5, wobei die lipophile Komponente die Reste einer oder mehrerer C₆-C₂₄-Fettsäuren aufweist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 6, wobei die lipophile Komponente der Rest einer C₁₄-C₂₄-Fettsäure ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 6, wobei die Fettsäure Laurin-, Myristin-, Palmitin-, Stearin-, Arachin-, Behen-, Lignocerin-, Palmitolein-, Olein-, Linol-, Linolen- oder Arachidonsäure ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 5, wobei die aliphatischen Amine, aliphatischen Alkohole oder aliphatischen Mercaptane zwischen 6 und 20 Kohlenstoffatome aufweisen.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 9, wobei die lipophile Komponente der Rest von Nonylamin oder Dodecylamin ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 5, wobei die lipophile Komponente der Rest von Retinal A oder Glucosamin-Ricinolsäure ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das nicht-acylierte oder desacylierte Triterpen-Saponin über eine kovalente Bindung zwischen dem 3-Glukuronsäurerest des Triterpen-Saponins und einer reaktiven Funktionsgruppe des lipophilen Restes direkt an die lipophile Komponente angelagert ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das nicht-acylierte oder desacylierte Triterpen-Saponin über einen bifunktionellen Linker, welcher eine erste Funktionsgruppe, die eine Bindung zwischen dem 3-Glukuronsäurerest des Triterpen-Saponins bildet, und eine zweiten Funktionsgruppe, welche eine Bindung mit einer reaktiven Funktionsgruppe des lipophilen Restes bildet, aufweist, an den lipophilen Rest angelagert ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Linkergruppe aus der Gruppe bestehend aus -NH-CH₂-CH₂-NH-, -NH-CH(COOH)-CH₂-NH-, -NH-CH₂-CH(COOH)-NH-, -NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH-, -O-(CH₂)_r-NH-, -S-(CH₂)_r-NH-, -S-(CH₂)_r-C(O)-, -NH-CH₂-C(O)-, -O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-, -NH-NH-C(O)-CH₂-, -NH-C(CH₃)₂-C(O)- und -NH-NH-C(O)-(CH₂)_r-C(O)-NH-N= ausgewählt ist, wobei r in jedem Falle von 2 – 5 ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Konjugat durch Formel II dargestellt ist:
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei R¹ Glukose oder Wasserstoff ist; R² Apiose oder Xylose ist; X gleich S, O, NH oder eine Verknüpfungsgruppe ist, und R³ eine lipophile Komponente ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Konjugat durch Formel III dargestellt ist:
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei X gleich S, O, NH oder eine Verknüpfungsgruppe ist, und R³ eine lipophile Komponente ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Konjugat durch Formel IV dargestellt ist:
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei X gleich S, O, NH oder eine Verknüpfungsgruppe ist, und R³ eine lipophile Komponente ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach den Ansprüchen 15 – 17, wobei X eine Verknüpfungsgruppe ist, und die Verknüpfungsgruppe ein bifunktionelles Molekül ist, oder wobei X gleich NH, O oder S ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei R³ eine lipophile Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fettsäure, Terpenoid, aliphatischem Amin, aliphatischem Alkohol, aliphatischem Mercaptan, Mono- oder Poly-C₂-C₄-Alkylenoxy-Derivat einer Fettsäure, Mono- oder Poly-C₂-C₄-Alkylenoxy-Derivat eines Fettalkohols, Polyethylenglykol, Glykosyl-Fettsäure, Glykolipid, Phospholipid, Monoacylglycerol und Diacylglycerol ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach Anspruch 18 oder 19, wobei X gleich S, O, NH oder eine Verknüpfungsgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -NH-CH₂-CH₂-NH-, -NH-CH(COOH)-CH₂-NH-, -NH-CH₂-CH(COOH)-NH-, -NH-CH₂-CH₂-CH₂-NH-, -O-(CH₂)_r-NH-, -S-(CH₂)_r-NH-, -S-(CH₂)_r-C(O)-, -NH-CH₂-C(O)-, -O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-, -NH-NH-C(O)-CH₂-, -NH-C(CH₃)₂-C(O)- und -NH-NH-C(O)-(CH₂)_r-C(O)-NH-N= ist, wobei r in jedem Falle von 2 – 5 ist.
Saponin-lipophiles Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Verwendung in der Medizin.
Saponin-lipophiles Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Verwendung als Impfstoff.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein oder mehrere Saponin-lipophile/s Konjugat/e nach einem der Ansprüche 1 – 22 und einen pharmazeutisch akzeptableres Trägerstoff oder Verdünnungsmittel enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 23, welche ferner ein Antigen enthält.
Impfstoff welcher Folgendes umfasst: (a) ein oder mehrere Saponin-lipophile/s Konjugat/e nach einem der Ansprüche 1 – 21; (b) eine immunologisch effektive Menge eines Antigens; und (c) einen pharmazeutisch akzeptablen/s Trägerstoff oder Verdünnungsmittel.
Verwendung eines Saponin-lipophilen Konjugates nach einem der Ansprüche 1 – 21 bei der Herstellung eines Medikamentes für die Unterstützung einer Immunreaktion in einem Tier.
Verwendung eines Saponin-lipophilen Konjugates nach einem der Ansprüche 1 – 21 bei der Herstellung eines Medikamentes zum Potenzieren einer Immunreaktion auf ein Antigen in einem Tier.
Verwendung eines Saponin-lipophilen Konjugates nach einem der Ansprüche 1 – 21 bei der Herstellung eines Impfstoffes.