DE69637435T2

DE69637435T2 - Saponin-zusammensetzungen und deren verwendung

Info

Publication number: DE69637435T2
Application number: DE69637435T
Authority: DE
Inventors: Charlotte A. Milford KENSIL
Original assignee: Antigenics LLC
Current assignee: Agenus Inc
Priority date: 1996-12-02
Filing date: 1996-12-02
Publication date: 2009-02-19
Anticipated expiration: 2016-12-03
Also published as: JP2001505573A; AU730230B2; AU1277897A; ES2297841T3; ATE385809T1; JP4138884B2; HK1025220A1; EP0952771A1; WO1998024319A1; DK0952771T3; CA2273922A1; DE69637435D1; EP0952771B1; EP0952771A4; CA2273922C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der medizinischen Chemie. Insbesondere betrifft die Erfindung Vakzine, die neue Kombinationen von Saponin-Adjuvantien umfassen, pharmazeutische Zusammensetzungen und Vakzine, die diese neuen Kombinationen umfassen, Verfahren zur Verwendung dieser neuen Kombinationen zur Verstärkung der Immunantwort eines Individuums auf ein Antigen, und die Verwendung der neuen Kombinationen zur Erhöhung der Immunogenität von Vakzinen.
Kurze Beschreibung des Standes der Technik
Quillaja-Saponine sind eine Mischung von aus der Rinde des Baumes Quillaja saponaria extrahierten Triterpen-Glycosiden. Sie sind seit langem als Immunstimulatoren, die als Vakzin-Adjuvantien verwendbar sind, anerkannt (Campbell, J. B., und Peerbaye, Y. A., Res. Immunol. 143(5): 526–530 (1992)), und eine Reihe im Handel erhältlicher komplexer Saponin-Extrakte wurde als Adjuvantien verwendet. Rohe Saponine wurden in großem Umfang als Adjuvantien in Vakzinen gegen die Maul- und Klauenseuche und bei der Verstärkung der schützenden Immunität, übermittelt durch Versuchsvakzine gegen Protozoen-Parasiten, wie Trypanosoma cruzi-Plasmodium und auch der humoralen Antwort auf rote Blutzellen von Schafen (sheep red blond cells, SRBC) verwendet. (Bomford, Int. Arch. Allerg. Appl. Immun. 67: 127 (1982)).
Die ersten im Handel erhältlichen Quillaja-Saponin-Adjuvantien waren rohe Extrakte, welche wegen ihrer Variabilität für eine Verwendung in der tierärztlichen Praxis oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen für den Menschen nicht erwünscht waren. Ein früher Versuch, Quillaja-Saponin-Adjuvantien zu reinigen, wurde von Dalsgaard unternommen, Archiv für die gesamte Virusforschung 44: 243(1974). Dalsgaard unternahm eine teilweise Reinigung eines wässrigen Extrakts des Saponin-Adjuvans-Materials von Quillaja saponaria Molina. Während jedoch Dalsgaards Präparat, „Quil-A", eine eindeutige Verbesserung gegenüber den früher im Handel erhältlichen Saponinen war, wies es noch immer eine beträchtliche Heterogenität auf.
Eine spätere Analyse auf dem Weg über Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zeigte, dass Quil A tatsächlich eine heterogene Mischung strukturell verwandter Verbindungen war. ( U.S. Patent Nr. 5,057,540 ; Kersen, G. F. A. et al., Infect. Im mun. 56: 432–438 (1988); Kensil, C. R. et al., J. Immunol. 146: 431–437 (1991); Kensil, C. R. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 199: 1423–1427 (1991)). Es waren jedoch nicht alle dieser Saponine als Adjuvantien wirksam.
Die vier am meisten vorherrschenden gereinigten Quillaja-Saponine sind QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 (alternativ als QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21 identifiziert). Diese Saponine wurden mittels HPLC und Niederdruck-Siliziumdioxid-Chromatographie gereinigt und erwiesen sich als adjuvantierend aktiv, obwohl sie sich in ihren biologischen Aktivitäten, wie Hämolyse und Toxizität in Mäusen, unterschieden. Insbesondere QS-21 und QS-7 erwiesen sich in Mäusen als am wenigsten toxisch. (Kensil, C. R. et al., J. Immunol. 146: 431–437 (1991)).
Wegen seiner starken adjuvantierenden Aktivität und geringen Toxizität wurde QS-21 (im Handel als das „Stimulon^®"-Adjuvans erhältlich) als ein nützliches immunologisches Adjuvans identifiziert. (Kensil, C. R. et al., „Structural and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21," in Vacccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M. J., Hrsg., Plenum Press, New York (1995)). QS-21 ist ein komplexes Triterpenglykosid der Quillasäure. QS-21 ist am Triterpen-Kohlenstoff 3, Triterpen-Kohlenstoff 28 und Kohlenstoff 5 der zweiten Fettacyl-Einheit in einer Fettsäure-Domäne glycosyliert.
In jüngerer Zeit wurde QS-21 weiter gereinigt, wobei die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) verwendet wurde, und in zwei Peaks, QS-21-V1 und QS-21-V2, aufgetrennt, welche sich als chemisch verschiedene Verbindungen erwiesen. In C57b1/6-Mäusen, die mit Vakzinen immunisiert worden waren, welche aus Ovalbumin und entweder QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2 bestanden, sind beide der einzelnen Komponenten QS-21-V1 und QS-21-V2 in der adjuvantierenden Wirkung dem ursprünglichen QS-21-Peak vergleichbar (enthaltend eine Mischung von 3: 2 QS-21-V1 und QS-21-V2) für das Bonstern der IgG-Unterklassen IgG1, IgG2b und IgG2, sowie für den gesamten IgG-Titer. (Gleichzeitig schwebende U. S. Patentanmeldung Nr. 07/906,880, erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche als U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht werden soll, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist).
Quillaja-Saponine sind von Saponinen, die von anderen Pflan zenarten stammen, strukturell verschieden. Zwei strukturelle Merkmale, die Quillaja-Saponine von jenen anderer Pflanzenarten unterscheiden, sind eine Fettsäure-Domäne und ein Triterpenaldehyd am Kohlenstoff 4 des Triterpens. (Kensil, C. R. et al., „Structural and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M. J., Hrsg., Plenum Press, New York (1995)). Modifikationen am Aldehyd am Triterpen weisen dafauf hin, dass diese funktionelle Gruppe beim Adjuvans-Mechanismus eine Rolle spielen könnte (Soltysik, S. et al., Vaccine 13(15): 1403–1410 (1995)).
Es zeigte sich, dass Quillaja-Saponine, insbesondere QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21, ausgezeichnete Stimulatoren der Antikörper-Antwort auf lösliche T-abhängige Protein-Antigene, „Untereinheits-Antigene", sind, welche nur wenig immunogen sind und ein starkes Adjuvans zur Maximierung der Immunantworten benötigen. Beispiele für gereinigte Untereinheits-Antigene, bei welchen Saponin-Adjuvantien die IgG-Antwort in Mäusen verstärken, inkludieren das Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (keyhole limpet hemocyanin, KLH), HIV-1 gp120 (Bomford, R. et al. AIDS Res. Hum. Retroviruses 8: 1765 (1992)), und Influenza-Nukleoprotein (Brett, S. et al., Immunology 80: 306 (1993)). Es zeigte sich auch, dass QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 starke Antikörper-Antworten bei Mäusen auf die Antigene Rinderserum-Albumin und Cytochrom b₅ stimulieren (Kensil, C. R. et al., J. Immunol. 146: 431 (1991)). Die Höhe der von diesen gereinigten Saponinen induzierten Antikörper-Antwort war mit anderen üblicherweise verwendeten Adjvuantien, z. B. dem kompletten Freund'schen Adjuvans, vergleichbar, und Aluminiumhydroxid überlegen.
Es zeigte sich auch, dass QS-21 die Antikörper-Antwort auf T-unabhängige Antigene verstärkt, einschließlich unkonjugierter bakterieller Polysaccharide (White A. C. et al., „A purified saponin acts as an adjuvant for a T-independent antigen, in Immunobiology of Proteins and Peptides, Bd. VI (M. Z. Atassi, Hrsg.), Plenum Press, New York, S. 207–210 (1991)). Die Immunogenität des Vakzins wurde durch Konjugation des Diphtherie-Toxoids mit dem Polysaccharid weiter verstärkt. QS-21 verbesserte die Antikörper-Antwort auf das Polysaccharid sowie auf den Träger, einschließlich der IgG2a, IgG2b und IgG3-Antworten (Coughlin, R. T. et al., Vaccine 13(1): 17–21 (1995)).
Die Fähigkeit von Adjuvantien, die Isotyp-Verteilung und IgG-Unterklassen-Verteilung der Antikörper-Antwort auf ein Antigen durch die Förderung der Ig-Unterklassen-Umschaltung („Ig subclass switching") zu modulieren, hat wichtige Implikationen für die Immunität gegen viele Bakterien- und Virus-Vakzine. QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 stimulieren die IgG2a-Antwort auf Cytochrom b₅ nach Verabreichung mit Saponin-Dosen von 20 μg (Kensil C. R. et al., J. Immunol. 146: 431 (1991)). In dieser Hinsicht verschiebt QS-21 vorwiegende IgG1-Antworten zu einem Profil, welches signifikante IgG2b- und IgG2a-Antworten inkludiert. Zum Beispiel zeigte es sich, dass QS-21 Antigen-spezifisches IgG2a gegen eine Reihe von Antigenen stimuliert, einschließlich der äußeren Oberflächen-Proteine („outer surface Proteins") OspA und OspB von Borrelia burgdorferi, (Ma, J. et al., Vaccine 12(10): 925 (1994), Felines Leukämievirus-(FeLV)-Hüllen-gp70 (Kensil, C. R. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 10: 1423 (1991)), humanes Cytomegalovirus (HCMV)-Hüllen-Protein gB (Britt, W. et al., J. infect. Dis. 171: 18 (1995), respiratorisches Syncytial-Virus (RSV) gereinigtes Fusionsprotein (Hancock, G. E. et al., Vaccine 13(4): 391 (1995)), und Tetanus-Toxoid (Coughlin, R. T. et al., Vaccine 13(1): 17 (1995)). Es zeigte sich, dass QS-21 auch boosterfähige Antikörper-Antworten induziert (Britt et al., J. Infect. Dis. 171: 18–25 (1995); Helling et al., Cancer Res. 55: 2783–2788 (1995)).
Die Fähigkeit des QS-21-Adjuvans, nach Immunisierung mit löslichen Proteinen hinsichtlich des Klasse I-Haupthistokompatibilitätskomplex-(major histocompatibility complex, MHC)-Antigens eingeschränkte zytotoxische T-Lymphozyten-Antworten (CTL) zu induzieren, ist ein Charakteristikum der Saponin-Adjuvantien. Eine Reihe von Studien zeigte die Fähigkeit von QS-21, starke zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antworten auf verschiedene Antigene einschließlich Ovalbumin zu induzieren(Wu, J.-Y. et al., Cell. Immunol. 154: 394–406 (1994); Newman, M. J. et al., J. Immunol. 148(8): 2357–2362 (1992)), rekombinantes HIV-1 gp160-Protein (Wu, J.-Y. et al., J. Immunol. 148: 1519 (1992)), und Untereinheit SIV_mac251 gag und env (Newman, M. J. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(7): 853 (1994)).
Die meisten der Saponin-Adjuvans-Studien wurden in Mäusen durchgeführt. Die Adjuvans-Aktivität von Saponinen ist jedoch nicht auf Mäuse eingeschränkt; sie wurde auch bei Meerschwein chen, Kaninchen, Schweinen, Schafen, Rindern und nicht-menschlichen Primaten nachgewiesen. Eine adjuvantierende Wirkung von QS-21 wurde bei Katzen, Meerschweinchen, Hunden, nicht-menschlichen Primaten und Menschen beobachtet. (Kensil, C. R. et al., „Structural and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21,", in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M. J. Hrsg., Plenum Press, New York (1995)).
Menschliche Versuche der Phase 1 von QS-21 mit GM2-Gangliosid-Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat-Vakzin wurden bei Patienten mit malignem Melanom durchgeführt (Livingston, P. O. et al., Vaccine 12: 1275–1280 (1994). Es wurde eine erhöhte Immunogenität nach Verabreichung mit QS-21-Adjuvans beobachtet (Helling, F. et al., Cancer Res. 55: 2783–2788 (1995)). Bei einem anderen Satz klinischer Versuche erwies sich QS-21 als starkes immunologisches Adjuvans, das die serologische Antwort von Melanom-Patienten auf den murinen antiidiotypischen Antikörper MELIMMUNE-1 signifikant erhöhte (Livingston, P. O. et al., Vaccine Res. 4(2): 87 (1995)).
In einer Reihe von Studien wird die Verwendung von Quillaja-Saponinen, insbesondere QS-21, in Verbindung mit anderen Adjuvantien behandelt. Zum Beispiel zeigte es sich, dass QS-21 ein wirksames Koadjuvans mit auf Aluminiumhydroxid (Alum) absorbierten Antigenen ist. (Ma, J.-Y. et al., Vaccine 12(10): 925–933 (1994); Newman, J. et al., J. Immunol. 148(8): 2357–2362 (1992); Kensil, C. R. et al., „Structural and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M. J. Hrsg., Plenum Press, New York (1995); Kensil et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 199: 1423–1427 (1991); Wu, J.-Y. et al., J. Immunol. 148: 1519–1525 (1992); Kensil et al., Vaccine Res. 2: 273–281 (1993)). Außerdem ist die Verwendung von Mischungen aus zwei oder mehr Saponin-Adjuvantien im U.S. Patent Nr. 5,057,540 und in der derzeit gleichzeitig schwebenden U. S. Patentanmeldung Nr. 07/906,880 (erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche als U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht werden soll) behandelt.
Die immun-adjuvantierende Wirkung von Saponinen hängt von der Dosis ab. Je nach dem Antigen und der Spezies, ist eine Mindestdosishöhe von QS-21 für eine optimale Antwort notwendig. (Kensil, C. R. et al., J. Immunol. (1991); Kensil, C. R. et al., Vaccine Res. (1993); Newman et al., J. Immunol. (1992); Livingston, et al., Vaccine (1994)). Unterhalb dieser Mindestdosis ist die immun-adjuvantierende Wirkung suboptimal (entweder niedrig oder fehlend). QS-7 hat auch einen Dosis-Reaktions-Kurve. (Kensil, C. R. et al., J. Immunol. (1991)).
Bisher war jedoch die Indentifizierung von Kombinationen von zwei oder mehr Quillaja-Saponinen in suboptimalen Dosen zur Erzeugung einer synergistischen Adjuvans-Wirkung auf dem Gebiet unbekannt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse eines typischen Quillaja saponaria-Rindenextrakts, der für die Reinigung der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Saponine geeignet ist. Die wichtigsten Saponin-Adjuvantien, QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21, sind auf dem Chromatogramm mit „a", „b", „c" bzw. „d" bezeichnet.
2, Tafel A zeigt die Analyse von QS-21 mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektroskopie im negativen Modus. Das vorherrschende pseudomolekulare Ion ist 1988, entsprechend m/z = [M-H]^–, worin M = C₉₂O₄₆H₁₄₈. Tafel B zeigt das Spektrum des QS-7-Peaks mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie. Das vorherrschende pseudomolekulare Ion ist 1862, entsprechend[M-H]^–. Eine mit dieser Struktur übereinstimmende Formel ist C₈₃O₄₆H₁₃₀
3, Tafel A zeigt die vorgeschlagene Struktur von QS-7. Tafel B zeigt die Struktur für QS-21, wie mittels 2-D¹H und ¹³C-NMR bestimmt. Die Variation zwischen den einzelnen Komponenten QS-21-V1 und QS-21-V2 ist durch die alternativen terminalen β-D-Apiose(QS-21-V1)- oder β-D-Xylose(QS-21-V2)-Reste angezeigt (Tafel B).
4 zeigt die zytotoxische, T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von E. G7-OVA Zielzellen, induziert durch die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (0,625 μg) und QS-7 (10 μg) im Vergleich zur CTL-Antwort, die durch identische, einzeln verabreichte Dosen dieser Saponine induziert wurde. Zum Vergleich ist die optimale, durch 20 μg QS-21 induzierte Antwort ebenfalls gezeigt.
5 zeigt die zytotoxische, T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von E. G7-OVA-Zielzellen, induziert durch die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (1,25 μg) und QS-7 (10 μg) im Ver gleich zur CTL-Antwort, die durch identische, einzeln verabreichte Dosen dieser Saponine induziert wurde. Zum Vergleich ist die optimale, durch 20 μg QS-21 induzierte Antwort ebenfalls gezeigt.
6 zeigt die zytotoxische, T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von E. G7-OVA-Zielzellen, induziert durch die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (0,625 μg) und QS-7 (20 μg) im Vergleich zur CTL-Antwort, die durch identische, einzeln verabreichte Dosen dieser Saponine induziert wurde. Zum Vergleich ist die optimale, durch 20 μg QS-21 induzierte Antwort ebenfalls gezeigt.
7 zeigt die zytotoxische, T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von E. G7-OVA-Zielzellen, induziert durch die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (1,25 μg) und QS-7 (20 μg) im Vergleich zur CTL-Antwort, die durch identische, einzeln verabreichte Dosen dieser Saponine induziert wurde. Zum Vergleich ist die optimale, durch 20 μg QS-21 induzierte Antwort ebenfalls gezeigt.
8 zeigt den mittleren log 10-Titer aus einem Durchschnitt von fünf Mäusen, die diese Mischungen erhielten, im Vergleich zu suboptimalen einzelnen Dosen.
9 zeigt die zytotoxische, T-Lymphozyten-Antwort auf die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (1,25 μg) und QS-7 (18,8 μg) im Vergleich zu Dosen von 1,25 μg bzw. 20 μg derselben, einzeln verabreichten Saponine, und zur vorhergesagten additiven Wirkung der Kombination von QS-21 (1,25 μg) und QS-7 (20 μg). Die optimale, durch 20 μg QS-21 induzierte Antwort ist zum Vergleich gezeigt.
10 zeigt die Antikörper-Antwort im Serum der Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (1,25 μg) und QS-7 (18,8 μg) im Vergleich zu Dosen von 1,25 μg bzw. 20 μg derselben, einzeln verabreichten Saponine. Die optimale, durch 20 μg QS-21 induzierte Antwort ist zum Vergleich gezeigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder entdeckten nun unerwarteter Weise, dass die Kombination suboptimaler Dosen der im Wesentlichen gereinigten QS-7- und QS-21-Saponine einen synergistischen Adjuvans-Effekt anstatt des erwarteten additiven Effekts erzeugen.
Demgemäß ist die vorliegende Erfindung auf eine Saponin-Zusammensetzung mit immun-adjuvantierender Aktivität gerichtet, welche zwei oder mehr im Wesentlichen reine Saponine umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf eine Saponin-Zusammensetzung mit immun-adjuvantierender Aktivität gerichtet, welche zwei oder mehr im Wesentlichen reine Saponine aus Quillaja saponaria in Dosen umfasst, die andernfalls für die einzelnen Saponine suboptimal sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht die neue Saponin-Zusammensetzung hauptsächlich aus im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf eine Saponin-Zusammensetzung mit immun-adjuvantierender Aktivität gerichtet, welche hauptsächlich aus im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21-V1 besteht.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf eine Saponin-Zusammensetzung mit immun-adjuvantierender Aktivität gerichtet, welche hauptsächlich aus im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21-V2 besteht.
Die vorliegende Erfindung ist weiters auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, welche zum Induzieren einer Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum geeignet ist und welche diese Saponin-Zusammensetzungen und eine immunogen wirksame Menge eines Antigens umfasst. Bei einer Ausführungsform ist das Antigen mit mindestens einem der im Wesentlichen reinen Saponine entweder direkt oder durch eine Linker-Gruppe konjugiert.
Die vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Vakzin gerichtet, welches solche pharmazeutischen Zusammensetzungen und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Verfahren zur Verstärkung einer Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum gerichtet, welches Verfahren das gemeinsame Verabreichen von zwei oder mehr im Wesentlichen reinen Saponinen aus Quillaja saponaria in Dosen, die andernfalls für die einzelnen Saponine suboptimal sind, umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Verfahren zur Verstärkung einer Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum gerichtet, welches Verfahren das gemeinsame Verabreichen einer wirksamen Menge von im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21 umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Verfahren zur Verstärkung einer Immunantwort auf ein Antigen in einem Indivi duum gerichtet, welches Verfahren das gemeinsame Verabreichen einer wirksamen Menge von im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21-V1 umfasst.
Die vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Verfahren zur Verstärkung einer Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum gerichtet, welches Verfahren das gemeinsame Verabreichen einer wirksamen Menge von im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21-V2 umfasst.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine immunogen wirksame Menge eines Antigens zusammen verabreicht mit QS-7 und entweder QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2, oder QS-7 und einer Mischung von QS-21, QS-21-V1 und/oder QS-21-V2.
Die Saponine der vorliegenden Erfindung können aus dem Baum Quillaja saponaria Molina erhalten werden.
Der Ausdruck „Saponin", wie hierin verwendet, inkludiert glycosidische Triterpenoid-Verbindungen, die Schaum in wässeriger Lösung erzeugen, hämolytische Aktivität in den meisten Fällen aufweisen und eine immun-adjuvantierende Aktivität besitzen. Die Erfindung umfasst das Saponin per se sowie natürliche und pharmazeutisch akzeptable Salze und pharmazeutisch akzeptable Derivate. Der Ausdruck „Saponin" umfasst auch biologisch aktive Fragmente davon.
Es wurde nun entdeckt, dass, wenn. Dosen der QS-7- und QS-21-(und/oder QS-21-V1- und/oder QS-21-V2)-Saponine, die zur Erreichung einer adjuvantierenden Wirkung suboptimal sind, wenn sie unabhängig von einander verabreicht werden, zusammen mit Antigen verabreicht werden, die Kombination eine synergistische adjuvantierende Wirkung hat, die beträchtlich höher ist als die von einer solchen Kombination erwartete additive Wirkung.
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die eine Kombination aus zwei oder mehr im Wesentlichen gereinigten Saponinen aus Quillaja saponaria umfassen, die zusammen in einer Mischung in Dosen verwendet werden, welche suboptimal wären, wenn man diese Saponine separat verwendete. Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen, wie immunologische Zusammensetzungen, die eine Kombination aus im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und entweder QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2, oder Fraktionen oder hydrolytische Produkte davon umfassen, welche mit einem Antigen verbunden sein können, und Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen als Vakzine und Immun-Adjuvantien. Mischungen von QS- 21, QS-21-V1 und QS-21-V2 können auch in Kombination mit QS-7 verwendet werden, im Gegensatz zu den einzelnen Saponinen.
Der Ausdruck „Immun-Adjuvans", wie hierin verwendet, bezeichnet Verbindungen, die – bei Verabreichung an ein Individuum oder beim Testen in vitro – die Immunantwort auf ein Antigen im Individuum oder Testsystem, welchem das Antigen verabreicht wird, steigern. Einige Antigene sind schwach immunogen, wenn sie alleine verabreicht werden, oder toxisch für das Individuum bei Konzentrationen, welche in diesem Individuum Immunantworten hervorrufen. Ein Immun-Adjuvans kann die Immunantwort des Individuums auf das Antigen verstärken, indem es das Antigen stärker immunogen macht. Die adjuvantierende Wrikung kann auch die Dosis des Antigens, die zum Erreichen einer Immunantwort bei diesem Individuum notwendig ist, verringern.
Mit dem Ausdruck „gemeinsam verabreichen" oder „gemeinsame Verabreichung" ist gemeint, dass jede von mindestens zwei Komponenten während eines Zeitrahmens verabreicht werden sollen, wobei die jeweiligen Zeiträume der biologischen Aktivität einander überlappen. Somit inkludiert der Ausdruck die sequentielle Verabreichung der Saponine und Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sowie deren Verabreichung zur gleichen Zeit.
Die immunogene Aktivität der Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann durch jede von einer Reihe von dem Durchschnittsfachmann bekannten Methoden bestimmt werden. Die Steigerung des Antikörper-Titers gegen ein bestimmtes Antigen nach Verabreichung der Vakzine und/oder Adjuvantien der Erfindung kann als Kriterium für eine immunogene Aktvitität verwendet werden (Dalsgaard, K., Acta Veterinia Scandinavica 69: 1–40 (1978); Scott et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77: 409–412 (1985)). Kurz gesagt wird bei einem solchen Test CD-1-Mäusen ein Saponin-Zusammensetzung/Antigen-Konjugat, welches mit verschiedenen Mengen eines potentiellen Adjuvans gemischt sein kann, intradermal injiziert. Zwei Wochen später wird den Mäusen Serum entnommen und mittels ELISA auf Anti-immunogen-Antikörper getestet.
Der Ausdruck „im Wesentlichen rein" bedeutet im Wesentlichen frei von Verbindungen, die normalerweise mit dem Saponin in seinem natürlichen Zustand verbunden sind und eine konstante und reproduzierbare chromatographische Reaktion, Elutionsprofile und biologische Aktivität aufweisen. Der Ausdruck „im Wesentlichen rein" soll künstliche oder synthetische Mischungen des Saponins mit anderen Verbindungen nicht ausschließen.
„QS-21" bezeichnet die Mischung von Komponenten QS-21-V1 und QS-21-V2, die als einziger Peak auf Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4-Säule aufscheinen (5 μm Partikelgröße, 300 Å Poren, 4,6 mm ID × 25 cml) in 40 mM Essigsäure in Methanol/Wasser (58/42, V/V). Die Fraktionen der Komponenten werden spezifisch als QS-21-V1 und QS-21-V2 bezeichnet, wenn Versuche oder Ergebnisse beschrieben werden, die an den weiter gereinigten Komponenten durchgeführt wurden.
Es gibt zahlreiche akzeptable Techniken für die Extraktion und Isolierung von Saponinen aus Quillaja saponaria Molina-Rinde. Akzeptable Vorgangsweisen zum Reinigen der Saponine der vorliegenden Erfindung aus Quillaja saponaria Molina-Rinde, Messen der Saponine auf ihre immun-adjuvantierende Aktivität und Charakterisieren der im Wesentlichen reinen Saponine sind geoffenbart im U.S. Patent Nr. 5,057,540 und in der U. S. Anmeldung Nr. 07/906,880 (erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche als U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht werden soll).
Wässrige Extrakte der Quillaja saponaria-Rinde sind auch im Handel erhältlich. Es sind dunkelbraune, schäumende Extrakte, die viele Verbindungen (Tannine, Polyphenole, Saponine) enthalten, welche mit einem Verfahren, wie einer Umkehrphasen-HPLC, analysiert werden können.
Ein Beispiel einer Umkehrphasen-HPLC-Analyse eines typischen Rindenextrakts, die sich für die Reinigung von Saponinen eignet, ist in 1 gezeigt. Die Saponin-Adjuvantien QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 sind als „a", „b", „c" bzw. „d" gezeigt. Andere unwesentliche Saponine mit adjuvantierender Aktivität wurden ebenfalls beschrieben.
Die partielle Reinigung zum Anreichern der Saponin-Fraktion und zum Entfernen des Großteils der Tannine und Polyphenole kann durch Dialyse des Extrakts gegen Wasser durch eine 10.000 Molekulargewicht-Membran erreicht werden. Die Saponin-Fraktion wird beibehalten.
Alternativ kann ein wässriger Saponin-Extrakt mit Polyvinylpolypyrrolidon vorbehandelt werden, um Tannine und Polyphenole mit hohem Molekulargewicht durch Absorption dieser Verbindungen zu entfernen.
Rest-Tannine und Polyphenole können aus der Saponin-Fraktion durch Diafiltration gegen Wasser entfernt werden. Die Saponin-Fraktion, die Micellen bildet, wird durch Ultrafiltrationsmembranen von 10.000 bis 30.000 Molekulargewicht-Ausschlussgrenzen-Porengröße zurückgehalten. Dies ergibt einen teilweise gereinigten Extrakt, der vorwiegend aus diversen Saponinen besteht.
Die Trennung von Saponinen kann mittels Chromatographie in organischen Lösungsmitteln oder organischen Lösungsmittel/Wasser-Mischungen erreicht werden. Eine Trennung der Saponine auf Siliziumdioxid wurde im U.S. Patent Nr. 5,057,540 beschrieben. Diese ergibt Saponine mit mittlerer Reinheit (an einem einzelnen Saponin angereichert, aber weniger als im Wesentlichen rein).
Alternativ können andere Lösungsmittelsysteme auf Silikagel oder die Verwendung einer Umkehrphasen-Chromatographie benützt werden, um die anfängliche Trennung der Saponine zu erreichen. Diesem anfänglichen Reinigungsschritt kann dann typischerweise eine Umkehrphasen-Chromatographie oder ein ähnlicher HPLC-Schritt folgen, um die Saponine auf nahezu Homogenität zu reinigen.
Die im Wesentlichen reinen Saponine, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können auch aus frischem Pflanzenmaterial, das aus im Wesentlichen lebenden Zellen besteht, isoliert werden, wie in der WO 95/09179 geoffenbart. Beispielsweise kann der Saponin-Extrakt aus Pflanzenzellenmaterial, das frisch aus etwa 15 jährigen Quillaja-Bäumen extrahiert wurde, gewonnen werden. Dialysierter Extrakt wird dann auf einer Ionenaustauschersäule, z. B. vom DE-52-Typ, gereinigt, gefolgt von Sephadex G50-Gelfiltration. Ultrafiltration kann anstelle einer Gelfiltration verwendet werden. Die gereinigte Saponin-Zusammensetzung wird dann einer RP-HPLC-Analyse auf einer VYDAC C4-Säule unterzogen, die mit 30–45% Acetonitril in einer 0,15% wässrigen TFA-Lösung eluiert wird.
Dieselbe Vorgangsweise kann an einem Pflanzenzellmaterial durchgeführt werden, welches mittels Gewebekultur oder Suspensions-Zellkultur erhalten wurde.
Die Saponin-Zusammensetzungen der Erfindung sind als Vakzine geeignet, welche eine aktive Immunität gegenüber Antigenen in Individuen induzieren. Vorzugsweise sind diese Individuen Menschen; die Erfindung soll jedoch nicht so einschränkend sein.
Jedes Tier, das die günstigen Auswirkungen der Vakzine der Erfindung erfahren kann, liegt im Bereich „Tiere", die gemäß der beanspruchten Erfindung behandelt werden können.
Die Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weisen bei Verabreichung adjuvantierende Wirkungen über einen weiten Bereich von Dosierungen und einen weiten Bereich von Verhältnissen zum verabreichten Antigen auf. Bei einer Ausführungsform wird die Saponin-Zusammensetzung in einem Verhältnis von Adjuvans zu Immunogen (Gew./Gew.) von 3,0 oder weniger, vorzugsweise 1,0 oder weniger, verabreicht.
Die Saponin-Zusammensetzungen der Erfindung können entweder einzeln oder gemischt mit anderen im Wesentlichen reinen Adjuvantien verabreicht werden, um die Verstärkung der Immunantwort auf ein Antigen zu erreichen.
Bei der vorliegenden Erfindung sind die beiden im Wesentlichen reinen Saponine, die bei der Erzeugung einer synergistischen Wirkung bei gemeinsamer Verabreichung wirksam sind, QS-7 und QS-21. Die Kombination von QS-7 und QS-21 kann auch zusammen mit Nicht-Saponin-Adjuvantien verabreicht werden. Solche bei der vorliegenden Erfindung nützlichen Nicht-Saponin-Adjuvantien sind Öl-Adjuvantien (z. B. Freund'sches vollständiges und unvollständiges Adjuvans), Liposome, Cholesterin, Mineralsalze (z. B. AlK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH₄(SO₄), Siliziumdioxid, Alum, Al(OH)₃, Ca₃(PO₄)₂, Kaolin und Kohlenstoff), Polynukleotide (z. B. Poly-IC- und Poly-AU-Säuren) und bestimmte natürliche Substanzen oder Derivate (z. B. Wachs D von Mycobacterium tuberculosis, Monophosphoryl-Lipid-A (Salmonella minnesota) sowie Substanzen, die man in Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis und Mitgliedern der Gattung Brucella findet), Rinderserum-Albumin, Diphtherie-Toxoid, Tetanus-Toxoid, Edestin, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, Pseudomonas-Toxin A, Choleragenoid, Cholera-Toxin, Pertussis-Toxin, Virusproteine und eukaryontische Proteine, wie Interferone, Interleukine oder Tumor-Nekrose-Faktor. Solche Proteine oder aktive Fragmente können aus natürlichen oder rekombinanten Quellen gemäß Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden. Andere bekannte immunpotenzierende Makromoleküle, die in der Ausübung der Erfindung benützt werden können, inkludieren – ohne Einschränkung darauf – Polysaccharide, DNA/RNA-Nukleotide, tRNA, nich-metabolisierbare synthetische Polymere, wie Polyvinylamin, Polymethacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, Misch-Polykondensate (mit relativ hohem Molekulargewicht) von 4'4'-Diaminodiphenyl-methan-3,3'-dicarbonsäure und 4-Nitro-2-aminobenzoesäure (vgl. Sela, M., Science 166: 1365–1374 (1969) oder Glykolipide, Lipide oder Kohlenhydrate.
Die Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können mit dem Antigen direkt oder über eine Linkergruppe verbunden sein, wie im U.S. Patent Nr. 5,057,540 und in der U. S. Anmeldung Nr. 07/906,880 (erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche als U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht werden soll) geoffenbart.
Die Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Immunantwort auf jedes beliebige Antigen zu verstärken. Typische Antigene, die für die eine Immunantwort hervorrufenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet sind, inkludieren Antigene, die von jeder der folgenden sowie von anderen Quellen stammen: Viren, wie Influenza-Virus, Herpes-simplex-Virus, Felines Leukämievirus, Felines Immundefizienz-Virus, HIV-1, HIV-2, Tollwut-Virus, Masern-Virus, Hepatitis B-Virus oder Maul- und Klauenseuche-Virus; Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Borrelia burgdorferi, Mycobacterium tuberculosis, oder Granulozyten- und Monozyten-Ehrlichia, Protozoen, wie Babeosis bovis oder Plasmodium; Krebs, z. B. Melanom; Parasiten, Prionen (z. B. Rinderwahn) und Autoimmunkrankheit. Die Antigene können Proteine, Peptide, Monosaccharide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Lipoproteine und DNA- oder RNA-Nukleotide sein. Die Proteine, Peptide und Nukleinsäuren können aus einer natürlichen Quelle gereinigt, mittels Festphasen-Synthese synthetisiert oder mittels rekombinanter Gentechnik erhalten worden sein.
Die Verabreichung der beim Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen Saponin-Zusammensetzungen kann parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan, intranasal, oral oder mit irgendwelchen anderen geeigneten Mitteln erfolgen. Die verabreichte Dosis kann von der Spezies, dem Alter, Gewicht, der Art der gleichzeitigen Behandlung, so vorhanden, und der Art des verabreichten Antigens abhängen. Die Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in jeder therapeutisch wirksamen Dosierung verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosie rung ist jede Dosierung, die dazu neigt, eine Immunantwort auf ein Antigen zu stimulieren. Vorzugsweise werden die neuen Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an einen menschlichen Patienten in einer Dosierung von 5 μg–25 μg QS-21, und von 100 μg bis 400 μg QS-7 verabreicht. Andere therapeutische Zusammensetzungen, die außerhalb dieses Bereichs liegen können (z. B. infolge der Verwendung verschiedener gereinigter Saponine, Antigene oder Spezies) können definiert werden durch Bestimmen der suboptimalen und optimalen Dosen für jedes der beiden gereinigten Saponine, wenn sie alleine verwendet werden, in einer Dosis-Bereichs-Studie mit einem bestimmten Antigen in einer bestimmten Spezies. Die therapeutische Zusammensetzung würde aus Dosen von zwei oder mehr Saponinen bestehen, die jeweils in Dosen im – bei einzelner Verwendung – suboptimalen Bereich kombiniert werden, wo jedoch dieselben Dosen in einer Mischung in einer Zusammensetzung die gewünschte Aktivität vorsehen.
Die maximal mögliche adjuvantierende Wirkung für ein Adjuvans wie QS-21, QS-7 oder andere gereinigte Saponine kann durch die Verwendung einer Dosis-Reaktionskurve für ein bestimmtes Antigen oder eine bestimmte Spezies definiert werden. Diese Kurve definiert typischerweise Dosen, die eine maximal mögliche Verstärkung der Immunantwort ergeben. Der Unterschied zwischen dieser maximalen Immunantwort und der Immunantwort auf eine nicht-adjuvantierte Formulierung kann als Wert „x" definiert werden. Dieser Wert „x" kann als Antigen-spezifischer Antiköper-Titer (nicht-log transformiert) und/oder als % der zytolytischen Aktivität infolge der zytotoxischen T-Lymphozyten bei einem bestimmten Effektor: Ziel-Verhältnis gemessen werden. Eine suboptimale Adjuvans-Antwort ist typischerweise 20% oder weniger von „x". Die gewünschte Adjuvans-Antwort ist typischerweise mindestens 50% oder mehr von „x".
Die wirksamen Saponin-Zusammensetzungen, die beim Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können in Formen wie Kapseln, flüssigen Lösungen, Suspensionen oder Elixieren zur oralen Verabreichung, oder in sterilen flüssigen Formen, wie Lösungen oder Suspensionen, verwendet werden. Irgendein inerter Träger wird vorzugsweise verwendet, wie Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, oder irgendein solcher Träger, in welchem die beim Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Verbindungen geeignete Löslichkeitseigenschaften für die Verwendung bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung haben.
Die Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können erfolgreich mit Vehikel-Adjuvantien kombiniert werden. Beispielsweise können die Saponin-Zusammensetzungen in Antigen/Saponin/Sterin (vorzugsweise Cholesterin)-immunstimulierenden Komplexen (ISCOMS) und ISCOM-Matrizen vereinigt werden, wie in Morein, B. et al., Nature 308: 457 (1984) geoffenbart. Eine annehmbare Vorgangsweise zur Herstellung von ISCOMS umfasst die Solubilisierung von amphipathischem Antigen in einem vorzugsweise nicht-ionischen Detergens, gefolgt von der Zugabe von Quillaja-Saponinen, z. B. QS-21 und QS-7, einem Sterin, z. B. Cholesterin, und Phosphatidylcholin. In Anwesenheit von amphipathischem Antigen werden ISCOM-Partikel beim Entfernen des Detergens gebildet. Wenn kein Antigen in der Mischung vorhanden ist, wird eine ISCOM-Matrix gebildet. Von ISCOM getragenes Antigen induziert eine verstärkte, zellvermittelte Immunantwort, eine Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und eine zytotoxische T-Lymphozyten(CTL)-Antwort unter MHC-Klasse I-Einschränkung.
Die Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch innerhalb polymerer Mikrokügelchen eingekapselt sein. Beispielsweise erwiesen sich polymere Mikrokügelchen, wie Poly(Milch-co-glykol)-säure (poly(lactic-co-glycolic)acid, PLGA) als eine mit QS-21 kompatible Kombination (Cleland, J. L. et al., AIDS Res. Hum. Retraviruses 10(S2): S21 (1994)).
Saponine wurden auch mit Liposomen und mit Liposomen, die aus natürlichen und synthetischen Lipiden gemäß dem U.S. Patent Nr. 4,235,877 an Fullerton hergestellt worden waren, vereinigt. Es wurden auch Liposome, die interkaliertes Quil A enthielten, als Vehikel für hydrophile Antigene verwendet (Lipford, G. B. et al., Vaccine 12(1): 73 (1994).
Die Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch in einem Set für die Immunisierung eines Individuums verwendet werden, umfassend einen kompartimentalisierten Träger, um in diesem in enger Begrenzung ein oder mehrere Behältermittel aufzunehmen, wobei ein erster Behälter eine Saponin-Zusammensetzung der Erfindung enthält. Das Set kann auch mindestens ein anderes Behältermittel inkludieren, welches ein Sapo nin-Adjuvans oder ein anderes Adjuvans, wie hierin beschrieben, enthält.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, kann diese durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele noch weiter verstanden werden.
Beispiel 1
Reinigung von QS-21 und QS-7-Zwischenprodukten durch Siliziumdioxid-Chromatographie
20 g lyophilisierter, dialysierter Quillaja saponaria-Extrakt wurde in 150 ml einer Mischung aus 62% Chloroform, 32% Methanol, 6% Wasser und 0,23% Essigsäure (V/V/V/V) gelöst. Ein Gesamtvolumen von 100 ml wurde auf eine Säule von 10 cm Durchmesser, die mit 450 g Siliziumdioxid beladen war (EM Lichroprep, Si 60, 40–63 Mikron) in derselben Lösungsmittelmischung geladen. Die separaten QS-21- und QS-7-Fraktionen wurden mittels Umkehrphasen-HPLC-Analyse identifiziert, gepoolt und mittels Rotationsverdampfung getrocknet, gefolgt von Lyophilisation. Die Gesamtausbeute des QS-21-Zwischenprodukts betrug 3,2 g von etwa 51% Reinheit mittels Umkehrphasen-HPLC. QS-7 eluierte in einer späteren Fraktion (0,66 g mit 17% Reinheit).
Beispiel 2
Reinigung von im Wesentlichen reinem QS-21 mittels C18-Chromatographie
QS-21-Zwischenprodukt, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C18-Säule (10 Mikron Partikelgröße, 300 Angstrom Porengröße, 25 cm Länge, 2,2 cm Durchmesser) weiter gereinigt. Eine 100 mg/ml Lösung von QS-21-Zwischenprodukt wurde in 38% Acetonitril/62% Wasser/0,15% Trifluoressigsäure (V/V/V) hergestellt. Ein 20 mg Aliquot wurde dann auf der Vydac-Säule unter isokratischen Chromatographiebedingungen in 38% Acetonitril/62% Wasser/0,15% Trifluoressigsäure getrennt. Sechzehn Chromatographie-Läufe unter identischen isokratischen Chromatographie-Läufen wurden durchgeführt. Fraktionen, die im Wesentlichen reines QS-21 ergaben (aus prozessinterner Umkehrphasen-HPLC-Analyse), wurden gesammelt und gepoolt für ein Gesamtvolumen von 930 ml. Dieses wurde durch Zugabe von Wasser von HPLC-Güte auf 1860 ml verdünnt. Der verdünnte Pool wurde auf eine Vydac C18-Säule (20–30 Mikron, 15 cm lang × 2,5 cm Innendurchmesser) geladen, die in Wasser äquilibriert wurde. Der verdünnte Pool wurde auf die Säu le mit 10 ml/Minute geladen, in 100% Wasser weitere 30 Minuten lang bei 10 ml/Minute laufen lassen, und dann wurde das QS-21 mit einem linearen Gradienten von 100% Wasser zu 100% Methanol über 60 Minuten eluiert. Das QS-21 eluierte als einzelner Peak. Die QS-21/Methanol/Wasser-Mischung wurde in einen lyophilisierten Kolben transferiert, unter einem gleichbleibenden Stickstoffstrom zum Entfernen von Methanol eingedampft und gefriergetrocknet. Die endgültige Ausbeute war 59 mg QS-21 von etwa 98% Reinheit.
Beispiel 3
Reinigung von im Wesentlichen reinem QS-7 mittels C18-Chromatographie
QS-7-Zwischenprodukt, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war, wurde auf einer Waters C18-Säule weiter gereinigt. Eine 100 mg/ml Lösung von QS-7-Zwischenprodukt wurde in Wasser gelöst. Zwanzig mg dieser Lösung wurden auf C18 (0,78 cm ID × 30 cm Länge, 10 Mikron) in einem linearen Gradienten von 80% Wasser/20% Acetonitril/0,15% Trifluoressigsäure zu 40% Wasser/60% Acetonitril/0,15% Trifluoressigsäure über 75 Minuten mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Minute eluiert. Insgesamt vier Läufe wurden durchgeführt, und die QS-7-Fraktionen wurden für eine Gesamtmenge von 19 mg von etwa 54% Reinheit vereinigt. Dieses Präparat wurde mit 4 mg/ml in Wasser gelöst und durch isokratische HPLC auf derselben Säule, die in 67% Wasser/33% Acetonitril/0,15% Trifluoressigsäure äquilibriert worden war, weiter gereinigt. Die gesammtelten Fraktionen wurden mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt und auf C18 Harz (20–30 Mikron) in einem Büchnertrichter adsorbiert und mit 90 ml Wasser gewaschen. Das QS-7 wurde dann mit 40 ml Methanol eluiert. Das Methanol wurde unter einem Stickstoffstrom eingedampft, das QS-7 wurde in Wasser wieder gelöst und lyophilisiert, was insgesamt 8 mg gereinigtes QS-7 ergab.
Andere Umkehrphasenharze, Lösungsmittel und Trennungsgradienten erwiesen sich als für die Reinigung von QS-7 und QS-21 sowie von anderen Saponinen aus Q. saponaria geeignet. (Kensil, J. Immunol. 146: 431–437 (1991)).
Beispiel 4
Charakterisierung von QS-7 und QS-21 mittels Massenspektrometrie
Verschiedene Saponine können mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. 2A zeigt die Analyse von QS-21 mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektroskopie in negativen Modus. Das vorherrschende pseudomolekulare Ion ist 1988, entsprechend m/z = [M-H]^–, worin M = C₉₂O₄₆H₁₄₈. 2B zeigt das Spektrum des QS-7-Peaks mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie. Das vorherrschende pseudomolekulare Ion ist 1862, entsprechend [M-H]^–. Eine mit dieser Struktur übereinstimmende Formel ist C₈₃O₄₆H₁₃₀.
Die Saponine aus Q. saponaria sind acetylierte bisdesmodische Triterpen-Glycoside. Die Struktur von QS-21 wurde mittels 2-D^1H und ¹³C-NMR bestimmt (Jacobsen, N. E. et al., Carbohydrate Research, Bd. 280: 1–14 (1996)). Diese Struktur ist in 3B gezeigt. Eine vorgeschlagene Struktur für QS-7 ist in 3A gezeigt.
Beispiel 5
Synergistische Adjuvans-Wirkung der gemeinsamen Verabreichung von QS-7 und QS-21
Immunologische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere im Wesentlichen reine Quillaja saponaria-Saponin-Fraktionen aufweisen, und Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzungen als Immun-Adjuvantien wurden schon früher in Kensil et al., U.S. Pat. Nr. 5,057,540 und in der gleichzeitig schwebenden U. S. Patentanmeldung Nr. 07/906,880, erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche als U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht werden soll) geoffenbart. Kensil, C. R. et al., Vaccine 2: 273–281 (1993) lehrt, dass Dosen von unter 2,5 μg QS-21 als Adjuvantien zum Hervorrufen einer Antikörper-Reaktion auf das Ovalbumin-Antigen in Mäusen wirkungslos sind. In ähnlicher Weise zeigt Newman, M. et al., J. Immunol. 148: 2357–2362 (1992) eine entsprechende QS-21-Dosis-Reaktionskurve für die zytotoxische T-Lymphozyten(CTL)-Antwort auf Ovalbumin. Wiederum ist bei 2,5 μg oder weniger die Reaktion bei Mäusen minimal.
Die vorliegenden Erfinder entdeckten nun, dass zwei im Wesentlichen reine Saponine unerwarteterweise eine synergistische adjuvantierende Wirkung erzeugen, wenn sie in suboptimalen Dosen vereinigt werden.
Die beiden Saponine, die bei Kombination in suboptimalen Dosen eine synergistische Antwort erzeugen, sind QS-7 und QS-21. Kurz gesagt wurden fünf Mischungen suboptimaler Dosen von QS-7 und QS-21 auf ihre Fähigkeit, eine synergistische Antwort zu er zeugen, getestet. Es wurde erwartet, dass die Wirkung eine additive adjuvantierende Wirkung sein würde.
Alle Versuche wurden in C57BL/6-Mäusen (weiblich, 8–12 Wochen alt) durchgeführt. Die synergistische Adjuvans-Wirkung der QS-21/QS-7-Mischungen wurde mit zwei Parametern beurteilt: (1) die Fähigkeit dieser Mischungen, die Antikörper-Titer auf ein Untereinheits-Antigen, Ovalbumin, in Mäusen zu verbessern; und (2) die Fähigkeit dieser Mischungen, eine Ovalbumin-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten(Killer-Zellen)-Antwort in Mäusen zu verbessern.
Die Versuchstechniken waren die Folgenden: Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt 1 Woche, 3 Wochen und 5 Wochen mit 0,2 ml der angegebenen Formulierungen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung subkutan immunisiert. Die Mäuse wurden in Gruppen zu 5 Tieren immunisiert. Die Seren und Milzen wurden zum Zeitpunkt 7 bis 9 Wochen geerntet. Die Seren wurden mit einem Enzym-Immunoassay auf eine Anti-Ovalbumin-Antikörper-Antwort getestet. Kurz gesagt wurde eine Immulon-Platte mit 96 Vertiefungen mit 10 μg/ml Ovalbumin in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht bei 4°C beschichtet. Diese Platten wurden mit 10% normalem Ziegenserum in PBS (Verdünnungsmittel) eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Serielle 1:10-Verdünnungen von Serum wurden in Verdünnungsmittel hergestellt und auf den Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Ein Enzym-Konjugat des Anti-Maus-IgG (oder der Anti-Maus-IgG-Unterklasse) wurde in Verdünnungsmittel verdünnt und auf der Platte inkubiert. Ein kolorimetrisches Enzym-Substrat, Tetramethylbenzidin, wurde verwendet, um auf Bindung von Anti-Ovalbumin-Antikörper zu testen. Milzen aus immunisierten Mäusen wurden verwendet, um auf die zytotoxische T-Lymphozyten(CTL)-Antwort zu testen. Die Effektorzellen für den (CTL)-Test waren mononukleare Milzzellen aus den geernteten Milzen. Die Antigenpositiven Zielzellen für den Test waren E. G7-OVA-Zellen, die eine MHC-Klasse II-Antigen-negative EL4-Maus-Zelllinie ist, die mit dem Ovalbumin-Gen transfiziert worden waren. Diese Zelllinie exprimiert ein Ovalbumin-Peptid auf MHC-Klasse I-Antigen und ist folglich ein Ziel für Ovalbumin-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (Moore, M. et al., Cell 54: 777 (1988)). EL4-Zellen wurden als eine Ovalbumin-negative Ziel-Zelllinie verwendet. Vor dem Test wurden mononukleare Milzzellen mit Antigen stimuliert, um die Reifung von Vorläufer-CTL in der Effektor-Zellpopulation zu induzieren. Die für die Stimulierung verwendeten Antigene waren mit Mitomycin C behandelte E. G7-OVA-Zellen (inkubiert mit Milzzellen in einem Verhältnis von 20:1 Milzzellen: E. G7-OVA-Zellen) oder denaturiertes Ovalbumin (25 μg/ml). Massen-Zellkultur wurde bei 37°C in einem 2 ml Volumen bei 10⁶/ml durchgeführt, wobei ergänztes RPMI 1640-Medium verwendet wurde. Zellen wurden nach einer sechstägigen Züchtung gewonnen, in frischem Medium resuspendiert und im CTL-Test verwendet. Die Ziel-Zellen (E. G7-OVA oder EL4) wurden für den CTL-Test zubereitet durch Markieren mit Na₂CrO₄ (⁵¹Cr) durch einstündige Inkubation bei 37°C in RPMI 1640 Kulturmedium mit 0,3 M Saccharose. Ein Standard-Zytotoxizitäts-Test mit 10⁴ Zielzellen pro Vertiefung und einer Titration des Effektor: Ziel-Verhältnisses von 25:1, 12:1, 6:1 und 3:1 wurde verwendet. Die Versuchsdaten wurden zu % Lyse umgewandelt. Die % Lyse der EL4-Zellen wurden von der Lyse der E. G7-OVA-Zellen subtrahiert, um die % der Antigenspezifischen Lyse zu bestimmen.
Zuerst wurden die suboptimalen Dosen der Saponin-Adjuvantien QS-7 und QS-21 bestimmt. Die 4 und 5 zeigen, dass 0,625 μg und 1,25 μg von QS-21 zum Stimulieren einer CTL-Antwort wirkungslos sind. Dagegen ist eine Dosis von 20 μg QS-21 zur Stimulierung einer CTL-Antwort hoch wirksam. Die 4 und 5 zeigen, dass 10 und 20 μg QS-7 zum Stimulieren einer starken CTL-Antwort wirkungslos sind.
Diese suboptimalen Dosen von QS-21 und QS-7 wurden dann wie folgt kombiniert:

Mischung QS-21 QS-7

1 0,625 μg 10 μg

2 1,25 μg 10 μg

3 0,625 μg 20 μg

4 1,25 μg 20 μg
Unerwarteterweise ergaben diese Mischungen beträchtlich höhere zytotoxische T-Lymphozyten-Antworten als durch eine einfache Additon der Antwort auf die Dosen von QS-21 und QS-7 vorhergesagt. Die Antwort ist bei der niedrigeren Dosis von QS-7 (10 μg) am drastischsten. Die Antwort für diese vier Mischungen ist in den 4–7 gezeigt.
Diese Mischungen ergaben auch unerwartet höhere Antikörper-Titer auf Ovalbumin, insbesondere in der IgG2b-Unterklasse. Der mittlere log-10-Titer aus einem Durchschnitt von fünf Mäusen, die diese Mischungen erhielten, im Vergleich zu suboptimalen Einzel-Dosen ist in 8 gezeigt. Beispielsweise ergeben weder 10 μg von QS-7 noch 0,625 μg von QS-21 einzeln einen Titer, der höher ist als ohne Adjuvans, was zeigt, dass diese Dosen suboptimal sind. Die Kombination von 0,625 μg QS-21 mit 10 μg QS-7 ergibt jedoch eine Steigerung von 1 log 10 Einheit im Titer (10-fache Steigerung im Titer), was anzeigt, dass die Kombination der beiden eine wirksame Adjuvans-Mischung ist, die eine Antwort ergibt, die mit jener einer bekannten optimalen Dosis von QS-21 (20 μg) vergleichbar ist.
Die synergistische Wirkung wurde auch bei einem anderen Versuch beobachtet, wobei dasselbe Versuchsmodell verwendet wurde. Bei diesem Versuch wurde eine Mischung aus 1,25 μg QS-21 und 18,8 μg QS-7 mit 1,25 μg QS-21 bzw. 20 μg QS-7 verglichen. Die Mischung erzeugte eine höhere zytotoxische T-Lymphozyten-Antwort und Serum-Antikörper-Antwort als für diese Saponine alleine vorhergesagt worden war (9–10).

Claims

Saponin-Zusammensetzung zur Verbesserung der Immun-Antwort auf ein Antigen bei einem Individuum, umfassend eine Kombination aus einem im Wesentlichen reinen QS-7-Saponin und einem oder mehreren im Wesentlichen reinen Saponinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) QS-21 b) QS-21 V1 und c) QS-21 V2, wobei die im Wesentlichen reinen Saponine eine immunadjuvantierende Aktivität in Anwesenheit einer immunologisch wirksamen Menge des Antigens haben.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche die im Wesentlichen reinen Saponine umfasst, wobei die im Wesentlichen reinen Saponine in suboptimalen Dosen zur Verbesserung einer Immun-Antwort bei einem Individuum vorliegen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welche eine Kombination aus einem im Wesentlichen reinen QS-7-Saponin und einem im Wesentlichen reinen QS-21-Saponin umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welche eine Kombination aus einem im Wesentlichen reinen QS-7-Saponin und einem im Wesentlichen reinen QS-21 V1-Saponin umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, welche eine Kombination aus einem im Wesentlichen reinen QS-7-Saponin und einem im Wesentlichen reinen QS-21 V2-Saponin umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Saponin-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmezeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, welche weiters eine immunologisch wirksame Menge eines Antigens umfasst, zur Verwendung als Medikament.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Antigen ein Protein, Peptid, Monosaccharid, Polysaccharid, Lipopolysaccharid, Lipoprotein oder ein Nucleotid ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Antigen von einem Virus, Bakterium, Parasiten, Prion oder Krebs stammt.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung einer Immun-Antwort auf ein Antigen.