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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der medizinischen Chemie.
Insbesondere betrifft die Erfindung Vakzine, die neue Kombinationen
von Saponin-Adjuvantien umfassen, pharmazeutische Zusammensetzungen
und Vakzine, die diese neuen Kombinationen umfassen, Verfahren zur
Verwendung dieser neuen Kombinationen zur Verstärkung der Immunantwort eines
Individuums auf ein Antigen, und die Verwendung der neuen Kombinationen
zur Erhöhung
der Immunogenität
von Vakzinen.
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Kurze Beschreibung des Standes der Technik
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Quillaja-Saponine
sind eine Mischung von aus der Rinde des Baumes Quillaja saponaria
extrahierten Triterpen-Glycosiden. Sie sind seit langem als Immunstimulatoren,
die als Vakzin-Adjuvantien
verwendbar sind, anerkannt (Campbell, J. B., und Peerbaye, Y. A.,
Res. Immunol. 143(5): 526–530
(1992)), und eine Reihe im Handel erhältlicher komplexer Saponin-Extrakte
wurde als Adjuvantien verwendet. Rohe Saponine wurden in großem Umfang
als Adjuvantien in Vakzinen gegen die Maul- und Klauenseuche und
bei der Verstärkung der
schützenden
Immunität, übermittelt
durch Versuchsvakzine gegen Protozoen-Parasiten, wie Trypanosoma cruzi-Plasmodium
und auch der humoralen Antwort auf rote Blutzellen von Schafen (sheep
red blond cells, SRBC) verwendet. (Bomford, Int. Arch. Allerg. Appl.
Immun. 67: 127 (1982)).
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Die
ersten im Handel erhältlichen
Quillaja-Saponin-Adjuvantien
waren rohe Extrakte, welche wegen ihrer Variabilität für eine Verwendung
in der tierärztlichen
Praxis oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen für den Menschen
nicht erwünscht
waren. Ein früher
Versuch, Quillaja-Saponin-Adjuvantien zu reinigen, wurde von Dalsgaard
unternommen, Archiv für
die gesamte Virusforschung 44: 243(1974). Dalsgaard unternahm eine
teilweise Reinigung eines wässrigen
Extrakts des Saponin-Adjuvans-Materials
von Quillaja saponaria Molina. Während
jedoch Dalsgaards Präparat, „Quil-A", eine eindeutige
Verbesserung gegenüber
den früher
im Handel erhältlichen
Saponinen war, wies es noch immer eine beträchtliche Heterogenität auf.
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Eine
spätere
Analyse auf dem Weg über
Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
zeigte, dass Quil A tatsächlich
eine heterogene Mischung strukturell verwandter Verbindungen war.
(
U.S. Patent Nr. 5,057,540 ; Kersen,
G. F. A. et al., Infect. Im mun. 56: 432–438 (1988); Kensil, C. R.
et al., J. Immunol. 146: 431–437
(1991); Kensil, C. R. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 199: 1423–1427 (1991)).
Es waren jedoch nicht alle dieser Saponine als Adjuvantien wirksam.
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Die
vier am meisten vorherrschenden gereinigten Quillaja-Saponine sind QS-7,
QS-17, QS-18 und QS-21 (alternativ als QA-7, QA-17, QA-18 und QA-21
identifiziert). Diese Saponine wurden mittels HPLC und Niederdruck-Siliziumdioxid-Chromatographie
gereinigt und erwiesen sich als adjuvantierend aktiv, obwohl sie sich
in ihren biologischen Aktivitäten,
wie Hämolyse
und Toxizität
in Mäusen,
unterschieden. Insbesondere QS-21 und QS-7 erwiesen sich in Mäusen als
am wenigsten toxisch. (Kensil, C. R. et al., J. Immunol. 146: 431–437 (1991)).
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Wegen
seiner starken adjuvantierenden Aktivität und geringen Toxizität wurde
QS-21 (im Handel als das „Stimulon®"-Adjuvans erhältlich)
als ein nützliches
immunologisches Adjuvans identifiziert. (Kensil, C. R. et al., „Structural
and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21," in Vacccine Design:
The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M.
J., Hrsg., Plenum Press, New York (1995)). QS-21 ist ein komplexes
Triterpenglykosid der Quillasäure.
QS-21 ist am Triterpen-Kohlenstoff 3, Triterpen-Kohlenstoff 28 und
Kohlenstoff 5 der zweiten Fettacyl-Einheit in einer Fettsäure-Domäne glycosyliert.
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In
jüngerer
Zeit wurde QS-21 weiter gereinigt, wobei die hydrophile Interaktionschromatographie
(HILIC) verwendet wurde, und in zwei Peaks, QS-21-V1 und QS-21-V2,
aufgetrennt, welche sich als chemisch verschiedene Verbindungen
erwiesen. In C57b1/6-Mäusen,
die mit Vakzinen immunisiert worden waren, welche aus Ovalbumin
und entweder QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2 bestanden, sind beide
der einzelnen Komponenten QS-21-V1 und QS-21-V2 in der adjuvantierenden Wirkung
dem ursprünglichen
QS-21-Peak vergleichbar
(enthaltend eine Mischung von 3: 2 QS-21-V1 und QS-21-V2) für das Bonstern
der IgG-Unterklassen IgG1, IgG2b und IgG2, sowie für den gesamten
IgG-Titer. (Gleichzeitig schwebende U. S. Patentanmeldung Nr. 07/906,880,
erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche
als
U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht
werden soll, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme mit
eingeschlossen ist).
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Quillaja-Saponine
sind von Saponinen, die von anderen Pflan zenarten stammen, strukturell
verschieden. Zwei strukturelle Merkmale, die Quillaja-Saponine von
jenen anderer Pflanzenarten unterscheiden, sind eine Fettsäure-Domäne und ein
Triterpenaldehyd am Kohlenstoff 4 des Triterpens. (Kensil, C. R.
et al., „Structural
and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21," in Vaccine Design:
The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M.
J., Hrsg., Plenum Press, New York (1995)). Modifikationen am Aldehyd
am Triterpen weisen dafauf hin, dass diese funktionelle Gruppe beim
Adjuvans-Mechanismus
eine Rolle spielen könnte
(Soltysik, S. et al., Vaccine 13(15): 1403–1410 (1995)).
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Es
zeigte sich, dass Quillaja-Saponine, insbesondere QS-7, QS-17, QS-18
und QS-21, ausgezeichnete Stimulatoren der Antikörper-Antwort auf lösliche T-abhängige Protein-Antigene, „Untereinheits-Antigene", sind, welche nur
wenig immunogen sind und ein starkes Adjuvans zur Maximierung der
Immunantworten benötigen.
Beispiele für
gereinigte Untereinheits-Antigene, bei welchen Saponin-Adjuvantien
die IgG-Antwort in Mäusen
verstärken,
inkludieren das Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin
(keyhole limpet hemocyanin, KLH), HIV-1 gp120 (Bomford, R. et al.
AIDS Res. Hum. Retroviruses 8: 1765 (1992)), und Influenza-Nukleoprotein (Brett,
S. et al., Immunology 80: 306 (1993)). Es zeigte sich auch, dass
QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 starke Antikörper-Antworten bei Mäusen auf
die Antigene Rinderserum-Albumin und Cytochrom b5 stimulieren (Kensil,
C. R. et al., J. Immunol. 146: 431 (1991)). Die Höhe der von
diesen gereinigten Saponinen induzierten Antikörper-Antwort war mit anderen üblicherweise
verwendeten Adjvuantien, z. B. dem kompletten Freund'schen Adjuvans, vergleichbar,
und Aluminiumhydroxid überlegen.
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Es
zeigte sich auch, dass QS-21 die Antikörper-Antwort auf T-unabhängige Antigene
verstärkt,
einschließlich
unkonjugierter bakterieller Polysaccharide (White A. C. et al., „A purified
saponin acts as an adjuvant for a T-independent antigen, in Immunobiology
of Proteins and Peptides, Bd. VI (M. Z. Atassi, Hrsg.), Plenum Press,
New York, S. 207–210
(1991)). Die Immunogenität
des Vakzins wurde durch Konjugation des Diphtherie-Toxoids mit dem
Polysaccharid weiter verstärkt.
QS-21 verbesserte die Antikörper-Antwort
auf das Polysaccharid sowie auf den Träger, einschließlich der
IgG2a, IgG2b und IgG3-Antworten (Coughlin, R. T. et al., Vaccine
13(1): 17–21
(1995)).
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Die
Fähigkeit
von Adjuvantien, die Isotyp-Verteilung und IgG-Unterklassen-Verteilung
der Antikörper-Antwort
auf ein Antigen durch die Förderung
der Ig-Unterklassen-Umschaltung („Ig subclass switching") zu modulieren,
hat wichtige Implikationen für
die Immunität
gegen viele Bakterien- und Virus-Vakzine. QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 stimulieren
die IgG2a-Antwort auf Cytochrom b5 nach
Verabreichung mit Saponin-Dosen von 20 μg (Kensil C. R. et al., J. Immunol.
146: 431 (1991)). In dieser Hinsicht verschiebt QS-21 vorwiegende
IgG1-Antworten zu einem Profil, welches signifikante IgG2b- und
IgG2a-Antworten inkludiert. Zum Beispiel zeigte es sich, dass QS-21
Antigen-spezifisches IgG2a gegen eine Reihe von Antigenen stimuliert,
einschließlich
der äußeren Oberflächen-Proteine
(„outer
surface Proteins")
OspA und OspB von Borrelia burgdorferi, (Ma, J. et al., Vaccine
12(10): 925 (1994), Felines Leukämievirus-(FeLV)-Hüllen-gp70
(Kensil, C. R. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 10: 1423 (1991)),
humanes Cytomegalovirus (HCMV)-Hüllen-Protein
gB (Britt, W. et al., J. infect. Dis. 171: 18 (1995), respiratorisches
Syncytial-Virus
(RSV) gereinigtes Fusionsprotein (Hancock, G. E. et al., Vaccine
13(4): 391 (1995)), und Tetanus-Toxoid (Coughlin, R. T. et al.,
Vaccine 13(1): 17 (1995)). Es zeigte sich, dass QS-21 auch boosterfähige Antikörper-Antworten
induziert (Britt et al., J. Infect. Dis. 171: 18–25 (1995); Helling et al.,
Cancer Res. 55: 2783–2788
(1995)).
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Die
Fähigkeit
des QS-21-Adjuvans, nach Immunisierung mit löslichen Proteinen hinsichtlich
des Klasse I-Haupthistokompatibilitätskomplex-(major
histocompatibility complex, MHC)-Antigens eingeschränkte zytotoxische
T-Lymphozyten-Antworten
(CTL) zu induzieren, ist ein Charakteristikum der Saponin-Adjuvantien. Eine
Reihe von Studien zeigte die Fähigkeit
von QS-21, starke zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antworten auf verschiedene
Antigene einschließlich
Ovalbumin zu induzieren(Wu, J.-Y. et al., Cell. Immunol. 154: 394–406 (1994);
Newman, M. J. et al., J. Immunol. 148(8): 2357–2362 (1992)), rekombinantes
HIV-1 gp160-Protein (Wu, J.-Y. et al., J. Immunol. 148: 1519 (1992)),
und Untereinheit SIVmac251 gag und env (Newman,
M. J. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 10(7): 853 (1994)).
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Die
meisten der Saponin-Adjuvans-Studien wurden in Mäusen durchgeführt. Die
Adjuvans-Aktivität von
Saponinen ist jedoch nicht auf Mäuse
eingeschränkt;
sie wurde auch bei Meerschwein chen, Kaninchen, Schweinen, Schafen,
Rindern und nicht-menschlichen
Primaten nachgewiesen. Eine adjuvantierende Wirkung von QS-21 wurde
bei Katzen, Meerschweinchen, Hunden, nicht-menschlichen Primaten und Menschen beobachtet.
(Kensil, C. R. et al., „Structural
and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21,", in Vaccine Design:
The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M.
J. Hrsg., Plenum Press, New York (1995)).
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Menschliche
Versuche der Phase 1 von QS-21 mit GM2-Gangliosid-Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Konjugat-Vakzin wurden bei
Patienten mit malignem Melanom durchgeführt (Livingston, P. O. et al.,
Vaccine 12: 1275–1280
(1994). Es wurde eine erhöhte
Immunogenität
nach Verabreichung mit QS-21-Adjuvans beobachtet (Helling, F. et
al., Cancer Res. 55: 2783–2788
(1995)). Bei einem anderen Satz klinischer Versuche erwies sich
QS-21 als starkes immunologisches Adjuvans, das die serologische
Antwort von Melanom-Patienten auf den murinen antiidiotypischen
Antikörper
MELIMMUNE-1 signifikant erhöhte
(Livingston, P. O. et al., Vaccine Res. 4(2): 87 (1995)).
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In
einer Reihe von Studien wird die Verwendung von Quillaja-Saponinen, insbesondere
QS-21, in Verbindung mit anderen Adjuvantien behandelt. Zum Beispiel
zeigte es sich, dass QS-21 ein wirksames Koadjuvans mit auf Aluminiumhydroxid
(Alum) absorbierten Antigenen ist. (Ma, J.-Y. et al., Vaccine 12(10):
925–933 (1994);
Newman, J. et al., J. Immunol. 148(8): 2357–2362 (1992); Kensil, C. R.
et al., „Structural
and Immunological Characterization of the Vaccine Adjuvant QS-21," in Vaccine Design:
The Subunit and Adjuvant Approach, Powell, M. F. und Newman, M.
J. Hrsg., Plenum Press, New York (1995); Kensil et al., J. Am. Vet.
Med. Assoc. 199: 1423–1427
(1991); Wu, J.-Y. et al., J. Immunol. 148: 1519–1525 (1992); Kensil et al.,
Vaccine Res. 2: 273–281
(1993)). Außerdem
ist die Verwendung von Mischungen aus zwei oder mehr Saponin-Adjuvantien im
U.S. Patent Nr. 5,057,540 und
in der derzeit gleichzeitig schwebenden U. S. Patentanmeldung Nr. 07/906,880
(erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche
als
U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht
werden soll) behandelt.
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Die
immun-adjuvantierende Wirkung von Saponinen hängt von der Dosis ab. Je nach
dem Antigen und der Spezies, ist eine Mindestdosishöhe von QS-21
für eine
optimale Antwort notwendig. (Kensil, C. R. et al., J. Immunol. (1991);
Kensil, C. R. et al., Vaccine Res. (1993); Newman et al., J. Immunol.
(1992); Livingston, et al., Vaccine (1994)). Unterhalb dieser Mindestdosis
ist die immun-adjuvantierende Wirkung suboptimal (entweder niedrig
oder fehlend). QS-7 hat auch einen Dosis-Reaktions-Kurve. (Kensil,
C. R. et al., J. Immunol. (1991)).
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Bisher
war jedoch die Indentifizierung von Kombinationen von zwei oder
mehr Quillaja-Saponinen in suboptimalen Dosen zur Erzeugung einer
synergistischen Adjuvans-Wirkung auf dem Gebiet unbekannt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt
eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse eines typischen Quillaja saponaria-Rindenextrakts, der
für die
Reinigung der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Saponine
geeignet ist. Die wichtigsten Saponin-Adjuvantien, QS-7, QS-17,
QS-18 und QS-21,
sind auf dem Chromatogramm mit „a", „b", „c" bzw. „d" bezeichnet.
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2, Tafel A zeigt die Analyse von QS-21
mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektroskopie
im negativen Modus. Das vorherrschende pseudomolekulare Ion ist
1988, entsprechend m/z = [M-H]–, worin M = C92O46H148.
Tafel B zeigt das Spektrum des QS-7-Peaks mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie.
Das vorherrschende pseudomolekulare Ion ist 1862, entsprechend[M-H]–.
Eine mit dieser Struktur übereinstimmende
Formel ist C83O46H130
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3, Tafel A zeigt die vorgeschlagene Struktur
von QS-7. Tafel B zeigt die Struktur für QS-21, wie mittels 2-D1H und 13C-NMR bestimmt. Die
Variation zwischen den einzelnen Komponenten QS-21-V1 und QS-21-V2
ist durch die alternativen terminalen β-D-Apiose(QS-21-V1)- oder β-D-Xylose(QS-21-V2)-Reste
angezeigt (Tafel B).
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4 zeigt
die zytotoxische, T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von E. G7-OVA Zielzellen,
induziert durch die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (0,625 μg) und QS-7
(10 μg)
im Vergleich zur CTL-Antwort, die durch identische, einzeln verabreichte
Dosen dieser Saponine induziert wurde. Zum Vergleich ist die optimale,
durch 20 μg
QS-21 induzierte Antwort ebenfalls gezeigt.
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5 zeigt
die zytotoxische, T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von E. G7-OVA-Zielzellen,
induziert durch die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (1,25 μg) und QS-7
(10 μg)
im Ver gleich zur CTL-Antwort, die durch identische, einzeln verabreichte
Dosen dieser Saponine induziert wurde. Zum Vergleich ist die optimale,
durch 20 μg
QS-21 induzierte Antwort ebenfalls gezeigt.
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6 zeigt
die zytotoxische, T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von E. G7-OVA-Zielzellen,
induziert durch die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (0,625 μg) und QS-7
(20 μg)
im Vergleich zur CTL-Antwort, die durch identische, einzeln verabreichte
Dosen dieser Saponine induziert wurde. Zum Vergleich ist die optimale,
durch 20 μg
QS-21 induzierte Antwort ebenfalls gezeigt.
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7 zeigt
die zytotoxische, T-Lymphozyten-vermittelte Lyse von E. G7-OVA-Zielzellen,
induziert durch die Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (1,25 μg) und QS-7
(20 μg)
im Vergleich zur CTL-Antwort, die durch identische, einzeln verabreichte
Dosen dieser Saponine induziert wurde. Zum Vergleich ist die optimale,
durch 20 μg
QS-21 induzierte Antwort ebenfalls gezeigt.
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8 zeigt
den mittleren log 10-Titer aus einem Durchschnitt von fünf Mäusen, die
diese Mischungen erhielten, im Vergleich zu suboptimalen einzelnen
Dosen.
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9 zeigt
die zytotoxische, T-Lymphozyten-Antwort auf die Kombination suboptimaler
Dosen von QS-21 (1,25 μg)
und QS-7 (18,8 μg)
im Vergleich zu Dosen von 1,25 μg
bzw. 20 μg
derselben, einzeln verabreichten Saponine, und zur vorhergesagten
additiven Wirkung der Kombination von QS-21 (1,25 μg) und QS-7 (20 μg). Die optimale,
durch 20 μg
QS-21 induzierte Antwort ist zum Vergleich gezeigt.
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10 zeigt
die Antikörper-Antwort
im Serum der Kombination suboptimaler Dosen von QS-21 (1,25 μg) und QS-7
(18,8 μg)
im Vergleich zu Dosen von 1,25 μg
bzw. 20 μg
derselben, einzeln verabreichten Saponine. Die optimale, durch 20 μg QS-21 induzierte
Antwort ist zum Vergleich gezeigt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
Anmelder entdeckten nun unerwarteter Weise, dass die Kombination
suboptimaler Dosen der im Wesentlichen gereinigten QS-7- und QS-21-Saponine
einen synergistischen Adjuvans-Effekt anstatt des erwarteten additiven
Effekts erzeugen.
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Demgemäß ist die
vorliegende Erfindung auf eine Saponin-Zusammensetzung mit immun-adjuvantierender
Aktivität
gerichtet, welche zwei oder mehr im Wesentlichen reine Saponine
umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung ist auch auf eine Saponin-Zusammensetzung mit immun-adjuvantierender Aktivität gerichtet,
welche zwei oder mehr im Wesentlichen reine Saponine aus Quillaja
saponaria in Dosen umfasst, die andernfalls für die einzelnen Saponine suboptimal
sind.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
besteht die neue Saponin-Zusammensetzung hauptsächlich aus im Wesentlichen
reinen Saponinen QS-7 und QS-21.
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Die
vorliegende Erfindung ist auch auf eine Saponin-Zusammensetzung mit immun-adjuvantierender Aktivität gerichtet,
welche hauptsächlich
aus im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21-V1 besteht.
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Die
vorliegende Erfindung ist auch auf eine Saponin-Zusammensetzung mit immun-adjuvantierender Aktivität gerichtet,
welche hauptsächlich
aus im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21-V2 besteht.
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Die
vorliegende Erfindung ist weiters auf eine pharmazeutische Zusammensetzung
gerichtet, welche zum Induzieren einer Immunantwort auf ein Antigen
in einem Individuum geeignet ist und welche diese Saponin-Zusammensetzungen
und eine immunogen wirksame Menge eines Antigens umfasst. Bei einer
Ausführungsform
ist das Antigen mit mindestens einem der im Wesentlichen reinen
Saponine entweder direkt oder durch eine Linker-Gruppe konjugiert.
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Die
vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Vakzin gerichtet, welches
solche pharmazeutischen Zusammensetzungen und einen pharmazeutisch
akzeptablen Träger
umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Verfahren zur Verstärkung einer
Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum gerichtet, welches
Verfahren das gemeinsame Verabreichen von zwei oder mehr im Wesentlichen
reinen Saponinen aus Quillaja saponaria in Dosen, die andernfalls
für die
einzelnen Saponine suboptimal sind, umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Verfahren zur Verstärkung einer
Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum gerichtet, welches
Verfahren das gemeinsame Verabreichen einer wirksamen Menge von
im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21 umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Verfahren zur Verstärkung einer
Immunantwort auf ein Antigen in einem Indivi duum gerichtet, welches
Verfahren das gemeinsame Verabreichen einer wirksamen Menge von
im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21-V1 umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung ist weiters auf ein Verfahren zur Verstärkung einer
Immunantwort auf ein Antigen in einem Individuum gerichtet, welches
Verfahren das gemeinsame Verabreichen einer wirksamen Menge von
im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und QS-21-V2 umfasst.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine immunogen wirksame Menge eines Antigens zusammen verabreicht
mit QS-7 und entweder QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2, oder QS-7 und
einer Mischung von QS-21, QS-21-V1 und/oder QS-21-V2.
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Die
Saponine der vorliegenden Erfindung können aus dem Baum Quillaja
saponaria Molina erhalten werden.
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Der
Ausdruck „Saponin", wie hierin verwendet,
inkludiert glycosidische Triterpenoid-Verbindungen, die Schaum in
wässeriger
Lösung
erzeugen, hämolytische
Aktivität
in den meisten Fällen
aufweisen und eine immun-adjuvantierende Aktivität besitzen. Die Erfindung umfasst
das Saponin per se sowie natürliche
und pharmazeutisch akzeptable Salze und pharmazeutisch akzeptable
Derivate. Der Ausdruck „Saponin" umfasst auch biologisch
aktive Fragmente davon.
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Es
wurde nun entdeckt, dass, wenn. Dosen der QS-7- und QS-21-(und/oder QS-21-V1-
und/oder QS-21-V2)-Saponine, die zur Erreichung einer adjuvantierenden
Wirkung suboptimal sind, wenn sie unabhängig von einander verabreicht
werden, zusammen mit Antigen verabreicht werden, die Kombination
eine synergistische adjuvantierende Wirkung hat, die beträchtlich
höher ist
als die von einer solchen Kombination erwartete additive Wirkung.
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Die
Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die eine Kombination aus zwei
oder mehr im Wesentlichen gereinigten Saponinen aus Quillaja saponaria
umfassen, die zusammen in einer Mischung in Dosen verwendet werden,
welche suboptimal wären,
wenn man diese Saponine separat verwendete. Die Erfindung betrifft
Zusammensetzungen, wie immunologische Zusammensetzungen, die eine
Kombination aus im Wesentlichen reinen Saponinen QS-7 und entweder
QS-21, QS-21-V1 oder QS-21-V2, oder Fraktionen oder hydrolytische
Produkte davon umfassen, welche mit einem Antigen verbunden sein
können,
und Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen als Vakzine
und Immun-Adjuvantien. Mischungen von QS- 21, QS-21-V1 und QS-21-V2 können auch
in Kombination mit QS-7 verwendet werden, im Gegensatz zu den einzelnen
Saponinen.
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Der
Ausdruck „Immun-Adjuvans", wie hierin verwendet,
bezeichnet Verbindungen, die – bei
Verabreichung an ein Individuum oder beim Testen in vitro – die Immunantwort
auf ein Antigen im Individuum oder Testsystem, welchem das Antigen
verabreicht wird, steigern. Einige Antigene sind schwach immunogen,
wenn sie alleine verabreicht werden, oder toxisch für das Individuum
bei Konzentrationen, welche in diesem Individuum Immunantworten
hervorrufen. Ein Immun-Adjuvans kann die Immunantwort des Individuums
auf das Antigen verstärken,
indem es das Antigen stärker
immunogen macht. Die adjuvantierende Wrikung kann auch die Dosis
des Antigens, die zum Erreichen einer Immunantwort bei diesem Individuum
notwendig ist, verringern.
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Mit
dem Ausdruck „gemeinsam
verabreichen" oder „gemeinsame
Verabreichung" ist
gemeint, dass jede von mindestens zwei Komponenten während eines
Zeitrahmens verabreicht werden sollen, wobei die jeweiligen Zeiträume der
biologischen Aktivität
einander überlappen.
Somit inkludiert der Ausdruck die sequentielle Verabreichung der
Saponine und Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
sowie deren Verabreichung zur gleichen Zeit.
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Die
immunogene Aktivität
der Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann durch jede
von einer Reihe von dem Durchschnittsfachmann bekannten Methoden
bestimmt werden. Die Steigerung des Antikörper-Titers gegen ein bestimmtes
Antigen nach Verabreichung der Vakzine und/oder Adjuvantien der
Erfindung kann als Kriterium für
eine immunogene Aktvitität
verwendet werden (Dalsgaard, K., Acta Veterinia Scandinavica 69:
1–40 (1978);
Scott et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun. 77: 409–412 (1985)).
Kurz gesagt wird bei einem solchen Test CD-1-Mäusen ein Saponin-Zusammensetzung/Antigen-Konjugat,
welches mit verschiedenen Mengen eines potentiellen Adjuvans gemischt
sein kann, intradermal injiziert. Zwei Wochen später wird den Mäusen Serum
entnommen und mittels ELISA auf Anti-immunogen-Antikörper getestet.
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Der
Ausdruck „im
Wesentlichen rein" bedeutet
im Wesentlichen frei von Verbindungen, die normalerweise mit dem
Saponin in seinem natürlichen
Zustand verbunden sind und eine konstante und reproduzierbare chromatographische
Reaktion, Elutionsprofile und biologische Aktivität aufweisen.
Der Ausdruck „im
Wesentlichen rein" soll
künstliche
oder synthetische Mischungen des Saponins mit anderen Verbindungen
nicht ausschließen.
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„QS-21" bezeichnet die Mischung
von Komponenten QS-21-V1 und QS-21-V2, die als einziger Peak auf
Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C4-Säule aufscheinen (5 μm Partikelgröße, 300 Å Poren,
4,6 mm ID × 25
cml) in 40 mM Essigsäure
in Methanol/Wasser (58/42, V/V). Die Fraktionen der Komponenten
werden spezifisch als QS-21-V1 und QS-21-V2 bezeichnet, wenn Versuche
oder Ergebnisse beschrieben werden, die an den weiter gereinigten
Komponenten durchgeführt
wurden.
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Es
gibt zahlreiche akzeptable Techniken für die Extraktion und Isolierung
von Saponinen aus Quillaja saponaria Molina-Rinde. Akzeptable Vorgangsweisen zum
Reinigen der Saponine der vorliegenden Erfindung aus Quillaja saponaria
Molina-Rinde, Messen der Saponine auf ihre immun-adjuvantierende
Aktivität
und Charakterisieren der im Wesentlichen reinen Saponine sind geoffenbart
im
U.S. Patent Nr. 5,057,540 und
in der U. S. Anmeldung Nr. 07/906,880 (erteilt, mit eingezahlter
Veröffentlichungsgebühr, welche
als
U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht
werden soll).
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Wässrige Extrakte
der Quillaja saponaria-Rinde sind auch im Handel erhältlich.
Es sind dunkelbraune, schäumende
Extrakte, die viele Verbindungen (Tannine, Polyphenole, Saponine)
enthalten, welche mit einem Verfahren, wie einer Umkehrphasen-HPLC,
analysiert werden können.
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Ein
Beispiel einer Umkehrphasen-HPLC-Analyse eines typischen Rindenextrakts,
die sich für
die Reinigung von Saponinen eignet, ist in 1 gezeigt.
Die Saponin-Adjuvantien QS-7, QS-17, QS-18 und QS-21 sind als „a", „b", „c" bzw. „d" gezeigt. Andere
unwesentliche Saponine mit adjuvantierender Aktivität wurden ebenfalls
beschrieben.
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Die
partielle Reinigung zum Anreichern der Saponin-Fraktion und zum
Entfernen des Großteils
der Tannine und Polyphenole kann durch Dialyse des Extrakts gegen
Wasser durch eine 10.000 Molekulargewicht-Membran erreicht werden.
Die Saponin-Fraktion wird beibehalten.
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Alternativ
kann ein wässriger
Saponin-Extrakt mit Polyvinylpolypyrrolidon vorbehandelt werden,
um Tannine und Polyphenole mit hohem Molekulargewicht durch Absorption
dieser Verbindungen zu entfernen.
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Rest-Tannine
und Polyphenole können
aus der Saponin-Fraktion durch Diafiltration gegen Wasser entfernt
werden. Die Saponin-Fraktion,
die Micellen bildet, wird durch Ultrafiltrationsmembranen von 10.000 bis
30.000 Molekulargewicht-Ausschlussgrenzen-Porengröße zurückgehalten. Dies ergibt einen
teilweise gereinigten Extrakt, der vorwiegend aus diversen Saponinen
besteht.
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Die
Trennung von Saponinen kann mittels Chromatographie in organischen
Lösungsmitteln
oder organischen Lösungsmittel/Wasser-Mischungen
erreicht werden. Eine Trennung der Saponine auf Siliziumdioxid wurde
im
U.S. Patent Nr. 5,057,540 beschrieben.
Diese ergibt Saponine mit mittlerer Reinheit (an einem einzelnen
Saponin angereichert, aber weniger als im Wesentlichen rein).
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Alternativ
können
andere Lösungsmittelsysteme
auf Silikagel oder die Verwendung einer Umkehrphasen-Chromatographie
benützt
werden, um die anfängliche
Trennung der Saponine zu erreichen. Diesem anfänglichen Reinigungsschritt
kann dann typischerweise eine Umkehrphasen-Chromatographie oder
ein ähnlicher
HPLC-Schritt folgen,
um die Saponine auf nahezu Homogenität zu reinigen.
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Die
im Wesentlichen reinen Saponine, die bei der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, können
auch aus frischem Pflanzenmaterial, das aus im Wesentlichen lebenden
Zellen besteht, isoliert werden, wie in der
WO 95/09179 geoffenbart. Beispielsweise
kann der Saponin-Extrakt aus Pflanzenzellenmaterial, das frisch aus
etwa 15 jährigen
Quillaja-Bäumen
extrahiert wurde, gewonnen werden. Dialysierter Extrakt wird dann
auf einer Ionenaustauschersäule,
z. B. vom DE-52-Typ, gereinigt, gefolgt von Sephadex G50-Gelfiltration.
Ultrafiltration kann anstelle einer Gelfiltration verwendet werden.
Die gereinigte Saponin-Zusammensetzung
wird dann einer RP-HPLC-Analyse auf einer VYDAC C4-Säule unterzogen,
die mit 30–45%
Acetonitril in einer 0,15% wässrigen
TFA-Lösung
eluiert wird.
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Dieselbe
Vorgangsweise kann an einem Pflanzenzellmaterial durchgeführt werden,
welches mittels Gewebekultur oder Suspensions-Zellkultur erhalten
wurde.
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Die
Saponin-Zusammensetzungen der Erfindung sind als Vakzine geeignet,
welche eine aktive Immunität
gegenüber
Antigenen in Individuen induzieren. Vorzugsweise sind diese Individuen
Menschen; die Erfindung soll jedoch nicht so einschränkend sein.
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Jedes
Tier, das die günstigen
Auswirkungen der Vakzine der Erfindung erfahren kann, liegt im Bereich „Tiere", die gemäß der beanspruchten
Erfindung behandelt werden können.
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Die
Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung weisen bei
Verabreichung adjuvantierende Wirkungen über einen weiten Bereich von
Dosierungen und einen weiten Bereich von Verhältnissen zum verabreichten
Antigen auf. Bei einer Ausführungsform
wird die Saponin-Zusammensetzung in einem Verhältnis von Adjuvans zu Immunogen
(Gew./Gew.) von 3,0 oder weniger, vorzugsweise 1,0 oder weniger,
verabreicht.
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Die
Saponin-Zusammensetzungen der Erfindung können entweder einzeln oder
gemischt mit anderen im Wesentlichen reinen Adjuvantien verabreicht
werden, um die Verstärkung
der Immunantwort auf ein Antigen zu erreichen.
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Bei
der vorliegenden Erfindung sind die beiden im Wesentlichen reinen
Saponine, die bei der Erzeugung einer synergistischen Wirkung bei
gemeinsamer Verabreichung wirksam sind, QS-7 und QS-21. Die Kombination
von QS-7 und QS-21 kann auch zusammen mit Nicht-Saponin-Adjuvantien
verabreicht werden. Solche bei der vorliegenden Erfindung nützlichen
Nicht-Saponin-Adjuvantien sind Öl-Adjuvantien
(z. B. Freund'sches
vollständiges
und unvollständiges
Adjuvans), Liposome, Cholesterin, Mineralsalze (z. B. AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), Siliziumdioxid,
Alum, Al(OH)3, Ca3(PO4)2, Kaolin und Kohlenstoff),
Polynukleotide (z. B. Poly-IC- und
Poly-AU-Säuren)
und bestimmte natürliche
Substanzen oder Derivate (z. B. Wachs D von Mycobacterium tuberculosis,
Monophosphoryl-Lipid-A (Salmonella minnesota) sowie Substanzen,
die man in Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis und Mitgliedern
der Gattung Brucella findet), Rinderserum-Albumin, Diphtherie-Toxoid,
Tetanus-Toxoid, Edestin, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin,
Pseudomonas-Toxin A, Choleragenoid, Cholera-Toxin, Pertussis-Toxin,
Virusproteine und eukaryontische Proteine, wie Interferone, Interleukine
oder Tumor-Nekrose-Faktor.
Solche Proteine oder aktive Fragmente können aus natürlichen
oder rekombinanten Quellen gemäß Methoden,
die dem Fachmann bekannt sind, erhalten werden. Andere bekannte
immunpotenzierende Makromoleküle,
die in der Ausübung
der Erfindung benützt
werden können,
inkludieren – ohne
Einschränkung
darauf – Polysaccharide,
DNA/RNA-Nukleotide, tRNA, nich-metabolisierbare synthetische Polymere,
wie Polyvinylamin, Polymethacrylsäure, Polyvinylpyrrolidon, Misch-Polykondensate
(mit relativ hohem Molekulargewicht) von 4'4'-Diaminodiphenyl-methan-3,3'-dicarbonsäure und 4-Nitro-2-aminobenzoesäure (vgl.
Sela, M., Science 166: 1365–1374
(1969) oder Glykolipide, Lipide oder Kohlenhydrate.
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Die
Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können mit
dem Antigen direkt oder über
eine Linkergruppe verbunden sein, wie im
U.S. Patent Nr. 5,057,540 und in der
U. S. Anmeldung Nr. 07/906,880 (erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche
als
U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht
werden soll) geoffenbart.
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Die
Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet
werden, um die Immunantwort auf jedes beliebige Antigen zu verstärken. Typische
Antigene, die für
die eine Immunantwort hervorrufenden Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung geeignet sind, inkludieren Antigene, die von jeder der
folgenden sowie von anderen Quellen stammen: Viren, wie Influenza-Virus,
Herpes-simplex-Virus, Felines Leukämievirus, Felines Immundefizienz-Virus,
HIV-1, HIV-2, Tollwut-Virus, Masern-Virus, Hepatitis B-Virus oder
Maul- und Klauenseuche-Virus; Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus anthracis, Corynebacterium
diphtheriae, Borrelia burgdorferi, Mycobacterium tuberculosis, oder
Granulozyten- und Monozyten-Ehrlichia, Protozoen, wie Babeosis bovis
oder Plasmodium; Krebs, z. B. Melanom; Parasiten, Prionen (z. B.
Rinderwahn) und Autoimmunkrankheit. Die Antigene können Proteine,
Peptide, Monosaccharide, Polysaccharide, Lipopolysaccharide, Lipoproteine
und DNA- oder RNA-Nukleotide sein. Die Proteine, Peptide und Nukleinsäuren können aus
einer natürlichen
Quelle gereinigt, mittels Festphasen-Synthese synthetisiert oder
mittels rekombinanter Gentechnik erhalten worden sein.
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Die
Verabreichung der beim Verfahren der vorliegenden Erfindung nützlichen
Saponin-Zusammensetzungen kann parenteral, intravenös, intramuskulär, subkutan,
intranasal, oral oder mit irgendwelchen anderen geeigneten Mitteln
erfolgen. Die verabreichte Dosis kann von der Spezies, dem Alter,
Gewicht, der Art der gleichzeitigen Behandlung, so vorhanden, und
der Art des verabreichten Antigens abhängen. Die Saponin-Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung können
in jeder therapeutisch wirksamen Dosierung verabreicht werden. Eine
therapeutisch wirksame Dosie rung ist jede Dosierung, die dazu neigt,
eine Immunantwort auf ein Antigen zu stimulieren. Vorzugsweise werden
die neuen Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an
einen menschlichen Patienten in einer Dosierung von 5 μg–25 μg QS-21, und von 100 μg bis 400 μg QS-7 verabreicht.
Andere therapeutische Zusammensetzungen, die außerhalb dieses Bereichs liegen können (z.
B. infolge der Verwendung verschiedener gereinigter Saponine, Antigene
oder Spezies) können
definiert werden durch Bestimmen der suboptimalen und optimalen
Dosen für
jedes der beiden gereinigten Saponine, wenn sie alleine verwendet
werden, in einer Dosis-Bereichs-Studie mit einem bestimmten Antigen
in einer bestimmten Spezies. Die therapeutische Zusammensetzung
würde aus
Dosen von zwei oder mehr Saponinen bestehen, die jeweils in Dosen
im – bei
einzelner Verwendung – suboptimalen
Bereich kombiniert werden, wo jedoch dieselben Dosen in einer Mischung
in einer Zusammensetzung die gewünschte
Aktivität
vorsehen.
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Die
maximal mögliche
adjuvantierende Wirkung für
ein Adjuvans wie QS-21, QS-7 oder andere gereinigte Saponine kann
durch die Verwendung einer Dosis-Reaktionskurve für ein bestimmtes
Antigen oder eine bestimmte Spezies definiert werden. Diese Kurve
definiert typischerweise Dosen, die eine maximal mögliche Verstärkung der
Immunantwort ergeben. Der Unterschied zwischen dieser maximalen
Immunantwort und der Immunantwort auf eine nicht-adjuvantierte Formulierung kann als
Wert „x" definiert werden.
Dieser Wert „x" kann als Antigen-spezifischer
Antiköper-Titer
(nicht-log transformiert) und/oder als % der zytolytischen Aktivität infolge
der zytotoxischen T-Lymphozyten bei einem bestimmten Effektor: Ziel-Verhältnis gemessen
werden. Eine suboptimale Adjuvans-Antwort ist typischerweise 20%
oder weniger von „x". Die gewünschte Adjuvans-Antwort
ist typischerweise mindestens 50% oder mehr von „x".
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Die
wirksamen Saponin-Zusammensetzungen, die beim Verfahren der vorliegenden
Erfindung nützlich
sind, können
in Formen wie Kapseln, flüssigen
Lösungen,
Suspensionen oder Elixieren zur oralen Verabreichung, oder in sterilen
flüssigen
Formen, wie Lösungen
oder Suspensionen, verwendet werden. Irgendein inerter Träger wird
vorzugsweise verwendet, wie Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferte
Kochsalzlösung, oder
irgendein solcher Träger,
in welchem die beim Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten
Verbindungen geeignete Löslichkeitseigenschaften
für die
Verwendung bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung haben.
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Die
Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können erfolgreich
mit Vehikel-Adjuvantien kombiniert werden. Beispielsweise können die
Saponin-Zusammensetzungen in Antigen/Saponin/Sterin (vorzugsweise
Cholesterin)-immunstimulierenden
Komplexen (ISCOMS) und ISCOM-Matrizen vereinigt werden, wie in Morein,
B. et al., Nature 308: 457 (1984) geoffenbart. Eine annehmbare Vorgangsweise
zur Herstellung von ISCOMS umfasst die Solubilisierung von amphipathischem
Antigen in einem vorzugsweise nicht-ionischen Detergens, gefolgt
von der Zugabe von Quillaja-Saponinen, z. B. QS-21 und QS-7, einem
Sterin, z. B. Cholesterin, und Phosphatidylcholin. In Anwesenheit
von amphipathischem Antigen werden ISCOM-Partikel beim Entfernen
des Detergens gebildet. Wenn kein Antigen in der Mischung vorhanden
ist, wird eine ISCOM-Matrix gebildet. Von ISCOM getragenes Antigen
induziert eine verstärkte,
zellvermittelte Immunantwort, eine Überempfindlichkeitsreaktion
vom verzögerten
Typ und eine zytotoxische T-Lymphozyten(CTL)-Antwort unter MHC-Klasse
I-Einschränkung.
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Die
Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch
innerhalb polymerer Mikrokügelchen
eingekapselt sein. Beispielsweise erwiesen sich polymere Mikrokügelchen,
wie Poly(Milch-co-glykol)-säure
(poly(lactic-co-glycolic)acid, PLGA) als eine mit QS-21 kompatible
Kombination (Cleland, J. L. et al., AIDS Res. Hum. Retraviruses
10(S2): S21 (1994)).
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Saponine
wurden auch mit Liposomen und mit Liposomen, die aus natürlichen
und synthetischen Lipiden gemäß dem
U.S. Patent Nr. 4,235,877 an
Fullerton hergestellt worden waren, vereinigt. Es wurden auch Liposome,
die interkaliertes Quil A enthielten, als Vehikel für hydrophile
Antigene verwendet (Lipford, G. B. et al., Vaccine 12(1): 73 (1994).
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Die
Saponin-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch
in einem Set für
die Immunisierung eines Individuums verwendet werden, umfassend
einen kompartimentalisierten Träger,
um in diesem in enger Begrenzung ein oder mehrere Behältermittel
aufzunehmen, wobei ein erster Behälter eine Saponin-Zusammensetzung der
Erfindung enthält.
Das Set kann auch mindestens ein anderes Behältermittel inkludieren, welches
ein Sapo nin-Adjuvans oder ein anderes Adjuvans, wie hierin beschrieben,
enthält.
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Nachdem
die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, kann diese durch
Bezugnahme auf die folgenden Beispiele noch weiter verstanden werden.
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Beispiel 1
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Reinigung von QS-21 und QS-7-Zwischenprodukten
durch Siliziumdioxid-Chromatographie
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20
g lyophilisierter, dialysierter Quillaja saponaria-Extrakt wurde in
150 ml einer Mischung aus 62% Chloroform, 32% Methanol, 6% Wasser
und 0,23% Essigsäure
(V/V/V/V) gelöst.
Ein Gesamtvolumen von 100 ml wurde auf eine Säule von 10 cm Durchmesser,
die mit 450 g Siliziumdioxid beladen war (EM Lichroprep, Si 60,
40–63
Mikron) in derselben Lösungsmittelmischung
geladen. Die separaten QS-21- und QS-7-Fraktionen wurden mittels
Umkehrphasen-HPLC-Analyse identifiziert, gepoolt und mittels Rotationsverdampfung
getrocknet, gefolgt von Lyophilisation. Die Gesamtausbeute des QS-21-Zwischenprodukts
betrug 3,2 g von etwa 51% Reinheit mittels Umkehrphasen-HPLC. QS-7
eluierte in einer späteren
Fraktion (0,66 g mit 17% Reinheit).
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Beispiel 2
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Reinigung von im Wesentlichen reinem QS-21
mittels C18-Chromatographie
-
QS-21-Zwischenprodukt,
das in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde mittels präparativer
Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac C18-Säule (10 Mikron Partikelgröße, 300
Angstrom Porengröße, 25 cm
Länge, 2,2
cm Durchmesser) weiter gereinigt. Eine 100 mg/ml Lösung von
QS-21-Zwischenprodukt wurde in 38% Acetonitril/62% Wasser/0,15%
Trifluoressigsäure
(V/V/V) hergestellt. Ein 20 mg Aliquot wurde dann auf der Vydac-Säule unter
isokratischen Chromatographiebedingungen in 38% Acetonitril/62%
Wasser/0,15% Trifluoressigsäure
getrennt. Sechzehn Chromatographie-Läufe
unter identischen isokratischen Chromatographie-Läufen wurden
durchgeführt.
Fraktionen, die im Wesentlichen reines QS-21 ergaben (aus prozessinterner Umkehrphasen-HPLC-Analyse),
wurden gesammelt und gepoolt für
ein Gesamtvolumen von 930 ml. Dieses wurde durch Zugabe von Wasser
von HPLC-Güte
auf 1860 ml verdünnt.
Der verdünnte
Pool wurde auf eine Vydac C18-Säule
(20–30
Mikron, 15 cm lang × 2,5
cm Innendurchmesser) geladen, die in Wasser äquilibriert wurde. Der verdünnte Pool
wurde auf die Säu le
mit 10 ml/Minute geladen, in 100% Wasser weitere 30 Minuten lang bei
10 ml/Minute laufen lassen, und dann wurde das QS-21 mit einem linearen
Gradienten von 100% Wasser zu 100% Methanol über 60 Minuten eluiert. Das
QS-21 eluierte als einzelner Peak. Die QS-21/Methanol/Wasser-Mischung
wurde in einen lyophilisierten Kolben transferiert, unter einem
gleichbleibenden Stickstoffstrom zum Entfernen von Methanol eingedampft
und gefriergetrocknet. Die endgültige
Ausbeute war 59 mg QS-21 von etwa 98% Reinheit.
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Beispiel 3
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Reinigung von im Wesentlichen reinem QS-7
mittels C18-Chromatographie
-
QS-7-Zwischenprodukt,
das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war, wurde
auf einer Waters C18-Säule
weiter gereinigt. Eine 100 mg/ml Lösung von QS-7-Zwischenprodukt
wurde in Wasser gelöst. Zwanzig
mg dieser Lösung
wurden auf C18 (0,78 cm ID × 30
cm Länge,
10 Mikron) in einem linearen Gradienten von 80% Wasser/20% Acetonitril/0,15%
Trifluoressigsäure
zu 40% Wasser/60% Acetonitril/0,15% Trifluoressigsäure über 75 Minuten
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 ml/Minute eluiert. Insgesamt vier Läufe wurden durchgeführt, und
die QS-7-Fraktionen wurden für
eine Gesamtmenge von 19 mg von etwa 54% Reinheit vereinigt. Dieses
Präparat
wurde mit 4 mg/ml in Wasser gelöst
und durch isokratische HPLC auf derselben Säule, die in 67% Wasser/33%
Acetonitril/0,15% Trifluoressigsäure äquilibriert
worden war, weiter gereinigt. Die gesammtelten Fraktionen wurden
mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt und auf C18 Harz (20–30 Mikron)
in einem Büchnertrichter
adsorbiert und mit 90 ml Wasser gewaschen. Das QS-7 wurde dann mit
40 ml Methanol eluiert. Das Methanol wurde unter einem Stickstoffstrom
eingedampft, das QS-7 wurde in Wasser wieder gelöst und lyophilisiert, was insgesamt
8 mg gereinigtes QS-7 ergab.
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Andere
Umkehrphasenharze, Lösungsmittel
und Trennungsgradienten erwiesen sich als für die Reinigung von QS-7 und
QS-21 sowie von anderen Saponinen aus Q. saponaria geeignet. (Kensil,
J. Immunol. 146: 431–437
(1991)).
-
Beispiel 4
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Charakterisierung von QS-7 und QS-21 mittels
Massenspektrometrie
-
Verschiedene
Saponine können
mittels Massenspektrometrie identifiziert werden. 2A zeigt
die Analyse von QS-21 mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektroskopie
in negativen Modus. Das vorherrschende pseudomolekulare Ion ist
1988, entsprechend m/z = [M-H]–, worin M = C92O46H148. 2B zeigt
das Spektrum des QS-7-Peaks mittels Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie.
Das vorherrschende pseudomolekulare Ion ist 1862, entsprechend [M-H]–.
Eine mit dieser Struktur übereinstimmende
Formel ist C83O46H130.
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Die
Saponine aus Q. saponaria sind acetylierte bisdesmodische Triterpen-Glycoside.
Die Struktur von QS-21 wurde mittels 2-D1H und 13C-NMR bestimmt (Jacobsen, N. E. et al.,
Carbohydrate Research, Bd. 280: 1–14 (1996)). Diese Struktur
ist in 3B gezeigt. Eine vorgeschlagene
Struktur für
QS-7 ist in 3A gezeigt.
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Beispiel 5
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Synergistische Adjuvans-Wirkung der gemeinsamen
Verabreichung von QS-7 und QS-21
-
Immunologische
Zusammensetzungen, die eine oder mehrere im Wesentlichen reine Quillaja
saponaria-Saponin-Fraktionen aufweisen, und Verfahren zur Verwendung
solcher Zusammensetzungen als Immun-Adjuvantien wurden schon früher in Kensil
et al.,
U.S. Pat. Nr. 5,057,540 und
in der gleichzeitig schwebenden U. S. Patentanmeldung Nr. 07/906,880,
erteilt, mit eingezahlter Veröffentlichungsgebühr, welche
als
U.S. Patent Nr. 5,583,112 veröffentlicht
werden soll) geoffenbart. Kensil, C. R. et al., Vaccine 2: 273–281 (1993) lehrt,
dass Dosen von unter 2,5 μg
QS-21 als Adjuvantien zum Hervorrufen einer Antikörper-Reaktion auf das Ovalbumin-Antigen
in Mäusen
wirkungslos sind. In ähnlicher
Weise zeigt Newman, M. et al., J. Immunol. 148: 2357–2362 (1992)
eine entsprechende QS-21-Dosis-Reaktionskurve
für die
zytotoxische T-Lymphozyten(CTL)-Antwort auf Ovalbumin. Wiederum
ist bei 2,5 μg
oder weniger die Reaktion bei Mäusen
minimal.
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Die
vorliegenden Erfinder entdeckten nun, dass zwei im Wesentlichen
reine Saponine unerwarteterweise eine synergistische adjuvantierende
Wirkung erzeugen, wenn sie in suboptimalen Dosen vereinigt werden.
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Die
beiden Saponine, die bei Kombination in suboptimalen Dosen eine
synergistische Antwort erzeugen, sind QS-7 und QS-21. Kurz gesagt
wurden fünf
Mischungen suboptimaler Dosen von QS-7 und QS-21 auf ihre Fähigkeit,
eine synergistische Antwort zu er zeugen, getestet. Es wurde erwartet,
dass die Wirkung eine additive adjuvantierende Wirkung sein würde.
-
Alle
Versuche wurden in C57BL/6-Mäusen
(weiblich, 8–12
Wochen alt) durchgeführt.
Die synergistische Adjuvans-Wirkung der QS-21/QS-7-Mischungen wurde
mit zwei Parametern beurteilt: (1) die Fähigkeit dieser Mischungen,
die Antikörper-Titer
auf ein Untereinheits-Antigen, Ovalbumin, in Mäusen zu verbessern; und (2)
die Fähigkeit
dieser Mischungen, eine Ovalbumin-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten(Killer-Zellen)-Antwort
in Mäusen
zu verbessern.
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Die
Versuchstechniken waren die Folgenden: Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt 1
Woche, 3 Wochen und 5 Wochen mit 0,2 ml der angegebenen Formulierungen
in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung subkutan immunisiert.
Die Mäuse
wurden in Gruppen zu 5 Tieren immunisiert. Die Seren und Milzen
wurden zum Zeitpunkt 7 bis 9 Wochen geerntet. Die Seren wurden mit
einem Enzym-Immunoassay auf eine Anti-Ovalbumin-Antikörper-Antwort
getestet. Kurz gesagt wurde eine Immulon-Platte mit 96 Vertiefungen
mit 10 μg/ml
Ovalbumin in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) über Nacht bei 4°C beschichtet.
Diese Platten wurden mit 10% normalem Ziegenserum in PBS (Verdünnungsmittel)
eine Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Serielle 1:10-Verdünnungen
von Serum wurden in Verdünnungsmittel
hergestellt und auf den Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur
oder über
Nacht bei 4°C
inkubiert. Ein Enzym-Konjugat des Anti-Maus-IgG (oder der Anti-Maus-IgG-Unterklasse)
wurde in Verdünnungsmittel
verdünnt
und auf der Platte inkubiert. Ein kolorimetrisches Enzym-Substrat,
Tetramethylbenzidin, wurde verwendet, um auf Bindung von Anti-Ovalbumin-Antikörper zu
testen. Milzen aus immunisierten Mäusen wurden verwendet, um auf
die zytotoxische T-Lymphozyten(CTL)-Antwort zu testen. Die Effektorzellen
für den
(CTL)-Test waren mononukleare Milzzellen aus den geernteten Milzen.
Die Antigenpositiven Zielzellen für den Test waren E. G7-OVA-Zellen,
die eine MHC-Klasse II-Antigen-negative EL4-Maus-Zelllinie ist,
die mit dem Ovalbumin-Gen transfiziert worden waren. Diese Zelllinie
exprimiert ein Ovalbumin-Peptid auf MHC-Klasse I-Antigen und ist
folglich ein Ziel für
Ovalbumin-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (Moore, M. et al., Cell
54: 777 (1988)). EL4-Zellen wurden als eine Ovalbumin-negative Ziel-Zelllinie
verwendet. Vor dem Test wurden mononukleare Milzzellen mit Antigen stimuliert, um
die Reifung von Vorläufer-CTL
in der Effektor-Zellpopulation zu induzieren. Die für die Stimulierung
verwendeten Antigene waren mit Mitomycin C behandelte E. G7-OVA-Zellen
(inkubiert mit Milzzellen in einem Verhältnis von 20:1 Milzzellen:
E. G7-OVA-Zellen)
oder denaturiertes Ovalbumin (25 μg/ml).
Massen-Zellkultur
wurde bei 37°C
in einem 2 ml Volumen bei 106/ml durchgeführt, wobei
ergänztes
RPMI 1640-Medium verwendet wurde. Zellen wurden nach einer sechstägigen Züchtung gewonnen,
in frischem Medium resuspendiert und im CTL-Test verwendet. Die
Ziel-Zellen (E.
G7-OVA oder EL4) wurden für
den CTL-Test zubereitet durch Markieren mit Na2CrO4 (51Cr) durch einstündige Inkubation
bei 37°C
in RPMI 1640 Kulturmedium mit 0,3 M Saccharose. Ein Standard-Zytotoxizitäts-Test
mit 104 Zielzellen pro Vertiefung und einer
Titration des Effektor: Ziel-Verhältnisses von 25:1, 12:1, 6:1
und 3:1 wurde verwendet. Die Versuchsdaten wurden zu % Lyse umgewandelt.
Die % Lyse der EL4-Zellen wurden von der Lyse der E. G7-OVA-Zellen
subtrahiert, um die % der Antigenspezifischen Lyse zu bestimmen.
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Zuerst
wurden die suboptimalen Dosen der Saponin-Adjuvantien QS-7 und QS-21
bestimmt. Die 4 und 5 zeigen,
dass 0,625 μg
und 1,25 μg
von QS-21 zum Stimulieren einer CTL-Antwort wirkungslos sind. Dagegen
ist eine Dosis von 20 μg
QS-21 zur Stimulierung einer CTL-Antwort hoch wirksam. Die 4 und 5 zeigen,
dass 10 und 20 μg
QS-7 zum Stimulieren einer starken CTL-Antwort wirkungslos sind.
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Diese
suboptimalen Dosen von QS-21 und QS-7 wurden dann wie folgt kombiniert:
Mischung | QS-21 | QS-7 |
1 | 0,625 μg | 10 μg |
2 | 1,25 μg | 10 μg |
3 | 0,625 μg | 20 μg |
4 | 1,25 μg | 20 μg |
-
Unerwarteterweise
ergaben diese Mischungen beträchtlich
höhere
zytotoxische T-Lymphozyten-Antworten als durch eine einfache Additon
der Antwort auf die Dosen von QS-21 und QS-7 vorhergesagt. Die Antwort
ist bei der niedrigeren Dosis von QS-7 (10 μg) am drastischsten. Die Antwort
für diese
vier Mischungen ist in den 4–7 gezeigt.
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Diese
Mischungen ergaben auch unerwartet höhere Antikörper-Titer auf Ovalbumin, insbesondere in der
IgG2b-Unterklasse. Der mittlere log-10-Titer aus einem Durchschnitt
von fünf
Mäusen,
die diese Mischungen erhielten, im Vergleich zu suboptimalen Einzel-Dosen
ist in 8 gezeigt. Beispielsweise ergeben weder 10 μg von QS-7
noch 0,625 μg
von QS-21 einzeln einen Titer, der höher ist als ohne Adjuvans,
was zeigt, dass diese Dosen suboptimal sind. Die Kombination von
0,625 μg
QS-21 mit 10 μg
QS-7 ergibt jedoch eine Steigerung von 1 log 10 Einheit im Titer
(10-fache Steigerung
im Titer), was anzeigt, dass die Kombination der beiden eine wirksame
Adjuvans-Mischung ist, die eine Antwort ergibt, die mit jener einer
bekannten optimalen Dosis von QS-21 (20 μg) vergleichbar ist.
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Die
synergistische Wirkung wurde auch bei einem anderen Versuch beobachtet,
wobei dasselbe Versuchsmodell verwendet wurde. Bei diesem Versuch
wurde eine Mischung aus 1,25 μg
QS-21 und 18,8 μg QS-7
mit 1,25 μg
QS-21 bzw. 20 μg
QS-7 verglichen. Die Mischung erzeugte eine höhere zytotoxische T-Lymphozyten-Antwort
und Serum-Antikörper-Antwort
als für
diese Saponine alleine vorhergesagt worden war (9–10).