DE69818445T2

DE69818445T2 - Verwendung von verbindungen die an ein zytoplasmatischen dipeptidase binden zur potenzierung des immunantworts

Info

Publication number: DE69818445T2
Application number: DE69818445T
Authority: DE
Inventors: T. Brigitte HUBER; Tracy Schmitz; Robert Underwood
Original assignee: TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE MEDF; Tufts University
Current assignee: TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE MEDF; Tufts University
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2018-05-01
Also published as: AU724257B2; PT975359E; US6040145A; CA2289125A1; WO1998050066A1; ATE250426T1; DE69818445D1; DK0975359T3; US20050008644A1; EP0975359B1; US6692753B2; US20080026007A1; ES2207831T3; US20010055777A1; JP2002511063A; AU7274798A; EP0975359A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung viraler Infektionen unter Anwendung organischer Verbindungen, die mit T-Zell-Enzymen wechselwirken.
Eine der klassischen Marker von ausgewachsenem AIDS, resultierend aus Langzeitinfektionen mit HIV-1, ist die schwere Abreicherung von CD4⁺-T-Zellen, die eine Schlüsselkomponente des Immunsystems darstellen. Es sind Versuche unternommen worden, die CD4⁺-Zählraten von AIDS-Patienten zu erhöhen, und einige dieser Bemühungen, insbesondere die Behandlung mit Protease-Inhibitoren, sind in beachtenswertem Umfang erfolgreich gewesen. Andere Ansätze, beispielsweise die Stimulation der Immunantwort durch Impfung mit viralen Peptiden, sind weniger erfolgreich gewesen. Die Gründe für die CD4⁺-Abreicherung bei AIDS und die Beständigkeit der CD4⁺-Zellen gegenüber Stimulation durch einige Therapien, sind nicht voll verstanden.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben entdeckt, dass sich der Aktivierungszustand humaner T-Zellen durch Verbindungen beeinflussen lässt, die mit einer cytoplasmatischen, nach Prolyl spaltenden Dipeptidaseaktivität wechselwirken, die der membrangebundenen T-Zell-Serinprotease CD26 ähnlich ist, sich von dieser jedoch unterscheidet. Die in der Erfindung nützlichen Verbindungen sind Inhibitoren dieser Aktivität, die in natürlich auftretenden T-Zellen in gesunden Individuen in den Schutz der T-Zellen vor der Apoptose oder dem programmierten Zelltod involviert ist. Somit beschleunigen diese Inhibitoren in hohen Konzentrationen den Tod von T-Zellen, indem sie das schützende Enzym inhibieren. Wir haben überraschenderweise entdeckt, dass geringe Konzentrationen der Inhibitoren einen paradoxen Effekt aufweisen: Sie sind potente Stimulatoren der T-Zeltaktivität in HIV-infizierten Individuen. Die Konzentrationen des Inhibitors, die diese T-zellstimulierende Response induzieren, sind sehr niedrig (in der Größenordnung von 10^–8 bis 10^–12 M), und daher können die Inhibitoren mit minimalen Nebenwirkungen verwendet werden, sogar dann, wenn die Inhibitoren in größeren Dosen toxisch wären.
Unsere Hypothese geht dahin, dass der Widerstand, bzw. die Beständigkeit gegenüber der vollen Aktivierung, der bei T-Zellen von HIV-infizierten Individuen beobachtet wird, die Blockade der oben diskutierten cytoplasmatischen Enzymaktivität involviert. Wir nehmen an, dass das Blockieren der Aktivität, das diese cytoplasmatische Aktivität involviert, die Differenzierung von T- Zellen HIV-infizierter Individuen zu Effektorzellen verhindert, was schließlich zum T-Zelltod führt.
Somit wird nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung bereitgestellt die Verwendung einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass

(a) sie an die im Cytoplasma von Jurkat-Zellen vorhandene, nach Prolyl spaltende Dipeptidaseaktivität bindet; und
(b) sie für die Verabreichung an einen Patienten so formuliert ist, dass ihre Konzentration im Blut des Patienten 10^–8 M nicht übersteigt,

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt die Verwendung einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass:

(a) sie durch die Membran von T-Zellen zum Eintritt in das Cytoplasma hindurchtreten kann;
(b) sie an die Cytoplasmatische, nach Prolyl spaltende Dipeptidaseaktivität in einer Konzentration unterhalb von 10^–8 M bindet;
(c) die Proliferation der T-Zellen in dieser Konzentration stimuliert;
(d) sie für die Verabreichung an einen Patienten so formuliert ist, dass ihre Konzentration im Blut des Patienten 10^–8 M nicht übersteigt,

In ihren spezielleren Aspekten betrifft die Erfindung die Verwendung einer organischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass:

(a) sie die Cytoplasmatische, nach Prolyl spaltende Dipeptidaseaktivität aus T-Zellen in einer Konzentration oberhalb von 10^–3 M inhibiert;
(b) sie mit der Dipeptidaseaktivität bei einer Konzentration unterhalb von 10^–8 M interagiert bzw. wechselwirkt, wobei die Fähigkeit der Aktivität gefördert wird, die Apoptose von T-Zellen des Patienten zu inhibieren;
(c) sie durch die Membran von T-Zellen des Patienten zum Eintritt in das Cytoplasma hindurchtreten kann; und
(d) sie zur Verabreichung an einen Patienten so formuliert ist, dass ihre Konzentration im Blut des Patienten 10^–8 M nicht übersteigt,

In einem anderen spezifischeren Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt Verwendung einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass:

(a) sie die Cytoplasmatische, nach Prolyl spaltende Dipeptidaseaktivität aus T-Zellen in einer Konzentration von etwa 10^–5 M inhibiert;
(b) sie mit der Dipeptidaseaktivität in einer Konzentration unterhalb von 10^–8 M interagiert bzw. wechselwirkt, wobei die Fähigkeit der Aktivität gefördert wird, die Apoptose von T-Zellen des Patienten zu inhibieren;
(c) sie durch die Membran von T-Zellen des Patienten zum Eintritt in das T-Zell-Cytoplasma hindurchtreten kann; und
(d) sie für die Verabreichung so formuliert ist, dass ihre Konzentration im Blut eines Patienten 10^–8 M nicht übersteigt,

Die Erfindung zeichnet sich somit durch die Verwendung einer Verbindung bei der Herstellung eines Medikaments zum Stimulieren der Proliferation von T-Zellen aus einem menschlichen Patienten aus, der an einem Erkrankungszustand leidet, der durch die Unfähigkeit der T-Zellen des Patienten gekennzeichnet ist, normal auf die T-Zell-Proliferation induzierende Stimuli zu reagieren; die Verwendung involviert das In-Kontakt-Bringen der T-Zellen mit einer organischen Verbindung bei einer Konzentration unterhalb von 10^–8 M, worin die Verbindung dadurch gekennzeichnet ist, dass sie an die nach Prolyl spaltende Dipeptidaseaktivität bindet, die im Cytoplasma menschlicher T-Zellen, beispielsweise CD4⁺-Zellen oder Jurkat-Zellen, vorhanden ist.
Eine Behandlung gemäß der Erfindung kann in vitro oder in vivo erfolgen. Bei der in vivo Therapie wird die mit dem Enzym wechselwirkende Verbindung der Erfindung so verabreicht, dass die Blutkonzentration im Patienten (beispielsweise einem HIV-infizierten Patienten) unterhalb von 10^–11 liegt. Die Verbindungen können auch in vitro in geringen Konzentrationen verwendet werden, um die Proliferation nicht infizierter, nützlicher Zellen, wie CD4⁺-Zellen und CTL's zu stimulieren. In dieser Ausführungsform werden PBMC (peripheral blood mononuclear cells) aus einem Patienten isoliert und mit einer Konzentration von kleiner als 10^–8 M der Verbindung inkubiert, um die Proliferation der T-Zellen zu bewirken, die dann in den Patienten wieder eingeführt werden.
Wir nehmen an, dass die Verabreichung niedriger Konzentrationen der Inhibitoren der Erfindung einen allosteren Effekt haben kann, so dass das cytoplasmatische T-Zellenzym, bei dem es sich um ein multimeres Enzym handelt (d. h. mehrere Untereinheiten), eine erhöhte Affinität des Enzyms für sein natürliches Substrat oder seine Liganden aufweist, was es den zuvor blockierten T-Zellen gestattet, zur vollen Aktivierung vorzuschreiten und somit das Überleben, die Proliferation und Interleukin 2-Produktion gestattet. Die Stimulierung der T-Zell-Immunantworten bei HIV-infizierten Patienten gemäß der Erfindung ergibt gesteigerte Anzahlen an Immuneffektorzellen, die sowohl das HIV selbst als auch andere opportunistische Pathogene bekämpfen können.
Die Behandlung gemäß der Erfindung hat die Vorzüge der Spezifizität und geringen Toxizität, nicht nur aufgrund der niedrigen Konzentrationen an Inhibitor, die eingesetzt werden können, sondern auch weil in T-Zellen von Patienten, die nicht mit einem Virus wie HIV infiziert sind, die Inhibitoren keine merkliche Wirkung haben. Darüber hinaus erfordert die Behandlung gemäß der Erfindung vorteilhafterweise nicht notwendigerweise eine in vitro Manipulation der T-Zellen aus HIV-infizierten Patienten. Weiterhin ist keine Immunisierung erforderlich und kann die Behandlung sogar dort wirksam sein, wo HIV-Proteine mutiert sind, da die Therapie auf ein zelluläres Enzym abzielt. Die Tatsache, dass in T-Zellen, die in vitro gemäß der Erfindung behandelt wurden, kein Anstieg des Levels des HIV-Proteins p24 beobachtet wird, zeigt vermutlich an, dass die T-Zellen, die mit HIV infiziert sind, nicht durch die niedrig dosierte Inhibitorbehandlung der Erfindung stimuliert werden.
Die Erfindung gestattet außerdem die Immunisierung HIV-infizierter Patienten mit beispielsweise HIV-Peptiden. Unter normalen Umständen können solche Patienten nicht geimpft werden, und zwar aufgrund des Defekts im T-Zell-Stimulationsweg. Die Verwendung der Inhibitoren in niedrigen Dosen als Adjuvans kann die T-Zellen bzgl. der Impfung mit HIV-Antigenen, insbesondere Peptiden, ansprechbar machen.
Die Behandlung HIV-infizierter Patienten mit niedrigen Dosen an Inhibitoren gemäß der Erfindung kann auch die Aktivität anderer AIDS-Wirkstoffe, insbesondere Proteaseinhibitoren, fördern. Wir haben gefunden, dass die Behandlung gemäß der Erfindung im Allgemeinen keinen Anstieg der CD4⁺-Zählrate bei Patienten erbringt, deren CD4⁺-Zählrate bereits sehr niedrig ist, d. h. unter etwa 400. Bei solchen Patienten lässt sich die CD4⁺-Zählrate über diesen Level unter Anwendung bekannter Proteaseinhibitoren steigern, und die neu erzeugten CD4-T-Zellen, die aus einer solchen Behandlung resultieren, sind für die stimulatorischen Wirkungen der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung ganz besonders empfänglich, was zu einer optimalen Kombination der AIDS-Therapie führt. Vorzugsweise werden die Wirkstoffe oral verabreicht.
Die niedrig dosierte Verabreichung der Inhibitoren der Erfindung kann auch eingesetzt werden, um einen Hilfseffekt bzw. Adjuvanseffekt bei HIV-negativen Individuen zu erzeugen, die mit Peptiden oder anderen viralen Antigenen immunisierte werden; dieser Impfmodus kann für die Prophylaxe von HIV, wie auch gegen jedes andere virale Pathogen genutzt werden. Üblicherweise sind aussagekräftige Antworten cytolytischer T-Lymphozyten („CTL" = cytolytic T-lymphocytes) sowohl in vitro als auch in vivo mit Peptidimmunisierungen schwierig zu erzielen gewesen. Die Erfindung sollte es möglich machen, signifikante CTL-Antworten auf virale Peptide, beispielsweise Peptide von Influenza, HIV, dem humanen Papilloma-Virus und Herpespeptiden zu erzeugen. Dieser Hilfseffekt bzw. Adjuvantseffekt kann auch genutzt werden, um CTL-Antworten auf Peptidantigene aus anderen Pathogenen wie beispielsweise pathogenen Bakterien wie toxigenen E. coli und Protozoenpathogenen wie den Pathogenen, die die ursächlichen Agenzien der Malaria und der Amöbenruhr sind, zu stimulieren. Die Verbindungen werden, wenn sie als Adjuvantien genutzt werden, vorzugsweise oral verabreicht.
Die Erfindung stellt eine neue und vorteilhafte Anwendung zum Potenzieren der Immunantwort sowohl in HIV-infizierten als auch nicht infizierten Patienten bereit, die extrem niedrige Konzentrationen an Inhibitoren nutzt, die bei diesen Konzentrationen eine paradoxe Wirkung aufweisen (d. h. sie wirken als stimulierende anstatt als inhibierende Moleküle, wie sie bei höheren Konzentrationen würden). Die gemäß der Erfindung verwendeten, sehr niedrigen Konzentrationen gestatten die Behandlung mit minimalen Nebenreaktionen und minimaler Toxizität. Die Spezifizität der Behandlung der Erfindung vermeidet außerdem solche nachteilige Effekte, wie sie beispielsweise bei der Behandlung mit immunstimulierenden Verbindungen wie Interleukin 2 zu sehen sind.
Andere Merkmale und Vorzüge der Erfindung werden aus der folgenden genauen Beschreibung derselben und aus den Ansprüchen ersichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Paar von Graphen, welche die lymphozytenstimulierende Wirkung der Behandlung der Erfindung auf mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) aus HIV-infizierten und nicht infizierten Patienten zeigen. 1a zeigt die Wirkung der Verbindung auf die T-Zell-Proliferation in vitro für PBMC aus einem HIV-1⁺-Individuum und 1b zeigt die Wirkung der Verbindung auf die T-Zell-Proliferation in vitro auf PBMC aus einem HIV-1^– Individuum. Jede der 1a und 1b veranschaulicht ein representatives Experiment aus einer Gesamtmenge von 10 Experimenten.
2 ist eine Auftragung, die die T-Zell-stimulierende Wirkung zweier inhibitorischer Verbindungen veranschaulicht, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden (Datum des Experiments: 09. März 1995; Patientenidentifikationsnummer: 1655185; CD4-Antikörperzählrate: 760; und Zellzahl/Vertiefung: 0,4 × 10⁶).
3 ist eine Auftragung, welche die stimulierende Wirkung der Behandlung gemäß der Erfindung bei Lymphozyten von HIV-infizierten Patienten im Vergleich zur Behandlung unter Anwendung zweier Kontrollverbindungen zeigt (Datum des Experiments: 15. März 1995; Patientenidentifikationsnummer: 1227604; CD4-Antikörperzählrate: 230; Zellzahl/Vertiefung: 0,16 × 10⁶; und ½ Fläche einer Platte mit 96 Vertiefungen).
4 ist eine Auftragung, welche die stimulierende Wirkung der Behandlung gemäß der Erfindung an Lymphozyten von HIV-infizierten Patienten im Vergleich zur Behandlung unter Verwendung zweier Kontrollverbindungen zeigt (Datum des Experiments: 23. März 1995; Patientenidentifikationsnummer: 1586496; CD4-Antikörperzählrate: 830; Zellzahl/Vertiefung: 0,4 × 10⁶).
5 ist eine Auftragung, die die stimulierende Wirkung eines Inhibitors gemäß der Erfindung auf PBMC in vitro zeigt, wobei die Korrelation mit CD4⁺-Zählraten gezeigt ist. Die Daten sind Auftragungen des natürlichen Logarithmus des Stimulationsindex (vertikale Richtung) über den natürlichen Logarithmus der CD4⁺-Zählrate des Patienten (horizontale Richtung) zeigt (insgesamt 71 Patienten; P ≤ 0,0001; RR = 2,04 (1,5–2,9)).
6 ist ein Histogramm, das belegt, dass ein Inhibitor gemäß der Erfindung eine Dosis-abhängige Apoptose in ruhenden T-Zellen induziert (diese Dosierungen sind höher als die extrem niedrigen Dosen, die gemäß der Erfindung verwendet werden). CD19⁺B-Zellen und CD4⁺/CD8⁺-T-Zellen wurden isoliert (Reinheit > 90% bzw. > 97%). Die Zellen wurden anschließend über Nacht in Anwesenheit oder Abwesenheit von VBBP (10^–4 M oder 10^–6 M) inkubiert. Die Menge des durch die VPB-Behandlung induzierten Todes wurde mittels 7AAD-Durchflußcytometrieanalyse bestimmt. Die Daten stellen mittlere Prozentzahlen des Todes aus Doppelbestinmungen dar.
7 ist ein Histogramm, das belegt, dass ein Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung bei höheren Dosen als gemäß der Erfindung die Dosis-abhängige Apoptose sowohl in CD26⁺ als auch CD26^–-Populationen von PBMC induziert. Die CD26⁺- und CD26^–-PBMC-Populationen waren im Ergebnis gleichermaßen empfänglich gegenüber dem durch DPPN als Inhibitor induzierten Tod. Die PBMC wurden mit dem monoklonalen Anti-CD26-Antikörper, 4 EL, gefärbt und anschließend unter Anwendung eines Facstar plus dual Laser-Flowcytometers in CD26⁺- und CD26^–-Populationen sortiert. Die die höchsten Level (5%) an CD26 exprimierenden Zellen und die die geringsten Level (untere 10%) an CD26 exprimierenden Zellen wurden als die CD26⁺- bzw. CD26^–-Populationen isoliert. Die Reinheit der Populationen, untersucht mittels Färbung mit dem monoklonalen Anti-CD26-Antikörper, 134-2C2, beträgt > 90%. Die CD26⁺- und CD26^–-Populationen wurden über Nacht in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen an VBP inkubiert. Die Menge an durch die VBP-Behandlung induziertem Tod wurde mittels 7AAD-Durchflußcytometrieanalyse bestimmt. Die Daten stellen Mittelwerte des Todes aus Doppelbestimmungen dar (+/–SD).
8 ist eine Auftragung, die zeigt, dass ein Inhibitor von CD26 (val-boroPro) auch das cytoplasmatische Enzym inhibierte.
9 ist eine Auftragung, die die stimulierende Wirkung der Behandlung gemäß der Erfindung bei Lymphozyten von HIV-infizierten Patienten im Vergleich zur Behandlung unter Anwendung zweier Kontrollverbindungen zeigt. Fluorolefine induzierten keinen Zelttod. PBMC wurden über Nacht in Anwesenheit oder Abwesenheit von DPPIV-Inhibitoren, L125, einem Fluorolefin, enthaltend einen N-peptidischen O-Acylhydroxylamin-Inhibitor, oder VBP kultiviert. Die Menge des induzierten Zelttodes wurde mittels 7 AAD-DurchflußCytometrieanalyse ermittelt. Die Daten stellen mittlere prozentuale Zelttode aus Doppelbestimmungen dar.
Genaue Beschreibung
Therapeutische Verbindungen
Jede organische Verbindung kann gemäß der Erfindung genutzt werden, die die folgenden Eigenschaften aufweist: (1) sie ist zum Hindurchtreten bzw. Überqueren der Membran humaner T-Zellen befähigt, um das Cytoplasma zu erreichen, wo die Verbindung (2) mit der cytoplasmatischen Dipeptidase interagieren kann, die in den T-Zellen vorliegt, um (3) die Aktivierung/Proliferation von T-Zellen (und am meisten bevorzugt CD4-Zellen oder CTLs) in Konzentrationen unterhalb von 10^–8 M zu stimulieren.
Ein einfaches Sichtungsverfahren wird im Folgenden für die Identifizierung von Verbindungen beschrieben, die mögliche therapeutische Verbindungen gemäß der Erfindung darstellen.
Substrat- und Enzympräparation
Der erste Schritt besteht in der Bereitstellung einer cytoplasmatischen Enzympräparation. Die Präparation muss keine Enzymprobe sein; ein roher cytoplasmatischer Extrakt ist zum Sichten von Verbindungen auf die gewünschte Aktivität ausreichend. Der Extrakt kann aus jeder menschlichen T-Zelllinie hergestellt werden, die auf CD26 negativ ist; ein Beispiel einer geeigneten Zelllinie ist die im Handel erhältliche Jurkat-Zelllinie.
Ein geeigneter, Enzym enthaltender Zellextrakt kann wie folgt hergestellt werden. Zunächst werden Jurkat-Zellen (10⁶–10¹¹ Zellen) gezogen und ein Zellniederschlag wird durch Zentrifugation erhalten. Der Zellniederschlag wird in gefrorenem Zustand gelagert.
Zur Anwendung im Test wird das gefrorene Pellet durch Zusatz von eiskaltem Lysepuffer in einer Menge von etwa 1 ml auf 10⁸ Zellen aufgetaut. Das verflüssigte Material wird mit 10 Stößen eines Dounce-Homogenisators homogenisiert und anschließend durch Zentrifugation bei 1500 g geklärt. Der Überstand wird entfernt (und aufbewahrt), und das 1500 g Pellet in Lysepuffer resuspendiert und mit 10 Stößen eines Dounce-Homogenisators homogenisiert. Die Klärung erfolgt wiederum durch Zentrifugation bei 1500 g, 4°C.
Die 1500 g-Überstände werden anschließend vereinigt, und EDTA wird auf 5 mM zugesetzt. Die resultierende Flüssigkeit wird bei 75000 g und 4°C für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand anschließend entfernt und bei 175000 g bei 4°C für 60 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand, enthaltend den cytosolischen Extrakt, stellt die DPPV-Aktivität- enthaltende Präparation dar, die im unten beschriebenen Test für mögliche therapeutische Verbindungen der Erfindung genutzt wird.
Der Test beruht auf unserer Beobachtung, dass das interessierende cytoplasmatische T-Zellenzym eine nach Prolyl spaltende Serinprotease ist. Wir haben daher als Reportersubstrat eine Verbindung gewählt, die Prolin an vorletzter Position enthält; jedes einer Anzahl von Substraten, die dieses Anfordernis erfüllen, kann genutzt werden. In dem hier beschriebenen Test, haben wir einen Fluoresenz-Spaltungstest unter Anwendung des Substrats Ala-ProAFC angewandt. Alternativ kann ein colorimetrischer Test unter Anwendung von Gly-Pro-pNA als Substrat durchgeführt werden. Die Auswahl der endständigen Aminosäure ist nicht kritisch mit der Maßgabe, dass das Substrat eine freie terminale Aminogruppe enthält.
In dem Test, den wir durchgeführt haben, haben wir ein Fluoreszenzspektrometer für die Anregung bei 400 nm und Emission bei 505 nm genutzt. Das Spektrometer wurde auf Fluoreszenzintensitäten von 0.000 = 10 mM HEPES, pH 7,4 und eine Fluoreszenzintensität von 1.000 = 10 mM HEPES, 1 μM AFC kalibriert.
Um den Test durchzuführen, werden zwischen 10 und 100 μl des obigen Enzymextraktes auf 1 ml mit 10 mM HEPES, pH 7,4, enthaltend 10 mM Ala-ProAFC, verdünnt. Mindestens eine Extrakt/Substratprobe wird ohne Testverbindung laufen gelassen, um einen Standard als Vergleich mit der Testprobe bereitzustellen.
In den Testproben lässt man mehrere Proben durchlaufen, enthaltend verschiedene Konzentrationen von bis zu 10^–8 M der Testverbindung. Die Probe (mit oder ohne Testverbindung) wird in eine Küvette gegeben und in ein Fluoreszenzspektrometer insertiert. Die Enzymaktivität wird als Akkumulation der Fluoreszenzintensität (d. h. des Substratspaltproduktes) über der Zeit (1 Minute) gemessen. Eine Verbindung wird als ein Inhibitor identifiziert, wenn die akkumulierte Fluoreszenz als Ergebnis der Anwesenheit der inhibierenden Verbindung abnimmt.
Sobald eine Verbindung als ein enzymatischer Inhibitor identifiziert worden ist, wie oben beschrieben, werden weitere Tests durchgeführt, um zu ermitteln, ob die Verbindung über die T-Zell-Membran in das Cytoplasma wandern kann; dies ist ein Test, der unter Anwendung wohl bekannter Techniken durchgeführt werden kann.
Falls erwünscht, können zusätzliche in-vitro-Tests unter Anwendung der möglichen Verbindungen der Erfindung vor deren Anwendung in vivo durchgeführt werden. Ein solcher Test nutzt die mögliche Verbindung bei einer sehr niedrigen Konzentration in einem Test, der darauf ausgelegt ist, zu bestimmen, ob die Verbindung bei niedrigen Konzentrationen die Proliferation von PBMC aus HIV-infizierten Patienten in vitro stimulieren kann. Wie in den Daten aus 4 gezeigt, kann die Stimulation beispielsweise durch Einbau eines markierten Nukleotids gemessen werden.
Die Verbindungen können auch in höheren Dosen getestet werden, um zu bestimmen, ob sie die gegenteilige Wirkung der Proliferation wie oben aufweisen, d. h. eine durch die Enzyminhibition verursachte Dosis abhängige Apoptose, wie in den Experimenten aus 6.
Mögliche Verbindungen
Wie oben diskutiert, sind Verbindungen, die möglicherweise zur Apoptoseinduktion in hohen Dosen und zur Proliferationsinduktion in niedrigen Dosen befähigt sind, diejenigen, die bei normalen oder hohen Dosen die cytoplasmatische T-Zell-Dipeptidase inhibieren und die die T-Zell-Membran in das T-Zell-Cytoplasma überqueren können, wo die Wechselwirkung mit dem Enzym auftritt. Die Verbindungen sollten somit organische Verbindungen sein, die eine freie Aminogruppe am Aminoterminus aufweisen; ein Prolin oder Prolin-Analogon an der vorletzten Position und eine Enzymbindungsstelle, die die nach Prolyl Spaltstelle der cytoplasmatischen Dipeptidase nachahmt.
Eine Anzahl bekannter Verbindungsklassen kann gesichtet und gemäß der Erfindung verwendet werden. Bei einer solchen Klasse handelt es sich um CD26-Inhibitoren (d. h. DPPIV), eingeschlossen diejenigen, die in Bachovchin et al., US-Patent der Nummer 4 935 493 beschrieben sind. In dem '493-Patent werden Verbindungen mit der Struktur:
beschrieben, worin jedes D₁ und D₂ unabhängig eine Hydroxylgruppe oder eine Gruppe darstellt, die in wässriger Lösung bei physiologischem pH-Wert zu einer Hydroxylgruppe hydrolisiert werden kann; und worin X eine Aminosäure oder ein Peptid umfasst, das die Stelle des Substrats nachahmt, die von einem nach Prolyl spaltenden Enzym erkannt wird.
Die Verbindungen im '493-Patent sind Inhibitoren von CD26 und stellen auch mögliche Inhibitoren der Erfindung dar. Wie oben diskutiert, ist es aufgrund der niedrigen Konzentrationen an Verbindung, die gemäß der Erfindung genutzt werden, annehmbar in der Erfindung eine Verbindung zu nutzen, die nicht nur mit dem cytoplasmatischen Enzym sondern auch mit CD26 interagiert.
Die Klasse an Verbindungen, die im '493-Patent beschrieben ist, wird auch in Takacs et al., US-Patentanmeldung der Seriennummer 07/923 337, entsprechend der PCT-Anmeldung Nr. WO94/03055, diskutiert und mit Beispielen versehen. In dieser Anmeldung wird eine der Familien von Molekülen im '493-Patent als die "Xaa-boroPro-Moleküle" beschrieben, deren Beispiele Ala-boroPro, Pro-boroPro und Gly-boroPro sind. Diese Xaa-boroPro-Moleküle sind alles mögliche Verbindungen für die Anwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung. Zwei dieser Verbindungen werden in einigen der Beispiele, die unten beschrieben sind, genutzt; bei diesen Verbindungen handelt es sich um Lys-boroPro ("KPB") und Val-boroPro ("VBP").
Beispiel 1
Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurden über Standardverfahren aus HIV-infizierten Individuen und aus nicht infizierten Individuen gewonnen. Schwankende Dosen von KBP oder VBP wurden mit den PBMC in vitro in Kontakt gebracht, und die Stimulation der Proliferation mittels Einbau von ³H-Thymidin (cpm) gemessen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 1 gezeigt: Sehr niedrige Dosen von Val-boroPro und Lys-boroPro stimulierten die Proliferation von PBMC aus HIV-infizierten Patienten, nicht jedoch von PBMC aus nicht infizierten Patienten.
Wie in 1 gezeigt, beeinflusst der der boroPro-Enzyminhibitor die PBMC aus nicht infizierten Individuen bei keiner Konzentration. Bei moderaten Konzentrationen verursachte der Inhibitor auch keine Proliferation der PBMC aus HIV-infizierten Individuen, verursachte jedoch eine ausgeprägte Proliferation bei sehr niedrigen Konzentrationen (10^–9 und 10^–10 M). Diese Ergebnisse sind mit unserer Hypothese konsistent, wie oben diskutiert, dass diese Enzyminhibitoren bei niedrigen Konzentrationen eine paradoxe Wirkung aufweisen: Statt das Apoptose-kontrollierende cytoplasmatische T-Zell-Enzym zu inhibieren, wechselwirken sie mit diesem Enzym auf eine Weise, die die Inaktivierung blockiert und die Proliferation der T-Zellen verursacht.
Konkordante Ergebnisse sind in 2 gezeigt, einem Histogramm, das zeigt, dass niedrige Dosen an Lys-boroPro und Val-boroPro die Proliferation von PBMC aus HIV-infizierten Patienten verursachen, während höhere Dosen (10^–4 M) diese Wirkung nicht haben.
Die gleichen Ergebnisse sind in den 3, 4, 9 und 10 gezeigt, die auch Daten für zwei Kontrollverbindungen, OKT3 und PHA, zeigen, die beide unspezifische Mitogene sind.
Unter Bezugnahme auf 5 werden Daten in einer Form präsentiert, die zeigt, dass niedrige Konzentrationen der Inhibitoren der Erfindung kaum Auswirkungen auf die PBMC HIV-infizierter Patienten haben, deren CD4⁺-Zählraten kleiner als etwa 400 sind (die klinische Indikation für AIDS). In der Auftragung von 5 ist der natürliche Logarithmus des Stimulationsindex (vertikale Achse) gegen den natürlichen Logarithmus der CD4⁺-Zählrate der Patienten aufgetragen; wie gezeigt, gibt es oberhalb einer Zählrate von 400 eine besonders signifikante Stimulation der Proliferation.
6 ist eine Auftragung, die belegt, dass gereinigte T-Zellen hochempfindlich gegenüber Inhibitoren der cytoplasmatischen T-Zell-Dipeptidase in moderaten Konzentrationen sind. CD19⁺-B-Zellen und CD4⁺/CD8⁺-T-Zellen wurden auf hohe Reinheit isoliert und über Nacht in Val-boroPro inkubiert. Die Menge des Zelltodes wurde mittels 7AAD-Durchlusscytometrieanalyse bestimmt. Die Daten stellen Prozent des Zelltodes aus doppelten Ansätzen dar. Diese Daten sind mit unserer Hypothese konsistent, dass die Inhibitoren bei moderaten Konzentrationen ein cytoplasmatisches Enzym inhibieren, das üblicherweise gegen die Apoptose schützt.
7 stellt Daten dar, die belegen, dass CD26⁺/ und CD26^–PBMC gleichermaßen für den durch den Inhibitor des cytoplasmatischen T-Zell-Enzyms induzierten Zelltod empfänglich sind, wobei der Inhibitor in moderaten Konzentrationen verabreicht wird. Die CD26⁺- und CD26^–-Populationen wurden über Nacht in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von Val-boroPro inkubiert. Die Menge des Zelltodes wurde mittels 7AAD-Durchflusscytometrieanalyse ermittelt. Die Daten stellen mittlere Prozent des Todes aus doppelten Ansätzen dar. Diese Daten weisen darauf hin, dass das die Apoptose inhibierende cytoplasmatische T-Zell-Enzym sowohl in CD26⁺-als auch in CD26^–-T-Zellen vorhanden ist.
8 präsentiert Daten, die die Auswirkungen eines in der Erfindung nützlichen Inhibitors, Val-boroPro, zeigt. Die Experimente wurden unter Anwendung zweier Präparationen durchgeführt: Gereinigtem DPPN (d. h. CD26) und einem cytoplasmatischen Extrakt aus Jurkat-T-Zellen, wie oben beschrieben (Jurkat-Zellen enthaltend das cytoplasmatische T-Zell-Enzym, tragen jedoch kein CD26 auf ihrer Oberfläche). Diese Präparationen wurden mit verschiedenen Konzentrationen an Val-boroPro inkubiert, und die enzymatische Aktivität wurde durch Messen der Akkumulation des fluoreszenten Spaltproduktes von 7-Amino-4-trifluoromethylbumarin (AFC) bestimmt, freigesetzt aus dem Substrat Ala-ProAFC bei enzymatischer Spaltung. Val-boroPro inhibierte sowohl das Enzym DPPN als auch das cytoplasmatische T-Zell-Enzym in der Jurkat-Präparation.
Andere Ausführungsformen liegen in den folgenden Ansprüchen.
Was beansprucht ist, ist:

Claims

Verwendung einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass: (a) sie an die im Zytoplasma von Jurkat-Zellen vorhandene, nach Prolyl spaltende Dipeptidase-Aktivität bindet; und (b) sie für die Verabreichung an einen Patienten so formuliert ist, dass ihre Konzentration im Blut des Patienten 10^–8 M nicht übersteigt, bei der Herstellung eines Medikaments zum Stimulieren der Proliferation von T-Zellen eines menschlichen Patienten, der an einem Erkrankungszustand leidet, gekennzeichnet durch die Unfähigkeit der T-Zellen des Patienten, normal auf die T-Zell-Proliferation induzierende Stimuli zu reagieren.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin der Erkrankungszustand durch HIV-Infektion verursacht ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Verbindung zusätzlich dadurch charakterisiert ist, dass sie bei einer Konzentration von 10^–4 M die in Jurkat T-Zellen zu findende, zytoplasmatische, nach Prolyl spaltende Dipeptidase-Aktivität inhibiert.
Verwendung gemäß Anspruch 3, worin die Verbindung zusätzlich dadurch charakterisiert ist, dass sie in einer Konzentration von 10^–8 M an die zytoplasmatische, nach Prolyl spaltende Dipetidase Aktivität von CD4⁺-T-Zellen aus HIV-infizierten Patienten bindet, um die Proliferation dieser Zellen zu stimulieren.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin das Medikament zur Behandlung eines mit HIV-infizierten Patienten ist und die Verbindung zur Verabreichung an den Patienten ist, um eine Blutkonzentration der Verbindung unterhalb von 10^–10 M zu ergeben.
Verwendung gemäß Anspruch 5, worin die Verbindung zusätzlich dadurch gekennzeichnet ist, dass sie durch die Membran von menschlichen CD4⁺-T-Zellen zum Eintritt in das Zytoplasma hindurchtreten kann.
Verwendung einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass: (a) sie durch die Membran von T-Zellen zum Eintritt in das Zytoplasma hindurchtreten kann; (b) sie an die zytoplasmatische, nach Prolyl spaltende Dipeptidase Aktivität in einer Konzentration unterhalb von 10^–8 M bindet; (c) die Proliferation der T-Zellen in dieser Konzentration stimuliert; (d) sie für die Verabreichung an einen Patienten so formuliert ist, dass ihre Konzentration im Blut des Patienten 10^–8 M nicht übersteigt, bei der Herstellung eines Medikaments zum Stimulieren der Proliferation von T-Zellen eines menschlichen Patienten, der an einem Erkrankungszustand leidet, gekennzeichnet durch die Unfähigkeit der T-Zellen des Patienten, normal auf die T-Zell-Proliferation induzierende Stimuli zu reagieren.
Verwendung gemäß Anspruch 7, worin die T-Zellen CD4⁺-Zellen sind.
Verwendung gemäß Anspruch 8, worin die Verbindung die Fähigkeit der CD4⁺-T-Zellen fördert, in Antwort auf antigenische Stimulation zu proliferieren.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Verbindung ein Serinprotease-Inhibitor ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Verbindung zur Verabreichung an einen HIV-infizierten Patienten ist.
Verwendung gemäß Anspruch 10, worin der Serinprotease-Inhibitor eine Spaltstelle oder eine Bindungsstelle aufweist, die die nach Prolin-Spaltstelle einer Serinprotease nachahmt.
Verfahren zum Testen einer Verbindung auf Enzym inhibitorische Aktivität, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Bereitstellen eines eine nach Prolyl spaltende Dipeptidase-Aktivität enthaltenden, zytoplasmatischen Extraktes von T-Zellen, denen CD26 auf ihrer Oberfläche fehlt; (b) in-Kontakt-Bringen des Extraktes mit einem Serinprotease-Bezugssubstrat für die Dipeptidase-Aktivität und mit der Verbindung; und (c) Ermitteln, ob die Verbindung die Spaltung des Bezugssubstrats inhibiert.
Verwendung einer organischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass: (a) sie die zytoplasmatische, nach Prolyl spaltende Dipeptidase-Aktivität aus T-Zellen in einer Konzentration oberhalb von 10^–3 M inhibiert; (b) sie mit der Dipeptidase-Aktivität bei einer Konzentration unterhalb von 10^–8 M interagiert bzw. wechselwirkt, wobei die Fähigkeit der Aktivität gefördert wird, die Apoptose von T-Zellen des Patienten zu inhibieren; (c) sie durch die Membran von T-Zellen des Patienten zum Eintritt in das Zytoplasma hindurchtreten kann; und (d) sie zur Verabreichung an einen Patienten so formuliert ist, dass ihre Konzentration im Blut des Patienten 10^–8 M nicht übersteigt, bei der Herstellung als Medikament zur Behandlung eines mit HIV-infizierten Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 14, worin die CD4⁺-Zählrate des Patienten höher als 400 ist.
Verwendung gemäß Anspruch 14, worin die Verbindung zur Verabreichung in Verbindung mit einem therapeutischen Mittel ist, welches die CD4⁺-Zählrate von HIV-infizierten Patienten erhöht.
Verwendung einer Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass: (a) sie die zytoplasmatische, nach Prolyl spaltende Dipeptidase-Aktivität aus T-Zellen in einer Konzentration von etwa 10^–5 M inhibiert; (b) sie mit der Dipeptidase-Aktivität in einer Konzentration unterhalb von 10^–8 M interagiert bzw. wechselwirkt, wobei die Fähigkeit der Aktivität gefördert wird, die Apoptose von T-Zellen des Patienten zu inhibieren; (c) sie durch die Membran von T-Zellen des Patienten zum Eintritt in das T-Zell-Zytoplasma hindurchtreten kann; und (d) sie für die Verabreichung so formuliert ist, dass ihre Konzentration im Blut eines Patienten 10^–8 M nicht übersteigt, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Patienten.
Verwendung gemäß Anspruch 11, worin der Virus HIV ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, worin die Verbindung oral verabreichbar ist.