DE69814526T2

DE69814526T2 - Verfahren zur Klonierung und Herstellung der BssHII Restriktionsendonuklease in E. Coli

Info

Publication number: DE69814526T2
Application number: DE69814526T
Authority: DE
Inventors: Shuang-yong Lexington XU; Jian-ping Wenhan Xiao
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1998-03-11
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2018-03-12
Also published as: EP0885964A3; EP0885964B1; JPH10313883A; JP4165775B2; EP0885964A2; DE69814526D1; US5786195A

Description

STAND DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BssHII Restriktionsendonuclease und BssHII Methylase kodiert, sowie die Herstellung von BssHII Restriktionsendonuclease von der rekombinanten DNA.
Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienkomponenten beseitigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in präzise Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen agieren, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als 211 Restriktionsendonuclasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies identifiziert, die bisher untersucht wurden (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 24: 223–235 (1996)).
Bakterien besitzen gewöhnlich höchstens nur eine geringe Anzahl von Restriktionsendonucleasem pro Spezies. Die Endonucleasen werden typischerweise entsprechend den Bakterien benannt, von denen sie abstammen. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen namens DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5'TTTAAA3', 5'PuGGNCCPy3' und 5'CACNNNGTG3'. Escherichia coli RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz 5'GAATTC3' erkennt.
Man geht davon aus, dass Restriktionsendonucleasen in der Natur eine schützende Rolle zum Wohle der Bakterienzelle spielen. Sie machen Bakterien widerstandsfähig gegen Infektionen durch Fremd-DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide, die sie sonst zerstören oder befallen würden. Sie übertragen Widerstandsfähigkeit, indem sie eindringende Fremd-DNA-Moleküle immer dann spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Durch die stattfindende Spaltung werden viele der infizierenden Gene deaktiviert, und die DNA wird für einen weiteren Abbau durch unspezifische Endonucleasen empfänglich.
Eine zweite Komponente von bakteriellen Schutzsystemen sind Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Nucleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird aufgrund der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets völlig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher als fremd erkennbare DNA regiert auf Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
Seit dem Beginn der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, die sie kodieren, in größeren Mengen zu produzieren, als es mit konventionellen Reinigungstechniken möglich ist. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d. h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10³ bis 10⁴ auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Restriktionsmodifikationssysteme des Typs II werden immer öfter kloniert. Die ersten klonierten Systeme nutzten eine Bakteriophage-Infektion als Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet. 178: 717–719, (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97–112, (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503–1507, (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien diese befähigen, Infektionen durch Bakteriophagen standhalten zu können, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die dem Phage ausgesetzt wurden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Es wurde insbesondere gefunden, dass klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand zeigen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz involviert das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide (EcoRV Bougeleret et. al., Nucl. Acid. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402–406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355–359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164:501–509 (1985)).
Ein dritter Ansatz, der zum Klonieren einer steigenden Zahl von Systemen angewendet wird, bezieht sich auf ein aktives Methylasegen (Wilson, US-Patent Nr. 5,200,333, erteilt am 6: April 1993, und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403–6421 (1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng gekoppelt sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion ergibt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219–225 (1980); Bcn3I: Janulaitis et al, Gene 20: 197– 204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111–119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235–1241 (1983)).
Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue"-Verfahren, wurde zum direkten Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstamms von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (Fomenkov et al., US-Patent-Nr. 5,498,535, erteilt am 12. März 1996; Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22: 2399–2403 (1994)). Im Rahmen dieses Verfahrens wird die E. coli SOS-Reaktion im Anschluss an einen DNA-Schaden durch Endonucleasen oder unspezifische Nucleasen genutzt. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert.
Ein weiteres Hindernis für das Klonieren dieser Systeme in E. coli wurde im Verfahren zur Klonierung diverser Methylasen entdeckt. Viele E. coli Stämme (einschließlich solcher, die normalerweise zum Klonieren benutzt werden) haben Systeme, die der Einführung von DNA widerstehen, die Cytosin-Methylierung beinhaltet. (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 9070–5074 (1986). Es ist daher auch eine sorgfältige Überlegung erforderlich, welche(r) E. coli Stamm/Stämme zum Klonieren verwendet werden.
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zum Erzeugen rekombinanter Moleküle im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Bakterienstämme durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Enzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme würden außerdem die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA- Moleküle, die ein multispezifisches Methylasegen (bssHIIMl), BssHII Restriktionsendonucleasegen (bssHIIR) und das zugehörige BssHII Methylasegen (bssHIIM2) von Bacillus stearothermophilus H3 E. coli kodieren. Das multispezifische BssHII Methylasegen wurde zuerst in einer Sau3AI Bibliothek unter Verwendung eines modifizierten pLITMUS28 Vektors (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) mit zwei BssHII Orten kloniert. Durch die Expression der multispezifischen BssHII Methylase werden die zwei BssHII Orte gegenüber einem BssHLI Verdau resistent gemacht. Überraschenderweise modifiziert die klonierte Methylase auch einige andere Orte zusätzlich zum BssHII Ort (5'GCGCGC3'). Im Speziellen modifiziert diese Methylase auch BsrFI (5'RCCGGY3') und HaeII Orte (5'RGCGCY3') und teilweise EagI (5'CGGCCG3') und MluI Orte (5'ACGCGT3'). Es wurde keine monospezifische BssHII Methylase von den Sau3AI Teilbliotheken wiedergewonnen, die von genomischer B. stearothermophilus H3 DNA präpariert wurden.
Zur Vereinfachung der Klonierung des BssHII Restriktionsendonucleasegens wurden große Mengen des BssHII Restriktionsendonucleaseproteins von B. stearothermophilus H3 Zellen gereinigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde wie folgt bestimmt: (Met) Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gin Len Val Ser ? Pro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp (SEQ ID Nr. 1). (? = Nomen ambiguum).
DNA-Fragmente neben dem multispezifischen BssHII Methylasegen (bssHIIMl) wurden in der Hoffnung sequenziert, ein BssHII Endonucleasegen zu finden. Es wurden mehr als 5000 by DNA, die das multispezifische Methylasegen umgeben, sequenziert. Die Translation der offenen Leseraster in Aminosäuresequenzen stimmte nicht mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des BssHII Endonucleaseproteins überein. Man folgerte, dass sich das bona fide BssHII Restriktionsendonucleasegen wahrscheinlich irgendwo anders in dem B. stearothermophilus H3 Chromosom befand.
Um den Standort der BssHII Restriktionsendonucleasegene zu bestimmen, wurden zwei Sätze degenerierter Primer auf der Basis der Proteinsequenz konstruiert und in einer PCR verwendet, um die ersten 59 by des BssHII Restriktionsendonucleasegens von genomischer B. stearothermophilus H3 DNA zu amplifizieren, wonach dann eine Klonierung in pUC19 (ATCC 37254) folgte und das Insert sequenziert wurde. Ein Satz inverser PCR-Primer wurde von der bekannten 59 by Sequenz konstruiert. Ein inverses PCR-Produkt wurde in der Sau3AI-verdauten und mit sich selbst ligierten genomischen B. stearothermophilus H3 DNA gefunden. Die inverse PCR-DNA wurde kloniert und sequenziert. So wurden zusätzliche 465 bp neuer DNA-Kodierungssequenz erhalten. Ein weiterer Satz inverser PCR wurde vom Ende der 465 bp Sequenz konstruiert und zum Amplifizieren des restlichen Teils des BssHII Endonucleasegens von HinfI- oder RsaI-gespaltener und mit sich selbst ligierter genomischer B. stearothermophilus H3 DNA verwendet. Die inversen PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Nach weiteren 730 by neuer Sequenz wurde ein Stoppcodon in dem RsaI-Fragment gefunden. Das gesamte BssHII Endonucleasegen (bssHIIR) umfasst 1254 by (59 by + 465 by + 730 bp), die die 417-aa BssHII Restriktionsendonuclease mit vorhergesagter Molekülmasse von 47 kDa kodieren.
Zum Pramodifizieren des E. coli Chromosoms wurde das multisμezifiscne BssHII Methylasegen (bssHIIML) in einem kompatiblen Vektor pACYC184 (ATCC 37033) kloniert. Das BssHII Endonucleasegen wurde durch PCR amplifiziert. Eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle und ein optimaler Abstand wurden vor das bssHIIR Gen gebaut. Das PCR-Produkt wurde in pUC19 kloniert. Es wurden drei Isolate gefunden, die die PCR-Inserts aufwiesen. Allerdings wurde keine Aktivität in den IPTG-induzierten Zellkulturen nachgewiesen. Man kam zu dem Schluss, dass die drei Inserts möglicherweise Mutationen im bssHIIR Gen aufwiesen.
Der Vektor pUC19 ist ein Plasmid hoher Kopiezahl, das einen lac-Promotor enthält. Die Expression von Genen vom lac- Promotor ist nicht streng reguliert. Es wurde daher gefolgert, dass möglicherweise ein streng regulierter Promotor wie der T7 Promotor für die Expression des bssHIIR Gens erwünscht ist. Das bssHIIR Gen wurde durch PCR mit Primern amplifiziert, die durch XbaI und BamHI Orte flankiert waren. Eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle und ein optimaler Abstand wurden vor das Gen eingebaut. Das PCR-Produkt wurde mit dem Vektor pET21AT ligiert (New England Biolabs Inc., Beverly, MA), einem T7 Expressionsvektor mit Transkriptionsterminatoren oberhalb des T7 Promotors. Das bssHIIMl Gen wurde zuerst in den Vektor pLG339 eingesetzt. Das Plasmid mit der Endonuclease wurde dann in die E. coli Zelle ER2504 transformiert [pLysS, pLG-BssHIIMl]. E. coli Zellen mit pLysS, pLG-BssHIIMl und pET21AT-BssHIIR wurden mit IPTG induziert, und Zellextrakte wurden hinsichtlich BssHII Endonucleaseaktivität überprüft. Es wurden Zellextrakte von zwölf Isolaten untersucht; alle zwölf Klone produzierten BssHII Endonucleaseaktivität. Ein Beispiel ist in 4 dargestellt.
Da sich das Restriktionsendonucleasegen des Typs II und das zugehörige Methylasegen in sehr nahe beieinander befinden, wurde ein Satz inverser PCR-Primer auf der Basis des Fades der Restriktionsendonucleasesequenz synthetisiert Stromabwärts gelegene Sequcenzen wurde durch inverse PCR amplifiziert und kloniert. Das bona fide BssHII Methylasegen (bssHIIM2) wurde in zwei Schritten der inversen PCR kloniert. Das gesamte bssHIIM2 Gen wurde durch PCR amplifiziert und in einen kompatiblen Vektor pLG339 (ATCC 37131) kloniert, der von pSC101 abstammte, um das E. coli Chromosom zu prämodifizieren. Der prämodifizierte Wirt ER2417 [pLysP, pLG-BssHIIM2] wurde mit pET21AT-BssHIIR transformiert. Der resultierende Stamm ER2417 [pLysP, pLG-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR] brachte 1 × 10⁵ Einheiten der BssHII Restriktionsendonuclease nach einer IPTG-Induktion hervor.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die DNA-Sequenz des multispezifischen BssHII Gens (bssHIIMI) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
2 zeigt die DNA-Sequenz des BssHII Restriktionsendonucleasegens (bssHIIR) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 3).
3 zeigt die BssHII Endonucleaseaktivitätsprüfung unter Verwendung von Zellextrakt und λ DNA.
4 zeigt die DNA-Sequenz des bona fide BssHII Methylasegens (bssHIIM2) und seine kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
5 zeigt die Genorganisation des BssHII Restriktionsmodifikationssystems.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das multispezifische BssHII Methylasegen und die BssHII Restriktionsendonuclease und das zugehörige Methylasegen vorzugsweise kloniert und exprimiert werden, umfasst die folgenden Schritte:

1. Die genomische DNA von B. stearothermophilus H3 wird gereinigt.
2. Die DNA wird teilweise mit einer Restriktonsendonuclease wie Sau3AI oder einem beliebigen ihrer Isoschizomere verdaut, die (ein) DNA-Fragment (e) erzeugt, das/die das gesamte multispezifische BssHII Methylasegen enthält/enthalten. Alternativ kann man zu Schritt 9 übergehen, um das BssHII Endonucleasegen direkt durch PCR und inverse PCR unter Verwendung von degenerierten Primern zu klonieren, die von der N-terminalen Aminosäuresequenz konstruiert werden.
3. Die Sau3AI-verdaute genomische DNA wird dann mit BamHI-gespaltenem/CIP-behandeltem pLITMUS-Klonierungsvektor mit zwei BssHII Orten ligiert. Die ligierte DNA wird zum Transformieren eines geeigneten Wirts verwendet, d. h. ein HsdR^–, McrBC^–, Mrr^– Stamm, wie E. coli Stamm RR1. Die DNA/Zellgemische werden dann auf Ampicillin-Medium plattiert, das nach transformierten Zellen selektiert. Nach der Inkubation werden die transformierten Kolonien geerntet und amplifiziert, um die Primärzellbibliothek zu bilden.
4. Die rekombinanten Plasmide werden als nächstes in toto von der Primärzellbibliothek gereinigt, um die Primärplasmidbibliothek herzustellen. Die gereinigte Plasmidbibliothek wird dann vollständig in vitro mit BssHII Restriktionsendonuclease oder einem beliebigen BssHII Isoschizomer verdaut. Der BssHII Endonucleaseverdau führt zur selektiven Zerstörung unmodifizierter Klone, die keine Methylase enthalten; was eine Erhöhung der relativen Frequenz von BssHII methylasehaltigen Klonen zur Folge hat.
5. Identifizierung des multispezifischen BssHII Methylaseklons: die verdaute Plasmidbibliothek-DNA wird zurück in einen Wirt wie den E. coli.Stamm RR1 transformiert, und transformierte Kolonien werden wieder durch Plattieren auf Ampicillinplatten erhalten. Die Kolonien werden aufgenommen und ihre Plasmide werden präpariert und hinsichtlich der Anwesenheit des BssHII Methylasegens analysiert, indem gereinigte Plasmid-DNA in vitro mit BssHII Endcrnclease inkuhiert wird um zu bestimmen, ob sie einem BssHII Verdau resistent ist.
6. Nachdem festgestellt wurde, dass das Methylasegen kloniert ist, wird der Klon durch Restriktionskartierung und Deletionskartierung analysiert. Das gesamte Insert wird dann sequenziert. Im Anschluss an dieses Verfahren wird ein offenes Leseraster, das dem multispezifischen BssHII Methylasegen entspricht, gefunden. Die klonierte Methylase modifiziert auch einige andere Orte zusätzlich zum BssHII Ort (5'GCGCGC3'). Die Plasmid-DNA, die das multispezifische BssHII Methylasegen enthält, ist auch gegenüber einen BsrFI (5'RCCGGY3') und HaeII (5'RGCGCY3') Verdau beständig; und teilweise gegenüber EagI (5'CGGCCG3') und MluI (5'ACGCGT3') Verdau beständig. Man gelangt zu dem Schluss, dass die klonierte Methylase eine multispezifische Methylase ist.
7. BssHII Restriktionsendonucleaseprotein wird in großen Mengen gereinigt und die N-terminale Aminosäuresequenz i wird bestimmt. Die N-terminale Sequenz lautet wie folgt:
8. Basierend auf dem obigen Verfahren wird ein 5,8 kb 1 DNA-Fragment, das das multispezifische BssHII Methylasegen umgibt, unter Verwendung methylasehaltiger Klone sequenziert. Die DNA-Sequenz wird in allen sechs Rastern translatiert und mit der Aminosäuresequenz der BssHII Restriktionsendonuclease verglichen. Es wird jedoch keine offensichtliche Identität/Homologie zwischen den translatierten Aminosäuresequenzen und der N-terminalen Aminosäuresequenz der gereinigten BssHII Restriktionsendonuclease gefunden. Man gelangt zu dem Schluss, dass sich das echte BssHII Restriktionsendonucleasegen nicht neben der multispezifischen Methylase befindet.
9. Es werden Anstrengungen unternommen, die BssHII Endonuclease direkt durch PCR und inverse PCR auf der Basis der N-rerminalen Aminosäuresequenz zu kloneren. Zwei Sätze degenerierter Primer werden von den ersten funf Rminosäureresten (MGENQE) (SEQ ID Nr. 5) und Resten 15 bis 20 (DKAQLV) (SEQ ID Nr. 6) konstruiert. Die Primer werden zum Amplifizieren der beginnenden 59 by des BssHIi Restriktionsendonucleasegens von der genomischen B. stearothermophilus H3 DNA durch PCR verwendet. Es werden mehrere PCR-Produkte gefunden, und DNA-Fragmente im Bereich von 59 bis 67 by werden gelgereinigt und in pUC19 kloniert und sequenziert. Einer der beiden Klone enthält translatierte Aminosäuresequenz, die mit der erwarteten N-terminalen Aminosäuresequenz identisch ist.
10. Inverse PCR-Primer werden von den beginnenden 59 by DNA konstruiert und zum Amplifizieren von umgebenden DNA-Sequenzen von genomischer B. stearothermophilus H3 DNA durch inverse PCR verwendet. Genomische B. stearothermophilus H3 DNA wird mit den folgenden Restriktionsenzymen mit 6 by Erkennungssequenzen verdaut: AatII, BamHI, BglII, BspEI, CIaI , EcoRI , HindIII , MluI , NheI oder SphI ; und Restriktionsenzyme mit 4–5 by Erkennungssequenzen: Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI oder Acil. Die Verdaus bringen eine Template-DNA einer geeigneten Größe (weniger als 10 kb) für die inverse PCR-Reaktion hervor. Die verdauten DNA-Proben werden bei einer niedrigen DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA wird als Matrize für inverse PCR-Reaktionen verwendet. Einzelne PCR-Produkte werden in mit Sau3AI, MboI und AciI verdauter und mit sich selbst ligierter genomischer DNA gefunden. Die DNA-Fragmente werden in pUC19 kloniert und sequenziert, woraus sich 465 by neue Sequenz ergeben.
11. Inverse PCR-Primer werden vom Ende der neuen 465 by Sequenz konstruiert und zum Amplifizieren zusätzlicher umgebender DNA verwendet. Genomische B. stearothermophilus H3 DNA wird mit ApoI, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RasaI, oder AciI verdaut. Die veraauten DNA-Proben werden bei einer nseurigen DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA wird als Matrize zur inversen PCR-Reaktion verwendet. Einzelne inverse PCR-Produkte werden in HinfI oder RsaI-verdauter und mit sich selbst ligierter genomischer DNA gefunden. Die DNA-Fragmente werden kloniert und sequenziert. Nach 730 by zusätzlicher Sequenz wird ein Stoppcodon in dem sequenzierten RsaI Fragment gefunden. Das gesamte BssHII Endonucleasegen umfasst 1254 by (59 by + 465 by + 730 bp), die die 417-aa BssHII Endonuclease mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 47 kDa kodieren.
12. Das multispezifische BssHII Methylasegen wird in pACYCl84 (ATCC 37033) kloniert, um den E. coli Wirt zu prämodifizieren. Das gesamte BssHII Endonucleasegen wird durch PCR mit zwei Primern amplifiziert. Eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle und ein Abstand von 7 by werden vor das ATG Startcodon gebaut. Das Endonucleasegen wird in pUC19 kloniert. Es werden drei Klone mit Inserts gefunden, allerdings wird keine BssHII Aktivität im Zellextrakt von IPTG-induzierten Zeltkulturen gefunden.
13. In einem zweiten Versuch zur Expression des bssHIIR Gens wird ein T7 Expressionsvektor pET21AT zur streng regulierten Expression verwendet (F. W. Studier und B. A. Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113–130 (1986)). Der Vektor pET21AT enthält vier Kopien von Transkriptionsterminatoren oberhalb des T7 Promotors. Durch die Cotransformation von. pLysS (F. W. Studier, J. Mol. Biol. 219: 37–44 (1991)) wird die Grundniveauexpression unter nichtinduzierten Bedingungen weiter reduziert. Das bssHIIMl Gen wird durch PCR amplifiziert und in den kompatiblen Vektor pLG339 kloniert (ATCC 37131), der von pSC101 abstammt. Das bssHIIR Gen wird durch PCR amplifiziert und in pET21AT kloniert. Die E. coli Wirtszelle zur T7 Expression, ER2504, wird mit pLysS, pLG-BssHIIMl, pET21AT-BssHIIR transformiert. Zwolf Isolate werden mit IPTG induzieit und Zellexträkte werden präparieu und auf BssHII Restriktionsendonucleaseaktivität hin überprüft. Alle Klone produzieren BssHII Endonuclease.
14. Zum Klonieren des Methylasegens neben dem bssHIIR Gen wird ein Satz Primer hergestellt, um die stromabwärtigen DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Inverse PCR-Produkte werden in den inversen PCR-Reaktionen von HhaI-, HaeIII- und Sau3AIverdauter und mit sich selbst ligierter genomischer DNA gefunden. Die inversen PCR-Produkte werden kloniert und sequenziert. Ein unfertiges offenes Leseraster wird in der neu gewonnenen 895 by Sequenz gefunden und mit den bekannten Genen der Genbank verglichen. Dieses unfertige offene Leseraster hat eine Aminosäuresequenzähnlichkeit mit den bekannten C⁵ Methylasen.
15. Ein zweiter Satz inverser PCR Primer wird synthetisiert und zum Amplifizieren der stromabwärtigen Sequenzen verwendet. Inverse PCR-Produkte werden in den inversen PCR-Reaktionen von Styl-verdauter und mit sich selbst ligierter DNA gefunden. Das DNA-Produkt wird in pUC19 kloniert und das Insert sequenziert. Das gesamte BssHII Methylasegen (bssHIIM2) umfasst 1128 bp, die das BssHII Methylaseprotein mit einer Molekülmasse von 42,2 kDa kodieren.
16. Das gesamte bssHIIM2 Gen wird amplifiziert und in den pLG339 Vektor eingesetzt. Die prämodifizierte E. coli Wirtszelle ER2417 (pLysP, pLG339-BssHIIM2] wird mit pET21AT-BssHIIR transformiert. Der resultierende Stamm ER2417 [pLysP, pLG339-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR] (NEB Nr. 1070) produziert 1 × 10⁵ Einheiten von BssHII Restriktionsendonuclease je Gramm nasser E. coli Zellen.

Eine Probe NEB Nr. 1070 wurde am 24. Februar 1997 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags mit der ATCC Beitrittsnummer 98334 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung wird weter anhand des folgenden Beispiels illustriert. Das Beispiel dient dem Verständnis der Erfindung und ist nicht als diese einschränkend anzusehen.
1.BEISPIEL
KLONIERUNG DES BSSHII RESTRIKTIONSENDONUCLEASEGENS
1. Klonierung des multispezifischen BssHII Methylasegens (bssHIIMl) unter Anwendung des Methylaseselektionsverfahrens.
Zehn μg genomische B. stearothermophilus H3 DNA wurden bei 37°C mit 4, 2, 1, 0,5 oder 0,25 Einheiten Sau3AI für 30 min teilweise gespalten. Die teilweise verdaute DNA wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Man stellte fest, dass 1 Einheit und 0,5 Einheiten des Sau3AI-Verdaus zu einem begrenzten Teilverdau führten. Die mit Sau3Al teilverdaute genomische B. stearothermophilus H3 DNA wurde über Nacht mit BamHI-gespaltenem/CIP-behandeltem pLITMUS28 (ein pUC19-Derivat mit zwei BssHII Orten, New England Biolabs Inc., Beverly, MA) bei 16°C ligiert. Ligierte DNA wurde in RR1-kompetente Zellen transformiert und auf Ampicillinplatten plattiert. Insgesamt wurden etwa 1 × 10⁵ Zellen in dem Transformationsexperiment gewonnen. Diese Zellen wurden zusammengepoolt und in 1 Liter LB-Broth plus Ap inokuliert und über Nacht bei 37°C kultiviert. Plasmid-DNA wurde von der Primärzellbibliothek präpariert. 10, 5, 2 und 1 μg Plasmid-DNA wurden mit 40 Einheiten BssHII Restriktionsendonuclease vier Stunden lang bei 50°C gespalten. Die BssHII-verdaute DNA wurde in RR1-kompetente Zellen retransformiert. Plasmide wurden wieder von Kulturen der überlebenden Transformanten isoliert und mit BssHII Restriktionsenzym verdaut, um zu sehen, ob die Plasmid-DNA gegenüber einem BssHII-Verdau resistent ist. Sechsunddreißig Plasmide wurden hinsichtlich BssHII-Verdaubeständigkeit überprüft. Es wurden drei resistente Klone (Nr. 3, Nr. 18 und Nr. 30). gefunden. Sie enthielten ein genomisches DNA-Insert von etwa 6 kb. Als diese Plasmide mit BsrFI, SacII, EagI, MluI, HaeII, NarI HhaI, SacI oder EcoO1091 verdaut wurden, wurde festgestellt, dass die Plasmid-DNA auch gegenüber BsrFI-, HaeII-, EagIoder MluI-Verdaus beständig oder teilweise beständig war. Zellextrakte wurden von den drei Isolaten präpariert und auf BssHII Endonucleaseaktivität hin überprüft. Es wurde keine offensichtliche BssHII Endonucleaseaktivität in den drei Zellextrakten nachgewiesen. Das gesamte multispezifische Methylasegen und die umgebende DNA wurden sequenziert. Die bssHIIMl Gensequenz ist in 1 dargestellt. Es wurde kein offensichtliches Restriktionsendonucleasegen gefunden. Man folgerte, dass dieses Methylasegen möglicherweise ein phagenkodiertes multispezifisches Methylasegen war. Das gleiche Gen wurde kloniert und seine Sequenz veröffentlicht (Schumann, J., et al, Gene 157: 103–104 (1995)).
2. Klonierung des bssHIIR Gens
Da das Methylaseselektionsverfahren nur eine multispezifische BssHII Methylase hervorbrachte, konzentrierten sich die Anstrengungen auf eine direkte Klonierung des BssHII Endonucleasegens. BssHIi Restriktionsendonuclease wurde von B. stearothermophilus H3 Zellen durch Chromatographie gereinigt und einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterzogen. Die N-terminale Aminosäuresequenz lautet wie folgt:
Ein degenerierter Vorwärtsprimer wurde auf der Basis der Sequenz der ersten sechs Aminosäuren konstruiert (Met) Gly Glu Asn Gln Glu (SEQ ID Nr. 5).
Die Vorwärtsprimersequenz lautet wie folgt:
Zwei degenerierte Rückwärtsprimer wurde auf der Basis der Aminosäuresequenz Asp Lys Ala Gln Leu Val (SEQ ID Nr.6) konstruiert. Da die Codon-Kodierung für Leu sechs Möglichkeiten hat (CUG, CUC, CUU, CUR, WG und UUA) wurden zwei degenerierte Primer hergestellt, einer mit Leu kodierendem CTN und einer mit Leu kodierendem TTR. Die beiden degenerierten Rückwärtsprimersequenzen sind:
Rückwärtsprimer 1:
Rückwärtsprimer 2:
Es wurden zwei PCR-Reaktionen eingerichtet: Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer 1 wurden in der PCR-Reaktion 1 verwendet, und Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer 2 wurden in der PCR-Reaktion 2 verwendet. Ein 59 by PCR-Produkt würde erwartet, wenn die DNA-Amplifikation positive Ergebnisse erbringen würde. Die 59 by des BssHII Endonucleasegens kodieren die ersten 20 Aminosäuren. Nach 30 Runden der PCR-Amplifikation (95°C 1 min, 40°C 1 min, 72°C 30 sec, 30 Zyklen) wurde ein erwartetes PCR-Produkt auf einem Agarosegel nachgewiesen. Das kleine DNA-Produkt wurde durch ein 3%iges, bei niedriger Temperatur schmelzendes Agarosegel gelgereinigt. Die Gelscheibe wurde mit β-Agarase behandelt und die DNA wurde präzipitiert und in pUC19 kloniert. Zwei Klone mit Insert wurden sequenziert. Die Sequenz der ersten 59 by des bssHIIR Gens lautet wie folgt:
Die kodierte Aminosäuresequenz lautet: Met Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val (SEQ ID Nr. 11), die perfekt zur N-terminalen Aminosäuresequenz passt, die aus der Aminosäuresequenzierung des nativen Proteins stammt.
Zum Klonieren des Reste des Endoncleasegens wurde ein Satz inverser PCR-Primer von der 59 by DNA-Sequenz konstruiert. Die inversen PCR-Primer sind wie folgt:
Genomische B. stearothermophilus H3 DNA wurde mit den folgenden Restriktionsenzymen mit 6 by Erkennungssequenzen, AatII, BamHI, BglII, BspEI, CIaI, EcoRI, HindIII, MluI, NheI oder SphI, und Restriktionsenzymen mit 4–5 by Erkennungssequenzen, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinPlI, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI oder AciI zwei Stunden lang bei den erforderlichen Temperaturen verdaut. Die Verdaus brachten eine Template-DNA mit angemessener Größe (weniger als 10 kb) für die inverse PCR-Reaktion hervor. Die verdauten DNA-Proben wurden bei niedriger DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde zweimal mit Phenol-CHCl₃ und einmal mit CHCl₃ extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert, in TE-Puffer resuspendiert und als Matrize für inverse PCR-Reaktionen verwendet (95°C 1 min, 60°C 1 min, 72°C 2 min, 30 Zyklen). PCR-Produkte wurden in Sau3AI., MboI und AciIverdauter und mit sich selbst ligierter, genomischer DNA gefunden. Die DNA-Fragmente wurden in pUC19 kloniert und sequenziert, woraus sich 465 by neue Sequenz ergaben.
Zum Klonieren des Rests des Endonucleasegens wurde ein zweiter Satz inverser PCR-Primer vom Ende der neuen 465 by Sequenz konstruiert. Die Primersequenzen sind wie folgt:
Zwei Primer wurden zum Amplifizieren zusätzlicher umgebender DNA verwendet. Genomische B. stearothermophilus H3 DNA wurde mit ApoI, BsaWI, Sau3AI, NIaIII, MspI, MboI, HinPlI, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RsaI oder AciI verdaut. Die verdauten DNA-Proben wurden bei niedriger DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde zweimal mit Phenol- CHCl₃ und einmal mit CHCl₃ extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer resuspendiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde als Matrize zur inversen PCR-Reaktion verwendet (95°C 1 min, 60°C 1 min, 72°C 2 min, 30 Zyklen). Inverse PCR-Produkte wurden in HinfIoder RsaI verdauter und mit sich selbst ligierter genomischer DNA gefunden. Die DNA-Fragmente wurden kloniert und sequenziert. Nach 730 by zusätzlicher Sequenz wurde ein Stoppcodon im sequenzierten RsaI-Fragment gefunden. Das gesamte, in 2 dargestellte BssHII Endonucleasegen umfasst 1254 by (59 by + 465 by + 730 bp), die die 417-aa BssHII Endonuclease mit vorhergesagter Molekülmasse von 47 kDa kodieren, was der offensichtlichen Größe (46,5 kDa) auf einem SDS-PAGE-Gel gut entspricht.
3. Expression des bssHIIR Gens in pUC19
Zum Prämodifizieren des E. coli Wirts wurde das multispezifische BssHII Methylasegen in pACYC184 kloniert. Das gesamte BssHII Endonucleasegen wurde durch PCR mit zwei Primern amplifiziert. Eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle und ein Abstand von 7bp wurden vor dem ATG-Startcodon eingebaut. Das Endonucleasegen wurde in pUC19 kloniert. Es wurden drei Klone mit Inserts gefunden, allerdings wurde keine offensichtliche BssHII Aktivität im Zellextrakt von IPTG-induzierten Zellkulturen festgestellt. Man kam zu dem Schluss, dass die Inserts möglicherweise Mutationen während der PCR-Amplifikationen enthielten. Die Expression des BssHII Endonucleasegens von pUCl9 ist möglicherweise aufgrund einer leaky-Expression auch instabil.
4. Expression des bssHIIR Gens im T7 Expressionsvektor pET21AT
In einem zweiten Versuch zur Expression des bssHIIR Gens wurde ein T7 Expressionsvektor pET21AT zur streng regulierten Expression verwendet. Der Vektor pET21AT enthielt vier Kopien von Transkriptionsterminatoren oberhalb des T7 Promotors. Die Cotransformation von pLysS reduziert die
Grundniveauexpressiün unter nichtinduierten Beäingungen weiter. Das bssHIIMl Gen wurde durch PCR amplifiziert und in einen kompatiblen Vektor pLG339 kloniert (stammt von pSC101). Zwei Primer wurden zur bssHIIR Genamplifikation wie folgt konstruiert: Vorwärtsprimer: (VbaI Ort)
Rückwärtsprimer: (BamHI)
SEQ ID NR. 17) Das bssHIIR Gen wurde durch PCR mit Vent^® Polymerase amplifiziert (95°C 1 min, 60°C 1 min, 72°C 1 min, 20 Zyklen) und in pET21AT kloniert. Die E. coli Wirtszelle zur T7 Expression, ER2504, wurde mit pLysS, pLG-BssHIIMl, pET21AT-BssHIIR transformiert. Zwölf Isolate wurden bis zur späten log-Wachstumsphase (etwa 120 Klett-Einheiten) kultiviert. IPTG wurde auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben. Es fand eine dreistündige IPTG-Induktion statt, und Zellextrakte wurden präpariert und auf BssHII Restriktionsendonucleaseaktivität hin untersucht. Alle 12 Klone produzierten BssHII Endonuclease. Ein Klon wurde in 500 ml Zellkultur induziert und sein Zellextrakt wurde 10-, 100-, 1000-fach verdünnt und zur Untersuchung der BssHII Endonucleaseaktivität auf Lamda-DNA verwendet. In 5 ist das Untersuchungsergebnis dargestellt. Der Zellextrakt wies BssHII Aktivität nach 10- und 100-facher Verdünnung auf (Bahnen 2 und 3).
5. Klonierung des bssHIIM2 Gens
In Restriktionsmodifikationssystemen des Typs II werden das Restriktionsendonucleasegen und sein zugehöriges Methylasegen gewöhnlich sehr nahe beieinander angeordnet. Die stromaufwärst vom bssHIIr Gen gelgene DNA wurde durch inverse PCR amplifiziert, kloniert und sequeizieit Die stromaufwärtige Sequenz weist Homologie zur bekannten ribosomalen rRNA-Sequenz auf. Es wurde daher beschlossen, dass sich das echte BssHII Methylasegen (bssHIIM2) unterhalb des Restriktionsendonucleasegens befinden muss. Zum Klonieren des Methylasegens unterhalb des bssHIIR Gens wurde ein Satz Primer wie folgt hergestellt:
Genomische B. stearothermophilus H3 DNA wurde mit AciI, AluI, ApoI, BsaWI, EaeI, HhaI, HaeII, HaeIII, MseI, Sau3AI oder Tsp509I verdaut. Die verdauten DNA-Proben wurden bei einer niedrigen DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde zweimal mit Phenol-CHCl₃ und einmal mit CHCl₃ extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer resuspendiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde als Matrize zur inversen PCR-Reaktion verwendet (95°C 1 min, 55°C 1 min, 72°C 2 min, 30 Zyklen). Inverse PCR-Produkte wurden in den inversen PCR-Reaktionen von mit HhaI, HaeIII und Sau3AI verdauter und mit sich selbst ligierter genomischer DNA gefunden. Die drei inversen PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert. Ein unfertiges offenes Leseraster wurde in der neu gewonnenen 895 by Sequenz gefunden und mit den bekannten Genen der Genbank verglichen. Dieses unfertige offene Leseraster hat eine Aminosäuresequenzähnlichkeit mit den bekannten C⁵ Methylasen.
Zum Klonieren des Rests des bssHIIM2 Gens wurde ein zweiter Satz inverser PCR-Primer wie folgt synthetisiert:
Diese beiden Primer wurden zum Amplifizieren der stromabwärtigen Sequenzen verwendet. Genomische B. stearothermophilus H3 DNA wurde mit AvaI, AluI, BsaJI, BstNI, Csp6I, DpnII, EcoO109I, HaeIII, Hinf1I, MboI, MseI, RsaI Sau3AI, Sau96I, SpsI Styl, TaiI, TfiI, Tsp45I oder Tsp509I verdaut. Die verdauten DNA-Proben wurden bei einer niedrigen DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde zweimal mit Phenol-CHC1₃ und einmal mit CHCl₃ extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer resuspendiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde als Matrize zur inversen PCR-Reaktion verwendet (95°C 1 min, 55°C 1 min, 72°C 2 min, 30 Zyklen). Inverse PCR-Produkte wurden in den inversen PCR-Reaktionen von mit HaeIII, HinflI, MboI, Sau3AI und Styl verdauter und mit sich selbst ligierter genomischer DNA gefunden. Das inverse PCR-Produkt von Styl-verdauter und mit sich selbst ligierter DNA wurde in pUCl9 kloniert, und das Insert wurde sequenziert. Ein Stoppcodon wurde in der neu gewonnenen 250 by DNA-Sequenz gefunden. Das gesamte, in 4 dargestellte BssHII Methylasegen (bssHIIM2) umfasst 1128 bp, die das 375-aa BssHII Methyhaseprotein mit einer Molekülmasse von 42,2 kDa kodieren.
6. Expression des bssHIIR Gens in der bssHIIM2 prämodifizierten Wirtszelle.
Das gesamte bssHIIM2 Gen wurde mit zwei Primern amplifiziert:
Das bssHIIM2 Gen wurde in den Plasmidvektor pLG339 eingesetzt. Die prämodifizierte E. coli Wirtszelle ER2417 [pLysP, pLG-BssHIIM2] wurde mit pET21AT-BssHIIR transformiert. Der resultierende Stamm ER2417 [pLysP, pLG-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR] wurde bei 30°C in 500 ml LB plus Ap (50 μg/ml), Km (50 μg/ml), Cm (30 μg/ml) bis zur späten log-Phase (120–150 Klett-Einheiten) kultiviert. IPTG wurde zur Kultur bis auf eine Endkonzentration von 0,5 mM gegeben. Nach einer 3-stΰndigen IPTG-Induktion wurden die Zellen geerntet und mit Lysozym und Beschallungen lysiert. Der Zellextrakt wurde auf BssHII Aktivität auf Lambda-DNA hin untersucht. Der Klon produzierte 1 × 10⁵ Einheiten BssHII Restriktionsendonuclease je Gramm nasser E. coli Zellen.

Claims

Isolierte DNA, die die BssHII-Restriktionsendonuclease kodiert, wobei die isolierte DNA von B. stearothermophilus erhältlich ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, in den ein DNA-Segment eingesetzt wurde, das die BssHII-Restriktionsendonuclease nach Anspruch 1 kodiert.
Isolierte DNA, die die BssHII-Restriktionsendonuclease und -Methylase kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. 98334 erhältlich ist.
Klonierungsvektor, der die isolierte DNA aus Anspruch 3 umfasst.
Wirtszelle, die durch den Klonierungsvektor aus Anspruch 2 oder 4 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer BssHII-Restriktionsendonuclease, umfassend das Kultivierem einer Wirtszelle, die mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 4 unter Bedingungen transformiert wird, die zur Expression der genannten Endonuclease geeignet sind.