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STAND DER TECHNIK
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Die vorliegende Erfindung betrifft
rekombinante DNA, die die BssHII Restriktionsendonuclease und BssHII
Methylase kodiert, sowie die Herstellung von BssHII Restriktionsendonuclease
von der rekombinanten DNA.
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Restriktionsendonucleasen des Typs
II sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen.
Wenn sie von anderen Bakterienkomponenten beseitigt werden, können Restriktionsendonucleasen im
Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in präzise Fragmente
zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
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Restriktionsendonucleasen agieren,
indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz")
entlang dem DNA-Molekül
erkennen und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das
Molekül
innerhalb oder an einer Seite der Erkennungssequenz. Unterschiedliche
Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen.
Mehr als 211 Restriktionsendonuclasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden
unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies identifiziert, die
bisher untersucht wurden (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res.
24: 223–235
(1996)).
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Bakterien besitzen gewöhnlich höchstens
nur eine geringe Anzahl von Restriktionsendonucleasem pro Spezies.
Die Endonucleasen werden typischerweise entsprechend den Bakterien
benannt, von denen sie abstammen. Die Spezies Deinococcus radiophilus
produziert beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen
namens DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten
jeweils die Sequenzen 5'TTTAAA3', 5'PuGGNCCPy3' und 5'CACNNNGTG3'.
Escherichia coli RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI,
das die Sequenz 5'GAATTC3' erkennt.
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Man geht davon aus, dass Restriktionsendonucleasen
in der Natur eine schützende
Rolle zum Wohle der Bakterienzelle spielen. Sie machen Bakterien
widerstandsfähig
gegen Infektionen durch Fremd-DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide,
die sie sonst zerstören
oder befallen würden.
Sie übertragen
Widerstandsfähigkeit,
indem sie eindringende Fremd-DNA-Moleküle immer
dann spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Durch die stattfindende
Spaltung werden viele der infizierenden Gene deaktiviert, und die
DNA wird für einen
weiteren Abbau durch unspezifische Endonucleasen empfänglich.
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Eine zweite Komponente von bakteriellen
Schutzsystemen sind Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen
und liefern das Mittel, das Bakterien befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und
sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen
erkennen und binden sich an die gleiche Nucleotiderkennungssequenz
wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die
DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid
innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im
Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr
durch die Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle
wird aufgrund der Aktivität
ihrer Modifikationsmethylase stets völlig modifiziert. Sie ist daher
gegenüber
der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich.
Lediglich unmodifizierte und daher als fremd erkennbare DNA regiert
auf Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
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Seit dem Beginn der Gentechnologie
ist es nun möglich,
Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, die sie kodieren,
in größeren Mengen
zu produzieren, als es mit konventionellen Reinigungstechniken möglich ist.
Der Schlüssel
zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist
die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung
solcher Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d. h. Populationen
von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn
sie in geringen Frequenzen von 103 bis 104 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren
selektiv sein, so dass die unerwünschte
Mehrheit von Klonen zerstört
wird, während
die erwünschten
seltenen Klone überleben.
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Restriktionsmodifikationssysteme
des Typs II werden immer öfter
kloniert. Die ersten klonierten Systeme nutzten eine Bakteriophage-Infektion
als Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen
(EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet. 178: 717–719, (1980);
HhaII: Mann et al., Gene 3: 97–112,
(1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503–1507, (1981)).
Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien
diese befähigen,
Infektionen durch Bakteriophagen standhalten zu können, können Zellen,
die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell
als Überlebende
von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die dem Phage ausgesetzt
wurden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von
begrenztem Nutzen ist. Es wurde insbesondere gefunden, dass klonierte Restriktionsmodifikationsgene
nicht immer ausreichend Phagenwiderstand zeigen, um selektives Überleben zu
gewähren.
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Ein weiterer Klonierungsansatz involviert
das Übertragen
von anfänglich
als plasmidbürtig
gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide (EcoRV
Bougeleret et. al., Nucl. Acid. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7: Gingeras
und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402–406 (1983); Theriault und
Roy, Gene 19: 355–359
(1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164:501–509 (1985)).
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Ein dritter Ansatz, der zum Klonieren
einer steigenden Zahl von Systemen angewendet wird, bezieht sich
auf ein aktives Methylasegen (Wilson, US-Patent Nr. 5,200,333, erteilt
am 6: April 1993, und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403–6421 (1985)).
Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng gekoppelt sind, können beide
Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion ergibt jedoch nicht
immer ein komplettes Restriktionssystem, sondern stattdessen nur
das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219–225 (1980);
Bcn3I: Janulaitis et al, Gene 20: 197– 204 (1982); BsuRI: Kiss und
Baldauf, Gene 21: 111–119
(1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235–1241 (1983)).
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Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue"-Verfahren,
wurde zum direkten Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in
E. coli auf der Basis des Indikatorstamms von E. coli beschrieben,
der die dinD::lacZ Fusion enthält
(Fomenkov et al., US-Patent-Nr. 5,498,535, erteilt am 12. März 1996;
Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22: 2399–2403 (1994)). Im Rahmen dieses
Verfahrens wird die E. coli SOS-Reaktion im Anschluss an einen DNA-Schaden
durch Endonucleasen oder unspezifische Nucleasen genutzt. Mit diesem
Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (Tth111I,
BsoBI, Tf Nuclease) kloniert.
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Ein weiteres Hindernis für das Klonieren
dieser Systeme in E. coli wurde im Verfahren zur Klonierung diverser
Methylasen entdeckt. Viele E. coli Stämme (einschließlich solcher,
die normalerweise zum Klonieren benutzt werden) haben Systeme, die
der Einführung
von DNA widerstehen, die Cytosin-Methylierung beinhaltet. (Raleigh
und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83: 9070–5074 (1986). Es ist daher
auch eine sorgfältige Überlegung
erforderlich, welche(r) E. coli Stamm/Stämme zum Klonieren verwendet
werden.
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Da gereinigte Restriktionsendonucleasen
und Modifikationsmethylasen nützliche
Werkzeuge zum Erzeugen rekombinanter Moleküle im Labor sind, gibt es einen
kommerziellen Anreiz, Bakterienstämme durch DNA-Rekombinationstechniken
zu gewinnen, die diese Enzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme würden außerdem die
Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft
rekombinante DNA- Moleküle, die
ein multispezifisches Methylasegen (bssHIIMl), BssHII Restriktionsendonucleasegen
(bssHIIR) und das zugehörige
BssHII Methylasegen (bssHIIM2) von Bacillus stearothermophilus H3
E. coli kodieren. Das multispezifische BssHII Methylasegen wurde
zuerst in einer Sau3AI Bibliothek unter Verwendung eines modifizierten
pLITMUS28 Vektors (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) mit zwei
BssHII Orten kloniert. Durch die Expression der multispezifischen BssHII
Methylase werden die zwei BssHII Orte gegenüber einem BssHLI Verdau resistent
gemacht. Überraschenderweise
modifiziert die klonierte Methylase auch einige andere Orte zusätzlich zum
BssHII Ort (5'GCGCGC3'). Im Speziellen modifiziert diese Methylase
auch BsrFI (5'RCCGGY3') und HaeII Orte (5'RGCGCY3') und teilweise
EagI (5'CGGCCG3') und MluI Orte (5'ACGCGT3'). Es wurde keine monospezifische
BssHII Methylase von den Sau3AI Teilbliotheken wiedergewonnen, die
von genomischer B. stearothermophilus H3 DNA präpariert wurden.
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Zur Vereinfachung der Klonierung
des BssHII Restriktionsendonucleasegens wurden große Mengen des
BssHII Restriktionsendonucleaseproteins von B. stearothermophilus
H3 Zellen gereinigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde wie folgt
bestimmt: (Met) Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile
Leu Asp Lys Ala Gin Len Val Ser ? Pro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa
Ala Asp (SEQ ID Nr. 1). (? = Nomen ambiguum).
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DNA-Fragmente neben dem multispezifischen
BssHII Methylasegen (bssHIIMl) wurden in der Hoffnung sequenziert,
ein BssHII Endonucleasegen zu finden. Es wurden mehr als 5000 by
DNA, die das multispezifische Methylasegen umgeben, sequenziert.
Die Translation der offenen Leseraster in Aminosäuresequenzen stimmte nicht
mit der N-terminalen Aminosäuresequenz
des BssHII Endonucleaseproteins überein. Man
folgerte, dass sich das bona fide BssHII Restriktionsendonucleasegen
wahrscheinlich irgendwo anders in dem B. stearothermophilus H3 Chromosom
befand.
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Um den Standort der BssHII Restriktionsendonucleasegene zu
bestimmen, wurden zwei Sätze
degenerierter Primer auf der Basis der Proteinsequenz konstruiert
und in einer PCR verwendet, um die ersten 59 by des BssHII Restriktionsendonucleasegens
von genomischer B. stearothermophilus H3 DNA zu amplifizieren, wonach
dann eine Klonierung in pUC19 (ATCC 37254) folgte und das Insert
sequenziert wurde. Ein Satz inverser PCR-Primer wurde von der bekannten
59 by Sequenz konstruiert. Ein inverses PCR-Produkt wurde in der
Sau3AI-verdauten und mit sich selbst ligierten genomischen B. stearothermophilus
H3 DNA gefunden. Die inverse PCR-DNA wurde kloniert und sequenziert.
So wurden zusätzliche
465 bp neuer DNA-Kodierungssequenz erhalten. Ein weiterer Satz inverser
PCR wurde vom Ende der 465 bp Sequenz konstruiert und zum Amplifizieren
des restlichen Teils des BssHII Endonucleasegens von HinfI- oder
RsaI-gespaltener und mit sich selbst ligierter genomischer B. stearothermophilus
H3 DNA verwendet. Die inversen PCR-Produkte wurden kloniert und
sequenziert. Nach weiteren 730 by neuer Sequenz wurde ein Stoppcodon
in dem RsaI-Fragment gefunden. Das gesamte BssHII Endonucleasegen
(bssHIIR) umfasst 1254 by (59 by + 465 by + 730 bp), die die 417-aa
BssHII Restriktionsendonuclease mit vorhergesagter Molekülmasse von
47 kDa kodieren.
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Zum Pramodifizieren des E. coli Chromosoms
wurde das multisμezifiscne
BssHII Methylasegen (bssHIIML) in einem kompatiblen Vektor pACYC184
(ATCC 37033) kloniert. Das BssHII Endonucleasegen wurde durch PCR
amplifiziert. Eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle und ein optimaler
Abstand wurden vor das bssHIIR Gen gebaut. Das PCR-Produkt wurde
in pUC19 kloniert. Es wurden drei Isolate gefunden, die die PCR-Inserts aufwiesen.
Allerdings wurde keine Aktivität
in den IPTG-induzierten Zellkulturen nachgewiesen. Man kam zu dem
Schluss, dass die drei Inserts möglicherweise
Mutationen im bssHIIR Gen aufwiesen.
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Der Vektor pUC19 ist ein Plasmid
hoher Kopiezahl, das einen lac-Promotor enthält. Die Expression von Genen
vom lac- Promotor
ist nicht streng reguliert. Es wurde daher gefolgert, dass möglicherweise
ein streng regulierter Promotor wie der T7 Promotor für die Expression
des bssHIIR Gens erwünscht
ist. Das bssHIIR Gen wurde durch PCR mit Primern amplifiziert, die
durch XbaI und BamHI Orte flankiert waren. Eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle
und ein optimaler Abstand wurden vor das Gen eingebaut. Das PCR-Produkt wurde mit
dem Vektor pET21AT ligiert (New England Biolabs Inc., Beverly, MA),
einem T7 Expressionsvektor mit Transkriptionsterminatoren oberhalb
des T7 Promotors. Das bssHIIMl Gen wurde zuerst in den Vektor pLG339
eingesetzt. Das Plasmid mit der Endonuclease wurde dann in die E.
coli Zelle ER2504 transformiert [pLysS, pLG-BssHIIMl]. E. coli Zellen
mit pLysS, pLG-BssHIIMl und pET21AT-BssHIIR wurden mit IPTG induziert,
und Zellextrakte wurden hinsichtlich BssHII Endonucleaseaktivität überprüft. Es wurden
Zellextrakte von zwölf
Isolaten untersucht; alle zwölf
Klone produzierten BssHII Endonucleaseaktivität. Ein Beispiel ist in 4 dargestellt.
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Da sich das Restriktionsendonucleasegen
des Typs II und das zugehörige
Methylasegen in sehr nahe beieinander befinden, wurde ein Satz inverser
PCR-Primer auf der Basis des Fades der Restriktionsendonucleasesequenz
synthetisiert Stromabwärts
gelegene Sequcenzen wurde durch inverse PCR amplifiziert und kloniert.
Das bona fide BssHII Methylasegen (bssHIIM2) wurde in zwei Schritten
der inversen PCR kloniert. Das gesamte bssHIIM2 Gen wurde durch
PCR amplifiziert und in einen kompatiblen Vektor pLG339 (ATCC 37131)
kloniert, der von pSC101 abstammte, um das E. coli Chromosom zu
prämodifizieren.
Der prämodifizierte
Wirt ER2417 [pLysP, pLG-BssHIIM2]
wurde mit pET21AT-BssHIIR transformiert. Der resultierende Stamm
ER2417 [pLysP, pLG-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR] brachte 1 × 105 Einheiten
der BssHII Restriktionsendonuclease nach einer IPTG-Induktion hervor.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 zeigt
die DNA-Sequenz des multispezifischen BssHII Gens (bssHIIMI) und
seine kodierte Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr. 2).
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2 zeigt
die DNA-Sequenz des BssHII Restriktionsendonucleasegens (bssHIIR)
und seine kodierte Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr. 3).
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3 zeigt
die BssHII Endonucleaseaktivitätsprüfung unter
Verwendung von Zellextrakt und λ DNA.
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4 zeigt
die DNA-Sequenz des bona fide BssHII Methylasegens (bssHIIM2) und
seine kodierte Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr. 4).
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5 zeigt
die Genorganisation des BssHII Restriktionsmodifikationssystems.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Das hierin beschriebene Verfahren,
mit dem das multispezifische BssHII Methylasegen und die BssHII Restriktionsendonuclease
und das zugehörige
Methylasegen vorzugsweise kloniert und exprimiert werden, umfasst
die folgenden Schritte:
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- 1. Die genomische DNA von B. stearothermophilus H3 wird
gereinigt.
- 2. Die DNA wird teilweise mit einer Restriktonsendonuclease
wie Sau3AI oder einem beliebigen ihrer Isoschizomere verdaut, die
(ein) DNA-Fragment (e) erzeugt, das/die das gesamte multispezifische
BssHII Methylasegen enthält/enthalten.
Alternativ kann man zu Schritt 9 übergehen, um das BssHII Endonucleasegen
direkt durch PCR und inverse PCR unter Verwendung von degenerierten
Primern zu klonieren, die von der N-terminalen Aminosäuresequenz
konstruiert werden.
- 3. Die Sau3AI-verdaute genomische DNA wird dann mit BamHI-gespaltenem/CIP-behandeltem
pLITMUS-Klonierungsvektor mit zwei BssHII Orten ligiert. Die ligierte
DNA wird zum Transformieren eines geeigneten Wirts verwendet, d.
h. ein HsdR–,
McrBC–,
Mrr– Stamm,
wie E. coli Stamm RR1. Die DNA/Zellgemische werden dann auf Ampicillin-Medium
plattiert, das nach transformierten Zellen selektiert. Nach der
Inkubation werden die transformierten Kolonien geerntet und amplifiziert,
um die Primärzellbibliothek
zu bilden.
- 4. Die rekombinanten Plasmide werden als nächstes in toto von der Primärzellbibliothek
gereinigt, um die Primärplasmidbibliothek
herzustellen. Die gereinigte Plasmidbibliothek wird dann vollständig in
vitro mit BssHII Restriktionsendonuclease oder einem beliebigen
BssHII Isoschizomer verdaut. Der BssHII Endonucleaseverdau führt zur
selektiven Zerstörung
unmodifizierter Klone, die keine Methylase enthalten; was eine Erhöhung der
relativen Frequenz von BssHII methylasehaltigen Klonen zur Folge
hat.
- 5. Identifizierung des multispezifischen BssHII Methylaseklons:
die verdaute Plasmidbibliothek-DNA wird zurück in einen Wirt wie den E.
coli.Stamm RR1 transformiert, und transformierte Kolonien werden
wieder durch Plattieren auf Ampicillinplatten erhalten. Die Kolonien
werden aufgenommen und ihre Plasmide werden präpariert und hinsichtlich der
Anwesenheit des BssHII Methylasegens analysiert, indem gereinigte
Plasmid-DNA in vitro mit BssHII Endcrnclease inkuhiert wird um zu
bestimmen, ob sie einem BssHII Verdau resistent ist.
- 6. Nachdem festgestellt wurde, dass das Methylasegen kloniert
ist, wird der Klon durch Restriktionskartierung und Deletionskartierung
analysiert. Das gesamte Insert wird dann sequenziert. Im Anschluss
an dieses Verfahren wird ein offenes Leseraster, das dem multispezifischen
BssHII Methylasegen entspricht, gefunden. Die klonierte Methylase
modifiziert auch einige andere Orte zusätzlich zum BssHII Ort (5'GCGCGC3').
Die Plasmid-DNA, die das multispezifische BssHII Methylasegen enthält, ist
auch gegenüber
einen BsrFI (5'RCCGGY3') und HaeII (5'RGCGCY3') Verdau beständig; und
teilweise gegenüber
EagI (5'CGGCCG3') und MluI (5'ACGCGT3') Verdau beständig. Man
gelangt zu dem Schluss, dass die klonierte Methylase eine multispezifische
Methylase ist.
- 7. BssHII Restriktionsendonucleaseprotein wird in großen Mengen
gereinigt und die N-terminale Aminosäuresequenz i wird bestimmt.
Die N-terminale Sequenz lautet wie folgt:
- 8. Basierend auf dem obigen Verfahren wird ein 5,8 kb 1 DNA-Fragment,
das das multispezifische BssHII Methylasegen umgibt, unter Verwendung
methylasehaltiger Klone sequenziert. Die DNA-Sequenz wird in allen sechs
Rastern translatiert und mit der Aminosäuresequenz der BssHII Restriktionsendonuclease
verglichen. Es wird jedoch keine offensichtliche Identität/Homologie
zwischen den translatierten Aminosäuresequenzen und der N-terminalen
Aminosäuresequenz
der gereinigten BssHII Restriktionsendonuclease gefunden. Man gelangt
zu dem Schluss, dass sich das echte BssHII Restriktionsendonucleasegen
nicht neben der multispezifischen Methylase befindet.
- 9. Es werden Anstrengungen unternommen, die BssHII Endonuclease
direkt durch PCR und inverse PCR auf der Basis der N-rerminalen
Aminosäuresequenz
zu kloneren. Zwei Sätze
degenerierter Primer werden von den ersten funf Rminosäureresten
(MGENQE) (SEQ ID Nr. 5) und Resten 15 bis 20 (DKAQLV) (SEQ ID Nr.
6) konstruiert. Die Primer werden zum Amplifizieren der beginnenden
59 by des BssHIi Restriktionsendonucleasegens von der genomischen
B. stearothermophilus H3 DNA durch PCR verwendet. Es werden mehrere PCR-Produkte
gefunden, und DNA-Fragmente im Bereich von 59 bis 67 by werden gelgereinigt
und in pUC19 kloniert und sequenziert. Einer der beiden Klone enthält translatierte
Aminosäuresequenz,
die mit der erwarteten N-terminalen Aminosäuresequenz identisch ist.
- 10. Inverse PCR-Primer werden von den beginnenden 59 by DNA
konstruiert und zum Amplifizieren von umgebenden DNA-Sequenzen von genomischer
B. stearothermophilus H3 DNA durch inverse PCR verwendet. Genomische
B. stearothermophilus H3 DNA wird mit den folgenden Restriktionsenzymen
mit 6 by Erkennungssequenzen verdaut: AatII, BamHI, BglII, BspEI,
CIaI , EcoRI , HindIII , MluI , NheI oder SphI ; und Restriktionsenzyme
mit 4–5
by Erkennungssequenzen: Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI,
HpaII, HaeII, EaeI oder Acil. Die Verdaus bringen eine Template-DNA
einer geeigneten Größe (weniger
als 10 kb) für
die inverse PCR-Reaktion hervor. Die verdauten DNA-Proben werden
bei einer niedrigen DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm
pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA
wird als Matrize für
inverse PCR-Reaktionen verwendet. Einzelne PCR-Produkte werden in
mit Sau3AI, MboI und AciI verdauter und mit sich selbst ligierter
genomischer DNA gefunden. Die DNA-Fragmente werden in pUC19 kloniert
und sequenziert, woraus sich 465 by neue Sequenz ergeben.
- 11. Inverse PCR-Primer werden vom Ende der neuen 465 by Sequenz
konstruiert und zum Amplifizieren zusätzlicher umgebender DNA verwendet.
Genomische B. stearothermophilus H3 DNA wird mit ApoI, BsaWI, Sau3AI,
NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI,
RasaI, oder AciI verdaut. Die veraauten DNA-Proben werden bei einer
nseurigen DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm pro ml) mit
sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA wird als Matrize
zur inversen PCR-Reaktion verwendet. Einzelne inverse PCR-Produkte werden in
HinfI oder RsaI-verdauter und mit sich selbst ligierter genomischer
DNA gefunden. Die DNA-Fragmente werden kloniert und sequenziert.
Nach 730 by zusätzlicher
Sequenz wird ein Stoppcodon in dem sequenzierten RsaI Fragment gefunden.
Das gesamte BssHII Endonucleasegen umfasst 1254 by (59 by + 465
by + 730 bp), die die 417-aa BssHII Endonuclease mit einer vorhergesagten
Molekülmasse
von 47 kDa kodieren.
- 12. Das multispezifische BssHII Methylasegen wird in pACYCl84
(ATCC 37033) kloniert, um den E. coli Wirt zu prämodifizieren. Das gesamte BssHII
Endonucleasegen wird durch PCR mit zwei Primern amplifiziert. Eine effiziente
Ribosomen-Bindungsstelle und ein Abstand von 7 by werden vor das
ATG Startcodon gebaut. Das Endonucleasegen wird in pUC19 kloniert.
Es werden drei Klone mit Inserts gefunden, allerdings wird keine
BssHII Aktivität
im Zellextrakt von IPTG-induzierten Zeltkulturen gefunden.
- 13. In einem zweiten Versuch zur Expression des bssHIIR Gens
wird ein T7 Expressionsvektor pET21AT zur streng regulierten Expression
verwendet (F. W. Studier und B. A. Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113–130 (1986)). Der
Vektor pET21AT enthält
vier Kopien von Transkriptionsterminatoren oberhalb des T7 Promotors.
Durch die Cotransformation von. pLysS (F. W. Studier, J. Mol. Biol.
219: 37–44
(1991)) wird die Grundniveauexpression unter nichtinduzierten Bedingungen
weiter reduziert. Das bssHIIMl Gen wird durch PCR amplifiziert und
in den kompatiblen Vektor pLG339 kloniert (ATCC 37131), der von
pSC101 abstammt. Das bssHIIR Gen wird durch PCR amplifiziert und
in pET21AT kloniert. Die E. coli Wirtszelle zur T7 Expression, ER2504,
wird mit pLysS, pLG-BssHIIMl,
pET21AT-BssHIIR transformiert. Zwolf Isolate werden mit IPTG induzieit
und Zellexträkte
werden präparieu
und auf BssHII Restriktionsendonucleaseaktivität hin überprüft. Alle Klone produzieren
BssHII Endonuclease.
- 14. Zum Klonieren des Methylasegens neben dem bssHIIR Gen wird
ein Satz Primer hergestellt, um die stromabwärtigen DNA-Sequenzen zu amplifizieren.
Inverse PCR-Produkte werden in den inversen PCR-Reaktionen von HhaI-,
HaeIII- und Sau3AIverdauter und mit sich selbst ligierter genomischer
DNA gefunden. Die inversen PCR-Produkte werden kloniert und sequenziert.
Ein unfertiges offenes Leseraster wird in der neu gewonnenen 895
by Sequenz gefunden und mit den bekannten Genen der Genbank verglichen.
Dieses unfertige offene Leseraster hat eine Aminosäuresequenzähnlichkeit
mit den bekannten C5 Methylasen.
- 15. Ein zweiter Satz inverser PCR Primer wird synthetisiert
und zum Amplifizieren der stromabwärtigen Sequenzen verwendet.
Inverse PCR-Produkte werden in den inversen PCR-Reaktionen von Styl-verdauter
und mit sich selbst ligierter DNA gefunden. Das DNA-Produkt wird
in pUC19 kloniert und das Insert sequenziert. Das gesamte BssHII
Methylasegen (bssHIIM2) umfasst 1128 bp, die das BssHII Methylaseprotein
mit einer Molekülmasse
von 42,2 kDa kodieren.
- 16. Das gesamte bssHIIM2 Gen wird amplifiziert und in den pLG339
Vektor eingesetzt. Die prämodifizierte
E. coli Wirtszelle ER2417 (pLysP, pLG339-BssHIIM2] wird mit pET21AT-BssHIIR transformiert.
Der resultierende Stamm ER2417 [pLysP, pLG339-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR]
(NEB Nr. 1070) produziert 1 × 105 Einheiten von BssHII Restriktionsendonuclease
je Gramm nasser E. coli Zellen.
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Eine Probe NEB Nr. 1070 wurde am
24. Februar 1997 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags mit
der ATCC Beitrittsnummer 98334 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung hinterlegt.
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Die vorliegende Erfindung wird weter
anhand des folgenden Beispiels illustriert. Das Beispiel dient dem
Verständnis
der Erfindung und ist nicht als diese einschränkend anzusehen.
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1.BEISPIEL
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KLONIERUNG DES BSSHII
RESTRIKTIONSENDONUCLEASEGENS
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1. Klonierung des multispezifischen
BssHII Methylasegens (bssHIIMl) unter Anwendung des Methylaseselektionsverfahrens.
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Zehn μg genomische B. stearothermophilus
H3 DNA wurden bei 37°C
mit 4, 2, 1, 0,5 oder 0,25 Einheiten Sau3AI für 30 min teilweise gespalten.
Die teilweise verdaute DNA wurde durch Gelelektrophorese analysiert.
Man stellte fest, dass 1 Einheit und 0,5 Einheiten des Sau3AI-Verdaus
zu einem begrenzten Teilverdau führten.
Die mit Sau3Al teilverdaute genomische B. stearothermophilus H3
DNA wurde über
Nacht mit BamHI-gespaltenem/CIP-behandeltem pLITMUS28 (ein pUC19-Derivat mit zwei
BssHII Orten, New England Biolabs Inc., Beverly, MA) bei 16°C ligiert.
Ligierte DNA wurde in RR1-kompetente
Zellen transformiert und auf Ampicillinplatten plattiert. Insgesamt
wurden etwa 1 × 105 Zellen in dem Transformationsexperiment
gewonnen. Diese Zellen wurden zusammengepoolt und in 1 Liter LB-Broth
plus Ap inokuliert und über
Nacht bei 37°C kultiviert.
Plasmid-DNA wurde von der Primärzellbibliothek
präpariert.
10, 5, 2 und 1 μg
Plasmid-DNA wurden mit
40 Einheiten BssHII Restriktionsendonuclease vier Stunden lang bei
50°C gespalten.
Die BssHII-verdaute DNA wurde in RR1-kompetente Zellen retransformiert.
Plasmide wurden wieder von Kulturen der überlebenden Transformanten
isoliert und mit BssHII Restriktionsenzym verdaut, um zu sehen,
ob die Plasmid-DNA gegenüber
einem BssHII-Verdau resistent ist. Sechsunddreißig Plasmide wurden hinsichtlich
BssHII-Verdaubeständigkeit überprüft. Es wurden
drei resistente Klone (Nr. 3, Nr. 18 und Nr. 30). gefunden. Sie
enthielten ein genomisches DNA-Insert von etwa 6 kb. Als diese Plasmide
mit BsrFI, SacII, EagI, MluI, HaeII, NarI HhaI, SacI oder EcoO1091
verdaut wurden, wurde festgestellt, dass die Plasmid-DNA auch gegenüber BsrFI-,
HaeII-, EagIoder MluI-Verdaus beständig oder teilweise beständig war.
Zellextrakte wurden von den drei Isolaten präpariert und auf BssHII Endonucleaseaktivität hin überprüft. Es wurde
keine offensichtliche BssHII Endonucleaseaktivität in den drei Zellextrakten
nachgewiesen. Das gesamte multispezifische Methylasegen und die
umgebende DNA wurden sequenziert. Die bssHIIMl Gensequenz ist in 1 dargestellt. Es wurde
kein offensichtliches Restriktionsendonucleasegen gefunden. Man
folgerte, dass dieses Methylasegen möglicherweise ein phagenkodiertes
multispezifisches Methylasegen war. Das gleiche Gen wurde kloniert
und seine Sequenz veröffentlicht
(Schumann, J., et al, Gene 157: 103–104 (1995)).
-
2. Klonierung des bssHIIR
Gens
-
Da das Methylaseselektionsverfahren
nur eine multispezifische BssHII Methylase hervorbrachte, konzentrierten
sich die Anstrengungen auf eine direkte Klonierung des BssHII Endonucleasegens.
BssHIi Restriktionsendonuclease wurde von B. stearothermophilus
H3 Zellen durch Chromatographie gereinigt und einer N-terminalen
Aminosäuresequenzierung
unterzogen. Die N-terminale Aminosäuresequenz lautet wie folgt:
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Ein degenerierter Vorwärtsprimer
wurde auf der Basis der Sequenz der ersten sechs Aminosäuren konstruiert
(Met) Gly Glu Asn Gln Glu (SEQ ID Nr. 5).
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Die Vorwärtsprimersequenz lautet wie
folgt:
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Zwei degenerierte Rückwärtsprimer
wurde auf der Basis der Aminosäuresequenz
Asp Lys Ala Gln Leu Val (SEQ ID Nr.6) konstruiert. Da die Codon-Kodierung
für Leu
sechs Möglichkeiten
hat (CUG, CUC, CUU, CUR, WG und UUA) wurden zwei degenerierte Primer
hergestellt, einer mit Leu kodierendem CTN und einer mit Leu kodierendem
TTR. Die beiden degenerierten Rückwärtsprimersequenzen
sind:
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-
-
Es wurden zwei PCR-Reaktionen eingerichtet:
Vorwärtsprimer
und Rückwärtsprimer 1 wurden
in der PCR-Reaktion 1 verwendet,
und Vorwärtsprimer
und Rückwärtsprimer 2 wurden
in der PCR-Reaktion 2 verwendet. Ein 59 by PCR-Produkt würde erwartet,
wenn die DNA-Amplifikation positive Ergebnisse erbringen würde. Die
59 by des BssHII Endonucleasegens kodieren die ersten 20 Aminosäuren. Nach 30 Runden
der PCR-Amplifikation (95°C
1 min, 40°C
1 min, 72°C
30 sec, 30 Zyklen) wurde ein erwartetes PCR-Produkt auf einem Agarosegel
nachgewiesen. Das kleine DNA-Produkt wurde durch ein 3%iges, bei
niedriger Temperatur schmelzendes Agarosegel gelgereinigt. Die Gelscheibe
wurde mit β-Agarase
behandelt und die DNA wurde präzipitiert
und in pUC19 kloniert. Zwei Klone mit Insert wurden sequenziert.
Die Sequenz der ersten 59 by des bssHIIR Gens lautet wie folgt:
-
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Die kodierte Aminosäuresequenz
lautet: Met Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu
Asp Lys Ala Gln Leu Val (SEQ ID Nr. 11), die perfekt zur N-terminalen
Aminosäuresequenz
passt, die aus der Aminosäuresequenzierung
des nativen Proteins stammt.
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Zum Klonieren des Reste des Endoncleasegens
wurde ein Satz inverser PCR-Primer von der 59 by DNA-Sequenz konstruiert.
Die inversen PCR-Primer sind wie folgt:
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Genomische B. stearothermophilus
H3 DNA wurde mit den folgenden Restriktionsenzymen mit 6 by Erkennungssequenzen,
AatII, BamHI, BglII, BspEI, CIaI, EcoRI, HindIII, MluI, NheI oder
SphI, und Restriktionsenzymen mit 4–5 by Erkennungssequenzen,
Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinPlI, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI oder
AciI zwei Stunden lang bei den erforderlichen Temperaturen verdaut.
Die Verdaus brachten eine Template-DNA mit angemessener Größe (weniger
als 10 kb) für
die inverse PCR-Reaktion hervor. Die verdauten DNA-Proben wurden
bei niedriger DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm pro ml)
mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde zweimal mit
Phenol-CHCl3 und einmal mit CHCl3 extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert,
in TE-Puffer resuspendiert und als Matrize für inverse PCR-Reaktionen verwendet (95°C 1 min,
60°C 1 min,
72°C 2 min,
30 Zyklen). PCR-Produkte wurden in Sau3AI., MboI und AciIverdauter und
mit sich selbst ligierter, genomischer DNA gefunden. Die DNA-Fragmente
wurden in pUC19 kloniert und sequenziert, woraus sich 465 by neue
Sequenz ergaben.
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Zum Klonieren des Rests des Endonucleasegens
wurde ein zweiter Satz inverser PCR-Primer vom Ende der neuen 465
by Sequenz konstruiert. Die Primersequenzen sind wie folgt:
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Zwei Primer wurden zum Amplifizieren
zusätzlicher
umgebender DNA verwendet. Genomische B. stearothermophilus H3 DNA
wurde mit ApoI, BsaWI, Sau3AI, NIaIII, MspI, MboI, HinPlI, HhaI,
HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RsaI oder AciI verdaut. Die verdauten
DNA-Proben wurden bei niedriger DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm
pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA
wurde zweimal mit Phenol- CHCl3 und einmal
mit CHCl3 extrahiert. Die DNA wurde mit
Ethanol präzipitiert
und in TE-Puffer resuspendiert. Die ligierte ringförmige DNA
wurde als Matrize zur inversen PCR-Reaktion verwendet (95°C 1 min,
60°C 1 min,
72°C 2 min,
30 Zyklen). Inverse PCR-Produkte wurden in HinfIoder RsaI verdauter
und mit sich selbst ligierter genomischer DNA gefunden. Die DNA-Fragmente
wurden kloniert und sequenziert. Nach 730 by zusätzlicher
Sequenz wurde ein Stoppcodon im sequenzierten RsaI-Fragment gefunden.
Das gesamte, in 2 dargestellte
BssHII Endonucleasegen umfasst 1254 by (59 by + 465 by + 730 bp),
die die 417-aa BssHII Endonuclease mit vorhergesagter Molekülmasse von
47 kDa kodieren, was der offensichtlichen Größe (46,5 kDa) auf einem SDS-PAGE-Gel
gut entspricht.
-
3. Expression des bssHIIR
Gens in pUC19
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Zum Prämodifizieren des E. coli Wirts
wurde das multispezifische BssHII Methylasegen in pACYC184 kloniert.
Das gesamte BssHII Endonucleasegen wurde durch PCR mit zwei Primern
amplifiziert. Eine effiziente Ribosomen-Bindungsstelle und ein Abstand von 7bp
wurden vor dem ATG-Startcodon
eingebaut. Das Endonucleasegen wurde in pUC19 kloniert. Es wurden
drei Klone mit Inserts gefunden, allerdings wurde keine offensichtliche
BssHII Aktivität
im Zellextrakt von IPTG-induzierten Zellkulturen festgestellt. Man
kam zu dem Schluss, dass die Inserts möglicherweise Mutationen während der
PCR-Amplifikationen enthielten. Die Expression des BssHII Endonucleasegens
von pUCl9 ist möglicherweise
aufgrund einer leaky-Expression auch instabil.
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4. Expression des bssHIIR
Gens im T7 Expressionsvektor pET21AT
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In einem zweiten Versuch zur Expression
des bssHIIR Gens wurde ein T7 Expressionsvektor pET21AT zur streng
regulierten Expression verwendet. Der Vektor pET21AT enthielt vier
Kopien von Transkriptionsterminatoren oberhalb des T7 Promotors.
Die Cotransformation von pLysS reduziert die
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Grundniveauexpressiün unter
nichtinduierten Beäingungen
weiter. Das bssHIIMl Gen wurde durch PCR amplifiziert und in einen
kompatiblen Vektor pLG339 kloniert (stammt von pSC101). Zwei Primer
wurden zur bssHIIR Genamplifikation wie folgt konstruiert: Vorwärtsprimer:
(VbaI Ort)
Rückwärtsprimer:
(BamHI)
SEQ
ID NR. 17) Das bssHIIR Gen wurde durch PCR mit Vent
® Polymerase
amplifiziert (95°C
1 min, 60°C
1 min, 72°C
1 min, 20 Zyklen) und in pET21AT kloniert. Die E. coli Wirtszelle
zur T7 Expression, ER2504, wurde mit pLysS, pLG-BssHIIMl, pET21AT-BssHIIR transformiert.
Zwölf Isolate
wurden bis zur späten
log-Wachstumsphase (etwa 120 Klett-Einheiten) kultiviert. IPTG wurde
auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben. Es fand eine dreistündige IPTG-Induktion
statt, und Zellextrakte wurden präpariert und auf BssHII Restriktionsendonucleaseaktivität hin untersucht.
Alle
12 Klone produzierten BssHII Endonuclease. Ein Klon
wurde in 500 ml Zellkultur induziert und sein Zellextrakt wurde
10-, 100-, 1000-fach verdünnt
und zur Untersuchung der BssHII Endonucleaseaktivität auf Lamda-DNA
verwendet. In
5 ist
das Untersuchungsergebnis dargestellt. Der Zellextrakt wies BssHII
Aktivität
nach 10- und 100-facher Verdünnung
auf (Bahnen
2 und
3).
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5. Klonierung des bssHIIM2
Gens
-
In Restriktionsmodifikationssystemen
des Typs II werden das Restriktionsendonucleasegen und sein zugehöriges Methylasegen
gewöhnlich
sehr nahe beieinander angeordnet. Die stromaufwärst vom bssHIIr Gen gelgene
DNA wurde durch inverse PCR amplifiziert, kloniert und sequeizieit
Die stromaufwärtige
Sequenz weist Homologie zur bekannten ribosomalen rRNA-Sequenz auf.
Es wurde daher beschlossen, dass sich das echte BssHII Methylasegen
(bssHIIM2) unterhalb des Restriktionsendonucleasegens befinden muss.
Zum Klonieren des Methylasegens unterhalb des bssHIIR Gens wurde
ein Satz Primer wie folgt hergestellt:
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Genomische B. stearothermophilus
H3 DNA wurde mit AciI, AluI, ApoI, BsaWI, EaeI, HhaI, HaeII, HaeIII,
MseI, Sau3AI oder Tsp509I verdaut. Die verdauten DNA-Proben wurden
bei einer niedrigen DNA-Konzentration (weniger als 2 Mikrogramm
pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte ringförmige DNA
wurde zweimal mit Phenol-CHCl3 und einmal
mit CHCl3 extrahiert. Die DNA wurde mit
Ethanol präzipitiert
und in TE-Puffer
resuspendiert. Die ligierte ringförmige DNA wurde als Matrize
zur inversen PCR-Reaktion verwendet (95°C 1 min, 55°C 1 min, 72°C 2 min, 30 Zyklen). Inverse
PCR-Produkte wurden in den inversen PCR-Reaktionen von mit HhaI,
HaeIII und Sau3AI verdauter und mit sich selbst ligierter genomischer
DNA gefunden. Die drei inversen PCR-Produkte wurden kloniert und
sequenziert. Ein unfertiges offenes Leseraster wurde in der neu
gewonnenen 895 by Sequenz gefunden und mit den bekannten Genen der
Genbank verglichen. Dieses unfertige offene Leseraster hat eine
Aminosäuresequenzähnlichkeit
mit den bekannten C5 Methylasen.
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Zum Klonieren des Rests des bssHIIM2
Gens wurde ein zweiter Satz inverser PCR-Primer wie folgt synthetisiert:
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Diese beiden Primer wurden zum Amplifizieren
der stromabwärtigen
Sequenzen verwendet. Genomische B. stearothermophilus H3 DNA wurde
mit AvaI, AluI, BsaJI, BstNI, Csp6I, DpnII, EcoO109I, HaeIII, Hinf1I, MboI,
MseI, RsaI Sau3AI, Sau96I, SpsI Styl, TaiI, TfiI, Tsp45I oder Tsp509I
verdaut. Die verdauten DNA-Proben wurden bei einer niedrigen DNA-Konzentration
(weniger als 2 Mikrogramm pro ml) mit sich selbst ligiert. Die ligierte
ringförmige
DNA wurde zweimal mit Phenol-CHC13 und einmal
mit CHCl3 extrahiert. Die DNA wurde mit
Ethanol präzipitiert
und in TE-Puffer resuspendiert. Die ligierte ringförmige DNA
wurde als Matrize zur inversen PCR-Reaktion verwendet (95°C 1 min,
55°C 1 min,
72°C 2 min,
30 Zyklen). Inverse PCR-Produkte wurden in den inversen PCR-Reaktionen
von mit HaeIII, HinflI, MboI, Sau3AI und Styl verdauter und mit
sich selbst ligierter genomischer DNA gefunden. Das inverse PCR-Produkt
von Styl-verdauter und mit sich selbst ligierter DNA wurde in pUCl9
kloniert, und das Insert wurde sequenziert. Ein Stoppcodon wurde
in der neu gewonnenen 250 by DNA-Sequenz gefunden. Das gesamte,
in 4 dargestellte BssHII
Methylasegen (bssHIIM2) umfasst 1128 bp, die das 375-aa BssHII Methyhaseprotein
mit einer Molekülmasse
von 42,2 kDa kodieren.
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6. Expression des bssHIIR
Gens in der bssHIIM2 prämodifizierten
Wirtszelle.
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Das gesamte bssHIIM2 Gen wurde mit
zwei Primern amplifiziert:
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Das bssHIIM2 Gen wurde in den Plasmidvektor
pLG339 eingesetzt. Die prämodifizierte
E. coli Wirtszelle ER2417 [pLysP, pLG-BssHIIM2] wurde mit pET21AT-BssHIIR
transformiert. Der resultierende Stamm ER2417 [pLysP, pLG-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR]
wurde bei 30°C
in 500 ml LB plus Ap (50 μg/ml),
Km (50 μg/ml),
Cm (30 μg/ml)
bis zur späten
log-Phase (120–150
Klett-Einheiten) kultiviert. IPTG wurde zur Kultur bis auf eine
Endkonzentration von 0,5 mM gegeben. Nach einer 3-stΰndigen
IPTG-Induktion wurden die Zellen geerntet und mit Lysozym und Beschallungen
lysiert. Der Zellextrakt wurde auf BssHII Aktivität auf Lambda-DNA hin
untersucht. Der Klon produzierte 1 × 105 Einheiten
BssHII Restriktionsendonuclease je Gramm nasser E. coli Zellen.