DE60002967T2 - Pseudo-cyclische oligonukleobasen - Google Patents

Pseudo-cyclische oligonukleobasen Download PDF

Info

Publication number
DE60002967T2
DE60002967T2 DE60002967T DE60002967T DE60002967T2 DE 60002967 T2 DE60002967 T2 DE 60002967T2 DE 60002967 T DE60002967 T DE 60002967T DE 60002967 T DE60002967 T DE 60002967T DE 60002967 T2 DE60002967 T2 DE 60002967T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
oligonucleobase
segment
functional
functional segment
oligonucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE60002967T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60002967D1 (de
Inventor
Sudhir Agrawal
Ekambar R. Kandimalla
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aceragen Inc
Original Assignee
Hybridon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybridon Inc filed Critical Hybridon Inc
Application granted granted Critical
Publication of DE60002967D1 publication Critical patent/DE60002967D1/de
Publication of DE60002967T2 publication Critical patent/DE60002967T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Holo Graphy (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Eye Examination Apparatus (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Oligonukleobasen, wie Oligonukleotide, zur allgemeinen Verwendung, und sie besitzen ein neues strukturelles Motiv, das es der Oligonukleobase ermöglicht, reversibel zu zirkularisieren.
  • Zusammenfassung des verwandten Fachgebiets
  • Der Fortschritt in der Entdeckung und Entwicklung von Antisense-Oligonukleotiden als therapeutische Mittel schreiten anhaltend in schneller Geschwindigkeit fort (1–3). Zur wirksamen Verwendung eines Oligonukleotids muss es mit der Ziel-mRNA durch Watson-Crick-Basenpaarung interagieren, RNase-H zur mRNA-Spaltung aktivieren, stabil gegen Nukleasen sein und von Zellen effizient aufgenommen werden (4, 5). Oligodeoxynukleotid-Phosphorothiotate (PS-Oligonukieotide) besitzen all diese Eigenschaften und wurden intensivst auf ihre in vitro und in vivo biologische Aktivität (6–10), Sicherheit (3, 11–15) und pharmakokinetische Profile (15–19) untersucht. Die potentielle Anwendbarkeit von PS-Oligonukleotiden als therapeutische Mittel wird augenblicklich in einer Anzahl von humanen klinischen Versuchen ausgewertet (2). Um das Potential von PS-Oligonukleotiden als Antisensemittel weiterhin zu verbessern, haben wir verschiedene Oligonukleotide mit gemischtem Rückgrat (MBOs) eingeführt und bewertet (20–24). In MBOs werden die gewünschten Eigenschaften von PS-Oligonukleotiden aufrechterhalten, wohingegen unerwünschte Eigenschaften durch eine Kombination von Modifikationen der Oligonukleotide minimiert werden. MBOs, die 2'-O-Alkylribonukleotide enthalten, wurden ausführlichst untersucht und haben vielversprechende Ergebnisse in Hinblick auf biologische Aktivität, in vivo Stabilität und allgemeine Toxizität, erbracht (21, 25–27). Basierend auf ihren Vorteilen gegenüber PS-Oligonukleotiden wurden MBOs zur ersten Wahl der zweiten Generation von Antisense-Oligonukleotiden und werden augenblicklich auf ihr Potential in humanen klinischen Versuchen untersucht. In Fortsetzung unserer Bemühungen, die Eigenschaften von PS-Oligonukleotiden als therapeutische Mittel zu verbessern, haben wir strukturelle Veränderun gen in PS-Oligonukleotiden in Betracht gezogen. In unseren früheren Studien haben wir über selbststabilisierende Oligonukleotide, ein PS-Oligonukleotid, das eine Haarnadelschleifenregion an dem 3'-Ende enthält, das gesteigerte in vivo Nukleasestabilität und verbesserte biologische Aktivität und noch wichtiger, eine Verbesserung in der Toxizität, im Vergleich zu einem PS-Oligonukleotid ohne eine Sekundärstruktur an dem 3'-Ende, zur Verfügung stellte, berichtet (12, 28–30). Nachfolgende Studien von anderen haben auch vielversprechende Ergebnisse ergeben (31).
  • In den letzten Jahren wurden Techniken, basierend auf der komplementären Hybridisierung zwischen Oligonukleotiden und Nukleinsäurezielen, weitgehend in der molekularen Diagnostik, der therapeutischen Entwicklung und der Mechanistik und in molekularbiologischen Studien angewandt. Als ein Ergebnis der humanen Genomanalyse wurden diese Techniken zur Routine und es besteht ein ständig ansteigender Bedarf an schnelleren, genaueren und effektiveren Nukleinsäurenachweis- und Messverfahren. Fluoreszenzbasierte Verfahren sind schneller und empfindlicher zur Hybridisierungsdetektion und -Messung, als die Verfahren, die auf Absorptionsspektroskopie, Kalorimetrie und Magnetresonanzspektroskopie basieren. Der Vorteil der fluoreszenzbasierten Techniken zur Überwachung von Komplementärhybridisierung ist, dass sie sowohl in Lösung als auch in Festphasenanwendungen verwendet werden kann.
  • Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wird umfangreich in der molekularbiologischen und genetisch basierten Forschung verwendet und wird zunehmend ein essentielles Werkzeug der molekularen Diagnostik. Verschiedene homogene Fluoreszenzassayverfahren zur Erforschung von Amplifikationsprodukten in PCR-Reaktionen wurden in den letzten Jahren entwickelt. Diese schließen TaqMan (40, 41), Molecular Bacon (42), Hairpin-Primer (43) und Scorpion (44) ein
  • Ungeachtet der Fortschritte, die wir und andere gemacht haben, besteht immer noch ein Wunsch, Antisense-Oligonukleotide zu entwickeln, die verbesserte Eigenschaften zur Verwendung als therapeutische Mittel und in diagnostischen Anwendungen haben.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue strukturelle Klasse von Oligonukleobasen zur Verfügung, die hier als "pseudocyclische Oligonukleobasen" (PCOs) oder, äquivalent, als Cyclicons, bezeichnet werden. In PCOs sind zwei Oligonukleobasen miteinander verbunden (direkt oder durch ein Linkersegment). Eine Oligonukleobase, hier genannt "funktionelles Seg ment" oder, äquivalent, das "Primer"- oder "Primer-Sonden"-Segment) stellt dem PCO Funktionalität zur Verfügung (z. B. das funktionelle Segment kann ein Antisense-Oligonukleotid sein) und das zweite, hier "protektives Segment" (oder, äquivalent, "Modifizierungssegment") genannte ist komplementär zu dem terminalen Ende des funktionellen Segments (1).
  • Unter ausgewählten Bedingungen nehmen PCOs eine intramolekular cyclische oder pseudocyclische Struktur an, als ein Ergebnis der Komplementarität zwischen funktionellen und protektiven Segmenten, die einen intramolekularen Duplex bilden (1). Die intramolekulare Duplexbildung schützt das funktionelle Segment, es steigert seine Stabilität. Wenn das funktionelle Segment ein Antisense-Oligonukleotid ist und das funktionelle Segment und das protektive Segment miteinander durch eine 3'-3'-Bindung verbunden sind, stellt die Verbindung gesteigerte Nukleasestabilität gegen 3'-exonukleolytische Angriffe zur Verfügung. Der Duplex, der zwischen den Antisense- und dem protektiven Segmenten gebildet wird, stellt zusätzliche Nukleasestabilität gegen 5'-Exenukleasen zur Verfügung.
  • Diese Designer-Oligonukleobasen können in linearer Form oder hybridisierter Form (1) bleiben, abhängig von der Temperatur, der Salzkonzentration und der Länge des protektiven Segments. Wenn die PCO in der intramolekular-pseudocyclischen Form ist, kann sie weniger der mit Polyanionen in Verbindung stehenden Nebenwirkungen zeigen, z. B. Komplementaktivierung und Verlängerung von teilweiser Thromboplastin Zeit), von denen bekannt ist, dass sie mit PS-Oligonukleotiden auftreten, da dort weniger exponierte Phosphorothioat-Verbindungen sind.
  • PCOs gemäß der Erfindung können hergestellt werden unter Verwendung von Standardtechniken zur Synthese von den einzelnen Oligonukleobasen und sie sind nützlich für alle Zwecke, für die die funktionelle Oligonukleobase nützlich ist. Das Vorstehende fasst lediglich bestimmte Aspekte der Erfindung zusammen und ist nicht dazu gedacht die Erfindung in irgendeiner Weise zu Beschränken, noch sollte dies so ausgelegt werden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine grafische Darstellung von Oligonukleobasen gemäß der Erfindung, die zwei Regionen eines pseudocyclischen Oligonukleotids (PCO) zeigt – ein funktionelles Segment (ein Antisense-Oligonukleotid) und ein protektives Segment. In pseudocyclischer Form hybridisieren das Antisense- und protektive Segment eines PCO miteinander. In Anwesenheit einer Komplementär-RNA nimmt das PCO aufgrund der höheren Stabilität des Heteroduplex zwischen Antisense-Oligonukleotid und Ziel-RNA an eine lineare Form an.
  • 2A und 2B zeigen Kapillargelelektrophorese-Profile von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 2 (2A) und SEQ ID NO: 3 (2B) in der Anwesenheit von Schlangengift-Phosphodiesterase zu den Zeitpunkten a) 0 Min., b) 5 Min. und c) 30 Min. in beiden Feldern.
  • 3 zeigt das RNase H-Spaltprofil von 5'-P32-markierter RNA in Anwesenheit von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 1, 6, 8, 10 und 11 in jeweils Bahnen 2–6. Bahn 1, markiertes C, repräsentiert Kontrolle in Abwesenheit von Antisense-Oligonukleotid.
  • 4A und 4B zeigen Inhibierung von anheftungs-unabhängigem Wachstum von GEO-Krebszellen (4A) und anheftungsabhängiges Wachstum von MDA-MB-468 Krebszellen durch Oligonukleotide, SEQ ID NO: 1, 8 und 6 bei 0,2 μM (nicht schattierte Säulen), 0,5 μM (hell schattierte Säulen) und 1,0 μM (dunkel schattierte Säulen) (4B).
  • 5 zeigt die in vivo Stabilität von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 1, 6 und 8 in Plasma bei 1 Std. (Bahn 2) und 3 Std. (Bahn 3) nach Verabreichung an Mäuse.
  • 6A, 6B und 6C zeigen Gewebedisposition (6A und 6B) und Eliminierung im Urin (6C) von Oligonukleotid SEQ ID NO: 8 nach subkutaner Verabreichung an Mäuse. In 6A und 6B zeigen nicht schattierte, hell schattierte und dunkel schattierte Säulen Gewebedisposition des Oligonukleotids bei jeweils 3 Std., 48 Std. und 96 Std. nach Verabreichung an Mäuse. Die Daten stellen den Durchschnitt ± Standardabweichung von wenigstens zwei Mäusen dar.
  • 7 zeigt eine Tabelle der Oligonukleotide, die in den Beispielen verwendet wurden, einschließlich ihrer Primär- und Sekundärstrukturen und Tms in Anwesenheit und Abwesenheit von Ziel-RNA.
  • 8 zeigt eine schematische Darstellung der Cycliconstruktur und ihre Hybridisierung mit einem komplementären Ziel-Nukleinsäurestrang. Die cyclische Strukturbildung bringt Fluorophore und Quenchermoleküle in direkte Nähe, was in FRET resultiert. Nach Bindung des Cyclicons an den Zielstrang wird die cyclische Struktur destabilisiert, um sich zu öffnen, was in Fluoreszenzemission resultiert.
  • 9A zeigt intra- (A) und intermolekulare (B) Interaktionen von Cyclicons. 9B zeigt Fluoreszenz von Oligonukleotid 14 mit ansteigender Konzentrationen der gleichen Se quenz, die ohne Fluorophore und Quenchermarkierung (0) synthetisiert ist und die gleiche Lösung in Anwesenheit eines komplementären Oligodeoxy-Nukleotidstranges (Δ).
  • 10A zeigt das Fluoreszuenzspektrum von Oligonukleotid 12 alleine und in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen des komplementären Oligodeoxynukleotids, wie bestimmt durch ABI Prisma 7700 Sequenznachweissystem in Palteread Modus. 10B zeigt einen linearen Anstieg der Fluoreszenz als eine Funktion von Zielkonzentration.
  • 11A zeigt ein Autoradiogramm, das DNA-Polymerasekettenverlängerung auf einem 40er-mer Template zeigt, unter Verwendung verschiedener Primer, die DABCYL (*) an verschiedenen Positionen des Primers enthalten. Die Bahnnummern, die oben auf dem Gel gezeigt sind, korrespondieren mit den Primernummern, die unter dem Gel angegeben sind. Die Bahn, die mit 1 bezeichnet wurde, enthielt Oligonukleotid 12 und zeigte keine Verlängerung. Die Markierungen a und b stellen Reaktionsgemische jeweils vor und nach Extension dar. 11B zeigt den korrespondierenden Echtzeit-Amplifizierungsansatz.
  • 12 zeigt die Sequenzspezifität von Cyclicons; es zeigt Oligonukleotid 13 (20 nM) in der Abwesenheit (weiße Balken) und Anwesenheit (schattierte Balken) von Ziel-DNA (50 nM).
  • 13 zeigt eine Standardkurve, die mit Oligonukleotid 14 erhalten wurde.
  • 14 ist eine Darstellung der Polymerasekettenverlängerung mit einem 5'-5'angehefteten Cyclicon als Primen-Sonde in RT-PCR. Die dicken Linien repräsentieren den DNA-Template-Strang, der es erfordert, amplifiziert zu werden. Dünne Linien repräsentieren den Vorwärts- und reversen Primer. Gepunktete Linien repräsentieren Kettenverlängerung und ihre Richtung.
  • 15 zeigt Echtzeit-Amplifizierungsansätze, ΔRn gegen Zyklusnummer, für MDM2 mRNA, extrahiert aus JAR-Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid 14 als reverse Primer-Sonde (Kurve 1) und TaqMan Primer und Sonde (Kurve 2). Puffer und Ansätze ohne Template sind an der Basislinie.
  • 16 zeigt Ansätze, die Veränderungen im Fluoreszenzmuster während der Amplifizierung in jedem Zyklus mit TaqMan Sonde (oben) und Oligonukleotid 14 (unten) zeigen.
  • 17 zeigt ein Beispiel der chemischen Struktur eines Cyclicons gemäß der Erfindung, angepasst zur Anheftung an einen festen Support.
  • 18 zeigt drei Konfigurationen eines Cyclicons, das an einen festen Support angeheftet ist (dargestellt durch den schwarzen Kreis).
  • 19A und B zeigen einen schematischen Vergleich zwischen dem herkömmlichen Nachweis von einem Nukleotid auf einem Chip und dem Nachweis von Nukleinsäuren unter Verwendung von den erfindungsgemäßen PCOs auf einem Chip.
  • 20 zeigt eine schematische Darstellung von PCR unter Verwendung eines PCO, das an einen festen Support gemäß der Erfindung angeheftet ist.
  • 21 zeigt eine schematische Darstellung, in der ein erfindungsgemäßes PCO in einer Lösungsphasen-Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäure verwendet wird, was eine Einzelschritt-amplifikation und Markierung der Ziel-Nukleinsäure mit nachfolgendem Nachweis auf einem Chip ermöglicht.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Klasse von Oligonukleotiden, pseudocyclische Oligonukleobasen ("PCOs") zur Verfügung, die im Wesentlichen aus einem funktionellen Segment, einem protektiven Segment und einem Linkersegment bestehen, wobei
    • a) das funktionelle Segment eine Oligonukleobase mit 11–75 Nukleobasen umfasst, die ein terminales Ende und ein Linkerende haben;
    • b) das protektive Segment eine Oligonukleobase mit 5–30 Nukleobasen umfasst, die ein terminales Ende und ein Linkerende hat und das sowohl zu einer Sequenz von Nukleobasen an dem terminalen Ende des funktionellen Segments komplementär ist als auch zu der Sequenz von Nukleobasen an dem terminalen Ende des funktionellen Segments, zu dem es komplementär ist, gegensätzliche Polarität hat;
    • c) das funktionelle Segment und das protektive Segment kovalent miteinander an den Linkerenden über das Linkersegment verbunden sind, wobei das Linkersegment eine direkte Bindung ist, eine Mono- oder Oligonukleobase mit 2–5 Nukleobasen ist, oder ein chemischer Rest ist;
    • d) das protektive Segment und das funktionelle Segment unter ausgewählten Bedingungen einen Doppelstrang bilden.
  • Wenn die PCO der Erfindung eingesetzt wird, um an eine Ziel-Nukleobase zu hybridisieren (z. B. und mRNA), umfasst das funktionelle Segment eine Sequenz von Nukleobasen, die komplementär zu der Ziel-Nukleobase sind und die Nukleobasesequenz des funktionellen Segments umfasst 6 oder mehr aufeinander folgende Nukleobasen, die unter den ausgewählten Bedingungen einzelsträngig sind. In solchen Ausführungsformen ist das funktionelle Segment daher wenigstens 6 Nukleobasen länger als das protektive Segment. Generell ist die PCO so konstruiert, dass das terminale Ende des funktionellen Segments einen Duplex mit dem protektiven Segment bilden wird, d. h. das protektive Segment ist komplementär zu dem terminalen Ende des funktionellen Segments.
  • Das funktionelle Segment ist eine Oligonukleobase, die eine gewünschte Funktion durchführt, z. B. ein Antisense-Oligonukleotid oder ein Aptamer.
  • Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "Nukleobase" jede heterocyclische Base, die die Fähigkeit besitzt, Wasserstoffbindung mit einem komplementären Ziel einzugehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleobase eine modifizierte oder unmodifizierte, synthetische oder natürliche Purin- oder Pyrimidinbase, z. B. Adenin, Guanin, Cytosin, Uridin, Thymin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl und andere Alkylderivate von Adenin und Guanin, 2-Propyl oder Alkylderivate von Adenin und Guanin, 5-Halouracil und Cytosin, 6-Azauracil, Cytosin und Thymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo, Amino, Thiol, Thiolalkyl, Hydroxyl und andere 8 substituierte Adenine und Guanine, 5-Trifluoromethyl und andere 5 substituierte Uracile und Cytosine und 7-Methylguanin. Andere Purine und Pyrimidine schließen die ein, die in U.S.-PS Nr. 3,687,808 offenbart sind, die, die in der Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, J. I. Kroschwitz, Hrsg. John Wiley & Sons, 1990 auf Seiten 858–859, und die, die von Englisch et al., Angewandte Chemie, Internationale Ausgabe 1991, 30, 613, offenbart sind. Nukleotide sind bevorzugte Nukleobasen.
  • Ein "Oligonukleobase" ist ein Polymer von Nukleobasen, das an ein komplementäres Ziel durch beispielsweise Watson-Crick-Basenpaarung hybridisieren kann. Nukleobasen der Oligonukleobase können durch Inter-Nukleotidverbindungen verbunden sein, z. B. Peptidylverbindungen, wie im Fall von Peptid-Nukleinsäuren (PNAs); Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497 und U.S.-PS Nr. 5,539,082 ) und Morpholinoverbindungen (Qin et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10, 11 (2000); Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 187 (1997); Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7, 63 (1997); Taylor et al., J Biol Chem. 271, 17445 (1996); Partridge et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6, 169 (1996)) oder durch jede andere natürliche oder modifizierte Verbindung. Die Oligonukleobasen können auch geschlossene (Locked) Nukleinsäuren sein (LNAs). Nielsen et al., J Biomol Struct dyn 17, 175 (1999); Petersen et al., J Mol Recognit 13, 44 (2000); Nielsen et al., Bioconjug Chem 11, 228 (2000). Oligonukleotide sind bevorzugt Oligonukleobasen.
  • Zusätzlich offenbart WO 96 35706 Oligonukleotide, die eine duplexbildende Region, eine triplexbildende Region und eine Linkerregion haben, wobei die duplexbildende Region komplementär zu einer Pyrimidinregion einer Ziel-Nukleinsäure ist und in der Lage ist, einen Duplex mit dieser Ziel-Nukleinsäure zu bilden. Die triplexbildende Region ist in der Lage, sowohl an die duplexbildende Region als auch an die Duplexe, die zwischen der duplexbildenden Region und der Pyrimidinregion der Ziel-Nukleinsäure gebildet wurden, zu binden, wodurch ein Triplex gebildet wird. Die duplexbildende Region und die triplexbildende Region haben gegensätzliche Polarität und sind miteinander durch eine Linkerregion verbunden. Diese zwei Stränge sind angeheftet durch entweder 3'-3'- oder 5'-5'-Verbindung, so dass die komplementären Stränge einen Parallelstrang-Haarnadelduplex (hairpin-duplex) bilden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleobasen durch ein Zuckerphosphatrückgrat verbunden. Die Zuckergruppe kann natürlich oder modifiziert sein; vorzugsweise ist die Zuckergruppe eine Pentosefuranosylgruppe, die eine Ribose sein kann, substituierte Ribose und 2'-Deoxyribose. Wenn die Zuckergruppe eine Ribose ist, verbindet sie angrenzende Nukleobasen über eine 3'-5'- (bevorzugt) oder 2'-5'-Verbindung. Bevorzugte substituierte Ribosegruppen sind 2'-O-substituierte Ribose, wobei der 2'-O-Substituent ein C1–6-gesättigtes oder -ungesättigtes Alkyl umfasst (vorzugsweise Methyl), C1–6-6-Alkoxy-C1–6-alkyl (vorzugsweise Methoxyethyl) oder eine Anl- oder Allylgruppe, die 2–6 Kohlenstoffatome hat, wobei eine solche Alkyl-, Anl- oder Allylgruppe unsubstituiert sein kann oder substituiert sein kann, z. B. mit Halo-, Hydroxy-, Trifluormethyl-, Cyano-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-, Carboxyl-, Carbalkoxyl- oder Aminogruppen; oder solche substituierten Ribosegruppen können solche sein, die eine 2'-Substitution mit solch einer Amino- oder Halogruppe tragen.
  • Die Phosphatgruppe ist eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterverbindung, der zum Beispiel einschließt Phosphorothioat (vorzugsweise) Phosphorodithioat, C1–6-Alkylphosphonat, C1–6-Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoamidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, verbrücktes Phosphoramidat, verbrücktes Methylphosphonat, verbrücktes Phosphorothioat, Phospholinol, Boranophosphat (Shaw of al., Methods Enzymol. 313, 226 (2000), Rait et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9, 53 (1999); Porter et al., Nucleic Acids Res. 15, 1611 (1997) und SulfoninterNukleotidverbindungen. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist diese Phosphatgruppe ein Phosphodiester, Phosphotriester, Phosphorothioat oder Phosphoramidatverbindungen oder Kombinationen davon. Oligonukleobasen gemäß der Erfindung können jede Kombination von Nukleobasen und Inter-Nukleobasenverbindungen umfassen.
  • In vielen Ausführungsformen tritt intramolekulare Duplexbildung zwischen Segmenten definierter Polarität in paralleler oder antiparalleler Weise auf. Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "Polarität" auf das Konzept der Direktionalität in der Primärstruktur (z. B. 3' → 5' und 5' → 3' im Fall von DNA und RNA oder N-terminal → C-terminal (oder umgekehrt) im Fall von PNAs). In dem Fall, in dem die erfindungsgemäßen PCOs beispielsweise Oligonukleotide umfassen, die durch Watson-Crick-Basenpaarung in antiparalleler Weise hybridisieren, wird das protektive Segment in der 3'- (oder 2'-) → 5'-Konfiguration sein und die Sequenz des Nukleotids, zu dem es in dem funktionellen Segment komplementär ist, wird in der 5'- zu 3'- (oder 2'-) Konfiguration sein oder umgekehrt. Die Veränderung der Polarität in dem PCO kann überall in dem PCO auftreten, anders als in dem protektiven Segment und der Sequenz der Nukleotide in dem funktionellen Segment, zu dem das protektive Segment komplementär ist. In einer bevorzugten Ausführungsform, in der das PCO Oligonukleotide umfasst, ist das funktionelle Segment in der 3' → 5'-Konfiguration und das protektive Segment ist in der 5' → 3'-Konfiguration oder umgekehrt.
  • Oligonukleobasen, die in den PCOs der Erfindung verwendet werden, können auch zusätzliche Substituenten haben, einschließlich, ohne Einschränkung lipophile Gruppen, interkalierende Mittel, Biotin, Streptavidin, Diamine und Adamantane. Solche Substituenten können beispielsweise erwünscht sein, um die zelluläre Aufnahme zu verstärken. Solche Gruppen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Gruppen, wie einer Cholesterin-Gruppe, einer Cholesteryl-Gruppe (Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553), Cholinsäure (Manoharan of al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Let., 4, 1053), ein Thioether, z. B. Hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 306; Manoharan et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765), ein Thiocholesterinl (Oberhauser et al. (1992) Nucl. Acids Res., 20, 533), eine aliphatische Kette, z. B. Dodecandiol oder Undecylreste (Saison-Behmoaras et al. (1991) EMBO J., 10, 111; Kabanov et al. (1990) FEBS Lett., 259, 327; Svinarchuk et al. (1993) Biochimie, 75, 49), ein Phospholipid, z. B. Dihexadecyl-rac-glycerol oder Triethylammonium-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651; Shea et al. (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3777), eine Polyamin- oder eine Polyethylenglycolkette (Manoharan et al. (1995) Nucleosides & Nukleotides, 14, 969) oder Adamantanessigsäure (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651). Oligonukleotide, die lipophile Gruppen umfassen und Verfahren zur Herstellung solcher Oligonukleotide sind auf dem Fachgebiet bekannt, zum Beispiel U.S.-PS Nr. 5,138,045 , Nr. 5,218,105 und Nr. 5,459,255 .
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Ausdruck "komplementär" auf ein Paar von Nukleobasen, die miteinander Wasserstoffbrücken bilden, bevorzugt zu anderen heterocyclischen Basen unter ausgewählten (z. B. physiologischen) Bedingungen. Wenn die Nukleobasen modifiziert oder unmodifiziert sind, natürliche oder synthetische Purine und Pyrimidine, bedeutet der Ausdruck "komplementär", dass sie komplementär im Sinn von Watson Crick sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind das funktionelle Segment und das protektive Segment Oligonukleotide, die in modifizierten oder unmodifizierten Deoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden oder Kombinationen davon umfasst sind, die Phosphodiester-Verbindungen, Phosphorothioat-Verbindungen oder Kombinationen davon haben.
  • PCOs nehmen intramolekular pseudocyclische Strukturen unter ausgewählten Bedingungen (die von der gewünschten Anwendung abhängen) an. Wie hier verwendet, werden "ausgewählte Bedingungen", "gewünschte Bedingungen" und "Bedingungen von Interesse" abwechselnd verwendet und beziehen sich auf eine oder mehrere verschiedene Bedingungen, unter denen die erfindungsgemäßen PCOs verwendet werden können. Wie vollständiger nachstehend beschrieben, können die erfindungsgemäßen PCOs als Antisense-Oligonukleotide verwendet werden (in diesem Fall können die "ausgewählten Bedingungen" physiologisch sein), genauso wie für Enzym-katalysierte Amplifizierungsassays (in diesem Fall können die "ausgewählten Bedingungen" die sein, die für die Amplifizierungsreaktion verwendet werden, z. B. PCR). Der Fachmann versteht, dass die PCOs der Erfindung unterschiedlich konstruiert werden müssen, um unter den verschiedenen Bedingungen (z. B. Salzkonzentrationen, usw.) richtig zu funktionieren. Die pseudocyclische Strukturbildung wurde durch thermales Schmelzen gezeigt und in vitro und in vivo Nukleasestabilitätsstudien sind nachstehend gezeigt. Pseudocyclische Strukturbildung steigert die Resistenz gegen Abbau (nukleolytisch oder anders).
  • Wenn die PCO ein Antisense-Oligonukleotid ist, nimmt sie eine lineare Form in Anwesenheit von komplementärer Ziel-RNA an und bindet an die Ziel-RNA wie durch thermales Schmelzen und RNase H-Spaltungsstudien gezeigt. In der linearen Form hybridisiert das funktionelle Segment (unter physiologischen Bedingungen, zu einem Minimum) mit der komplementären Ziel-RNA (falls anwesend), um einen Duplex zu bilden. Dieser Duplex ist ein Substrat für RNase H und in Anwesenheit von RNase N unter den geeigneten Bedingungen (z. B. phy siologisch) wird der RNase-Strang des Duplex durch RNase H gespalten, wodurch die Expression verhindert wird.
  • Ist das funktionelle Segment der erfindungsgemäßen PCO ein Antisense-Oligonukleotid, enthält es vorzugsweise wenigstens 4 aufeinander folgende Deoxyribonukleotid Phosphodiester oder Phosphorothioate. Die Sequenz von wenigstens 4 aufeinander folgenden Deoxyribonukleotid Phosphodiestern oder Phosphorothioaten ermöglicht es einem Duplex, der zwischen dem funktionellen Segment und einer komplementären Ziel-RNA gebildet wurde, ein Substrat für RNase N zur Spaltung einer Ziel-RNA zu sein.
  • Die einzige Beschränkung der Nukleobase- und Inter-Nukleobaseverbindungen ist, dass sie nicht (a) die Fähigkeit des protektiven Segments an das funktionelle Segment der PCO zu hybridisieren und einen Duplex mit dem funktionellen Segment des PCOs unter den gewünschten Bedingungen zu bilden (b) die Fähigkeit des funktionellen Segments, seine geplante Funktion auszuführen (z. B. im Falle eines funktionellen Segments, das ein Antisense-Oligonukleotid ist, zu hybridisieren an und einen Duplex zu bilden mit einem kcmplementären RNA-Segment unter physiologischen Bedingungen, wobei der Duplex ein Substrat für RNase H ist, eliminieren. Bevorzugte Nukleobase- und inter-Nukleobaseverbindungen sind die, die die Stabilität von der PCO gegen Nukleasen und andere Formen chemischer Degradation verstärken und/oder die Fähigkeit des funktionellen Segments, seine geplante Funktion auszuführen, verstärken.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn das funktionelle Segment ein Antisense-Oligonukleotid ist, umfasst das PCO gemäß der Erfindung eine oder mehrere und vorzugsweise von zwei bis vier 2'-substituierte Nukleotide (vorzugsweise 2'-O-substituierte, bevorzugter 2'-O-Methyl oder 2'-Methyloxyethyl), die vorzugsweise an den terminalen Enden des funktionellen und/protektiven Segments sind.
  • In anderen Ausführungsformen kann das funktionelle Segment jedes Oligonukleobasemotiv sein, das eine gewünschte Funktion oder Reaktion durchführt oder induziert. Somit kann das funktionelle Segment beispielsweise auch ein Ribozym sein.
  • Alternativ kann das funktionelle Segment ein CpG-Motiv haben, das Immunstimulierung induziert, wie beschrieben in U.S. 5,856,462 .
  • In einer anderen Ausführungsform kann das funktionelle Segment eine molekülbindende Oligonukleobase sein, wie ein Aptamer. (Ellington und Szostak (1990) Nature, 346, 818–822), Famulok und Szostak (1992) J. Am. Chem. Soc. 114, 3990–3991; Ellington und Szostak (1992) Nature 355, 850–852; Tuerk und Gold (1990) Science 249, 505-510; Famulok und Szostak (1992) Angew. Chem. Intl. Ausgabe Engl. 31, 979–988; Bock et al. (1992) Nature 355, 564–566); Famulok und Szostak (1992) Angew. Chem. Intl. Ausgabe Engl. 31, 979–988; Gannon of al. (1990) EMBO J. 9, 1595–1602; Steven und Lane (1992) J. Mol. Biol. 255, 577–583). Man weiß, dass Proteine mit spezifischen Nukleotidmotiven interagieren, sowohl mit Einzelstrang- als auch Doppelstrang-Nukleinsäuren und Oligonukleotiden.
  • Oder das funktionelle Segment kann einfach eine Sonde für eine Ziel-Nukleinsäure sein und eine Nukleobasesequenz haben, die komplementär zu dem Ziel ist.
  • Das Linkersegment kann eine direkte Bindung, eine Mono- oder Oligonukleobase von 2–5 Nukleobasen oder andere chemische Gruppen seine. Die einzige Beschränkung des Linkersegments ist, dass es nicht die essentiellen Funktionen der PCO eliminiert, nämlich (a) die Fähigkeit der PCO, eine intermolekulare pseudocyclische Struktur unter den Bedingungen von Interesse zu bilden (z. B. physiologischen Bedingungen) und (b) die Fähigkeit des funktionellen Segments, seine geplante Funktion auszuführen. Bevorzugte "andere chemische Gruppen" Linker schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Ethylenglycol, Tri(ethylenglycol), Tetra(ethylenglycol), Penta(ethylenglycol), Hexa(ethylenglycol) und -NH(CH2)nNH-, wobei n 2, 3, 4, 5 oder 6 ist. Alternativ kann das Linkersegment eine Kombination des vorhergehenden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Linker eine direkte Bindung, in diesem Fall sind die funktionellen und protektiven Segmente direkt in einer 3'-3'- oder 5'-5'-Konfiguration gebunden.
  • Das funktionelle Segment und das protektive Segment können unabhängig voneinander mit dem Linkersegment durch die terminate Linkerend-Nukleobase an der Nukleobase oder der Inter-Nukleotidverbindung (die bei einem Nukleotid eine Zucker- oder Phosphatgruppe sein kann) verbunden sein. Wenn das Linkersegment eine Mono- oder Oligonukleobase ist, kann sie mit dem funktionellen oder protektiven Segment an ihrer Basen- oder Inter-Nukleobasenverbindung (z. B. Zucker- oder Phosphatgruppe) genauso verbunden werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das funktionelle Segment der PCO der Erfindung ein Antisense-Oligonukleotid zur Spaltung einer Ziel-RNA und
    • a) das funktionelle Segment besteht im Wesentlichen aus einem Oligonukleotid von 11 bis 50 Nukleotiden Länge, die eine Sequenz, komplementär zu einer RNA, die gespalten werden soll, haben, wobei die 11 bis 50 Nukleotide eine Sequenz von 4 bis 50 Deoxyribonukleotid Phosphodiester oder Phosphorthioate enthalten;
    • b) das protektive Segment im Wesentlichen aus einem Oligonukleotid von 5 bis 8 Nukleotiden Länge besteht und komplementär zu einer Sequenz von Nukleotiden in dem funktionellen Segment ist;
    • c) die ausgewählten Bedingungen physiologische Bedingungen sind, unter denen und in Abwesenheit von RNA das protektive Segment und das funktionelle Segment einen Duplex bilden; und
    • d) unter physiologischen Bedingungen und in Anwesenheit von RNA, die eine Sequenz von Nukleotiden hat, die komplementär zu dem funktionellen Segment sind, bildet das funktionelle Segment einen Duplex mit der komplementären RNA.
  • In einer anderen Ausführungsform kann der Duplex, der zwischen dem funktionellen Segment und dem protektiven Segment gebildet wurde, selbst eine funktionelle Einheit sein. Beispielsweise kann der Duplex ein Ziel für die Bindung einer endogenen Nukleinsäure durch Triplexbildung sein. Alternativ kann der Duplex ein Substrat für ein duplexbindendes Molekül, z. B. ein Transkriptionsfaktor, sein.
  • In einem anderen Aspekt der Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen PCOs weiterhin ein "Donor"- Molekül und ein "Akzeptor"- Molekül. Der Donor oder der Akzeptor oder beide sind in der Lage, eine beobachtbare Eigenschaft auf den anderen durch radioaktiven oder nichtradioaktiven Energietransfer auszuüben, wenn sie zueinander in Nähe gebracht werden. Der Donor und der Akzeptor sind an das PCO in einer Weise geheftet, so dass eine beobachtbare Eigenschaft des Donors und/oder Akzeptors sich ändert, im Vergleich dazu, wenn das PCO in nichtkatalytischer Form ist.
  • Als erläuterndes Beispiel ist der Donor in einer bevorzugten Ausführungsform ein Fluoreszenzenergiedonor ("FRED") (z. B. eine Fluorophore) und der Akzeptor ist ein Fluoreszenzenergieakzeptor ("FREA") (z. B. ein Quencher). Der FRED und der FREA sind so angeheftet, dass der FRED und der FREA nahe genug zueinander gebracht werden, um dem FRED und dem FREA zu ermöglichen, Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) zu durchleben, wenn die Oligonukleobase in cyclischer Form ist (z. B. in Abwesenheit der Ziel-Nukleinsäure). Das Ergebnis ist, dass eine Veränderung in der Fluoreszenz beobachtet wird (z. B. eine Veränderung der Intensität (entweder Verstärkung oder Verringerung) oder eine Veränderung der Farbe). Beispielsweise wird eine Verringerung der Fluoreszenz beobachtet, wenn FRED eine Fluorophore ist und FREA ein Quencher, wenn die zwei in die Nähe zueinander gebracht werden. Wenn das funktionelle Segment an die Komplementärsequenz einer Ziel-Nukleinsäure bindet, wird die cyclische Struktur des Cyclicons geöffnet und die Fluorophore und der Quencher werden weit genug voneinander getrennt, um FRET zwischen den Donor- und Akzeptormolekülen zu zerstören, was in spontaner Fluoreszenz resultiert.
  • In dieser Ausführungsform ist der Fluoreszenzresonanzenergiedonor (FRED) (z. B. eine Fluorophore wie Fluorescein) an das Modifikator-Oligonukleotid (d. h. protektives Segment) geheftet, vorzugsweise an dem freien Ende (3'- oder 5'-). Der Modifikator ist vorzugsweise 4 bis 8 Nukleobasen lang und ist komplementär zu dem 3'- oder 5'-Ende der Primer-Sonde (d. h. funktionelles Segment), das selbst vorzugsweise 15–20 Nukleobasen lang ist und komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure. Ein FREA (z. B. ein Fluoreszenzquencher wie DABCYL) wird in die Primer-Sondensequenz eingebaut (8). Alternativ kann der FRED (z. B. eine Fluorophore) auf der Primer-Sondensequenz sein und der FREA kann auf dem Modifiikator-Oligo sein. In noch einer anderen Ausführungsform können beide, FREA und FRED, auf dem gleichen Segment sein, so dass der FREA und der FRED in dichte Nähe geraten oder getrennt werden, so dass ein effizienter Energietransfer zwischen den beiden entweder erleichtert oder verhindert wird, wenn das funktionelle Segment des Cyclicons mit dem Zielmolekül interagiert mit einer konsequenten Veränderung der Tertiärstruktur des Cyclicons. Generell können Donor/Akzeptor-Paare (es können FRED/FREA oder andere sein) überall lokalisiert sein und sie können in einer Weise angeheftet sein, die in Einklang steht mit der Fähigkeit des PCOs, einen intramolekularen Duplex unter ausgewählten Bedingungen zu bilden, der Fähigkeit des funktionellen Segments in der ihm zugedachten Weise zu funktionieren und der Fähigkeit des nachweisbaren Energietransfers (z. B. Fluoreszenz), nach Öffnung des PCOs aus seinem cyclischen Stadium aufzutreten.
  • In Abwesenheit der Ziel-Nukleinsäure bilden Cyclicons intramolekulare cyclische Strukturen; in diesem Stadium werden die Fluorophore und der Quencher nah zueinander in dichte Nähe gebracht (8), was in dem Verlust von Fluoreszenz aufgrund von FRET resultiert. In der Anwesenheit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in der Lösung hybridisiert die Sondensequenz an die komplementäre Sequenz auf dem Ziel, destabilisiert die intramolekulare cyclische Struktur und verursacht ein Öffnen, was in spontaner Fluoreszenzemission resultiert. Die Anwesenheit von Fluoreszenz weist auf Hybridisierung zwischen der Ziel-Nukleinsäure und der Sondensequenz des Cyclicons hin (8).
  • Generell haben Cyclicons mit einem 5'-5'-verbundenen Primer-Sonden/Modifikator-Oligos geringere Hintergrundfluoreszenz als 3'-3'-angeheftete Cyclicons. Diese Differenz könnte die größere Distanz zwischen der Fluorophore und dem Quencher in dem 3'-3'-verbundenen Cyclicon widerspiegeln, als ein Ergebnis von 3'-Verdrehung der zwei Stränge der Duplex-DNA. Es ist angebracht, keine Base zwischen der Fluorophore und dem Quencher in 3'-3'verbundenen Cyclicons auszulassen, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Die optimale Entfernung zwischen den FRED- und FREA-Molekülen, um FRET zu zerstören und vollständige Fluoreszenz zu erreichen, ist etwa 70 bis 100 Å (49,50). Vorzugsweise wird eine Entfernung von etwa neunzehn Inter-Nukleotidphosphatbrücken zwischen den Donor- und Akzeptormolekülen aufrecht erhalten. In einer solchen Konfiguration, wenn das Cyclicon an die Ziel-Nukleinsäuresequenz hybridisiert, werden die FRED- und FREA-Moleküle etwa 70 Å auseinandergezogen, was wirksam FRET zwischen den Molekülen vermindert und in spontaner Fluoreszenzemission resultiert. Für den Fachmann ist es Routine, geeignete Platzierung von Donor- und Akzeptormolekülen in der Oligonukleobase zu finden, so dass Energietransfer zwischen den beiden möglich ist, wenn das Cyclicon in dem zirkulären Status ist, jedoch nicht in dem linearen Status möglich ist, oder umgekehrt.
  • Das protektive und das funktionelle Segment sind miteinander durch ein Linkersegment in entweder einer 3'-3'- oder 5'-5'-Konfiguration verbunden, wie für die Anwendung des Cyclicons erforderlich. Beispielsweise würde für die Verwendung in zellulären Studien eine 3'-3'-Verbindung geeigneter sein, aufgrund der höheren Stabilität von 3'-3'-verbundenen Oligonukleotiden gegen Nuklease in in vitro und in vivo Studien (6), wohingegen für einen Primer in PCR-Reaktionen ein 5'-5'-verbundenes Cyclicon mit einem freien 3'-Ende geeigneter ist.
  • Cyclicons, die Donor/Akzeptorpaare (z. B. ein FRED/ FREA-Paar) tragen, können verwendet werden, um die Konzentration von spezifischen mRNAs oder cDNAs in Gesamtzellextrakten oder Enzym-amplifizierten (z. B. PCR) Nukleinsäuren (z. B. DNA), in homogener Umgebung (Flüssigphase) oder wenn die Probe an eine Festphase geheftet ist, zu messen. Cyclicons gemäß diesem Aspekt der Erfindung sind nützlich als Primer oder integrierte Primer-Sonden in Enyzm-katalysierten Amplifizierungsreaktionen (z. B. Realtime-PCR (Echtzeit-PCR) zur Überwachung von Nukleinsäureamplifikation. In Verwendungen als Primer oder Primer-Sonde in der Enzym-katalysierter Amplifikation ist das funktionelle Segment komplementär zu dem terminalen Teil der Nukleinsäure, die amplifiziert werden soll. Das Cyclicon selbst kann mit der festen Oberfläche verbunden sein oder es kann ein Bestandteil der Lösung sein, die mit der festen Oberfläche in Kontakt gebracht wird, wenn es als ein Primer oder Primer-Sonde in einer Enzym-katalysierten Amplifikation verwendet wird. Vergleiche 20 und 21.
  • Erfindungsgemäße Cyclicons bieten gegenüber der TAQMAN®-Sonde Vorteile, in der eine Sonde mit einem Quencher und einer Fluorophore an jedem Ende markiert ist. Die TAQMAN®-Sonde wird durch die 5'-Exonukleaseaktivität der DNA-Polymerase während der PCR geschnitten, wodurch eine freie Fluorophore entlassen wird und dadurch wird das Fluoreszenzsignal gesteigert. Die Sondenfunktion des Cyclicons ist unabhängig von der Nukleaseaktivität der Polymerase und somit kann sie mit Polymerasen ohne Nukleaseaktivität verwendet werden. Nukleasen ohne Polymeraseaktivität sind wesentlich günstiger als Polymerasen, die eine Nukleaseaktivitätsuntereinheit besitzen. Die integrierte Primer-Sondenfunktion von Cyclicons ist ein wichtiger Schritt vorwärts in dem PCR-Nachweis und der Diagnostik ohne die Gesamtlänge des Oligonukleotids (verglichen mit der Länge und den Modifikationen, die in dem Scorpion eingebaut sind) und, Kosten aufs Spiel zu setzen. Zusätzlich vereinfacht die Verwendung einer einheitlichen Primer-Sonde in dem PCR-Nachweis den Reaktionsansatz und verhindert unnötige Verschleppungskontaminationen.
  • Eine Anzahl von Donor/ Akzeptormolekülen, die geeignet zur Verwendung als FREDs und FREAs sind, sind in dem Fachgebiet bekannt. Die Fachleute werden hingewiesen auf U.S. 5,866,336 (das '336-Patent) für seine Lehren bezüglich solcher Moleküle. Solche Moleküle können mit den erfindungsgemäßen Cyclicons. verbunden sein, mit der Basengruppe der Nukleobase oder einer Oligonukleobasenrückgratgruppe (z. B. die 2'-Position eines Nukleotidzuckerrestes). Beispielsweise lehrt Yamana et al., Nucleic Acids Res. 27, 2387 (1999) 2'-Pyren-modifizierte Oligonukleotide als hochsensitive Sonden für RNA. Auch Barrio et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 46, 597 (1972) lehrt Fluoreszenzadenosin- und – cytidinderivate.
  • Moleküle, die gewöhnlich in FRET verwendet werden, schließen Fluorescein, 5-Carboxyfluorescein (FAM), 2'7-Dimethoxy-4'5'-dichlor-6-carboxyfluorescein (JOE), Rhodamin, 6-Carboxyrhodamin (R6G), N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 4-(4'-Dimethylaminophenylazo)benzonsäure (DABCYL), Cy3, Cy5 und 5-(2'-Aminoethyl)aminonaphthalen-1-sulfonsäure (EDANS) ein. Ob eine Fluorophore ein Donor oder ein Akzeptor ist, wird durch ihr Anregungs- und Emissionsspektrum definiert und durch die Fluorophore, mit der sie gepaart ist. Beispielsweise wird FAM am wirksamsten durch Licht einer Wellenlänge von 488 nm angeregt und es emittiert Licht mit einem Spektrum von 500 bis 650 nm und einem Emissionsmaximum von 525 nm. FAM ist eine geeignete Donorfluorophore zur Verwendung mit JOE, TAMRA und ROX (die alle ihr Anregungsmaximum bei 514 nm haben).
  • FRET-Markierungen wurden in Immunofluoreszenzassays eingeschlossen, die verwendet wurden, um spezifische Antigene nachzuweisen (Ullman et al. U.S.-PS Nr. 2,998,943 ; 3,996,345 ; 4,160,016 ; 4,174,384 ; und 4,199,559 ). Verschiedene Patente lehren die Anwendung von Energietransfer auf Polynukleotidhybridisierung (U.S.-PS Nr. 4,996,143 ; 5,532,129 und 5,565,322 ).
  • Die europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer EP 0 229 943 A2 lehrt spezifizierte Entfernungen zwischen Donor und Akzeptor für maximalen FRET. Sie offenbart auch, dass Donor- und Akzeptormarkierungen auf der gleichen Sonde lokalisiert sein können.
  • Eine ähnliche Anwendung von Energietransfer wurde von Cardullo et al. in einem Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäurehybridisierung offenbart (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790–8794 und WO 92/14845 ). Fluorescein (Donor) und Rhodamin (Akzeptor) sind an die 5'-Enden von komplementären Oligodeoxynukleotiden geheftet.
  • Andere Publikationen haben die Verwendung von Energietransfer in einem Verfahren zur Einschätzung von Entfernungen zwischen spezifischen Steilen in der DNA offenbart (Ozaki und McLaughlin, 1992, Nucl. Acids Res., 20: 5,205–5214), in einem Verfahren zur Analyse der Struktur von Vier-Wege-DNA-Verbindung (Clegg et al. 1992, Biochem., 31: 4846–4856) und in einem Verfahren zur Beobachtung der helikalen Geometrie von DNA (Clegg et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2994–2998).
  • Das '366-Patent offenbart die Verwendung von FRED/FREA- Paaren in synthetischen Analoga von natürlich vorkommenden Haarnadelstrukturen (hairpin structures). Die Cyclicons der vorliegenden Erfindung sind strukturell unterschiedliche, nicht natürlich vorkommende Konstrukte, die wenigstens zwei terminale Sequenzen (das funktionelle Segment und das protektive Segment) von gegensätzlicher Polarität enthalten, was in einem Molekül resultiert, das zwei 3'- oder zwei 5'-Enden besitzt. Diese Eigenschaft resultiert in verschiedenen physikochemischen Eigenschaften; sie ermöglichen es generell Cyclicons, aus weniger Nukleobasen zu bestehen und sie sind somit weniger teuer herzustellen.
  • Aus dem Vorstehenden sollte klar sein, dass alle oder jeder Teil des funktionellen Segments der PCO ihre Funktionalität geben kann. Somit kann beispielsweise, wenn die Funktionalität der PCO ein Antisensemittel ist, das gesamte funktionelle Segment oder nur ein Teil davon Antisense zu dem Ziel sein. Oder, als ein weiteres Beispiel, wo die Funktionalität der PCO die Bindung eines Proteins an den PCO-Duplex ist (palindromisch oder decoy (Falle)), befin det sich die Funktionalität in der Sequenz des Nukleotids in dem funktionellen Segment, das komplementär zu dem protektiven Segment ist, d. h. die Sequenz, die an der Duplexbildung beteiligt ist.
  • Die erfindungsgemäßen PCOs können leicht auf einen geeigneten festen Support synthetisiert werden, unter Verwendung von gutbekannten chemischen Ansätzen, einschließlich für Oligonukleotide, H-Phosphonatchemie, Phosphoramiditchemie oder eine Kombination von H-Phosphonatchemie und Phosphoramiditchemie (d. h. H-Phosphonatchemie für einige Zyklen und Phosphoramiditchemie für andere Zyklen. Geeignete feste Supports schließen alle der standardfesten Supports ein, die für Festphasen-Oligonukleotidsynthese verwendet werden, wie kontrolliertes Porenglas (CPG). (Siehe z. B. Pon (1993) Methods in Molec. Biol. 20, 465).
  • Die PCOs gemäß der Erfindung können für jeden Zweck verwendet werden, für den ihre funktionelle Segmentoligobase verwendet werden kann. Beispielsweise können sie als "Sonden" verwendet werden. Sie können auch verwendet werden, um die biologische und/oder physiologische Funktion von einem Ziel-Gen aufzuklären, durch ihre Verwendung, um die Aktivität des Gens in einem experimentellen Zellkultur- oder Tiersystem zu inhibieren. In solchen Anwendungen werden die erfindungsgemäßen PCOs verwendet, um die Spaltung eines Ziel-mRNA-Moleküls durch In-Kontakt-Bringen der PCO mit der Ziel-mRNA in Anwesenheit von RNase H, die die RNA von RNA/DNA-Duplexen spaltet, zu bewirken. Dies wird in vitro und in vivo erreicht durch Verabreichung einer PCO gemäß der Erfindung an jeweils eine Zelle oder ein Tier, wobei das funktionelle Segment eine Antisense-Oligonukleobase (vorzugsweise Oligonukleotid), komplementär zu der Ziel-mRNA umfasst und die Wirkungen beobachtet werden. In dieser Verwendung sind die PCOs gemäß der Erfindung herkömmlichen (Gen-Knockout)-Ansätzen vorzuziehen, da sie leichter zu verwenden sind und verwendet werden können, um Genaktivität in bestimmten Stadien der Tumorentwicklung oder -differenzierung zu inhibieren.
  • Ist das funktionelle Segment eine Antisense-Oligonukleobase (vorzugsweise Oligonukleotid), sind die PCOs gemäß der Erfindung auch nützlich in therapeutischen Ansätzen, in denen die Inhibierung von Genexpression gewünscht ist. Dies kann beispielsweise die Inhibierung eines endogenen Gens (z. B. eines Onkogens) oder eines exogenen Gens (z. B. eines Gens, das essentiell für Wachstum und/oder Metabolismus eines Pathogens ist) einschließen.
  • Die erfindungsgemäßen PCOs können in einer Lösungsphase oder in der Festphase verwendet werden, z. B. angeheftet an einen Biochip oder Magnetkügelchen für Nukleinsäure- Screenings mit hohem Durchsatz und Festphasen-PCR. Die Anheftung kann an jedem Ende der PCOs erfolgen (d. h. an dem protektiven Segmentterminus oder dem funktionellen Segmentterminus) oder überall in den funktionellen, protektiven oder Linkersegmenten und sie kann durch jedes geeignete Mittel, das in dem Fachgebiet bekannt ist, erfolgen. PCOs können in DNA- oder Oligonukleotid-Microarrays auf einem festen Support (Glas, Membran, Glasfaser, Siliconchips, usw.) zur Genexpressionsbeschreibung und -analyse, Diagnose, Toxikologie, zum Nachweis von genetischen Mutationen, zur Einzelnukleotidpolymorphismusanalyse, molekulare Pharmakologie, usw. verwendet werden. Zum Beispiel Case-Green et al., Current Opinion in Chem Biol. 2, 404 (1998). Die Verwendung von PCOs gemäß der Erfindung in Festphasennachweis ermöglicht beispielsweise eine Anzahl von Vorteilen gegenüber herkömmlichen Nachweistechniken auf einem Chip, wie gezeigt in 19. Während die Qualitätskontrolle von jedem Fluoreszenzpunkt (spot) in herkömmlicher Chiptechnologie schwierig und mengenbezogen ist, erlaubt die Verwendung der erfindungsgemäßen PCOs die präzise Quantifizierung. Der herkömmliche Nachweis auf einem Chip erfordert eine getrennte Sonde mit einer Nachweismarkierung, was in einem Zweischritt-Nachweisprozess resultiert: 1) anfängliche Hybridisierung mit der Ziel-Nukleinsäure und 2) eine zweite Hybridisierung zwischen der Ziel-Nukleinsäure und der Nachweissonde. Im Gegensatz dazu ermöglichen die PCOs Hybridisierung und Nachweis in einem Einzelschritt.
  • 20 zeigt ein schematisches Diagramm, in dem eine PCO, die mit Donor/ Akzeptorpaaren markiert ist, mit einer festen Oberfläche verbunden ist, wobei das funktionelle Segment der PCO komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure ist, die durch PCR amplifiziert werden soll (auch andere enzymatische Amplifikationsprotokolle könnten eingesetzt werden). Während der Amplifikation, wenn die PCO in die intermolekulare Hybridisierung involviert ist, wird ein nachweisbares Signal durch das Donormolekül (z. B. FRED) emittiert.
  • 21 zeigt ein schematisches Diagramm, in dem das funktionelle Segment einer PCO, die mit Donor/Akzeptorpaaren markiert ist, als Primer-Sonde dient. Die Amplifikation resultiert in einer markierten Nukleinsäure, die direkt auf einen Microarray-DNA-Chip gegeben werden kann. Dieses Verfahren verhindert die Notwendigkeit, cDNA vor der Hybridisierung an einen cDNA-Gen-Microarray zu reinigen, zu isolieren und zu markieren. Zusätzlich besteht keine Notwendigkeit, getrennte Reaktionen zur Identifizierung von verschiedenen RNAs (oder Genexpressionen) durchzuführen. Verschiedene biotinylierte Primer (Sonden) und verschiedene Cyclicons für jede spezifische RNA können zur Amplifikation eingesetzt werden und die resultierende Lösung kann direkt auf einen Mikroarray gegeben werden ohne weitere Trennung, Isolierung oder Markierung, um zu identifizieren, welche Gene exprimiert werden. Da die erste Erkennung der RNA von einem (einer) biotinylierten Pri mer/Sonde kommt und die zweite Erkennung von einer Cyclicon-Primer-Sonde, sollte die Spezifität der Amplifikation wesentlich höher sein als reguläre Amplifikationsverfahren, wodurch Falschpositive reduziert werden.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung umfasst PCOs, die zur Bindung an eine feste Oberfläche angepasst sind. Solche PCOs umfassen erfindungsgemäße PCOs, die eine angeheftete chemische Gruppe haben, die die Verbindung der PCO mit dem festen Support (z. B. Glas, Siliconchips, magnetische Kügelchen, Membranen (z. B. Nylonmembranen), Platten mit 96 Vertiefungen, usw.) erleichtern. Solche chemischen Gruppen schließen diejenigen zur kovalenten Verbindung mit einen festen Support ein, wie C1–12-Alkylaminolinker, die optional substituiert sind mit Hydroxy-C1–6-alkyl, C1–12-Alkylsuccinimide und Thiol, genauso wie die für nicht-kovalente Bindungen, wie Biotin, Avidin oder Streptavidin (zur Bindung an einen festen Support, der sein Konjugatpaar enthält). Solche chemische Gruppen können überall in dem PCO angeheftet werden (solange sie nicht die Basisfunktion des funktionellen Segments stören oder die intramolekulare Duplexbildung verhindern), unter Verwendung herkömmlicher Techniken. In Ausführungsformen, in denen das funktionelle Segment konstruiert ist, um an ein komplementäres Ziel-Molekül zu hybridisieren (z. B. eine mRNA), wird ein Segment von wenigstens 6 Nukleobasen an dem terminalen Ende des funktionellen Segments komplementär zu dem Ziel sein und einzelsträngig, wenn die PCO einen intramolekularen Duplex bildet. In diesen Ausführungsformen hybridisieren die PCOs in zwei Schritten an die Zielsequenz. Der erste Schritt schließt Hybridisierung der Einzelstrangregion der PCO an die Zielsequenz ein. Die Stabilität des intramolekularen Duplex, der dadurch gebildet wird, bringt den intramolekularen Duplex des PCO zur Destabilisierung und ermöglicht vollständige Hybridisierung an das Ziel. Da es zwei Erkennungsschritte gibt, sind diese PCOs spezifischer in dem Nachweis von komplementärer RNA, als ihre linearen Gegenstücke. Die Verwendung von PCOs als Sonden in Lösung oder in Festphase (entweder durch 3'- oder 5'-Terminus oder durch die Basen) ist spezifischer als ihre linearen Gegenstücke.
  • Die nachstehend gezeigten Studien zeigen, dass PCOs, die funktionelle Antisensesegmente enthalten, Antisenseaktivität in Zellkulturen aufrecht erhalten. Der Vorteil, der für diese PCOs vorhergesehen wird, ist, dass ihre Bildung von intramolekularen pseudocyclischen Strukturen weniger Interaktion mit Nichtziel-Makromolekülen (einschließlich Nukleinsäuren und Proteinen) ermöglicht und auch mit Polyanionen in Verbindung stehende Nebenwirkungen reduziert und sie nur in Anwesenheit der Ziel-mRNA linearisiert.
  • In einem anderen Aspekt ist die Erfindung ein Kit. In diesem Aspekt umfasst der Kit wenigstens eine erfindungsgemäße PCO und ein oder mehrere andere Reagenzien, die die Ver- wendung des PCOs erleichtern. In spezifischen Ausführungsformen umfassen die Kits ein oder mehrere PCOs zur Verwendung in Enzym-katalysierter Nukleinsäureamplifikation (z. B. PCR, RT-PCR) in einem oder mehreren Containern und umfasst weiterhin zusätzliche Bestandteile zur Durchführung der Amplifikationsreaktionen. Wenn die Ziel-Nukleinsäuresequenz, die amplifiziert wird, eine ist, die mit Erkrankung oder Störung in Zusammenhang gebracht wird, können die Kits zur Diagnose und Prognose verwendet werden. In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Kit zur Verfügung gestellt, der in einem oder mehreren Containern PCOs zur Verwendung als Vorwärts- und Rückwärts-Primer (reverse) zur Durchführung der Amplifikation enthält und optional eine DNA-Polymerase oder andere Polymerasen (z. B. eine Reverse Polymerase zur Verwendung in RT-PCR) mit und ohne Exonukleaseaktivität. Ein Kit zur Triamplifizierung kann weiterhin in einem oder mehreren Containern ein Blockierungs-0ligonukleotid und optional DNA-Ligase umfassen.
  • PCOs in Containern können in jeder Form sein, z. B. lyophylisiert oder in Lösung (z. B. destilliertes Wasser oder gepufferte Lösung) usw. PCOs und andere Reagenzien, die fertig zur Verwendung in der gleichen Amplifizierungsreaktion sind, können in einem Einzelcontainer kombiniert werden oder können in getrennten Containern sein.
  • In einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst ein Kit zum Nachweis einer ausgewählten Ziel-DNA Zielsequenzen in einem oder mehreren Containern (a) Primer zur Enzym-katalysierten Amplifizierung, von denen einer oder beide PCOs sind, die mit fluoreszierenden oder quenchenden Gruppen markiert sind; und optional: (b) eine Kontroll-DNA-Zielseqenz; (c) einen optimierter Puffer zur Amplifikation; (d) geeignete Enzyme für das in Erwägung gezogene Verfahren der Amplifikation, z. B. eine DNA-Polymerase zur PCR- oder Triamplifikation oder SDA, eine reverse Transkriptase für NASBA; (d) einen Satz von Anweisungen zum Ausführen der Amplifikation, die z. B. die optimalen Bedingungen beschreiben, z. B. Temperatur, Anzahl der Amplifikationszyklen. Optional stellt der Kit (e) Mittel zur Stimulierung und zum Nachweis von Fluoreszenzlichtemission zur Verfügung, z. B. ein Fluoreszenzplattenlesegerät oder ein Kombinations-Thermocycler-Plattenlesegerät, um die Analyse durchzuführen.
  • Die folgenden Beispiele werden nur zu erklärenden Zwecken zur Verfügung gestellt und sind weder gedacht, noch sollten sie als in irgendeiner Weise die Erfindung einschränkend ausgelegt werden.
  • BEISPIELE Beispiel 1
  • Synthese und Analyse von Oligonukleotiden
  • Um das therapeutische Potential von PCOs zu untersuchen, haben wir ein PS-Oligonukleotid (18er-Mer) das komplementär zu der regulatorischen Untereinheit von PKA (Rlα) (7, 32) ist verwendet. Ein Antisense-Oligonukleotid, das komplementär zu dieser Region der PKA Rlcc mRNA ist, wurde im Detail in in vitro und in vivo Modellen untersucht (7, 32, 33) und wird zur Zeit in humanen klinischen Versuchen ausgewertet.
  • Die Synthese von Oligonukleotiden wurde in einem 1 μMol-Maßstab auf einem Biosearch 8900 DNA-Synthesizer durchgeführt unter Verwendung von Deoxynukleosid-3'phosphoramiditen (Perseptive Biosystems, Framingham, MA) zur Kettenverlängerung von dem 3'- zu 5'-Ende und Deoxynukleosid-5'-phosphoramiditen (Glen Research, Sterling, VA) für Kettenverlängerung von dem 5'- zu 3'-ende. A11e Oligonukleotide mit Ausnahme des 01igonukleotids mit der SEQ ID NO: 1, wurden in zwei Schritten synthetisiert. Zunächst wurden die Oligonukleotide (mit Ausnahme der Oligonukleotide SEQ ID NO: 2 und 3) von dem 5'- zu dem 3'-Ende synthetisiert unter Verwendung von 3'-Dimethoxytrityi-deoxynucleosid-CPG (Glen Research, Sterling, VA) und geeignete Deoxynucleosid-5'-phosphoramidite wurden synthetisiert unter Verwendung eines modifizierten RNA-Syntheseprogramms, in dem die Detritylierungszeit und Detritylierungslösungsvolumen verdoppelt waren im Vergleich zu dem Standard-RNA-Syntheseprogramm. Der zweite Teil der Oligonukleotide (mit Ausnahme der Oligonukleotide SEQ ID NO: 2 und 3) wurde von dem 3'- zu dem 5'-Ende synthetisiert unter Verwendung von Deoxynukleosid-3'-phosphoramiditen und einem Standard-DNA-Syntheseprogramm. Die Oligonukleotide SEQ ID NO: 2 und 3 wurden zunächst von dem 5'zu dem 3'-Ende synthetisiert, dann von dem 5'- zu dem 3'-Ende unter Verwendung von einem geeigneten CPG-supportgebundenen Nukleosid, Nukleosidphosphoramiditen und einem Syntheseprogramm. Oligonukleotid SEQ ID NO: 1 wurde synthetisiert unter Verwendung von Deoxynucleosid-3'-phosphoramiditen und einem Standard-DNA-Syntheseprogramm. Oxidation nach jeder Kopplung wurde durchgeführt unter Verwendung von 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid, um eine Phosphorothioatverbindung zu erhalten oder es wurde ein Jodreagens verwendet, um eine Phosphodiesterverbindung wie gewünscht zu erhalten. Die Deprotektion aller Oligonukleotide wurde durch Inkubation mit der konzentrierten Ammoniumhydroxidlösung bei 65°C über Nacht vervollständigt. Die Oligonukleotide wurden gereinigt unter Verwendung von präparativer Polyacrylamidgelelektrophorese und entsalzt unter Verwendung von C18 Sep-Pak-Patronen (Waters). Die Analyse der Oligonukleotide wurde durchgeführt unter Verwendung von Kapillargelelektrophorese (CGE). Die Reinheit der Oli gonukleotide, basierend auf A260/Massenverhältnis war > 98% und basierend auf CGE war 95%, der Rest waren n–1-, n–2-, usw., Produkte.
  • Für die vorliegende Untersuchungen haben wir ein 18er-Mer PS-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 1), das komplementär zu der mRNA der regulatorischen Untereinheit von Proteinkinase A (Rlα) ist und von dem gezeigt wurde, dass es wirksam ist in der Inhibierung des Wachstums von verschiedenen Krebszellen in vitro und dem Wachstum von Tumoren in Maus-Xenograftmodellen durch einen sequenzspezifischen Antisensemechanismus (7, 32, 33).
  • PCOs, die das funktionelle Phosphodiestersegment enthalten: Zunächst synthetisierten wir Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 (Tabelle 1), das ein 18er-Mer Phosphodiester-Oligonukleotid (PO-Oligonukleotid) als funktionelles Segment und ein 6er-mer als das protektive PO-Oligonukleotid, verbunden durch ihre 5'-5'-Enden, enthält. Als eine Kontrolle synthetisierten wir Oligonukleotid SEQ ID NO: 3 (Tabelle 1), in dem das funktionelle Segment das gleiche ist wie in Oligonukleotide SEQ ID NO: 2, was jedoch zwei Fehlpaarungen in dem protektiven PO-Oligonukleotid enthält.
  • Beispiel 2 Synthese von S35-markiertem Oligonukleotid
  • Zur S35-Markierung wurde Oligonukleotid SEQ ID NO: 8, das vier N-Phosphonatverbindungen an dem 5'-Ende des funktionellen Segments enthielt, synthetisiert. Für das markierte Produkt wurde die Synthese von Oligonukleotid SEQ ID NO: 8 in drei Schritten ausgeführt – der erste und zweite Schritt wurde ausgeführt, wie vorstehend beschrieben. In dem dritten Schritt wurden die letzten vier Kopplungen ausgeführt unter Verwendung von Nucleosid-H-phosphonat und H-Phosphonatchemie. Die Oxidation von den letzten vier H-Phosphonatverbindungen wurde durchgeführt mit elementarem S35-Schwefel (0,5 bis 2,5 Ci/mg, Amersham), wie früher berichtet (34). S35-markiertes Oligonukleotid SEQ ID NO: 8 wurde gereinigt unter Verwendung von präparativer 20%-iger Polyacrylamidgelelektrophorese und entsalzt unter Verwendung von C18 Sep-Pak-Patronen. Die spezifische Aktivität, die von Oligonukleotide SEQ ID NO: 8 erhalten wurde, war 0,2 μCi/μg.
  • Beispiel 3
  • Thermale Schmelzexperimente
  • Die Schmelztemperaturen von Oligonukleotiden allein und in Anwesenheit von Komplementär-RNA wurden bestimmt in einem Puffer, enthaltend 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM Na2EDTA und 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 (23). Jedes Oligonukleotid wurde allein genommen oder mit Komplementär-RNA in einem Verhältnis von 1 : 1 in einem Eppendorf-Röhrchen gemischt und in einer Speed-Vac getrocknet und resuspendiert in 1 ml Puffer. Die Endkonzentration des Oligonukleotids in jeder Probe war 1 μM und die Endkonzentration der Komplementär-RNA war 1 μM. Die Proben, die das Oligonukleotid allein enthielten, wurden auf 85°C für 2 Min. erhitzt und direkt auf Eis für 5 Min. abgekühlt, um die Bildung von intramolekularen Duplexen zu ermöglichen. Die Proben, die das Oligonukleotid mit der Komplementär-RNA enthielten, wurden bei Raumtemperatur (21°C) für 1 Std. inkubiert. Dann wurden die UV-Absorptionskurven als eine Funktion der Temperatur auf einem Lambda 20 UV/Vis-Spektrometer (Perkin-Elmer) bei 260 nm unter Verwendung eines linearen Bewegungsmulticell-Halters (6 Zellen) aufgezeichnet. Die Temperatur wurde durch ein PTP-6-Peltier-System, das an dem Spektrometer hing, kontrolliert. Die Heizrate war 0,5°C/Min. Die Daten wurden auf einem Dell-Computer, der mit dem Instrument verbunden war, gesammelt und mit UV-WinLab-Software, die mit dem Instrument geliefert wurde, prozessiert. Die Schmelztemperaturen (Tms) wurden von den ersten abgeleiteten Kurven gemessen. Jeder Tm-Wert war ein Durchschnitt von wenigstens zwei Messungen und die Reproduzierbarkeit lag innerhalb ± 1,0°C.
  • Der Tm von Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 allein war 51,9°C, wohingegen Oligonukleotid SEQ ID NO: 3 allein eine breite Transition ohne einen definierten Tm zeigte, was darauf hinweist, dass das funktionelle Segment mit dem Komplementär 6er-mer protektiven Segment hybridisiert und eine intramolekulare pseudocyclische Struktur, wie gezeigt in 1, bildet. Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 kann abwechselnd einen linearen tandem-intramolekularen Komplex unter experimentellen Bedingungen bilden. Jedoch würde ein linearer intramolekularer Komplex einen geringeren Tm-Wert haben als der, der für Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 alleine beobachtet wurde. Zusätzlich haben wir keine langsam wandernden Banden auf nichtdenaturierenden Gelen beobachtet, was die Möglichkeit der Bildung von linearen Tandemstrukturen ausschließt (Daten nicht gezeigt). Oligonukleotid SEQ ID NO: 2, das zwei Fehlpaarungen in dem protektiven Segment hatte, hybridisiert nicht mit dem funktionellen Segment und bleibt in der linearen Form.
  • In Anwesenheit der Komplementär-RNA hatten Oligonukleotide SEQ ID NO: 2 und 3 jeweils Tms von 76,7°C und 76,8°C, was nahe legt, dass das funktionelle Segment von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 2 und 3 mit der Ziel-RNA hybridisierte und stabile Heteroduplexe bildete. Die Tms wurden aufgenommen durch Mischen der hybridisierten Form des Oligonukleotids SEQ ID NO: 2 und der Komplementär-RNA bei Raumtemperatur (21°C) vor der Erhitzung auf 85°C und dann Abkühlen des Gemisches um die intramolekulare pseudocyclische Struk tur des Oligonukleotids SEQ ID NO: 2 zu destabilisieren, um die Duplexbildung mit RNA zu begünstigen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die intramolekulare pseudocyclische Struktur des Oligonukleotids SEQ ID NO: 2 sich selbst in Anwesenheit der Komplementär-RNA destabilisiert und einen stabilen Heteroduplex bildet. Die thermale Stabilität des Duplex aus Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 und der RNA war höher als die thermale Stabilität der intramolekularen pseudocyclischen Struktur von Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 (Tabelle 1), die auch die Destabilisierung der pseudocyclischen Struktur von Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 begünstigen würde.
  • Thermale Schmelzstudien zeigten, dass Oligonukleotid SEQ ID NO: 6 alleine eine breite Transition hatte, wohingegen Oligonukleotide SEQ ID NO: 7–9 alleine jeweils Tms-Werte von 48°C, 50,2°C und 55,3°C hatten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Oligonukleotid SEQ ID NO: 5, in dem das protektive Segment nur fünf Nukleotide lang war, keine stabile pseudocyclische Struktur mit der 5'-Region des funktionellen Segments (PS-Oligonukleotid) gebildet hat. Die Stabilität der pseudocyclischen Strukturen der Oligonukleotide SEQ ID NO: 7-9, in denen die Länge des protektiven Segments sich jeweils von sechs Basen zu acht Basen Länge steigerte, steigerte sich stufenweise. Oligonukleotide SEQ ID NO: 10 und 11, die Fehlpaarungen in dem protektiven Segment enthielten, zeigten breite Schmelztransitionen ohne bestimmte Tms. In der Anwesenheit von Komplementär-RNA zeigten Oligonukleotide SEQ ID NO: 6-11 ähnliche Tms (Tabelle 1), was nahe legt, dass alle Oligonukleotide die lineare Form in Anwesenheit von RNA annahmen und Heteroduplexe gebildet haben.
  • Beispiel 4
  • Nukleasestabilität von Oligonukleotiden
  • Eine A260-Oligonukleotideinheit wurde auf 90°C für 2 Min. erhitzt in einem Puffer, enthaltend 100mM NaCl, 2 mM MgCl2, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, und dann schnell auf 0°C abgekühlt. Die angelagerten Proben wurden mit Schlangengift-Phosphodiesterase (0,1 μg, Boehringer Mannheim) bei 37°C für 5 Min. oder 30 Min. inkubiert. Der Verdau wurde gestoppt durch Erhitzen auf 90°C für 5 Min. Die verdauten Oligonukleotide wurden entsalzt unter Verwendung einer C18 Sep-Pak-Patrone vor Analyse durch CGE (Modell 2200, Backuran Instruments).
  • Um zu bestimmen, ob die pseudocyclische Form des Oligonukleotids SEQ ID NO: 2 größere Nukleasestabilität auf das Oligonukleotid überträgt, als sie bei Oligonukleotid SEQ ID NO: 3 gefunden wird, wurden beide Oligonukleotide SEQ ID NO: 2 und 3 mit Schlangengift-Phosphodiesterase (SVPD) inkubiert. Aliquots der Inkubationsgemische wurden nach 0, 5 und 30 Min. entfernt und durch CGE analysiert. 2 zeigt, dass Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 verhältnismäßig stabiler war als Oligonukleotid SEQ ID NO: 3, intaktes Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 war noch nach 30 Min. nachweisbar, wohingegen Oligonukleotid SEQ ID NO: 3 unter den gleichen experimentellen Bedingungen schon zu dem 5 Min.-Zeitpunkt vollständig abgebaut war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass trotz der Anwesenheit von zwei 3'-Enden in diesen Oligonukleotiden nur Oligonukleotid SEQ ID NO: 2 stabil gegen 3'-ExoNuklease SVPD ist, aufgrund der Anwesenheit der intramolekularen pseudocyclischen Struktur.
  • In dem nächsten Schritt synthetisierten und untersuchten wir Oligonukleotide SEQ ID NO: 4 und 5, in denen Antisense- und protektive PO-Oligonukleotide durch 3'-3'-Verbindungen verbunden sind. Oligonukieotide SEQ ID NO: 4 und 5 hatten Tms, ähnlich zu denen von jeweils SEQ ID NO: 2 und 3 (Tabelle 1). In Nukleasestabilitätsexperimenten gegen Milzphosphodiesterase (eine 5'-cxoNuklease) war Oligonukleotid SEQ ID NO:4, das in einer pseudocyclischen Form existiert, stabil (wie in dem Fall von Oligonukleotid SEQ ID NO: 2; Oligonukleotid SEQ ID NO: 5, das keine intramolekulare pseudocyclische Struktur bilden kann, wurde vollständig verdaut (wie im Fall mit Oligonukleotid SEQ ID NO: 3; Daten nicht gezeigt). Diese Daten legen nahe, dass pseudocyclische Strukturbildung Antisense-Oligonukieotide mit Stabilität gegen Exonukleasen versorgt.
  • Ermutigt durch diese Ergebnisse, synthetisierten wir Oligonukleotide SEQ ID NO: 6–9, die aus einem 18er-Mer PS-Oligonukleotid als funktionelles Segment und einem PO-Oligonukleotid als protektives Segment, verbunden durch ihre 3'-Enden (3'-3'-Verbindung) bestanden. Die Länge des protektiven Segments variierte von 5 bis 8er-Mer (jeweils Oligonukleotide SEQ ID NO:6–9) (Tabelle 1). Als Kontrollen synthetisierten wir Oligonukleotide SEQ ID NO: 10 und 11, die jeweils zwei und drei Fehlpaarungen in dem protektiven Segment enthielten. Diese Kontrollen korrespondierten mit den Oligonukleotiden SEQ ID NO: 6 und 9 in der Länge. Oligonukleotid SEQ ID NO: 1, ein 18er-Mer PS-Oligonukleotid ohne einen protektiven Segmentanhang wurde zum Vergleich synthetisiert.
  • Beispiel 5
  • RNase H-vermittelte Spaltungsexperimente
  • RNA wurde mit P32 am 5'-Ende markiert, unter Verwendung von T4 Polynukleotidkinase (Pharmacia) und [γ-32P]ATP (Amersham), wie früher berichtet (24). Oligonukleotide SEQ ID NOs: 1, 6, 8, 10 und 11 wurden in 10 μl Puffer (30 mM MEPES.KOH, pH 8,0, 75 mM KCl, 6 mM MgCl2, 1,5 mM DTT, 75 μg/ml BSA), gelöst, erhitzt beim 85°C für 1 Min. und dann auf Eis für 5 Min. abgekühlt. Etwa 50.000 CPM P32-endmarkierte RNA in 4 μl Wasser wurde zu gesetzt zu dem angelagerten Oligonukleotid in Pufferlösung (10 μl) und bei 37°C für 10 Min. inkubiert. RNase N (0,65 μl 1 : 10 verdünnt; Pharmacia) wurde dem Gemisch zugesetzt und bei 37°C für 10 Min. inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 1 μl 0,5 M EDTA und 20 μl Formamid gestoppt und analysiert unter Verwendung einer 20%-igen denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese und Autoradiographie.
  • Oligonukleotide SEQ ID NO: 5–11 wurden mit der Komplementär-RNA inkubiert, die an dem 5'-Ende mit P32 markiert war und mit RNase H. RNase H bindet an den DNA-RNA-Heteroduplex und spaltet RNA an dem 3'-Ende der RNA des Heteroduplex (24). Das Spaltungsmuster von RNA in der Anwesenheit von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 6–11 war ähnlich zu dem von Oligonukleotid SEQ ID NO: 1 (3), was nahe legt, dass diese Oligonukleotide eine lineare Form in Anwesenheit der komplementären RNA annahmen und dass alle Oligonukleotide Heteroduplexe mit der Ziel-RNA gebildet haben; diese Heteroduplexe waren Substrate für RNase H, was eine der wichtigsten Eigenschaften ist, die für Antisense-Aktivität erforderlich sind.
  • Beispiel 6
  • In vivo Stabilität von Oligonuk1eotiden
  • Die Oligonukleotide SEQ ID NO: 1, 6 und 8 wurden intravenös CD-1-Mäusen (20–25 g) bei einer Dosis von 50 mg/kg verabreicht. Blut wurde von den Mäusen 1 und 3 Std. nach Verabreichung in heparinisierten Röhrchen gesammelt. Das Plasma (100 ml) wurde mit Proteinase K (60 μg, Sigma) in Extraktionspuffer (0,5% SDS, 10 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA) für 2 Std. bei 60°C inkubiert. Die Proben wurden zweifach mit Phenol/Chloroform (1 : 1; v/v) extrahiert und mit Ethanol nach Zusatz von Glycogen (1 μg) präzipitiert. Die Proben wurden 5'-endmarkiert mit [γ-P32]ATP (Amersham) unter Verwendung von T4-PolyNukleotidkinase (10 Einheiten, New England Biolabs) und dann analysiert unter Verwendung einer 20%-igen denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese und Autoradiographie.
  • Nachdem wir etabliert hatten, dass Oligonukleotide SEQ ID NO: 6-9 intramolekulare pseudocyclische Formen unter physiologischen Bedingungen annehmen, eine lineare Form in Anwesenheit von Komplementär-RNA annehmen, Bindungsaffinität zur Aktivierung von RNase H aufrechterhalten und biologische Aktivität haben, waren wir interessiert an der Untersuchung der in vivo Nukleasestabilität von diesen Oligonukleotiden im Vergleich zu Oligonukleotid SEQ ID NO: 1. Wir untersuchten drei Oligonukleotide, SEQ ID NO: 1, 6 und 8 auf ihre verhältnismäßige in vivo Stabilität. Wir verabreichten diese drei Oligonukleotide intravenös an Mäuse in einer Dosis von 50 mg/kg. 1 und 3 Std. nach Verabreichung wurde Blut in heparinisierten Röhrchen gesammelt und Plasmaproben wurden hergestellt. Die Oligonukleotide wurden von dem Plasma extrahiert unter Verwendung der vorher beschriebenen Protokolle (35) und mit P32 unter Verwendung von PolyNukleotidkinase markiert. Die Analyse der markierten Oligonukleotide durch Polyacrylamidgelelektrophorese zeigte die Anwesenheit von sowohl intakten als auch abgebauten Produkten von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 1, 6 und 8 im Plasma (5).
  • Die Analyse der Ergebnisse von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 6 und 8 zeigten vornehmlich die Anwesenheit von Banden mit geringerer Beweglichkeit als das intakte 18er-Mer Oligonukleotid SEQ ID NO: 1, wohingegen Oligonukleotid SEQ ID NO: 1 die Anwesenheit von Abbauprodukten zeigte, was nahe legt, dass die 3'-3'-Verbindung zwischen dem protektiven Segment und dem funktionellen Segment gesteigerte Nukleasestabilität zur Verfügung stellt. Der Vergleich der Abbauprodukte von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 6 und 8, die jeweils ein 5er- und 7er-Mer protektives Segment enthielten, legt nahe, dass Oligonukleotid SEQ ID NO: 7 stabiler ist als Oligonukleotid SEQ ID NO: 5. Oligonukleotid SEQ ID NO: 7 bildet eine stabilere intramolekulare pseudocyclische Struktur als Oligonukleotid SEQ ID NO: 5 (siehe auch Tm Daten). Es ist erwähnenswert, dass der Abbau von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 8 ein 18er-Mer PS-Oligonukleotid erzeugt (Oligonukleotid SEQ ID NO: 1), das wenigstens ein Nukleotid, angeheftet über eine 3'-3'-Verbindung, als Intermediärprodukt enthält, das gesteigerte Stabilität zur Verfügung stellt (siehe 5).
  • Beispiel 7
  • Pharmakokinetik und Gewebedisposition
  • Oligonukleotid SEQ ID NO: 8 wurde subkutan in einer Dosis von 2 mg/kg (ein Gemisch von unmarkiertem und S35-markiertem Oligonukleotid SEQ ID NO: 8) in 100 μl Saline männlichen CD-1 Mäusen (20–24 g; Charles River, Wilmington, MA) verabreicht. 3, 48 und 96 Std. nach Verabreichung wurden zwei Mäuse zu jedem Zeitpunkt betäubt durch Aussetzen gegen Metofane (Malinkrodt Veterinary, Mundelein), gefolgt von einer cervicalen Dislokation. Blut wurde in EDTA enthaltenden Röhrchen (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) gesammelt. Leber, Nieren, Milz, Herz und Lungen wurden entfernt und auf ein Stück Gaze geblottet, gewogen und bei –20°C gelagert. Zur Zählung von S35 wurden 50 μl Plasma 1 ml TS-2 (Research Product International, Mt. Prospect, IL) zugegeben, verwirbelt und mit 250 μl 10%-iger eiskalter Essigsäure vermischt. Die Proben wurden wieder verwirbelt, bis sie gleichmäßig waren, dann wurden 18 ml eines 3a70B-Scintillationscocktails (Research Product International) zugegeben. Die Proben wurden dreifach hergestellt und über Nacht bei Raumtemperatur vor der Zählung inkubiert. Die dreifachen Gewebestücke, die zwischen 10–50 mg wogen, wurden in Szintillationsfläschchen gegeben, die 1 ml gewebesolubilisiertes TS-2 zugegeben wurde. Die Fläschchen wurden für 2–4 Std. bei 50°C inkubiert, mit 250 μl 10%-iger eiskalter Essigsäure gemischt, nach dem Mischen wurden 18 ml 3a70B Szintillationscocktail zugegeben. Das Fläschchen wurde wieder verwirbelt und über Nacht stehen gelassen, um die Chemilumineszenz zu verringern. Das Radioaktivitätsniveau wurde gezählt unter Verwendung von Beckman Liquid Scintillation Counter.
  • Die vorstehenden zeigen, dass Oligonukleotide SEQ ID NO: 6 und 8 gesteigerte in vivo Stabilität, verglichen mit Oligonukleotid SEQ ID NO: 1, besitzen und dass der Anstieg der Stabilität von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 6 und 8 das Ergebnis der Bildung von intramolekularen pseudocyclischen Strukturen unter physiologischen Bedingungen sind, genauso wie Schutz von 3'-Enden durch 3'-3'-Verbindung. Wir haben eine vorläufige pharmakokinetische Gewebedispositionsstudie von Oligonukleotid SEQ ID NO: 8 in Mäusen durchgeführt. Wir verabreichten 2 mg/kg Oligonukleotid SEQ ID NO: 8 (ein Gemisch von S35-markiertem und unmarkiertem Oligonukieotid) subkutan an Mäuse, um zu verstehen, ob signifikante Unterschiede in den pharmakokinetischen und Gewebeverteilungsprofilen bestehen, verglichen mit PS-Oligonukleotiden generell. 3, 48 und 96 Std. nach Verabreichung wurden die Mäuse getötet und Leber, Niere, Herz, Lunge und Milz wurden gesammelt. Die Gewebe wurden homogenisiert und radioaktive Spiegel wurden quantifiziert.
  • Die Konzentration von Oligonukleotid SEQ ID NO: 8, basierend auf den Radioaktivitätsspiegeln in Geweben ist in 6A und B gezeigt. Sie zeigt, dass Oligonukleotid SEQ ID NO: 8 auf die Hauptorgane verteilt war und dass das Gewebedispositionsprofil ähnlich zu dem war, das für andere PS-Oligonukleotide berichtet wurde (36–39). Allerdings wurden beachtenswerte Veränderungen beobachtet bezüglich der Leerung der Gewebe, verglichen mit PS-Oligonukleotiden (16, 17, 19, 36). 6A zeigt die Prozente der verabreichten Dosis, verteilt auf Leber, Niere und Milz nach 3, 48 und 96 Std. 6C zeigt, dass mehr als 60 % der verabreichten Dosis in 7 Tagen im Urin ausgeschieden wurde. Das Verschwinden des Oligonukleotids von den Geweben war schneller als es generell für PS-Oligonukleotide im Allgemeinen beobachtet wurde (16, 17, 19, 36). Diese Beobachtung legt nahe, dass Oligonukleotid SEQ ID NO: 8 in der intramolekularen pseudocyclischen Form in diesen Geweben bleibt, weniger mit Makromolekülen interagiert und dadurch schnell aus diesen Geweben entfernt wird.
  • Beispiel 8
  • Inhibition von Zellwachstum
  • Nachdem wir festgestellt hatten, dass diese Oligonukleotide intramolekulare pseudocyclische Strukturen unter physiologischen Bedingungen bildeten und eine lineare Form annahmen und an das Ziel in Anwesenheit der Komplementär-RNA banden, führten wir weitere Experimente durch, um zu bestimmen, ob die pseudocyclischen Strukturen von der Zelle aufgenommen würden, an die mRNA binden würden und letztendlich biologische Aktivität, ähnlich zu der von Oligonukleotid SEQ ID NO: 1, zeigen würden, das keinen protektiven Segmentanhang hat und auch keine intramolekularen Strukturen bildet. Untersuchungen wurden durchgeführt unter Verwendung von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 1 und 7–9, um die Inhibition von Krebszellwachstum von MDA-MB 468 (Brustkrebs)- und GEO (Colon-Krebs)-Zelllinien zu untersuchen, unter Verwendung von anheftungsabhängigen und anheftungs-unabhängigen Assays. In dem nachstehend beschriebenen Assaysystem ist die Verwendung von Lipiden nicht erforderlich zur Lieferung von Oligonukleotiden. Die Vermeidung der Benutzung von Lipiden war erwünscht, da PCOs variable polyanionische Eigenschaften haben und ihre Verkapselung mit Lipiden nicht gleichmäßig sein könnte.
  • Zellkultur. MDA-MB-468 humane Brustkrebszellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD} bezogen. Die Zellen wurden routinemäßig in einem 1 : 1 (v/v) Gemisch von Dulbeccos Modifiziertem Eagles-Medium (DMEM) und Hams F12-Medium, angereichert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum, 20 mM Hepes (pH 7,4), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) (Flow, Irvine, UK) kultiviert. GEO-Zellen wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. M. Brattain (Baylor College of Medicine, Houston, TX). GEO-Zellen wurden in McCoys-Medium, angereichert mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum, 20 mM Hepes (pH 7,4), Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 μg/ml) in einer angefeuchteten Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO2 bei 37°C kultiviert.
  • Anheftungsabhängiger Wachstumsassay. MDA-MB-468-Zellen (104 Zellen/Vertiefung) wurden in 48 Multivertiiefungs-Clusterschälchen (Becton Dickinson, Mailand, Italien) gesät und alle 24 Std. mit den angegebenen Konzentrationen der Oligonukleotide behandelt. Nach 5 Tagen Wachstum wurden die Zellen trypsiniert und mit einem Hämocytometer gezählt.
  • Clonogener Assay. GEO-Zellen (5 × 103 Zellen/Vertiefung) wurden in 0,3% Difco Bactoagar (Difco, Detroit, MI), angereichert mit Vollkultur, gesät. Die Suspension wurde 0,5 m überlagert; von 0,8% Agarmedium Basisschicht in 24 Multivertiefungs-Clusterschälchen (Becton Dickinson, Mailand, Italien). Nach 12 Tagen wurden die Kolonien mit Nitroblau-Tetrazolium gefärbt und Kolonien, die größer als 50 μm waren, wurden mit einem Artek 880-Koloniezähler (Artek Systems, Farmingdale, NY) gezählt.
  • Oligonukleotid SEQ ID NO: 1 wurde intensivst untersucht gegen eine Anzahl von Krebszelllinien und es wurde gezeigt, dass es das Zellwachstum durch einen Antisense-Mechanismus inhibiert (7, 32, 33). Ergebnisse der prozentualen Wachstumsinhibierung unter Verwendung dieser Oligonukleotide sind in 4 zusammengefasst. Alle Oligonukleotide zeigten ähnliche dosisabhängige Wachstumsinhibierungsaktivität. Diese Ergebnisse bestätigen, dass Oligonukleotide SEQ ID NO: 7–9, die die gleiche Antisensesequenz wie die von Oligonukleotid SEQ ID NO: 1 haben, ähnliche Zellwachstum inhibierende Aktivität hatten und der protektive Segmentanteil von Oligonukleotiden SEQ ID NO: 7–9 störte ihre biologische Aktivität nicht. Zukünftige Studien werden sich auf die Untersuchungen nicht sequenzspezifischer Aktivitäten, falls vorhanden, des protektiven Segmentanteils mit geeigneten Kontrollen konzentrieren.
  • Beispiel 9
  • Fluorophore-markierte Cyclicons
  • Cycliconaufbau und -synthese
  • Die Cyclicons wurden so gebaut, dass sie eine lange Primer-Sonde und ein kurzes Modifikatoroligo, angeheftet durch eine 3'-3'- oder 5'-5'-Verbindung enthalten. Die hier untersuchte Primer-Sonde war eine zwanzig Nukleotid lange Sequenz, die komplementär zu einem Teil der humanen MDM2-mRNA war. Das Modifikatoroligo war komplementär zu sechs bis acht Nukleotiden an dem 3'- oder 5'-Ende der Primer-Sondensequenz. Wenn das Modifikatoroligo komplementär zu dem 5'-Ende der Primer-Sonde war, wurden die zwei Oligos über eine 3'-3'-Verbindung angeheftet. Wenn das Modifikatoroligo komplementär zu dem 3'-Ende der Primer-Sonde war, wurden die zwei Oligos über eine 5'-5'-Verbindung angeheftet.
  • Fluoreszierender Cyclicon-Sondenaufbau
  • Um die Hybridisierung zwischen der Sondensequenz des Cyclicons und der Ziel-Nukleinsäure nachzuweisen, wurde eine Fluorophore (Fluorescein) oder ein Fluoreszenzresonanzenergiedonor (FRED) an das freie Ende (3' oder 5') des Modifikatoroligos angeheftet. Ein Fluoreszenzquencher (DABCYL) oder ein Fluoreszenzresonanzenergieakzeptor (FREA) auf einer Thyminbase (an 5-Position) wurde in der Primer-Sondensequenz eingebaut ( 8). In Abwesenheit der Ziel-Nukleinsäure bilden Cyclicons intramolekulare cyclische Strukturen; in diesem Stadium werden die Fluorophore und der Quencher in direkte Nähe zueinander gebracht (8), was in einem Verlust der Fluoreszenz aufgrund von FRET resultiert. In der Anwesenheit einer Ziel-Nukleinsäuresequenz in Lösung hybridisiert die Sondensequenz an die Komplementärsequenz des Ziels, was die intramolekulare cyclische Struktur destabilisiert und ein Öffnen verursacht, was in spontaner Fluoreszenzemission resultiert. Die Anwesenheit von Fluoreszenz zeigt die Hybridisierung zwischen der Ziel-Nukleinsäure und der Sondensequenz des Cyclicons an (8).
  • Synthese
  • 3'-3'- und 5'-5'-verbundene Cyclicons wurden in einem 1 bis 2 μMol-Maßstab auf einem Biosearch 8900 DNA-Synthesizer, wie früher beschrieben, synthetisiert (45–47), unter Verwendung von 3'- und 5'-Phosphoramiditen, wie erforderlich. Die 5'-Phosphoramidite, 6-FAM-Phosphoramidit, 6-FAM-CPG, DABCYL-T-Phosphoramidit und DABCYL-CPG wurden von Glen Research Corporation bezogen. Deoxynucleosid-3'-phosphoramidite wurden von Perkin-Eimer bezogen. Nach der Synthese wurden die Oligonukleotide deprotektiert mit konzentriertem Ammoniumhydroxid und auf nichtdenaturierenden Polyacrylamidgelen gereinigt. Nach Ausschneiden und Extraktion der geeigneten Gesamtlängen-Oligonukleotidbande aus dem Gel wurden sie entsalzt unter Verwendung von Waters C18 Sep-Pack-Patronen. Die Oligonukleotide wurden in einer Speed-Vac unter Vakuum getrocknet und die Konzentrationen wurden durch Absorptionsmessung bei 260 nm bestimmt. Die Oligonukleotidsequenzen, die synthetisiert wurden und in den nachfolgenden Beispielen verwendet wurden, sind:
    Figure 00320001
  • Fluoreszenzmessungen
  • Fluoreszenzmessungen wurden durchgeführt in Perkin-Elmers ABI Prisma 7700-Maschine im Plattenlesemodus in einer Platte mit 96 Vertiefungen. Jede Probe war 50 μl. Alle Reaktionen wurden in 50 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 1 mM MgCl2, durchgeführt.
  • DNA-Polymerasekettenverlängerung
  • Das 40er-Mer Template (SEQ ID NO: 17 3'-TTCCACTGTGGACAAGAGTGAGTGTCTACATGGACCCAGG-5') (0,15 A260-Einheiten) wurde mit 5'-P32-endmarkierten Primern (0,08 A260-Einheiten) in 16 μl 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, gemischt. Die Proben wurden auf 95°C für 5 Min. erhitzt und auf Raumtemperatur für 15 Min. vor der Lyophylisierung gekühlt. In einem Endvolumen von 30 μl wurden die angelagerten Template/Primer dann für 3 Std. bei 37°C mit 5 Einheiten Taq DNA-Polymerase (Amersham Pharmacia), 200 μM dNTPs (Perkin-Eimer), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, inkubiert. Die Verlängerungsprodukte wurden durch 15%-iges denaturierendes PAGE fraktioniert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
  • RT-PCR
  • MDM2 mRNA wurde von JAR-Zellen, wie beschrieben (45), extrahiert und in den PCR-Reaktionen verwendet. Alle PCR-Reagenzien wurden von PE-Biosystems, CA, gekauft. Die TagMan-Primer und -Sonden, die verwendet wurden, sind 3'-GACTAACTGATGATGGTTCAAGGACA-5' (SEQ ID NO: 13; Vorwärts-Primer; +311 bis +366), 3'-CACTCTTGTCCACAGTGGAACT-5' (SEQ ID NO: 14; Reverser Primer; +368 bis +389), 3'-TAMRA-TCCTTAGTAGCCTGAGTCCATGTAGACAC-6-FAM-5' (SEQ ID NO: 15; Sonde; +338 bis +389) und 3'-CATGTTCTCGAAGTCCTTCTC-5' (SEQ ID NO: 16; Reverser Primer-2; +415 bis +435). Typischerweise wurde jede Reaktion in einem Endvolumen von 200 μl, enthaltend 1 × TaqMan EZ-Puffer, 3 mM Mangan, 300 μM jeweils von dATP, dCTP und dGTP, 600 μM dUTP, 200 nM jeweils von Vorwärts- und Reversen Primern, 100 nM TaqMan-Sonde, 0,1 U/μl rTth DNA-Polymerase, 0,01 U/μl AmpErase UNG und 1 bis 50 ng Template-RNA ausgeführt. In Reaktionen, in denen die TaqMan-Sonde und der reverse Primer durch 5'-5'-angeheftetes Cyclicon ersetzt wurde, lag die Endkonzentration des Cyclicons bei 300 nm. Alle RT-PCR-Reaktionen wurden dreifach ausgeführt (50 μl jeweils). Die Amplifikation wurde in Perkin-Elmers ABI Prisma 770-Sequenznachweissystem durchgeführt. Die thermalen Zyklusparameter waren – ein anfänglicher 2 Min.-Stillstand bei 50°C und 30 Min. Stillstand bei 60°C, ein Deaktivierungsstillstand von 5 Min. bei 95°C, gefolgt von 38 bis 40 Zyklen eines 20 Sek.-Denaturierungsschrittes bei 94°C und einem 1 Min.-Anlagerungs/Verlängerungsschritt bei 60°C.
  • Cycliconstruktur
  • Die Bildung von intramolekularen cyclischen Strukturen durch Cyclicons wurde untersucht durch Inkubation einer kleinen Menge (~ 20 nM) des Fluoreszenzcyclicons mit ansteigenden Konzentrationen (bis zu 1 : 1000-Verhältnis) des gleichen Cyclicons synthetisiert ohne fluoreszierende und Quencher Markierungen und Messen der Fluoreszenz. Wenn die Cyclicons intramolekulare lineare oder cyclische Strukturen bilden, sollte ein Fluoreszenzsignal als Ergebnis von Überschuss von Nichtfluoreszenz-Cyclicons in Lösung erscheinen (9). In der vorliegenden Untersuchung haben wir den Quencher an die 5-Position des Thymins geheftet; diese Moleküle können auch an andere Positionen geheftet werden, einschließlich der 2'-Position einer Zuckergruppe (48). 9 zeigt, dass der Anstieg der Fluoreszenz als Ergebnis mit ansteigenden Konzentrationen von Nichtfluoreszenz-Cyclicon minimal ist. Wurde ein großer Überschuss Ziel-DNA über Nichtfluoreszenz-Cyclicons der gleichen Lösung zugesetzt, wurde jedoch vollständige Fluoreszenz nachgewiesen (9B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Cyclicons in intramolekularer cyclischen Strukturform in Abwesenheit der Zielsequenz existieren. Zusätzlich zeigten konzentrationsabhängige UV-thermale Schmelzuntersuchungen von Cyclicons alleine Tms in ± 1,0°C, was intramolekulare cyclische Strukturbildung in Abwesenheit der Zielsequenz nahe legt (Daten nicht gezeigt).
  • 3'-3'- im Vergleich zu 5'-5'-Verbindung in Cyclicons
  • Der Quencher wird in die Sondensequenz so eingebaut, dass, wenn eine cyclische Struktur gebildet wird, die Fluorophore nahezu dem FREA kommt und die Fluoreszenz vollständig gequencht wird. Die Untersuchung der Fluoreszenz von Oligonukleotiden 12–15 alleine, zeigte, dass 3'-3'-angeheftete Oligonukleotide 12 und 13 höhere Hintergrundfluoreszenz hatten, als 5'-5'-angeheftete Oligonukleotide 14 und 15. Dieser Unterschied könnte die größere Distanz zwischen der Fluorophore und dem Quencher in 3'-3'-angehefteten Cyclicons als ein Ergebnis von 3'-3'-Verdrehung von den zwei Strängen der Duplex-DNA widerspiegeln. Es würde angebracht sein, keine Base zwischen der Fluorophore und dem Quencher in 3'-3'angehefteten Cyclicons zu verwerfen, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Die optimale Distanz zwischen den FRED- und FREA-Molekülen würde etwa 70 bis 100 Å sein, um FRET zu zerstören und um vollständige Fluoreszenz zu erreichen (49,50). Wir hielten eine Entfernung von etwa neunzehn Internukleotid-Phosphatbrücken zwischen den Donor- und Akzeptormolekülen aufrecht. Hybridisiert das Cyclicon an die Ziel-Nukleinsäuresequenz, werden die FRED- und FREA-Moleküle etwa 70 Å auseinandergezogen, was wirksam FRET zwischen den Molekülen verringert und in spontaner Fluoreszenzemission resultiert. Die Verbindung zwischen der Sonde und den kurzen Oligos kann entweder 3'-3' oder 5'-5' sein, wie wie für die Anwendung des Cyclicons erforderlich. Beispielsweise würde für die Verwendung in zellulären Studien eine 3'-3'-Verbindung geeigneter sein, aufgrund der höheren Stabilität von 3'-3'-angehefteten Oligonukleotiden gegen Nukleasen in in vitro und in vivo Untersuchungen (45), wohingegen für einen Primer in einer PCR-Reaktion ein freies 3'-Ende, das 5'-5'-angeheftetes Cyclicon enthält, geeigneter ist.
  • Spezifität der Hybridisierung von Cyclicons an Ziel-Nukleinsäure
  • Um die Spezifität von Cyclicons zu bestimmen, wurde ein synthetisches Gemisch hergestellt, das eine bis acht verschiedene Oligonukleotidsequenzen (20er- bis 24er-Mere) enthält, und Gemisch mit Cyclicons in der Abwesenheit und Anwesenheit von perfekt komplementärer Ziel-DNA. Oligonukleotid 2 (20 nM) in Abwesenheit (weiße Balken in 12) und Anwesenheit (schattierte Balken in 12) des DNA-Ziels (50 nM}. In Probe 1 wurden keine anderen nichtspezifischen Oligonukleotide zugesetzt. In Probe 2 wurde eine 20er-Mer Zufalls-Oligonukleotidsequenz (1 μM) zugesetzt. In Probe 3 wurden zwei 20er-Mer Oligonukleotide (1 μM) zugesetzt, die nichtkomplementär zu dem Cyclicon waren. In Probe 4 wurden vier 20er-Mer Oligonukleotide (2 μM) zugesetzt, die nichtkomplementär zu dem Cyclicon waren. In Probe 5 wurden acht 20er-Mer Oligonukleotide (2 μM) zugesetzt, die nichtkomplementär zu dem Cyclicon waren. 12 zeigt, dass die Cyclicons in Abwesenheit einer passenden Ziel-DNA keine oder geringe Fluoreszenz zeigten. Wurde der perfekt passende Ziel-DNA-Strang der gleichen Lösung zugesetzt, wurde Fluoreszenz nachgewiesen, was nahe legt, dass die intramolekulare cyclische Struktur des Cyclicons geöffnet wurde in Anwesenheit der Ziel-Nukleinsäure, jedoch nicht in Anwesenheit von Nichtziel-Nukleinsäuresequenzen.
  • Wirkung der Anwesenheit und Position von Dabcyl auf Primerverlängerung
  • Um zu bestimmen, ob die Anwesenheit eines Quenchers auf ein Thymin des Primers die Taq-Polymeraseverlängerung stören würde, haben wir vier 20er-Mer Oligodeoxynukleotide mit DABCYL-Thymin an Nukleotidpositionen 2, 3, 5 und 7 von dem 3'-Ende synthetisiert und mit der Primerkettenverlängerung mit dem Primer ohne DABCYL verglichen. 11 zeigt die Taq-Polymeraseverlängerungsprodukte in Anwesenheit von jedem Primer. Diese Ergebnisse zeigen, dass alle fünf Oligos als Primer dienten, was nahe legt, dass die Anwesenheit von DABCYL in dem Primer die Kettenverlängerungsaktivität der Polymerase nicht störte. Dies ermöglicht die Flexibilität, den Quencher in die Sequenz an geeigneten Stellen einzubauen.
  • Nachweis und Quantifizierung von Ziel-Nukleinsäuren mit Cyclicons
  • Wir haben die Hybridisierung des Cyclicons mit der Ziel-Nukleinsäure beobachtet und die Fluoreszenzsteigerung als eine Funktion der Ziel-Nukleinsäurekonzentration gemessen. 10 zeigt Fluoreszenzspektren von Oligonukleotid 12 in der Abwesenheit und Anwesenheit von DNA-Ziel-Nukleinsäuresträngen, wie bestimmt durch ABI Prisma 7700-Sequenzdetektor in dem Plattenlesemodus. Die Hintergrundfluoreszenz in Abwesenheit des Ziels war das Ergebnis der größeren Entfernung zwischen der Fluorophore und dem Quencher in 3'-3'-verbundenen Cyclicons. Der Zusatz des DNA-Zielstrangs zu der Lösung steigerte die Fluoreszenz als ein Ergebnis der Hybridisierung der Cyclicon-Sondensequenz an den Ziel-Nukleinsäurestrang und der Öffnung der intramolekularen cyclischen Struktur (10). Der lineare Anstieg der Fluoreszenz mit dem Anstieg der Zielkonzentration (10B) legt nahe, dass das Verfahren verwendet werden kann für den quantitativen Nachweis der Ziel-Nukleinsäuresequenz in Lösung.
  • Um zu verifizieren, ob die vollständige Fluoreszenz emittiert wurde nach Hybridisierung des Cyclicons an die Ziel-Nukleinsäure, wurden die Cyclicons alleine und in Anwesenheit der Ziel-DNA mit DNase 1 behandelt und die Fluoreszenz wurde gemessen (Daten nicht gezeigt). Die Fluoreszenzmessungen waren innerhalb ± 10% von denen, die ohne DNase i-Behandlung in Anwesenheit von Ziel-Nukleinsäure beobachtet wurden, was nahe legt, dass die vollständige Fluoreszenz nach Hybridisierung des Cyclicons an die Ziel-Nukleinsäure der Untersuchung emittiert wurde.
  • Um weiterhin die Anwendbarkeit von Cyclicon-Primer-Sonden für die Bestimmung von mRNA-Spiegeln in unbekannten Proben durch quantitative Realtime (Echtzeit) RT-PCR zu untersuchen, haben wir eine Standardkurve mit bekannten Mengen von MDM2 mRNA extrahiert aus JAR-Zellen (13) konstruiert, unter Verwendung von Oligonukleotid 14 als reverse Primer-Sonde. Die in 13 gezeigte Standardkurve legt nahe, dass das Verfahren für fehlerfreie Messung von MDM2 mRNA in unbekannten Proben anwendbar sein könnte.
  • Cyclicons als unimolekulare Primer-Sonden in Realtime (Echtzeit)-PCR-Amplifikation
  • Das 5'-5'-angeheftete Cyclicon kann als unimolekulare Primer-Sonde verwendet werden, um Realtime RT-PCR-Amplifikation zu beobachten (14). Wir führten RT-PCR von MDM2 RNA, extrahiert aus JAR-Zellen, wie vorstehend durch. Wir haben die Amplifikationsergebnisse, die mit TaqMan-Primern und Sonde erhalten wurde, mit denen der Cyclicon-Primer-Sonde verglichen. In diesen Experimenten war der Vorwärtsprimer der gleiche in beiden Re aktionen und der bimolekulare TaqMan Reverse Primer und Sonde wurde ersetzt durch eine unimolekulare 5'-5'-angeheftete Cyclicon-Primer-Sonde.
  • Das 5'-5'-angeheftete Cyclicon hatte zwei 3'-Enden. Nur das Primer-Sondenoligosegment war komplementär zu der MDM2 RNA und dieses 3'-Ende wurde verlängert, wenn es erkannt wurde und an die RNA in der ersten Runde der RT-PCR hybridisierte. Das 3'-Ende des Modifikatoroligos war nicht verlängerbar, da das Modifikatoroligo nicht an die RNA band und sein 3'-Ende war durch eine Fluoresceingruppe blockiert.
  • Die Ergebnisse der RT-PCR-Amplifikation durch MDM2 RNA durch TaqMan-Primer und Sonde und Cyclicon sind in 15 gezeigt. Diese grafischen Darstellungen legen nahe, dass das 5'-5'-angeheftete Cyclicon als eine wirksame unimolekulare Primer-Sonde diente. Um das Amplifikationsprodukt zu untersuchen, haben wir das 5'-Ende von jedem Produkt der PCR-Reaktionen mit P32 markiert und dann durch denaturierende PAGE analysiert. Die Ergebnisse zeigten die Anwesenheit von dem erwarteten Längenamplifikationsprodukt, in dem das Cyclicon als Primer-Sonde verwendet wurde, wie es der Fall war mit dem TaqMan Primer (Daten nicht gezeigt).
  • Signalmechanismus
  • Um den Mechanismus der Fluoreszenzsignalübertragung durch Cyclicon während der PCR-Zyklen zu untersuchen, haben wir das Fluoreszenzsignal der PCR-Zyklen 14 bis 40 für sowohl die TaqMan-Sonde als auch das Cyclicon eingezeichnet (16). Wie erwartet, waren die Signalmechanismen unterschiedlich für die beiden Sonden und sie zeigten unterschiedliche Eigenschaften. Wie man in 9A sieht, registrierte die TaqMan-Sonde einen Anstieg des Fluoreszenzsignals mit der Amplifikation und zeigte niemals eine Verringerung des Fluoreszenzsignals, wie erwartet. Im Gegensatz dazu gab das Cyclicon einen Anstieg des Fluoreszenzsignals mit der Amplifikation und ein geringeres Fluoreszenzsignal während des 60°C-Stillstands.
  • Zusätzliche Referenzen
    • 1. Agrawal (1996) Trends Biotech., 14, 376–387.
    • 2. Ciba Foundation Symposium. (1997) Oligonucleotides as Therapeutic Agents; Johne Wiley, New York.
    • 3. Agrawal und Zhao (1998) Cur. Opn. Chem. Biol., 2, 519–528.
    • 4. Agrawal. (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press, New Jersey.
    • 5. Crooke. (1998) Antisense Research and Application, Springer, New York.
    • 6. Chen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 195–200.
    • 7. Cho-Chung et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7, 217–223.
    • 8. Akhtar und Agrawal (1997) Trends Pharmaceutical Sci., 18, 12–18.
    • 9. Gennett (1998) Biochem. Pharmacol., 55, 9–19.
    • 10. Dean und McKay (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 11762–11766.
    • 11. Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7, 495–502.
    • 12. Agrawal et al. (1997) Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 7, 575–584.
    • 13. Schechter und Martin, R.R. (1998) In Crooke, S.T. (Hrsg.), Antisense Research and Applications, Springer, New York, S. 233–241.
    • 14. Henry et al. (1997) Anti-Cancer Drug Des., 12, 395–408.
    • 15. Srinivasan und lversen (1995) J. Clin. Lab. Anal., 9, 129–137.
    • 16. Agrawal et al. (1995) Clin. Pharmacokin., 28, 7–16.
    • 17. Grindel et al. (1998) Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 8, 43–52.
    • 18. Zhang et al. (1995) Clin. Pharm. Expt. Ther., 58, 44–53.
    • 19. Nicklin et al. (1998) In Crooke, S.T. (Hrsg.), Antisense Research and Applications, Springer, New York, S. 141–168.
    • 20. Metelev et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett., 4, 2929–2934.
    • 21. Agrawal et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 94, 2620–2625.
    • 22. Kandimalla et al. (1995) Nucleosides and Nucleotides, 14, 1031–1035.
    • 23. Kandimalla et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 370–378.
    • 24. Shen et al. (1998) Bioorg. Med. Chem, 6, 1695–1705.
    • 25. Agrawal und Zhao (1998) Antisense Nucleic Acids Drug Dev., 8, 135139.
    • 26. Altman et al. (1996) Chimia, 50, 168–.
    • 27. Nicklin et al. (1997) Nucleosides and Nucleotides, 16, 1145–1153.
    • 28. Tang et al. (1993) Nucleic Acids Res., 21, 2729–2735.
    • 29. Agrawal of al. (1995) In Akhtar, S. (Hrsg.), Delivery Stratagies for Antisense Oligonukleotide Therapeutics. CRC Press, Boca Raton, FL, S. 105–121.
    • 30. Zhang et al. (1995) Clin. Chem, 41, 836–843.
    • 31. Abe et al. (1998) FEBS Lett., 425, 91–96.
    • 32, Srivastava et al. (1998) Breast Cancer Res. Treat., 49, 97–107.
    • 33. Nesterova und Cho-Chung (1995) Nature Med., 1, 528–533.
    • 34. Agrawal und Iyer (1997) In Schlingensiepen, R. und Schlingensiepen, W.B.K.-H. (Hrsg.), Antisense – From Technology to Therapy, Blackwell Sciences, Berlin, Deutschland, S. 59–77.
    • 35. Temsamani of al. (1997) Antisense Nucleic Acids Drug Dev.; 7, 159–165.
    • 36. Agrawal et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7595–7599.
    • 37. Zhang et al. (1995) Biochem. Pharmacol., 49, 929–939.
    • 38. Sands et al. (1994) Mol. Pharmacol., 45, 932–943.
    • 39. Orr et al. (1997) Nucleosides and Nucleotides, 16, 1699–1702.
    • 40. Holland et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 7276–7280.
    • 41. Lie et al. (1998) J. Cur. Opn. Biotech., 9, 43–48.
    • 42. Tyagi et al. (1996) Nat. Biotechnol., 14, 303–308.
    • 43. Nazarenko et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 2516–2521.
    • 44. Whitcombe et al. (1999) Nat. Biotechnol., 17, 804–807.
    • 45. Jiang et al. (1999) Bioorg. Med. Chem. 7, 2727–2735.
    • 46. Kandimalla et al. (1995) J. Am. Chem. Soc., 117, 6416–6417.
    • 47. Kandimalla et al. (1996) Biochemistry, 35, 15332–15339.
    • 48. Yamana et al. (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3427–8430.
    • 49. Cardullo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8790–8794.
    • 50. Selvin et al. (1995) Enzymology, 246, 300–334.

Claims (33)

  1. Pseudozyklische Oligcnukleobase, umfassend ein funktionelles Segment, ein protektives Segment und ein Linkersegment, wobei a) das funktionelle Segment eine Oligonukleobase mit 11–75 Nukleobasen, welche ein terminales Ende und ein Linkerende hat, umfasst; b) das protektive Segment eine Oigonukleobase mit 5–30 Nukleobasen, welche ein terminales Ende und ein Linkerende hat, umfasst und das sowohl zu einer Sequenz von Nukleobasen an dem terminalen Ende des funktionellen Segments komplementär ist als auch zu der Sequenz von Nukleobasen an dem terminalen Ende des funktionellen Segments, zu dem es komplementär ist, gegensätzliche Polarität hat; c) das funktionelle Segment und das protektive Segment kovalent miteinander an deren Linkerenden über das Linkersegment verbunden sind, wobei das Linkersegment eine direkte Bindung ist, eine Mono- oder Oligonukleobase mit 2–5 Nukleobasen ist, oder ein chemischer Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Tri-(ethylenglykol), Tetra(ethylenglykol), Penta-(ethylenglykol), Hexa-(ethylenglykol), -NH(CH2)nNH-, wobei n 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, und Kombinationen davon; d) das protektive Segment und das funktionelle Segment unter ausgewählten Bedingungen einen Doppelstrang bilden.
  2. Oligonukleobase gemäß Anspruch 1, wobei das funktionelle Segment mindestens 6 Nukleobasen mehr als das protektive Segment hat, das funktionelle Segment komplementär zu einer Ziel-Oligonukleobase ist und eine Region von mindestens 6 zusammenhängenden Nukleobasen des funktionellen Segments unter ausgewählten Bedingungen einzelsträngig ist
  3. Oligonukleobase gemäß Anspruch 2, wobei das funktionelle Segment und das protektive Segment Oligonukleotide sind und das Linkersegment eine direkte Bindung ist, ein Mono- oder Oligonukleotid mit 2–5 Nukleotiden ist oder ein chemischer Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Tri-(ethylenglykol), Tetra(ethylenglykol), Penta-(ethylenglykol), Hexa-(ethylenglykol), -NH(CH2)nNH-, wobei n 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, und Kombinationen davon.
  4. Oligonukleobase gemäß Anspruch 3, wobei das funktionelle Segment eine Sequenz mit mindestens 4 zusammenhängenden Desoxyribonukleotid-Phosphodiestern und/oder Fhosphorothioaten umfasst.
  5. Oligonukleobase gemäß Anspruch 4, weiter umfassend ein oder mehrere 2'substituierte Nukleotide.
  6. Oligonukleobase gemäß Anspruch 5, wobei mindestens die zwei terminalen Nukleotide des funktionellen Segments und/oder das protektive Segment 2'-substituierte Nukleotide sind.
  7. Oligonukleobase gemäß Anspruch 5, wobei die 2'-substituierten Nukliotide 2'-OMethyl- oder 2'-O-Methoxyethyil-Nukleotide sind.
  8. Oligonukleobase gemäß Anspruch 3, weiter umfassend ein oder mehrere Nukleotide mit einer modifzierten internukleotid-Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphorothioat, Phosphorodithioat, C1–C6-Alkylphosphonat, –C1–C6-Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, verbrücktes Phosphoramidat, verbrücktes Methylenphosphonat, verbrücktes Phosphorothioat, Phospholinol, Boranophosphat, Morpholin und Sulfon-Internukleotid-Verbindungen.
  9. Oligonukleobase gemäß Anspruch 1, wobei die Oligonukleobase ein PNA oder ein LNA ist.
  10. Oligonukleobase gemäß Anspruch 1, die daran einen chemischen Rest gebunden hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus lipophilen Gruppen, interkalierenden Agenzien, Biotin, Streptavidin, Diaminen, alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase und Adamantan.
  11. Oligonukleobase gemäß Anspruch 1, die ein Donor- und ein Akzeptormolekül daran gebunden hat, wobei es einen erkennbaren Unterschied bei einer physikalisch-chemischen Eigenschaft des Donor- und/oder Akzeptormoleküls zwischen einem Zustand der Oligonukleobase,. in dem das funktionelle Segment und das protektive Segment einen Doppelstrang bilden, und einem Zustand, in dem das funktionelle Segment und das protektive Segment keinen Doppelstrang bilden, gibt.
  12. Oligonukleobase gemäß Anspruch 11, wobei das Donormolekül ein FRED ist, das Akzeptormolekül ein FREA ist und die physikalisch-chemische Eigenschaft Fluoreszenz ist.
  13. Oligonukleobase gemäß Anspruch 12, wobei das funktionelle Segment eine Oligonukleobase mit 11–75 Nukleobasen umfasst, das funktionelle Segment mindestens 6 Nukleobasen mehr als das protektive Segment hat, das funktionelle Segment komplementär zu einer Ziel-Oligonukleobase ist, und eine Region von mindestens 6 zusammenhängenden Nukleobasen des funktionellen Segments unter ausgewäh1ten Bedingungen einzelsträngig ist.
  14. Oligonukleobase gemäß Anspruch 13, wobei das funktionelle Segment und das protektive Segment Oligonukleotide sind und das Linkersegment ein direkte Bindung ist, ein Mono- oder Oligonukleotid mit 2–6 Nukleotiden ist oder ein chemischer Rest ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ethylenglykol, Tri-(ethylengiykol), Tetra(ethylenglykol), Penta-(ethylenglykol), Hexa-{ethylenglykon, -NH(CH2)nNH-, wobei n 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, und Kombinationen davon.
  15. Oligonukleobase gemäß Anspruch 14, wobei das funktionelle Segment eine Sequenz mit mindestens 4 zusammenhängenden Desoxyribonukleotid-Phosphodiestern und/oder Phosphorothioaten umfasst.
  16. Oligonukleobase gemäß Anspruch 15, weiter umfassend ein oder mehrere 2'-substituierte Nukleotide.
  17. Oligonukleobase gemäß Anspruch 16, wobei mindestens die zwei terminalen Nukleotide des funktionellen Segments und/oder das protektive Segment 2'-substituierte Nukleotide sind.
  18. Oligonukieobase gemäß Anspruch 16, wobei die 2'-substituierten Nukleotide 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Methoxyethyi-Nukleotide sind.
  19. Oligonukleobase gemäß Anspruch 14, weiter umfassend ein oder. mehrere Nukleotide mit einer modifizierten Internukleotid-Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phosphorothioat, Phosphorodithioat, Alkylphosphonat, Alkylphosphonothioat, Phosphotriester, Phosphoramidat, Siloxan, Carbonat, Carboxymethylester, Acetamidat, Carbamat, Thioether, verbrücktes Phosphoramidat, verbrücktes Methylenphosphonat, verbrücktes Phosphorothioat, Phospholinol, Boranophosphat, Mcrpholin und Sulfon-Internukleotid-Verbindungen.
  20. Oligonukleobase gemäß Anspruch 12, wobei die Oligonukleobase ein PNA oder ein LNA ist.
  21. Oligonukleobase gemäß Anspruch 12, die daran einen chemischen Rest gebunden hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus lipophilen Gruppen, interkalierenden Agenzien, Biotin, Streptavidin, Diaminen, alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase und Adamantan.
  22. Oligonukleobase gemäß Anspruch 1, 11 oder 12, wobei das funktionelle Segment ein Ribazym ist.
  23. Oligonukleebase gemäß Anspruch 1, 11 oder 12, wobei das funktionelle Segment ein Aptamer ist.
  24. Oligonukleobase gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 11, 12 und 14, wobei die Oligonukleobase zur Verknüpfung an eine feste Oberfläche angepasst ist.
  25. Oligonukleobase gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 11, 12 und 14, wobei die Oligonukleobase an eine feste Oberfläche verknüpft ist.
  26. Kit, umfassend in einem oder mehreren Behältern, eine Oligonukleobase gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 11, 12 und 14.
  27. Kit, umfassend In einem oder mehreren Behältern, eine Oligonukleobase gemäß Anspruch 24.
  28. Kit, umfassend in einem oder mehreren Behältern, eine Oligonukleobase gemäß Anspruch 25.
  29. Verfahren zur Spaltung eines mRNA-Moleküls, umfassend das In-Kontaktbringen des mRNA-Moleküls mit einer Oligonukleobase gemäß einem der Ansprüche 2 bis 10 in der Gegenwart einer RNase H unter Bedingungen, welche die Hybridisierung des funktionellen Segments an mindestens einem Teil der mRNA erlaubt, und die darauffolgende Spaltung der mRNA, wobei das funktionelle Segment der Oligonukleobase zu mindestens einem Teil der mRNA komplementär ist.
  30. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Oligonukleobase, umfassend das In-Kontaktbringen der Ziel-Oligonukleobase mit einer Oligonukleobase gemäß einem der Ansprüche 11 bis 21, wobei das funktionelle Segment der Oligonukleobase zu mindestens einem Teil der Ziel-Oligonukleobase komplementär ist.
  31. Verfahren zum Nachweis einer Ziel-Oligonukleobase, umfassend das InKontaktbringers der Ziel-Oligonukleobase mit einer Oligonukleobase gemäß Anspruch 25.
  32. Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäure, umfassend die Verwendung einer Oligonukleobase gemäß einem der Ansprüche 11 bis 21 als ein Primer und/oder Primer-Sonde, wobei die funktionelle Segment zu der Ziel-Nukleinsäure, die amplifiziert werden soll, komplementär ist.
  33. Verfahren zum Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäure, umfassend die Verwendung einer Oligonukleobase gemäß Anspruch 25 als ein Primer und/oder Primer-Sonde, wobei das funktionelle Segment zu der Ziel-Nukleinsäure, die amplifiziert werden soll, komplementär ist.
DE60002967T 1999-03-31 2000-03-31 Pseudo-cyclische oligonukleobasen Expired - Fee Related DE60002967T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12713899P 1999-03-31 1999-03-31
US127138P 1999-03-31
US17464200P 2000-01-05 2000-01-05
US174642P 2000-01-05
PCT/US2000/008826 WO2000058330A2 (en) 1999-03-31 2000-03-31 Pseudo-cyclic oligonucleobases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60002967D1 DE60002967D1 (de) 2003-07-03
DE60002967T2 true DE60002967T2 (de) 2004-05-19

Family

ID=26825372

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60002967T Expired - Fee Related DE60002967T2 (de) 1999-03-31 2000-03-31 Pseudo-cyclische oligonukleobasen

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1086216B1 (de)
AT (1) ATE241697T1 (de)
AU (1) AU770615B2 (de)
CA (1) CA2334707A1 (de)
DE (1) DE60002967T2 (de)
DK (1) DK1086216T3 (de)
ES (1) ES2197868T3 (de)
PT (1) PT1086216E (de)
WO (1) WO2000058330A2 (de)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030099959A1 (en) * 1995-04-12 2003-05-29 Kandimalla Ekambar R. Cooperative oligonucleotides
US8431544B1 (en) * 2009-08-27 2013-04-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting gene expression and uses thereof
WO2012102616A1 (en) * 2011-01-28 2012-08-02 Flexgen B.V. Heterodirectional polynucleotides
WO2023049275A2 (en) * 2021-09-23 2023-03-30 Arnay Sciences, Llc Cyclic structured oligonucleotides as therapeutic agents

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399676A (en) * 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
NZ255028A (en) * 1992-07-02 1997-03-24 Hybridon Inc Antisense oligonucleotides resistant to nucleolytic degradation
WO1996035706A1 (en) * 1995-05-11 1996-11-14 Hybridon, Inc. Pyrimidine targeting hairpin triplex-forming oligonucleotides
US5866336A (en) * 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon

Also Published As

Publication number Publication date
WO2000058330A3 (en) 2001-01-25
ATE241697T1 (de) 2003-06-15
AU770615B2 (en) 2004-02-26
AU4066600A (en) 2000-10-16
PT1086216E (pt) 2003-09-30
ES2197868T3 (es) 2004-01-16
EP1086216A2 (de) 2001-03-28
DE60002967D1 (de) 2003-07-03
DK1086216T3 (da) 2003-08-18
CA2334707A1 (en) 2000-10-05
EP1086216B1 (de) 2003-05-28
WO2000058330A2 (en) 2000-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6383752B1 (en) Pseudo-cyclic oligonucleobases
DE60310944T2 (de) Neue formen von interferierenden rns-molekülen
DE69303712T2 (de) Gezielte spaltung von rna mittels eukaryontischer rnase p und externe führungssequenz
EP1350854B1 (de) Katalytische Nukleinsäure und deren medizinische Verwendung
DE69126311T2 (de) Therapeutische zusammensetzungen auf der basis von ribozymen
DE69432919T2 (de) Verfahren für den Nachweis spezifischer Polynukleotiden
DE69233117T2 (de) In sich geschlossende "sens-" und "antisense"-oligonukleotide und deren verwendungen
JP2022078069A (ja) 二本鎖ＲＮＡによるα－１アンチトリプシンの特異的阻害のための方法及び組成物
US20110097716A1 (en) Methods for Detecting Oligonucleotides
EP2407558A1 (de) Verfahren zum Nachweis eines einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls
DE69934227T2 (de) Auf Beta-Arabinose und dessen Analoga basierte Antisense-Oligonukleotide
CA2208427A1 (en) Stabilized ribozyme analogs
JP2001501614A (ja) 三つの構成成分からなるキメラアンチセンスオリゴヌクレオチド
DE69729145T2 (de) Reagenz und Verfahren zur Inhibierung der N-RAS Expression
CN102239259A (zh) UsiRNA复合物
JP2021511042A (ja) Ａｌｄｈ２発現を阻害するための組成物及び方法
DE19935303A1 (de) Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
EP2114981B1 (de) Verbindungen und Methoden zur Modulation der Proteinexpression
CN104903464A (zh) 用于从混合物富集突变核酸的化合物和方法
CN112105745A (zh) 用于寡核苷酸治疗剂的大规模平行发现方法
JP2021517826A (ja) Ｇｙｓ２発現を阻害するための組成物及び方法
DE60002967T2 (de) Pseudo-cyclische oligonukleobasen
WO2003022858A2 (de) Verfahren zum screenen von inhibitoren für die protein-protein-wechselwirkung sowie ribozyme hierzu
EP1316607A1 (de) Pseudo-zyklische Oligonukleobasen zur Hemmung des Tumorwachstums
WO2024110565A1 (en) Antisense oligonucleotides for the treatment of hereditary hfe-hemochromatosis

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee