DE68929477T2

DE68929477T2 - Interzellulare Adhäsions-Moleküle und deren Bindungsliganden

Info

Publication number: DE68929477T2
Application number: DE68929477T
Authority: DE
Inventors: Timothy Alan Chestnut Hill Springer; Robert Danbury Rothlein; Steven Dean Danbury Marlin; Michael Loran St. Louis Dustin
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 1988-09-28
Filing date: 1989-09-23
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2009-09-24
Also published as: PT101731A; DE68929477D1; GR3017959T3; EP0365837A3; EP0606518B1; IE69975B1; IE893089L; CA1341185C; DE68923675T2; ES2077572T3; PT91834A; EP0365837B1; PT91834B; ES2201052T3; ATE125708T1; EP0365837A2; ATE246245T1; HK1003105A1; DE68923675D1; PT101731B

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft interzelluläre Haftmoleküle, wie ICAM-1, die an dem Vorgang beteiligt sind, durch den Populationen von Lymphozyten zelluläre Substrate erkennen und an diesen haften, so dass sie zu den Entzündungsstellen wandern können und während entzündlicher Reaktionen mit Zellen in Wechselwirkung treten können. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Ligandenmoleküle, die zur Bindung an derartige interzelluläre Haftmoleküle befähigt sind, einen Screeningtest für diese Liganden und Verwendungsmöglichkeiten für das interzelluläre Haftmolekül, die Ligandenmoleküle und den Screeningtest.
Beschreibung des Stands der Technik
Leukozyten müssen zur Haftung an zellulären Substraten befähigt sein, um den Wirt gegen fremde Eindringlinge, wie Bakterien oder Viren, zu verteidigen. Ein ausgezeichneter Übersichtsartikel über das Abwehrsystem ist der Artikel von H. W. Eisen (in: Microbiology, 3. Auflg., Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), S. 290–295 und 381–418). Sie müssen zur Haftung an Endothelzellen befähigt sein, so dass sie aus dem Kreislauf zu Stellen, an denen Entzündungen ablaufen, wandern können. Ferner müssen sie sich an Antigene präsentierende Zellen anheften, so dass eine normale spezifische Immunantwort erfolgen kann, und schließlich müssen sie sich an entsprechende Zielzellen anheften, so dass eine Lysis von viral infizierten Zellen oder von Tumorzellen erfolgen kann.
In letzter Zeit wurden Leukozyten-Oberflächenmoleküle, die an der Vermittlung derartiger Haftvorgänge beteiligt sind, unter Anwendung der Hybridomtechnik identifiziert. Kurz zusammengefasst, es wurden monoklonale Antikörper gegen humane T-Zellen (D. Davignon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78 (1981), S. 4535–4539) und Mäuse-Milzzellen (T. Springer et al., Eur. J. Immunol., Bd. 9 (1979), S. 301–306) identifiziert, die an Leukozyten-Oberflächen binden und die vorstehend beschriebenen, mit der Haftung in Zusammenhang stehenden Funktionen hemmen (T. Springer et al., Fed. Proc., Bd. 44 (1985), S. 2660–2663). Die von diesen Antikörpern identifizierten Moleküle wurden als Mac-1 und mit der Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen-1 (LFA-1) bezeichnet. Mac-1 ist ein Heterodimeres, das an Makrophagen, Granulozyten und großen granulären Lymphozyten festgestellt wird. LFA-1 ist ein Heterodimeres, das an den meisten Lymphozyten festgestellt wird (T. A. Springer et al., Immunol. Rev., Bd. 68 (1982), S. 111–135). Diese beiden Moleküle und ein drittes Molekül, nämlich p150,95 (das eine ähnliche Gewebeverteilung wie Mac-1 aufweist) spielen eine Rolle bei der zellulären Haftung (G. Keizer et al., Eur. J. Immunol., Bd. 15 (1985), S. 1142–1147).
Es wurde festgestellt, dass die vorstehend beschriebenen Leukozytenmoleküle Mitglieder einer verwandten Familie von Glycoproteinen sind (F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med., Bd. 158 (1983), S. 1785–1803; G. D. Keizer et al., Eur. J. Immunol., Bd. 15 (1985), S. 1142–1147). Diese Glycoprotein-Familie ist aus Heterodimeren mit einer alpha-Kette und einer beta-Kette zusammengesetzt. Während die alpha-Ketten der einzelnen Antigene sich voneinander unterscheiden, wurde festgestellt, dass die beta-Kette in hohem Maße konserviert ist (F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med., Bd. 158 (1983), S. 1785–1803). Von der beta-Kette der Glycoprotein-Familie (gelegentlich als "CD18" bezeichnet) wurde festgestellt, dass sie ein Molekulargewicht von 95 kd aufweist, während für die alpha-Ketten variierende Molekulargewichte von 150 bis 180 kd festgestellt wurden (T. Springer, Fed. Proc., Bd. 44 (1985), S. 2660–2663). Während die alpha-Untereinheiten der Membranproteine nicht die weitgehende Homologie, die die beta-Untereinheiten aufweisen, zeigen, ergab eine Analyse der alpha-Untereinheiten der Glycoproteine, dass es erhebliche Ähnlichkeiten zwischen ihnen gibt. Übersichtsartikel über die Ähnlichkeiten zwischen den alpha- und beta-Untereinheiten der mit LFA-1 im Zusammenhang stehenden Glycoproteine wurden von F. Sanchez-Madrid et al. veröffentlicht (J. Exper. Med., Bd. 158 (1983), S. 586–602; und J. Exper. Med., Bd. 158 (1983), S. 1785–1803).
Es wurde eine Gruppe von Individuen identifiziert, die nicht zur Expression von normalen Mengen beliebiger Mitglieder dieser Familie von Haftproteinen an ihren Leukozyten-Zelloberflächen befähigt waren (D. C. Anderson et al., Fed. Proc., Bd. 44 (1985), S. 2671–2677; D. C. Anderson et al., J. Infect. Dis., Bd. 152 (1985), S. 668–689). Lymphozyten dieser Patienten zeigten ähnliche in vitro-Defekte wie normale Personen, deren LFA-1-Familie von Molekülen einer antagonistischen Wirkung durch Antikörper unterzogen worden war. Ferner waren diese Personen unfähig, eine normale Immunantwort zu erzeugen, was auf eine Unfähigkeit ihrer Zellen zur Haftung an zellulären Substraten zurückzuführen war (D. C. Anderson et al., Fed. Proc., Bd. 44 (1985), S. 2671–2677; und D. C. Anderson et al., J. Infect. Dis., Bd. 152 (1985), S. 668–689). Diese Daten zeigen, dass die Immunreaktionen abgemildert werden, wenn Lymphozyten aufgrund des Fehlens von funktionellen Haftmolekülen der LFA-1-Familie nicht dazu befähigt sind, auf normale Weise in haftende Verbindung zu treten.
Die Expression eines kürzlich identifizierten Liganden von LFA-1, des interzellulären Haftmoleküls-1 (ICAM-1) wurde in verschiedenen Zelltypen in Reaktion auf Cytokine untersucht (R. Rothlein et al., J. Immunol., Bd. 141 (1988), S. 1665–1669). Die Induktion von ICAM-1 wurde durch Cytokin-spezifische Antiseren und einige pharmakologische Wirkstoffe neutralisiert. Cyclohexamid erhöhte die Expression von ICAM-1 an Chondrosarkomzellen, wies aber einen geringen oder gar keinen Einfluss auf Karzinomzellen auf. Diese Daten stellten einen Hinweis auf unterschiedliche Mechanismen in der Regulation und Expression von ICAM-1 in den verschiedenen Zelltypen dar.
Im Ergebnis macht es somit die Fähigkeit von Lymphozyten zur Aufrechterhaltung der Gesundheit und Lebensfähigkeit eines Tieres notwendig, dass sie dazu befähigt sind, sich an andere Zellen (wie Endothelzellen) anzuheften. Es wurde festgestellt, dass diese Haftung Zell-Zell-Kontakte erfordert, an denen spezifische Rezeptormoleküle, die an Zelloberflächen der Lymphozyten vorhanden sind, beteiligt sind. Diese Rezeptoren ermöglichen es einem Lymphozyten an anderen Lymphozyten oder an Endothelzellen oder anderen nicht-vaskulären Zellen zu haften. Es wurde festgestellt, dass die Zelloberflächen-Rezeptormoleküle miteinander in hohem Maße verwandt sind. Menschen, an deren Lymphozyten diese Zelloberflächen-Rezeptormoleküle fehlen, leiden an chronischen und wiederkehrenden Infektionen sowie an anderen klinischen Symptomen, unter Einschluss von fehlenden Antikörper-Antworten.
Da die Lymphozyten-Haftung an dem Vorgang beteiligt ist, durch den fremdes Gewebe identifiziert und abgestoßen wird, ist ein Verständnis dieses Vorgangs von erheblichem Wert auf dem Gebiet der Organtransplantation, Gewebetransplantation, Allergie und Onkologie.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das interzelluläre Haftmolekül-1 (ICAM-1) sowie dessen funktionelle Derivate, Antikörper und Fragmente von Antikörpern, die zur Hemmung der Funktion von ICAM-1 befähigt sind, und andere Inhibitoren der ICAM-1-Funktion. Die Erfindung umfasst therapeutische Anwendungsmöglichkeiten für sämtliche vorstehend beschriebenen Moleküle. Im einzelnen ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Behandlung von Entzündungen, die aus einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems bei einem Säuger resultieren, abgestellt, wobei das Verfahren das Bereitstellen eines entzündungshemmenden Mittels für ein behandlungsbedürftiges Objekt in einer Menge, die zur Unterdrückung der Entzündung ausreicht, umfasst, wobei das entzündungshemmende Mittel aus folgender Gruppe ausgewählt ist: ein Antikörper, der zur Bindung an ICAM-1 befähigt ist; ein Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment zur Bindung an ICAM-1 befähigt ist; ICAM-1; ein funktionelles Derivat von ICAM-1; und ein Nicht-Immunoglobulin-Antagonist von ICAM-1.
Die Erfindung umfasst ferner das vorstehend beschriebene Verfahren zur Behandlung von Entzündungen, wobei es sich beim Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1 um einen Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1 handelt, der von LFA-1 abweicht.
Die Erfindung umfasst eine pharmazeutische Zusammensetzung, die folgendes umfasst:

(a) ein entzündungshemmendes Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem Antikörper, der zur Bindung an ICAM-1 befähigt ist; einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment zur Bindung an ICAM-1 befähigt ist; ICAM-1; einem funktionellen Derivat von ICAM-1; und einem Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1, und
(b) mindestens einem immunsuppressiven Mittel, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Dexamethason, Azathioprin und Cyclosporin A besteht.

Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt in schematischer Form die Haftung zwischen einer normalen Zelle und einer Zelle mit LFA-1-Mangel.
2 zeigt in schematischer Form den Vorgang der Haftung einer normalen Zelle an einer normalen Zelle.
3 zeigt die Kinetik der zellulären Aggregation in Abwesenheit (X) oder Gegenwart von 50 ng/ml PMA (0).
4 zeigt die Koaggregation zwischen LFA-^1–- und LFA-¹⁺-Zellen. Mit Carboxyfluorescein-diacetat markierte, EBV-transformierte Zellen (104) gemäß der Bezeichnung in der Figur wurden mit 10⁵ unmarkierten, autologen Zellen (ausgefüllte Balken) oder JY-Zellen (offene Balken) in Gegenwart von PMA vermischt. Nach 1,5 Stunden wurden die markierten Zellen (in Aggregaten oder freiem Zustand) unter Verwendung des qualitativen Tests von Beispiel 2 gezählt. Der prozentuale Anteil an markierten Zellen in Aggregatform ist dargestellt. Es ist ein repräsentatives Experiment von zwei Experimenten dargestellt.
5 zeigt die Immunopräzipitation von ICAM-1 und LFA-1 aus JY-Zellen. Triton X-100-Lysate von JY-Zellen (Bahnen 1 und 2) oder Kontroll-Lysispuffer (Bahnen 3 und 4) wurden der Immunopräzipitation mit Antikörper, der zur Bindung an ICAM-1 befähigt war (Bahnen 1 und 3), oder Antikörpern, die zur Bindung an LFA-1 befähigt war (Bahnen 2 und 4), unterzogen. Das Feld A zeigt die Ergebnisse unter reduzierenden Bedingungen. Das Feld B zeigt die unter nicht-reduzierenden Bedingungen erzielten Ergebnisse. Molekulargewichtsstandards wurden in Bahn S laufen gelassen.
6 zeigt die Kinetik des Einflusses von IL-1 und gamma-Interferon auf die ICAM-1-Expression an humanen dermalen Fibroblasten. Humane dermale Fibroblasten wurden bis zu einer Dichte von 8 × 10⁴ Zellen/0,32 cm² Vertiefung gezüchtet. IL-1 (10 U/ml, ausgefüllte Kreise) oder rekombinantes gamma-Interferon (10 U/ml, leere Quadrate) wurden zugesetzt. Zum angegebenen Zeitpunkt wurde nach Abkühlen des Testgemisches auf 4°C ein indirekter Bindungstest durchgeführt. Die Standardabweichung stieg nicht über 10%.
7 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit der Einflüsse von IL-1 und gamma-Interferon auf ICAM-1. Humane dermale Fibroblasten wurden bis zu einer Dichte von 8 × 104 Zellen/0,32 cm²/Vertiefung gezüchtet. IL-2 (leere Kreise), rekombinantes humanes IL-1 (leere Quadrate), rekombinantes Mäuse-IL-1 (ausgefüllte Quadrate), rekombinantes humanes gamma-Interferon (ausgefüllte Kreise) und rekombinantes beta-Interferon (leere Dreiecke) wurden in der angegebenen Verdünnung zugesetzt und 4 Stunden (IL-1) und 16 Stunden (beta- und gamma-Interferon) inkubiert. Die dargestellten Ergebnisse sind die Mittelwerte von Vierfachbestimmungen. Die Standardabweichung lag nicht über 10%.
8 zeigt die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von ICAM-1-cDNA. Das erste ATG befindet sich in Position 58. Translatierte Sequenzen, die den tryptischen ICAM-1-Peptiden entsprechen, sind unterstrichen. Die hydrophoben, mutmaßlichen Signalpeptid- und Transmembransequenzen sind fett unterstrichen. N-verknüpfte Glycosylierungsstellen sind eingerahmt. Das Polyadenylierungssignal AATAAA in Position 2976 ist mit einem Überstrich versehen. Die dargestellte Sequenz gilt für den HL-60-cDNA-Klon. Die endotheliale Zell-cDNA wurde über den Großteil ihrer Länge hinweg sequenziert und zeigte nur untergeordnete Unterschiede.
9 zeigt die homologen ICAM-1-Domänen und die Beziehung zur Immunoglobulin-Supergenfamilie. (A) Ausrichtung von 5 homologen Domänen (D1-5). Zwei oder mehr identische Reste, die ausgerichtet sind, sind eingerahmt. Reste, die in NCAM-Domänen 2-mal oder öfter konserviert waren, sowie Reste, die in den Domänen der Sätze C2 und C1 konserviert waren, wurden mit den internen ICAM-1-Wiederholungen ausgerichtet. Die Stellung der vorhergesagten beta-Stränge in der ICAM-1-Domäne ist mit Balken und Kleinbuchstaben oberhalb der Ausrichtungen markiert. Die bekannte Stellung von beta-Strängen in Immunoglobulin C-Domänen ist mit Balken und Großbuchstaben unterhalb der Ausrichtung markiert. Die Stellung der mutmaßlichen Disulfidbrücke innerhalb von ICAM-1-Domänen ist mit S-S angegeben. (B-D) Ausrichtung von Proteindomänen, die zu ICAM-1-Domänen homolog sind: Proteine wurden zu Beginn durch Absuchen von NBRF-Datenbanken unter Verwendung des FASTP-Programms ausgerichtet. Die Proteinsequenzen sind MAG, NCAM, T-Zellrezeptor-α-Untereinheit-V-Domäne, IgMμ-Kette und α-1-B-Glycoprotein.
10 zeigt einen schematischen Vergleich der Sekundärstrukturen von ICAM-1 und MAG.
11 zeigt LFA-1-positive, EBV-transformierte, B-Lymphoblastoidzellen, die an ICAM-1 in planaren Membranen binden.
12 zeigt LFA-1-positive T-Lymphoblasten und T-Lymphomzellen, die an ICAM-1 in kunststoffgebundenen Vesikeln binden.
13 zeigt die Hemmung der Bindung von JY-B-Lymphoblastoidzellen, die an ICAM-1 in kunststoffgebundenen Vesikeln binden, durch Vorbehandlung von Zellen oder Vesikeln mit monoklonalen Antikörpern.
14 zeigt den Einfluss der Temperatur auf die Bindung von T-Lymphoblasten an ICAM-1 in kunststoffgebundenen Vesikeln.
15 zeigt den Bedarf an zweiwertigen Kationen bei der Bindung von T-Lymphoblasten an ICAM-1 in kunststoffgebundenen Vesikeln.
16 zeigt den Einfluss von anti-Haftantikörpern auf die Fähigkeit von peripheren, mononuklearen Blutzellen zur Vermehrung in Reaktion auf die Erkennung des T-Zellen-assoziierten Antigens OKT3. "OKT3" bedeutet die Zugabe von Antigen.
17 zeigt den Einfluss von anti-Haftantikörpern auf die Fähigkeit von peripheren, mononuklearen Blutzellen zur Vermehrung in Reaktion auf die Erkennung des nicht-spezifischen T-Zellen-Mitogens Concanavalin A. "CONA" bedeutet die Zugabe von Concanavalin A.
18 zeigt den Einfluss von anti-Haftantikörpern auf die Fähigkeit von peripheren, mononuklearen Blutzellen zur Vermehrung in Reaktion auf die Erkennung des Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin-Antigens. Die Zugabe von Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin zu den Zellen ist mit "KLH" bezeichnet.
19 zeigt den Einfluss von anti-Haftantikörpern auf die Fähigkeit von peripheren, mononuklearen Blutzellen zur Vermehrung in Reaktion auf die Erkennung des Tetanus-Toxoid-Antigens. Die Zugabe von Tetanus-Toxoid-Antigen zu den Zellen ist mit "AGN" bezeichnet.
20 zeigt die Bindung der monoklonalen Antikörper RR1/1, R6.5, LB2 und CL203 an ICAM-1-Deletionsmutanten.
21 zeigt die Bindung von ICAM-1-Deletionsmutanten an LFA-1.
22 zeigt die Epitope, die durch die monoklonalen anti-ICAM-1-Antikörper RR1/1, R6.5, LB2 und CL203 erkannt werden.
23 zeigt die Bindungskapazität von ICAM-1-Domäne 2-Mutanten an LFA-1.
24 zeigt die Bindungskapazität von ICAM-1-Domäne 3-Mutanten an LFA-1.
25 zeigt die Bindungskapazität von ICAM-1-Domäne 1-Mutanten an LFA-1.
26 zeigt die Ausrichtung von aminoterminalen ICAM-1-Domänen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das Auffinden eines natürlichen Bindungsliganden, der an LFA-1 bindet. Moleküle, z. B. solche der LFA-1-Familie, die beim Vorgang der zellulären Haftung beteiligt sind, werden als "Haftmoleküle" bezeichnet.
Der erfindungsgemäße natürliche Bindungsligand wird als "interzelluläres Haftmolekül-1" oder "ICAM-1" bezeichnet. ICAM-1 ist ein Glycoprotein mit 76–97 kd. ICAM-1 ist kein Heterodimeres. Die Erfindung ist auf ICAM-1 und dessen "funktionelle Derivate" abgestellt. Ein "funktionelles Derivat" von ICAM-1 ist eine Verbindung, die eine biologische Aktivität (entweder funktionell oder strukturell) besitzt, die eine wesentliche Ähnlichkeit mit einer biologischen Aktivität von ICAM-1 zeigt. Der Ausdruck "funktionelle Derivate" soll "Fragmente", "Varianten", "Analoge" oder "chemische Derivate" eines Moleküls einschließen. Der Ausdruck "Fragment" eines Moleküls, wie ICAM-1, bezieht sich auf eine beliebige Polypeptid-Unterklasse des Moleküls. Fragmente von ICAM-1, die ICAM-1-Aktivität besitzen und die löslich sind (d. h. nicht membrangebunden) werden besonders bevorzugt. Der Ausdruck "Variante" eines Moleküls, wie ICAM-1, bezieht sich auf ein Molekül, das bezüglich seiner Struktur und Funktion eine wesentliche Ähnlichkeit entweder mit dem gesamten Molekül oder einem Fragment davon aufweist. Ein Molekül wird als "im wesentlichen ähnlich" mit einem anderen Molekül bezeichnet, wenn beide Moleküle im wesentlichen ähnliche Strukturen aufweisen oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität besitzen. Somit werden unter der Voraussetzung, dass zwei Moleküle eine ähnliche Aktivität besitzen, diese Moleküle als Varianten angesehen, da der Ausdruck hier auch dann verwendet wird, wenn die Struktur von einem der Moleküle im anderen Molekül nicht festgestellt wird oder wenn die Sequenz von Aminosäureresten nicht identisch ist. Der Ausdruck "Analoges" eines Moleküls, wie ICAM-1, bezieht sich auf ein Molekül, dessen Funktion im wesentlichen ähnlich entweder mit dem gesamten Molekül oder mit einem Fragment davon ist. Gemäß der hier verwendeten Terminologie ist ein Molekül ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls, wenn es zusätzliche chemische Reste enthält, die normalerweise nicht Bestandteil des Moleküls sind. Derartige Reste können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und dergl. des Moleküls verbessern. Die Reste können alternativ die Toxizität des Moleküls verringern, unerwünschte Nebenwirkungen des Moleküls beseitigen oder abschwächen und dergl. Reste, die zur Vermittlung derartiger Wirkungen befähigt sind, sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben. "Von Toxin abgeleitete" Moleküle stellen eine spezielle Klasse von "chemischen Derivaten" dar. Ein "von Toxin abgeleitetes Molekül" ist ein Molekül (z. B. ICAM-1 oder ein Antikörper), das einen Toxinrest enthält. Die Bindung eines derartigen Moleküls an eine Zelle bringt den Toxinrest in unmittelbare Nähe zur Zelle und fördert dadurch den Tod der Zelle. Es können beliebige geeignete Toxinreste verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, Toxine, wie das Ricin-Toxin, das Diphtherie-Toxin, radioisotope Toxine, Membrankanäle bildende Toxine und dergl. zu verwenden. Verfahren zum Kuppeln derartiger Reste an ein Molekül sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Ein antigenes Molekül, wie ICAM-1, oder Mitglieder der LFA-1-Familie von Molekülen werden natürlicherweise an den Oberflächen von Lymphozyten exprimiert. Somit führt die Einführung derartiger Zellen in ein geeignetes Tier, z. B. durch intraperitoneale Injektion und dergl., zur Bildung von Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 oder an Mitglieder der LFA-1-Familie von Molekülen befähigt sind. Gegebenenfalls kann das Serum eines derartigen Tiers entnommen und als Quelle für polyklonale Antikörper, die zur Bindung an diese Moleküle befähigt sind, verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, derartigen Tieren Splenozyten zu entnehmen, um solche Milzzellen mit einer Myelom-Zelllinie zu fusionieren und derartigen Fusionszellen die Bildung einer Hybridomzelle zu ermöglichen, die monoklonale Antikörper sezerniert, die zur Bindung an ICAM-1 oder Mitglieder der LFA-1-Familie von Molekülen befähigt sind.
Die auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltenen Hybridomzellen können nach einer Reihe von Verfahren abgesucht werden, um die angestrebten Hybridomzellen zu identifizieren, die Antikörper sezernieren, die zur Bindung an ICAM-1 oder an Mitglieder der LFA-1-Familie von Molekülen befähigt sind. In einem bevorzugten Screeningtest, werden derartige Moleküle aufgrund ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Aggregation von mit dem Epstein-Barr-Virus transformierten Zellen identifiziert. Antikörper, die zur Hemmung einer derartigen Aggregation befähigt sind, werden sodann einem weiteren Screening unterzogen, um festzustellen, ob sie eine derartige Aggregation durch Bindung an ICAM-1 oder an ein Mitglied der LFA-1-Familie von Molekülen hemmen. Bei einem derartigen Screening können beliebige Mittel, die eine Unterscheidung von ICAM-1 von der LFA-1-Familie von Molekülen ermöglichen, herangezogen werden. Somit kann beispielsweise das durch den Antikörper gebundene Antigen durch Immunopräzipitation und Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert werden. Wenn es sich bei dem gebundenen Antigen um ein Mitglied der LFA-1-Familie von Molekülen handelt, so erweist sich das immunopräzipitierte Antigen als ein Dimeres, während dann, wenn das gebundene Antigen ICAM-1 ist, eine Spezies mit einfachem Molekulargewicht immunopräzipitiert wird. Alternativ ist es möglich, zwischen solchen Antikörpern, die an Mitglieder der LFA-1-Familie von Molekülen binden, und Antikörpern, die an ICAM-1 binden, zu unterscheiden, indem man ein Screening auf die Fähigkeit des Antikörpers zur Bindung an Zellen, wie Granulozyten, die LFA-1, jedoch nicht ICAM-1 exprimieren, durchführt. Die Fähigkeit eines Antikörpers (von dem bekannt ist, dass er eine zelluläre Aggregation hemmt) zur Bindung an Granulozyten zeigt an, dass der Antikörper zur Bindung von LFA-1 befähigt ist. Das Fehlen einer derartigen Bindung stellt ein Anzeichen für einen Antikörper dar, der zur Erkennung von ICAM-1 befähigt ist. Die Fähigkeit eines Antikörpers zur Bindung an eine Zelle, z. B. an einen Granulozyten, kann durch übliche Maßnahmen, die vom Fachmann herangezogen werden, nachgewiesen werden. Zu derartigen Maßnahmen gehören Immunoassays, zelluläre Agglutination, Filterbindungsuntersuchungen, Antikörperfällung und dergl.
Die erfindungsgemäßen anti-Aggregationsantikörper können alternativ identifiziert werden, indem man ihre Fähigkeit zur differenziellen Bindung an Zellen, die ICAM-1 exprimieren (z. B. aktivierte Endothelzellen), binden, und ihre Unfähigkeit zur Bindung an Zellen, die kein ICAM-1 exprimieren, misst. Wie es für den Fachmann leicht ersichtlich ist, können die vorstehenden Tests modifiziert werden oder in unterschiedlicher Reihenfolge durchgeführt werden, um dadurch verschiedene mögliche Screeningtests bereitzustellen, die jeweils dazu befähigt sind, eine Identifizierung und Unterscheidung von Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, gegenüber Mitgliedern der LFA-1-Familie von Molekülen vorzunehmen.
Die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Mittel können gewonnen werden durch: natürliche Verfahren (z. B. Herbeiführung einer Induktion bei Tieren, Pflanzen, Pilzen, Bakterien und dergl. zur Bildung eines Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1 oder einer Induktion bei einem Tier zur Erzeugung von polyklonalen Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind); synthetische Verfahren (z. B. Anwendung des Merrifield-Verfahrens zur Synthese von Polypeptiden, um ICAM-1, funktionelle Derivate von ICAM-1 oder Protein-Antagonisten von ICAM-1 (entweder Immunoglobuline oder Nicht-Immunoglobuline) herzustellen); Hybridomtechnik (z. B. zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind); oder rekombinante Technik (z. B. zur Herstellung der erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Mittel in verschiedenen Wirten (d. h. Hefen, Bakterien, Pilzen, gezüchteten Säugetierzellen und dergl.) oder aus rekombinanten Plasmiden oder viralen Vektoren). Die Wahl des anzuwendenden Verfahrens hängt von Faktoren, wie Zweckmäßigkeit, angestrebte Ausbeute und dergl., ab. Es ist nicht erforderlich, nur eine oder eines der vorstehend beschriebenen Methoden, Verfahren oder Techniken zur Herstellung eines speziellen entzündungshemmenden Mittels anzuwenden, vielmehr können die vorstehend beschriebenen Verfahren, Methoden und Techniken zur Herstellung eines speziellen entzündungshemmenden Mittels kombiniert werden.
A. Identifizierung des LFA-1-Bindungspartners (ICAM-1)
1. Tests auf LFA-1-abhängige Aggregation
Zahlreiche durch den Epstein-Barr-Virus transformierte Zellen zeigen eine Aggregation. Diese Aggregation kann in Gegenwart von Phorbolestern verstärkt werden. Es wurde festgestellt, dass eine derartige homotypische Aggregation (d. h. Aggregation unter Beteiligung nur eines einzigen Zelltyps) durch anti-LFA-1-Antikörper blockiert wird (R. Rothlein et al., J. Exper. Med., Bd. 163 (1986), S. 1132–1149; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Somit kann das Ausmaß der LFA-1-abhängigen Bindung ermittelt werden, indem man das Ausmaß der spontanen oder von Phorbolester abhängigen Aggregatbildung bestimmt.
Ein Mittel, das die LFA-1-abhängige Aggregation stört, lässt sich durch Anwendung eines Tests identifizieren, der zu der Feststellung befähigt ist, ob das Mittel die spontane oder die von Phorbolester abhängige Aggregation von durch den Epstein-Barr-Virus transformierten Zellen stört. Die meisten der durch den Epstein-Barr-Virus transformierten Zellen lassen sich in einem derartigen Test verwenden, sofern die Zellen zur Expression des LFA-1-Rezeptormoleküls befähigt sind. Derartige Zellen lassen sich nach der Technik von T. A. Springer et al., (J. Exper. Med., Bd. 160 (1984), S. 1901–1918; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) herstellen. Obgleich im erfindungsgemäßen, LFA-1-abhängigen Bindungstest beliebige derartige Zellen verwendet werden können, ist es bevorzugt, Zellen der JY-Zelllinie heranzuziehen (C. T. Terhost et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 73 (1976), S. 910). Die Zellen lassen sich in einem beliebigen geeigneten Kulturmedium züchten, wobei es jedoch besonders bevorzugt ist, die Zellen in RMPI-1640-Kulturmedium, das mit 10 fötalem Kälberserum und 50 μg/ml Gentamycin (Gibco Laboratories, NY) ergänzt ist, zu züchten. Die Zellen sollen unter Bedingungen gezüchtet werden, die für die Vermehrung von Säugetierzellen geeignet sind (d. h. bei einer Temperatur von im allgemeinen 37°C, in einer Atmosphäre mit 5% CO₂, bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95% und dergl.).
2. LFA-1 bindet an ICAM-1
Es wurden Personen identifiziert, bei denen die Familie der LFA-1-Rezeptormoleküle in den Lymphozyten fehlt (D. C. Anderson et al., Fed. Proc, Bd. 44 (1985), S. 2671–2677; und D. C. Anderson et al., J. Infect. Dis., Bd. 152 (1985), S. 668–689). Diese Personen leiden am Leukozyten-Adhäsionsdefizit (LAD). Mit EBV transformierte Zellen derartiger Personen können beim vorstehend beschriebenen Aggregationstest weder spontan noch in Gegenwart von Phorbolestern aggregieren. Wenn derartige Zellen mit LFA-1 exprimierenden Zellen vermischt wurden, wurde eine Aggregation beobachtet (R. Rothlein et al., J. Exper. Med., Bd. 163 (1986), S. 1132–1149) (1). Von Bedeutung ist, dass diese Aggregate nicht gebildet werden konnten, wenn diese Zellen in Gegenwart von anti-LFA-1-Antikörpern inkubiert wurden. Obgleich somit die Aggregation LFA-1 erforderte, zeigte die Fähigkeit von LFA-1-defizitären Zellen zur Bildung von Aggregaten mit LFA-1 enthaltenden Zellen an, dass der LFA-1-Bindungspartner nicht LFA-1 war, sondern vielmehr ein vorher unentdecktes zelluläres Haftmolekül. 1 zeigt den Mechanismus der zellulären Haftung.
B. Interzelluläres Haftmolekül-1 (ICAM-1)
Das neue interzelluläre Haftmolekül ICAM-1 wurde zunächst gemäß dem Verfahren von R. Rothlein et al. (J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 1270–1274; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) identifiziert und partiell charakterisiert. Zum Nachweis des ICAM-1-Moleküls wurden monoklonale Antikörper aus Milzzellen von Mäusen, die mit Zellen von Personen mit einem genetischen Defizit der LFA-1-Expression immunisiert worden waren, hergestellt. Die erhaltenen Antikörper wurden einem Screening in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Aggregation von LFA-1 exprimierenden Zellen unterzogen (2). Im einzelnen wurden Mäuse mit EBV-transformierten B-Zellen von LAD-Patienten, die das LFA-1-Antigen nicht exprimieren, immunisiert. Anschließend wurden die Milzzellen dieser Tiere entnommen, mit Myelomzellen fusioniert und zu Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper bilden, gemacht. Anschließend wurden EBV-transformierte B-Zellen von normalen Personen, die LFA-1 exprimieren, in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers der Hybridomzelle inkubiert, um etwaige monoklonale Antikörper zu identifizieren, die zur Hemmung der durch Phorbolester vermittelten, LFA-1-abhängigen, spontanen Aggregation der EBV-transformierten B-Zellen befähigt sind. Da die Hybridomzellen von Zellen abgeleitet waren, die nie dem LFA-1-Antigen begegnet waren, wurde kein monoklonaler Antikörper gegen LFA-1 gebildet. Somit muss jeglicher Antikörper, für den eine Hemmung der Aggregation festgestellt wird, zur Bindung an ein Antigen befähigt sein, das (obgleich es sich nicht um LFA-1 handelt) am LFA-1-Haftvorgang teilgenommen hatte. Obgleich beliebige Verfahren zur Gewinnung derartiger monoklonaler Antikörper herangezogen werden können, ist es bevorzugt, ICAM-1 bindende monoklonale Antikörper durch Immunisierung von BALB/C-Mäusen unter Anwendung von Wegen und Schemata zu immunisieren, die von R. Rothlein et al. (J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 1270–1274) im Zusammenhang mit durch den Epstein-Barr-Virus transformierten, peripheren, mononuklearen Blutzellen von LFA-1-defizitären Personen beschrieben wurden. Derartige Zellen werden von T. A. Springer et al. beschrieben (J. Exper. Med., Bd. 160 (1984), S. 1901–1918).
Bei einem bevorzugten Verfahren zur Erzeugung und zum Nachweis von Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, werden Mäuse entweder mit EBV-transformierten B-Zellen, die sowohl ICAM-1 als auch LFA-1 exprimieren, oder vorzugsweise mit TNF-aktivierten Endothelzellen, die ICAM-1, jedoch nicht LFA-1 exprimieren, immunisiert. Bei einem besonders bevorzugten Verfahren zur Erzeugung von Hybridomzellen, die anti-ICAM-1-Antikörper bilden, wurde eine Balb/C-Maus nacheinander mit JY-Zellen und mit differenzierten U937-Zellen (ATCC CRL-1593) immunisiert. Milzzellen derartiger Tiere wurden entnommen, mit Myelomzellen fusioniert und zur Bildung von Antikörper erzeugenden Hybridomzellen herangezogen. Die Antikörper wurden einem Screening auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der LFA-1-abhängigen, durch Phorbolester induzierten Aggregation einer EBV-transformierten Zelllinie, wie JY-Zellen, die sowohl den LFA-1-Rezeptor als auch ICAM-1 exprimiert, unterzogen. Wie von R. Rothlein et al. gezeigt (J. Immunol., Bd. 137 (1987), S. 1270–1274), werden sodann Antikörper, die zur Hemmung dieser Aggregation befähigt sind, auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der durch Phorbolester induzierten Aggregation einer Zelllinie, wie SKW3 (M. Dustin et al., J. Exper. Med., Bd. 165 (1987), S. 672–692), getestet, deren Fähigkeit zur spontanen Aggregation in Gegenwart eines Phorbolesters durch einen Antikörper, der zur Bindung von LFA-1 befähigt ist, gehemmt wird, jedoch nicht durch anti-ICAM-1-Antikörper gehemmt wird. Antikörper, die zur Hemmung der durch Phorbolester induzierten Aggregation von Zellen, wie JY-Zellen, befähigt sind, jedoch nicht zur Hemmung der durch Phorbolester induzierten Aggregation von Zellen, wie SKW3-Zellen, befähigt sind, sind vermutlich anti-ICAM-1-Antikörper. Alternativ lassen sich Antikörper, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, durch Absuchen auf Antikörper identifizieren, die zur Hemmung der von LFA-1 abhängigen Aggregation von LFA-Expressionszellen (wie JY-Zellen) befähigt sind, jedoch nicht zur Bindung an Zellen befähigt sind, die LFA-1 exprimieren, jedoch wenig oder gar kein ICAM-1 exprimieren (z. B. normale Granulozyten), oder die zur Bindung an Zellen, die ICAM-1 exprimieren, jedoch nicht LFA-1 exprimieren (z. B. TNF-aktivierten Endothelzellen) befähigt sind. Eine weitere Alternative besteht in der Immunopräzipitation von Zellen, die ICAM-1 und/oder LFA-1 exprimieren, unter Verwendung von Antikörpern, die eine von LFA-1 abhängige Aggregation von Zellen, wie JY-Zellen, hemmen, und durch SDS-PAGE oder ein gleichwertiges Verfahren zur Bestimmung einer charakteristischen molekularen Eigenschaft des mit dem Antikörper gefällten Moleküls. Wenn die charakteristische Eigenschaft die gleiche wie die von ICAM-1 ist, kann angenommen werden, dass es sich beim Antikörper um einen anti-ICAM-1-Antikörper handelt.
Unter Verwendung der auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellten monoklonalen Antikörper wurde das ICAM-1-Zelloberflächenmolekül gereinigt und charakterisiert. ICAM-1 wurde aus humanen Zellen oder Geweben unter Anwendung der Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern gereinigt. Bei einem derartigen Verfahren wird ein mit ICAM-1 reaktiver monoklonaler Antikörper an eine inerte Säulenmatrix gekuppelt. Es können beliebige Verfahren zur Herbeiführung einer derartigen Kupplung herangezogen werden, wobei es jedoch bevorzugt ist, sich des Verfahrens von H. C. Oettgen et al., J. Biol. Chem., Bd. 259 (1984), S. 12034, zu bedienen. Wird ein derartiges zelluläres Lysat durch die Matrix geleitet, werden die vorhandenen ICAM-1-Moleküle an der Matrix adsorbiert und festgehalten. Durch Veränderung des pH-Werts oder der Ionenkonzentration der Säule können die gebundenen ICAM-1-Moleküle von der Säule eluiert werden. Obgleich beliebige geeignete Matrices herangezogen werden können, ist es bevorzugt, Sepharose (Pharmacia) als Matrixmaterial zu verwenden. Die Bildung von Säulenmatrices und deren Verwendung bei der Proteinreinigung ist aus dem Stand der Technik bekannt.
In einer dem Fachmann geläufigen Art und Weise können die vorstehend beschriebenen Tests zur Identifizierung von Verbindungen herangezogen werden, die dazu befähigt sind, die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der zellulären Haftung abzuschwächen oder zu hemmen.
ICAM-1 ist ein Zelloberflächen-Glycoprotein, das an nicht-hämatopoetischen Zellen, wie vaskulären Endothelzellen, Thymus-Epithelzellen, bestimmten anderen Epithelzellen und Fibroblasten, und an hämatopoetischen Zellen, wie Gewebemakrophagen, mitogenstimulierten T-Lymphozytenblasten und germinalen, zentrierten B-Zellen und dendritischen Zellen in Tonsillen, Lymphknoten und Peyer-Plaques, exprimiert wird. ICAM-1 wird an vaskulären Endothelzellen in T-Zellbereichen in Lymphknoten und Tonsillen mit reaktiver Hyperplasie in hohem Maße exprimiert. ICAM-1 wird in geringen Mengen an peripheren Blutlymphozyten exprimiert. Die durch Phorbolester stimulierte Differenzierung einiger myelomonozytischer Zelllinien erhöht in starkem Maße die ICAM-1-Expression. Somit wird ICAM-1 bevorzugt an Entzündungsstellen exprimiert und wird im allgemeinen durch ruhende Zellen nicht exprimiert. Die ICAM-1-Expression an dermalen Fibroblasten wird durch Interleukin-1 oder gamma-Interferon in Konzentrationen von 10 U/ml innerhalb einer Zeitspanne von 4 bzw. 10 Stunden auf das 3- bis 5-fache erhöht. Die Induktion ist von der Protein- und mRNA-Synthese abhängig und reversibel.
ICAM-1 zeigt in verschiedenen Zelltypen eine Heterogenität des Molekulargewichts. Es weist ein Molekulargewicht von 97 kd an Fibroblasten, von 114 kd an der myelomonozytischen Zelllinie U937 und von 90 kd an der B-Lymphoblastoidzelle JY auf. Es wurde festgestellt, dass an der ICAM-1-Biosynthese ein intrazellulärer Vorläufer von etwa 73 kd beteiligt ist. Die nicht-N-glycosylierte Form, die sich durch Behandlung mit Tunicamycin (das die Glycosylierung hemmt) ergibt, weist ein Molekulargewicht von 55 kd auf.
ICAM-1, das aus mit Phorbolester stimulierten U937-Zellen oder aus Fibroblastenzellen isoliert worden ist, ergibt nach chemischer Deglycosylierung ein identisches Hauptprodukt mit einem Molekulargewicht von 60 kd. Monoklonale ICAM-1-Antikörper stören die Haftung von Phytohämagglutininblasten an Zelllinien mit LFA-1-Defizit. Eine Vorbehandlung von Fibroblasten, jedoch nicht von Lymphozyten mit monoklonalen Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, hemmt die Lymphozyten-Fibroblasten-Haftung. Es wurde festgestellt, dass eine Vorbehandlung von Lymphozyten, jedoch nicht von Fibroblasten mit Antikörpern gegen LFA-1 die Lymphozyten-Fibroblasten-Haftung hemmt.
ICAM-1 stellt somit den Bindungsliganden des CD 18-Komplexes an Leukozyten dar. Es ist an Fibroblasten und Endothelzellen in vitro durch entzündliche Mediatoren, wie IL-1, gamma-Interferon und Tumornekrosefaktor, in einem Zeitrahmen induzierbar, der mit der in vivo-Infiltration von Lymphozyten in entzündliche Läsionen übereinstimmt (M. L. Dustin et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 245–254; und J. S. Prober et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 1893–1896). Ferner wird ICAM-1 an nicht-hämatopoetischen Zellen, wie vaskulären Endothelzellen, Thymus-Epithelzellen, anderen Epithelzellen und Fibroblasten, und an hämatopoetischen Zellen, wie Gewebemakrophagen, mitogenstimulierten T-Lymphozytenblasten und germinalen Zentrum-B-Zellen und dendritischen Zellen in Tonsillen, Lymphknoten und Peyer-Plaques exprimiert (M. L. Dustin et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 245–254). ICAM-1 wird an Keratinozyten in gutartigen entzündlichen Läsionen, wie allergischen Ekzemen, Lichen planus, Exanthemen, Nesselsucht und Bläschenkrankheiten, exprimiert. Allergische Hautreaktionen, die durch das Aufbringen eines Haptens, gegenüber dem der Patient allergisch ist, auf die Haut hervorgerufen werden, haben ebenfalls eine starke ICAM-1-Expression an den Keratinozyten ergeben. Andererseits ergaben toxische Pflaster auf der Haut keine ICAM-1-Expression an den Keratinozyten. ICAM-1 ist an Keratinozyten aus Biopsien von Hautläsionen verschiedener dermatologischer Störungen vorhanden. Die ICAM-1-Expression wird an Läsionen von allergischen Pflastertests induziert, während Keratinozyten aus Läsionen von toxischen Pflastertests kein ICAM-1 exprimierten.
ICAM-1 stellt somit ein zelluläres Substrat dar, an dem Lymphozyten haften können, so dass die Lymphozyten zu Entzündungsstellen wandern und/oder verschiedene Effektorfunktionen, die zu dieser Entzündung beitragen, ausüben können. Zu derartigen Funktionen gehören die Antikörperbildung, Lysis von viral infizierten Zielzellen und dergl. Der hier verwendete Ausdruck "Entzündung" soll Reaktionen der spezifischen oder nicht-spezifischen Abwehrsysteme umfassen. Der hier verwendete Ausdruck "spezifisches Abwehrsystem" bezieht sich auf die Komponente des Immunsystems, die auf die Anwesenheit von spezifischen Antigenen reagiert. Eine Entzündung wird als das Ergebnis einer Reaktion des spezifischen Abwehrsystems bezeichnet, wenn die Entzündung durch eine Reaktion des spezifischen Abwehrsystems verursacht oder vermittelt wird oder mit diesem assoziiert ist. Zu Beispielen für eine Entzündung, die sich aus einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems ergibt, gehören die Antwort auf Antigene, wie Rubella-Virus, Autoimmunerkrankungen, durch T-Zellen vermittelte Hypersensibilitätsreaktionen vom verzögerten Typ (wie sie beispielsweise bei Personen mit einem "positiven" Testergebnis beim Mantaux-Test auftreten), Psoriasis und dergl.
Bei einer "nicht-spezifischen Abwehrsystem-Reaktion" handelt es sich um eine durch Leukozyten, die über kein immunologisches Gedächtnis verfügen, vermittelte Antwort. Derartige Zellen umfassen Granulozyten und Makrophagen. Der hier verwendete Ausdruck "Entzündung" ist das Ergebnis einer Antwort des nicht-spezifischen Abwehrsystems, wenn die Entzündung durch eine Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems verursacht oder vermittelt wird oder mit diesem assoziiert ist. Zu Beispielen für Entzündungen, die sich zumindest teilweise aufgrund einer Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems ergeben, gehören Entzündungen, die mit folgenden Zuständen verbunden sind: Asthma; respiratorisches Distress-Syndrom beim Erwachsenen (ARDS) oder Mehrfachorgan-Schädigungssyndrome im Anschluss an eine Septikämie oder ein Trauma; Repertusionsschädigungen des Myokardgewebes oder anderer Gewebe; akute Glomerulonephritis; reaktive Arthritis; Dermatosen mit akuten entzündlichen Komponenten; akute purulente Meningitis oder andere entzündliche Störungen des Zentralnervensystems; thermische Läsionen; Hämodialyse; Leukapherese; ulzerative Kolitis; Morbus-Crohn; nekrotisierende Enterokolitis; mit Syndromen verbundene Granulozytentransfusion; und cytokininduzierte Toxizität.
Erfindungsgemäß können funktionelle ICAM-1-Derivate und insbesondere Derivate, die Fragmente oder mutante Varianten von ICAM-1, die die Domänen 1, 2 und 3 aufweisen, bei der Behandlung oder Therapie von derartigen Reaktionen des nicht-spezifischen Abwehrsystems verwendet werden. Besonders bevorzugt für eine derartige Behandlung oder Therapie sind ICAM-1-Fragmente oder mutante Varianten, die die Domäne 2 von ICAM-1 enthalten. Besonders bevorzugt für eine derartige Behandlung oder Therapie sind ICAM-1-Fragmente oder mutante Varianten, die die Domäne 1 von ICAM-1 enthalten.
C. Klonierung des ICAM-1-Gens
Es können eine Reihe von Verfahren zur Klonierung des ICAM-1-Gens herangezogen werden. Ein derartiges Verfahren erfordert die Analyse einer Shuttle-Vektorbibliothek von cDNA-Inserts (abgeleitet von einer ICAM-1 exprimierenden Zelle) auf die Anwesenheit eines Inserts, das das ICAM-1-Gen enthält. Eine derartige Analyse kann durch Transfektion von Zellen mit dem Vektor und durch anschließendes Testen auf die ICAM-1-Expression durchgeführt werden. Das bevorzugte Verfahren zum Klonieren dieses Gens erfordert die Bestimmung der Aminosäuresequenz des ICAM-1-Moleküls. Um dies durchzuführen, kann ICAM-1-Protein gereinigt und mit automatisierten Sequenziervorrichtungen analysiert werden. Alternativ kann das Molekül mit Bromcyan oder mit Proteasen, wie Papain, Chymotrypsin oder Trypsin, fragmentiert werden (Y. Oike et al., J. Biol. Chem., Bd. 257 (1982), S. 9751–9758; und C. Liu et al., Int. J. Pept. Protein Res., Bd. 21 (1983), S. 209–215). Obgleich es möglich ist, die gesamte Aminosäuresequenz von ICAM-1 zu bestimmen, ist es bevorzugt, die Sequenz von Peptidfragmenten des Moleküls zu bestimmen. Wenn die Peptidgröße eine Länge von mehr als 10 Aminosäuren aufweist, so reicht die Sequenzinformation im allgemeinen aus, um ein Gen, wie das Gen für ICAM-1, zu klonieren.
Die Sequenz von Aminosäureresten in einem Peptid wird hier entweder durch die üblicherweise verwendeten Bezeichnungen mit drei Buchstaben oder durch den Einbuchstabencode bezeichnet. Diese Dreibuchstaben- und Einbuchstabencodes finden sich beispielsweise in Biochemistry, A. Lehninger, Worth Publishers, New York, NY (1970). Wenn eine derartige Sequenz vertikal aufgeführt wird, soll sich der aminoterminale Rest oben auf der Liste und der carboxyterminale Rest am Ende der Liste befinden. Bei horizontaler Auflistung soll sich der Aminoterminus am linken Ende befinden, während der Carboxyterminus sich am rechten Ende befinden soll. Die Reste von Aminosäuren in einem Peptid können durch Bindestriche getrennt werden. Derartige Bindestriche sollen nur die Darstellung einer Sequenz erleichtern. Als ein rein erläuterndes Beispiel gibt die Aminosäuresequenz
-Gly-Ala-Ser-Phe-
an, dass ein Ala-Rest mit der Carboxylgruppe von Gly verbunden ist und ein Ser-Rest mit der Carboxylgruppe des Ala-Restes und mit der Aminogruppe eines Phe-Restes verknüpft ist. Die Darstellung zeigt ferner an, dass die Aminosäuresequenz das Tetrapeptid GIy-Ala-Ser-Phe enthält. Die Darstellung ist nicht als eine Beschränkung der Aminosäuresequenz auf dieses eine Tetrapeptid zu verstehen, sondern so zu verstehen, dass sie (1) das Tetrapeptid, bei dem ein oder mehr Aminosäurereste mit dem Amino- oder Carboxylende verknüpft sind, (2) das Tetrapeptid, bei dem ein oder mehr Aminosäurereste sowohl mit dem Amino- als auch mit dem Carboxylende verknüpft sind, und (3) das Tetrapeptid ohne weitere Aminosäurereste umfassen.
Nachdem ein oder mehr geeignete Peptidfragmente sequenziert worden sind, werden dann die DNA-Sequenzen, die zur Kodierung dieser Fragmente befähigt sind, untersucht. Da der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon zum Kodieren einer bestimmten Aminosäure verwendet werden (J. D. Watson, in: Molecular Biology of the Gene, 3. Auflg., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S. 356–357). Die Peptidfragmente werden analysiert, um Aminosäuresequenzen zu identifizieren, die durch Oligonucleotide mit dem geringsten Degenerationsgrad kodiert werden können. Dies wird vorzugsweise erreicht, indem man Sequenzen identifiziert, die Aminosäuren enthalten, die nur durch ein einziges Codon kodiert werden. Obgleich gelegentlich derartige Aminosäuresequenzen nur durch ein einziges Oligonucleotid kodiert werden können, kann die Aminosäuresequenz häufig durch einen beliebigen Bestandteil aus einem Satz von ähnlichen Oligonucleotiden kodiert werden. Von Bedeutung ist, dass zwar sämtliche Mitglieder des Satzes Oligonucleotide enthalten, die zum Kodieren des Peptidfragments befähigt sind und somit möglicherweise die gleiche Nucleotidsequenz wie das Gen, das für das Peptidfragment kodiert, enthalten, aber nur ein Mitglied des Satzes eine Nucleotidsequenz enthält, die identisch mit der Nucleotidsequenz dieses Gens ist. Da dieses Mitglied innerhalb des Satzes vorhanden ist und zur Hybridisierung mit DNA auch in Gegenwart der übrigen Mitglieder des Satzes befähigt ist, ist es möglich, den unfraktionierten Satz von Oligonucleotiden auf die gleiche Weise einzusetzen, in der man ein einziges Oligonucleotid zum Klonieren des Gens, das für das Peptid kodiert, einsetzen würde.
In genau analoger Art und Weise, wie sie vorstehend beschrieben wurde, kann man ein Oligonucleotid (oder einen Satz von Oligonucleotiden) verwenden, die eine Nucleotidsequenz aufweisen, die mit der Oligonucleotidsequenz oder dem Satz von Sequenzen, die zur Kodierung des Peptidfragments befähigt sind, komplementär ist.
Ein geeignetes Oligonucleotid oder ein Satz von Oligonucleotiden, die zum Kodieren eines Fragments des ICAM-1-Gens befähigt sind (oder die mit einem Nucleotid oder Satz von Oligonucleotiden komplementär sind) werden (unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens) identifiziert, synthetisiert und unter Anwendung bekannter Maßnahmen mit einem DNA-Präparat oder vorzugsweise mit einem cDNA-Präparat, das sich von humanen Zellen ableitet, die zur Expression von ICAM-1-Gensequenzen befähigt sind, hybridisiert. Techniken zur Nucleinsäurehybridisierung werden von T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982), und von B. D. Haymes et al., in Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985) (diese Druckschriften werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) beschrieben. Die verwendete DNA- oder cDNA Quelle ist vorzugsweise in Bezug auf ICAM-1-Sequenzen angereichert. Eine derartige Anreicherung lässt sich auf besonders einfache Weise aus cDNA erreichen, die durch Extraktion von RNA aus Zellen erhalten worden ist, die unter Bedingungen gezüchtet worden sind, die eine ICAM-1-Synthese induzieren (z. B. U937, gezüchtet in Gegenwart von Phorbolestern und dergl.).
Techniken, wie sie beispielsweise vorstehend beschrieben wurden, oder ähnliche Techniken haben in erfolgreicher Weise die Klonierung von Genen für humane Aldehyd-dehydrogenasen (L. C. Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 3771–3775), Fibronectin (S. Suzuki et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J., Bd. 4 (1985), S. 2519–2524), das humane Östrogen-Rezeptor-Gen (P. Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 7889–7893), den Plasminogen-Aktivator vom Gewebetyp (D. Pennica et al., Nature, Bd. 301 (1983), S. 214–221) und die komplementäre DNA für humane, plazentare alkalische Phosphatase (W. Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 82 (1985), S. 8715–8719) ermöglicht.
Gemäß einem bevorzugten alternativen Weg zum Klonieren des ICAM-1-Gens wird eine Bibliothek von Expressionsvektoren hergestellt, indem man DNA oder vorzugsweise cDNA aus einer Zelle, die zur Expression von ICAM-1 befähigt ist, in einen Expressionsvektor kloniert. Die Bibliothek wird sodann auf Elemente, die zur Expression eines Proteins, das an anti-ICAM-1-Antikörper bindet, befähigt sind und deren Nucleotidsequenz zur Kodierung von Polypeptiden, die die gleiche Aminosäuresequenz wie ICAM-1 oder Fragmente von ICAM-1 aufweisen, abgesucht.
Das klonierte ICAM-1-Gen, das gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten worden ist, kann in funktioneller Weise mit einem Expressionsvektor verknüpft und in bakterielle oder eukaryontische Zellen eingeführt werden, um ICAM-1-Protein zu erzeugen. Techniken für derartige Manipulationen werden von T. Maniatis et al. (a.a.O.) beschrieben und sind aus dem Stand der Technik bekannt.
D. Anwendungsmöglichkeiten von Tests der LFA-1-abhängigen Aggregation
Der vorstehend beschriebene Test, der zum Messen der LFA-1-abhängigen Aggregation befähigt ist, kann zum Identifizieren von Mitteln verwendet werden, die als Antagonisten zur Hemmung des Ausmaßes der LFA-1-abhängigen Aggregation wirken. Derartige Antagonisten können wirken, indem sie die Fähigkeit von LFA-1 oder von ICAM-1 zur Vermittlung der Aggregation stören. Somit umfassen derartige Mittel Immunoglobuline, z. B. einen Antikörper, der zur Bindung entweder an LFA-1 oder an ICAM-1 befähigt ist. Ferner können Nicht-Immunoglobulin-Mittel (d. h. chemische Mittel) unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Tests geprüft werden, um festzustellen, ob sie Antagonisten der LFA-1-Aggregation darstellen.
E. Anwendungsmöglichkeiten von Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1-Rezeptorproteine befähigt sind
1. Entzündungshemmende Mittel
Monoklonale Antikörper gegen Mitglieder des CD 18-Komplexes hemmen zahlreiche haftungsabhängige Funktionen von Leukozyten, einschließlich der Bindung an Endothel (D. Haskard et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 2901–2906), homotypischer Adhäsionen (R. Rothlein et al., J. Exp. Med., Bd. 163 (1986), S. 1132–1149), Antigen- und Mitogen-induzierter Proliferation von Lymphozyten (D. Davignon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78 (1981), S. 4535–4539), der Antikörperbildung (A. Fischer et al., J. Immunol., Bd. 136 (1986), S. 3198–3203) und der Effektorfunktionen sämtlicher Leukozyten, wie die lytische Aktivität von zytotoxischen T-Zellen (A. M. Krensky et al., J. Immunol., Bd. 132 (1984), S. 2180–2182), Makrophagen (G. Strassman et al., J. Immunol., Bd. 136 (1986), S. 4328–4333) und sämtliche Zellen, die an Antikörper-abhängigen, zellulären Zytotoxizitätsreaktionen beteiligt sind (S. Kohl et al., J. Immunol., Bd. 133 (1984), S. 2972–2978). Bei sämtlichen vorstehenden Funktionen hemmen die Antikörper die Fähigkeit des Leukozyten zur Haftung am entsprechenden zellulären Substrat, was wiederum das letztendliche Ergebnis hemmt.
Wie vorstehend erörtert, ist die Bindung von ICAM-1-Molekülen an die Mitglieder der LFA-1-Familie von Molekülen von zentraler Bedeutung bei der zellulären Haftung. Durch den Haftungsvorgang sind die Lymphozyten dazu fähig, kontinuierlich ein Tier in Bezug auf die Gegenwart von fremden Antigenen zu überwachen. Obgleich diese Vorgänge normalerweise wünschenswert sind, können sie auch die Abstoßung von Organtransplantaten, die Abstoßung von Gewebetransplantaten und zahlreiche Autoimmunerkrankungen hervorrufen. Daher sind jegliche Mittel, die zur Abschwächung oder Hemmung der zellulären Haftung befähigt sind, bei Empfängern von Organtransplantaten oder Gewebetransplantaten oder bei Autoimmunpatienten in hohem Maße erwünscht.
Monoklonale Antikörper, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, eignen sich in hohem Maße als entzündungshemmende Mittel bei einem Säuger. Derartige Mittel unterscheiden sich in signifikanter Weise von allgemeinen entzündungshemmenden Mitteln insofern, als sie zur selektiven Hemmung der Haftung befähigt sind und keine Nebenwirkungen, wie eine Nephrotoxizität, die bei herkömmlichen Mitteln auftreten, aufweisen. Monoklonale Antikörper, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, können daher dazu herangezogen werden, bei einem Säuger Organ- oder Gewebeabstoßungen zu verhindern oder Autoimmunreaktionen zu modifizieren, ohne dass eine Furcht vor derartigen Nebenwirkungen besteht.
Von Bedeutung ist, dass es die Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die zur Erkennung von ICAM-1 befähigt sind, ermöglichen kann, Organtransplantationen auch unter Individuen mit fehlerhafter HLA-Übereinstimmung durchzuführen.
2. Suppressoren der Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ
Da ICAM-1-Moleküle großenteils an Entzündungsstellen, z. B. an Stellen, die bei der Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ beteiligt sind, sind Antikörper (insbesondere monoklonale Antikörper), die zur Bindung an ICAM-1-Moleküle befähigt sind, von möglichem therapeutischen Nutzen bei der Abschwächung oder Beseitigung derartiger Reaktionen. Diese mögliche therapeutische Anwendung kann auf zweierlei Weise ausgenützt werden. Erstens kann eine Zusammensetzung, die einen monoklonalen Antikörper gegen ICAM-1 enthält, einem Patienten verabreicht werden, der einer Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ unterliegt. Beispielsweise können derartige Zusammensetzungen einem Individuum zur Verfügung gestellt werden, das in Kontakt mit Antigenen, z. B. Efeugift, Eichengift und dergl., gekommen ist. Bei der zweiten Ausführungsform wird der monoklonale Antikörper, der zur Bindung an ICAM-1 befähigt ist, einem Patienten in Verbindung mit einem Antigen verabreicht, um eine anschließende entzündliche Reaktion zu verhindern. Somit kann die zusätzliche Verabreichung eines Antigens zusammen mit einem ICAM-1-bindenden, monoklonalen Antikörper ein Individuum zeitweise gegenüber einer anschließenden Darreichung dieses Antigens tolerant machen.
3. Therapie von chronischen Entzündungskrankheiten
Da LAD-Patienten, bei denen LFA-1 fehlt, keine entzündliche Reaktion aufbauen, wird angenommen, dass der Antagonismus des natürlichen Liganden von LFA-1, nämlich ICAM-1, auch eine entzündliche Reaktion hemmt. Die Fähigkeit von Antikörpern gegenüber ICAM-1 zur Hemmung von Entzündungen bietet die Basis für deren therapeutische Verwendung bei der Behandlung von chronischen Entzündungskrankheiten und Autoimmunkrankheiten, wie Lupus erythematosus, autoimmuner Thyroiditis, experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (EAE), multipler Sklerose, einigen Formen von Diabetes, Reynaud-Syndrom, rheumatoider Arthritis und dergl. Derartige Antikörper können als therapeutisches Mittel bei der Behandlung von Psoriasis verwendet werden. Im allgemeinen können die monoklonalen Antikörper, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, bei der Behandlung von Krankheiten, die derzeit durch eine Steroidtherapie behandelbar sind, verwendet werden.
4. Diagnostische und prognostische Anwendungsmöglichkeiten
Da ICAM-1 großenteils an Entzündungsstellen exprimiert wird, können monoklonale Antikörper, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, als Mittel zur Abbildung oder Sichtbarmachung der Infektions- und Entzündungsstellen bei einem Patienten verwendet werden. Bei einer derartigen Anwendung werden die monoklonalen Antikörper durch Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkierungen (z. B. Biotin, Avidin und dergl.), fluoreszierenden Markierungen, paramagnetischen Atomen und dergl. nachweisbar markiert. Verfahren zur Herbeiführung einer derartigen Markierung sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ein Übersichtsartikel über die klinische Anwendung von Antikörpern bei der diagnostischen Abbildung findet sich bei H. B. Grossman, Urol. Clin. North Amer., Bd. 13 (1986), S. 465–474; E. C. Unger et al., Invest. Radiol., Bd. 20 (1985), S. 693–700 und B. A. Khaw et al., Science, Bd. 209 (1980), S. 295–297).
Das Vorliegen einer Entzündung kann auch durch die Verwendung von bindenden Liganden, wie mRNA, cDNA oder DNA, die an ICAM-1-Gensequenzen oder an ICAM-1-mRNA-Sequenzen von Zellen, die ICAM-1 exprimieren, binden, nachgewiesen werden. Techniken zur Durchführung derartiger Hybridisierungstests werden von T. Maniatis (a.a.O.) beschrieben.
Der Nachweis von Herden von derart nachweisbar markierten Antikörpern stellt ein Anzeichen für eine Stelle einer Entzündung oder einer Tumorentwicklung dar. Gemäß einer Ausführungsform wird diese Prüfung auf Entzündungen durchgeführt, indem man Gewebe- oder Blutproben entnimmt und die Proben in Gegenwart von nachweisbar markierten Antikörpern inkubiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird diese Technik in einer nicht-invasiven Art und Weise unter Anwendung von magnetischer Abbildung, Fluorographie und dergl. durchgeführt. Ein derartiger diagnostischer Test kann zur Überwachung von Empfängern von Organtransplantaten auf frühe Anzeichen möglicher Gewebeabstoßungen herangezogen werden. Derartige Tests können auch bei Bemühungen herangezogen werden, um die Disposition einer Person für rheumatoide Arthritis oder andere chronische Entzündungskrankheiten festzustellen.
5. Zusatzmittel zur Einführung von antigenem Material, das zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken verabreicht wird
Immunreaktionen auf therapeutische oder diagnostische Mittel, z. B. Rinderinsulin, Interferon, Plasminogenaktivator vom Gewebetyp oder monoklonale Mäuseantikörper hemmen in erheblichem Maße den therapeutischen oder diagnostischen Wert von derartigen Mitteln und können tatsächlich Krankheiten, z. B. Serumkrankheit, hervorrufen. Eine derartige Situation kann durch Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper behandelt werden. Bei dieser Ausführungsform werden derartige Antikörper in Kombination mit dem therapeutischen oder diagnostischen Mittel verabreicht. Ferner verhindern die Antikörper, dass der Empfänger das Mittel erkennt und verhindern somit, dass beim Empfänger eine Immunreaktion gegen das Mittel einsetzt. Das Fehlen einer derartigen Immunantwort führt dazu, dass der Patient in die Lage gesetzt wird, zusätzliche Verabreichungen des therapeutischen oder diagnostischen Mittels zu erhalten.
F. Anwendungsmöglichkeiten des interzellulären Haftmoleküls-1 (ICAM-1)
ICAM-1 ist ein Bindungspartner von LFA-1. Als solcher können ICAM-1 oder funktionelle Derivate davon in austauschbarer Weise mit Antikörpern, die zur Bindung von LFA-1 befähigt sind, bei der Behandlung einer Krankheit verwendet werden. Somit können derartige Moleküle in solubilisierter Form dazu herangezogen werden, eine Entzündung, Organabstoßungen, Transplantatabstoßungen und dergl. zu hemmen. ICAM-1 oder funktionelle Derivate davon können auf die gleiche Weise wie anti-ICAM-1-Antikörper verwendet werden, um die Immunogenizität von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln zu verringern.
ICAM-1, funktionelle Derivate davon und Antagonisten davon können zur Blockierung der Metastasierung oder Proliferation von Tumorzellen, die ICAM-1 oder LFA-1 an ihren Oberflächen exprimieren, verwendet werden. Eine Reihe von Verfahren kann zum Erreichen eines derartigen Ziels herangezogen werden. Beispielsweise erfordert die Wanderung von hämatopoetischen Zellen eine LFA-1-ICAM-1-Bindung. Antagonisten einer derartigen Bindung unterdrücken somit diese Wanderung und blockieren die Metastasierung von Tumorzellen, die von Leukozyten abstammen. Alternativ können von Toxinen abgeleitete Moleküle, die zur Bindung an ICAM-1 oder an ein Mitglied der LFA-1-Familie von Molekülen befähigt sind, einem Patienten verabreicht werden. Wenn derartige, von Toxinen abgeleitete Moleküle an Tumorzellen, die ICAM-1 oder ein Mitglied der LFA-1-Familie von Molekülen exprimieren, binden, tötet die Anwesenheit des Toxins die Tumorzellen ab, wodurch die Proliferation des Tumors gehemmt wird.
G. Anwendungsmöglichkeiten von Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten der ICAM-1-abhängigen Haftung
Eine ICAM-1-abhängige Haftung kann durch Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten, die zur Bindung an ICAM-1 oder an LFA-1 befähigt sind, gehemmt werden. Ein Beispiel für einen Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten von ICAM-1 ist LFA-1. Ein Beispiel für einen Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten, der an LFA-1 bindet, ist ICAM-1. Durch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Tests können zusätzliche Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten identifiziert und gereinigt werden. Nicht-Immunoglobulin-Antagonisten der von ICAM-1 abhängigen Haftung können für den gleichen Zweck wie Antikörper gegen LFA-1 oder Antikörper gegen ICAM-1 herangezogen werden.
H. Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
Die therapeutischen Wirkungen von ICAM-1 lassen sich erzielen, indem man einen Patienten mit dem vollständigen ICAM-1-Molekül oder mit beliebigen, therapeutisch aktiven Peptidfragmenten davon versorgt.
ICAM-1 und funktionelle Derivate davon lassen sich auf synthetischem Wege, durch Anwendung der rekombinanten DNA-Technik oder durch Proteolyse erhalten. Die therapeutischen Vorteile von ICAM-1 lassen sich durch die Verwendung von funktionellen Derivaten von ICAM-1 erhöhen, die zusätzliche Aminosäurereste aufweisen, die hinzugefügt worden sind, um eine Kupplung an einen Träger zu verstärken oder um die Aktivität des ICAM-1 zu erhöhen. Unter den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen ferner funktionelle Derivate von ICAM-1, denen bestimmte Aminosäurereste fehlen oder die veränderte Aminosäurereste enthalten, sofern derartige Derivate die Fähigkeit zur Beeinflussung der zellulären Haftung aufweisen.
Sowohl für die erfindungsgemäßen Antikörper als auch für das hier beschriebene ICAM-1-Molekül wird angegeben, dass sie "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen" sind, wenn Präparate, die diese Bestandteile enthalten, im wesentlichen frei von Materialien sind, die normalerweise und natürlicherweise zusammen mit diesen Produkten auftreten.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Antikörper und biologisch aktive Fragmente davon (entweder polyklonal oder monoklonal), die zur Bindung an ICAM- 1 befähigt sind. Derartige Antikörper können entweder von einem Tier oder von einer Gewebekultur oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt werden.
Bei der Versorgung eines Patienten mit Antikörpern oder Fragmenten davon, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, oder bei der Versorgung eines Patienten mit ICAM-1 (oder einem Fragment, einer Variante oder einem Derivat davon) hängt die Dosierung von Faktoren ab, z. B. vom Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen medizinischen Zustand, der medizinischen Vorgeschichte des Patienten und dergl. Im allgemeinen ist es wünschenswert, den Empfänger mit einer Dosierung des Antikörpers zu versorgen, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, obgleich auch eine geringere oder höhere Dosierung verabreicht werden kann. Bei der Versorgung eines Patienten mit ICAM-1-Molekülen oder funktionellen Derivaten davon ist es bevorzugt, derartige Moleküle in einer Dosierung zu verabreichen, die im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegen, obgleich auch niedrigere oder höhere Dosierungen verabreicht werden können. Wie vorstehend erörtert, kann die therapeutisch wirksame Dosis gesenkt werden, wenn der anti-ICAM-1-Antikörper zusätzlich zusammen mit einem anti-LFA-1-Antikörper verabreicht wird. Gemäß der hier verwendeten Terminologie wird von einer zusätzlichen Verabreichung einer Verbindung zusammen mit einer zweiten Verbindung dann gesprochen, wenn die Verabreichung der beiden Verbindungen in einer derartigen zeitlichen Nähe erfolgt, dass beide Verbindungen gleichzeitig im Serum des Patienten nachgewiesen werden können.
Sowohl der Antikörper, der zur Bindung an ICAM-1 befähigt ist als auch ICAM-1 selbst können den Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral verabreicht werden. Bei Verabreichung eines Antikörpers oder von ICAM-1 durch Injektion, kann die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion oder durch Gabe eines einzelnen oder von mehreren Boli erfolgen.
Die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Mittel sind dazu vorgesehen, dass die Empfänger damit mit einer zur Unterdrückung von Entzündungen ausreichenden Menge versorgt werden. Eine Menge wird als ausreichend zur "Unterdrückung" einer Entzündung angesehen, wenn die Dosierung, der Verabreichungsweg und dergl. des Mittels zu einer Abschwächung oder Verhinderung der Entzündung ausreichen.
Anti-ICAM-1-Antikörper oder ein Fragment davon können entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren weiteren immunosuppressiven Mitteln verabreicht werden (insbesondere an einen Empfänger eines Organ- oder Gewebetransplantats). Die Verabreichung einer oder mehrerer derartiger Verbindungen kann zu prophylaktischen oder therapeutischen Zwecken erfolgen. Bei Bereitstellung in prophylaktischer Weise werden eine oder mehrere immunosuppressive Verbindungen vor einer entzündlichen Reaktion oder vor dem Auftreten von Symptomen (z. B. vor, gleichzeitig oder kurz nach der Vornahme einer Organ- oder Gewebetransplantation, jedoch vor dem Auftreten von etwaigen Symptomen einer Organabstoßung) verabreicht. Die prophylaktische Verabreichung von einer oder mehreren Verbindungen dient dazu, etwaige anschließende entzündliche Reaktionen (z. B. eine Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes und dergl.) zu verhindern oder abzuschwächen. Bei einer therapeutischen Versorgung werden eine oder mehrere immunosuppressive Verbindungen zum Zeitpunkt (oder kurz danach) des Einsetzens eines Symptoms einer tatsächlichen Entzündung (z. B. einer Organ- oder Gewebeabstoßung) verabreicht. Die therapeutische Verabreichung der einen oder mehreren Verbindungen dient zur Abschwächung etwaiger tatsächlicher Entzündungen (z. B. der Abstoßung eines transplantierten Organs oder Gewebes). Die erfindungsgemäßen entzündungshemmenden Mittel können somit entweder vor dem Einsetzen einer Entzündung (zur Unterdrückung einer erwarteten Entzündung) oder nach dem Einsetzen einer Entzündung verabreicht werden.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmakologisch verträglich" bezeichnet, wenn die Verabreichung von einem Empfänger toleriert werden kann. Für ein derartiges Mittel wird von einer Verabreichung in einer "therapeutisch wirksamen Menge" gesprochen, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Anwesenheit zu einer nachweisbaren Veränderung im physiologischen Zustand eines Patienten führt.
Die erfindungsgemäßen Antikörper und ICAM-1-Moleküle können nach bekannten Verfahren zur Herstellung von pharmazeutisch wertvollen Zusammensetzungen zubereitet werden, wobei diese Materialien oder funktionelle Derivate davon im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vereinigt werden. Geeignete Träger und deren Zubereitungen, einschließlich von anderen humanen Proteinen, z. B. humanes Serumalbumin, werden beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences (16. Auflg., Hrsg. A. Osol, Mack, Easton, PA (1980) beschrieben. Um eine pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzung zu bilden, die sich für eine wirksame Verabreichung eignet, enthalten derartige Zusammensetzungen eine wirksame Menge an anti-ICAM-1-Antikörpern oder ICAM-1-Molekülen oder an funktionellen Derivaten davon zusammen mit einer geeigneten Menge eines Trägers.
Weitere pharmazeutische Verfahren können zur Steuerung der Wirkungsdauer herangezogen werden. Präparate mit kontrollierter Wirkstofffreisetzung lassen sich unter Verwendung von Polymeren herstellen, um anti-ICAM-1-Antikörper, ICAM-1 oder funktionelle Derivate davon zu komplexieren oder zu absorbieren. Die kontrollierte Abgabe kann vorgenommen werden, indem man entsprechende Makromoleküle (beispielsweise Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinylpyrrolidon, Ethylen-Vinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat) sowie die Konzentration von Makromolekülen und die Verfahren zur Einverleibung mit dem Ziel einer kontrollierten Freisetzung auswählt. Ein weiteres mögliches Verfahren zur Kontrolle der Wirkungsdauer durch Präparate mit kontrollierter Wirkstofffreisetzung besteht in der Einverleibung von anti-ICAM-1-Antikörpern oder ICAM-1-Molekülen oder funktionellen Derivaten davon in Teilchen eines polymeren Materials, wie Polyester, Polyaminosäuren, Hydrogele, Poly-(milchsäure) oder Ethylen-Vinylacetat-Copolymere. Alternativ ist es anstelle der Einverleibung dieser Mittel in polymere Teilchen möglich, diese Materialien in Mikrokapseln, die beispielsweise durch Koazervierungstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation hergestellt worden sind, z. B. in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. in Poly-(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidale Arzneistoffabgabesysteme, z. B. Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanoteilchen und Nanokapseln, oder in Makroemulsionen einzuverleiben. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben.
An die vorstehende allgemeine Beschreibung schließt sich nun eine leichter verständliche Beschreibung der Erfindung anhand der folgenden Beispiele an, die lediglich der Erläuterung dienen und den Schutzumfang der Erfindung nicht beschränken sollen, sofern nichts anderes angegeben ist.
Beispiel 1
Züchtung von Säugetierzellen
Im allgemeinen wurden die erfindungsgemäßen EBV-transformierten und Hybridomzellen in RPMI-1640-Kulturmedium, das mit 20 mM L-Glutamin, 50 μg/ml Gentamicin und 10% fötalem Kälberserum ergänzt worden war, gehalten. Die Zellen wurden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre aus 5% CO₂ und 95% Luft gehalten.
Zur Bereitstellung von Epstein-Barr-Virus (EBV)-Transformanten wurden 10⁶ an T-Zellen verarmte periphere mononukleare Blutzellen/ml in RMPI-1640-Medium, das mit 20% fötalem Kälberserum (FCS) und 50 μg/ml Gentamicin ergänzt war, 16 Stunden mit einem EBV enthaltenden Überstand von B95-8-Zellen inkubiert (D. A. Thorley-Lawson et al., J. Exper. Med., Bd. 146 (1977), S. 495). Zellen in 0,2 ml-Aliquotanteilen wurden in 10 Mikrotiter-Vertiefungen gebracht. Das Medium wurde durch RMPI-1640-Medium (ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum und 50 μg/ml Gentamicin) ersetzt, bis Zellwachstum festgestellt wurde. Die Zellen wuchsen in den meisten Vertiefungen und wurden im gleichen Medium vermehrt. Phytohämagglutinin (PHA)-Blasten wurden in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in RMPI-1640-Medium (ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum), das eine 1:800-Verdünnung von PHA-P (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI) enthielt, bereitgestellt. PHA-Linien wurden mit Medium, das mit Interleukin 2 (IL-2) konditioniert worden war, vermehrt und wöchentlich mit PHA gepulst (D. A. Cantrell et al., J. Exper. Med., Bd. 158 (1983), S. 1895). Das vorstehende Verfahren wurde von T. Springer et al. beschrieben (J. Exper. Med., Bd. 160 (1984), S. 1901–1918; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht). Gemäß dem vorstehenden Verfahren erhaltene Zellen wurden sodann auf anti-LFA-1-Antikörper abgesucht, um festzustellen, ob sie das LFA-1-Antigen exprimierten. Derartige Antikörper wurden von F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med., Bd. 158 (1983), S. 1785, beschrieben.
Beispiel 2
Tests auf zelluläre Aggregation und Haftung
Um das Ausmaß der zellulären Haftung festzustellen, wurden Aggregationstests angewendet. Die bei diesen Tests verwendeten Zelllinien wurden 2-mal mit RMPI-1640-Medium, das 5 mM HEPES-Puffer (Sigma Chemical Co., St. Louis) enthielt, gewaschen und in einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. In flachbödige Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nr. 3596; Costar, Cambridge, MA) wurden 50 μl des entsprechenden monoklonalen Antikörper-Überstands oder 50 μl komplettes Medium mit oder ohne gereinigte monoklonale Antikörper, 50 μl komplettes Medium mit einem Gehalt an 200 ng/ml des Phorbolesters Phorbolmyristatacetat (PMA) und 100 μl Zellen in einer Konzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml in Komplettmedium gegeben. Dies ergab eine Endkonzentration von 50 ng/ml PMA und 2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung. Man ließ die Zellen spontan absetzen. Der Aggregationsgrad wurde zu verschiedenen Zeitpunkten bewertet. Die Bewertungsskala reichte von 0 bis 5+, wobei 0 bedeutet, dass im wesentlichen keine Zellen in Form von Clustern vorlagen. 1+ bedeutet, dass weniger als 10% der Zellen in Form von Aggregaten vorlagen. 2+ bedeutet, dass weniger als 50% der Zellen aggregiert waren. 3+ bedeutet, dass bis zu 100% der Zellen in Form von kleinen, lockeren Clustern vorlagen. 4+ bedeutet, dass bis zu 100% der Zellen in größeren Clustern aggregiert waren. 5+ bedeutet, dass 100 der Zellen in großen, sehr kompakten Aggregaten vorlagen. Um eine stärker quantitative Bestimmung der zellulären Haftung zu erhalten, wurden Reagenzien und Zellen in der gleichen Reihenfolge in 5 ml fassende Polystyrolröhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden bei 37°C in einem Gestell auf eine Drehschüttelvorrichtung gebracht. Nach 1 Stunde bei etwa 200 U/min wurden 10 μl der Zellsuspension in ein Hämozytometer gegeben. Die Anzahl an freien Zellen wurde quantitativ ermittelt. Die prozentuale Aggregation wurde gemäß der folgenden Gleichung bestimmt:
Bei der Anzahl der zugesetzten Zellen in der vorstehenden Gleichung handelt es sich um die Anzahl an Zellen pro ml in einem Kontrollröhrchen, das nur Zellen und Komplettmedium, das nicht inkubiert worden war, enthielt. Die Anzahl an freien Zellen in der vorstehenden Gleichung entspricht der Anzahl an nicht-aggregierten Zellen pro ml aus Versuchsröhrchen. Das vorstehende Verfahren wurde von R. Rothlein et al., J. Exper. Med., Bd. 163 (1986), S. 1132–1149, beschrieben.
Beispiel 3
LFA-1-abhängige zelluläre Aggregation
Der in Beispiel 2 beschriebene qualitative Aggregationstest wurde unter Verwendung der mit dem Epstein-Barr-Virus transformierten ZelLlinie JY durchgeführt. Bei Zugabe von PMA zum Kulturmedium in den Mikrotiterplatten wurde keine Aggregation von Zellen beobachtet. Im Laufe der Zeit aufgezeichnete Videoaufnahmen ergaben, dass die JY-Zellen am Boden der Mikrotitervertiefungen beweglich waren und eine aktive Membran-Kräuselung und eine Pseudopodia-Bewegung aufwiesen. Ein Kontakt zwischen den Pseudopodia von benachbarten Zellen führte oft zu einer Zell-Zell-Haftung. Wenn die Haftung anhielt, bewegte sich die Region des Zellkontakts zum Uropod. Der Kontakt konnte trotz heftiger Zellbewegungen und des Zerrens der Zellen in entgegengesetzten Richtungen aufrechterhalten werden. Der primäre Unterschied zwischen PMA-behandelten und unbehandelten Zellen bestand offensichtlich in der Stabilität dieser Kontakte nach deren Bildung. Mit PMA entwickelten sich Cluster von Zellen, deren Größe zunahm, wenn zusätzliche Zellen an ihrem Umfang hafteten.
Als zweite Maßnahme zur Messung der Haftung wurde der in Beispiel 2 beschriebene quantitative Test herangezogen. Zellsuspensionen wurden 2 Stunden mit 200 U/min geschüttelt, in ein Hämozytometer übertragen und einer Zählung der nicht in Aggregaten befindlichen Zellen unterworfen. In Abwesenheit von PMA befanden sich 42% (SD = 20%, N = 6) der JY-Zellen nach 2 Stunden in Aggregaten, während bei JY-Zellen, die unter identischen Bedingungen mit 50 ng/ml PMA inkubiert wurden, 87% (SD = 8%, N = 6) der Zellen in Aggregaten vorlagen. Kinetische Aggregationsuntersuchungen ergaben, dass PMA die Geschwindigkeit und die Stärke der Aggregation zu allen getesteten Zeitpunkten erhöhte (3).
Beispiel 4
Hemmung der Aggregation von Zellen unter Verwendung von monoklonalen anti-LFA-1-Antikörpern
Zur Prüfung der Einflüsse von monoklonalen anti-LFA-1-Antikörpern auf die durch PMA induzierte zelluläre Aggregation wurden die Antikörper zu Zellen gegeben, die gemäß dem qualitativen Aggregationstest von Beispiel 2 inkubiert wurden. Es wurde festgestellt, dass die monoklonalen Antikörper die Bildung von Aggregaten von Zellen entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von PMA hemmten. Sowohl die F(ab')₂- als auch die Fab'-Fragmente von monoklonalen Antikörpern gegen die alpha-Kette von LFA-1 waren zur Hemmung der zellulären Aggregation befähigt. Während im wesentlichen 100% der Zellen Aggregate in Abwesenheit von anti-LFA-1-Antikörpern bildeten, wurde festgestellt, dass weniger als 20% der Zellen in Aggregaten vorlagen, wenn Antikörper zugesetzt wurde. Die Ergebnisse dieses Versuchs wurden von R. Rothlein et al., J. Exper. Med., Bd. 163 (1986), S. 1132–1149, beschrieben.
Beispiel 5
Die zelluläre Aggregation erfordert den LFA-1-Rezeptor
Mit EBV transformierte Lymphoblastoidzellen wurden aus Patienten gemäß den Angaben in Beispiel 1 präpariert. Derartige Zellen wurden einem Screening gegen monoklonale Antikörper, die zur Erkennung von LFA-1 befähigt waren, unterzogen. Es wurde festgestellt, dass die Zellen LFA-1-defizitär waren.
Der in Beispiel 2 beschriebene qualitative Aggregationstest wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen LFA-1-defizitären Zellen durchgeführt. Diese Zellen konnten selbst in Gegenwart von PMA nicht spontan aggregieren.
Beispiel 6
Das Auffinden von ICAM-1
Die LFA-1-defizitären Zellen von Beispiel 5 wurden mit Carboxyfluoresceindiacetat markiert (M. Patarroyo et al., Cell. Immunol., Bd. 63 (1981), S. 237–248). Die markierten Zellen wurden in einem Verhältnis von 1:10 mit autologen oder JY-Zellen vermischt. Der prozentuale Anteil an mit Fluorescein markierten Zellen in den Aggregaten wurde gemäß dem Verfahren von R. Rothlein et al., J. Exper. Med., Bd. 163 (1986), S. 1132–1149, bestimmt. Von den LFA-1-defizitären Zellen wurde festgestellt, dass sie zur Coaggregation mit LFA-1 exprimierenden Zellen befähigt waren (4).
Zur Feststellung, ob LFA-1 nur bei der Bildung von Aggregaten oder bei deren Aufrechterhaltung wichtig war, wurden Antikörper, die zur Bindung an LFA-1 befähigt waren, zu vorher auf die vorstehend beschriebene Weise gebildeten Aggregaten gegeben. Es wurde festgestellt, dass die Zugabe von Antikörper in starkem Maße zu einem Aufbrechen der vorher gebildeten Aggregation führt. Videoaufzeichnungen des zeitlichen Verlaufs bestätigten, dass die Zugabe der monoklonalen Antikörper zu den vorher gebildeten Aggregaten innerhalb von 2 Stunden ein allmähliches Aufbrechen der Aggregate bewirkte (Tabelle 1). Nach Zugabe von monoklonalen Antikörpern gegen LFA-1 blieben pseudopodiale Bewegungen und Veränderungen der Gestalt von einzelnen Zellen innerhalb der Aggregate unverändert. Einzelne Zellen dissoziierten allmählich vom Umfang des Aggregats. Nach 8 Stunden waren die meisten Zellen dispergiert. In der Videoaufzeichnung des zeitlichen Verlaufs erschien das Aufbrechen von vorher gebildeten Aggregaten durch monoklonale LFA- 1-Antikörper im wesentlichen als gleichwertig mit dem zeitlich rückwärts ablaufenden Aggregationsvorgang in Abwesenheit von monoklonalem LFA-1-Antikörper.
Tabelle 1 Fähigkeit von monoklonalen anti-LFA-1-Antikörpern zum Aufbrechen von vorher gebildeten, mit PMA induzierten JY-Zellaggregaten Aggregationsbewertung
Die Aggregation im qualitativen Mikrotiter-Plattentest wurde visuell bewertet. Wenn anti-LFA-1 während der gesamten Testdauer vorhanden war, wurde die Aggregation mit weniger als 1+ bewertet.

^aAggregationsbetrag unmittelbar vor Zugabe von monoklonalem Antikörper nach 2 h.
^bTS 1/18 + TS1/22
^cTS 1/18
^dTS 1/22

Beispiel 7
Notwendigkeit von zweiwertigen Ionen für die LFA-1-abhängige Aggregation
LFA-1-abhängige Adhäsionen zwischen zytotoxischen T-Zellen und Zielen benötigen das Vorliegen von Magnesium (E. Martz, J. Cell. Biol., Bd. 84 (1980), S. 584–598). Die durch PMA induzierte JY-Zellaggregation wurde auf ihre Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen getestet. JY-Zellen konnten (unter Anwendung des Tests von Beispiel 2) in Medium, das frei von Calcium- oder Magnesiumionen war, nicht aggregieren. Die Zugabe von zweiwertigem Magnesium unterstützte die Aggregation bei Konzentrationen von nur 0,3 mM. Die Zugabe von Calciumionen allein hatte nur einen geringen Einfluss. Es wurde jedoch festgestellt, dass Calciumionen die Fähigkeit von Magnesiumionen zur Unterstützung der PMA-induzierten Aggregation erhöhten. Wenn 1,25 mM Calciumionen zum Medium gegeben wurden, wurde festgestellt, dass Magnesiumionenkonzentrationen von 0,02 mM die Aggregation unterstützten. Diese Daten zeigen, dass die LFA-1-abhängige Aggregation von Zellen Magnesiumionen benötigt und dass Calciumionen, die zwar alleine nicht ausreichen, in synergistischer Weise zusammen mit Magnesiumionen die Aggregation ermöglichen.
Beispiel 8
Isolierung von Hybridomzellen, die zur Expression von monoklonalen anti-ICAM-1-Antikörpern befähigt sind
Monoklonale Antikörper, die zur Bindung an ICAM-1 befähigt sind, wurden gemäß dem Verfahren von R. Rothlein et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 1270–1274 (diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht), isoliert. Dabei wurden drei BALB/C-Mäuse intraperitoneal mit EBV-transformierten, peripheren, mononuklearen Blutzellen einer Person mit LFA-1-Defizit immunisiert (T. A. Springer et al., J. Exper. Med., Bd. 160 (1984), S. 1901). Etwa 10⁷ Zellen in 1 ml RMPI-1640-Medium wurden für jede Immunisierung herangezogen. Die Immunisierungen wurden 45, 29 und 4 Tage vor Entnahme von Milzzellen aus den Mäusen verabreicht, um die erwünschten Hybridom-Zelllinien zu erzeugen. 3 Tage vor Entnahme der Milzzellen erhielten die Mäuse weitere 10⁷ Zellen in 0,15 ml Medium (intravenös).
Aus den vorstehend beschriebenen Tieren isolierte Milzzellen wurden mit P3X73Ag8.653-Myelomzellen in einem Verhältnis von 4:1 gemäß dem Verfahren von G. Galfre et al., Nature, Bd. 266 (1977), S. 550, fusioniert. Aliquotanteile der erhaltenen Hybridomzellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gegeben. Die Hybridom-Überstände wurden einem Screening auf eine Hemmung der Aggregation unterzogen. Ein hemmendes Hybridom (von über 600 getesteten Vertiefungen) wurde kloniert und durch Grenzverdünnung subkloniert. Dieser Subklon erhielt die Bezeichnung RR1/1.1.1 (nachstehend als "RR1/1" bezeichnet).
Es wurde übereinstimmend festgestellt, dass der monoklonale Antikörper RR1/1 die durch PMA stimulierte Aggregation der LFA-1 exprimierenden Zelllinien JY hemmte. Der monoklonale RR1/1-Antikörper hemmte die Aggregation in gleichwertigem Maße oder geringfügig weniger als einige monoklonale Antikörper gegen die LFA-1-alpha- oder -beta-Untereinheiten. Im Gegensatz dazu hemmten monoklonale Kontrollantikörper gegen HLA, das an JY-Zellen reichlich exprimiert wird, die Aggregation nicht. Das durch den monoklonalen Antikörper RR1/1 gebundene Antigen wird als interzelluläres Haftmolekül-1 (ICAM-1) definiert.
Beispiel 9
Verwendung von monoklonalen anti-ICAM-1-Antikörpern zur Charakterisierung des ICAM-1-Moleküls
Um die Natur von ICAM-1 zu ermitteln und insbesondere um festzustellen, ob ICAM-1 sich von LFA-1 unterscheidet, wurden Zellproteine unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers RR1/1 immunopräzipitiert. Die Immunopräzipitation wurde gemäß dem Verfahren von R. Rothlein et al. (J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 1240–1274) durchgeführt. JY-Zellen wurden in einer Konzentration von 5 × 10⁷ Zellen/ml in 1% Triton X-100, 0,14 M NaCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,0, mit frisch zugesetztem 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 0,2 Einheiten pro ml Trypsin-Inhibitor Aprotinin (Lysis-Puffer) 20 Minuten bei 4°C einer Lysis unterzogen. Die Lysate wurden 10 Minuten mit 10000 g × zentrifugiert und mit 50 μl einer 50%igen Suspension von CNBr-aktivierter, mit Glycin versetzter Sepharose C1-4B 1 Stunde bei 4°C vorgeklärt. 1 ml Lysat wurde mit 20 μl einer 50%igen Suspension von monoklonalem Antikörper RR1/1, gekuppelt an Sepharose CL-4B (1 mg/ml), über Nacht bei 4°C immunopräzipitiert (T. A. Springer et al., J. Exper. Med., Bd. 160 (1984), S. 1901). An Sepharose gebundener, monoklonaler Antikörper wurde unter Anwendung der CNBr-Aktivierung von Sepharose CL-4B in Carbonatpuffer gemäß dem Verfahren von S. March, et al., (Anal. Biochem., Bd. 60 (1974), S. 149, hergestellt. Gewaschene Immunopräzipitate wurden der SDS-PAGE und Silberfärbung gemäß dem Verfahren von J. H. Morrissey, Anal. Biochem., Bd. 117 (1981), S. 307, unterworfen.
Nach Elution von Proteinen mit SDS-Probenpuffer (M. K. Ho et al., J. Biol. Chem., Bd. 258 (1983), S. 636) bei 100°C wurden die Proben halbiert und der Elektrophorese (SDS-8% PAGE) unter reduzierenden (5A) oder nicht-reduzierenden Bedingungen (5B) unterworfen. Banden mit Molekulargewichten von 50 kd und 25 kd entsprachen den schweren und leichten Ketten von Immunoglobulinen aus der monoklonalen Antikörper-Sepharose (5A, Bahn 3). Variable Mengen anderer Banden im Bereich von 25–50 kd wurden ebenfalls beobachtet, waren aber in Präzipitaten von Haar-Leukämiezellen nicht sichtbar, die nur eine 90 kd-Molekulargewichtsbande ergaben. Es wurde festgestellt, dass die 177 kd-alpha-Untereinheit und die 95 kd-beta-Untereinheit von LFA-1 unterschiedlich zu ICAM-1 wanderten, und zwar sowohl unter reduzierenden (5A, Bahn 2) als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen (5B, Bahn 2).
Um den Einfluss des monoklonalen Antikörpers RR1/1 auf die PHA-Lymphoblastenaggregation festzustellen, wurde der in Beispiel 2 beschriebene quantitative Aggregationstest herangezogen. Dabei wurden T-Zell-Blastzellen 4 Tage mit PHA stimuliert, gründlich gewaschen und sodann 6 Tage in Gegenwart von IL-2-konditioniertem Medium gezüchtet. Es wurde festgestellt, dass PHA während dieser 6-tägigen Züchtung aufgenommen wurde und nicht zum Aggregationstest beitrug. In drei verschiedenen Tests mit verschiedenen T-Zellen-Blastpräparaten hemmten monoklonale ICAM-1-Antikörper übereinstimmend die Aggregation (Tabelle 2).
Tabelle 2 Hemmung der durch PMA stimulierten PHA-Lymphoblastenaggregation durch monoklonalen RR1/1-Antikörper^a
Monoklonale LFA-1-Antikörper hemmten übereinstimmend stärker als monoklonale ICAM-1-Antikörper, während monoklonale HLA-A-, B- und LFA-3-Antikörper ohne Einfluss waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass von den getesteten monoklonalen Antikörpern nur solche, die zur Bindung an LFA-1 oder ICAM-1 befähigt waren, zur Hemmung der zellulären Haftung befähigt waren.
Beispiel 10
Herstellung von monoklonalem Antikörper gegen ICAM-1 Immunisierung
Eine BALB/C-Maus wurde intraperitoneal (i.p.) mit 0,5 ml 2 × 10⁷ JY-Zellen in RPMI-Medium 103 Tage und 24 Tage vor der Fusion immunisiert. Am 4. und 3. Tag vor der Fusion wurden die Mäuse intraperitoneal mit 10⁷ Zellen von PMA-differenzierten U937 Zellen in 0,5 ml RPMI-Medium immunisiert.
Differenzierung von U937-Zellen
U937-Zellen (ATCC CRL-1593) wurden durch Inkubation in einer Konzentration von 5 × 10⁵/ml in RPMI mit 10% fötalem Kälberserum, 1% Glutamin und 50 μg/ml Gentamycin (komplettes Medium) mit einem Gehalt an 2 ng/ml Phorbol-12-myristatacetat (PMA) in einem sterilen Behälter aus Polypropylen differenziert. Am 3. Tag dieser Inkubation wurde der halbe Volumenanteil des Mediums entfernt und durch frisches komplettes Medium mit einem Gehalt an PMA ersetzt. Am 4. Tag wurden die Zellen entnommen, gewaschen und zur Immunisierung vorbereitet.
Fusion
Milzzellen der immunisierten Mäuse wurden mit P3x63 Ag8·653-Myelomzellen im Verhältnis 4:1 gemäß Galfre et al., (Nature, Bd. 266 (1977), S. 550) fusioniert. Nach der Fusion wurden die Zellen in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 10⁵ Milzzellen/Vertiefung ausgestrichen.
Selektion auf anti-ICAM-1-positive Zellen
Nach einer Woche wurden 50 μl Überstand gemäß dem qualitativen Aggregationstest von Beispiel 2 unter Verwendung von JY- und SKW-3 als aggregierenden Zelllinien einem Screening unterworfen. Zellen von Überständen, die die Aggregation von JY-Zellen jedoch nicht von SKW-3 hemmten, wurden ausgewählt und 2-mal unter Anwendung der Grenzverdünnung kloniert.
Dieser Versuch führte zur Identifizierung und Klonierung von 3 getrennten Hybridomlinien, die monoklonale anti-ICAM-1-Antikörper bildeten. Bei den von diesen Hybridomlinien gebildeten Antikörpern handelte es sich um IgG_2a, IgG_2b bzw. IgM. Die Hybridom-Zelllinie, die den IgG_2a-anti-ICAM-1-Antikörper bildete, erhielt die Bezeichnung R6'5'D6'E9'B2. Der von der bevorzugten Hybridom-Zelllinie erzeugte Antikörper erhielt die Bezeichnung R6'5'D6'E9'B2 (hier als "R6-5-D6" bezeichnet).
Beispiel 11
Expression und Regulation von ICAM-1
Zur Messung der ICAM-1-Expression wurde ein Radioimmuntest entwickelt. Bei diesem Test wurde gereinigter RR1/1 unter Verwendung von Iodogen in einer spezifischen Aktivität von 10 μCi/μg jodiert. Endothelzellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet und gemäß den für jeden Versuch gemachten Angaben behandelt. Die Platten wurden 0,5–1 Stunde in einem kalten Raum bei 4°C und nicht unmittelbar auf Eis gelagert. Die Monoschichten wurden 3-mal mit kaltem komplettem Medium gewaschen und sodann 30 Minuten bei 4°C mit ¹²⁵I-RR1/1 inkubiert. Anschließend wurden die Monoschichten 3-mal mit komplettem Medium gewaschen. Das gebundene ¹²⁵I wurde unter Verwendung von 0,1 M NaOH freigesetzt und gezählt. Die spezifische Aktivität des ¹²⁵I-RR1/1 wurde unter Verwendung von unmarkiertem RR1/1 so eingestellt, dass sich über den Bereich der bei dieser Untersuchung auftretenden Antigendichten ein lineares Signal ergab. Die nicht-spezifische Bindung wurde in Gegenwart eines 1000-fachen Überschusses an unmarkiertem RR1/1 bestimmt und von der gesamten Bindung substrahiert, um die spezifische Bindung zu erhalten.
Die unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Radioimmuntests gemessene ICAM-1-Expression wird an humanen Umbilikalvenen-Endothelzellen (HUVEC) und humanen Wadenvenen-Endothelzellen (HSVEC) durch IL-1, TNF, LPS und IFN-gamma erhöht (Tabelle 3). Wadenvenen-Endothelzellen wurden in dieser Untersuchung eingesetzt, um die Ergebnisse von Umbilikalvenen-Endothelzellen in gezüchteten großen Venen-Endothelzellen, die von Erwachsenemgewebe abgeleitet waren, zu bestätigen. Die basale Expression von ICAM-1 ist an Wadenvenen-Endothelzellen 2-fach höher als an Umbilikalvenen-Endothelzellen. Eine Einwirkung von rekombinantem IL-1-alpha, IL-1-beta und TNF-gamma auf Umbilikalvenen-Endothelzellen erhöht die ICAM-1-Expression auf das 10- bis 20-fache. IL-1-alpha, TNF und LPS waren die stärksten Induktoren. IL-1 war auf Gewichtsbasis und auch bei Sättigungskonzentrationen für die Reaktion weniger wirksam (Tabelle 3). IL-1-beta in einer Konzentration von 100 ng/ml erhöhte die ICAM-1-Expression an HUVEC auf das 9-fache und auf das 7,3-fache an HSVEC, wobei eine halbmaximale Zunahme bei 15 ng/ml erfolgte. rTNF in einer Konzentration von 50 ng/ml erhöhte die ICAM-1-Expression an HUVEC auf das 16-fache und an HSVEC auf das 11-fache bei halbmaximalen Wirkungen bei 0,5 ng/ml. Interferon-gamma erzeugte eine signifikante Zunahme der ICAM-1-Expression auf das 5,2-fache an HUVEC oder das 3,5-fache an HSVEC bei 10 000 U/ml. Der Einfluss von LPS in einer Konzentration von 10 μg/ml lag in einer ähnlichen Größenordnung wie der von rTNF. Paarweise Kombinationen dieser Mediatoren ergaben additive oder geringfügig darunter liegende Einflüsse auf die ICAM-1-Expression (Tabelle 3). Eine Kreuztitration von rTNF mit rIL-1-beta oder rIFN-gamma ergab bei suboptimalen oder optimalen Konzentrationen keinen Synergismus zwischen diesen Bestandteilen.
Da LPS die ICAM-1-Expression an Endothelzellen in Konzentrationen, die gelegentlich in Kulturmedien auftreten, erhöhte, wurde die Möglichkeit, dass die basale ICAM-1-Expression auf LPS zurückzuführen sein könnte, geprüft. Bei einem Test von mehreren Serumansätzen wurde festgestellt, dass Serum mit geringem Endotoxin eine um 25% geringere basale ICAM-1-Expression ergab. Alle hier aufgeführten Ergebnisse gelten für Endothelzellen, die in Serum mit wenig Endotoxin gezüchtet worden sind. Jedoch verringerte eine Zugabe des LPS neutralisierenden Antibiotikums Polymyxin B in einer Konzentration von 10 μg/ml die ICAM-1-Expression nur um zusätzliche 25% (Tabelle 3). Die Zunahme der ICAM-1-Expression bei Behandlung mit IL-1 oder TNF wurde durch die Anwesenheit von 10 μg/ml Polymyxin B nicht beeinflusst, was mit den geringen Endotoxinkonzentrationen in diesen Präparaten übereinstimmt (Tabelle 3).
Tabelle 3 Monoklonale anti-ICAM-1-Antikörper
Hochregelung der ICAM-1-Expression an HUVEC und HSVEC. HUVEC oder HSVEC wurden aus einer konfluenten Monoschicht in Platten mit 96 Vertiefungen in einem Verhältnis von 1:3 überimpft und bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen wurden sodann mit den angegebenen Materialien oder Medien 16 Stunden behandelt. Der RIA-Rest wurde gemäß den Angaben unter Methoden durchgeführt. Sämtliche Versuche wurden 4-fach durchgeführt.
Beispiel 12
Kinetik der Interleukin 1- und gamma-Interferon-Induktion von ICAM-1
Die Kinetik der Interleukin 1- und gamma-Interferon-Einflüsse auf die ICAM-1-Expression an dermalen Fibroblasten wurde unter Verwendung des ¹²⁵I-Ziegen-anti-Maus-IgG-Bindungstests von M. L. Dustin et al. (J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 245–254; diese Druckschrift wird durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) bestimmt. Zur Durchführung dieses Bindungstests wurden humane dermale Fibroblasten in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen bis zu einer Dichte von 2–8 × 10⁴ Zellen/Vertiefung (0,32 cm²) gezüchtet. Die Zellen wurden 2-mal mit RMPI-1640-Medium, das gemäß Beispiel 1 ergänzt war, gewaschen. Sodann wurden die Zellen ein weiteres Mal mit ausgewogener Hanks-Salzlösung (HBSS), 10 mM HEPES, 0,05% NaN₃ und 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, gewaschen. Der Waschvorgang mit diesem Bindungspuffer wurde bei 4°C durchgeführt. Jede Vertiefung wurde mit 50 μl des vorstehend beschriebenen Bindungspuffers und 50 μl des entsprechenden Hybridom-Überstands mit X63 und W6/32 als negativer bzw. positiver Kontrolle versetzt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 4°C wurden die Vertiefungen unter vorsichtigem Bewegen 2-mal mit Bindungspuffer gewaschen. Der zweite Antikörper, nämlich ¹²⁵I-Ziegen-anti-Maus-IgG wurde mit 50 nCi in 100 μl zugegeben. Der ¹²⁵I-Ziegen-anti-Maus-Antikörper wurde unter Verwendung von Iodogen (Pierce) gemäß dem Verfahren von P. J. Fraker et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 80 (1978), S. 849) hergestellt. Nach 30 Minuten bei 4°C wurden die Vertiefungen mit 200 μl Bindungspuffer gewaschen. Die Zellschicht wurde durch Zugabe von 100 μl 0,1 N NaOH solubilisiert. Diese Flüssigkeit und 100 μl Waschflüssigkeit wurden in einem Beckman 5500-gamma-Zähler ausgezählt. Die spezifischen gebundenen Zählereignisse pro Minute wurden berechnet als [cpm mit monoklonalem Antikörper] – [cpm mit X63]. Sämtliche Stufen, einschließlich der Induktion mit spezifischen Reagenzien, wurden als Vierfachversuche durchgeführt.
Der Einfluss von Interleukin 1 mit einer Halbwertszeit der ICAM-1-Induktion von 2 Stunden erfolgte rascher als der von gamma-Interferon mit einer Halbwertszeit von 3,75 Stunden (6). Der zeitliche Verlauf der Rückkehr auf Ruhekonzentrationen von ICAM-1 war offensichtlich vom Zellzyklus oder der Geschwindigkeit des Zellwachstums abhängig. In ruhenden Zellen waren die Einflüsse von Interleukin 1 und gamma-Interferon 2 bis 3 Tage stabil, während in Kulturen in der logarithmischen Phase die ICAM-1-Expression 2 Tage nach Entfernung dieser Induktionsmittel nahe der Basislinie verlief.
Die Dosis-Wirkungs-Kurven zur Induktion von ICAM-1 für rekombinantes, murines und humanes Interleukin 1 und für rekombinantes humanes gamma-Interferon sind in 7 dargestellt. Es wurde festgestellt, dass gamma-Interferon und Interleukin 1 ähnliche Konzentrationsabhängigkeiten mit nahezu identischen Wirkungen bei 1 ng/ml aufwiesen. Das humane und murine rekombinante Interleukin 1 zeigen ferner ähnliche Kurven, sind aber bezüglich der Induktion der ICAM-1-Expression wesentlich weniger wirksam als humane Interleukin 1-Präparationen.
Cycloheximid, ein Inhibitor der Proteinsynthese, und Actinomycin D, ein Inhibitor der mRNA-Synthese, beseitigen die Einflüsse sowohl von Interleukin 1 als auch von gamma-Interferon auf die ICAM-1-Expression an Fibroblasten (Tabelle 4). Ferner hemmte Tunicamycin, ein Inhibitor der N-verknüpften Glycosylierung, nur den Interleukin 1-Einfluss um 43%. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Protein- und mRNA-Synthese, jedoch nicht die N-verknüpfte Glycosylierung für die durch Interleukin 1 und gamma-Interferon stimulierten Zunahmen der ICAM-1-Expression erforderlich sind.
Tabelle 4 Einflüsse von Cycloheximid, Actinomycin D und Tunicamycin auf die ICAM-1-Induktion durch IL-1 und gamma-IFN an humanen dermalen Fibroblasten^a
Beispiel 13
Gewebeverteilung von ICAM-1
Histochemische Untersuchungen wurden an gefrorenem Gewebe von humanen Organen durchgeführt, um die Verteilung von ICAM-1 in Thymus, Lymphknoten, Darm, Haut, Niere und Leber zu bestimmen. Zur Durchführung einer derartigen Analyse wurden gefrorene Gewebeschnitte (4 μm dick) von normalen humanen Geweben 10 Minuten in Aceton fixiert und mit dem monoklonalen Antikörper RR1/1 durch eine Immunoperoxidase-Technik unter Anwendung des Avidin-Biotin-Komplex-Verfahrens (Vector Laboratories, Burlingame, CA) gemäß den Angaben von N. Cerf-Bensussan et al. (J. Immunol., Bd. 130 (1983), S. 2615) gefärbt. Nach Inkubation mit dem Antikörper wurden die Schnitte nacheinander mit biotinyliertem Pferde-anti-Maus-IgG und Avidin-biotinylierten Peroxidase-Komplexen inkubiert. Die Schnitte wurden schließlich in eine Lösung mit einem Gehalt an 3-Amino-9-ethylcarbazol (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) getaucht, um eine Farbreaktion zu entwickeln. Anschließend wurden die Schnitte 5 Minuten in 4 Formaldehyd fixiert und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Die Kontrollen umfassten Schnitte, die anstelle des RR1/1-Antikörpers mit nicht-einschlägigen monoklonalen Antikörpern inkubiert wurden.
Es wurde festgestellt, dass ICAM-1 eine sehr ähnliche Verteilung wie die Antigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse II aufwiesen. Der Großteil der Blutgefäße (sowohl kleine als auch große) in sämtlichen Geweben zeigte eine Färbung von Endothelzellen mit ICAM-1-Antikörper. Die vaskuläre Endothelfärbung war intensiver in den interfollikulären (parakortikalen) Bereichen in Lymphknoten, Tonsillen und Peyer-Plaques, verglichen mit Gefäßen in Niere, Leber und normaler Haut. In der Leber war die Färbung weitgehend auf sinusoidale Auskleidungszellen begrenzt. Die Hepatozyten und die Endothelzellen-Auskleidung eines Großteils der portalen Venen und Arterien wurden nicht gefärbt.
In der Thymus-Medulla wurden eine diffuse Färbung von großen Zellen und ein dendritisches Färbungsmuster beobachtet. Im Kortex war das Färbungsmuster fokal und vorwiegend dendritisch. Thymozyten wurden nicht gefärbt. Im peripheren lymphoiden Gewebe wurden die germinalen Zentrumzellen der sekundären lymphoiden Follikel intensiv gefärbt. In einigen lymphoiden Follikeln war das Färbemuster vorwiegend dendritisch, ohne erkennbare Färbung von Lymphozyten.
Ein schwache Färbung von Zellen in der Mantelzone wurde ebenfalls beobachtet. Außerdem zeigten dendritische Zellen mit zytoplasmatischen Erweiterungen (interdigitierende Reticulum-Zellen) und eine geringe Anzahl von Lymphozyten in den interfollikulären und parakortikalen Bereichen eine Färbung mit dem ICAM-1-bindenden Antikörper.
Zellen, die Makrophagen ähnlich waren, wurden in den Lymphknoten und in der Lamina propria des Dünndarms gefärbt. Fibroblastenartige Zellen (spindelförmige Zellen) und dendritische Zellen, die im Stroma der meisten untersuchten Organe verstreut waren, ergaben eine Färbung mit dem ICAM-1 bindenden Antikörper. Keine Färbung wurde in den Langerhans-/indeterminanten-Zellen in der Epidermis festgestellt. Ferner wurde kein Färbung in Gewebe von glatter Muskulatur festgestellt.
Die Färbung von Epithelzellen war übereinstimmend in der Schleimhaut der Tonsillen erkennbar. Obgleich Hepatozyten, Gallentrakt-Epithel, intestinale Epithelzellen und tubuläre Epithelzellen in der Niere unter den meisten Umständen keine Färbung ergaben, zeigten Schnitte von normalem Nierengewebe, dass aus einer Nephrektomie-Probe mit renalem Zellkarzinom erhalten worden war, eine Färbung zahlreicher proximaler, tubulärer Zellen auf ICAM-1. Diese tubulären Epithelzellen färbten sich ferner mit einem anti-HLA-DR-bindenden Antikörper.
Zusammengefasst ist festzustellen, dass ICAM-1 an nicht-hämatopoetischen Zellen, wie vaskulären Endothelzellen, und an hämatopoetischen Zellen, wie Gewebe-Makrophagen und Mitogen-stimulierten T-Lymphozytenblasten, exprimiert wird. Es wurde festgestellt, dass ICAM-1 in geringen Mengen an peripheren Blutlymphozyten exprimiert wird.
Beispiel 14
Reinigung von ICAM-1 durch Affinitätschromatographie mit monoklonalem Antikörper
Allgemeines Reinigungsschema
ICAM-1 wurde aus humanen Zellen oder Gewebe unter Anwendung der Affinitätschromatographie mit monoklonalem Antikörper gereinigt. Mit ICAM-1 reaktiver monoklonaler Antikörper, RR1/1, wurde zunächst gereinigt und dann an eine inerte Säulenmatrix gekuppelt. Dieser Antikörper wurde von R. Rothlein et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 1270–1274, und von M. L. Dustin et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 245, beschrieben. ICAM-1 wurde durch Lysis der Zellen in dem nicht-ionogenen Detergens Triton X-100 bei einem nahezu neutralen pH-Wert von den Zellmembranen in Lösung gebracht. Das Zelllysat mit einem Gehalt an solubilisiertem ICAM-1 wurde sodann durch Vorsäulen geleitet, die dazu dienten, Materialien zu entfernen, die unspezifisch eine Bindung mit dem Säulen-Matrixmaterial eingehen. Anschließend wurden sie durch die Säulenmatrix mit dem monoklonalen Antikörper geleitet, um für eine Bindung des ICAM-1 an den Antikörper zu sorgen. Die Antikörpersäule wurde sodann mit einer Serie von Detergens-Waschpuffern mit einem steigenden pH-Wert bis zu 11,0 gewaschen. Während dieser Waschvorgänge blieb ICAM-1 an der Antikörpermatrix gebunden, während nicht-bindende und schwach bindende Verunreinigungen entfernt wurden. Das gebundene ICAM-1 wurde sodann spezifisch von der Säule unter Aufsetzen eines Detergenspuffers vom pH-Wert 12,5 eluiert.
Reinigung des monoklonalen Antikörpers RR1/1 und kovalente Kupplung an Sepharose CL-4B
Der monoklonale anti-ICAM-1-Antikörper RR1/1 wurde aus Aszitesflüssigkeit von Mäusen mit Hybridomen oder aus Hybridom-Kulturüberständen gemäß üblichen Techniken der Fällung mit Ammoniumsulfat und der Protein A-Affinitätschromatographie gereinigt (Ey et al., Immunochem., Bd. 15 (1978), S. 429). Das gereinigte IgG oder Ratten-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde kovalent an Sepharose CL-4B (Pharmacia, Upsala, Schweden) unter Anwendung einer Modifikation des Verfahrens von March et al. (Anal. Biochem., Bd. 69 (1974), S. 149) gekuppelt. Kurz zusammengefasst, Sepharose CL-4B wurde in destilliertem Wasser gewaschen, 5 Minuten mit 40 mg/ml CNBr in 5 M K₂HPO₄ (pH-Wert etwa 12) aktiviert und sodann gründlich mit 0,1 mM HCl bei 4°C gewaschen. Die filtrierte, aktivierte Sepharose wurde mit einem gleichen Volumen an gereinigtem Antikörper (2–10 mg/ml in 0,1 M NaHCO₃, 0,1 M NaCl) resuspendiert. Die Suspension wurde 18 Stunden bei 4°C unter mäßigem Rotieren unter Ausführung einer Sturzbewegung inkubiert. Der Überstand wurde sodann durch Messung der Absorption bei 280 nm auf Anwesenheit von ungebundenem Antikörper geprüft. Verbleibende reaktive Stellen an der aktivierten Sepharose wurden durch Zugabe von Glycin bis zu einer Konzentration von 0,05 M abgesättigt. Der Kupplungswirkungsgrad lag üblicherweise über 90%.
Detergens-Solubilisierung von aus menschlicher Milz präparierten Membranen
Sämtliche Vorgänge wurden bei 4°C durchgeführt. Gefrorene humane Milz (200 g-Fragmente) von Patienten mit Haarzellen-Leukämie wurden auf Eis in 200 ml Tris-Kochsalzlösung (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH-Wert 7,4, 4°C) mit einem Gehalt an 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,2 U/ml Aprotinin und 5 mM Iodacetamid aufgetaut. Das Gewebe wurde sodann in kleine Stücke zerschnitten und bei 4°C mit einem Tekmar-Hochleistungshomogenisator homogenisiert. Das Volumen wurde sodann mit Tris-Kochsalzlösung auf 300 ml gebracht. 100 ml 10% Tween 40 (Polyoxyethylen-sorbitanmonopalmitat) in Tris-Kochsalzlösung wurden zugegeben, um eine Endkonzentration an 2,5% Tween 40 zu erzielen.
Zur Präparation von Membranen wurde das Homogenisat unter Anwendung von drei Stößen eines Dounce-Homogenisators oder vorzugsweise eines Teflon Potter Elvejhem-Homogenisators extrahiert und 15 Minuten mit 1000 g × zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und das Pellet wurde mit 200 ml 2,5% Tween 40 in Tris-Kochsalzlösung reextrahiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation mit 1000 g wurden die Überstände beider Extraktionen vereinigt und 1 Stunde mit 150000 g × zentrifugiert, um die Membranen zu pelletisieren. Sodann wurden die Membranen durch Resuspendieren in 200 ml Tris-Kochsalzlösung gewaschen und 1 Stunde mit 150000 g × zentrifugiert. Sodann wurde das Membranpellet in 200 ml Tris-Kochsalzlösung resuspendiert und mit einem Motorhomogenisator und einem Teflon-Pistill homogenisiert, bis die Suspension gleichmäßig trüb war. Sodann wurde das Volumen mit Tris-Kochsalzlösung auf 900 ml gebracht. N-Lauroylsarcosin wurde in einer Endkonzentration von 1% zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei 4°C wurde unlösliches Material im Detergens-Lysat durch 1-stündige Zentrifugation mit 150000 g × entfernt. Sodann wurde Triton X-100 zum Überstand in einer Endkonzentration von 2% zugegeben. Sodann wurde das Lysat 1 Stunde bei 4°C gerührt.
Detergens-Solubilisierung von JY B-Lymphoblastoidzellen
Die mit EBV transformierte B-Lymphoblastoid-Zelllinie JY wurde in RMPI-1640-Medium mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum (FCS) und 10 mM HEPES bis zu einer annähernden Dichte von 0,8–1,0 × 10⁶ Zellen/ml gezüchtet. Zur Erhöhung der Zelloberflächenexpression von ICAM-1 wurde Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) in einer Konzentration von 25 ng/ml 8–12 Stunden vor dem Ernten der Zellen zugegeben. Ferner wurden die Kulturen während dieser Zeitspanne mit Natriumvanadat (50 μM) versetzt. Sodann wurden die Zellen 10 Minuten durch Zentrifugation mit 500 × g pelletisiert und 2-mal in ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) durch Resuspension und Zentrifugation gewaschen. Die Zellen (etwa 5 g pro 5 Liter Kultur) wurden einer Lysis in 50 ml Lysis-Puffer (0,14 M NaCl, 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, 1% Triton X-100, 0,2 U/ml Aprotinin, 1 mM PMSF, 50 μm Natriumvanadat) durch 30-minütiges Rühren bei 4°C unterzogen. Nicht-lysierte Kerne und unlösliche Bruchstücke wurden durch 15-minütige Zentrifugation mit 10000 g × entfernt, wonach der Überstand 1 Stunde mit 150000 g × zentrifugiert und sodann durch 3 mm Whatman-Filterpapier filtriert wurde.
Affinitätschromatographie von ICAM-1 für Strukturuntersuchungen
Zur Reinigung von ICAM-1 im Großmaßstab zur Verwendung in Strukturuntersuchungen wurden eine Säule mit 10 ml RR1/1-Sepharose CL-4B (Kupplung von 2,5 mg Antikörper/ml Gel) und zwei 10 ml-Vorsäulen von CNBr-aktivierter, mit Glycin gestoppter Sepharose CL-4B und an Sepharose CL-4B gekuppeltem Ratten-IgG (2 mg/ml) verwendet. Die Säulen wurden in Serie verbunden und vorher mit 10 Säulenvolumina Lysis-Puffer, 10 Säulenvolumina Puffer vom pH-Wert 12,5 (50 mM Triethylamin, 0,1% Triton X-100, pH-Wert 12,5, 4°C) gewaschen, wonach sich eine Äquilibration mit 10 Säulenvolumina Lysis-Puffer anschloss. 1 Liter Detergens-Lysat von humaner Milz wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5–1,0 ml pro Minute aufgesetzt. Die beiden Vorsäulen wurden zur Entfernung von nicht-spezifisch bindendem Material aus dem Lysat vor der Passage durch die RR1/1-Sepharosesäule verwendet.
Nach dem Aufsetzen wurde die Säule mit RR1/1-Sepharose und gebundenem ICAM-1 nacheinander bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min mit mindestens 5 Säulenvolumina der folgenden Flüssigkeiten gewaschen: 1) Lysis-Puffer, 2) 20 mM Tris, pH-Wert 8,0/0,14 M NaCl/0,1% Triton X-100, 3) 20 mM Glycin, pH-Wert 10,0/0,1% Triton X-100 und 4) 50 mM Triethylamin, pH-Wert 11,0/0,1% Triton X-100. Sämtliche Waschpuffer enthielten 1 mM PMSF und 0,2 U/ml Aprotinin. Nach dem Waschen wurde verbleibendes, gebundenes ICAM-1 mit 5 Säulenvolumina Elutionspuffer (50 mM Triethylamin/0,1% Triton X-100/pH-Wert 12,5, 4°C) mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/3 min eluiert. Das eluierte ICAM-1 wurde in 1 ml-Fraktionen gesammelt und sofort durch Zugabe von 0,1 ml 1 M Tris, pH-Wert 6,7, neutralisiert. ICAM-1 enthaltende Fraktionen wurden durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese von 10 μl-Aliquotanteilen (Springer et al., J. Exp. Med., Bd. 160 (1984), S. 1901) und anschließende Silberfärbung (J. H. Morrissey, Anal. Biochem., Bd. 117 (1981), S. 307) identifiziert. Unter diesen Umständen wurde der Großteil des ICAM-1 in etwa 1 Säulenvolumen eluiert und war gemäß Beurteilung durch mit Silber gefärbte Elektropherogramme zu mehr als 90% rein (eine geringe Menge an IgG, das aus der Affinitätsmatrix ausgelaugt wurde, stellte die Hauptverunreinigung dar). Die Fraktionen mit einem Gehalt an ICAM-1 wurden vereinigt und unter Verwendung von Centricon-30-Mikrokondensatoren (Amicon, Danvers, MA) etwa 20-fach eingeengt. Das gereinigte ICAM-1 wurde einer quantitativen Proteinbestimmung mit dem Lowry-Test unterzogen, wozu ein mit Ethanol gefällter Aliquotanteil des Pools verwendet wurde. Etwa 500 μg reines ICAM-1 wurden aus 200 g humaner Milz erzeugt.
Etwa 200 μg gereinigtes ICAM-1 wurden einer zweiten Reinigungsstufe durch präparative SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Die Bande für ICAM-1 wurde durch Einweichen des Gels in 1 M KCl sichtbar gemacht. Die Gelregion, die ICAM-1 enthielt, wurde sodann ausgeschnitten und gemäß dem Verfahren von Hunkapiller et al., Meth. Enzymol., Bd. 91 (1983), S. 227–236, der Elektroelution unterzogen. Das gereinigte Protein wies bei Prüfung durch SDS-PAGE und Silberfärbung eine Reinheit von mehr als 98% auf.
Affinitätsreinigung von ICAM-1 für Funktionsuntersuchungen
ICAM-1 für Funktionsuntersuchungen wurde aus Detergens-Lysaten von JY-Zellen auf die vorstehend beschriebene Weise gereinigt, jedoch in einem kleineren Maßstab (eine 1 ml-Säule mit RR1/1-Sepharose) und unter den folgenden Modifikationen. Sämtliche Lösungen enthielten 50 μM Natriumvanadat. Nach Waschen der Säule mit Puffer vom pH-Wert 11,0 mit einem Gehalt an 0,1% Triton X-100 wurde die Säule erneut mit 5 Säulenvolumina des gleichen Puffers mit einem Gehalt an 1% n-Octyl-β-D-glucopyranosid (Octylglucosid) anstelle von 0,1% Triton X-100 gewaschen. Das Octylglucosid-Detergens verdrängt das an das ICAM-1 gebundene Triton X-100 und kann im Gegensatz zu Triton X-100 anschließend durch Dialyse entfernt werden. Das ICAM-1 wurde sodann mit Puffer vom pH-Wert 12,5 mit einem Gehalt an 1% Octylglycosid anstelle von 0,1% Triton X-100 eluiert und auf die vorstehend beschriebene Weise analysiert und eingeengt.
Beispiel 15
Eigenschaften von gereinigtem ICAM-1
Aus humaner Milz gereinigtes ICAM-1 wandert in SDS-Polyacrylamidgelen als eine breite Bande mit einem M_r-Wert von 72 000 bis 91 000. Aus JY-Zellen gereinigtes ICAM-1 wandert ebenfalls als breite Bande mit einem M_r-Wert von 76 500 bis 97 000. Diese M_r-Werte liegen innerhalb des angegebenen Bereiches für ICAM-1, das aus verschiedenen Zellquellen immunopräzipitiert worden ist: M_r = 90000 für JY-Zellen, 114 000 an der myelomonozytischen Zelllinie U937 und 97 000 an Fibroblasten (Dustin et al., J. Immunol., Bd. 37 (1986), S. 245). Dieser breite Bereich der M_r-Werte wurde einem starken, aber variablen Glycosylierungsgrad zugeschrieben. Der nicht-glycosylierte Vorläufer weist einen M_r-Wert von 55 000 auf (Dustin et al.). Das Protein, das entweder aus JY-Zellen oder humaner Milz gereinigt worden ist, behält seine antigene Aktivität, wie sich aufgrund seiner Fähigkeit zur erneuten Bindung an die ursprüngliche Affinitätssäule und durch Immunopräzipitation mit RR1/1-Sepharose und SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese ergibt.
Zur Herstellung von Peptidfragmenten von ICAM-1 wurden etwa 200 μg mit 2 mM Dithiothreit/2% SDS reduziert, wonach sich eine Alkylierung mit 5 mM Jodessigsäure anschloss. Das Protein wurde mit Ethanol gefällt, in 0,1 M NH₄CO₃/0,1 mM CaCl₂/0,1% Zwittergent 3–14 (Calbiochem) in Lösung gebracht und 4 Stunden bei 37°C mit 1% (Gew./Gew.) Trypsin verdaut. Daran schloss sich eine weitere 12-stündige Verdauung bei 37°C mit 1% Trypsin an. Die tryptischen Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer 0,4 × 15 cm-C4-Säule (Vydac) gereinigt. Die Peptide wurden mit einem linearen Gradienten von 0% mit 60% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert. Ausgewählte Peptide wurden einer Sequenzanalyse an einem Gasphasen-Mikrosequenator (Applied Biosystems) unterzogen. Die bei diesen Untersuchungen erhaltenen Sequenzinformationen sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5 Aminosäuresequenzen von tryptischen ICAM-1-Peptiden
Aminosäure ist als erste aufgeführt.
a = Hauptpeptid
b = Nebenpeptid
Beispiel 16
Klonierung des ICAM-1-Gens
Das Gen für ICAM-1 kann unter Anwendung einer Vielzahl von Verfahren kloniert werden. Beispielsweise kann die durch Sequenzierung der tryptischen Fragmente von ICAM-1 (Tabelle 5) gewonnene Information über die Aminosäuresequenz zur Identifizierung einer Oligonucleotidsequenz herangezogen werden, die dem ICAM-1-Gen entspricht. Alternativ kann das ICAM-1-Gen unter Verwendung von anti-ICAM-1-Antikörper zum Nachweis von Klonen, die ICAM-1 bilden, kloniert werden.
Klonierung des Gens für ICAM-1 unter Verwendung von Oligonucleotid-Sonden
Unter Verwendung des kinetischen Codes (J. D. Watson, in Molecular Biology of the Gene, 3. Auflg., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)) lassen sich ein oder mehr verschiedene Oligonucleotide identifizieren, von denen jedes zur Kodierung der tryptischen ICAM-1-Peptide befähigt ist. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein spezielles Oligonucleotid wirklich die tatsächliche ICAM-1-Kodierungssequenz darstellt, lässt sich unter Berücksichtigung von abnormalen Basenpaarbeziehungen und der Häufigkeit, mit der ein bestimmtes Codon in eukaryontischen Zellen tatsächlich verwendet wird (zur Kodierung einer bestimmten Aminosäure) abschätzen. Derartige "Codon-Verwendungsregeln" werden von R. Lathe et al., J. Molec. Biol., Bd. 183 (1985), S. 1–12, beschrieben. Unter Einsatz der "Codon-Verwendungsregeln" von Lathe wird ein einzelnes Oligonucleotid oder ein Satz von Oligonucleotiden identifiziert, die eine theoretische, "höchstwahrscheinliche" Nucleotidsequenz (d. h. die Nucleotidsequenz mit der geringsten Redundanz), die zur Kodierung der tryptischen ICAM-1-Peptidsequenzen befähigt ist, enthalten.
Das Oligonucleotid oder der Satz von Oligonucleotiden, die die theoretisch "höchstwahrscheinliche" Sequenz, die zur Kodierung von ICAM-1-Fragmenten befähigt ist, enthalten, werden zur Identifizierung der Sequenz eines komplementären Oligonucleotids oder eines Satzes von Oligonucleotiden, die zur Hybridisierung mit der "höchstwahrscheinlichen" Sequenz oder dem Satz von Sequenzen befähigt sind, verwendet. Ein Oligonucleotid, das eine derartige komplementäre Sequenz enthält, kann als eine Sonde zum Identifizieren und Isolieren des ICAM-1-Gens verwendet werden (T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Gold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982).
Wie im vorstehenden Abschnitt C beschrieben, ist es möglich, das ICAM-1-Gen aus eukaryontischen DNA-Präparaten, von denen angenommen wird, dass sie dieses Gen enthalten, zu klonieren. Zum Identifizieren und Klonieren des Gens, das für das ICAM-1-Protein kodiert, wird eine DNA-Bibliothek einem Screening auf ihre Fähigkeit zur Hybridisierung mit den vorstehend beschriebenen Oligonucleotidsonden unterzogen. Da es wahrscheinlich ist, dass nur zwei Kopien des Gens für ICAM-1 in einer normalen diploiden Zelle vorhanden sind, und da es möglich ist, dass das ICAM-1-Gen große, nicht-transkribierte, zwischenliegende Sequenzen (Introns) enthält, deren Klonierung nicht erwünscht ist, ist es bevorzugt, für ICAM-1 kodierende Sequenzen aus einer cDNA-Bibliothek zu isolieren, die aus der mRNA einer ICAM-1 bildenden Zelle, statt aus der genomischen DNA hergestellt worden ist. Geeignete DNA- oder cDNA-Präparate werden enzymatisch gespalten oder willkürlich geschnitten und in rekombinante Vektoren ligiert. Die Fähigkeit dieser rekombinanten Vektoren zur Hybridisierung mit den vorstehend beschriebenen Oligonucleotidsonden wird sodann gemessen. Verfahren zur Hybridisierung werden beispielsweise von T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982), oder von B. T. Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1985), beschrieben. Vektoren, für die eine derartige Hybridisierungsfähigkeit festgestellt worden ist, werden sodann analysiert, um das Ausmaß und die Natur der ICAM-1-Sequenzen, die sie enthalten, zu bestimmen. Auf Grundlage rein statistischer Überlegungen lässt sich ein Gen, das z. B. für das ICAM-1-Molekül kodiert, unzweideutig (durch Hybridisierungsscreening) unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde mit nur 18 Nucleotiden identifizieren.
Zusammenfassend ausgedrückt, ermöglicht somit die tatsächliche Identifizierung von ICAM-1-Peptidsequenzen die Identifizierung einer theoretischen DNA-Sequenz von "höchster Wahrscheinlichkeit" oder eines Satzes von derartigen Sequenzen, die zur Kodierung eines derartigen Peptids befähigt sind. Durch Konstruktion eines mit dieser theoretischen Sequenz komplementären Oligonucleotids (oder durch Konstruktion eines Satzes von mit diesem Satz von Oligonucleotiden von "höchster Wahrscheinlichkeit" komplementären Oligonucleotiden) erhält man ein DNA-Molekül (oder einen Satz von DNA-Molekülen), die als Sonde zur Identifizierung und Isolierung des ICAM-1-Gens geeignet sind.
Unter Verwendung der ICAM-1-Peptidsequenzen von Tabelle 5 wurde die Sequenz einer Sequenz von "höchster Wahrscheinlichkeit" eines Oligonucleotids, das zur Kodierung der AA- und J-Peptide befähigt ist, bestimmt (Tabellen 6 bzw. 7). Mit diesen Sequenzen komplementäre Oligonucleotide wurden synthetisiert und gereinigt, um sie als Sonden zur Isolierung von ICAM-1-Gensequenzen zu verwenden. cDNA-Bibliotheken mit in geeigneter Weise ausgewählter Größe wurden aus Poly(A)⁺-RNA sowohl von PMA-induzierten HL-60-Zellen und von PS-stimulierten Umbilikalvenen-Endothelzellen erzeugt. Eine in Bezug auf die Größe ausgewählte cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von Poly(A)⁺-RNA aus PMA-induzierten HL-60-Zellen gemäß dem Verfahren von U. Gubler et al. hergestellt (Gene, Bd. 25 (1983), S. 263–269; und A. Corbi et al., EMBO J., Bd. 6 (1987), S. 4023–4028); diese Druckschriften werden durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
Eine in Bezug auf die Größe ausgewählte cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von Poly(A)⁺-RNA aus Umbilikalvenen-Endothelzellen, die 4 Stunden mit PS in einer Menge von 5 μg/ml stimuliert worden waren, hergestellt. Die RNA wurde durch Homogenisieren der Zellen in 4 M Guanidiniumisothiocyanat und durch Ultrazentrifugation des Überstands mit einem CsCl-Gradienten extrahiert (J. M. Chirgwin et al., Biochem., Bd. 18 (1979), S. 5294–5299). Poly(A)⁺-RNA wurde aus dem Gemisch der gesamten RNA-Spezies durch Anwendung der oligo-(dT)- Cellulose-Chromatographie (Typ 3, Collaborative Research) isoliert (H. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 69 (1972), S. 140–1412).
Tabelle 6 Oligonucleotid, das zur Nucleotidsequenz von höchster Wahrscheinlichkeit, die zur Kodierung des ICAM-1-AA-Peptids befähigt ist, komplementär ist
Tabelle 6 (Forts.) Oligonucleotid, das zur Nucleotidsequenz von höchster Wahrscheinlichkeit, die zur Kodierung des ICAM-1-AA-Peptids befähigt ist, komplementär ist
Tabelle 7 Oligonucleotid, das zur Nucleotidsequenz von höchster Wahrscheinlichkeit, die zur Kodierung des ICAM-1-J-Peptids befähigt ist, komplementär ist
Zunächst wurde cDNA unter Verwendung von 8 μg poly(A)⁺-RNA, reverser Transkriptase von Geflügel-Myeloblastose-Virus (Life Sciences) und oligo(dT)-Primer synthetisiert. Das DNA-RNA-Hybrid wurde mit RNase H (BRL) verdaut. Der zweite Strang wurde unter Verwendung von DNA-Polymerase I(New England Biolabs) synthetisiert. Das Produkt wurde mit EcoRI-Methylase (New England Biolabs) methyliert, stumpfendig mit EcoRI-Linkern (New England Biolabs) ligiert, mit EcoRI verdaut und einer Größenauswahl an einem Agarosegel von niedrigem Schmelzpunkt unterzogen. cDNA mit mehr als 500 bp wurde mit λgt10, das vorher mit EcoRI verdaut und dephosphoryliert worden war (Stratagene), ligiert. Das Ligationsprodukt wurde sodann gepackt (Stratagene Gold).
Die Umbilikalvenen-Endothelzellen und HL-60-cDNA-Bibliotheken wurden sodann in 20000 PFU/150 mm-Platte ausgestrichen. Rekombinante DNA wurde im Doppelversuch auf Nitrocellulosefilter übertragen, in 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl denaturiert, in 1 M Tris, pH-Wert 7,5/1,5 M NaCl neutralisiert und 2 Stunden einer Wärmebehandlung bei 80°C unterworfen (W. D. Benton et al., Science, Bd. 196 (1977), S. 180–182). Filter wurden in 5X SSC mit einem Gehalt an 5X Denhardt-Lösung, 50 mM NaPO₄ und 1 μg/ml Lachssperma-DNA vorhybridisiert und hybridisiert. Die Vorhybridisierung wurde 1 Stunde bei 45°C durchgeführt.
Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von 32 bp (5'-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGTGAC) oder 47 bp (5'-GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTC)-antisense-Oligonucleotiden, die auf die vorstehend beschriebene Weise auf den tryptischen ICAM-1-Peptiden J bzw. AA beruhten (Tabellen 6 und 7) durchgeführt (R. Lathe, J. Molec. Biol., Bd. 183 (1985), S. 1–12). Oligonucleotide wurden einer Endmarkierung mit γ-(³²P)ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotid-kinase unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen (New England Biolabs) markiert. Nach Hybridisierung über Nacht wurden die Filter 2-mal mit 2 X SSC/0,1% SDS 30 Minuten bei 45°C gewaschen. Aus Plaques, die Hybridisierung zeigten, wurden Phagen isoliert und durch anschließendes erneutes Ausstreichen und erneutes Screening gereinigt.
Klonierung des Gens für ICAM-1 unter Verwendung von anti-ICAM-1-Antikörper
Das Gen für ICAM-1 kann alternativ unter Verwendung von anti-ICAM-1-Antikörper kloniert werden. DNA oder insbesondere cDNA werden aus einer Zelle, die zur Expression von ICAM-1 befähigt ist, extrahiert und gereinigt. Die gereinigte cDNA wird fragmentiert (durch Schneiden, Endonuclease-Verdau und dergl.), um einen Pool von DNA- oder cDNA-Fragmenten zu bilden. DNA- oder cDNA-Fragmente aus diesem Pool werden sodann in einen Expressionsvektor kloniert, um eine Genombibliothek von Expressionsvektoren zu erzeugen, deren Mitglieder jeweils ein einzigartiges kloniertes DNA- oder cDNA-Fragment enthalten.
Beispiel 17
Analyse der cDNA-Klone
Phagen-DNA aus positiven Klonen wurde mit EcoRI verdaut und durch Southern-Analyse unter Verwendung einer cDNA aus einem Klon als Sonde untersucht. cDNA-Inserts von maximaler Größe, die eine Kreuzhybridisierung ergaben, wurden in die EcoRI-Stelle des Plasmidvektors pGEM 4Z (Promega) subkloniert. HL-60-Subklone, die die cDNA in beiden Orientierungen enthielten, wurden durch Exonuclease III-Verdau (S. Henikoff, Gene, Bd. 28 (1984), S. 351–359) gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Erase-a-Base, Promega) deletiert.
Zunehmend deletierte cDNAs wurden sodann kloniert und der Didesoxynucleotid-Kettenendesequenzierung (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 74 (1977), S. 5463–5467) gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Sequenase, U. S. Biochemical) unterworfen. Die HL-60-cDNA-5'- und Kodierungsregionen wurden an beiden Strängen vollständig sequenziert. Die 3'-Region wurde an beiden Strängen zu etwa 70% sequenziert. Eine repräsentative, endotheliale cDNA wurde über den Großteil ihrer Länge durch Schrotschuss-Klonierung von 4 bp-Erkennungs-Restriktionsenzym-Fragmenten sequenziert.
Die cDNA-Sequenz einer HL-60- und einer Endothelzellen-cDNA wurde ermittelt (8). Die 3023 bp-Sequenz enthält eine kurze 5'-untranslatierte Region und eine 1,3 kb 3'-untranslatierte Region mit einem Konsensus-Polyadenylierungssignal in Position 2966. Der längste offene Leseraster beginnt mit dem ersten ATG in Position 58 und endet mit einem TGA-Terminationstriplett in Position 1653. Die Identität zwischen der translatierten Aminosäuresequenz und Sequenzen, die aus 8 verschiedenen tryptischen Peptiden mit insgesamt 91 Aminosäuren (in 8 unterstrichen) ermittelt wurden, bestätigte, dass authentische ICAM-1-cDNA-Klone isoliert worden waren. Die Aminosäuresequenzen von tryptischen ICAM-1-Peptiden sind in Tabelle 8 aufgeführt.
Tabelle 8 Aminosäuresequenzen von tryptischen ICAM-1-Peptiden
Eine Hydrophobizitätsanalyse (J. Kyte et al., J. Molec. Biol., Bd. 157 (1982), S. 105–132, lässt auf die Anwesenheit einer Signalsequenz mit 27 Resten schließen. Die Zuordnung des +1-Glutamin stimmt damit überein, dass wir nicht in der Lage waren, bei drei verschiedenen ICAM-1-Proteinpräparaten eine N-terminale Sequenz zu erhalten: Glutamin kann zu Pyroglutaminsäure cyclisieren, was zu einem blockierten N-Terminus führt. Die translatierte Sequenz von 1 bis 453 ist vorwiegend hydrophil, wonach sich eine hydrophobe, mutmaßliche Transmembransequenz mit 24 Resten anschließt. Der Transmembrandomäne folgen unmittelbar mehrere geladene Reste, die innerhalb einer mutmaßlichen zytoplasmatischen Domäne mit 27 Resten enthalten sind.
Die vorhergesagte Größe der reifen Polypeptidkette beträgt 55 219 Dalton, was hervorragend mit der festgestellten Größe von 55000 für deglycosyliertes ICAM-1 übereinstimmt (M. L. Dustin et al., J. Immunol. Bd. 137 (1986), S. 245–254). 8 N-verknüpfte Glycosylierungsstellen werden vorhergesagt. Die Abwesenheit von Asparagin in den tryptischen Peptidsequenzen von zwei dieser Stellen bestätigen deren Glycosylierung und deren extrazelluläre Orientierung. Unter der Annahme von 2 500 Dalton pro stark mannosehaltigem, N-verknüpftem Kohlenhydrat wird eine Größe von 75 000 Dalton für den ICAM-1-Vorläufer vorhergesagt, verglichen mit der beobachteten Größe von 73000 Dalton (M. L. Dustin et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 245–254). Nach Umwandlung von hoher Mannose zur Komplexierung von Kohlenhydrat weist das reife ICAM-1-Glycoprotein 76 bis 114 kd auf, je nach dem Zelltyp (M. L. Dustin et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 245–254). Somit stellt ICAM-1 ein stark glycosyliertes, jedoch ansonsten typisches integrales Membranprotein dar.
Beispiel 18
ICAM-1 stellt ein Integrin bindendes Mitglied der Immunoglobulin-Supergenfamilie dar.
Eine Ausrichtung von internen ICAM-1-Wiederholungen wurde unter Verwendung des Mikrogenie-Protein-Ausrichtungsprogramms (C. Queen et al., Nucl. Acid Res., Bd. 12 (1984), S. 581–599) durchgeführt, wonach eine Inspektion vorgenommen wurde. Die Ausrichtung von ICAM-1 in Bezug zu IgM, N-CAM und MAG wurde unter Verwendung des Mikrogenie- und des ALIGN-Programms (M. O. Dayhoff et al., Meth. Enzymol., Bd. 91 (1983), S. 524–545) durchgeführt. Vier Proteinsequenz-Datenbanken, die von der National Biomedical Research Foundation unterhalten wurden, wurden auf Proteinsequenz-Ähnlichkeiten unter Verwendung des FASTP-Programms von Williams und Pearson abgesucht (D. J. Lipman et al., Science, Bd. 227 (1985), S. 1435–1439).
Da ICAM-1 ein Ligand eines Integrins darstellt, war nicht zu erwarten, dass es ein Mitglied der Immunoglobulin-Supergenfamilie sein würde. Jedoch zeigt eine Inspektion der ICAM-1-Sequenz, dass es sämtliche Kriterien, die für eine Mitgliedschaft in der Immunoglobulin-Supergenfamilie vorgeschlagen werden, erfüllt. Diese Kriterien werden nachstehend erörtert.
Die gesamte extrazelluläre Domäne von ICAM-1 ist aus fünf homologen, immunoglobulinartigen Domänen konstruiert, die in 9A in ausgerichteter Form dargestellt sind. Die Domänen 1–4 weisen Längen von 88, 97, 99 bzw. 99 Resten auf und haben somit eine typische Größe von Ig-Domänen. Die Domäne 5 ist innerhalb von 68 Resten geschnitten. Recherchen in der NBRF-Datenbank unter Verwendung des FASTP-Programms ergaben signifikante Homologien mit Mitgliedern der Immunoglobulin-Supergenfamilie, einschließlich der IgM- und IgG-C-Domänen, der variablen T-Zellrezeptor-α-Untereinheit-Domäne und alpha-1-beta-Glycoprotein (9B–D).
Unter Verwendung der vorstehenden Informationen wurde die Aminosäuresequenz von ICAM-1 mit den Aminosäuresequenzen von anderen Mitgliedern der Immunoglobulin-Supergenfamilie verglichen.
Drei Typen von Ig-Superfamiliendomänen, nämlich V, C1 und C2, wurden differenziert. Sowohl die V- als auch die C-Domänen sind aus 2 β-Blättern konstruiert, die durch die Intradomänen-Disulfidbindung miteinander verknüpft sind. Die V-Domänen enthalten 9 antiparallele β-Stränge, während die C-Domänen 7 aufweisen. Konstante Domänen wurden auf der Grundlage von charakteristischen Resten gemäß der Darstellung in 9A in die C1- und C2-Sätze unterteilt. Der C1-Satz umfasst Proteine, die an der Antigenerkennung beteiligt sind. Der C2-Satz umfasst mehrere Fc-Rezeptoren und Proteine, die an der Zellhaftung beteiligt sind, einschließlich CD2, LFA-3, MAG und NCAM. Es wurde festgestellt, dass die ICAM-1-Domänen die stärkste Homologie mit Domänen des C2-Satzes aufwiesen, wenn ICAM-1 in diesen Satz platziert wurde. Dies spiegelt sich in einer stärkeren Ähnlichkeit zu konservierten Resten in C2- im Vergleich zu C1-Domänen wieder, wie für die beta-Stränge B–F in 9 gezeigt ist. Ferner ergab sich für ICAM-1-Domänen eine wesentlich bessere Ausrichtung mit den beta-Strängen A und G von C2-Domänen als mit diesen Strängen in V- und C1-Domänen, was eine gute Ausrichtung über die gesamte C2-Domänenstärke ermöglicht. Ausrichtungen mit C2-Domänen aus NCAM, MAG und alpha-1-β-Glycoprotein sind in den 9B und 9C dargestellt. Die Identität lag im Bereich von 28 bis 33%. Ausrichtungen mit einem T-Zellrezeptor Va mit einer Identität von 27% und der IgM-C-Domäne 3 mit einer Identität von 34% sind ebenfalls dargestellt (9B, 9D).
Eine der wichtigsten Eigenschaften von Immunoglobulindomänen sind die disulfidgebundenen Cysteine, die die B- und Fβ-Stränge, die das β-Blatt-Sandwich stabilisieren, überbrücken. In ICAM-1 sind die Cysteine in sämtlichen Fällen mit Ausnahme des Strangs f von Domäne 4 konserviert, wo sich ein Leucin findet, das dem Sandwich zugewandt sein kann und den Kontakt stabilisieren kann, wie für einige andere Domänen der V- und C2-Sätze vorgeschlagen wird. Der Abstand zwischen den Cysteinen (Reste 43, 50, 52 und 37) entspricht den Angaben für den C2-Satz.
Zum Test auf die Anwesenheit von Intraketten-Disulfidbindungen in ICAM-1 wurde Endothelzellen-ICAM-1 einer SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht- reduzierenden Bedingungen unterworfen. Endothelzellen-ICAM-1 wurde verwendet, da es eine geringere Glycosylierungsheterogenität als JY- oder Haarzellen-Milz-ICAM-1 zeigt und eine größere Empfindlichkeit gegenüber Verschiebungen im M_r-Wert ermöglicht. ICAM-1 wurde daher aus 16-stündigen, mit LPS (5 μg/ml) stimulierten Umbilikalvenen-Endothelzellen-Kulturen durch Immunoaffinitätschromatographie gemäß den vorstehenden Angaben gereinigt. Mit Aceton ausgefälltes ICAM-1 wurde in Probenpuffer (U. K. Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680–685) mit 0,25% 2-Mercaptoethanol oder 25 mM Iodacetamid resuspendiert und 5 Minuten auf 100°C gebracht. Die Proben wurden sodann der SDS-PAGE 4670 und der Silberfärbung 4613 unterworfen. Endothelzellen-ICAM-1 wies einen scheinbaren M_r-Wert von 100 kd unter reduzierenden Bedingungen und von 96 kd unter nicht-reduzierenden Bedingungen auf, was stark auf die Anwesenheit von Intraketten-Disulfiden in nativem ICAM-1 schließen lässt.
Bei Verwendung der Primärsequenz zur Vorhersage der Sekundärstruktur (P. Y. Chou et al., Biochem., Bd. 13 (1974), S. 211–245) ergaben sich die 7 erwarteten β-Stränge in jeder ICAM-1-Domäne (in 9A oben mit a–g bezeichnet), was exakt die Vorhersage für eine Immunoglobulindomäne erfüllt und den Positionen der Stränge A–H in den Immunoglobulinen (9A unten) entspricht. Den Domänen 5 fehlen die A- und C-Stränge. Da diese aber die Ränder der Blätter bilden, konnten die Blätter immer noch entstehen, wobei möglicherweise der Strang D die Stelle des Stranges C einnimmt, wie für einige andere C2-Domänen vorgeschlagen wird. Die charakteristische Disulfidbindung zwischen den Strängen B und F bliebe unbeeinflusst. Somit sind die Kriterien für Domänengröße, Sequenzhomologie, konservierte Cysteine, die die mutmaßliche Intradomänen-Disulfidbindung bilden, Vorliegen von Disulfidbindungen und vorhergesagte β-Blattstruktur alle erfüllt, um ICAM-1 in die Immunoglobulin-Supergenfamilie einzuordnen.
Es wurde festgestellt, dass ICAM-1 die stärkste Homologie zu den NCAM- und MAG-Glycoproteinen des C2-Satzes zeigt. Dies ist von besonderem Interesse, da sowohl NCAM als auch MAG die Zell-Zell-Haftung vermitteln. NCAM ist bei Neuron-Neuron- und neuromuskulären Wechselwirkungen von Bedeutung (B. A. Cunningham, et al., Science, Bd. 236 (1987), S. 799–806), während MAG von Bedeutung bei Neuron-Oligodendrozyt- und Oligodendrozyt-Oligodendrozyt-Wechselwirkungen während der Myelinierung ist (M. Poltorak et al., J. Cell Biol., Bd. 105 (1987), S. 1893–1899). Die Zelloberflächenexpression von NCAM und MAG wird im Verlauf der Entwicklung während der Bildung des Nervensystems bzw. der Myelinierung in Analogie zu der regulierten Induktion von ICAM-1 bei Entzündungen reguliert (T. A. Springer et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 5 (1987), S. 223–252). ICAM-1, NCAM (B. A. Cunningham et al., Science, Bd. 236 (1987), S. 799–806) und MAG (J. L. Salzer et al., J. Cell. Biol., Bd. 104 (1987), S. 957–965) sind in ihrer Gesamtstruktur ähnlich sowie homolog, da es sich bei jedem dieser Bestandteile um ein integrales Membran-Glycoprotein handelt, das aus 5 C2-Domänen, die die N-terminale, extrazelluläre Region bilden, konstruiert ist, obgleich in NCAM eine zusätzliche nicht-Ig-ähnliche Sequenz zwischen der letzten C2-Domäne und der Transmembrandomäne vorhanden ist. ICAM-1 richtet sich über seine gesamte Länge, einschließlich der Transmembran- und zytoplasmatischen Domänen mit MAG bei einer Identität von 21% aus. Die gleiche prozentuale Identität wird bei einem Vergleich der 5 Domänen von ICAM-1 und NCAM-1 festgestellt. Ein schematischer Vergleich der Sekundärstrukturen von ICAM-1 und MAG ist in 10 dargestellt. Ein domänenweiser Vergleich zeigt, dass der Homologiegrad zwischen Domänen innerhalb der ICAM-1- und NCAM-Moleküle (x ± s.d. 21 ± 2,8% bzw. 18,6 ± 3,8%) der gleiche ist wie der Homologiegrad bei einem Vergleich der ICAM-1-Domänen mit NCAM- und MAG-Domänen (20,4 ± 3,7 bzw. 21,9 ± 2,7). Obgleich es Anzeichen für ein alternatives Spleissen in den C-terminalen Regionen von NCAM (B. A. Cunningham, et al., Science, Bd. 236 (1987), S. 799–806; und D. Barthels et al., EMBO J., Bd. 6 (1987), S. 907–914) und MAG (C. Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 84 (1987), S. 4377–4341) gibt, wurden hierfür keine Anzeichen bei der Sequenzierung von endothelialen oder HL-60-ICAM-1-Klonen oder bei Untersuchungen über das ICAM-1-Proteingerüst und Vorläufer bei einer Vielzahl von Zelltypen festgestellt (M. L. Dustin et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 245–254).
ICAM-1 fungiert als Ligand für LFA-1 bei Lymphozyten-Wechselwirkungen mit einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen. Lymphozyten binden an ICAM-1, das künstlichen Membrandoppelschichten einverleibt ist. Dafür ist LFA-1 am Lymphozyt erforderlich, was direkt eine LFA-1-Wechselwirkung mit ICAM-1 zeigt (S. D. Marlin et al., Cell, Bd. 51 (1987), S. 813–819). LFA-1 ist ein Leukozyten-Integrin und zeigt keine immunoglobulinartigen Merkmale. Leukozyten-Integrine umfassen eine Integrin-Unterfamilie. Die anderen beiden Unterfamilien vermitteln Zell-Matrix-Wechselwirkungen und erkennen die Sequenz RGD innerhalb ihrer Liganden, die Fibronectin, Vitronectin, Kollagen und Fibrinogen einschließen (R. O. Hynes, Cell, Bd. 48 (1987), S. 549–554; und E. Ruoslahti et al., Science, Bd. 238 (1987), S. 491–497). Die Leukozyten-Integrine werden nur an Leukozyten exprimiert und sind an Zell-Zell-Wechselwirkungen beteiligt. Die einzigen bekannten Liganden sind ICAM-1 und iC3b, ein Fragment der Komplementkomponente C3, die keine immunoglobulinartigen Merkmale zeigt und von Mac-1 erkannt wird (T. K. Kishimoto et al., in Leukocyte Typing III, McMichael, M. (Hrsg.), Springer-Verlag, New York (1987); T. A. Springer et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 5 (1987), S. 223–252; und D. C. Anderson et al., Ann. Rev. Med., Bd. 38 (1987), S. 175–194). Auf der Grundlage der Sequenzanalyse sind mögliche Peptide innerhalb der ICAM-1-Sequenz, die von LFA-1 erkannt werden, in Tabelle 9 aufgeführt.
Tabelle 9 Peptide innerhalb der ICAM-1-Sequenz, die möglicherweise durch LFA-1 erkannt werden
ICAM-1 ist das erste Beispiel eines Mitglieds der Immunoglobulin-Supergenfamilie, die an ein Integrin bindet. Obgleich diese beiden Familien eine wichtige Rolle bei der Zellhaftung spielen, wurde früher eine Wechselwirkung zwischen diesen nicht erwartet. Im Gegensatz dazu sind Wechselwirkungen innerhalb der Immunoglobulin-Gensuperfamilie recht üblich. Es ist gut möglich, dass weitere Beispiele für Wechselwirkungen zwischen den Integrin- und Immunoglobulinfamilien gefunden werden. LFA-1 erkennt einen von ICAM-1 unterschiedlichen Liganden (T. A. Springer et al., Ann. Rev. Immunol., Bd. 5 (1987), S. 223–252). Das Leukozyten-Integrin Mac-1 erkennt einen von C3bi unterschiedlichen Liganden bei der Neutrophilen-Neutrophilen-Haftung (D. C. Anderson et al., Ann. Rev. Med., Bd. 38 (1987), S. 175–194). Ferner binden gereinigte, MAG enthaltende Vesikel an Neuriten, bei denen es sich um MAG handelt. Somit muss MAG zu einer heterophilen Wechselwirkung mit einem bestimmten Rezeptor befähigt sein (M. Poltorak et al., J. Cell Biol., Bd. 105 (1987), S. 1893–1899).
Es wurde vorgeschlagen, dass die Rolle von NCAM bei neural-neuralen und neural-muskulären Zellwechselwirkungen auf homophile NCAM-NCAM-Wechselwirkungen zurückzuführen ist (B. A. Cunningham et al., Science, Bd. 236 (1987), S. 799–806). Die wichtige Rolle von MAG bei Wechselwirkungen zwischen benachbarten, sich drehenden Schleifen von Schwann-Zellen, die Axons während der Bildung der Myelinscheide einhüllen, könnte auf eine Wechselwirkung mit einem bestimmten Rezeptor oder auf homophile MAG-MAG-Wechselwirkungen zurückzuführen sein. Die Homologie mit NCAM und das häufige Auftreten von Domänen-Domänen-Wechselwirkungen innerhalb der Immunoglobulin-Supergenfamilie lässt auf die Möglichkeit schließen, dass ICAM-1 in homophile Wechselwirkungen sowie in heterophile ICAM-1-LFA-1-Wechselwirkungen eingreifen könnte. Jedoch kann die Bindung von B-Lymphoblastenzellen, die ähnliche Dichten an LFA-1 und ICAM-1 koexprimieren, an ICAM-1 in künstlichen oder zellulären Monoschichten durch Vorbehandlung des B-Lymphoblasten mit LFA-1-Mab vollständig gehemmt werden, während die Haftung durch Vorbehandlung von B-Lymphoblasten mit ICAM-1-Mab unbeeinflusst bleibt. Eine Vorbehandlung der Monoschicht mit ICAM-1-Mab beseitigt die Bindung vollständig (M. L. Dustin et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 245–254; und S. D. Marlin et al., Cell, Bd. 51 (1987), S. 813–819). Diese Befunde zeigen, dass dann, wenn überhaupt homophile ICAM-1-Wechselwirkungen auftreten, diese wesentlich schwächer als eine heterophile Wechselwirkung mit LFA-1 sein müssen.
Die Möglichkeit, dass die Leukozyten-Integrine Liganden in grundlegend unterschiedlicher Weise erkennen, stimmt mit dem Vorliegen einer Sequenz mit 180 Resten in deren α-Untereinheiten überein, die bei der Ligandenbindung von Bedeutung sein kann und die in den RGD erkennenden Integrinen nicht vorhanden ist (A. Corbi et al., EMBO J., Bd. 6 (1987), S. 4023–4028). Obgleich angeregt wurde, dass Mac-1 die in iC3b 5086 vorhandene RGD-Sequenz erkennt, gibt es in ICAM-1 keine RGD-Sequenz (8). Dies stimmt mit dem fehlenden Vermögen des Fibronectinpeptids GRGDSP und des Kontrollpeptids GRGESP zur Hemmung der ICAM-1-LFA-1-Haftung überein (S. D. Marlin et al., Cell, Bd. 51 (1987), S. 813–819). Jedoch sind verwandte Sequenzen, wie PRGGS und RGEKE in ICAM-1 in Regionen vorhanden, von denen eine Schleifenbildung zwischen den β-Strängen a und b der Domäne 2 bzw. c und d der Domäne 2 vorhergesagt wird, (9) und können somit für eine Erkennung zugänglich sein. Es ist von Interesse, dass das homologe MAG-Molekül eine RGD-Sequenz zwischen den Domänen 1 und 2 enthält (M. Poltorak et al., J. Cell Biol., Bd. 105 (1987), S. 1893–1899; und J. L. Salzer et al., J. Cell. Biol., Bd. 104 (1987), S. 957–965).
Beispiel 19
Southern und Northern-Blots
Southern-Blots wurden unter Verwendung von 5 μg genomischer DNA, die aus drei Zelllinien extrahiert war, durchgeführt: BL2, eine Burkitt-Lymphom-Zelllinie (von Dr. Gilbert Lenoir zur Verfügung gestellt); JY und Er-LCL, mit EBV transformierte β-Lymphoblastoid-Zelllinien.
Die DNAs wurden mit der 5-fachen Menge der von den Herstellern empfohlenen Mengen an BamHI- und EcoRI-Endonucleasen (New England Biolabs) verdaut. Nach Elektrophorese durch ein 0,8%-Agarosegel wurden die DNAs auf eine Nylon-Membran (Zeta Probe, BioRad) übertragen. Der Filter wurde gemäß den nachstehenden üblichen Verfahren vorhybridisiert und hybridisiert, wobei ICAM-cDNA aus HL-60 verwendet wurde, das mit α-(³²P)dXTP's durch willkürliches Priming markiert war (Boehringer Mannheim). Northern-Blots wurden unter Verwendung von 20 μg gesamter RNA oder 6 μg poly(A)⁺-RNA durchgeführt. RNA wurde denaturiert, der Elektrophorese durch ein 1%-Agarose-Formaldehyd-Gel unterzogen und der Elektroübertragung auf Zeta Probe unterworten. Die Filter wurden gemäß früheren Angaben vorhybridisiert und hybridisiert (D. E. Staunton et al., EMBO J., Bd. 6 (1987), S. 3695–3701), wobei die HL-60-cDNA-Sonde von mit ³²P-markierten Oligonucleotidsonden (vorstehend beschrieben) verwendet wurde.
Die Southern-Blots unter Verwendung der 3 kb-cDNA-Sonde und von genomischer DNA, die mit BamHI und EcoRI verdaut war, zeigten einzelne vorherrschende Hybridisierungsfragmente mit 20 bzw. 8 kb, was auf ein einziges Gen schließen lässt und ferner darauf schließen lässt, dass der Großteil der Kodierungsinformation innerhalb von 8 kb vorhanden ist. In Blots von 3 verschiedenen Zelllinien gab es kein Anzeichen auf einen Restriktionsfragment-Polymorphismus.
Beispiel 20
Expression des ICAM-1-Gens
Bei einem "Expressionsvektor" handelt es sich um einen Vektor, der (aufgrund der Anwesenheit von entsprechenden transkriptionalen und/oder translationalen Kontrollsequenzen) zur Expression eines DNA- (oder cDNA-) Moleküls befähigt ist, das in den Vektor geklont worden ist und somit zur Bildung eines Polypeptids oder Proteins befähigt ist. Die Expression der klonierten Sequenzen erfolgt, wenn der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wird. Bei Verwendung eines prokaryontischen Expressionsvektors handelt es sich bei der geeigneten Wirtszelle um eine beliebige prokaryontische Wirtszelle, die zur Expression der klonierten Sequenzen befähigt ist. Gleichermaßen handelt es sich bei Verwendung eines eukaryontischen Expressionsvektors bei der geeigneten Wirtszelle um eine beliebige eukaryontische Zelle, die zur Expression der klonierten Sequenzen befähigt ist. Da eukaryontische DNA zwischenliegende Sequenzen enthalten kann und da derartige Sequenzen in prokaryontischen Zellen möglicherweise nicht korrekt prozessiert werden, wird vorzugsweise eine cDNA aus einer Zelle verwendet, die zur Expression von ICAM-1 befähigt ist, um eine prokaryontische, genomische Expressionsvektorbibliothek zu erzeugen. Verfahren zur Präparation von cDNA und zur Herstellung einer Genombibliothek werden von T. Maniatis et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)) beschrieben.
Die vorstehend beschriebene Expressionsvektor-Genombibliothek wird zur Erstellung einer Bank von Wirtszellen verwendet (die jeweils ein Mitglied der Bibliothek enthalten). Der Expressionsvektor kann in die Wirtszelle durch beliebige Maßnahmen (d. h. Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation und dergl.) eingeführt werden. Die Bank von einen Expressionsvektor enthaltenden Zellen wird klonal vermehrt und ihre Mitglieder werden individuell (unter Anwendung eines Immunoassays) getestet, um festzustellen, ob sie ein Protein, das zur Bindung an anti-ICAM-1-Antikörper befähigt ist, erzeugen.
Die Expressionsvektoren von Zellen, die ein zur Bindung an anti-ICAM-1-Antikörper befähigtes Protein erzeugen, werden sodann weiter analysiert, um festzustellen, ob sie das gesamte ICAM-1-Gen exprimieren (und somit enthalten), ob sie nur ein Fragment des ICAM-1-Gens exprimieren (und enthalten) oder ob sie ein Gen exprimieren (und enthalten), dessen Produkt zwar immunologisch mit ICAM-1 verwandt ist, jedoch nicht ICAM-1 ist. Obgleich eine derartige Analyse durch beliebige zweckmäßige Maßnahmen durchgeführt werden kann, ist es bevorzugt, die Nucleotidsequenz des DNA- oder cDNA-Fragments zu bestimmen, das in den Expressionsvektor geklont worden ist. Derartige Nucleotidsequenzen werden sodann einer Prüfung unterzogen, um festzustellen, ob sie zur Kodierung von Polypeptiden mit der gleichen Aminosäuresequenz wie die tryptischen Verdauungsfragmente von ICAM-1 befähigt sind (Tabelle 5).
Ein Expressionsvektor, der ein DNA- oder cDNA-Molekül enthält, das für das ICAM-1-Gen kodiert, kann somit auf folgende Weise erkannt werden: (i) durch die Fähigkeit, die Expression eines Proteins zu dirigieren, das zur Bindung an anti-ICAM-1-Antikörper befähigt ist; und (ii) durch die Anwesenheit einer Nucleotidsequenz, die zur Kodierung der einzelnen tryptischen Fragmente von ICAM-1 befähigt ist. Das klonierte DNA-Molekül eines derartigen Expressionsvektors kann aus dem Expressionsvektor entfernt und in reiner Form isoliert werden.
Beispiel 21
Funktionelle Aktivitäten von gereinigtem ICAM-1
In Zellen wirkt ICAM-1 normalerweise als Oberflächenprotein, das mit der Zellmembran assoziiert ist. Daher wurde die Funktion von gereinigtem ICAM-1 getestet, nachdem das Molekül zu künstlichen Lipidmembranen (Liposomen oder Vesikel) rekonstituiert worden war, indem man das Protein in mit einem Detergens solubilisierten Lipiden löste und anschließend das Detergens durch Dialyse entfernte. ICAM-1, das auf die vorstehend beschriebene Weise aus JY-Zellen gereinigt und im Detergens Octylglucosid eluiert worden war, wurde zu Vesikeln rekonstituiert. Die ICAM-1 enthaltenden Vesikel wurden mit Glas-Abdeckscheiben oder Kunststoff-Kulturvertiefungen fusioniert, um den Nachweis von Zellen, die an das Protein binden, zu ermöglichen.
Herstellung von Planaren Membranen und kunststoffgebundenen Vesikeln
Vesikel wurden gemäß dem Verfahren von Gay et al. (J. Immunol., Bd. 136 (1986), S. 2026) hergestellt. Kurz zusammengefasst, Ei-Phosphatidylcholin und -Cholesterin wurden in Chloroform gelöst und in einem Molverhältnis von 7:2 vermischt. Das Lipidgemisch wurde durch Rotieren unter einem Stickstoffgasstrom zu einer dünnen Schicht getrocknet und sodann 1 Stunde lyophilisiert, um sämtliche Chloroformspuren zu entfernen. Anschließend wurde die Lipidschicht in 1% Octylglucosid/0,14 M NaCL/20 mM Tris (pH-Wert 7,2) in einer Endkonzentration von 0,1 mM Phosphatidylcholin gelöst. Etwa 10 μg gereinigtes ICAM-1 oder humanes Glycophorin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) als Kontroll-Membranglycoprotein wurden pro 1 ml gelöste Lipide zugesetzt. Die Protein-Lipid-Detergens-Lösung wurde sodann bei 4°C 3-mal gegen 200 Volumenteile 20 mM Tris/0,14 M NacL, pH-Wert 7,2, und 1-mal gegen HBSS dialysiert.
Planare Membranen wurden gemäß dem Verfahren von Brian et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 81 (1984), S. 6159, hergestellt. Glas-Abdeckstreifen (11 mm Durchmesser) wurden 15 Minuten einer Siedebehandlung in einer 1:6-Verdünnung von 7X Detergens (Linbro) unterzogen, über Nacht in destilliertem Wasser gewaschen, in 70% Ethanol eingeweicht und an der Luft getrocknet. Ein 80 μl-Tropfen der Vesikelsuspension mit einem Gehalt an entweder ICAM-1 oder Glycophorin wurde auf den Boden von Vertiefungen einer Clusterplatte mit 24 Vertiefungen gebracht. Die vorbereiteten Glas-Abdeckstreifen ließ man vorsichtig darauf schwimmen. Nach 20- bis 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen mit HBSS gefüllt und die Abdeckstreifen wurden umgedreht, um die planare Membranfläche nach oben zu bringen. Die Vertiefungen wurden sodann gründlich mit HBSS gewaschen, um nicht-gebundene Vesikel zu entfernen. Die planare Membranoberfläche wurde dabei nie der Luft ausgesetzt.
Im Lauf der Versuche mit einer an Glasoberflächen fusionierten planaren Membran wurde festgestellt, dass Vesikel mit einem Gehalt an ICAM-1 direkt an die Kunststoffoberfläche der Gewebekulturplatten mit zahlreichen Vertiefungen binden und ihre funktionelle Aktivität behalten, wie sich durch die spezifische Zellbindung zeigt. Derartige Vesikel werden nachstehend als "kunststoffgebundene Vesikel" (PBV) bezeichnet, da die Natur der an den Kunststoff gebundenen Lipidvesikel nicht bestimmt worden ist. Kunststoffgebundene Vesikel wurden durch Zugabe von 30 μl Vesikelsuspension direkt auf den Boden von Vertiefungen in Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon), anschließendes Inkubieren und Waschen gemäß den Angaben für planare Membranen hergestellt.
Zellhaftungstests
Zellhaftungstests unter Verwendung von planaren Membranen oder kunststoffgebundenen Vesikeln wurden im wesentlichen auf die gleiche Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Zellanzahl und die Volumina für die PBV-Tests auf 1/5 der Werte bei den planaren Membrantests verringert wurden.
T-Lymphozyten von normalen Kontrollen und einem Patienten mit Leukozyten-Adhäsionsdefizit (LAD), dessen Zellen nicht LFA-1 exprimieren können (D. C. Anderson et al., J. Infect. Dis., Bd. 152 (1985), S. 668) wurden präpariert, indem man periphere mononukleare Blutzellen mit 1 μg/ml Concanavalin-A (Con-A) in RMPI-1640 plus 20% FCS bei 5 × 10⁵ Zellen/ml 3 Tage züchtete. Die Zellen wurden sodann 2-mal mit RPMI und 1-mal mit 5 mM Methyl-alpha-D-Mannopyranosid gewaschen, um restliches Lectin von der Zelloberfläche zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen in RPMI/20% FCS mit einem Gehalt an 1 ng/ml rekombinantem IL-2 gezüchtet und 10 bis 22 Tage nach Züchtungsbeginn verwendet.
Um eine Zellbindung an planare Membranen oder PBV festzustellen, wurden Con-A-Blasten, das T-Lymphom SKW-3 und die EBV-transformierten B-Lymphoblastoid-Zelllinien JY (LFA-1-positiv) und die LFA-1-defizitäre Lymphoblastoid-Zelllinie (BBN), abgeleitet von Patient 1, (T. A. Springer et al., J. Exper. Med., Bd. 160 (1986), S. 1901–1918) radioaktiv markiert, indem man 1 × 10⁷ Zellen in 1 ml RMPI-1640/10% FCS mit 100 μCi Na⁵¹CrO₄ 1 Stunde bei 37°C inkubierte, wonach sich 4 Waschvorgänge mit RMPI-1640 anschlossen, um nicht-eingebaute Markierung zu entfernen. Bei Blockierungsversuchen mit monoklonalem Antikörper wurden Zellen oder kunststoffgebundene Vesikel mit 20 μg/ml gereinigtem Antikörper 30 Minuten in RMPI-1640/10% FCS bei 4°C vorbehandelt, wonach sich 4 Waschvorgänge zur Entfernung von nicht-gebundenem Antikörper anschlossen. Bei Versuchen über die Einflüsse von zweiwertigen Kationen auf die Zellbindung wurden die Zellen 1-mal mit Ca²⁺, Mg²⁺-freiem HBSS plus 10% dialysiertes FCS gewaschen. CaCl₂ und MgCl₂ wurden in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Bei sämtlichen Versuchen wurden Zellen und planare Membranen oder PBV vorher bei der entsprechenden Temperatur (4°C, 22°C oder 37°C) im entsprechenden Testpuffer voräqulibriert.
Zur Messung der Zellbindung an gereinigtem ICAM-1 wurden mit ⁵¹Cr-markierte Zellen (5 × 10⁵ EBV-Transformanten in planaren Membrantests; 1 × 10⁵ EBV-Transformanten oder SKW-3-Zellen, 2 x 10⁵ Con-A-Blasten bei PBV-Tests) 2 Minuten mit 25 × g auf planare Membranen oder PBV zentrifugiert, wonach sich eine 1-stündige Inkubation bei 4°C, 22°C oder 37°C anschloss. Nach der Inkubation wurden nicht-gebundene Zellen durch 8 Zyklen unter Auffüllen und Absaugen von Puffer, der auf die entsprechende Temperatur voräquilibriert worden war, entfernt. Gebundene Zellen wurden quantitativ durch Auflösen der Inhalte von Vertiefungen mit 0,1 N NaOH/1% Triton X-100 und Zählen in einem gamma-Zählgerät bestimmt. Die prozentuale Zellbindung wurde ermittelt, indem man den cpm-Wert von gebundenen Zellen durch den eingesetzten zellassoziierten cpm-Wert dividierte. Bei planaren Membrantests wurde der eingesetzte cpm-Wert auf das Verhältnis der Oberfläche von Abdeckstreifen im Vergleich zur Oberfläche der Kulturvertiefungen korrigiert.
Bei diesen Tests gingen EBV-transformierte B-Lymphoblastoidzellen, SKW-3-T-Lymphomzellen und Con-A-T-Lymphoblasten eine spezifische Bindung an ICAM-1 in künstlichen Membranen ein (11 und 12). Die Bindung war spezifisch, da die Zellen nur sehr schlecht an planare Kontrollmembranen oder Vesikel mit einem Gehalt an äquivalenten Mengen eines anderen humanen Zelloberflächen-Glycoproteins, nämlich Glycophorin, banden. Ferner gingen LFA-1-positive EBV-Transformanten und Con-A-Blasten eine Bindung ein, während ihre LFA-1-negativen Gegenstücke nicht zur Bindung in erheblichem Ausmaß befähigt waren, was belegt, dass die Bindung von der Gegenwart von LFA-1 an den Zellen abhängig ist.
Sowohl die Spezifität der Zellbindung als auch die Abhängigkeit von zellulärem LFA-1 wurde bei monoklonalen Antikörper-Blockierversuchen bestätigt (13). Die Bindung von JY-Zellen konnte um 97% gehemmt werden, wenn ICAM-1 enthaltende PBV mit monoklonalem anti-ICAM-1-Antikörper RR1/1 vorbehandelt wurden. Eine Vorbehandlung der Zellen mit dem gleichen Antikörper hatte nur einen geringen Einfluss. Umgekehrt hemmte der monoklonale anti-LFA-1-Antikörper TS1/18 die Bindung um 96%, jedoch nur wenn die Zellen, aber nicht die PBV vorbehandelt worden waren. Ein Kontrollantikörper TS2/9, der mit LFA-3 (einem unterschiedlichen Lymphozyten-Oberflächenantigen) reaktiv war, hatte keine signifikante Hemmwirkung, wenn Zellen oder PBV vorbehandelt wurden. Dieser Versuch belegt, dass ICAM-1 selbst in den künstlichen Membranen und nicht irgendwelche untergeordneten Verunreinigungen die beobachtete zelluläre Haftung vermittelt und dass die Haftung von LFA-1 von der bindenden Zelle abhängig ist.
Die Bindung von Zellen an ICAM-1 in künstlichen Membranen wies ferner zwei weitere charakteristische Eigenschaften des LFA-1-abhängigen Haftungssystems auf: Temperaturabhängigkeit und Bedarf an zweiwertigen Kationen. Wie in 14 gezeigt ist, banden Con-A-Blasten an ICAM-1 in PBV in besonders wirksamer Weise bei 37°C, teilweise bei 22°C und sehr schlecht bei 4°C. Wie in 15 gezeigt ist, war die Bindung vollständig von der Anwesenheit von zweiwertigen Kationen abhängig. Bei physiologischen Konzentrationen reichte Mg²⁺ allein für eine maximale Zellbindung aus, während Ca²⁺ allein nur sehr geringe Bindungsgrade bewirkte. Jedoch verhielt sich Mg²⁺ bei einem Zehntel der normalen Konzentration unter Kombination mit Ca²⁺ synergistisch und rief eine maximale Bindung hervor.
Zusammengefasst lässt sich feststellen, dass die Spezifität der Zellbindung an gereinigtes ICAM-1, das künstlichen Membranen einverleibt ist, die spezifische Hemmung mit monoklonalen Antikörpern und die Erfordernisse in Bezug auf Temperatur und zweiwertige Kationen belegen, dass ICAM-1 einen spezifischen Liganden für das LFA-1-abhängige Haftungssystem darstellt.
Beispiel 22
Expression von ICAM-1 und HLA-DR bei allergischen und toxischen Pflastertestreaktionen
Hautbiopsien von 5 normalen Personen wurden auf ihre Expression von ICAM-1 und HLA-DR untersucht. Es wurde festgestellt, dass zwar die Endothelzellen in einigen Blutgefäßen üblicherweise ICAM-1 exprimierten, dass aber kein ICAM-1 an Keratinozyten von normaler Haut exprimiert wurde. Es wurde keine Färbung auf HLA-DR an einem Keratinozyten von normalen Hautbiopsien beobachtet. Die Kinetik der Expression von ICAM-1 und der Klasse II-Antigene wurde sodann an Zellen in Biopsien von allergischen und toxischen Hautläsionen untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Hälfte der 6 untersuchten Personen Keratinozyten aufwiesen, die ICAM-1 4 Stunden nach Auftragen des Haptens exprimierten (Tabelle 10). Es gab einen Anstieg des prozentualen Anteils von Personen, die ICAM-1 im Laufe der Zeit bei Belastung mit dem Hapten an ihren Keratinozyten exprimierten, sowie einen Anstieg der Intensität der Färbung bis zu 48 Stunden, was auf eine stärkere ICAM-1-Expression pro Keratinozyt hinweist. Tatsächlich ergab zu diesem Zeitpunkt ein Anteil von Keratinozyten in sämtlichen Biopsien eine positive Färbung auf ICAM-1. Nach 72 Stunden (24 Stunden nach Entfernung des Haptens) exprimierten 7 der 8 Personen immer noch ICAM-1 an ihren Keratinozyten, während die Expression von ICAM-1 bei einer Person im Zeitraum von 48 und 72 Stunden verschwand.
Tabelle 10 Kinetik der Induktion von ICAM-1 und HLA-DR an Keratinozyten von allergischen Hauttestbiopsien
Histologisch ergab sich ein Färbemuster für ICAM-1 an Keratinozyten aus Biopsien, die 4 Stunden nach Aufbringen des Haptens entnommen wurden, üblicherweise in Form von kleinen Clustern. Nach 48 Stunden wurde ICAM-1 an der Oberfläche des Großteils der Keratinozyten exprimiert, wobei kein Unterschied zwischen dem Zentrum und der Peripherie der Läsion erkennbar war. Die Intensität der Färbung nahm mit Annäherung der Keratinozyten zum Stratum corneum ab. Dies wurde bei Biopsien festgestellt, die sowohl im Zentrum als auch an der Peripherie der Läsionen entnommen wurden. Ferner war zu diesem Zeitpunkt der Pflastertest positiv (Infiltration, Erythem und Vesikel). Kein Unterschied in der ICAM-1-Expression wurde festgestellt, wenn verschiedene Haptene auf empfindliche Personen aufgebracht wurden. Zusätzlich zu Keratinozyten wurde ICAM-1 auch an einigen mononuklearen Zellen und Endothelzellen an der Läsionsstelle exprimiert.
Die Expression von HLA-DR an Keratinozyten in den allergischen Hautläsionen war weniger häufig als die von ICAM-1. Keine der Personen wies Läsionen mit Keratinozyten auf, die 24 Stunden nach Aufbringen des Haptens eine positive Färbung auf HLA-DR ergaben. Tatsächlich wiesen nur 4 Biopsieproben Keratinozyten auf, die HLA-DR exprimierten. Keine Biopsie wies Keratinozyten auf, die positiv auf HLA-DR und negativ auf ICAM-1 waren (Tabelle 10).
Im Gegensatz zur allergischen Pflastertestläsion ergab die toxische Pflastertestläsion bei Induktion mit Crotonöl oder Natriumlaurylsulfat Keratinozyten, die zu sämtlichen getesteten Zeitpunkten nur wenig, wenn überhaupt ICAM-1 auf ihren Oberflächen aufwiesen (Tabelle 11). Tatsächlich erwies sich der Zeitpunkt von 48 Stunden nach dem Aufbringen des Pflasters als der optimale Zeitpunkt für die ICAM-1-Expression bei den Personen mit dem allergischen Pflastertest, wobei nur eine der 14 Personen mit dem toxischen Pflastertest in ihren Läsionen Keratinozyten aufwies, die ICAM-1 exprimierten. Ferner wurde im Gegensatz zu den Biopsien beim allergischen Pflastertest kein HLA-DR an Keratinozyten der Läsionen des toxischen Pflastertests exprimiert.
Diese Daten zeigen, dass ICAM-1 bei Entzündungen auf Immunbasis und nicht bei Entzündungen auf toxischer Basis exprimiert wird. Somit kann die Expression von ICAM-1 dazu herangezogen werden, zwischen Entzündungen auf immunologischer Basis und Entzündungen auf toxischer Basis zu unterscheiden, z. B. bei akutem Nierenversagen bei Personen mit Nierentransplantation, wo die Feststellung schwierig ist, ob das Versagen auf eine Abstoßung oder auf eine Nephrotoxizität des immunosuppressiven therapeutischen Mittels zurückzuführen ist. Eine renale Biopsie und Bestimmung der Hochregelung der ICAM-1-Expression ermöglicht eine Differenzierung zwischen Abstoßungen auf immunologischer Basis und Toxizitätsreaktionen auf nicht-immunologischer Basis.
Tabelle 11 Kinetik der Induktion von ICAM-1 und HLA-DR an Keratinozyten von Biopsien des toxischen Pflastertests
Beispiel 23
Expression von ICAM-1 und HLA-DR bei gutartigen Hauterkrankungen
Zellen von Hautbiopsien von Läsionen von Patienten mit verschiedenen Typen entzündlicher Hauterkrankungen wurden auf die Expression von ICAM-1 und HLA-DR untersucht. Ein Teil von Keratinozyten in Biopsien von allergischem Kontaktekzem, Pemphigoid/Pemphigus und Lichen planus exprimierten ICAM-1. Lichen planus-Biopsien zeigten die intensivste Färbung mit einem ähnlichen oder noch stärkeren Muster, als es bei allergischen Pflastertestbiopsien nach 48 Stunden zu erkennen ist (Tabelle 12). Übereinstimmend mit den Ergebnissen beim allergischen Pflastertest war die intensivste ICAM-1-Färbung an Stellen einer schweren mononuklearen Zellinfiltration erkennbar. Ferner waren 8 von 11 der getesteten Lichen planus-Biopsien positiv auf eine HLA-DR-Expression an Keratinozyten.
Die Expression von ICAM-1 an Keratinozyten von Hautbiopsien von Patienten mit Exanthem und Nesselsucht war weniger stark ausgeprägt. Nur 4 der 7 getesteten Patienten mit diesen Krankheiten wiesen Keratinozyten auf, die ICAM-1 an der Läsionsstelle exprimierten. Eine HLA-DR-Expression wurde nur bei einem Patienten festgestellt und dies in Verbindung mit ICAM-1.
Endothelzellen und ein Teil des mononuklearen Zellinfiltrats von sämtlichen getesteten gutartigen entzündlichen Hauterkrankungen exprimierten ICAM-1 in unterschiedlichem Ausmaß.
Tabelle 12 Expression von ICAM-1 und HLA-DR an Keratinozyten von gutartigen Hautkrankheiten
Beispiel 24
Expression von ICAM-1 an Keratinozyten von psoriatischen Hautläsionen Die Expression von ICAM-1 in Hautbiopsien von 5 Patienten mit Psoriasis wurde vor Behandlungsbeginn und periodisch im Verlauf einer PUVA-Behandlung untersucht. Biopsien wurden von 5 Patienten mit klassischer Psoriasis, die histologisch bestätigt war, erhalten. Die Biopsien wurden vor der PUVA-Behandlung und anschließend zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen. PUVA wurde 3- bis 4-mal wöchentlich gegeben. Biopsien wurden am Rand der psoriatischen Plaques bei 5 Patienten entnommen. Ferner wurden Biopsien von klinisch normaler Haut bei 4 der Patienten entnommen.
Frische Hautbiopsieproben wurden eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. 6 Mikron-Kryostatschnitte wurden über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet, 10 Minuten in Aceton fixiert und entweder sofort gefärbt oder in Aluminiumfolie eingewickelt und bis zur Färbung bei –80°C gelagert.
Die Färbung wurde folgendermaßen durchgeführt: Schnitte wurden mit monoklonalen Antikörpern inkubiert und durch ein dreistufiges Immunoperoxidase-Verfahren gefärbt (H. Stein et al., Adv. Cancer Res., Bd. 42 (1984), S. 67–147), wobei Diaminobenzidin·H₂O₂ als Substrat verwendet wurde. Tonsillen und Lymphknoten wurden als positive Kontrolle für die anti-ICAM-1 und HLA-DR-Färbung verwendet. Gewebe, das in Abwesenheit von primärem Antikörper eine Färbung ergab, wurde als negative Kontrolle verwendet.
Die monoklonalen Antikörper gegen HLA-DR wurden von der Fa. Becton Dickinson (Mountainview, Kalifornien) bezogen. Beim monoklonalen anti-ICAM-1-Antikörper handelte es sich um R6-5-D6. Peroxidase-konjugiertes Kaninchen-anti-Maus-Ig und Peroxidase-konjugiertes Schweine-anti-Kaninchen-Ig wurden von der Fa. DAKAPATTS, Kopenhagen, Dänemark, bezogen. Diaminobenzidintetrahydrochlorid wurde von der Fa. Sigma (St. Louis, Mo) bezogen.
Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass die Endothelzellen in einigen Blutgefäßen ICAM-1 sowohl in erkrankter als auch in normaler Haut exprimieren, wobei die Intensität der Färbung und die Anzahl der Blutgefäße, die ICAM-1 exprimieren, in den psoriatischen Hautläsionen erhöht sind. Außerdem variierte das Expressionsmuster von ICAM-1 in Keratinozyten von unbehandelten psoriatischen Hautläsionen der 5 Patienten nur geringfügig von kleinen Clustern von sich färbenden Zellen zu zahlreichen gefärbten Keratinozyten. Im Verlauf der PUVA-Behandlung zeigte die ICAM-1-Expression bei 2 der Patienten (Patienten 2 und 3) eine ausgeprägte Verringerung, wobei eine klinische Remission vorausging oder gleichzeitig eintrat (Tabelle 13). Die Patienten 1, 4 und 5 zeigten Verringerungen und Erhöhungen der ICAM-1-Expression während der PUVA-Behandlung unter korrelierenden klinischen Remissionen bzw. Rückfällen. Es gab keine ICAM-1-Expression an Keratinozyten von normaler Haut vor oder nach PUVA-Behandlung. Dies zeigt, dass PUVA ICAM-1 an Keratinozyten aus normaler Haut nicht induziert.
Bemerkenswert war die Feststellung, dass die Dichte des mononuklearen Zellinfiltrats mit dem Betrag der ICAM-1-Expression an Keratinozyten korrelierte. Dies galt sowohl für eine verringerte Anzahl an mononuklearen Zellen in Läsionen während der PUVA-Behandlung, wenn auch die ICAM-1-Expression verschwand, als auch für eine erhöhte Anzahl an mononuklearen Zellen während der PUVA-Behandlung, wenn die ICAM-1-Expression an Keratinozyten ausgeprägter war. Endothelzellen und dermale mononukleare Zellen waren ebenfalls ICAM-1-positiv. Bei klinisch normaler Haut war die ICAM-1-Expression auf Endothelzellen ohne Markierung von Keratinozyten beschränkt.
Die Expression von HLA-DR an Keratinozyten war variabel. Es gab keine HLA-DR-positive Biopsie, die nicht auch ICAM-1-positiv war.
Zusammengefasst lässt sich feststellen, dass diese Ergebnisse belegen, dass vor der Behandlung die ICAM-1-Expression an den Keratinozyten ausgeprägt ist und mit einem dichten mononuklearen zellulären Infiltrat korreliert. Während der PUVA-Behandlung ist eine ausgeprägte Abnahme der ICAM-1-Färbung parallel zur klinischen Besserung erkennbar. Histologisch verringerte sich auch das dermale Infiltrat. Wenn ein klinischer Rückfall während der Behandlung auftrat, war die Expression von ICAM-1 an den Keratinozyten erhöht, wie auch die Dichte des dermalen Infiltrats. Wenn während der Behandlung eine klinische Remission erkennbar war, trat eine gleichzeitige Verringerung der ICAM-1-Färbung an den Keratinozyten sowie eine Verringerung des dermalen Infiltrats auf. Somit entsprach die Expression von ICAM-1 an Keratinozyten der Dichte des mononuklearen zellulären Infiltrats der Dermis. Diese Daten zeigen, dass die klinische Reaktion auf eine PUVA-Behandlung zu einer ausgeprägten Verringerung der ICAM-1-Expression an Keratinozyten parallel zu einem mäßigeren Abfall der mononuklearen Zellen führte. Dies zeigt, dass die ICAM-1-Expression an Keratinozyten für das Entstehen und die Aufrechterhaltung des dermalen Infiltrats verantwortlich ist und dass eine PUVA-Behandlung ICAM-1 herunterreguliert, was wiederum das dermale Infiltrat und die entzündliche Reaktion abschwächt. Die Daten zeigen ferner, dass während der PUVA-Behandlung an Keratinozyten eine variable HLA-DR-Expression stattfand.
Die Expression von ICAM-1 an Keratinozyten von psoriatischen Läsionen korreliert mit der klinischen Schwere der Läsion sowie mit der Größe des dermalen Infiltrats. Somit spielt ICAM-1 eine zentrale Rolle bei Psoriasis und eine Hemmung seiner Expression und/oder eine Hemmung seiner Wechselwirkung mit dem CD 18-Komplex an mononuklearen Zellen stellt eine wirksame Behandlung der Krankheit dar. Ferner stellt eine Überwachung der ICAM-1-Expression an Keratinozyten ein wirksames Werkzeug für die Diagnose und Prognose sowie bei der Bewertung des Therapieverlaufs bei Psoriasis dar.
Tabelle 13 Sequenzielle ICAM-1-Expression durch Keratinozyten in psoriatischen Hautläsionen (PS) und klinisch normaler Haut (N) vor und nach PUVA-Behandlung Patient Nr
Beispiel 25
Expression von ICAM-1 und HLA-DR bei malignen Hauterkrankungen
Im Gegensatz zu Läsionen von gutartigen Hautzuständen war die Expression von ICAM-1 an Keratinozyten von malignen Hautläsionen wesentlich stärker variabel (Tabelle 14). Von den 23 untersuchten T-Zelllymphomen wurden nur in 14 Fällen ICAM-1-positive Keratinozyten identifiziert. Es gab eine Tendenz bei Keratinozyten aus Biopsien von Mycosis fungoides-Läsionen zum Verlust ihrer ICAM-1-Expression bei Fortschreiten der Krankheit zu späteren Stadien. Jedoch wurde eine ICAM-1-Expression an einem variierenden Anteil des mononuklearen Zellinfiltrats an den meisten der kutanen T-Zelllymphon-Läsionen beobachtet. Unter den restlichen untersuchten Lymphomen wiesen 4 von 8 Keratinozyten auf, die ICAM-1 exprimierten. Von den untersuchten 29 Patienten mit malignen Hauterkrankungen wiesen 5 Keratinozyten auf, die HLA-DR ohne Expression von ICAM-1 exprimierten (Tabelle 14).
Tabelle 14 Expression von ICAM-1 und HLA-DR an Keratinozyten von malignen Hautkrankheiten
Beispiel 26
Einfluss von anti-ICAM-1-Antikörpern auf die Proliferation von humanen peripheren mononuklearen Blutzellen
Humane periphere mononukleare Blutzellen werden induziert, um das Vorliegen und die Erkennung von Antigenen oder Mitogenen zu fördern. Bestimmte Moleküle, wie das Mitogen Concanavalin A oder der T-Zellen bindende Antikörper OKT3, verursachen eine nicht spezifische Proliferation von peripheren mononuklearen Blutzellen.
Humane periphere mononukleare Blutzellen sind insofern heterogen, als sie aus Subpopulationen von Zellen zusammengesetzt sind, die zur Erkennung von spezifischen Antigenen befähigt sind. Wenn eine periphere mononukleare Blutzelle, die zur Erkennung eines speziellen Antigens befähigt ist, auf dieses Antigen trifft, wird die Proliferation dieser Subpopulation von mononuklearen Zellen induziert. Tetanus-Toxoid und Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin sind Beispiele für Antigene, die durch Subpopulationen von peripheren mononuklearen Zellen erkannt werden, jedoch nicht durch sämtliche peripheren mononuklearen Zellen von sensibilisierten Personen erkannt werden.
Die Fähigkeit des monoklonalen anti-ICAM-1-Antikörpers R6-5-D6 zur Hemmung der proliferativen Reaktionen auf humane periphere mononukleare Blutzellen in Systemen, die eine Zell-Zell-Haftung benötigen, wurde getestet.
Periphere mononukleare Blutzellen wurden an Ficoll-Paque (Pharmacia)-Gradienten gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Im Anschluss an die Gewinnung der Grenzfläche wurden die Zellen 3-mal mit RMPI-1640-Medium gewaschen und in flachbödigen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml in RMPI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM Glutamin und Gentamicin (50 μg/ml) ergänzt war, gezüchtet.
Antigen, das T-Zell-Mitogen Concanavalin A (0,25 μg/ml); der T-Zellen bindende Antikörper OKT3 (0,001 μg/ml)M Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (10 g/ml); oder Tetanus-Toxoid (1:100-Verdünnung der Quelle) wurden zu Zellen gegeben, die auf die vorstehend beschriebene Weise entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von anti-ICAM-1-Antikörper (R6-5-D6, Endkonzentration 5 g/ml) gezüchtet wurden. Die Zellen wurden 3,5 Tage (Versuch mit Concanavalin A), 2,5 Tage (Versuch mit OKT3) oder 5,5 Tage (Versuch mit Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Versuch mit Tetanus-Toxoid) vor Beendigung des Tests gezüchtet.
18 Stunden vor Testende wurden die Kulturen mit 2,5 μCi3H-Thymidin versetzt. Die zelluläre Proliferation wurde durch Messen des Einbaus von Thymidin in DNA durch periphere mononukleare Blutzellen bestimmt. Eingebautes Thymidin wurde gewonnen und in einem Flüssigszintillationszähler (Merluzzi et al., J. Immunol., Bd. 139 (1987), S. 166–168) gezählt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in 16 (Versuch mit Concanavalin A), 17 (Versuch mit OKT3), 18 (Versuch mit Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin) und 19 (Versuch mit Tetanus-Toxoid) dargestellt.
Es wurde festgestellt, dass der anti-ICAM-1-Antikörper proliferative Reaktionen des nicht-spezifischen T-Zellen-Mitogens ConA, des nicht-spezifischen T-zellassoziierten Antigens OKT3 und der spezifischen Antigene Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin und Tetanus-Toxoid in mononuklearen Zellen hemmt.
Die Hemmung durch anti-ICAM-1-Antikörper war vergleichbar mit der von anti-LFA-1-Antikörper, was darauf schließen lässt, dass ICAM-1 einen funktionellen Liganden von LFA-1 darstellt und dass der Antagonismus von ICAM-1 die spezifischen Reaktionen des Abwehrsystems hemmt.
Beispiel 27
Einfluss von anti-ICAM-1-Antikörper auf die gemischte Lymphozytenreaktion
Wie vorstehend erörtert, ist ICAM-1 für wirksame zelluläre Wechselwirkungen während einer Immunreaktion, die durch eine LFA-1-abhängige Zellhaftung vermittelt wird, erforderlich. Die Induktion von ICAM-1 bei Immunreaktionen oder entzündlichen Krankheiten ermöglicht die Wechselwirkung von Leukozyten untereinander und mit Endothelzellen.
Wenn Lymphozyten von zwei nicht miteinander verwandten Personen miteinander gezüchtet werden, werden eine Blastentransformation und Zellproliferation der Lymphozyten beobachtet. Diese Reaktion von einer Population von Lymphozyten auf die Anwesenheit einer zweiten Population von Lymphozyten ist als gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) bekannt und ist analog zur Reaktion von Lymphozyten auf die Zugabe von Mitogenen (Immunology, The Science of Self-Nonself Discrimination, J. Klein, John Wiley & Sons, NY (1982), S. 453–458).
Es wurden Versuche durchgeführt, um den Einfluss von monoklonalen anti-ICAM-1-Antikörpern auf die humane MLR zu bestimmen. Diese Versuche wurden folgendermaßen durchgeführt. Peripheres Blut wurde durch Venenpunktur von normalen gesunden Spendern gewonnen. Das Blut wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt und bei Raumtemperatur 1:1 mit Puck G (GIBCO)ausgewogener Salzlösung (BSS) verdünnt. Das Blutgemisch (20 ml) wurde über 15 ml eines Ficoll/Hypaque-Dichtegradienten (Pharmacia, Dichte = 1,078, Raumtemperatur) geschichtet und 20 Minuten mit 1000 g × zentrifugiert. Die Grenzfläche wurde sodann gewonnen und 3-mal in Puck G gewaschen. Die Zellen wurden in einem Hämozytometer gezählt und in RMPI-1640-Kulturmedium (GIBCO) mit einem Gehalt an 0,5% Gentamicin, 1 mM L-Glutamin (GIBCO) und 5 wärmeinaktivierten (56°C, 30 min) humanen AB-Seren (Flow Laboratories) (nachstehend als RPMI-Kulturmedium bezeichnet) resuspendiert.
Bei diesen Versuchen wurde Mäuse-anti-ICAM-1 (R6-5-D6) verwendet. Sämtliche monoklonalen Antikörper (präpariert aus Aszites von der Fa. Jackson Immunoresearch Laboratories, Boston, MA) wurden als gereinigte Ig-Präparate verwendet.
Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden im Medium mit 6,25 × 10⁵ Zellen/ml in Linbro-Rundboden-Mikrotiterplatten (#76-013-05) gezüchtet. Stimulatorzellen eines getrennten Spenders wurden mit 1000 R bestrahlt und in der gleichen Konzentration mit den Responderzellen gezüchtet. Das Gesamtvolumen pro Kultur betrug 0,2 ml. Kontrollen umfassten Responderzellen allein sowie Stimulatorzellen allein. Die Kulturplatten wurden bei 37°C 5 Tage in einer befeuchteten Luftatmosphäre mit einem Gehalt an 5% CO₂ inkubiert. Die Vertiefungen wurden mit 0,5 μCi tritiertem Thymidin (³HT) (New England Nuclear) für die mindestens 18-stündige Kultur gepulst. In einigen Fällen wurde eine Zweiweg-MLR durchgeführt. Die Vorgehensweise war die gleiche, mit der Ausnahme, dass die Zellen des zweiten Spenders nicht durch Bestrahlung inaktiviert wurden.
Die Zellen wurden an Glasfaserfiltern unter Verwendung eines automatisierten Mehrfachproben-Erntegeräts (Skatron, Norwegen) geerntet und mit Wasser und Methanol gespült. Die Filter wurden im Trockenschrank getrocknet und in Aquasol in einem Flüssigszintillationszähler der Fa. Beckman (LS-3801) gezählt. Die Ergebnisse sind als durchschnittliche CPM-Werte ± Standardfehler von 6 Einzelkulturen angegeben.
Tabelle 15 zeigt, dass gereinigte, monoklonale anti-ICAM-1-Antikörper die MLR in dosisabhängiger Weise hemmten, wobei eine signifikante Suppression bei 20 ng/ml auftrat. Gereinigtes Mäuse-IgG wies eine geringe oder gar keine suppressive Wirkung auf. Die Suppression der MLR durch den monoklonalen anti-ICAM-1-Antikörper erfolgt, wenn der Antikörper innerhalb der ersten 24 Stunden der Züchtung zugesetzt wird (Tabelle 16).
Tabelle 15 Einfluss von anti-ICAM-1-Antikörper auf die Einweg-Lymphozytenreaktion
Tabelle 16 Zeitpunkt der Zugabe von anti-ICAM-1
Zusammengefasst lässt sich feststellen, dass die Fähigkeit des Antikörpers gegen ICAM-1 zur Hemmung der MLR zeigt, dass monoklonale ICAM-1-Antikörper von therapeutischem Wert bei akuten Transplantatabstoßungen sind. Monoklonale ICAM-1-Antikörper sind auch von therapeutischem Wert bei verwandten, immunologisch vermittelten Störungen, die von LFA-1/ICAM-1-regulierten Zell-Zell-Wechselwirkungen abhängen.
Die hier beschriebenen Versuche zeigen, dass die Zugabe von monoklonalen Antikörpern zu ICAM-1 die gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) hemmt, wenn die Zugabe während der ersten 24 Stunden der Reaktion erfolgt. Ferner wird ICAM-1 an humanen peripheren Blutmonozyten während der in vitro-Züchtung hochgeregelt. Außerdem wurde festgestellt, dass ICAM-1 an humanen ruhenden peripheren Blutlymphozyten oder Monozyten nicht exprimiert wird. ICAM-1 wird an den Monozyten von gezüchteten Zellen allein oder von Zellen, die zusammen mit nichtverwandten Spenderzellen in einer gemischten Lymphozytenreaktion gezüchtet werden, unter Anwendung herkömmlicher fließzytometrischer Analysen hochgeregelt. Diese Hochregelung von ICAM-1 an Monozyten kann als ein Indikator für Entzündungen herangezogen werden, insbesondere wenn ICAM-1 an frischen Monozyten von Personen mit akuter oder chronischer Entzündung exprimiert wird.
Die Spezifität von ICAM-1 in Bezug auf aktivierte Monozyten und die Fähigkeit des Antikörpers gegen ICAM-1 zur Hemmung einer MLR lassen darauf schließen, dass monoklonale ICAM-1-Antikörper von diagnostischem und therapeutischem Wert bei akuten Transplantatabstoßungen und verwandten, immunologisch vermittelten Störungen, die Zell-Zell-Wechselwirkungen erfordern, sind.
Beispiel 28
Synergistische Wirkung der gemeinsamen Verabreichung von anti-ICAM-1- und anti-LFA-1-Antikörpern
Wie in Beispiel 27 gezeigt, wird die MLR durch anti-ICAM-1-Antikörper gehemmt. Die MLR kann auch durch den anti-LFA-1-Antikörper gehemmt werden. Um festzustellen, ob die kombinierte Verabreichung von anti-ICAM-1- und anti-LFA-1-Antikörpern eine verstärkte oder synergistische Wirkung besitzt, wurde ein MLR-Test (durchgeführt gemäß Beispiel 27) in Gegenwart verschiedener Konzentrationen der beiden Antikörper durchgeführt.
Dieser MLR-Test ergab, dass die Kombination von anti-ICAM-1 und anti-LFA-1 bei Konzentrationen, bei denen keiner der Antikörper allein die MLR drastisch hemmt, eine signifikant stärkere Hemmung der MLR-Reaktion bewirkt (Tabelle 17). Dieses Ergebnis zeigt, dass Therapien, bei denen zusätzlich die Verabreichung von anti-ICAM-1-Antikörper (oder von Fragmenten davon) und von anti-LFA-1-Antikörper (oder von Fragmenten davon) die Fähigkeit besitzen, eine verbesserte entzündungshemmende Therapie zu erreichen. Eine derartig verbesserte Therapie erlaubt die Verabreichung geringerer Dosen von Antikörper, als sie ansonsten therapeutisch wirksam wären, und ist in Fällen, wo hohe Konzentrationen an einzelnen Antikörpern eine antiidiotypische Reaktion herbeiführen, von Bedeutung.
Tabelle 17 Einfluss verschiedener Dosen von anti-ICAM-1 und (R3.1) anti-LFA-1 auf die gemischte Lymphozytenreaktion
Beispiel 29
Additive Wirkungen der kombinierten Verabreichung von suboptimalen Dosen an anti-ICAM-1 und anderen immunosuppressiven Mitteln auf die MLR
Wie in Beispiel 28 gezeigt, wird die MLR durch Kombinationen von anti-ICAM-1- und anti-LFA-1-Antikörpern gehemmt. Um festzustellen, ob die kombinierte Verabreichung von anti-ICAM-1 und anderen immunosuppressiven Mitteln (wie Dexamethason, Azathioprin, Cyclosporin A oder Steroiden (z. B. Prednison und dergl.)) ebenfalls eine verstärkte Wirkung besitzt, wurden MLR-Tests unter Verwendung suboptimaler Konzentrationen (d. h. Konzentrationen, die unter der optimalen Konzentration liegen, mit der die Person mit dem Mittel allein versorgt wird) von R6-5-D6 in Verbindung mit anderen immunosuppressiven Mitteln gemäß der Vorgehensweise von Beispiel 27 durchgeführt.
Die Daten zeigen, dass die Hemmwirkungen von R6-5-D6 mindestens additiv zu den Hemmwirkungen von suboptimalen Dosen von Dexamethason (Tabelle 18), Azathioprin (Tabelle 19) und Cyclosporin A (Tabelle 20) sind. Dies lässt darauf schließen, dass anti-ICAM-1-Antikörper eine Senkung der erforderlichen Dosen von bekannten immunosuppressiven Mitteln bewirken können, wodurch deren toxische Nebenwirkungen vermindert werden. Bei Verwendung eines anti-ICAM-1-Antikörpers (oder eines Fragments davon) zur Erzielung einer derartigen Immunosuppression ist es möglich, die Verabreichung des Antikörpers (oder eines Fragments davon) mit entweder einem einzelnen zusätzlichen immunosuppressiven Mittel oder mit einer Kombination von mehr als einem zusätzlichen immunosuppressiven Mittel zu kombinieren.
Tabelle 18 Einfluss von anti-ICAM-1- und Dexamethason auf die humane MLR
Tabelle 19 Einfluss von anti-ICAM-1- und Azathioprin auf die humane MLR
Tabelle 20 Einfluss von anti-ICAM-1- und Cyclospprin A auf die humane MLR
Beispiel 30
Einfluss von anti-ICAM-1-Antikörper auf die Unterdrückung der Abstoßung von transplantierten, allogenen Organen
Um den Einfluss von anti-ICAM-1-Antikörper bei der Unterdrückung der Abstoßung eines allogenen transplantierten Organs zu zeigen, erhielten Cynomolgus-Affen eine Transplantation von allogenen Nieren gemäß dem Verfahren von Cosimi et al. (Transplant. Proc., Bd. 13 (1981), S. 499–503) mit der Modifikation, dass Valium und Ketamin als Anästhetika verwendet wurden.
Dabei wurde die Nierentransplantation im wesentlichen auf die folgende Weise durchgeführt. Heterotrope renale Allotransplantationen wurden in Cynomolgus-Affen mit einem Gewicht von 3–5 kg im wesentlichen gemäß den Angaben von Marquet (Marquet et al., Medical Primatology, Teil II, Basel, Karger, (1972), S. 125) nach Induktion einer Anästhesie mit Valium und Ketamin durchgeführt. End-Seite-Anastomosen von renalen Spendergefäßen auf einem Flecken von Aorta oder Vena cava wurden unter Verwendung einer 7-0-Prolene-Naht aufgebaut. Der Spender-Ureter wurde "gespatelt" und in die Blase auf extravesikalem Wege implantiert (Y. Taguchi et al., in Dausset et al., (Hrsg.), Advances in Transplantation, Baltimore, Williams & Wilkins, (1968), S. 393). Die Nierenfunktion wurde wöchentlich oder im Abstand von 2 Wochen durch Bestimmung von Serumkreatinin bewertet. Ferner wurden häufige Fremdtransplantat-Biopsien für die histopathologische Prüfung gewonnen und vollständige Autopsien an sämtlichen nicht-überlebenden Empfängern durchgeführt. Bei den meisten Empfängern wurde eine bilaterale Nephrektomie zum Zeitpunkt der Transplantation vorgenommen. Der anschließende urämische Tod wurde als Endpunkt der Allotransplantat-Überlebenszeit angesehen. Bei einigen Empfängern wurde eine unilaterale native Nephrektomie und eine kontralaterale ureterale Ligation zum Zeitpunkt der Transplantation vorgenommen. Wenn die Fremdtransplantat-Abstoßung eintrat, wurde die Ligatur am autologen Ureter entfernt, was zu einer Wiederherstellung der normalen Nierenfunktion führte und die Möglichkeit eröffnete, die immunologische Überwachung des Empfängertiers fortzusetzen.
Monoklonaler Antikörper R6-5-D6 wurde 12 Tage lang täglich verabreicht, beginnend 2 Tage vor der Transplantation und zwar in einer Dosis von 1–2 mg/kg/Tag. Die Kreatinin-Serumspiegel wurden zur Überwachung der Abstoßung periodisch getestet. Der Einfluss von anti-ICAM-1-Antikörper auf die Abstoßung der allogenen Nieren durch das Immunsystem ist in Tabelle 21 gezeigt.
Tabelle 21 R6-5-D6-Aktivität in Bezug auf die Verlängerung der Überlebenszeit des renalen Fremdtransplantats bei prophylaktischer Vorgehensweise beim Cynomolgus-Affen^a
Die Ergebnisse zeigen, dass R6-5-D6 eine Verlängerung der Lebensdauer von Affen, die allogene Nierentransplantate erhalten, bewirkt.
Beispiel 31
Einfluss von anti-ICAM-1-Antikörper auf die Unterdrückung von akuten Abstoßungen von transplantierten Organen
Um zu zeigen, dass anti-ICAM-1-Antikörper in einem akuten Modell der Transplantatabstoßung wirksam ist, wurde R6-5-D6 auch in einem therapeutischen oder akuten Nierenabstoßungsmodell getestet. Bei diesem Modell erhielten Affen eine Nierentransplantation (unter Anwendung der in Beispiel 30 beschriebenen Vorgehensweise) und wurden perioperativ mit 15 mg/kg Cyclosporin A (CyA) auf intramuskulärem Wege behandelt, bis eine stabile Nierenfunktion erreicht wurde. Die Dosis an CyA wurde sodann im Abstand von 2 Wochen in Schritten von 2,5 mg/kg verringert, bis eine Abstoßung eintrat, wie durch einen Anstieg der Kreatinin-Blutspiegel erkennbar war. Zu diesem Zeitpunkt wurde R6-5-D6 10 Tage lang verabreicht. Die Überlebensdauer wurde überwacht. Die Feststellung ist wichtig, dass bei dieser Vorgehensweise die Dosis an CyA suboptimal bleibt, da sie nicht verändert wird, wenn die akute Abstoßungsepisode erfolgt. Bei diesem Modell überleben historische Kontrollen (N = 5) ohne Antikörper-Behandlung 5–14 Tage ab dem Einsetzen der Abstoßungsepisode. Bis jetzt wurden 6 Tiere unter Verwendung von R6-5-D6 bei dieser Vorgehensweise getestet (Tabelle 22). Zwei dieser Tiere sind noch am Leben (M12, 31 Tage und M5, 47 Tage nach der Verabreichung von R6-5-D6). Zwei Tiere lebten 38 und 55 Tage nach Beginn der R6-5-D6-Therapie und zwei Tiere starben an anderen Ursachen und nicht an der akuten Abstoßung (ein Tier starb aufgrund von CyA-Toxizität und das andere während der Verabreichung von R6-5-D6 unter Anästhesie). Dieses Modell kommt der klinischen Situation näher, bei dem man zu Beginn R6-5-D6 verwenden würde.
Tabelle 22 Aktivität von R6-5-D6 auf die Verlängerung der Überlebenszeit von renalen Fremdtransplantaten bei therapeutischer Vorgehensweise bei Cynomolgus-Affen^a
Beispiel 32
Genetische Konstruktion und Expression von geschnittenen Derivaten von ICAM-1
Im natürlichen Zustand handelt es sich bei ICAM-1 um ein an die Zellmembran gebundenes Protein mit einem Gehalt an einer extrazellulären Region von 5-Immunoglobulin-artigen Domänen, einer Transmembrandomäne und einer zytoplasmatischen Domäne. Es war wünschenswert, funktionelle Derivate von ICAM-1 zu konstruieren, bei denen die Transmembrandomäne und/oder die zytoplasmatische Domäne fehlte, um somit eine lösliche, sezernierte Form von ICAM-1 zu erzeugen. Diese funktionellen Derivate wurden durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese des ICAM-1-Gens unter anschließender Expression in Affenzellen nach Transfektion mit dem mutanten Gen konstruiert.
Mutationen im ICAM-1-Gen, die zu Aminosäuresubstitutionen führten, und/oder geschnittene Derivate wurden gemäß dem Verfahren von T. Kunkel erzeugt (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 82 (1985), S. 488–492). ICAM-1-cDNA, die gemäß den vorstehenden Angaben hergestellt worden war, wurde mit den Restriktionsendonucleasen SalI und KpnI verdaut. Das erhaltene 1,8 kb-DNA-Fragment wurde in den Plasmidvektor CDM8 subkloniert (B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 84 (1987), S. 3365–3369). Ein dut^–, ung^–-Stamm von E. coli (BW313/P3) wurde sodann mit diesem Konstrukt mit der Bezeichnung pCD1.8C transformiert. Eine einzelsträngige, uracilhaltige Matrize wurde aus den Transformanten durch Infektion mit der Helferphage R408 (Stratagene^®) gewonnen. Mutante ICAM-1-cDNAs wurden sodann erzeugt, indem man eine zweite Strangsynthese einem Priming mit einem Oligonucleotid, das nicht-passende Basen enthielt, unterwarf und anschließend einen ung⁺-Wirt (MC1061/P3) mit dem erhaltenen Heteroduplex transformierte. Mutanten wurden durch Screening auf neu erzeugte Endonuclease-Restriktionsstellen, die durch das mutante Oligonucleotid erzeugt worden waren, isoliert. Das mutante ICAM-1-Protein wurde durch Transfektion von Cos-7-Zellen mit der mutanten DNA im eukaryontischen Expressionsvektor CDM8 unter Anwendung üblicher DEAE-Dextran-Verfahren exprimiert (R. F. Selden et al., in: Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., Hrsg.) (1987), S. 9.2.1–9.2.6).
Ein geschnittenes funktionelles Derivat von ICAM-1, bei dem die Transmembran- und zytoplasmatische Domänen fehlten, das aber die extrazelluläre Region mit sämtlichen 5 immunoglobulinartigen Domänen aufwies, wurde hergestellt. Ein mutantes Oligonucleotid mit 30 bp (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) wurde zur Transformation der Codons für die Aminosäuren Tyrosin (Y) und Glutaminsäure (E) an den Positionen 452 bzw. 453 in Phenylalanin (F) und ein translationales Stoppcodon (TAG) verwendet. Die Mutante wurde aufgrund ihrer einzigen Xbal-Restriktionsstelle isoliert und erhielt die Bezeichnung Y452E/F,TAG.
Zur Expression des mutanten Proteins wurden COS-Zellen mit drei mutanten Subklonen (#2, #7 und #8) transfiziert. 3 Tage nach der Transfektion mit den drei mutanten Subklonen wurden die Kulturüberstände und die Zelllysate durch Immunopräzipitation mit monoklonalem anti-ICAM-1-Antikörper RR1/1 und SDS-PAGE analysiert. ICAM-1 wurde aus den Kulturüberständen von Zellen, die mit den mutanten Subklonen #2 und #8 transformiert worden waren, jedoch nicht aus Detergenslysaten dieser Zellen präzipitiert. Das Molekulargewicht des im Kulturüberstand gefundenen ICAM-1 war um etwa 6 kd, bezogen auf die Membranform von ICAM-1, verringert, was mit der vorhergesagten Größe für die mutante DNA übereinstimmt. Somit wird dieses funktionelle Derivat von ICAM-1 als lösliches Protein ausgeschieden. Im Gegensatz dazu wurde ICAM-1 aus Kontrollkultur-Überständen von Zellen, die mit nativem ICAM-1 transfiziert worden waren, nicht immunopräzipitiert, was belegt, dass die Membranform von ICAM-1 nicht von COS-Zellen abgelöst wurde. Ferner wurde kein ICAM-1 entweder aus Kulturüberständen oder aus Zelllysaten von negativen, scheintransfizierten Kontrollzellen immunopräzipitiert.
Das geschnittene ICAM-1, das aus transfizierten Zellen sezerniert worden war, wurde durch Immunoaffinitätschromatographie mit einem ICAM-1-spezifischen Antikörper (R6-5-D6) gereinigt und auf seine funktionelle Aktivität in einem Zellbindungstest getestet. Nach Reinigung in Gegenwart des Detergens Octylglucosid wurden Präparationen mit einem Gehalt an nativem ICAM-1 oder der geschnittenen, sezernierten Form auf eine Endkonzentration von 0,25 Octylglucosid verdünnt (eine Konzentration unterhalb der kritischen Mizellenkonzentration des Detergens). Man ließ diese Präparate von ICAM-1 eine Bindung mit den Oberflächen von Kunststoffplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc) eingehen, um an eine feste Phase gebundenes ICAM-1 zu erzeugen. Nach Auswaschen von nicht-gebundenem Material gingen etwa 75–80% und 83–88% der SKW3-Zellen, die LFA-1 an ihrer Oberfläche trugen, eine spezifische Bindung mit der nativen bzw. mit der geschnittenen Form von ICAM-1 ein. Diese Daten zeigen, dass das sezernierte, geschnittene, lösliche, funktionelle ICAM-1-Derivat sowohl die immunologische Reaktivität als auch die Fähigkeit zur Vermittlung der ICAM-1-abhängigen Haftung, die für natives ICAM-1 charakteristisch sind, behielt.
Ein funktionelles Derivat von ICAM-1, dem nur die zytoplasmatische Domäne fehlte, wurde nach ähnlichen Verfahren hergestellt. Ein Oligonucleotid mit 25 bp (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) wurde dazu verwendet, das Codon für die Aminosäure 476 (Y) in ein translationales TAG-Stoppcodon abzuändern. Die Mutante erhielt die Bezeichnung Y⁴⁷⁶/TAG. Eine Immunopräzipitationsanalyse und SDS-PAGE von Cos-Zellen, die mit der Mutante transfiziert worden waren, ergab eine membrangebundene Form von ICAM-1, deren Molekulargewicht etwa 3 kd unter dem Wert von nativem ICAM-1 lag. Eine indirekte Immunofluoreszenz der mit der Mutante transformierten Cos-Zellen ergab ein punktförmiges Färbemuster ähnlich wie bei nativem ICAM-1, das an LPS-stimulierten humanen Endothelzellen exprimiert worden war. Schließlich gingen die mit der mutanten DNA transfizierten Zellen eine spezifische Bindung mit gereinigtem LFA-1 an Kunststoffoberflächen ein, ähnlich wie Cos-Zellen, die mit nativer ICAM-1-DNA transfiziert worden waren (Tabelle 23).
Tabelle 23 Fähigkeit von Zellen, die ICAM-1 oder ein funktionelles Derivat von ICAM-1 exprimieren, zur Bindung von LFA-1
Beispiel 33
Kartierung von funktionellen ICAM-1-Domänen
Untersuchungen an ICAM-1 ergaben, dass das Molekül 7 Domänen besitzt. 5 dieser Domänen sind extrazellulär (die Domäne 5 befindet sich am nächsten zur Zelloberfläche und die Domäne 1 ist von der Zelloberfläche am weitesten entfernt). Bei einer Domäne handelt es sich um eine Transmembrandomäne und bei einer anderen Domäne um eine zytoplasmatische Domäne (d. h. sie liegt innerhalb der Zelle). Um festzustellen, welche Domänen zur Fähigkeit von ICAM-1 zur Bindung an LFA-1 beitragen, können Epitop-Kartierungsuntersuchungen herangezogen werden. Zur Durchführung dieser Untersuchungen werden verschiedene Deletionsmutanten hergestellt und in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Bindung an LFA-1 charakterisiert. Alternativ können diese Untersuchungen unter Verwendung von anti-ICAM-1-Antikörper durchgeführt werden, von dem bekannt ist, dass er die Fähigkeit von ICAM-1 zur Bindung an LFA-1 beeinträchtigt. Zu Beispielen für derartige geeignete Antikörper gehören: RR1/1 (R. Rothlein et al., J. Immunol., Bd. 137 (1986), S. 1270–1274), R6.5 (T. A. Springer et al., US-Patentanmeldung 07/250 446), LB-2 (E. A. Clark et al., in: Leukocyte Typing I (Hrsg. A. Bernhard et al.), Springer-Verlag (1984), S. 339–346) oder CL203 (D. E. Staunton et al., Cell, Bd. 56 (1989), S. 849–853).
Deletionsmutanten von ICAM-1 lassen sich durch eine Reihe von Maßnahmen erzeugen. Es wird jedoch bevorzugt, derartige Mutanten über eine ortsgerichtete Mutagenese oder durch andere rekombinante Maßnahmen (z. B. durch Konstruktion von ICAM-1, das Gensequenzen exprimiert, bei denen Sequenzen, die für spezielle Proteinregionen kodieren, deletiert worden sind) zu erzeugen. Verfahren, die zur Erzeugung derartiger Mutanten geeignet sind, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Unter Anwendung derartiger Verfahren wurden 3 ICAM-1-Deletionsmutanten hergestellt. Bei der ersten Mutante fehlen die Aminosäurereste F185 bis P284 (d. h. Deletion der Domäne 3). Bei der zweiten Mutante fehlen die Aminosäurereste P284 bis R451 (d. h. Deletion der Domänen 4 und 5). Bei der dritten Mutante fehlen die Aminosäurereste im Anschluss an Y476 (d. h. Deletion der zytoplasmatischen Domäne). Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass die Domänen 1, 2 und 3 vorwiegend an ICAM-1-Wechselwirkungen mit anti-ICAM-1-Antikörper und LFA-1 beteiligt sind.
Beispiel 34
Einfluss von Mutationen in ICAM-1 auf die LFA-1-Bindung
Die Fähigkeit von ICAM-1 zur Wechselwirkung mit und Bindung an LFA-1 wird durch ICAM-1-Aminosäurereste, die in der Domäne 1 des ICAM-1-Moleküls vorhanden sind, vermittelt (8, 9 und 10). Derartige Wechselwirkungen werden jedoch durch Beiträge von Aminosäuren, die in den Domänen 2 und 3 von ICAM-1 vorhanden sind, unterstützt. Somit befinden sich unter den bevorzugten funktionellen Derivaten der vorliegenden Erfindung lösliche Fragmente des ICAM-1-Moleküls, die die Domänen 1, 2 und 3 von ICAM-1 enthalten. Besonders bevorzugt werden lösliche Fragmente des ICAM-1-Moleküls, die die Domänen 1 und 2 von ICAM-1 enthalten. Insbesondere bevorzugt sind lösliche Fragmente des ICAM-1-Moleküls, die die Domäne 1 von ICAM-1 enthalten. Einige Aminosäurereste innerhalb der ersten ICAM-1-Domäne sind an der Wechselwirkung von ICAM-1 und LFA-1 beteiligt. Substitutionen dieser Aminosäuren durch andere Aminosäuren verändern die Fähigkeit von ICAM-1 zur Bindung von LFA-1. Diese Aminosäurereste und die Substitutionen sind in 25 dargestellt. 25 zeigt die Einflüsse derartiger Mutationen auf die Fähigkeit des erhaltenen mutanten ICAM-1-Moleküls zur Bindung an LFA-1. In den 23–25 werden die Reste mit dem Einbuchstabencode für Aminosäuren bezeichnet, im Anschluss daran findet sich die Position des Restes im ICAM-1-Molekül. Somit bedeutet beispielsweise "E90" den Glutaminsäurerest in Position 90 von ICAM-1. Gleichermaßen bedeutet "E90V" das Dipeptid, das aus dem Glutaminsäurerest in Position 90 und dem Valinrest in Position 91 zusammengesetzt ist. Die Substitutionssequenz ist auf der rechten Seite des Schrägstriches ("/") angegeben. Die Reste V4, R13, Q27, Q58 und D60S61 von ICAM-1 sind an der LFA-1-Bindung beteiligt.
Ein Ersatz dieser Aminosäuren veränderte das Vermögen von ICAM-1 zur Bindung an LFA-1. Beispielsweise führt ein Ersatz von V4 durch G zur Bildung eines mutanten ICAM-1-Moleküls, das weniger stark zur Bindung an LFA-1 befähigt ist (25). Ein Ersatz des Restes R13 von ICAM-1 durch E führt zur Bildung eines mutanten Moleküls mit einem erheblich geringeren Vermögen zur Bindung an LFA-1 (25). Ein Ersatz des Q58-Restes von ICAM-1 durch H führt zur Bildung eines mutanten Moleküls mit einem im wesentlichen normalen Vermögen zur Bindung von LFA-1 (25). Ein Ersatz der D60S-Reste von ICAM-1 durch KL führt zur Bildung eines mutanten Moleküls, das ein wesentlich geringeres Vermögen zur Bindung von LFA-1 aufweist (25).
Glycosylierungsstellen in der zweiten Domäne sind ebenfalls an der LFA-1-Bindung beteiligt (23). Ein Ersatz von N103 durch K oder von A155N durch SV führt zur Bildung eines mutanten ICAM-1-Moleküls, das zur Bindung von LFA-1 im wesentlichen unfähig ist. Im Gegensatz dazu hatte ein Ersatz der Glycosylierungsstelle N175 durch A offensichtlich keinen wesentlichen Einfluss auf das Vermögen des mutanten ICAM-1 zur Bindung von LFA-1.
Mutationen in der dritten ICAM-1-Domäne veränderten die ICAM-1-LFA-1-Bindung nicht merklich (24).
Beispiel 35
Multimere Formen von ICAM-1 mit erhöhter biologischer Halbwertsaftinität und erhöhtem Clearance-Vermögen
Chimäre Moleküle werden konstruiert, bei denen die Domänen 1 und 2 von ICAM-1 an die Gelenkregion der schweren Immunoglobulinkette gebunden sind. Bei bevorzugten Konstrukten ist der C-Terminus der ICAM-1-Domäne 2 an ein Segment des Gens der schweren Immunoglobulinkette unmittelbar N-terminal zur Gelenkregion gebunden, was die durch die Gelenkregion herbeigeführte Segmentflexibilität ermöglicht. Die ICAM-1-Domänen 1 und 2 ersetzen somit das Fab-Fragment eines Antikörpers. Ein Anbringen an schwere Ketten der IgG-Klasse und die Erzeugung von tierischen Zellen führt zur Bildung eines chimären Moleküls. Die Erzeugung von Molekülen, die von IgA oder von IgM abgeleitete schwere Ketten enthalten, führt zur Bildung von Molekülen mit höherer multimerer Beschaffenheit mit einem Gehalt an 2 bis 12 ICAM-1-Molekülen. Eine Coexpression des J-Ketten-Gens in tierischen Zellen, die chimäre Moleküle mit ICAM-1 und der schweren Kette bilden, ermöglicht den einwandfreien Zusammenbau von IgA- und IgM-Multimeren, was vorwiegend zu IgA-Molekülen mit einem Gehalt an 4 bis 6 ICAM-1-Molekülen und im Fall von IgM zu einem Gehalt mit etwa 10 ICAM-1-Molekülen führt. Diese chimären Moleküle können verschiedene Vorteile aufweisen. Zunächst besitzen Ig-Moleküle eine lange Lebensdauer im Kreislauf und können somit die biologische Halbwertszeit verbessern.
Ferner ermöglicht es die multimere Natur dieser konstruierten Moleküle, dass sie mit höherer Avidität mit Rhinovirus sowie mit Zelloberflächen-LFA-1 in Wechselwirkung treten, je nach den therapeutischen Umständen, und somit in erheblichem Maße die Menge an rekombinantem Protein, das zur Erzielung einer wirksamen Dosis verabreicht werden muss, verringert. IgA und IgM stellen hochgradig glycosylierte Moleküle dar, die normalerweise in Sekreten an Schleimhäuten, z. B. in der Nase, vorhanden sind. Ihre stark hydrophile Natur trägt dazu bei, Bakterien und Viren, an die sie in der Schleimhaut binden, von einer Haftung an Zellen und einem Durchqueren der epithelialen Zellmembransperre abzuhalten. Somit können sie einen erhöhten therapeutischen Wirkungsgrad besitzen. IgM und insbesondere IgA sind in der Schleimhautumgebung stabil und können die Stabilität der ICAM-1-Konstrukte erhöhen. Wenn ein derartiges funktionelles ICAM-1-Derivat in die Blutbahn verabreicht wird, kann es ebenfalls eine Verlängerung der biologischen Halbwertszeit bewirken. IgA fixiert Komplement nicht und erweist sich somit als ideal für Anwendungen, bei denen dies schädlich sein könnte. Wenn Chimäre aus IgG und H-Ketten erwünscht sind, ist es möglich, Regionen, die an der Haftung an Komplement sowie an Wechselwirkungen mit Fc-Rezeptoren beteiligt sind, zu mutieren.
Beispiel 36
Erzeugung von ICAM-1-Mutanten
Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese
Die Kodierungsregion einer ICAM-1-cDNA in einem 1,8 kb-SalI-KpnI-Fragment wurde in den Expressionsvektor CDMB subkloniert (B. Seed et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 84 (1987), S. 3365–3369). Auf der Grundlage des Verfahrens von T. Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 82 (1985), S. 488–492) und unter Anwendung der Modifikationen von D. E. Staunton et al. (D. E. Staunton et al., Cell, Bd. 52 (1988), S. 925–933) wurde dieses Konstrukt (pCD1.8) zur Erzeugung einer einzelsträngigen, uracilhaltigen Matrize zum Einsatz bei einer Oligonucleotid-gerichteten Mutagenese verwendet.
Kurz zusammengefasst, E. coli Stamm XS127 wurde mit pCD1.8 transformiert. Einzelne Kolonien wurden in 1 ml Luria-Brühe (LB)-Medium (Difco) mit 13 μg/ml Ampicillin und 8 μg/ml Tetracyclin bis zur Sättigung gezüchtet. 100 μl der Kultur wurden mit R408-Helferphagen (Stratagene) bei einem Infektionsvielfachen (MOI) von 10 infiziert. 10 ml LB-Medium mit Ampicillin und Tetracyclin wurde für eine 16-stündige Züchtung bei 37°C zugegeben. Im Anschluss an eine 1-minütige Zentrifugation mit 10000 U/min und eine 0,22 μm-Filtration des Überstands wurde die Phagensuspension zur Infektion von E. coli BW313/P3 verwendet, das sodann auf LB-Agar (Difco)-Platten, die mit Ampicillin und Tetracyclin ergänzt waren, ausgestrichen wurde. Kolonien wurden entnommen, in 1 ml LB-Medium mit Ampicillin und Tetracyclin bis nahe zur Sättigung gezüchtet und mit dem Helferphagen bei einem MOI-Wert von 10 infiziert. Sodann wurde das Kulturvolumen auf 250 ml erhöht und die Zellen wurden über Nacht gezüchtet. Einzelsträngige DNA wurde durch übliche Phagenextraktion isoliert.
Mutante Oligonucleotide wurden phosphoryliert und mit der pCD1.8-Matrize bei einer Synthesereaktion des zweiten Stranges verwendet (D. E. Staunton et al., Cell, Bd. 52 (1988), S. 925–933).
Transfektion
COS-Zellen wurden auf 10 cm-Gewebekulturplatten so überimpft, dass sie innerhalb von 16–24 Stunden eine Konfluenz von 50% zeigten. Die COS-Zellen wurden sodann 1-mal mit TBS gewaschen und 4 Stunden mit 4 ml RPMI mit einem Gehalt an 10% Nu-Serum (Collaborative), 5 μg/ml Chloroquin, 3 μg mutantem Plasmid und 200 μg/ml DEAE-Dextransulfat inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 10% DMSO/PBS und sodann 1-mal mit PBS gewaschen und 16 Stunden im Kulturmedium gezüchtet. Das Kulturmedium wurde durch frisches Medium ersetzt. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die COS-Zellen durch Behandlung mit Trypsin/EDTA (Gibco) suspendiert und auf zwei 10 cm-Platten und Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen zur HRV-Bindung aufgeteilt. Nach 72 Stunden wurden Zellen von den 10 cm-Platten mit 5 mM EDTA/HBSS geerntet und für die Haftung an mit LFA-1 beschichtetem Kunststoff und zur Immunofluoreszenzbestimmung bearbeitet.
LFA-1- und HRV-Bindung
LFA-1 wurde aus SKW3-Lysaten durch Immunoaffinitätschromatographie an TS2/4-LFA-1-mAb-Sepharose gereinigt und beim pH-Wert 11,5 in Gegenwart von 2 mM MgCl₂ und 1% Octylglucosid eluiert. LFA-1 (10 μg pro 200 μL pro 6 cm-Platte) wurde an bakteriologische Petri-Schalen gebunden, indem man eine Verdünnung mit Octylglucosid auf 0,1% in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) mit einem Gehalt an 2 mM MgCl₂ und eine Inkubation über Nacht bei 4°C vornahm. Die Platten wurden mit 1% BSA (Rinderserumalbumin) blockiert und in PBS mit einem Gehalt an 2 mM MgCl₂, 0,2% BSA, 0,025% Azid und 50 μg/ml Gentamycin gelagert.
Mit ⁵¹Cr markierte COS-Zellen in PBS mit einem Gehalt an 5% FCS (fötales Kälberserum), 2 mM MgCl₂, 0,025% Azid (Puffer) wurden mit und ohne 5 μg/ml RR1/1 und R6.5 in mit LFA-1 beschichteten Mikrotiterplatten 1 Stunde bei 25°C inkubiert. Nicht-haftende Zellen wurden durch 3-maliges Waschen mit Puffer entfernt. Haftende Zellen wurden durch Zugabe von EDTA in einer Konzentration von 10 mM eluiert und einer gamma-Zählung unterworfen.
Ergebnisse
Anti-ICAM-1-Antikörper, wie RR1/1, R6.5, LB-2 oder CL203 wurden identifiziert. Wenn diese Antikörper zur Hemmung der ICAM-1-Funktion befähigt sind, müssen sie zur Bindung an eine bestimmte Stelle im ICAM-1-Molekül, die auch für die ICAM-1- Funktion von Bedeutung ist, befähigt sein. Somit ist es durch Herstellung der vorstehend beschriebenen Deletionsmutanten von ICAM-1 und durch Bestimmung des Ausmaßes, in dem die anti-ICAM-1-Antikörper an die Deletion binden können, möglich, festzustellen, ob die deletierten Domänen für die Funktion wichtig sind.
ICAM-1 ist ein integrales Membranprotein, für dessen extrazelluläre Domäne eine Zusammensetzung aus 5 Ig-artigen C-Domänen vorhergesagt wird. Um Domänen, die an der LFA-1-Bindung beteiligt sind, zu identifizieren, wurden die Domäne 3 und die Domänen 4 und 5 (carboxylendständig) durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese deletiert. Im Anschluss an eine Expression in COS-Zellen wurde ein Funktionstest durchgeführt. Ferner wurde die gesamte zytoplasmatische Domäne deletiert, um deren möglichen Einfluss auf ICAM-1-Wechselwirkungen zu bestimmen. Wie erwartet, ergab die Deletion der zytoplasmatischen Domäne, Y476/*, keinen Verlust an RR1/1-, R6.5-, LB-2- und CL203-Reaktivität, während eine Deletion der Domäne 3, F185-R451, zu einer Verringerung bzw. einem Verlust an CL203-Reaktivität führte (20). Somit befindet sich das CL203-Epitop offensichtlich in der Domäne 4, während RR1/1, R6.5 und LB-2 sich offensichtlich in den zwei aminoendständigen Domänen befinden.
Sämtliche 3 Deletionsmutanten zeigen Wildtypniveaus der Haftung an LFA-1 (21). Aminosäuresubstitutionen in vorhergesagten β-Windungen in den Domänen 1, 2 und 3 wurden ebenfalls erzeugt und funktionell im Anschluss an Expression in COS-Zellen getestet. Das R6.5-Epitop wurde somit in der Sequenz E111GGA in der Domäne 2 lokalisiert und kann auch E39 in der Domäne 1 beteiligen, während RR1/1 und LB-2 beide von R13 in Domäne 1 abhängig sind (22). Außerdem wird die RR1/1-Bindung durch Mutationen in der Sequenz D71GQS verringert. Mutationen, bei denen die N-verknüpften Glycosylierungsstellen an N103 und N165 beseitigt sind, führen zu einer verringerten RR1/1-, R6.5- und LB-2-LFA-1-HRV-Bindung. Diese Mutationen beeinflussen offensichtlich die Prozessierung, so dass ICAM-1-Dimere erzeugt werden.
Weitere Mutationen in den Domänen 2 oder 3 führten nicht zu einer veränderten LFA-1-Haftung (23 und 24). Die Aminosäure R13 und D60 in der Domäne 1 waren beide an der Bindung mit LFA-1 beteiligt (25).
Somit scheint die LFA-1- und HRV-Bindung offensichtlich eine Funktion der aminoterminalen, Ig-artigen Domäne von ICAM-1 zu sein. 26 zeigt eine Ausrichtung der aminoterminalen ICAM-Domänen.

Claims

Entzündungshemmendes Mittel zur Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die zusammen mit einem immunsuppressiven Arzneimittel anzuwenden ist, das bevorzugt ausgewählt ist aus Dexamethason, Azathioprin und Cyclosporin A, zur Behandlung von Entzündungen, die aus einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems resultieren, wobei das entzündungshemmende Mittel ausgewählt ist aus einem Antikörper, der befähigt ist zur Bindung an ICAM-1; einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment befähigt ist zur Bindung an ICAM-1; ICAM-1; einem funktionellen Derivat von ICAM-1; und einem Nicht-Immunglobulin-Antagonisten von ICAM-1.
Entzündungshemmendes Mittel zur Verwendung bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Entzündungen, die aus einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems resultieren, welche zusammen mit einem zweiten Mittel anzuwenden ist, ausgewählt aus einem Antikörper, der befähigt ist zur Bindung an LFA-1; einem funktionellen Derivat eines Antikörpers, wobei das funktionelle Derivat befähigt ist zur Bindung an LFA-1; und einem Nicht-Immunglobulin-Antagonisten von LFA-1; wobei das entzündungshemmende Mittel ausgewählt ist aus einem Antikörper, der befähigt ist zur Bindung an ICAM-1; einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment befähigt ist zur Bindung an ICAM-1; ICAM-1; einem funktionellen Derivat von ICAM-1; und einem Nicht-Immunglobulin-Antagonisten von ICAM-1.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend: a) ein entzündungshemmendes Mittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Antikörper, der befähigt ist zur Bindung an ICAM-1; einem Fragment eines Antikörpers, wobei das Fragment befähigt ist zur Bindung an ICAM-1; ICAM-1; einem funktionellen Derivat von ICAM-1; und einem Nicht-Immunglobulin-Antagonisten von ICAM-1, und b) mindestens einem immunsuppressiven Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Dexamethason, Azathioprin und Cyclosporin A.