DE69734930T2 - Adenovirales fiberprotein mit einem kurzen schaft und seine verwendung - Google Patents

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Description

  • Technischer Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine adenovirale Kurzschaft-Fiber, ein rekombinantes Virus, welches eine Kurzschaft-Fiber umfasst, einen Vektor, der ein adenovirales Kurzschaft-Fiber-Gen umfasst, und ein Verfahren zur Zielsteuerung der Anheftung eines rekombinanten Kurzschaft-Adenovirus an eine Zelle, um so den Eintritt des rekombinanten Kurzschaft-Adenovirus in die Zelle zu bewirken.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Adenoviren gehören zur Familie der Adenoviridae, die in zwei Genera unterteilt ist, nämlich Mastadenovirus und Aviadenovirus (Horwitz, Shenk und Murphy, einzeln, In: Virology, 3rd ed., Fields et al., eds., pp. 2149–2171, 2111–2148 bzw. 15–57 (Raven Press, New York (1996)). Humane Adenoviren sind in sechs Untergruppen klassifiziert, nämlich A bis F, basierend auf Hämagglutinationsmustern von Erythrocyten von diversen Tierspezies, und sind weiter aufgeteilt in über 49 Serotypen (Horwitz et al., supra; und Schnurr et al., Intervirol., 36, 79–83 (1993)).
  • Adenoviren sind nichtumhüllte regelmäßige Ikosaeder mit einem Durchmesser von ca. 65 bis 80 nm. Das adenovirale Capsid umfasst 252 Capsomere; davon sind 240 Hexone und 12 Pentone. Die Hexone und Pentone leiten sich von drei verschiedenen viralen Polypeptiden ab (Maizel et al., Virology, 36, 115–125 (1968); Weber et al., Virology, 76, 709–724 (1977)). Das Hexon umfasst drei identische Polypeptide von jeweils 967 Aminosäuren, nämlich Polypeptid II (Roberts et al., Science, 232, 1148–1151 (1986)). Das Penton umfasst eine Pentonbasis, die dem Capsid einen Anheftungspunkt bereitstellt, und ein trimeres Fiber-Protein, welches nichtkovalent an die Pentonbasis gebunden ist und von derselben hervorragt.
  • Die Pentonbasis selbst ist ein ringförmiger Komplex, umfassend fünf identische Proteinuntereinheiten von Polypeptid III (571 Aminosäuren) (Boudin et al., Virology, 92, 125–138 (1979)). Die Pentonbasis-Sequenz ist konserviert zwischen den verschiedenen Serotypen von Adenovirus, die sequenziert worden sind (Neumann et al., Gene, 69, 153–157 (1988)).
  • Das Fiber-Protein umfasst drei identische Proteinuntereinheiten von Polypeptid IV (582 Aminosäuren) und umfasst einen Schwanz, einen Schaft und ein Knob (Devaux et al., J. Molec. Biol., 215, 567–588 (1990)). Der Fiber-Schaft umfasst 15 Aminosäure-Repeats, von denen man annimmt, dass sie zwei alternierende β-Stränge und β-Biegungen bilden (Green et al., EMBO J., 2, 1357–1365 (1983)). Die Gesamtlänge des Fiber-Schaftes und die Zahl von 15 Aminosäure-Repeats variiert zwischen adenoviralen Serotypen. So ist zum Beispiel der Ad2-Fiber-Schaft 37 nm lang und umfasst 22 Repeats, während die Ad3-Fiber 11 nm lang ist und 6 Repeats umfasst. Die Sequenzierung von über zehn Fiber-Proteinen von verschiedenen adenoviralen Serotypen hat eine größere Sequenzdiversität gezeigt als die zwischen anderen adenoviralen Proteinen beobachtete. So zeigen beispielsweise die Knob-Regionen der Fiber-Proteine von den eng verwandten Serotypen Ad2 und Ad5 nur 63% Ähnlichkeit auf der Aminosäure-Ebene (Chroboczek et al., Virology, 186, 280–285 (1992)), während ihre Pentonbasis-Sequenzen zu 99% identisch sind. Jedoch binden die Ad2- und Ad5-Fiber-Proteine wahrscheinlich beide an den gleichen zellulären Rezeptor, da sie ihre Bindung gegenseitig kreuzblockieren. Im Gegensatz dazu sind Ad2- und Ad3-Fibern nur zu 20% identisch (Signas et al., J. Virol., 53, 672–678 (1985)) und binden an unterschiedliche Rezeptoren (Defer et al., J. Virol., 64(8), 3661–3673 (1990)). Die Fibern von Ad2 und Ad3 sind heterolog exprimiert und strukturell analysiert worden (Albiges-Rizo et al., J. Biol. Chem., 266, 3961–3967 (1991) und Novelli et al., Virology, 185, 365–376 (1991)).
  • Im adenoviralen Capsid liegen ferner andere Proteine vor, nämlich die Proteine IX, VI und IIIa. Von diesen Proteinen wird angenommen, dass sie das virale Capsid stabilisieren (Stewart et al., Cell, 67, 145–154 (1991); Stewart et al., EMBO J., 12(7), 2589–2599 (1993).
  • Von einem Adenovirus, nämlich Serotyp 2 (Ad2), ist gezeigt worden, dass es die Fiber und die Pentonbasis nutzt, um mit distinkten zellulären Rezeptoren zu interagieren, um an eine Zelle anzuheften und diese effizient zu infizieren (Wickham et al., Cell, 73, 309–319 (1993)). Als Erstes verwendet das Virus eine in dem Fiber-Knob lokalisierte Rezeptorbindungsdomäne (Henry et al., J. Virol., 68(8), 5239–5246 (1994)), um an einen bisher noch unidentifizierten Zelloberflächenrezeptor anzuheften (Phillipson et al., J. Virol., 2, 1064–1075 (1968); Wickham et al., Cell, 73, 309–319 (1993); Svensson et al., J. Virol., 38, 70–81 (1981); Hennache et al., Biochem. J., 166, 237–247 (1977); Defer et al. (1990), supra; und DiGuilmi et al., Virus Res., 38, 71–81 (1995)). Dann, nach der viralen Anheftung, bindet die Pentonbasis an ein spezifisches Mitglied einer Familie von heterodimeren Zelloberflächenrezeptoren, die Integrine genannt werden. Bei den Serotypen Ad2 und Ad5, welche die Langschaft-Fibern besitzen, ist die Pentonbasis nicht signifikant in die virale Anheftung an Wirtszellen involviert (Wickham et al. (1993), supra).
  • Die Spezifität, mit der eine adenovirale Pentonbasis an ein Integrin bindet, ist eine Funktion der gepaarten α- und β-Untereinheiten des Integrins. So bindet beispielsweise die Ad2-Pentonbasis an die Integrine αvβ3 und αvβ5 (Wickham et al. (1993), supra; Nemerow et al., In: Biology of Vitronectins and their Receptors, Preissner et al. (eds.), pp. 177–184 (Elsevier Science Publishers (1993)); und Varga et al., J. Virol., 65, 6061–6070 (1991)). Einige Integrine, z.B. die αv-Integrine, liegen auf der Oberfläche von nahezu allen Zellen vor, ausgenommen unstimulierte hämatopoetische Zellen (Gladson et al., In: Integrins, Y. Takada (ed.), pp. 83–99 (CRC Press, Boca Raton, FL (1994)), während andere Integrine eine engere Gewebeverteilung aufweisen. Im Besonderen liegen β2-Integrine nur auf Leukocyten wie Neutrophile und Makrophagen vor, α4-Integrine liegen nur auf Lymphocyten und Fibroblasten vor und das αIIbβ3-Integrin liegt nur auf Plättchen und Megakaryocyten vor. Das Integrin-Untereinheit-Komplement einer Zelle limitiert daher in gewissem Sinne die Infizierbarkeit dieser Zelle durch verschiedene Serotypen von Adenovirus.
  • Die meisten Integrine erkennen kurze lineare Aminosäurestrecken in einem Liganden, z.B. das Tripeptid RGD (d.h. Arg Gly Asp), welches in der Mehrzahl der extrazellulären Matrixliganden gefunden wird. Das Integrin αIIbβ3 bindet Fibrinogen über die Aminosäuresequenz KQAGD (d.h. Lys Gln Ala Gly Asp; SEQ ID Nr. 1) (Kloczewiak et al., Biochemistry, 23, 1767–1774 (1984)), und α4β1 bindet Fibronectin über die Core-Sequenz EILDV (d.h. Glu Ile Leu Asp Val; SEQ ID Nr. 2) (Komoriya et al., J. Biol. Chem., 266, 15075–15079 (1991)). Ferner hat sich ein weiteres Strukturmotiv, NPXY (d.h. Asn Pro Xaa Tyr; SEQ ID Nr. 3), welches in den β-Untereinheiten von αv-haltigen Integrinen vorliegt, als wichtig für die Integrin-vermittelte Internalisierung erwiesen (Suzuki et al., PNAS (USA, 87, 5354 (1990)).
  • Es erscheint, dass das RGD-Tripeptid ebenfalls an der Interaktion der adenoviralen Pentonbasis mit αv-Integrinen beteiligt ist. Exogen hinzugefügte RGD-Peptide blockieren die Bindung der Pentonbasis an Zellen (Wickham et al. (1993), supra), und Adenoviren mit Punktmutationen in der RGD-Sequenz der Pentonbasis sind in ihrer Fähigkeit, Zellen zu infizieren, eingeschränkt (Bai et al., J. Virol., 67, 5198–5205 (1993)).
  • Die RGD-Tripeptid-Sequenz liegt in den hypervariablen Regionen der Pentonbasen von Ad2 und Ad5 (beides Angehörige der Untergruppe C) vor, die in der Region der RGD-Tripeptid-Sequenz identisch sind. Die Sekundärstrukturanalyse der hypervariablen Regionen der RGD-haltigen Pentonbasen von Ad2, Ad5 und Ad12 (Untergruppe A) sagt vorher, dass in jedem Fall das RGD-Motiv von α-Helices flankiert ist, von denen man annimmt, dass sie die Spikes bilden, die in cryo-elektronenmikroskopischen(Cryo-EM-)Bildern der Ad2-Pentonbasis zu sehen sind (Stewart et al., EMBO J., 12(7), 2589–2599 (1993)). Ferner liegt das RGD-Tripeptid in der Pentonbasis von Ad3 (Untergruppe B, die Rhesus affenerythrocyten stark hämagglutiniert, nicht jedoch Rattenerythrocyten) und Ad4 (Untergruppe E) vor.
  • Sobald sich Ad2 oder Ad5 über seine Fiber an eine Zelle anheftet, durchläuft es Rezeptor-vermittelte Internalisierung in clathrinumhüllte endocytische Vesikel durch Pentonbasis-Bindung an Integrine. Die Pentonbasis von Ad2 oder Ad5 (Untergruppe C) ist nicht signifikant in die virale Anheftung an die Wirtszelle involviert (Wickham et al. (1993), supra), vermutlich wegen der Länge ihrer Fiber-Schäfte (37 nm), die ein primäres Anheftungsereignis an αv-Integrine sterisch blockieren kann. Schließlich werden die viralen Partikel zu dem Kernporenkomplex der Zelle transportiert, wo das virale Genom in den Kern eintritt und dadurch die Infektion initiiert.
  • Die Fähigkeit von Adenovirus zum effizienten Zelleintritt hat den Adenovirusvermittelten zielgesteuerten Transfer eines oder mehrerer rekombinanter Gene in erkrankte Zellen oder Gewebe, die der Behandlung bedürfen, ermöglicht. In der Tat werden adenovirale Vektoren vor anderen, allgemein üblich für die Gentherapie eingesetzten Vektoren (z.B. retrovirale Vektoren) bevorzugt, weil adenovirale Vektoren in hohen Titern hergestellt werden können (z.B. bis zu ca. 1013 Viruspartikel/ml) und weil sie Gene effizient sowohl in nichtreplizierende wie auch in replizierende Zellen transferieren (siehe z.B. Review von Crystal, Science, 270, 404–410 (1995)). Adenovirale Vektoren sind angesichts ihres normalen Tropismus für das respiratorische Epithel besonders bevorzugt für die somatische Gentherapie der Lunge.
  • Weitere Vorteile, die mit der Verwendung von Adenoviren als Vektoren für die Gentherapie einhergehen, umfassen: (1) die seltene Beobachtung von Rekombination; (2) das Fehlen einer ostensiblen Korrelation zwischen humaner Malignität und adenoviraler Infektion, trotz des üblichen Auftretens einer Infektion; (3) das adenovirale Genom (welches aus linearer doppelsträngiger DNA besteht) kann so manipuliert werden, dass es bis zu ca. 7,5 kb an exogener DNA trägt, und längere DNA-Sequenzen können potenziell in eine Zelle eingetragen werden, z.B. durch Anheftung an das adenovirale Capsid (Curie) et al., Human Gene Therapy, 3, 147–154 (1992)); (4) es ist unwahrscheinlich, dass ein Adenovirus mit der normalen Zellfunktion interferiert, da der Vektor die Expression seiner codierten Sequenzen in einer epichromosalen Weise steuert; und (5) lebendes Adenovirus wird als Humanvakzin schon seit vielen Jahren sicher verwendet.
  • Ein Nachteil der Verwendung von Adenovirus in der Gentherapie liegt jedoch darin, dass alle die Zellen, die Rezeptoren für die adenovirale Fiber und die Pentonbasis umfassen – und nicht nur die Zellen, die einer therapeutischen Behandlung bedürfen – das Adenovirus und damit das bzw. die Gene, die verabreicht werden, internalisieren. Ferner sind Zellen, denen der Fiber-Rezeptor oder der Pentonbasis-Rezeptor, z.B. Integrin, fehlt, im adenoviral vermittelten Gen-Delivery beeinträchtigt (Silver et al., Virology, 165, 377–387 (1988); Horvath et al., J. Virol., 62, 341–345 (1988); und Huang et al., J. Virol., 69, 2257–2263 (1995)). Ähnlich werden andere Zellen, denen ein adenoviraler Fiber-Rezeptor zu fehlen scheint, mit einer sehr geringen Effizienz, wenn überhaupt, durch Adenovirus transduziert (Curie) et al., (1992), supra; Cotten et al., PNAS (USA, 87, 4033–4037 (1990); Watte) et al., Leukemia, 10, 171–174 (1996)). Es würde also eine wesentliche Verbesserung gegenüber der heutigen Technologie bedeuten, wenn man den adenoviralen Eintritt auf spezifische Zellen beschränken und/oder das der Adenovirus-vermittelten Gentherapie zugängliche Zellrepertoire erweitern könnte. Ein derartiges, wirklich "zielgesteuertes" adenovirales Gen-Delivery könnte ferner potenziell die Menge an adenoviralem Vektor vermindern, die erforderlich ist, um Genexpression in den gezielt angesteuerten Zellen zu erhalten, und könnte damit potenziell Nebenwirkungen und Komplikationen verringern, die mit einer erhöhten Adenovirusdosis verbunden sind.
  • Im Bemühen, eine gezielte Zellansteuerung zu erreichen, ist Adenovirus im Wesentlichen verwendet worden als ein endosomolytisches Agens beim Transfer in eine Zelle von Plasmid-DNA, welche ein Markergen enthält und komplexiert und kondensiert ist mit Polylysin, das kovalent verknüpft ist mit einem Zellbindungsliganden, z.B. Transferrin (Cotten et al., PNAS (USA, 89, 6094–6098 (1992); und Curie) et al., PNAS (USA), 88, 8850–8854 (1991)). Es wurde demonstriert, dass eine Kopplung des Transferrin-Polylysin/DNA-Komplexes und Adenovirus (z.B. mittels eines Adenovirus-gerichteten Antikörpers, mit Transglutaminase oder über eine Biotin/Streptavidin-Brücke) den Gen transfer wesentlich verbessert (Wagner et al., PNAS (USA, 89, 6099–6103 (1992)). Diese Ansätze sind jedoch nicht ganz erstrebenswert, weil sie die Ligation des Liganden, z.B. Transferrin, mit Polylysin und die Vorausherstellung des Transferrin-Polylysin/DNA-Komplexes verlangen. Ferner könnten die mit Adenovirus gebildeten Komplexe durch Bindung an zelluläre adenovirale Rezeptoren oder an Transferrin-Rezeptoren endocytosiert werden. Ferner ist Polylysin selbst zur Bindung an Zellen befähigt und interferiert dadurch mit der Spezifität dieses Ansatzes.
  • Um eine derartige nichtspezifische Bindung des Adenovirus zu umgehen, ist die adenovirale Fiber modifiziert worden durch Inkorporation von Sequenzen für einen Liganden zu einem Zelloberflächenrezeptor oder von Sequenzen, die die Bindung an einen bispezifischen Antikörper erlauben (d.h. ein Molekül, das an einem Ende Spezifität für die Fiber aufweist und am anderen Ende Spezifität für einen Zelloberflächenrezeptor aufweist) (internationale Patentanmeldung PCT Nr. WO 95/26412 (die Anmeldung Nr. WO 95/26412); Watkins et al., "Targeting Adenovirus-Mediated Gene Delivery with Recombinant Antibodies", Abst. No. 336). In beiden Fällen sind die typischen Fiber/Zelloberflächenrezeptor-Interaktionen aufgehoben und das Adenovirus wird mittels seiner Fiber auf einen neuen Zelloberflächenrezeptor umdirigiert. Einige Nachteile, die mit dem Ansatz der Anmeldung Nr. WO 95/26412 verbunden sind, der eine Modifikation der Fiber verlangt, liegen darin, dass derartige Fiber-Modifikationen unterschiedliche Zelllinien (d.h. Zelllinien, die den Rezeptor aufweisen, auf den das modifizierte Virus nun zielgesteuert ist) zum Propagieren des Virus und/oder unterschiedliche Mittel des Zell-Delivery (z.B. liposomenvermitteltes Delivery) zur intrazellulären Einführung von Adenovirus notwendig machen können. Ferner erscheinen die Ansätze von Watkins et al. und der Anmeldung Nr. WO 95/26412 auf den Einsatz der adenoviralen Fiber bei der gezielten Zellansteuerung begrenzt.
  • Ein weiterer Ansatz des zielgesteuerten Gen-Delivery beinhaltet die Verabreichung eines Zielsteuerungselementes, gekoppelt an ein erstes Molekül eines Hochaffinitätsbindungspaares, wobei das Zielsteuerungselement zur spezifischen Bindung an einen selektierten Zelltyp befähigt ist (internationale Patentanmeldung PCT Nr. WO 95/31566). Sodann wird ein Gen-Delivery-Vehikel, gekoppelt an ein zweites Molekül des Hochaffinitätsbindungspaares, verabreicht, wobei das zweite Molekül zur spezifischen Bindung an das erste Molekül befähigt ist, so dass das Gen-Delivery-Vehikel auf den selektierten Zelltyp zielgesteuert wird. Die sequentielle Verabreichung der verschiedenen Komponenten wird vermutlich durchgeführt, um Agglomeration der Vektorpartikel zu vermeiden, z.B. in Fällen, wo das Zielsteuerungselement multivalent ist für die Domäne, die den Vektor erkennt, was die Transduktionseffizienz vermindern würde. Eine derartige sequentielle Verabreichung ist jedoch nachteilig, weil sie die Internalisierung des Zielsteuerungselementes erlaubt, bevor es mit dem Vektor komplexieren kann. Ferner entfernt die Internalisierung des vorausgehend verabreichten Zielsteuerungselementes den Rezeptor von der Zelloberfläche, was eine effiziente Zielsteuerung des komplexierten Zielsteuerungselementes und Vektors verhindert und ferner potenziell zu einer Beeinträchtigung der durch die Rezeptoren kontrollierten Zellprozesse führt. Ferner würde eine derartige vorzeitige Internalisierung die Verwendung von relativ hohen Zielsteuerungselement-Levels verlangen.
  • Die vorliegende Erfindung sucht zahlreiche der Probleme der im Vorstehenden erwähnten Ansätze der rekombinanten adenoviralen Gentherapie zu überwinden. Demnach liegt eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Zielsteuerung der Anheftung eines Adenovirus an eine Zelle für den Zelleintritt sowie eines rekombinanten Adenovirus, Vektoren und anderer Komponenten zur Durchführung des Verfahrens. Diese und andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie weitere erfindungsgemäße Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Detailbeschreibung.
  • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine adenovirale Kurzschaft-Fiber wie hierin definiert, ein rekombinantes Adenovirus, welches eine Kurzschaft-Fiber umfasst, ein rekombinantes Baculovirus, welches ein adenovirales Kurzschaft-Fiber-Gen umfasst, einen Vektor, insbesondere einen viralen Transfervektor, vorzugsweise einen adenoviralen Transfervektor, oder einen prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionsvektor, der ein adenovirales Kurzschaft-Fiber-Gen umfasst, und ein Verfahren zur Zielsteuerung der Anheftung eines re kombinanten Kurzschaft-Adenovirus an eine Zelle, um einen Eintritt des rekombinanten Kurzschaft-Adenovirus in die Zelle zu bewirken, bereit. Das Verfahren vermindert den Level oder die Effizienz der Bindung der adenoviralen Fiber an ihren Zelloberflächenrezeptor und erhöht die Bindung der adenoviralen Pentonbasis an ihren Zelloberflächenrezeptor, wodurch die Spezifität der Bindung des Adenovirus an eine gegebene Zelle erhöht wird. Alternativ ermöglicht das Verfahren die Zielsteuerung des Adenovirus auf einen gewünschten Zelloberflächenrezeptor durch die Einführung einer nichtnativen Aminosäuresequenz in die Pentonbasis oder in das Fiber-Knob. Die nichtnative Aminosäuresequenz kann so sein, dass sie eine direkte oder indirekte Bindung, d.h. mittels eines bispezifischen oder multispezifischen Bindungsagens, des Adenovirus an den gewünschten Zelloberflächenrezeptor ermöglicht.
  • Das rekombinante Adenovirus umfasst bevorzugt ferner ein nichtnatives Gen, welches in einer Zelle exprimiert werden kann, an die das rekombinante Adenovirus anheftet oder durch die das rekombinante Adenovirus internalisiert wird, und optional eine nichtnative Aminosäuresequenz zusätzlich zu oder anstelle einer nativen Pentonbasis- oder Fiber-Knob-Aminosäuresequenz. Die nichtnative Aminosäuresequenz verhindert nicht den Zusammenbau des Adenovirus, kann eine bispezifische oder multispezifische Proteinbindungssequenz, z.B. eine Antikörperbindungsstelle, oder eine Zellrezeptorbindungssequenz sein und kann in einer exponierten Schleife des Fiber-Knobs oder am C-Terminus des Fiber-Knobs als C-terminale Verlängerung lokalisiert sein. Die Kurzschaft-Fiber umfasst einen Schwanz, einen Schaft, der nicht mehr als 12 β-Repeats, bevorzugt 6 bis 12 β-Repeats, umfasst, und ein Knob. Der Schaft der Kurzschaft-Fiber und das Knob können vom gleichen oder von unterschiedlichen Serotypen sein. Der Schaft der Kurzschaft-Fiber kann ein Teil eines Schafts sein, z.B. derjenige Teil, der in einer natürlich vorkommenden adenoviralen Fiber dem Schwanz benachbart liegt (z.B. 3 bis 6 β-Repeats eines Schaftes, die benachbart zu dem Schwanz liegen). Das Verfahren zur Zielsteuerung der Anheftung eines Adenovirus an eine Zelle zum Zelleintritt umfasst das Inkontaktbringen der Zelle mit dem oben beschriebenen rekombinanten Adenovirus, so dass der Eintritt des Adenovirus in die Zelle bewirkt wird. Wenn das rekombinante Adenovirus eine nichtnative Aminosäuresequenz umfasst, die eine bispezifische oder multispezifische Proteinbindungssequenz ist, z.B. eine Antikörperbindungsstelle, wird anfänglich das rekombinante Adenovirus mit dem bispezifischen oder multispezifischen Bindungsagens in Kontakt gebracht, welches umfasst: (i) eine erste Komponente, die selektiv die bispezifische bzw. multispezifische Proteinbindungssequenz des Adenovirus bindet, und (ii) eine zweite Komponente, die selektiv eine Zelloberflächen-Bindungsstelle auf der Zelle bindet, um so einen Komplex aus dem Adenovirus und dem bispezifischen oder multispezifischen Bindungsagens, z.B. dem Antikörper, zu bilden. Sodann wird die Zelle mit dem Komplex in Kontakt gebracht, so dass der Eintritt des Adenovirus in die Zelle bewirkt wird.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
  • 1A ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad2 (% Kontrolle) gegen die Fiber-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierender unmarkierter Fiber 2 (
    Figure 00100001
    ) und unmarkierter Fiber 5 (•) aufgetragen ist.
  • 1B ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad5 (% Kontrolle) gegen die Fiber-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierender unmarkierter Fiber 2 (
    Figure 00100002
    ) und unmarkierter Fiber 5 (•) aufgetragen ist.
  • 2A ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad2 (% Kontrolle) gegen die Fiber-Knob-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem Fiber-3-Knob (F3K) (
    Figure 00100003
    ), Fiber-5-Knob (F5K) (•) und Fiber-9-Knob (F9K) (✦) aufgetragen ist.
  • 2B ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad3 (% Kontrolle) gegen die Fiber-Knob-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00100004
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist.
  • 2C ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad9 (% Kontrolle) gegen die Fiber-Knob-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00100005
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist.
  • 3A ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem F5K (% Kontrolle) gegen die Fiber-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00110001
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist.
  • 3B ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem F9K (% Kontrolle) gegen die Fiber-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00110002
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist.
  • 4A ist ein Balkendiagramm, in dem die Bindung von markiertem Ad2 (% Kontrolle) gegen die Kontrolle (CTRL), F5K, den monoklonalen Antikörper (mAb) L230, Pentonbasis (PB) und PB plus F5K aufgetragen ist.
  • 4B ist ein Balkendiagramm, in dem die Bindung von markiertem Ad9 (% Kontrolle) gegen CTRL, F9K, L230, Pentonbasis (PB) und PB plus F9K aufgetragen ist.
  • 5A ist ein Balkendiagramm, in dem die Ad2-Infektivität (FFU/106 Zellen) gegen CTRL, F5K, F9K, PB und PB plus F5K für ein in Duplikat ausgeführtes Experiment mit Anti-PB-Antikörper aufgetragen ist.
  • 5B ist ein Balkendiagramm, in dem die Ad9-Infektivität (FFU/106 Zellen) gegen CTRL, F5K, F9K, PB und PB plus F5K für ein in Duplikat ausgeführtes Experiment mit Anti-PB-Antikörper aufgetragen ist.
  • 6A ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad2 (% Kontrolle) gegen CTRL, F5K, PB und F5K plus PB für CS-1 aufgetragen ist. Die gezeigten Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Proben und auf die Kontrolle bei 100 standardisiert. Die Standardabweichung vom Mittelwert betrug 10% oder weniger für alle Proben.
  • 6B ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad2 (% Kontrolle) gegen CTRL, F5K, PB und F5K plus PB für CS-1-αvβ5 aufgetragen ist. Die gezeigten Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Proben und auf die Kontrolle bei 100 standardisiert. Die Standardabweichung vom Mittelwert betrug 10% oder weniger für alle Proben.
  • 6C ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad9 (% Kontrolle) gegen CTRL, F9K, PB und F9K plus PB für CS-1 aufgetragen ist. Die gezeigten Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Proben und auf die Kontrolle bei 100 standardisiert. Die Standardabweichung vom Mittelwert betrug 10% oder weniger für alle Proben.
  • 6D ist eine graphische Darstellung, in der die Bindung von markiertem Ad9 (% Kontrolle) gegen CTRL, F9K, PB und F9K plus PB für CS-1-αvβ5 aufgetragen ist. Die gezeigten Ergebnisse sind der Mittelwert von drei Proben und auf die Kontrolle bei 100 standardisiert. Die Standardabweichung vom Mittelwert betrug 10% oder weniger für alle Proben.
  • 7 ist eine Karte des Plasmids p193 F5F9K-Short.
  • 8 ist ein Balkendiagramm der Alkalische-Phosphatase-Expression (RLU) gegen Kontrolle, Fiber, PB und Fiber plus PB.
  • 9 ist ein Balkendiagramm der Alkalische-Phosphatase-Expression (RLU) gegen Kontrolle und die Kompetitoren Penton und "Mock" für AdSe.F5F9Kshort (
    Figure 00120001
    ) und AdSe (☐).
  • Für alle Figuren zeigen Fehlerbalken die Standardabweichung. Für die 1A–4B sind die Werte Mittelwerte von Triplikaten.
  • Detailbeschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert zumindest teilweise auf der Entdeckung, dass distinkte Untergruppen von Adenovirus-Serotypen, die deutlich unterschiedliche Tropismen zeigen, den gleichen zellulären Fiber-Rezeptor erkennen, wenn auch mit deutlich unterschiedlichen Bindungscharakteristika. So erkennen z.B. die der Untergruppe C angehörenden Viren Ad2 und Ad5 den gleichen zellulären Fiber-Rezeptor wie das der Untergruppe D angehörende Virus Ad9. Das zur Untergruppe B gehörende Virus Ad3 jedoch erkennt einen Rezeptor, der distinkt ist von dem von den Serotypen Ad2, Ad5 und Ad9 erkannten Rezeptor. Ad2 und Ad9 zeigen allerdings deutlich unterschiedliche Bindungscharakteristika. Es erscheint, dass dieser Unterschied in den Bindungscharakteristika zwischen Ad2 und Ad9 aus der direkten Bindung von Ad9 an Zellen via αv-Integrine resultiert. Anders als bei Ad2 wurde bei Ad9 die Bindung an viele Zelllinien nicht aufgehoben durch die Kompetition mit dem Fiber-9-Knob (F9K). Die Ad9-Bindung an Fiber-Rezeptor-defiziente Zellen, die αv-Integrine exprimieren, wurde jedoch durch einen monoklonalen Antikörper zu αv-Integrinen blockiert. Im Gegensatz dazu wurde die Ad9-Bindung an αv-Integrin-defiziente Zellen, die den Fiber-Rezeptor exprimieren, durch F9K blockiert. Ähnlich resultierte die Transfektion einer αvβ5-Integrin-defizienten Zelllinie mit einem Plasmid, welches die β5-Integrin-Untereinheit exprimiert, in einer αvβ5-Integrin-Expression und in einer Ad9-Bindung, die nicht signifikant durch F9K blockiert wurde, die aber mit einer Kombination von F9K und Pentonbasis blockiert wurde. Diese Resultate weisen darauf hin, dass die kürzere Länge von Fiber 9, die – als Mitglied der Untergruppe D – im Bereich von 12–13 nm liegt, relativ zu Fiber 2, die zusammen mit Fiber 5 ein Mitglied der Untergruppe C ist und eine Länge von 37 nm aufweist, eine Fiber-unabhängige Bindung von Ad9-Pentonbasis an αv-Integrine erlaubt. Die kürzere Schaftlänge der Ad9-Fiber ist ferner korreliert mit einer verminderten Effizienz der Fibervermittelten Bindung an gewisse Zellen, z.B. HepG2-Leberzellen. Der Unterschied in der Fiber-Länge erklärt ferner die deutlich unterschiedlichen Gewebetropismen und Bindungscharakteristika der verschiedenen adenoviralen Serotypen. Die vorliegende Erfindung stellt die Mittel bereit zur Ausnutzung unterschiedlicher Fiber-Längen zur gezielten Ansteuerung von Zellen mit Adenovirus durch das Hinzufügen einer nichtnativen Bindungssequenz zu der Pentonbasis oder dem Fiber-Knob, entweder direkt oder indirekt, d.h. über eine bispezifische oder multispezifische Bindungssequenz, und/oder zur Erhöhung der Spezifität der Bindung von Adenovirus an eine gegebene Zelle durch Vermindern des Levels oder der Effizienz der Bindung der Fiber an ihren zellulären Rezeptor und Erhöhen des Levels der Bindung der Pentonbasis an ihren zellulären Rezeptor. Die vorliegende Erfindung stellt also u.a. eine adenovirale Kurzschaft-Fiber wie hierin definiert, ein rekombinantes Adenovirus, welches eine derartige Kurzschaft-Fiber umfasst, und ein Verfahren zur Zielsteuerung der Anheftung eines rekombinanten Kurzschaft-Adenovirus an eine Zelle, um einen Eintritt des rekombinanten Kurzschaft-Adenovirus in die Zelle zu bewirken, bereit.
  • Ein adenovirales Kurzschaft-Fiber-Protein gemäß vorliegender Erfindung kann durch seine biochemischen Eigenschaften charakterisiert werden. Beispielsweise bindet ein adenovirales Kurzschaft-Fiber-Protein, welches bis auf die Länge des Schaftes mit einem Wildtyp-Fiber-Protein identisch ist, effizient an seinen kognaten Fiber-Rezeptor, wenn das Kurzschaft-Fiber-Protein von einem Virus getrennt ist. Wird es aber in ein Wildtyp-Virus (z.B. Ad5) inkorporiert, so bindet es nicht effizient an einen adenoviralen Fiber-Rezeptor und dirigiert daher nicht wesentlich die Bindung dieses Virus in Zellen, für die es Affinität aufweist. Ferner wird die Aufnahme eines nur Kurzschaft-Fiber-Proteine aufweisenden rekombinanten Adenovirus in eine besondere Zelle nicht wesentlich inhibiert durch einen großen Überschuss (z.B. sättigender oder tausendfacher molarer Überschuss an freiem Protein gegenüber viral gebundenem Protein) an Kurzschaft-Fiber-Protein desselben Typs (natürlich nur, wenn die Kurzschaft-Fiber nicht weiter modifiziert ist, so dass sie eine nichtnative Aminosäuresequenz umfasst (z.B. eine in einer rekombinanten Pentonbasis enthaltene nichtnative Aminosäuresequenz), die spezifisch ist für einen Rezeptor oder eine bispezifische Bindungsstelle und dieses rekombinante Virus bindet). In diesem Fall bedeutet "nicht wesentlich inhibiert", dass die virale Aufnahme um nicht mehr als 50%, bevorzugt nicht mehr als 10%, noch mehr bevorzugt um nicht mehr als 5%, vermindert ist.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein "Adenovirus" ein beliebiges Virus aus der Familie der Adenoviridae und ist wünschenswerterweise vom Genus Mastadenovirus (z.B. Adenoviren der Säugetiere) oder Aviadenovirus (z.B. Adenoviren der Vögel). Das Adenovirus kann beliebigen Serotyps sein. Adenovirale Stocks, die als Quelle für Adenovirus oder adenovirales Coat-Protein, z.B. Fiber und/oder Pentonbasis, eingesetzt werden können, können aus den adenoviralen Serotypen 1 bis 47 amplifiziert werden, die derzeit von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) verfügbar sind, oder aus einem beliebigen anderen, von einer beliebigen anderen Quelle erhältlichen Adenovirus-Serotyp. Beispielsweise kann das Adenovirus von einem Serotyp der Untergruppe A (z.B. Serotypen 12, 18, 31), der Untergruppe B (z.B. Serotypen 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35), der Untergruppe C (z.B. Serotypen 1, 2, 5, 6), der Untergruppe D (z.B. Serotypen 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22–30, 32, 33, 36–39, 42–47), der Untergruppe E (Serotyp 4), der Untergruppe F (Serotyp 40, 41) oder von einem beliebigen anderen adenoviralen Serotyp sein. Bevorzugt ist es jedoch, wenn ein Adenovirus vom Serotyp Ad2, Ad5 oder Ad9 ist. Am meisten bevorzugt ist es, wenn ein Adenovirus aus der Gruppe C kommt (insbesondere Serotyp Ad2 und Ad5), was bedeutet, dass neutralisierende Antikörper, die für andere (von Gruppe C verschiedene) Serotypen spezifisch sind, das Adenovirus nicht neutralisieren. Serotypen der Untergruppe B sind am wenigsten bevorzugt. Wünschenswerterweise umfasst ein Adenovirus Coat-Proteine (z.B. Pentonbasis, Hexon und/oder Fiber) vom gleichen Serotyp. Ebenso bevorzugt ist es jedoch, wenn das Coat-Protein, z.B. die Pentonbasis oder die Fiber, chimär ist (wie hierin näher definiert) in dem Sinne, dass es ganz oder teilweise von einem anderen Serotyp ist.
  • Vorzugsweise ist das Adenovirus replikationskompetent. Alternativ und vorzugsweise umfasst das Adenovirus ein Genom mit mindestens einer Modifikation darin, optimalerweise mit einer Modifikation, die das Virus replikationsdefizient macht. Die Modifikation des adenoviralen Genoms umfasst, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, die Deletion eines DNA-Segmentes, das Hinzufügen eines DNA-Segments, die Umlagerung eines DNA-Segmentes, das Austauschen eines DNA-Segments oder die Einführung einer DNA-Läsion. Ein DNA-Segment kann so klein sein wie ein einziges Nucleotid oder so groß wie 36 Kilobasenpaare (d.h. die ungefähre Größe des adenoviralen Genoms) oder 38 Kilobasenpaare, was die maximale Menge darstellt, die in ein adenovirales Virion verpackt werden kann (d.h. ca. 38 kb). Bevorzugte Modifikationen des adenoviralen Genoms umfassen Modifikationen, welche den Fiber-Schaft, das Fiber-Knob und die Pentonbasis beeinflussen. Ein Adenovirus kann ebenso bevorzugt ein Kointegrat sein, d.h. eine Ligation von adenoviralen genomischen Sequenzen mit anderen Sequenzen; z.B. anderen Virus-, Phagen- oder Plasmidsequenzen.
  • Rekombinantes Adenovirus
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein rekombinantes Adenovirus bereit, umfassend (a) eine Kurzschaft-Fiber, (b) ein nichtnatives Gen, welches in einer Zelle exprimiert werden kann, an die das rekombinante Adenovirus anheftet oder durch die das rekombinante Adenovirus internalisiert wird, und optional eine nichtnative Aminosäuresequenz zusätzlich zu oder anstelle einer nativen Pentonbasis- oder Fiber-Knob-Aminosäuresequenz, wobei die nichtnative Aminosäuresequenz den Zusammenbau von adenoviralen Partikeln nicht verhindert.
  • Unter der Bezeichnung "Kurzschaft-Fiber" ist eine Fiber gemeint, deren Schaft kürzer ist als der in dem entsprechenden natürlich vorkommenden, d.h. Wildtyp-Adenovirus vorliegende Schaft. Die Kurzschaft-Fiber umfasst einen Schwanz, einen Schaft und ein Knob. Der Schaft sollte hinreichend kürzer sein als der Wildtyp-Schaft für das entsprechende Adenovirus, so dass der Level oder die Effizienz der Bindung der Fiber an ihren Zelloberflächenrezeptor vermindert und die Bindung der Pentonbasis an ihren Zelloberflächenrezeptor erhöht und dadurch die Spezifität der Bindung des Adenovirus an eine gegebene Zelle erhöht wird. Beispielsweise sollte ein Schaft kürzer sein als der in Ad2 oder Ad5 vorliegende Schaft. Der Schaft kann verkürzt werden durch Ersetzen einer längeren Fiber durch eine kürzere Fiber, die von einem unterschiedlichen Serotyp sein kann. Wenn ein Schaft durch Ersetzen der ganzen Fiber (oder des Fiberschaftes und Knobs) verkürzt wird, ist es bevorzugt, wenn eine Fiber der Untergruppe C, z.B. Ad2 oder Ad5, durch eine Fiber der Untergruppe D, z.B. Ad9, ersetzt wird. Diesbezüglich können Fiber-Schaft und Knob vom gleichen Serotyp sein, oder der Schaft kann von einem Serotyp und das Knob von einem anderen Serotyp sein. Am wenigsten bevorzugt ist jedoch eine Fiber der Untergruppe B, weil die Fiber trotz ihrer kurzen Länge immer noch stark an ihren Zelloberflächenrezeptor bindet. Eine Fiber der Untergruppe B könnte jedoch verwendet werden, wenn z.B. ihr Knob in den Ad9-Serotyp geändert würde. Bevorzugt wird der Schaft jedoch verkürzt durch Deletion eines Teils des Schaftes, vorzugsweise distal des Schwanzes. Zusätzlich oder als Alternative kann das Knob von einem anderen Serotyp als der Schaft sein. Es kann also eine verkürzte Ad2- oder Ad5-Fiber verwendet werden, oder es kann eine Ad9-Fiber verwendet werden. Ferner kann ein verkürzter Ad2- oder Ad5-Fiber-Schaft mit einem Ad9-Knob verwendet werden, oder ein Ad9-Fiber-Schaft kann mit einem Ad2- oder Ad5-Knob verwendet werden. Erfindungsgemäß umfasst der Schaft nicht mehr als 12 β-Repeats, bevorzugt 6 bis 12 β-Repeats. Der Schaft der Kurzschaft-Fiber kann ein Teil eines Schaftes sein, z.B. der Teil des Schaftes, der in der Fiber des entsprechenden natürlich vor kommenden Adenovirus dem Schwanz benachbart ist. Die Kurzschaft-Fiber kann chimär sein. Ferner kann die Kurzschaft-Fiber ein αv-Integrin über eine nichtnative Sequenz binden.
  • Unter der Bezeichnung "nichtnatives Gen" ist ein beliebiges Gen gemeint, welches in dem entsprechenden natürlich vorkommenden (d.h. Wildtyp-)Adenovirus nicht vorkommt. Das nichtnative Gen kann ein beliebiges Gen sein und ist wünschenswerterweise ein therapeutisches Gen oder ein Reporter-Gen, das vorzugsweise in einer Zelle exprimiert werden kann, in die das Adenovirus eingetreten ist. Ein therapeutisches Gen kann ein Gen sein, das seine Wirkung auf RNA- oder Proteinebene ausübt. Beispielsweise kann ein von einem therapeutischen Gen codiertes Protein bei der Behandlung einer Erbkrankheit eingesetzt werden; ein Beispiel ist die Verwendung einer den Transmembran-Leitfähigkeitsregulator der cystischen Fibrose codierenden cDNA bei der Behandlung der cystischen Fibrose. Alternativ kann das von dem therapeutischen Gen codierte Protein seinen therapeutischen Effekt dadurch ausüben, dass es den Zelltod hervorruft. So kann z.B. die Expression des Proteins selbst zum Zelltod führen, wie bei der Expression von Diphterietoxin A, oder die Expression des Proteins kann Zellen selektiv sensitiv für gewisse Arzneimittel machen; so macht z.B. die Expression des Thymidinkinase-Gens aus Herpes simplex (HSV) Zellen sensitiv für antivirale Verbindungen wie Acyclovir, Gancyclovir und FIAU (1-(2-Desoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosil)-5-iodouracil).
  • Ferner kann das therapeutische Gen seine Wirkung auf der RNA-Ebene ausüben, z.B. durch Codieren einer "Antisense-Message" oder eines Ribozyms, eines Proteins, das das Spleißen oder die 3'-Prozessierung (z.B. Polyadenylierung) beeinflusst, oder eines Proteins, das den Expressionslevel eines anderen Gens innerhalb der Zelle beeinflusst (d.h. wobei Genexpression breit, als alle Schritte von der Transkriptionsinitiation bis zur Produktion eines prozessierten Proteins umfassend betrachtet wird), eventuell u.a. durch Vermittlung einer veränderten mRNA-Akkumulationsrate, einer Veränderung des mRNA-Transports und/oder einer Veränderung in der posttranskriptionalen Regulation. Die Verwendung des Ausdrucks "therapeutisches Gen" soll also diese und alle anderen Ausführungsformen dessen umfassen, was allgemein als Gentherapie bezeichnet wird, wie dem Fachmann bekannt.
  • Unter der Bezeichnung "nichtnative Aminosäuresequenz" ist eine beliebige Aminosäuresequenz gemeint, die in der Pentonbasis oder dem Fiber-Knob eines gegebenen Adenovirus nicht vorkommt und die in die Fiber oder Pentonbasis dieses Adenovirus auf der Genexpressionsebene eingeführt wird. "Nichtnative Aminosäuresequenz" umfasst eine Aminosäuresequenz von einem adenoviralen Serotyp, der von dem Serotyp des Adenovirus mit der Kurzschaft-Fiber verschieden ist, insbesondere von dem Serotyp des Fiber-Schaftes oder Knobs oder der Pentonbasis des Adenovirus mit der Kurzschaft-Fiber. Vorzugsweise verleiht die nichtnative Aminosäuresequenz der Pentonbasis oder dem Knob der Kurzschaft-Fiber die Fähigkeit, direkt oder indirekt über ein bispezifisches oder multispezifisches Bindungsagens, z.B. über einen Antikörper oder ein Fragment hiervon, an einen Zielrezeptor oder eine Klasse von Zielrezeptoren, vorzugsweise einen zellspezifischen oder gewebespezifischen Rezeptor, zu binden. Vorzugsweise wird die nichtnative Aminosäuresequenz in die Pentonbasis eingeführt. Wird die nichtnative Aminosäuresequenz jedoch in das Fiber-Knob eingeführt, so wird sie bevorzugt in eine exponierte Schleife oder am C-Terminus des Fiber-Knobs eingeführt.
  • Unter der Bezeichnung "Rezeptor" ist ein Protein, Kohlenhydrat, Lipid oder anderes Molekül oder Gruppe gemeint, die an der Oberfläche einer Zelle vorliegt, einschließlich membrangebundener und löslicher Proteine.
  • Ein "bispezifisches Bindungsagens" gemäß vorliegender Erfindung ist ein Bindungsagens mit Spezifität für mindestens zwei Moleküle (d.h. es können mehr als zwei Moleküle und das Agens damit multispezifisch sein). Ein bispezifisches Bindungsagens kann eine beliebige Kombination von einem Antikörper und/oder einer Anheftungssequenz sein, wie hierin weiter beschrieben. Ein derartiges bispezifisches (multispezifisches) Bindungsagens umfasst bevorzugt: (i) eine erste Komponente, die selektiv die bispezifische (multispezifische) Proteinbindungssequenz des Adenovirus bindet, und (ii) eine zweite Komponente, die selektiv eine gewünschte Zelloberflächen-Bindungsstelle bindet, z.B. die besondere Zelloberflächen-Bindungsstelle, die auf der Zelle vorliegt, mit der das Adenovirus in Kontakt gebracht wird.
  • Eine "Komponente" (d.h. eine erste oder eine zweite Komponente) bedeutet ein beliebiges Molekül, welches (z.B. kovalent oder nichtkovalent) mit der bispezifischen oder multispezifischen Proteinbindungsstelle auf der Pentonbasis oder dem Fiber-Knob oder einer besonderen Zelloberflächen-Bindungsstelle interagieren kann. Optimalerweise sind die erste und die zweite Komponente des bispezifischen Bindungsagens auf gewisse Weise miteinander verknüpft, z.B. durch eine kovalente Interaktion (z.B. chemische Bindung und/oder Fusion mit zwei oder mehr Proteindomänen) oder durch eine nichtkovalente Interaktion. Eine Komponente ist bevorzugt ein Antikörper (z.B. ein polyklonaler, monoklonaler, bispezifischer und/oder "Single-Chain"-Antikörper) und/oder eine Anheftungssequenz (wie etwa ein Ligand für eine Zelloberflächen-Bindungsstelle).
  • Eine Komponente, die eine Anheftungssequenz ist, ist bevorzugt ein Ligand (z.B. für eine Zelloberflächen-Bindungsstelle, wie ein Rezeptor). Die Gegenwart eines Liganden für eine Zelloberflächen-Bindungsstelle in dem bispezifischen (multispezifischen) Bindungsagens (z.B. optimalerweise in der zweiten Komponente) stellt die Zielsteuerung von Adenovirus auf Zellen bereit, die auf ihren Oberflächen diese spezifische Bindungsstelle für den Liganden aufweisen. Beispiele für bevorzugte Bindungsstellen und ihre entsprechenden Liganden oder Anheftungssequenzen umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein: CR2-Rezeptor, der die Aminosäurerest-Anheftungssequenzen EDPGFFNVE (d.h. Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu; SEQ ID Nr. 4) und EPGKQLYNVE (d.h. Glu Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu; SEQ ID Nr. 5) bindet; CD4-Rezeptor, der die V3-Schleife von HIV gp120 erkennt; Transferrin-Rezeptor und seinen Liganden; "Low-Density"-Lipoprotein-Rezeptor und seinen Liganden; den ICAM-1-Rezeptor auf Epithel- und Endothelzellen der Lunge und seinen Liganden; und Asialoglykoproteine, die deglykosylierte Proteinliganden erkennen. Ferner umfassen weitere Liganden und deren Bindungsstellen bevorzugt (ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein) Integrine, die lineare Aminosäurestrecken erkennen, z.B. die Tripeptide RGD (d.h. Arg Gly Asp) und LDV (d.h. Leu Asp Val), die Sequenz KQAGD (d.h. Lys Gln Ala Gly Asp; SEQ ID Nr. 1) und die Sequenz EILDV (d.h. Glu Ile Leu Asp Val; SEQ ID Nr. 2) sowie Polylysin- (d.h. Lys Lys Lys Lys Lys; SEQ ID Nr. 6, wobei die Sequenz ein- bis zehnmal vorliegen kann) und Polyarginin-Sequenzen (d.h. Arg Arg Arg Arg Arg; SEQ ID Nr. 7, wobei die Sequenz ein- bis zehnmal vorliegen kann). Das Inserieren von multiplen Lysinen und/oder Argininen stellt die Erkennung von Heparin und DNA bereit.
  • Eine Komponente, die ein Antikörper ist, z.B. gerichtet gegen eine besondere Zelloberflächen-Bindungsstelle oder ein Epitop, welches auf einer chimären oder Wildtyp-Pentonbasis oder Fiber-Knob vorliegt, kann in das bispezifische Bindungsagens inkorporiert sein, bevorzugt in die erste Komponente. Ein derartiger Antikörper umfasst, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, Immunoglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile hiervon, z.B. Teile, die ein Paratop (d.h. eine Antigen-Bindungsstelle) enthalten, so dass der Antikörper z.B. intakte Immunoglobulinmoleküle oder Teile hiervon, wie sie auf dem Fachgebiet als Fab, Fab', F(ab')2 und F(v) bekannt sind, umfasst. Der Antikörper kann z.B. Folgendes sein: ein monoklonaler Antikörper, ein polyklonaler Antikörper, ein "Single-Chain"-Antikörper (der z.B. ferner einen Liganden oder eine Anheftungssequenz zusätzlich zu einem Paratop umfassen kann) und ein bispezifischer Antikörper (der an sich selbst z.B. ein bispezifisches Molekül sein kann mit einem Paratop, das auf ein Epitop einer Wildtyp- oder chimären Pentonbasis oder Fiber-Knob gerichtet ist, und einem anderen Paratop, das auf ein Epitop einer Zelloberflächen-Bindungsstelle gerichtet ist).
  • Bevorzugte Antikörper in Einklang mit der Erfindung sind diejenigen, die gegen eine Zelloberflächen-Bindungsstelle gerichtet sind, insbesondere die im Vorstehenden erwähnten, und diejenigen, die gegen eine Bindungsdomäne gerichtet sind, welche ein Epitop konstituiert, das in einer Wildtyp- (d.h. nativen) oder chimären Pentonbasis oder Fiber-Knob vorliegt. Optimalerweise ist ein Antikörper also gegen den CR2-Rezeptor, den CD4-Rezeptor, den Transferrin-Rezeptor, den "Low-Density"-Lipoprotein-Rezeptor, den ICAM-1-Rezeptor, Asialoglykoproteine und ein beliebiges der Integrine gerichtet. Ebenso bevorzugt ist ein Antikörper gegen eine exponierte Region einer Pentonbasis oder eines Fiber-Knobs gerichtet (exponierte Schleife oder C-Terminus), z.B. eine Region, die von dem Capsid-Protein nach außen vorsteht und konformativ zugänglich ist zum Binden an einen bispezifischen Antikörper. Weiter bevorzugte Antikörper beiderlei Typs (d.h. gerichtet gegen eine Zelloberflächen-Bindungs stelle oder ein Epitop einer Wildtyp- oder chimären Pentonbasis oder Fiber-Knob), umfassen also, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein: den monoklonalen L230-Antikörper, der gegen αv-Integrine gerichtet ist; den monoklonalen M2-Antikörper, der gegen das FLAG-Octapeptid DYKDDDDK (d.h. Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys; SEQ ID Nr. 8) gerichtet ist; den bispezifischen L230:FLAG-Antikörper, der die monoklonalen Antikörper L230 und M2 inkorporiert; den bispezifischen OKT3:FLAG-Antikörper, der einen monoklonalen FLAG-Antikörper inkorporiert, der mit einem gegen den CD3-T-Zell-Rezeptor gerichteten Antikörper verknüpft ist; den bispezifischen ICAM:FLAG-Antikörper, der einen monoklonalen FLAG-Antikörper inkorporiert, der mit einem gegen den ICAM-1-Rezeptor gerichteten Antikörper verknüpft ist; den P1F6-Antikörper, der gegen das Integrin αvβ5 gerichtet ist; den monoklonalen 1B1.3.2.-Antikörper, der gegen die αv-Untereinheit von αv-Integrinen gerichtet ist; und den monoklonalen 12CA5-Antikörper, der gegen das Hämagglutinin-Peptid gerichtet ist.
  • Der Antikörper kann nach einer beliebigen geeigneten Technik hergestellt werden, z.B. nach konventionellen Techniken zur Herstellung monoklonaler, polyklonaler, "Single-Chain"- und bispezifischen Antikörpern, sowie aktuelleren DNA-Rekombinationstechniken, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise können insbesondere gegen Adenovirus gerichtete Antikörper hergestellt werden wie z.B. in US-Patent Nr. 4 487 829 beschrieben. Chimäre Moleküle mit einer Ligandenkomponente, die mit einer konstanten Immunoglobulin-Region verknüpft ist, und andere Immunokonjugate, z.B. bispezifische Antikörper, können hergestellt werden wie z.B. beschrieben in den US-Patenten Nr. 4 816 567, Nr. 5 349 053, Nr. 5 332 567 und Nr. 5 443 953 und in den internationalen Patentanmeldungen PCT Nr. WO 90/14424, WO 91/05805, WO 91/05871, WO 92/02553 und WO 95/16037; Cook et al., J. Immunol. Methods, 171, 227–237 (1994); und Spooner et al., Human Pathol., 25, 606–614 (1994). Im Besonderen können bispezifische Antikörper durch vielfältige Mittel hergestellt werden, z.B. durch chemische Techniken (siehe z.B. Kranz et al., PNAS (USA), 78, 5807 (1981)), beispielsweise Disulfid-Spaltungsreformation von ganzen IgG oder, vorzugsweise, F(ab')2-Fragmenten; Fusionen von mehr als einem Klon zur Bildung von Polyomas, die Immuno globuline mit mehr als einer Spezifität produzieren (siehe z.B. US-Patent Nr. 4 474 893; Segal et al., In: Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (eds.), Vol. 1, 2.13.1–2.13.16 (John Wiley & Sons, Inc. (1995)); oder durch genetisches Engineering (siehe z.B. US-Patent Nr. 4 816 567 und die internationale Patentanmeldung PCT Nr. WO 90/14424).
  • Eine Komponente, z.B. ein Antikörper und/oder eine Anheftungssequenz, welche ein bispezifisches Molekül umfasst, "bindet selektiv" eine Bindungsdomäne einer adenoviralen Pentonbasis oder Fiber-Knobs und/oder eine Zelloberflächen-Bindungsstelle, wenn sie mit einer größeren Affinität mit dieser Bindungsdomäne und/oder Zelloberflächen-Bindungsstelle interagiert oder wenn sie spezifischer ist oder eine größere Spezifität aufweist für diese Bindungsdomäne und/oder Zelloberflächen-Bindungsstelle, verglichen mit anderen Bindungsdomänen und/oder Zelloberflächen-Bindungsstellen. Die Ausdrücke "Spezifität aufweisen für" und "spezifisch sein für" beziehen sich auf den Grad der Selektivität, die ein Peptid oder Protein zeigt in Bezug auf die Zahl und Arten von Reaktanden, mit denen das Protein interagiert, und die Raten und das Ausmaß dieser Reaktionen, den Grad der Selektivität, die ein Antikörper zeigt in Bezug auf die Zahl und Arten von Antigenen, mit denen der Antikörper kombiniert, und die Raten und das Ausmaß dieser Reaktionen oder auf die Art und den Grad der Permeabilität für Substanzen, die durch ein Zelloberflächen-Bindungsprotein durch die Membran hindurch transportiert werden. Der Ausdruck "bindet selektiv" im vorliegenden Kontext bedeutet hinreichende Bindung, um für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet zu sein. Wie auf dem Fachgebiet bekannt, hängt die geeignete selektive Bindung, beispielsweise an einen Rezeptor, sowohl von der Bindungsaffinität als auch von der Ligandenkonzentration ab, die in der Nachbarschaft des Rezeptors erzielbar sind. Somit sind niedrigere als die für natürlich vorkommende kompetierende Liganden gefundenen Bindungsaffinitäten geeignet, solange die zu behandelnden Zellen oder Gewebe ausreichende Konzentrationen an zugegebenem Liganden tolerieren können, um beispielsweise für die Bindung an einen Zelloberflächenrezeptor zu kompetieren.
  • Eine "bispezifische oder multispezifische Proteinbindungssequenz" ist eine Region auf der Pentonbasis oder dem Fiber-Knob (exponierte Schleife oder C-Terminus), mit der eine Komponente interagiert. Diese Interaktion kann eine kovalente oder eine nichtkovalente Interaktion sein. Eine bispezifische oder multispezifische Proteinbindungssequenz kann ein Epitop umfassen (d.h. eine antigene Determinante oder der Teil eines Antigens, der mit einem Antikörper in einer Antigen-Antikörper-Reaktion kombiniert). Ebenso bevorzugt ist eine bispezifische oder multispezifische Proteinbindungssequenz eine Peptidsequenz oder Proteindomäne, die in der Lage ist, eine Zelloberflächen-Bindungsstelle zu erkennen. Sie ist ebenso bevorzugt eine "Koppler"-Proteinsequenz, die dazu verwendet wird, andere Proteine an das Fiber-Knob oder die Pentonbasis zu koppeln. Ein Beispiel hierfür ist eine Sequenz, wie im Stand der Technik beschrieben, die eine Biotin-Avidin(-Streptavidin)-Bindung vermittelt (z.B. wie beschrieben von Saggio et al., Biochem. J., 293, 613–616 (1993); Alon, Eur. J. Immunol., 23, 893–898 (1993); Miller et al., Biochem. J., 278, 573–585 (1991)) und als Anheftungsstelle für Avidin- und Biotin-konjugierte Proteine dient.
  • Vorzugsweise umfasst eine bispezifische oder multispezifische Proteinbindungsdomäne also eine der im Vorstehenden erwähnten Anheftungssequenzen, z.B. EDPGFFNVE (d.h. Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Val Glu; SEQ ID Nr. 4) und EPGKQLYNVE (d.h. Glu Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu; SEQ ID Nr. 5), die von dem CR2-Rezeptor erkannt werden; die V3-Schleife von HIV gp120, die von dem CD4-Rezeptor erkannt wird; den Liganden Transferrin, der von dem Transferrin-Rezeptor erkannt wird; den Liganden für den "Low-Density"-Lipoprotein-Rezeptor; den Liganden für den ICAM-1-Rezeptor auf Epithel- und Endothelzellen der Lunge; deglykosylierte Proteinliganden, die von Asialoglykoprotein erkannt werden; lineare Aminosäurestrecken, die von Integrinen erkannt werden, z.B. die Tripeptide RGD (d.h. Arg Gly Asp) und LDV (d.h. Leu Asp Val), die Sequenz KQAGD (d.h. Lys Gln Ala Gly Asp; SEQ ID Nr. 1) und die Sequenz EILDV (d.h. Glu Ile Leu Asp Val; SEQ ID Nr. 2) sowie Polylysin- (d.h. Lys Lys Lys Lys Lys; SEQ ID Nr. 6, wobei die Sequenz ein- bis zehnmal vorliegen kann) und Polyarginin-Sequenzen (d.h. Arg Arg Arg Arg Arg; SEQ ID Nr. 7, wobei die Sequenz ein- bis zehnmal vorliegen kann), die die Erkennung von Heparin und DNA bereitstellen.
  • Ebenso bevorzugt umfasst eine bispezifische oder multispezifische Proteinbindungsdomäne ein Epitop für: den monoklonalen M2-Antikörper, der gegen das FLAG-Octapeptid DYKDDDDK (d.h. Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys; SEQ ID Nr. 8) gerichtet ist; den bispezifischen L230:FLAG-Antikörper, der die monoklonalen Antikörper L230 und M2 inkorporiert; den bispezifischen OKT3:FLAG-Antikörper, der einen monoklonalen FLAG-Antikörper inkorporiert, der mit einem gegen den CD3-T-Zell-Rezeptor gerichteten Antikörper verknüpft ist; den bispezifischen ICAM:FLAG-Antikörper, der einen monoklonalen FLAG-Antikörper inkorporiert, der mit einem gegen den ICAM-1-Rezeptor gerichteten Antikörper verknüpft ist; oder den monoklonalen 12CA5-Antikörper, der gegen das Hämagglutinin-Peptid gerichtet ist. Die Bindungsdomäne kann zum Teil einen Teil der Wildtyp-Sequenz und zum Teil einen Teil der Nicht-Wildtyp-Sequenz umfassen. Ähnlich ist es nicht unbedingt notwendig, dass die (nativen und/oder nichtnativen) Sequenzen, welche die Bindungssequenz umfassen, in der Kette von Aminosäuren, welche das Protein umfassen, benachbart sind. Anders ausgedrückt: die Bindungssequenz kann hergestellt werden durch die besondere Konformation des Proteins, z.B. durch Falten des Proteins in einer Weise, dass benachbarte und/oder nichtbenachbarte Sequenzen in Proximität zueinander gebracht werden.
  • Vektoren
  • Das rekombinante Adenovirus, welches eine Kurzschaft-Fiber umfasst, und das rekombinante Adenovirus, welches zusätzlich ein oder mehrere nichtnative Gene umfasst, die in einer besonderen Zelle exprimiert werden können, können hergestellt werden durch die Verwendung eines viralen Transfervektors, bevorzugt eines adenoviralen Transfervektors gemäß vorliegender Erfindung. Der virale Transfervektor, vorzugsweise ein adenoviraler Transfervektor, umfasst eine Gensequenz, die eine Kurzschaft-Fiber wie hierin definiert codiert. Die Kurzschaft-Fiber-Gensequenz umfasst ein Gen für eine kürzere Fiber (verglichen mit dem Wildtyp) oder – bevorzugt – einen Teil eines Fiber-Gens. Die Fiber-Gensequenz umfasst einen Teil eines Fiber-Gens, der nicht mehr als 12 β-Repeats, vorzugsweise 6 bis 12 β-Repeats, codiert. Bevorzugt ist der den Schaft codierende Teil des Fiber-Gens derjenige Teil des Fiber-Gens, der die β-Repeats benachbart zum Schwanz der Fiber in einem natürlich vorkommenden, d.h. Wildtyp-Adenovirus codiert.
  • Die Erfindung stellt also ferner einen Vektor bereit, umfassend eine Gensequenz, die eine Kurzschaft-Fiber wie hierin definiert codiert. Ein "Vektor" ist ein Vehikel für den Gentransfer, wie dieser Terminus vom Fachmann verstanden wird. Die erfindungsgemäßen Vektoren umfassen, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, Plasmide, Phagen und Viren. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßer Vektor ein adenoviraler Vektor. Ein Beispiel für einen bevorzugten Vektor ist AdSe.F5F9Kshort. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind nicht auf diejenigen begrenzt, die für das erfindungsgemäße Verfahren Verwendung finden können, sondern umfassen auch Intermediärtyp-Vektoren (z.B. "Transfervektoren"), die bei der Konstruktion von Gentransfervektoren eingesetzt werden können. Beispiele für derartige Transfervektoren sind in den nachfolgenden Beispielen gegeben. Bevorzugt umfasst der Vektor ferner ein nichtnatives Gen wie im Vorstehenden beschrieben.
  • Bezüglich eines adenoviralen Vektors (insbesondere eines replikationsdefizienten adenoviralen Vektors) kann ein derartiger Vektor vollständige Capside (d.h. umfassend ein virales Genom, z.B. ein adenovirales Genom) oder leere Capside (d.h. worin ein virales Genom fehlt oder degradiert wurde, z.B. durch physikalische oder chemische Mittel) umfassen. Bevorzugt umfasst der virale Vektor vollständige Capside, d.h. als Mittel zum Tragen eines oder mehrerer nichtnativer Gene. Alternativ wird bevorzugt ein nichtnatives Gen wie oben definiert in eine Zelle an der Außenseite des adenoviralen Capsids eingetragen. Nach den gleichen Grundsätzen – da Verfahren zum Transferieren von Viren, Plasmiden und Phagen in Form ihrer Nucleinsäuresequenzen (d.h. RNA oder DNA) zur Verfügung stehen – kann ein Vektor in ähnlicher Weise RNA oder DNA umfassen, in Abwesenheit eines assoziierten Proteins wie Capsidprotein und in Abwesenheit eines Hülllipids. Ähnlich – da Liposome einen Zelleintritt durch Fusion mit Zellmembranen bewirken – kann ein Vektor Liposome mit konstitutiven Nucleinsäuren, welche das Coat-Protein codieren, umfassen. Derartige Liposome sind kommerziell erhältlich, z.B. von Life Technologies, Bethesda, MD, und können gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet werden. Ferner kann ein Liposom verwendet werden, um Gen-Delivery zu bewirken. Das lösliche chimäre Coat-Protein (wie mittels hierin beschriebener Verfahren hergestellt) kann den Liposomen nach der Herstellung der Liposomen gemäß den Empfehlungen des Herstellers oder während der Herstellung der Liposomen zugegeben werden.
  • Ein erfindungsgemäßer Vektor kann zusätzliche Sequenzen und Mutationen umfassen, z.B. innerhalb der adenoviralen Kurzschaft-Fiber, wie z.B. des Knob- und/oder Pentonbasis-Proteins und/oder nichtnativer Gensequenzen. Im Besonderen umfasst ein erfindungsgemäßer Vektor ferner bevorzugt eine Nucleinsäure umfassend ein nichtnatives Gen wie oben definiert, welches eine ganz oder teilweise synthetisch hergestellte codierende oder andere genetische Sequenz oder eine genomische oder komplementäre DNA-(cDNA-)Sequenz umfassen kann und in der Form von DNA oder RNA bereitgestellt werden kann.
  • Eine rekombinante adenovirale Kurzschaft-Fiber-Gensequenz kann in einen oder von einem adenoviralen Vektor von bzw. in Baculovirus oder einen geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionsvektor überführt werden zur Expression von mRNA und Proteinproduktion und zur Evaluierung von Rezeptor- oder Proteinspezifität und -avidität, Trimerisierungspotenzial, Pentonbasis-Bindung und anderer biochemischer Charakteristika. Im Besonderen kann das Verfahren der Proteinproduktion in Baculovirus verwendet werden wie von Wickham et al. (1995), supra, beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt also ferner rekombinante baculovirale und prokaryotische und eukaryotische Plasmide und Expressionsvektoren bereit, umfassend eine Gensequenz, die eine Kurzschaft-Fiber wie hierin definiert codiert, welche ebenfalls "Transfervektoren" sind wie hierin definiert. Die Kurzschaft-Fiber-Gensequenz kann eine nichtnative Sequenz zusätzlich zu oder anstelle einer nativen Aminosäuresequenz umfassen, wodurch die resultierende chimäre Kurzschaft-Fiber dazu befähigt wird, an einen gewünschten Zelloberflächenrezeptor direkt oder indirekt, d.h. über ein bispezifisches oder multispezifisches Bindungsagens, zu binden. Durch Überführen des chimären Gens von einem adenoviralen Vektor, PCR-Produkt oder dem Klonierungsvektor in Baculovirus oder einen prokaryotischen oder eukaryotischen Expressi onsvektor ist eine hohe Proteinexpression erzielbar (wobei ca. 5–50% des Gesamtproteins von der chimären Fiber stammen).
  • Ein erfindungsgemäßer Vektor kann ferner entweder innerhalb, anstelle oder außerhalb der Codierungssequenz der Gensequenz, welche eine Kurzschaft-Fiber wie hierin beschrieben codiert, zusätzliche Sequenzen umfassen, die z.B. die Fähigkeit eines Kurzschaft-Fiber-Proteins zum Trimerisieren beeinflussen. Eine Sequenz, welche die Fähigkeit zum Trimerisieren beeinflusst, ist eine Sequenz, die die Trimerisierung einer chimären Kurzschaft-Fiber im Kontext der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
  • Bezüglich der Herstellung von erfindungsgemäßen Vektoren (einschließlich rekombinanter adenoviraler Vektoren und Transfervektoren) können Transfervektoren unter Verwendung von molekularen und genetischen Standardtechniken, wie sie dem Fachmann bekannt sind, konstruiert werden. Vektoren, welche Virionen und Viruspartikel umfassen (z.B. rekombinante adenovirale Vektoren) können mittels viraler Vektoren in den geeigneten Zelllinien hergestellt werden. Ähnlich können Partikel, welche die Fiberchimäre enthalten, in Standardzelllinien hergestellt werden, z.B. solchen, wie sie derzeit für adenovirale Vektoren verwendet werden. Diese resultierenden Partikel können dann über die Pentonbasis, die eine nichtnative Aminosäuresequenz wie hierin definiert umfassen kann, oder über die Fiber, deren Knob eine nichtnative Aminosäuresequenz wie hierin definiert umfassen kann, auf spezifische Zellen zielgesteuert werden. Die Zielsteuerung kann direkt oder indirekt sein, z.B. über ein bispezifisches oder multispezifisches Bindungsagens wie ein Antikörper oder ein Fragment hiervon.
  • Adenovirale Kurzschaft-Fiber
  • Die vorliegende Erfindung stellt also ferner eine adenovirale Kurzschaft-Fiber bereit. Wünschenswerterweise ist die adenovirale Kurzschaft-Fiber von einer adenoviralen Wildtyp-Fiber (oder ihrer codierenden Nucleinsäuresequenz) abgeleitet, z.B. durch Ersetzen einer längeren Fiber oder eines längeren Schaftes und Knobs durch eine kürzere Fiber oder einen kürzeren Schaft und Knob oder, vorzugsweise, durch Deletion eines Teils des Schaftes einer adenoviralen Wildtyp-Fiber, vorzugsweise distal in Bezug auf den Schwanz. Zusätzlich oder als Alternative kann das Knob vom gleichen Serotyp oder von einem anderen Serotyp als der Schaft sein. Obschon ein beliebiger Serotyp von Adenovirus als Fiber-Quelle (d.h. als Quelle für DNA zur Herstellung des Proteins durch Rekombinationsmittel oder als Quelle für das Protein selbst) verwendet werden kann, wird ein Serotyp der Untergruppe C, wie Ad2 oder Ad5, oder D, wie Ad9, bevorzugt, wobei ein Serotyp der Untergruppe B am wenigsten bevorzugt ist. Der Durchschnittsfachmann ist mit den Mitteln der Proteinherstellung gut vertraut.
  • Die erfindungsgemäße Kurzschaft-Fiber ist kürzer als die von Ad2 oder Ad5 und umfasst nicht mehr als 12 β-Repeats, typisch mindestens 6 β-Repeats (z.B. sechs bis 12 β-Repeats). Idealerweise werden diese Repeats aus der Region des Fiber-Schaftes erhalten, die in einem natürlich vorkommenden Adenovirus benachbart zu dem Schwanz liegt. Die Kurzschaft-Fiber kann ferner den Zusatz einer Aminosäuresequenz zu dem Wildtyp-Protein oder den Austausch einer Aminosäuresequenz in dem Protein umfassen. Ein derartiger Zusatz oder Austausch wird bevorzugt so durchgeführt, dass die chimäre Kurzschaft-Fiber eine bispezifische oder multispezifische Proteinbindungssequenz (d.h. eine Anheftungssequenz oder ein Epitop für einen Antikörper, wie bereits beschrieben) oder eine Zellrezeptor-Bindungssequenz, z.B. eine Sequenz zum Binden an ein Integrin, in dem Fiber-Knob umfasst.
  • Wünschenswerterweise konstituiert die bispezifische oder multispezifische Proteinbindungssequenz (wie oben definiert) in einem chimären Kurzschaft-Fiber-Protein einen Zusatz zu dem Wildtyp-Protein oder einen Austausch in dem Protein von einer Aminosäuresequenz zwischen ca. 1 und ca. 250 Aminosäuren, mehr bevorzugt zwischen ca. 1 und ca. 150 Aminosäuren und optimalerweise zwischen ca. 1 und ca. 50 Aminosäuren des Fiber-Knobs. Alternativ umfasst die adenovirale Pentonbasis eine bispezifische oder multispezifische Proteinbindungssequenz wie oben definiert, die die Bindung an ein besonderes Molekül bewirkt, welches das entsprechende natürlich vorkommende (d.h. Wildtyp) adenovirale Pentonbasis-Protein nicht bindet. Alternativ und vorzugsweise umfasst die chimäre adenovirale Pentonbasis oder Fiber-Knob eine nichtnative Aminosäuresequenz, die ein Molekül bindet, z.B. einen Zellre zeptor, der von einer natürlich vorkommenden (d.h. Wildtyp-)Pentonbasis bzw. Fiber-Knob nicht gebunden wird.
  • Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Proteine (und Peptide) nach einer beliebigen aus einer Reihe von konventionellen Techniken hergestellt werden. Beispielsweise kann im Falle von rekombinanten Peptiden ein DNA-Fragment, welches ein gewünschtes Peptid codiert, mittels wohlbekannter molekulargenetischer Techniken (siehe z.B. Maniatis et al., Molecular Clonina: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)) in einen geeigneten Vektor subkloniert werden. Das Fragment kann transkribiert und das Peptid anschließend in vitro translatiert werden. Ferner können kommerziell erhältliche Kits verwendet werden (wie sie z.B. von Clontech, Palo Alto, CA; Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL; InVitrogen, San Diego, CA, u.a. hergestellt werden). Optional kann die Polymerase-Kettenreaktion bei der Manipulation von Nucleinsäuren verwendet werden.
  • Veränderungen der nativen Aminosäuresequenz, um variante Peptide herzustellen, können durch vielfältige Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden. Ein variantes Peptid ist ein Peptid, das zu einem anderen angegebenen Peptid im Wesentlichen homolog ist, aber eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von jenem Peptid unterscheidet. Der Grad der Homologie (d.h. Prozent Identität) kann z.B. bestimmt werden durch einen Vergleich von Sequenzinformationen mittels eines auf einen solchen Vergleich optimierten Computerprogramms (z.B. mit dem GAP-Computerprogramm, Version 6.0 oder höher, beschrieben von Devereux et al. (Nucleic Acids Res., 12, 387 (1984)), das von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) frei zur Verfügung gestellt wird).
  • Die Aktivität der varianten Proteine und/oder Peptide kann z.B. abgeschätzt werden durch Untersuchung der Transduktionsfähigkeit oder Zellbindungsfähigkeit, vermittelt durch eine chimäre Pentonbasis oder einen chimären Knob, in Kombination mit einem Kurzschaft-Fiber-Protein, oder unter Verwendung anderer Methoden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Bezüglich Aminosäureresten, die nicht identisch sind zwischen dem varianten Protein (Peptid) und dem Referenzprotein (-peptid), umfassen die varianten Proteine (Peptide) bevorzugt konservative Aminosäuresubstitutionen, d.h. derart, dass eine gegebene Aminosäure mit einer anderen Aminosäure von ähnlicher Größe, Ladungsdichte, Hydrophobie/Hydrophilie und/oder Konfiguration substituiert wird (z.B. Val für Phe). Die varianten ortsspezifischen Mutationen können eingeführt werden durch Ligieren eines synthetisierten, die modifizierte Stelle umfassenden Oligonucleotids in einen Expressionsvektor. Alternativ können Oligonucleotid-gerichtete ortsspezifische Mutageneseverfahren verwendet werden, wie sie z.B. in Walder et al., Gene, 42, 133 (1986); Bauer et al., Gene, 37, 73 (1985); Craik, Biotechniques, 12–19 (January 1995); und den US-Patenten Nr. 4 518 584 und Nr. 4 737 462 offenbart sind.
  • Ein beliebiger geeigneter Expressionsvektor (wie z.B. beschrieben von Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevier, NY: 1985)) und korrespondierender geeigneter Wirt können zur Herstellung von rekombinanten Peptiden verwendet werden. Expressionswirte umfassen, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, bakterielle Spezies innerhalb der Genera Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, Säugetier- oder Insektenwirtszellsysteme, einschließlich baculoviraler Systeme (wie z.B. beschrieben von Luckow et al., Bio/Technology, 6, 47 (1988)), und etablierte Zelllinien, z.B. die Zelllinien COS-7, C127, 3T3, CHO, HeLa, BHK und dergleichen. Ein besonders bevorzugtes Expressionssystem zur Herstellung von erfindungsgemäßen chimären Proteinen (Peptiden) ist das baculovirale Expressionssystem (wie z.B. von Wickham et al. (1995), supra, beschrieben), wobei Tn 5B1-4-Insektenzellen aus Trichoplusia ni oder andere geeignete Insektenzellen verwendet werden, um hohe Levels an rekombinanten Proteinen herzustellen. Dem Durchschnittsfachmann ist natürlich bewusst, dass die Wahl des Expressionswirtes Auswirkungen auf die Art des hergestellten Peptids hat. So differiert z.B. die Glykosylierung von Peptiden, die in Hefe- oder Säugetierzellen (z.B. COS-7-Zellen) hergestellt werden, von derjenigen von Peptiden, die in bakteriellen Zellen, z.B. Escherichia coli, hergestellt werden.
  • Alternativ können die erfindungsgemäßen Peptide (einschließlich der varianten Peptide) mittels Standard-Peptidsynthesetechniken synthetisiert werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind (wie z.B. zusammenfassend darstellt von Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Heidel berg: 1984)). Im Besonderen können die Peptide synthetisiert werden nach dem Verfahren der Festphasensynthese (siehe z.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149–54 (1963); Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705–739 (1987); und US-Patent Nr. 5 424 398). Falls gewünscht, kann dies unter Verwendung eines Peptidsyntheseautomaten durchgeführt werden. Die Entfernung der Aminosäureschutzgruppe t-Butyloxycarbonyl (t-BOC) oder 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) und Trennung der Peptide von dem Harz kann z.B. durch Säurebehandlung bei verminderter Temperatur durchgeführt werden. Die peptidhaltige Mischung kann dann z.B. mit Dimethylether extrahiert werden, um organische Nichtpeptid-Verbindungen zu entfernen, und die synthetisierten Peptide können aus dem Harzpulver extrahiert werden (z.B. mit ca. 25% w/v Essigsäure). Nach der Synthese des Peptids kann optional eine weitere Reinigung (z.B. mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)) durchgeführt werden, um unvollständige Peptide oder freie Aminosäuren zu eliminieren. An den synthetisierten Peptiden kann eine Aminosäure- und/oder HPLC-Analyse durchgeführt werden, um die Identität der Peptide zu validieren.
  • Falls gewünscht, können die erfindungsgemäßen Peptide oder Proteine (einschließlich der varianten Peptide oder Proteine) modifiziert werden, z.B. durch Glykosylierung, Amidierung, Carboxylierung oder Phosphorylierung, oder durch die Erzeugung von Säureadditionssalzen, Amiden, Estern, insbesondere C-terminalen Estern, und N-Acyl-Derivaten der erfindungsgemäßen Peptide. Die Peptide können ferner modifiziert werden, um Peptid-Derivate zu erzeugen durch Bildung kovalenter oder nichtkovalenter Komplexe mit anderen Gruppen. Kovalent gebundene Komplexe können hergestellt werden durch Verknüpfen der chemischen Gruppen mit funktionellen Gruppen an den Seitenketten von Aminosäuren, welche die Peptide umfassen, oder am N- oder C-Terminus. Derartige Modifikationen können z.B. besonders geeignet sein bei der Konstruktion bispezifischer Moleküle mit einem Liganden zu einem Zelloberflächenrezeptor, der an einen Antikörper geheftet ist. Weitere Modifikationen sind für den Durchschnittsfachmann erkennbar.
  • Verschiedene charakteristische harameter des interessierenden Kurzschaft-Fiber-Proteins können abgeschätzt werden. Spezifität und Affinität des Rezep tors oder andere Protein/Kurzschaft-Fiber-Interaktionen können durch Scatchard-Analyse abgeschätzt werden, wie bereits von Wickham et al (1993), supra, für Wildtyp-Pentonbasis-Protein gezeigt. Die Rezeptorspezifität kann ferner abgeschätzt werden mittels Antikörpern und Peptiden, die spezifisch sind für den gezielt angesteuerten Rezeptor, um die Kurzschaft-Fiber-Bindung an Zellen zu blockieren, unter Verwendung konventioneller Methoden. Die Kurzschaft-Fiber-Bindung an Pentonbasis-Protein kann abgeschätzt werden durch ihre Fähigkeit zur Präzipitation von radioaktiv markiertem Pentonbasis-Protein bei Kopplung an Protein-A-umhüllte Beads über einen Antikörper zu dem Kurzschaft-Fiber-Protein.
  • Virale Anheftung, Eintritt und Genexpression können anfänglich evaluiert werden durch die Verwendung des adenoviralen Vektors enthaltend das interessierende Insert, um ein rekombinantes Virus herzustellen, welches das Kurzschaft-Fiber-Protein exprimiert, und ein Marker-Gen, z.B. β-Galactosidase. β-Galactosidase-Expression in Zellen, die mit das β-Galactosidase-Gen (Ad-LacZ) enthaltendem Adenovirus infiziert sind, kann bereits zwei Stunden nach Zugabe von Ad-Gluc zu Zellen detektiert werden. Dieses Verfahren stellt eine rasche und effiziente Analyse des Zelleintritts des rekombinanten Virus und der Genexpression bereit und kann vom Durchschnittsfachmann mittels konventioneller Techniken leicht durchgeführt werden.
  • Verfahren zur Zielsteuerung der Anheftung eines Adenovirus an eine Zelle
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Zielsteuerung der Anheftung eines Adenovirus an eine Zelle zum Zelleintritt. Das Verfahren umfasst das Inkontaktbringen der Zelle mit einem rekombinanten Adenovirus wie oben beschrieben, derart, dass der Eintritt des Adenovirus in die Zelle bewirkt wird.
  • Unter der Bezeichnung "Zielsteuerung" ist die präferenzielle Einführung in eine bestimmte Zelle gegenüber einer anderen Zelle gemeint. Erfindungsgemäß kann eine Zelle eine beliebige Zelle sein und ist bevorzugt eine eukaryotische Zelle. Bevorzugt stammt die eukaryotische Zelle von einer vielzelligen Spezies (z.B. im Gegensatz zu einer einzelligen Hefezelle); noch mehr bevorzugt ist sie eine Säugetier-, z.B. eine menschliche Zelle. Wünschenswerterweise ist eine solche eukaryotische Zelle eine Zelle, in der ein Adenovirus für eine Zeitspanne (d.h. typisch für eine beliebige Zeit bis hin zu ca. 2 Monaten, potenziell sogar noch länger) nach Eintritt in die Zelle existieren kann. Optimalerweise wird naszierende RNA von dem adenoviralen Genom transkribiert, welches bevorzugt ein nichtnatives Gen umfasst, das durch das Adenovirus in die Zelle eingetragen wird, wie hierin näher beschrieben.
  • Eine Zelle kann als eine einzige Entität vorliegen oder sie kann Teil einer größeren Zellsammlung sein. Eine solche "größere Zellsammlung" kann z.B. umfassen: eine Zellkultur (gemischt oder rein), ein Gewebe (z.B. das Epithelgewebe oder ein anderes Gewebe), ein Organ (z.B. Herz, Lunge, Leber, Gallenblase, Harnblase, Auge und andere Organe), ein Organsystem (z.B. das Zirkulationssystem, das Respirationssystem, das gastrointestinale System, das Harnsystem, das Nervensystem, das Haut- und Hautanhangsystem oder ein anderes Organsystem), oder ein Organismus (z.B. ein Vogel, Säugetier oder dergleichen). Bevorzugt sind die gezielt angesteuerten Organe/Gewebe/Zellen ausgewählt aus dem Zirkulationssystem (z.B. inklusive, jedoch nicht beschränkt auf Herz, Blutgefäße und Blut), dem Respirationssystem (z.B. Nase, Pharynx, Larynx, Trachea, Bronchien, Bronchiolien, Lunge und dergleichen), dem gastrointestinalen System (z.B. inklusive Mund, Pharynx, Ösophagus, Magen, Darm, Speicheldrüsen, Pankreas, Leber, Gallenblase u.a.), dem Harnsystem (z.B. Nieren, Ureter, Harnblase, Urethra und dergleichen), dem Nervensystem (z.B. inklusive, jedoch nicht beschränkt auf Gehirn und Rückenmark und spezielle Sinnesorgane, z.B. das Auge) und dem Haut- und Hautanhangsystem (z.B. die Haut). Noch mehr bevorzugt sind die gezielt angesteuerten Zellen ausgewählt aus der Gruppe, welche aus Herz-, Blutgefäß-, Lungen-, Leber-, Gallenblasen-, Harnblasen- und Augenzellen besteht.
  • Im Besonderen unterscheidet sich eine Zelle, auf die ein rekombinantes Adenovirus zielgesteuert ist, von einer anderen, nicht gezielt angesteuerten Zelle darin, dass die so gezielt angesteuerte Zelle eine besondere Zelloberflächen-Bindungsstelle umfasst. Unter dem Ausdruck "besondere Zelloberflächen-Bindungsstelle" ist eine beliebige auf der Oberfläche einer Zelle vorliegende Stelle (d.h. ein Molekül oder eine Kombination von Molekülen) gemeint, mit der das Adenovirus interagieren kann, um an die Zelle anzuheften und dadurch den Zelleintritt zu fördern. Eine besondere Zelloberflächen-Bindungsstelle umfasst daher einen Zelloberflächenrezeptor und ist bevorzugt ein Protein (inklusive eines modifizierten Proteins), ein Kohlenhydrat, ein Glykoprotein, ein Proteoglykan, ein Lipid, ein Muzinmolekül oder Mukoprotein und dergleichen. Beispiele für potenzielle Zelloberflächen-Bindungsstellen umfassen, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein: Heparin- und Chondroitinsulfat-Gruppen, welche auf Glykosaminoglykanen vorkommen; Sialinsäuregruppen, welche auf Muzinen, Glykoproteinen und Gangliosiden vorkommen; Haupthistokompatibilitätskomplex I-(MHC I)-Glykoproteine; die üblichen Kohlenhydratmoleküle, die in Membranglykoproteinen vorkommen, einschließlich Mannose, N-Acetylgalactosamin, N-Acetylglucosamin, Fukose und Galaktose; Glykoproteine, z.B. ICAM-1, VCAM, E-Selektin, P-Selektin, L-Selektin und Integrinmoleküle; und tumorspezifische Antigene, welche auf Krebszellen vorliegen, z.B. MUC-1-tumorspezifische Epitope. Jedoch ist das vorliegende Verfahren zur Zielsteuerung eines Adenovirus auf eine Zelle nicht begrenzt auf einen spezifischen Mechanismus der zellulären Interaktion (d.h. Interaktion mit einer gegebenen Zelloberflächen-Bindungsstelle) und soll nicht so verstanden werden.
  • Wenn das Verfahren zur Zielsteuerung der Anheftung eines der oben beschriebenen rekombinanten Adenoviren die Verwendung eines bispezifischen oder multispezifischen Bindungsagens involviert, so umfasst das Verfahren (a) Inkontaktbringen des Adenovirus mit einem bispezifischen oder multispezifischen Bindungsagens umfassend: (i) eine erste Komponente, die selektiv die bispezifische bzw. multispezifische Proteinbindungssequenz des Adenovirus (z.B. die Antikörper-Bindungsstelle) bindet, und (ii) eine zweite Komponente, die selektiv eine Zelloberflächen-Bindungsstelle auf der Zelle bindet, um so einen Komplex aus dem Adenovirus und dem bispezifischen oder multispezifischen Bindungsagens, z.B. einem Antikörper, zu bilden; und (b) Inkontaktbringen der Zelle mit dem Komplex aus (a), so dass der Eintritt des Adenovirus in die Zelle bewirkt wird.
  • Zur Optimierung der Fähigkeit des Adenovirus zum Zelleintritt durch das erfindungsgemäße Verfahren wird das Verfahren bevorzugt durchgeführt in Abwesenheit von neutralisierenden Antikörpern, die gegen das besondere Adenovirus, welches intrazellulär eingeführt wird, gerichtet sind. In Abwesenheit sol cher Antikörper besteht keine Möglichkeit, dass das Adenovirus durch den Antikörper gebunden und damit an einer Bindung an die Zelle und/oder einen Eintritt in die Zelle gehindert wird. Für den Durchschnittsfachmann ist es leicht möglich, auf die Anwesenheit solcher neutralisierender Antikörper zu testen. In dem Falle, dass die Anwesenheit solcher neutralisierender Antikörper ein Hindernis für das intrazelluläre Delivery eines Adenovirus bedeutet, kann ein anderer adenoviraler Vektor, z.B. ein adenoviraler Vektor anderen Serotyps (Crompton et al., J. Gen. Virol., 75, 133–139 (1994)), oder ein anderer adenoviraler Vektor, dem das Epitop fehlt, gegen das der Antikörper gerichtet ist, verwendet werden.
  • Ein "Komplex" aus dem Adenovirus und dem bispezifischen (multispezifischen) Molekül ist eine beliebige Interaktion, z.B. kovalent oder nichtkovalent, zwischen dem Adenovirus und dem bispezifischen (multispezifischen) Molekül, vorzugsweise eine nichtkovalente Interaktion. Ein solches "Inkontaktbringen" kann durchgeführt werden durch beliebige Mittel, wie sie dem Fachmann bekannt und hierin beschrieben sind, durch die die scheinbare Berührung oder gegenseitige Berührung des Adenovirus und des bispezifischen (multispezifischen) Moleküls oder der Zelle und des Komplexes aus dem Adenovirus und dem bispezifischen (multispezifischen) Molekül bewirkt werden kann. Beispielsweise kann das Inkontaktbringen des Adenovirus und des bispezifischen (multispezifischen) Moleküls durchgeführt werden durch Mischen dieser Elemente in einem kleinen Volumen der gleichen Lösung. Optional können die Elemente ferner kovalent verbunden werden, z.B. durch dem Fachmann bekannte chemische Mittel oder andere Mittel, oder sie können – vorzugsweise – mittels nichtkovalenter Interaktionen (z.B. ionische Bindungen, Wasserstoffbindungen, Van-der-Waals-Kräfte und/oder nichtpolare Interaktionen) verknüpft werden. Im Vergleich dazu müssen die Zelle und der Komplex nicht unbedingt in einem kleinen Volumen in Kontakt gebracht werden, z.B. in Fällen, wo der Komplex einem Wirt (z.B. einem Menschen) verabreicht wird und der Komplex mit dem Blutstrom zu der Zelle wandert, an die er selektiv bindet und eintritt. Das Inkontaktbringen des Adenovirus mit einem bispezifischen (multispezifischen) Molekül wird vorzugsweise durchgeführt, bevor die Zelle mit dem Komplex aus dem Adenovirus und dem bispezifischen (multispezifi schen) Molekül in Kontakt gebracht wird. Der Ausdruck "bevor" bedeutet eine beliebige Zeitspanne vor dem Inkontaktbringen der Zelle, die ausreichend ist, um zu gewährleisten, dass ein Komplex aus dem Adenovirus und dem bispezifischen Molekül gebildet wird, bevor der Komplex mit der Zelle in Kontakt gebracht wird, d.h. eine Zeitspanne, die von ca. 5 Minuten bis ca. 5 Jahre reichen kann (oder ungefähr so lange wie die maximale Zeitspanne, über die ein Komplex aus einem Adenovirus und einem bispezifischen Molekül in gebrauchsfähiger Form stabil erhalten bleiben kann, z.B. lyophilisiert oder in der Gegenwart von cryoprotektiven Agenzien bei –80°C).
  • Es gibt mehrere bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung. Beispielsweise wird bevorzugt das Verfahren ausgeführt, bei dem das Adenovirus ein nichtnatives Gen umfasst, wie hierin beschrieben. Ebenso bevorzugt wird das Verfahren ausgeführt, bei dem die Zelle, die eine besondere Zelloberflächen-Bindungsstelle umfasst, eine Zelle ist, an die das entsprechende Wildtyp-Adenovirus typisch nicht bindet (d.h. transduziert oder infiziert) oder mit einer ersichtlich niedrigen Effizienz bindet. Ebenso bevorzugt ist es jedoch, das Verfahren so auszuführen, dass das Adenovirus in eine beliebige Zelle eingeführt wird, selbst in eine Zelle, an die das Wildtyp-Adenovirus mit relativ hoher Effizienz bindet und eintritt (z.B. Epithelzellen).
  • Das Verfahren kann so ausgeführt werden, dass das bispezifische Molekül ein bispezifischer Antikörper ist, umfassend (a) einen ersten Antikörper, der selektiv an eine bispezifische Proteinbindungssequenz des Fiber-Knobs oder der Pentonbasis bindet, und (b) einen zweiten Antikörper, der selektiv die Zelloberflächen-Bindungsstelle bindet, die auf der Oberfläche der Zelle vorliegt, mit der das Adenovirus in Kontakt gebracht wird, um so den Zelleintritt des Adenovirus zu bewirken. Dieses Verfahren wird optional so ausgeführt, dass ein Adenovirus verwendet wird, welches eine Wildtyp- oder eine chimäre adenovirale Pentonbasis umfasst, wie hierin näher beschrieben. Die chimäre adenovirale Pentonbasis umfasst vorzugsweise eine nichtnative Aminosäuresequenz, die eine Bindungsdomäne ist, welche die Bindung an ein besonderes Molekül bewirkt, das die adenovirale Wildtyp-Pentonbasis nicht bindet. Die Bindungsdomäne der chimären adenoviralen Pentonbasis (wie die Bindungsdomäne der adenoviralen Wildtyp-Pentonbasis) umfasst vorzugsweise ein Epitop für den ersten Antikörper. Bevorzugt umfasst das Epitop des chimären adenoviralen Pentonbasis-Proteins eine Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus SEQ ID Nr. 8 (d.h. DYKDDDDK oder Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys), SEQ ID Nr. 9 (d.h. TSEAAAHAIRGDTYADYKDDDDKGSS oder Thr Ser Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Arg Gly Asp Thr Tyr Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Ser), SEQ ID Nr. 10 (d.h. TSEAAAHAIRGDTYPYDVPDYAGSS oder Thr Ser Glu Ala Ala Ala His Ala Ile Arg Gly Asp Thr Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Ser) und SEQ ID Nr. 11 (d.h. YPYDVPDYA oder Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala) oder Ableitungen dieser Sequenzen (d.h. umfassend Deletionen und/oder Mutationen), die von den monoklonalen Antikörpern M2 oder 12CA5 oder von anderen Antikörpern, die gegen die FLAG- oder Hämaglutinin-Peptide gerichtet sind, erkannt werden (US-Patentanmeldung Serial No. 08/634 060).
  • Ebenso bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt, bei dem ferner umfasst ist, die Bindung der Fiber des Adenovirus, das zur Anheftung an eine Zelle zielgesteuert wird, aufzuheben (d.h. zu verhindern). Im Besonderen wird vorzugsweise die Bindung der adenoviralen Fiber an eine Zelloberflächen-Bindungsstelle, durch die das Adenovirus einen Zelleintritt bewirken kann, aufgehoben. Bei dieser bevorzugten Ausführungsform ist jegliche Interaktion der Fiber mit ihrem Zelloberflächenrezeptor im Wesentlichen eliminiert, wodurch ausgeschlossen wird, dass irgendeine dieser Interaktionen mit der Fähigkeit der Pentonbasis zur Zielsteuerung der Zellbindung/Zelleintritt auf einen besonderen Zelloberflächenrezeptor interferiert. Der Teil des Fiber-Knobs, der Affinität zu dem adenoviralen Rezeptor einer Zielzelle aufweist, wird zur Interaktion mit diesem Rezeptor unfähig gemacht durch Kürzen des Schaftes des adenoviralen Fiber-Proteins. Jedoch behält das Fiber-Protein die Funktionen bei, die für die virale Viabilität kritisch sind, z.B. Trimerisierungspotenzial. Das Kurzschaft-Fiber-Protein gemäß vorliegender Erfindung ist also bevorzugt in der Lage zu trimerisieren, und sofern es nicht weiter spezifisch modifiziert ist, um eine Bindung an einen adenoviralen Rezeptor zu verhindern, ist es in der Lage, mit Wildtyp-Viren zu kompetieren, die ein ansonsten identisches Volllängeschaft-Fiber-Protein zum Binden an den adenoviralen Rezeptor umfassen. Die Bindung eines Adenovirus an eine Zelle ist ein stochasti scher Prozess. Daher kann die Kurzschaft-Fiber einen kleinen Teil der Bindung an die Zielzellen vermitteln. Jedoch wird die Kurzschaft-Fiber-Bindung an Zielzellen in Adenoviren beträchtlich verringert, bevorzugt um mindestens 90%, noch bevorzugter um mindestens 95%. Bei vielen erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist es wünschenswerterweise die Adenovirus-Pentonbasis, die die Zellbindung/Zelleintritt steuert.
  • Dieses Verfahren wird bevorzugt ausgeführt, wobei das Adenovirus eine chimäre oder eine Wildtyp-Pentonbasis wie oben beschrieben umfasst, wie hierin noch näher beschrieben. Beispielsweise wird wünschenswerterweise die Bindung aufgehoben durch Inkontaktbringen des Adenovirus mit einem Antikörper, der selektiv an ein Epitop der adenoviralen Wildtyp-Fiber bindet. Bevorzugt bindet dieser Antikörper (oder ein anderes Agens) in einer Weise, dass die Interaktion der adenoviralen Fiber mit ihrem Rezeptor verhindert wird. Noch mehr bevorzugt ist der Antikörper ein funktionsblockierender Antikörper.
  • Alternativ und bevorzugt umfasst das in dem Verfahren verwendete Adenovirus (welches eine chimäre oder eine Wildtyp-Pentonbasis umfasst) ferner eine chimäre adenovirale Fiber. Optional wird die Bindung der chimären adenoviralen Fiber im Wesentlichen aufgehoben durch Inkontaktbringen des Adenovirus mit einem Antikörper oder einem anderen Agens, das selektiv ein Epitop der chimären adenoviralen Fiber bindet. Wünschenswerterweise bindet dieser Antikörper (oder andere Agens) in einer Weise, dass die Interaktion der adenoviralen Fiber mit ihrem Rezeptor verhindert wird.
  • Das Kurzschaft-Adenovirus kann ferner wünschenswerterweise ein chimäres adenovirales Fiber-Knob umfassen, welches dadurch charakterisiert ist, dass es natürlicherweise unfähig ist, an eine Zelle zu binden, an die das entsprechende adenovirale Wildtyp-Fiber-Knob binden kann. Zum Beispiel kann das adenovirale Fiber-Knob eine nichtnative Aminosäuresequenz umfassen, die eine Bindungsdomäne für einen unterschiedlichen Zellrezeptor ist und/oder das Fiber-Knob kann von einem Serotyp sein, der von dem Serotyp des Schaftes verschieden ist. Der Wechsel von Fiber-Proteinen, um ein Kurzschaft-Adenovirus zu bilden, ist ferner vorteilhaft, weil die kürzere Länge des in dem Verfahren verwendeten chimären Fiber-Proteins vorzugsweise bispezifischen Antikörpern, die an die Pentonbasis komplexiert sind, die Interaktion der chimären Fiber (z.B. der Ad9-Fiber) mit dem adenoviralen Fiber-Rezeptor sterisch zu hindern erlaubt.
  • Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zum Einführen eines Adenovirus in eine Zelle, die eine besondere Zelloberflächen-Bindungsstelle umfasst, bevorzugt ausgeführt unter Verwendung der erfindungsgemäßen rekombinanten adenoviralen Vektoren wie hierin beschrieben.
  • Beispielhafte Verwendungen
  • Ein Vektor gemäß vorliegender Erfindung kann in vitro verwendet werden. Ein solcher Vektor kann als Forschungswerkzeug beim Studium der adenoviralen Anheftung und Infektion von Zellen und in einem Verfahren zum Testen der Bindungsstelle-Liganden-Interaktion verwendet werden. Ähnlich kann ein adenoviraler Vektor, insbesondere ein adenoviraler Vektor, der ein adenovirales Kurzschaft-Fiber-Gen umfasst, in vivo verwendet werden.
  • Im Besonderen können rekombinante Adenoviren gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden zur Behandlung einer Reihe von Erkrankungen durch das Delivery von korrektiver DNA, d.h. DNA, die eine Funktion codiert, die entweder fehlt oder beeinträchtigt ist, oder eines diskreten "Killing"-Agens, z.B. DNA, die ein Cytotoxin codiert, welches z.B. nur intrazellulär aktiv ist, oder DNA, welche z.B. Ribozyme oder Antisense-Moleküle codiert, in gezielt angesteuerte Zellen. Dementsprechend soll die Verwendung des Ausdrucks "nichtnatives adenovirales Gen" (z.B. als ein "therapeutisches Agens" codierend) diese und andere Ausführungsformen dessen umfassen, was allgemein als Gentherapie bezeichnet wird, wie dem Fachmann bekannt. Erkrankungen, die Kandidaten für eine derartige Behandlung sind, umfassen beispielsweise Krebs, z.B. Melanom und Gliom, cystische Fibrose, genetische Störungen und pathogene Infektionen, einschließlich HIV-Infektion.
  • So kann beispielsweise ein rekombinantes Adenovirus mit einer Kurzschaft-Fiber, das von αvβ3-Rezeptoren erkannt wird, zur Behandlung von Melanom und Gliom verwendet werden, und ein rekombinantes Adenovirus, welches von α3β1-Rezeptoren erkannt wird und das Transmembran-Regulator-Gen der cystischen Fibrose (CFTR-Gen) exprimiert, kann zur Behandlung von cystischer Fibrose verwendet werden durch Delivery in die Epithelzellen der Lunge. Ferner können verschiedene blutbezogene Erkrankungen behandelt werden durch die Verwendung von einem rekombinanten Adenovirus, welches von αmβ2-Rezeptoren erkannt wird, um gezielt Neutrophile und Makrophagen anzusteuern, einem rekombinanten Adenovirus, welches von α4β1-Rezeptoren erkannt wird, um gezielt Lymphocyten anzusteuern, einem rekombinanten Adenovirus, welches von αIIbβ3-Rezeptoren erkannt wird, um gezielt Plättchen und Megakaryocyten anzusteuern, und einem rekombinanten Adenovirus, welches von αvβ3-Integrinen erkannt wird, um gezielt Endothelzellen anzusteuern, die zur Angiogenese fähig sind.
  • Die αv-Integrine sind gewebespezifische Rezeptoren, die für die zielgesteuerte Gentherapie geeignet sind. Die αv-Integrin-Expression wird in der Mehrzahl der Melanome (Albelda et al., Cancer Res., 50, 6757–6764 (1990)) und Glioblastome (Gladson et al., J. Clin. Invest., 88, 1924 (1991)) aktiviert. Die Zielsteuerung eines therapeutischen Adenovirus auf die αv-Integrine auf diesen Zellen erlaubt z.B. das Delivery eines toxischen Gens bei gleichzeitiger Vermeidung des Gen-Delivery in gesundes umliegendes Gewebe. Ferner wird das αvβ3-Integrin auf proliferierenden Endothelzellen exprimiert (Brooks et al, Science, 264, 569–571 (1994); Brooks et al., Cell, 79, 1157–1165 (1994)). Die gezielte Ansteuerung des αvβ3-Rezeptors auf diesen Zellen kann nützlich sein, um ihre Proliferation zu verhindern, z.B. bei der Verminderung des Tumorwachstums oder in der Behandlung von Netzhauterkrankungen, oder zur Förderung weiterer Vaskularisierung, z.B. der Förderung der Revaskularisierung von ischämischem Gewebe.
  • Ferner können andere Zellen, z.B. solche Zellen, die Adenovirus typisch nicht infiziert, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens gezielt angesteuert werden, z.B. durch Zielsteuerung der Anheftung des Adenovirus an Zellrezeptoren auf diesen Zellen oder durch Erhöhen der Eintrittseffizienz (d.h. Spezifität) für diese Zellen. Dies kann durch vielfältige Mittel durchgeführt werden, vorzugs weise durch die Verwendung eines bispezifischen oder multispezifischen Bindungsagens, z.B. durch einen Antikörper, der ein Adenovirus an einen besonderen Zellrezeptor anheftet.
  • Weitere Anwendungen des Verfahrens und der Komponenten der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann erkennbar.
  • Mittel der Verabreichung
  • Die Vektoren gemäß vorliegender Erfindung können verwendet werden, um in vitro oder in vivo mit Zellen in Kontakt gebracht zu werden. Erfindungsgemäß bedeutet "Inkontaktbringen" beliebige Mittel, mit denen der Zelleintritt eines Vektors bewirkt wird; das Verfahren ist nicht von besonderen Mitteln der Einführung abhängig und soll nicht so verstanden werden. Mittel der Einführung sind dem Fachmann wohlbekannt und sind ferner beispielhaft hierin erläutert.
  • Demnach kann die Einführung z.B. in vitro (z.B. in einem ex vivo-Verfahren der Gentherapie oder in Gewebekulturstudien) oder in vivo durch Elektroporation, Transformation, Transduktion, Konjugation oder "Triparental Mating", (Ko-)Transfektion, (Ko-)Infektion, Membranfusion mit kationischen Lipiden, Hochgeschwindigkeitsbombardement mit DNA-umhüllten Mikroprojektilen, Inkubation mit Calcium-Phosphat-DNA-Präzipitat, direkte Mikroinjektion in Einzelzellen und dergleichen bewirkt werden. Ähnlich können die Vektoren mittels kationischer Lipide, z.B. Liposome, eingeführt werden. Solche Liposome sind kommerziell erhältlich (z.B. Lipofectin®, LipofectamineTM und dergleichen von Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Ferner können Liposome mit erhöhter Transferkapazität und/oder verminderter Toxizität in vivo (siehe z.B. die internationale Patentanmeldung PCT Nr. WO 95/21259) für vorliegende Erfindung verwendet werden. Ferner stehen andere Methoden zur Verfügung und sind dem Fachmann bekannt.
  • Für den Fachmann ist erkennbar, dass geeignete Verfahren zur Verabreichung eines Vektors (insbesondere eines adenoviralen Vektors) gemäß vorliegender Erfindung an ein Tier zum Zwecke der Gentherapie (siehe z.B. Rosenfeld et al., Science, 252, 431–434 (1991); Jaffe et al., Clin. Res., 39(2), 302A (1991); Rosenfeld et al., Clin. Res., 39(2), 311A (1991); Berkner, BioTechniques, 6, 616–629 (1988)), Chemotherapie und Impfung zur Verfügung stehen und dass man zwar mehr als eine Route zur Verabreichung verwenden kann, dass aber die eine Route eine unmittelbarere und effektivere Reaktion bereitstellen kann als die andere Route. Pharmazeutisch zulässige Exzipienten sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt und sind leicht verfügbar. Die Wahl des Exzipienten wird zum Teil bestimmt durch das besondere Verfahren, welches zur Verabreichung des Vektors verwendet wird. Dementsprechend gibt es eine breite Vielfalt an geeigneten Formulierungen zur Verwendung im Kontext der vorliegenden Erfindung. Die folgenden Verfahren und Exzipienten sind rein exemplarisch und in keiner Weise limitierend.
  • Zur oralen Verabreichung geeignete Formulierungen können bestehen aus: (a) flüssigen Lösungen, z.B. aus einer wirksamen Menge der Verbindung, gelöst in Verdünnungsmitteln wie Wasser, Kochsalzlösung oder Orangensaft; (b) Kapseln, Sachets oder Tabletten, die jeweils eine vorgegebene Menge der Aktivsubstanz als Feststoffe oder Granulen enthalten; (c) Suspensionen in einer geeigneten Flüssigkeit; und (d) geeignete Emulsionen. Tablettenformen können eine oder mehrere der folgenden Komponenten umfassen: Lactose, Mannitol, Maisstärke, Kartoffelstärke, mikrokristalline Cellulose, Acacia, Gelatine, kolloidales Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Talkum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Exzipienten, Farbmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Feuchthaltemittel, Konservierungsmittel, Geschmackstoffe und pharmakologisch kompatible Exzipienten. Pastillenformen können die Aktivsubstanz in einem Geschmackstoff umfassen, üblicherweise Saccharose und Acacia oder Tragant, sowie Pastillen, welche die Aktivsubstanz in einer inerten Grundlage, z.B. Gelatine und Glycerin, Emulsionen, Gelen und dergleichen umfassen, die neben der Aktivsubstanz solche Exzipienten enthalten, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind.
  • Ein Vektor gemäß vorliegender Erfindung kann – für sich allein oder in Kombination mit anderen geeigneten Komponenten – zu Aerosol-Formulierungen verarbeitet werden, welche durch Inhalation zu verabreichen sind. Diese Aerosol-Formulierungen können in zulässige Drucktreibmittel eingebracht werden, z.B. Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dergleichen. Sie können ferner als Arzneimittel für drucklose Zubereitungen, z.B. in Nebulisatoren oder Zerstäubern, formuliert werden.
  • Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen umfassen wässrige und nichtwässrige isotonische, sterile Injektionslösungen, welche Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Substanzen, welche die Formulierung auf Isotonie mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers einstellen, enthalten können, sowie wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, welche Suspensionsmittel, Lösungsvermittler, Verdickungsmittel, Stabilisatoren und Konservierungsmittel umfassen können. Die Formulierungen können in versiegelten Einzeldosis- oder Mehrdosenbehältnissen, z.B. Ampullen und Vials, dargeboten werden und können in gefriergetrocknetem (lyophilisiertem) Zustand gelagert werden, wobei nur die Zugabe des sterilen flüssigen Exzipienten wie Wasser für Injektionen unmittelbar vor Gebrauch erforderlich ist. Extemporane Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granulen und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
  • Ferner kann ein Vektor gemäß vorliegender Erfindung zu Suppositorien verarbeitet werden durch Mischen mit einer Vielfalt von Grundlagen, z.B. mit emulgierenden Grundlagen oder wasserlöslichen Grundlagen.
  • Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schaumpräparate oder Sprayformulierungen dargeboten werden, welche neben der Aktivsubstanz solche Träger enthalten, wie sie auf dem Fachgebiet als geeignet bekannt sind.
  • Die einem Tier, insbesondere einem Menschen verabreichte Dosis im Kontext der vorliegenden Erfindung variiert je nach dem interessierenden Gen, der verwendeten Zusammensetzung, der Verabreichungsmethode und dem jeweils behandelten Ort und Organismus. Bevorzugt wird jedoch eine Dosis korrespondierend zu einer wirksamen Menge eines Vektors (z.B. eines erfindungsgemäßen adenoviralen Vektors) verwendet. Eine "wirksame Menge" bedeutet eine Menge, die ausreichend ist, um in einem Wirt den gewünschten Effekt zu erzeugen, der unter Verwendung mehrerer Endpunkte überwacht werden kann, wie dem Fachmann bekannt. Ein gewünschter Effekt ist z.B. der Nucleinsäuretransfer in eine Wirtszelle. Ein derartiger Transfer kann durch vielfältige Mittel überwacht werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf einen therapeutischen Effekt (z.B. Milderung eines mit der behandelten Erkrankung, Zustand, Störung oder Syndrom assoziierten Symptoms), oder weiteren Nachweis des transferierten Gens oder Codierungssequenz oder deren Expression in dem Wirt (z.B. mittels Polymerase-Kettenreaktion, Northern- oder Southern-Hybridisierungen oder Transkriptionsassays, um die Nucleinsäure in Wirtszellen zu detektieren, oder mittels Immunoblot-Analyse, antikörpervermittelter Detektion oder partikularisierten Assays zum Detektieren von Protein oder Polypeptid, das von der transferierten Nucleinsäure codiert oder in Level oder Funktion infolge eines solchen Transfers beeinflusst wird). Diese beschriebenen Verfahren sind keineswegs allumfassend, und für den Durchschnittsfachmann sind weitere Verfahren, den Bedürfnissen der spezifischen Anwendung angepasst, erkennbar.
  • Um den effektiven Transfer der Vektoren gemäß vorliegender Erfindung zu gewährleisten, ist es allgemein bevorzugt, wenn ca. 1 bis ca. 5 000 Kopien des erfindungsgemäßen adenoviralen Vektors pro zu kontaktierende Zelle verwendet werden, basierend auf einer ungefähren Zahl von zu kontaktierenden Zellen in Hinsicht auf die gegebene Verabreichungsroute, und es ist noch mehr bevorzugt, wenn ca. 3 bis 300 pfu in jede Zelle eintreten. Dies ist jedoch nur eine allgemeine Richtlinie, die keinesfalls die Verwendung größerer oder kleinerer Mengen ausschließt, wie dies für eine besondere Anwendung in vitro oder in vivo gerechtfertigt sein mag. Beispielsweise können die tatsächliche Dosis und der Plan variieren in Abhängigkeit davon, ob die Zusammensetzung in Kombination mit anderen pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht wird, oder in Abhängigkeit von interindividuellen Unterschieden in Bezug auf Pharmakokinetik, Arzneimitteldisposition und Metabolismus. Ähnlich können die Mengen in in vitro-Anwendungen variieren in Abhängigkeit von dem besonderen Zelltyp, der gezielt angesteuert wird, oder den Mitteln, durch die der Vektor transferiert wird. Für den Fachmann ist es leicht möglich, die notwendigen Anpassungen gemäß den Erfordernissen der besonderen Situation vorzunehmen.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, ohne ihren Bereich in irgendeiner Weise begrenzen zu wollen.
  • Bezüglich der folgenden Beispiele gilt:
  • Alle DNA-Manipulationen wurden gemäß Standardprotokollen durchgeführt (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assocs./Wiley-Interscience, New York (1989)).
  • Die Proteinanalyse mittels SDS-PAGE und Western-Blotting wurde ebenfalls gemäß veröffentlichten Protokollen durchgeführt (Ausubel et al., supra; und Laemmli, Nature, 227, 680–685 (1970)).
  • Ad2, Ad3, Ad5 und Ad9 wurden als Stocks von der ATCC (Rockville, MD) erhalten und auf A549- oder HeLa-Zellen in Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD) mit Zusatz von in 5% fötalem Kälberserum (FCS) passagiert.
  • Die Zelllinien HepG2, Hs 700T, A172, 0118 und Tera 2 wurden von ATCC erhalten und wurden in DMEM mit Zusatz von 5% FCS gehalten.
  • Die Zelllinien Ramos und Y79 wurden ebenfalls von der ATCC erhalten und wurden in RPMI (Gibco BRL) mit Zusatz von 5% FCS gehalten.
  • Humane glatte Aortenmuskelzellen (HASMS) wurden von Cell Systems Corp. (Kirklans, WA) bezogen und in MCDB (Gibco BRL) mit 5% FCS gehalten.
  • Humane Melanom-ACA19-Zellen waren eine Gabe von John Hilkens (Netherlands Cancer Institute, Amsterdam) und wurden in DMEM mit 5% FCS gehalten.
  • Hamster-Melanom-CS-1-Zellen waren eine Gabe von Caroline Damsky (Schools of Dentistry and Medicine, UCSF, San Francisco, CA).
  • Das β5-Integrin-Untereinheit-Gen wurde von Sarah Bodary (Genentech Inc., South San Francisco, CA) erhalten.
  • Die CS-1-Zellen und Ableitungen hiervon wurden in DMEM mit 5% FCS gehalten.
  • 3H-Methylthymidin-markierte Adenoviren wurden erhalten durch Infizieren von A549-Monolayern (ca. 12 Millionen Zellen/Kolben) bei einer Multiplizität der Infektion (moi) von 5. 24 Stunden nach Infektion (Postinfektion; pi) wurden 0,5 mCi von 3H-Methylthymidin in einem Volumen von 10 ml hinzugegeben. Nach Inkubieren über Nacht in diesem geringen Volumen wurden 15 ml Medium hinzugegeben und die Zellen 55–96 h pi geerntet. Die Zellen wurden dann pelletiert, zweimal gewaschen und in DMEM mit 10 mM Tris, pH = 8,0 resuspendiert. Das Virus wurde aus den Zellen durch drei Gefrier-Tau-Zyklen freigesetzt und das Zelldebris durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde auf einen CsCl-Gradienten geschichtet und für 5 h bei 22 500 U/min zentrifugiert. Die Virusbande wurde gesammelt und über Nacht gegen 10 mM Tris, pH = 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 10% Glycerol dialysiert. Das Dialysat wurde aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Reinigung von adenoviralen Proteinen.
  • Die Fiber-Sequenzen von Ad3 (GenBank-Accession Nr. M12411; Signaes et al (1985), supra), Ad5 (GenBank-Accession Nr. M18369; Chroboczek et al. (1992), supra; und Chroboczek et al., Virol., 161, 549–554 (1987)) und Ad9 (GenBank-Accession Nr. X74659) wurden verwendet zum Design von Primern zur Amplifizierung von Fiber-Knobs aus der adenoviralen genomischen DNA. Die Primer wurden so entworfen, dass sie eine BamHI-Stelle auf dem Sense-Primer und eine KpnI-Stelle auf dem Antisense-Primer umfassen, um das Klonieren des PCR-Produktes nach Verdau mit den geeigneten Restriktionsenzymen zu erleichtern. Die Sense-Primer wurden für eine Hybridisierung entworfen, derart, dass nach Amplifikation das Produkt das letzte Repeat des Schaftes von jedem Ziel-Fiber-Gen, den konservierten Schaft-Knob-Übergang TLWT (Stouten et al., J. Molec. Biol., 226, 1073–1084 (1992); SEQ ID Nr. 4) und das rezeptorerkennende Knob (Henry et al. (1994), supra; Louis et al., J. Virol., 68, 4104–4106 (1994); und Stevenson et al., J. Virol., 69, 2850–2857 (1995)) umfasste. PCR-Reaktionen wurden durchgeführt mittels Ultma DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Foster City, CA) und einem Standard-PCR-Protokoll. Die Produkte wurden dann als BamHI/KpnI-Fragmente in den bakteriellen Ex pressionsvektor pQE32 (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) kloniert. Die DNA-Sequenz der Fiber-Knobs wurde mittels eines automatischen 373-DNA-Sequenzers (Applied Biosystems, Foster City, CA) bestimmt, und es wurden keine Sequenz-Unterschiede im Vergleich mit den in der Genbank-Datenbasis angegebenen Originalsequenzen gefunden.
  • Der pQE32-Vektor wurde dann mit den Restriktionsenzymen EcoRI und KpnI geschnitten, um das komplette Insert freizusetzen, das dann in den baculoviralen Transfervektor pAcSG2 (Pharmingen, San Diego, CA) kloniert wurde. Rekombinante Baculoviren, welche die Ad3-, Ad5- oder Ad9-Fiber-Knob-Konstrukte enthielten, wurden gemäß Standardprotokollen isoliert und amplifiziert (O'Reilly et al., Baculovirus expression vectors: a laboratory manual, W. H. Freeman & Co., Salt Lake City, Utah (1992)). Rekombinante Ad2-, Ad3-, Ad5- und Ad9-Fibern wurden hergestellt und gereinigt, wie bereits beschrieben (Wickham et al. (1993), supra). Ad3-, Ad5- und Ad9-Knob-Proteine (F3K, F5K bzw. F9K) wurden in hohen Ausbeuten in Tn 5B1-4-Insektenzellen (Invitrogen, San Diego, CA) produziert und ließen sich mittels Ni2+-NTA-Agarosesäulen nach Angaben des Herstellers (Qiagen) leicht bis zur Homogenität reinigen. Eine Proteingelanalyse zeigte Banden, die bei den erwarteten Größen von 24,1 kDA für F3K, 23,5 kDA für F5K und 24,3 kDA für F9K wanderten. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass sowohl F5K als auch F9K mit einem gegen das Fiber 2-Protein gerichteten polyklonalen Kaninchen-Antikörper kreuzreagierte, F3K dagegen nicht. 35S-markierte Ad3-, Ad5- und Ad9-Fiber-Knobs wurden hergestellt wie bereits beschrieben (Wickham et al., (1993), supra).
  • Beispiel 2
  • Dieses Beispiel demonstriert die Kreuzkompetition von Ad2, Ad5 und Ad9 für den gleichen zellulären Fiber-Rezeptor auf A549-Zellen.
  • Ungefähr 1 × 106 A549-Zellen in 250 μl Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Gibco BRL) mit 3 mM MgCl2 und 1 mM CaCl2 (PBS++) wurden für 1 h bei 4°C mit steigenden Zahlen an viralen Partikeln in Eppendorf-Röhrchen vorinkubiert, die zuvor mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS++ beschichtet worden waren. Rekombinante Fiber-Knobs wurden zu den Zellsuspensionen bei Endkonzentrationen von 10 μg/ml zugegeben und die Suspensionen dann bei 37°C für 1 h inkubiert und anschließend für 15 min bei 4°C abgekühlt. Markiertes Virus oder markiertes Fiber-Protein (1–3 × 104 cpm) wurde dann zu den Zellsuspensionen hinzugegeben, die bei 4°C für eine weitere Stunde inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die Zellen pelletiert, das Inokulum wurde entfernt und das Pellet zweimal mit kalter PBS++ gewaschen. Das Pellet wurde in 100 μl PBS++ resuspendiert, zu einer Szintillationsflüssigkeit hinzugegeben und in einem Beckman-Szintillationszähler direkt gezählt.
  • Steigende Mengen an rekombinanter Volllänge-Fiber 2 und -Fiber 5 inhibierten vergleichsweise die Bindung von sowohl Ad2 als auch Ad5, wie in den 1A bzw. 1B gezeigt. Die 1A und 1B sind graphische Darstellungen, in denen die Bindung von markiertem Ad2 bzw. von markiertem Ad5 (% Kontrolle) über der Fiber-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierender unmarkierter Fiber 2 (
    Figure 00480001
    ) und unmarkierter Fiber 5 (•) aufgetragen ist. In beiden Fällen trat Sättigung der Rezeptorstellen mit einer maximalen Inhibition der markierten viralen Bindung von 95% zwischen den Endkonzentrationen 0,1 und 0,3 μg/ml auf. Somit trat Fiber-vermittelte homotypische (gleicher Serotyp) und heterotypische (gleiche Untergruppe) Kreuzkompetition zwischen den Serotpyen Ad2 und Ad5 auf, was darauf hindeutete, dass die Ad2- und die Ad5-Fiber den gleichen Rezeptor erkannten. Dies deutete ferner darauf hin, dass die Fibern austauschbar als Kompetitoren in viralen Ad2- und Ad5-Bindungsstudien verwendet werden können.
  • Die Kreuzkompetition zwischen Serotypen von verschiedenen Untergruppen d.h. Ad2 (Untergruppe C), Ad3 (Untergruppe B) und Ad9 (Untergruppe D), wurde mittels rezeptorerkennender rekombinanter Fiber-Knobs anstelle der vollständigen Fiber-Proteine als Kompetitoren untersucht. His-tagged F3K, F5K und F9K wurden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die Vorinkubation von A549-Zellen mit steigenden Mengen an F3K, F5K oder F9K führte zu einer dosisabhängigen Inhibition der Bindung von markiertem Ad2 mit F5K und F9K, nicht aber mit F3K, wie in 2A gezeigt, die eine graphische Darstellung ist, in der die Bindung von markiertem Ad2 (% Kontrolle) über der Fiber-Knob-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00490001
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist. Bei einer Konzentration von 1 μg/ml waren mehr als 90% der Ad2-Bindung inhibiert. Diese Experimente deuteten darauf hin, dass das F9K-Protein für die gleiche Rezeptorstelle kompetierte wie das F5K-Protein. Das F3K-Protein, welches in diesem Bindungsexperiment als Kontrolle verwendet wurde, hatte keinen Effekt auf die Ad2-Bindung.
  • Die Vorinkubation von A549-Zellen mit steigenden Mengen an F3K, F5K oder F9K mit anschließender Inkubation mit markiertem Ad3 zeigte, dass nur das homologe Fiber-Knob einen maximalen inhibitorischen Effekt von 85% auf die Ad3-Bindung bei den getesteten Höchstdosen hatte, wie in 2B gezeigt, die eine graphische Darstellung ist, in der die Bindung von markiertem Ad3 (% Kontrolle) über der Fiber-Knob-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00490002
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist. Die weitere Vorinkubation von Zellen mit einer Kombination aus F3K und Pentonbasis-Protein oder dem monoklonalen Antikörper L230, der gegen αv-Integrine gerichtet ist (Weinacker et al., J. Biol. Chem., 269, 6940–6948 (1994)), führte zur vollständigen Inhibition der Ad3-Bindung. Weder F5K noch F9K hatten einen Effekt auf die Ad3-Bindung. Diese Ergebnisse bestätigten, dass Ad3 einen anderen als den Ad2/Ad5-Rezeptor erkannte, und zeigten ferner, dass Ad3 seine Pentonbasis nutzen kann, um direkt mit αv-Integrinen zu interagieren.
  • Die Vorinkubation von A549-Zellen mit steigenden Mengen an F3K, F5K oder F9K mit anschließender Inkubation mit markiertem Ad9 zeigte, dass die letzteren beiden Knobs bei der verwendeten Höchstkonzentration einen maximalen inhibitorischen Effekt von 20% auf die virale Bindung hatten, wie in 2C gezeigt, die eine graphische Darstellung ist, in der die Bindung von markiertem Ad9 (% Kontrolle) über der Fiber-Knob-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00490003
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist. In der Tat wurde in Kompetitionsexperimenten mit den beiden Epithelzelllinien A549 und Hs 700T unter Verwendung von Endkonzentrationen bis zu 25 μg/ml keine weitere Inhibition beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ad9 durch Nutzung eines Fiber-unabhängigen Mechanismus an A549- und Hs 700T-Zellen anheften kann.
  • Direkte Protein-Protein-Kompetitionsexperimente für den Fiber-Rezeptor auf A549-Zellen wurden mit 355-markiertem F5K und unmarkiertem F5K oder F9K und vice versa erstellt, um zu bestimmen, ob die Inhibition der Ad2-Bindung auf die Kompetition für den Ad2/Ad5-Fiber-Rezeptor zurückzuführen war oder nicht. Beide Kompetitoren kompetierten für die Bindungsstellen von markiertem F5K mit identischer Affinität, wie in 3A gezeigt, die eine graphische Darstellung ist, in der die Bindung von markiertem F5K (% Kontrolle) über der Fiber-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00500001
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist. Vollständige Kompetition der Bindung von markiertem F5K trat auf bei Vorinkubation der Zellen mit zwischen 300 ng/ml und 1 μg/ml an unmarkiertem F5K oder F9K. Mit markiertem F9K kompetierten die unmarkierten Kompetitoren ebenfalls in ähnlicher Weise, wie in 3B gezeigt, die eine graphische Darstellung ist, in der die Bindung von markiertem F9K (% Kontrolle) über der Fiber-Konzentration (μg/ml) in Gegenwart von kompetierendem unmarkiertem F3K (
    Figure 00500002
    ), F5K (•) und F9K (✦) aufgetragen ist.
  • Ferner resultierte in Virus/Virus-Kompetitionsexperimenten die Vorinkubation von A549-Zellen mit steigenden Zahlen an unmarkierten Ad9-Virionen pro Zelle in einer dosisabhängigen Verminderung der Bindung von markierten Ad2-Virionen. Die Virus/Virus-, Fiber/Virus- und Fiber/Fiber-Kreuzkompetitionsdaten geben allesamt starke Hinweise darauf, dass F5K und F9K den gleichen oder ähnliche Rezeptoren erkennen.
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel demonstriert, dass Ad2 und Ad9 über das Pentonbasis-Protein direkt an αv-Integrine binden.
  • Hs700T-Zellen wurden vorinkubiert mit F5K oder F9K (bei einer Endkonzentration von 2 μg/ml), welches die Ad2- bzw. Ad9-Fiber-Bindung inhibiert, dem mAb L230 (bei einer Endkonzentration von 50 μg/ml), der die direkte Penton/αv-Integrin-Interaktion funktionell blockiert, der Ad2-Pentonbasis oder der Ad2-Pentonbasis mit dem entsprechenden Fiber-Knob. Als nächstes wurden 1–3 × 104 cpm markiertes Ad2 oder Ad9 hinzugegeben und die Mischung für 1 h bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und zweimal mit kaltem PBS++ gewaschen. Der zellassoziierten cpm-Wert wurde sodann in einem Szintillationszähler bestimmt (prozentuale Bindung = zellgebundene Counts der Eingangsdosis/präzise cpm der Eingangsdosis). Die Bestimmung des gebundenen Virus zeigte, dass die Ad2-Bindung durch F5K um mehr als 95% inhibiert wurde, wie in 4A gezeigt, die ein Balkendiagramm der Bindung von markiertem Ad2 (% Kontrolle) über CTRL, F5K, L230, PB und PB plus F5K darstellt (Standardabweichung vom Mittelwert ≤ 7%). Die Vorinkubation der Zellen mit sättigenden Mengen an L230 oder Ad2-Pentonbasis hatte keinen Effekt auf die Ad2-Bindung. Eine Kombination von Pentonbasis mit F5K zeigte keinen additiven inhibitorischen Effekt auf die Ad2-Bindung, was bestätigte, dass nur Fiber die anfängliche Ad2-Bindung an Hs 700T-Zellen und andere Epithelzelllinien, wie A549, vermittelt, wie in Tabelle I gezeigt.
  • Figure 00520001
  • Die Bindung von Ad9 war blockiert um 20–25% durch F9K, um 46% durch L230, um 57% durch Ad2-Pentonbasis und um 77% durch Ad2-Pentonbasis kombiniert mit F9K, wie in 4B gezeigt, die ein Balkendiagramm der Bindung von markiertem Ad9 (% Kontrolle) über CTRL, F9K, L230, PB und PB plus F9K darstellt. Diese Ergebnisse bestätigten, dass Ad9 unabhängig von Fiber-Rezeptor-Interaktionen an Zellen binden konnte durch Nutzung eines Mechanismus wie die direkte Interaktion von Pentonbasis mit αv-Integrinen, von der hier gezeigt wurde, dass sie eine vorherrschende Rolle spielt in der Ad9-Anheftung und -Bindung an Hs 700T-Zellen und andere Epithelzelllinien, z.B. die Linie A549, wie die obige Tabelle I zeigt. Diese Resultate schließen jedoch die Möglichkeit nicht aus, dass andere als Fiber- oder Pentonbasis-Proteine eine kleinere Rolle in der viralen Anheftung und Bindung an die Zelloberfläche spielen.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel demonstriert, dass lösliches Fiber-Protein die zelluläre Infektion durch Ad9 nicht blockiert.
  • Es wurden ca. 106 Hs 700T-Zellen pro Vertiefung ausgesät und anheften gelassen. Das Medium (DMEM plus 10% FCS) wurde entfernt und die Zellen zweimal mit PBS++ gewaschen. Das Fiber-5- und das Fiber-9-Knob und die Ad2-Pentonbasis wurden dann zu den Vertiefungen hinzugegeben bei Endkonzentrationen von 10, 10 bzw. 50 μg/ml in DMEM ohne FCS, und die Zellen wurden für 2 h bei 4°C inkubiert. Das Virus wurde zugesetzt bei vorab bestimmten Verdünnungen, um statistisch zuverlässige Foci-Zahlen zu erzeugen, und die Zellen wurden weitere 1,5 h in der Kälte inkubiert. Das Inokulum wurde entfernt und die Vertiefungen zweimal mit kaltem DMEM ohne FCS gewaschen. Es wurden 2 ml DMEM mit 10% FCS hinzugegeben und die Zellen für 24–48 h inkubiert. Die adenovirale Infektion wurde quantifiziert wie von Wickham et al. (1993), supra, beschrieben, mit den folgenden Modifikationen. Kurz gefasst wurden Zell-Monolayer mit 2% Paraformaldehyd in PBS für 20 min fixiert, gefolgt von zweifachem Waschen mit PBS und 5minütiger Inkubation mit 0,2% Triton X-100. Die Zellen wurden zweimal mit 0,5% Fischgelatine (Sigma, St. Louis, MO) in PBS gewaschen und dann mit der gleichen Lö sung für 1 h blockiert. Primäre Antikörper, die gegen das adenovirale DNA-Bindungsprotein und das Hexon-Protein (beide bereitgestellt von Douglas Brough, GenVec, Inc.) oder das Pentobasis-Protein (bereitgestellt von Glen Nemerow, The Scripps Institute) gerichtet waren, wurden in Verdünnungen von 1:100 bis 1:250 in PBS mit 0,5% Fischgelatine verwendet und für 1 h inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und über Nacht mit einer 1:100-Verdünnung von FITC-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in PBS mit 0,5% Fischgelatine inkubiert. Nach dreifachem Waschen wurde 1 ml PBS über die angefärbten Zellen gegeben und die Foci mittels eines Nikon Diaphot 200-Fluoreszenz-Mikroskops gezählt.
  • Der Effekt der Kompetitoren auf die Infektion von Hs 700T-Zellen durch unmarkiertes Ad2 und Ad9 wurde analysiert unter Verwendung von Antikörpern, die Proteine detektieren, welche spezifisch sind sowohl für die frühe Phase (α-DNA-Bindungsprotein) als auch für die späte Phase (α-Hexon und α-Pentonbasis) des adenoviralen Infektionszyklus. Die Analyse der Ad2-Infektion mit den drei beschriebenen Antikörpern zeigte vollständige Aufhebung durch Vorinkubation der Zellen mit beiden Fiber-Knobs, wie in 5A gezeigt, die ein Balkendiagramm darstellt, in dem die Ad2-Infektivität (FFU/106 Zellen) über CTRL, F5K, F9K, PB und PB plus F5K aufgetragen ist für ein in Duplikat durchgeführtes Experiment mit Anti-PB-Antikörper. Kein Effekt wurde beobachtet für Vorinkubation mit sättigenden Mengen an Ad2-Pentonbasis-Protein.
  • Die Analyse der Ad9-Infektion mit den drei beschriebenen Antikörpern zeigte keinen signifikanten inhibitorischen Effekt für F5K. Ähnlich resultierte die Vorinkubation der Zellen mit F9K in nur eine marginale, aber statistisch insignifikante Inhibition der Infektivität, wie in 5B gezeigt, die ein Balkendiagramm darstellt, in dem die Ad9-Infektivität (FFU/106 Zellen) über CTRL, F5K, F9K, PB und PB plus F5K für ein in Duplikat durchgeführtes Experiment mit Anti-PB-Antikörper aufgetragen ist. Die Vorinkubation mit sättigenden Mengen an Ad2-Pentonbasis resultierte jedoch in einer 45%igen Verminderung der Zahl der gebildeten Foci. Diese Resultate zeigen, dass die Ad9-Infektion eine direkte Interaktion der Pentonbasis mit den αv-Integrinen involviert. Die Tat sache, dass eine Kompetition mit einer Kombination von Pentonbasis und Fiber die Infektivität nicht weiter vermindert, deutet darauf hin, dass Ad9-Penton mit anderen Zellrezeptoren interagieren kann.
  • Beispiel 5
  • Dieses Beispiel demonstriert, dass Ad9 direkt an αv-Integrine binden kann.
  • Die Ad2- und Ad9-Bindung wurde weiter analysiert mittels eines Panels von humanen Zelllinien, die unterschiedliche Fiber-Rezeptor-Levels zeigen und αv-Integrine exprimieren oder ihrer ermangeln (siehe Tabelle I). Zwei Zelllinien, Hepatokarzinom-abgeleitete HepG2 und Hs 700T, banden Ad2 bei Levels zwischen 5 und 10% der Eingangsdosis des eingesetzten markierten Ad2-Virus. Diese Levels fielen um mehr als 90%, wenn die Zellen mit sättigenden Mengen an F5K vorinkubiert wurden, was zeigt, dass die Bindung von Ad2 Fiberabhängig und spezifisch ist. Kein Effekt wurde für L230 beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Pentonbasis keine merkliche Rolle in der Ad2-Bindung spielt. Die Ad9-Bindung an HepG2 wurde durch F9K nicht inhibiert, durch L230 jedoch um 25%. Die Ad9-Bindung an Hs 700T wurde durch F9K um 25% inhibiert. Ca. 45% der Ad9-Bindung an Hs 700T involvierten eine Interaktion mit den αv-Integrinen. Die Bindung von Ad2 an A172, U118 MG, ACA19 und HASMC, die alle niedrige Levels an Ad2-Fiber-Rezeptor zeigen, war gering. Die Ad9-Bindung an diese Zelllinien wurde durch Vorinkubation mit F9K-Protein nicht signifikant vermindert und involvierte daher in der Hauptsache direkte Penton/αv-Integrin-Interaktionen, wie durch den Abfall der prozentualen Bindung nach Vorinkubation der Zellen mit dem mAb L230 bestätigt wurde. Ad9 band an Ramos und Y79, die beide wenig oder gar keine αv-Integrine exprimieren, bei niedrigen Levels. Ca. 60–80% des gebundenen Virus schienen an diese Zellen über die Fiber zu binden, wie durch die nach Vorinkubation mit F9K-Protein erhaltene prozentuale Bindung nachgewiesen wurde. Weder Ramos noch Y79 zeigten einen Effekt auf die Bindung durch Vorinkubation mit L230. Ad9 band ferner an Tera 2, die αv-Integrine aufweist und extrem hohe Levels an Fiber-Rezeptor exprimiert (wie durch die Bindungsdaten für Ad2 nachgewiesen), in der Hauptsache über die Fiber, trotz der Anwesenheit der αv-Integrine, was die Fiber-Zellrezeptordichte widerspiegeln kann. Die Vorin kubation von Tera 2-Zellen mit L230 hatte keinen Effekt auf die Ad9-Bindung. Die Fiber-vermittelte Bindung von Ad9 an HepG2, Ramos, Y79 und Tera 2 war um etwa das 6- bis 9fache niedriger als die von Ad2. Diese Resultate deuten darauf hin, dass adenovirale Vektoren mit verkürzten Fiber-Schäften eine höhere Zielsteuerungs-Spezifität aufweisen durch Verminderung des Levels an Fiber-Rezeptor-vermittelter Bindung.
  • Analysiert wurde ferner die Bindung von Ad2 und Ad9 an die Hamster-Melanomzelllinie CS-1, der funktionelle αv-Integrine fehlen. Eine Million Zellen wurden mit 2 μg/ml des geeigneten Fiber-Knobs, 50 μg/ml Ad2-Pentonbasis oder einer Kombination von beidem vorinkubiert und für 1 h bei 4 C inkubiert. Eine subsättigende Menge an markiertem Virus wurde hinzugegeben und die Inkubation eine weitere Stunde fortgesetzt. Die Zellen wurden dann pelletiert, zweimal mit kaltem PBS++ gewaschen und in einem Szintillationszähler gezählt. Ad2 band erwartungsgemäß an CS-1 wie in den 6A und 6B gezeigt, die graphische Darstellungen sind, in denen die Bindung von markiertem Ad2 (% Kontrolle) über CTRL, F5K, PB und F5K plus PB für CS-1 bzw. CS-1-αvβ5 aufgetragen ist. Ad2 band CS-1 gut, und eine Vorinkubation mit F5K resultierte in einer 90%igen Kompetition. Die Pentonbasis war nicht in die Bindung involviert. Die Transfektion von CS-1-Zellen mit αvβ5-Integrin hatte keinen Effekt auf die Ad2-Bindung.
  • Ad9 band an CS-1 wie in den 6C und 6D gezeigt, die graphische Darstellungen sind, in denen die Bindung von markiertem Ad9 (% Kontrolle) über CTRL, F9K, PB und F9K plus PB für CS-1 bzw. CS-1-αvβ5 aufgetragen ist. Ad9 band CS-1 bei einem um das ca. 5fache niedrigeren Level als Ad2, und die Vorinkubation mit F9K resultierte in 65%iger Kompetition. Es wurde kein signifikanter Effekt für Vorinkubation mit Pentonbasis beobachtet. Anders als bei Ad2 veränderte die Transfektion von CS-1-Zellen mit αvβ5-Integrin die Bindungseigenschaften von Ad9 jedoch dramatisch. Während die Gesamtbindung von Ad9 um einen Faktor von 2 anstieg, ließ die Vorinkubation mit F9K die Kompetition auf 25% sinken, die Vorinkubation mit Pentonbasis resultierte in einer Inhibition von 40% und die Vorinkubation mit F9K und Pentonbasis er höhte die Inhibition auf 65%. Die Transfektion von CS-1-Zellen mit αvβ3-Integrin hatte einen ähnlich, aber weniger ausgeprägten Effekt.
  • Das Versagen von F9K, die Ad9-Bindung an viele Zelllinien zu blockieren, korreliert mit der Fähigkeit von Ad9 – im Gegensatz zu Ad2 – via αv-Integrine Fiber-unabhängig an Zellen zu binden. Daher können αv-Integrine als zweite Anheftungsstellen für Ad9-Virus fungieren, was erklärt, warum lösliche Fiber die Anheftung von Ad9 an viele Zelllinien nicht blockiert. Die Vorinkubation von Hs 700T-Zellen mit sättigenden Mengen an Pentonbasis und F9K, die 77% der Ad9-Bindung blockiert, zeigt, dass Virus-Zell-Interaktionen, die von Fiber-Rezeptor- und Penton-Integrin-Interaktionen verschieden sind, eine Rolle spielen können und in der Tat wenigstens teilweise diese Interaktionen ersetzen können, wie für die FFU-Analyse von Ad9-Infektion in Hs 700T-Zellen gezeigt, siehe 5B. Die Interaktion von Pentonbasis mit zellulären Integrinen, die von αv-Integrinen verschieden sind, und die Interaktion von Hexon mit Zelloberflächenproteinen können erklären, warum Ad9 augenscheinlich an Zellen binden und in diese eintreten kann durch Nutzung eines Fiber- und αv-Integrin-unabhängigen Mechanismus.
  • Anders als bei Ad9 hob die Vorinkubation von A549-Zellen mit sättigenden Mengen des funktionsneutralisierenden mAb L230 und F3K die Bindung von markiertem Ad3 vollständig auf, obwohl Ad3 eine kurze Fiber (10–11 nm) wie Ad9 (12–13 nm) aufweist. Bis zu 15% der für markiertes Ad3 beobachteten Bindung resultierten daher aus der direkten Interaktion des Virus mit αv-Integrinen. Es erscheint also, dass Ad3, obschon es eine Fiber-Länge aufweist, die vergleichbar ist mit der von Ad9, in der Hauptsache mit seinem Fiber-Rezeptor interagiert, der leichter verfügbar sein muss als der durch die Ad2/5/9-Fibern erkannte Fiber-Rezeptor.
  • Beispiel 6
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion des viralen Kurzschaft-Vektors AdSEAP.F5F9Kshort.
  • Das Transferplasmid p193 NS 83–100 wurde konstruiert durch Klonieren des NdeI-SalI-Fragmentes von Ad5, welches sich über die Karteneinheiten-Re gion 83–100 des Ad5-Genoms erstreckt, in das Plasmid pNEB193 (New England Biolabs, Beverly, MA). Das NdeI-MunI-Fragment wurde durch ein synthetisches Oligonucleotid ersetzt, umfassend eine BamHI-Stelle, die von einer 5'-NdeI-Stelle und einer 3'-MunI-Stelle flankiert war, um das Klonieren zu erleichtern. Das doppelsträngige synthetische Oligonucleotid-Fragment wurde aus den überlappenden synthetischen einzelsträngigen Sense- und Antisense-Oligonucleotiden TATGGAGGAT CCAATAAAGA ATCGTTTGTG TTATGTTTCA ACGTGTTTAT TTTTC (SEQ ID Nr. 12) und AATTGAAAAA TAAACACGTT GAAACATAAC ACAAACGATT CTTTATTGGA TCCTCCA (SEQ ID Nr. 13) erzeugt. Die Enden der überlappenden Oligomeren wurden so erzeugt, dass Überhänge entstehen, die kompatibel sind für eine direkte Klonierung in die NdeI- und MunI-Stellen. Dem resultierenden Vektor p193NS(ΔF) fehlte die komplette Codierungssequenz für das Fiber-Gen, er enthielt aber die gesamte adenovirale E4-Codierungssequenz. In dem Plasmid war das Polyadenylierungssignal, fett dargestellt in den Sequenzen SEQ ID Nr. 14 und Nr. 15, die in dem synthetischen NdeI/MunI-Oligonucleotid enthalten sind, beibehalten und ferner eine neue BamHI-Restriktionsschnittstelle inkorporiert, die in den Sequenzen SEQ ID Nr. 14 und Nr. 15 unterstrichen dargestellt ist.
  • Das Transfer-Plasmid p193(F5*), welches ein mutiertes Fiber-Gen mit einer BamHI-Stelle zwischen dem letzten Fiber-Protein-Codon und dem Fiber-Protein-Stopcodon enthält, wurde aus p193NS(ΔF) konstruiert. Das mutierte Fiber-Gen wurde in das Fiber-minus-p193NS(ΔF)-Plasmid inkorporiert mittels synthetischer Sense- und Antisense-Oligonucleotid-Primer, um das Fiber-Gen durch Polymerase-Kettenreaktion zu amplifizieren, während eine modifizierte, auf das letzte Codon des Fiber-Gens folgende BamHI-Stelle inkorporiert wurde, um das mutante Fiber-Gen zu erzeugen. Diese BamHI-Stelle diente ferner dazu, für die Aminsäuren Glycin und Serin zu codieren. Die eingesetzten Primer zur Amplifizierung von der NdeI-Stelle zu den C-terminalen Codierungsregionen des Fiber-Gens aus der genomischen DNA von Ad5 waren der Antisense-Primer TCCCCCCGGG TCTAGATTAG GATCCTTCTT GGGCAATGTA TGA (Stopstelle fett; BamHI-Stelle unterstrichen; SEQ ID Nr. 14) und der Sense-Primer CGTGTATCCA TATGACACAG A (NdeI-Stelle unterstrichen; SEQ ID Nr. 15). Das PCR-Produkt wurde dann mit NdeI und BamHI geschnitten und in die NdeI/BamHI-Stellen von p193N5(ΔF) kloniert.
  • Das Plasmid p193F5F9K-short wurde aus p193F5* konstruiert. Die Oligonucleotid-Primer GGACTAGTAG CATTTAATAA AAAAGAAGAT AAGCGC (SEQ ID Nr. 16) und CCGGATCCTC ATTCTTGGGC GATATAGG (SEQ ID Nr. 17) wurden verwendet zur Amplifizierung der Ad9-Sequenz, die das letzte Schaft-Repeat und den Knob aus dem Fiber-Gen codiert. Das PCR-Produkt wurde dann mittels Standardtechniken gereinigt und dann mit den Restriktionsenzymen NheI und BamHI verdaut, was das Klonieren des PCR-Produktes in die NheI/BamHI-Region des p193(F5*)-Transferplasmids erlaubte.
  • Das Transferplasmid p193 F5F9Kshort, welches die essenzielle E4-Region von Adenovirus enthält, wurde mit SalI geschnitten und in 293-Zellen transfiziert, die 1 h zuvor mit dem adenoviralen Vektor AdSE.E4.Gus infiziert worden waren, dem die E4-Region fehlt und der ohne die E4-Gene in 293-Zellen nicht replizieren kann. Erst wenn die AdSE.E4Gus-DNA mit der p193 F5F9K short-Plasmid-DNA rekombiniert, um die E4-Gene zu erhalten, wird der Vektor zur Replikation in 293-Zellen befähigt. Während dieser Rekombination nimmt der neu gebildete Vektor ferner die in den Plasmiden codierten Fiber-Mutationen auf. Lebensfähiges rekombinantes E4+-Adenovirus, welches die F5F9Kshort-Fiber-Chimäre enthält, wurde dann durch Plaquebildung der transfizierten Zelllysate 5 Tage nach Transfektion isoliert. Der resultierende Vektor Ad5E.F5F9Kshort wurde mittels virologischer Standardtechniken unter Verwendung von zwei aufeinanderfolgenden Plaquebildungsrunden auf 293-Zellen isoliert und gereinigt. Durch PCR und Restriktionsanalyse der viralen DNA wurde verifiziert, dass der Vektor das richtige Insert enthielt. Oligonucleotid-Primer, die auf beiden Seiten des Fiber-Gens "primen", zeigten, dass das PCR-Produkt die richtige Größe für ein verkürztes chimäres Fiber-Gen hatte. Die Restriktionsanalyse der Vektor-DNA zeigte, dass der neue Vektor die richtigen Restriktionsschnittstellen enthielt, die singulär sind für das Ad9-Fiber-Knob. Dementsprechend codiert das p193 F5F9K-short-Plasmid, von dem eine Karte in 7 gezeigt ist, ein chimäres Fiber-Protein mit einem kurzen Schaft, bestehend aus den ersten acht β-Repeats, d.h. 1–8, aus Ad5-Fiber und dem letzten β-Repeat aus Ad9-Fiber, so dass sich insgesamt 9 Schaft-Repeat-Ein heiten ergeben. Anders ausgedrückt: das Ad5-Fiber-Gen wurde von der NheI-Restriktionsschnittestelle von Ad5-Fiber bis zum Ende der Codierungssequenz für Ad5-Fiber deletiert, und die deletierte Sequenz wurde durch die Ad9-Fiber-Sequenz ersetzt, die das Knob und das letzte Schaft-Repeat codiert.
  • Beispiel 7
  • Dieses Beispiel demonstriert die Spezifität von Alkalische-Phosphatase-Gen-Delivery in 293-Zellen durch AdSE.F5F9Kshort.
  • 293-Zellen wurden in einer Suspension in 0,3 ml DMEM, enthaltend 3 μg/ml Ad9-Fiber, 50 μg/ml Pentonbasis, eine Kombination von Fiber und Pentonbasis oder keinen Kompetitor, für 45 min bei 37°C inkubiert. Sodann wurde jeder Probe die gleiche Menge an AdSE.F5F9Kshort zugegeben, und die Proben wurden für 60 min bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal gewaschen und bei 37°C einen Tag lang kultiviert. Das Medium wurde sodann mittels eines Alkalische-Phosphatase-Kits nach Herstellerangaben auf Sekretorische-Alkalische-Phosphatase-Aktivität getestet. Die Resultate sind in 8 gezeigt, die ein Balkendiagramm darstellt, in dem die Alkalische-Phosphatase-Expression (RLU) über der Kontrolle, Fiber, PB und Fiber plus PB aufgetragen ist. Die Konzentrationen an rekombinantem Fiber-Protein, welche 95–99% des Gen-Delivery durch adenovirale Vektoren, welche ein Langschaft-Fiber-Protein enthalten, blockieren, hatten nur einen marginalen Effekt auf das Gen-Delivery durch AdSE.F5F9Kshort. Pentonbasis aber, mit nur einem marginalen Effekt auf das Gen-Delivery durch Langschaft-Ad5-Vektoren, verminderte das Delivery durch AdSE.F5F9Kshort um über 95%. Diese Resultate demonstrieren, dass die Pentonbasis das Gen-Delivery in Zellen durch AdSe.F5F9Kshort steuert, während das Fiber-Protein das Gen-Delivery in Zellen durch Langschaft-Ad2- und -Ad5-Vektoren steuert.
  • Beispiel 8
  • Dieses Beispiel vergleicht das Gen-Delivery in glatte Muskelzellen durch AdSE (mit langem Schaft) und AdSE.F5F9Kshort (mit kurzem Schaft).
  • Humane glatte Darmmuskelzellen, die nur wenig, wenn überhaupt, funktionellen Fiber-Rezeptor für Ad2, Ad5 oder Ad9 exprimieren, wurden in 24-Ver tiefungen-Platten 1 Tag vor dem Experiment plattiert. Die Zellen wurden dann in 0,3 ml DMEM mit oder ohne 50 μg/ml Pentonbasis-Protein für 1 h bei 37°C inkubiert. Sodann wurde AdSE oder AdSE.F5F9Kshort zu den Zellen hinzugegeben und die Zellen bei Raumtemperatur für 1 h hin- und herbewegt. Die Zellen wurden sodann dreimal gewaschen und bei 37°C einen Tag lang kultiviert. Das Medium wurde sodann mittels eines Alkalische-Phosphatase-Kits nach Herstellerangaben auf Sekretorische-Alkalische-Phosphatase-Aktivität getestet. Die Resultate sind in 9 gezeigt, die ein Balkendiagramm darstellt, in dem die Alkalische-Phosphatase-Expression (RLU) über der Kontrolle und den Kompetitoren Penton und "Mock" für AdSe.F5F9Kshort (
    Figure 00610001
    ) und AdSe (☐) aufgetragen ist. Diese Resultate demonstrieren, dass AdSE.F5F9Kshort effizienter ist als AdSE im Hinblick auf das Gen-Delivery in gewisse Zelltypen. Ferner – angesichts der Tatsache, dass Pentonbasis die Transduktion der Zellen blockierte – zeigen diese Resultate, dass die Pentonbasis von AdSE.F5F9Kshort Bindung und Transduktion vermittelt.
  • Alle hierin angeführten Referenzen werden hiermit durch Bezug in den vorliegenden Text aufgenommen in dem gleichen Umfang, als wenn für jede Referenz einzeln und spezifisch angegeben worden wäre, dass sie durch Bezug und in ihrer Gesamtheit in den vorliegenden Text aufgenommen wird.
  • Die Erfindung wurde mit Betonung auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben; für den Durchschnittsfachmann ist erkennbar, dass die bevorzugten Ausführungsformen variiert werden können. Die Erfindung kann auch anders als spezifisch hierin beschrieben umgesetzt werden.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
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  • Figure 00690001
  • Figure 00700001

Claims (21)

  1. Adenovirale Fiber, umfassend einen Schwanz, einen Schaft und ein Knob, wobei der Schaft durch Deletion eines Teils des Schafts gekürzt ist, so dass der Schaft nicht mehr als 12 β-Repeats umfasst.
  2. Adenovirale Fiber nach Anspruch 1, wobei der deletierte Teil in Bezug auf den Schwanz distal ist.
  3. Adenovirale Fiber nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Knob durch ein Knob eines unterschiedlichen adenoviralen Serotyps ersetzt worden ist.
  4. Adenovirale Fiber nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Schaft von einem Serotyp der Untergruppe C oder der Untergruppe D ist, und wobei das Knob von einem Serotyp der Untergruppe C oder der Untergruppe D ist.
  5. Adenovirale Fiber nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die adenovirale Fiber eine Aminosäuresequenz umfasst, die in einem adenoviralen Fiber-Knob des Serotyps bzw. der Serotypen der adenoviralen Fiber nicht vorkommt.
  6. Adenovirale Fiber nach Anspruch 5, wobei die Aminosäuresequenz eine Zellrezeptor-Bindungssequenz oder eine bispezifische oder multispezifische Protein-Bindungssequenz ist.
  7. Adenovirale Fiber nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Aminosäuresequenz in eine oder anstelle einer Aminosäuresequenz einer exponierten Schleife des Knobs eingefügt ist, oder eine Verlängerung des C-Terminus des Knobs ist.
  8. Adenovirale Fiber nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die Aminosäuresequenz den Zusammenbau eines Adenovirus, das die adenovirale Fiber umfasst, nicht verhindert.
  9. Transfervektor, umfassend eine DNA, die die adenovirale Fiber nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
  10. Baculovirus, umfassend ein adenovirales Fiber-Gen, das die adenovirale Fiber nach einem der Ansprüche 1 bis 8 kodiert.
  11. Adenovirus, umfassend ein nicht adenovirales Gen und die adenovirale Fiber nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  12. Adenovirus, umfassend ein nicht adenovirales Gen, wobei die Fiber des Adenovirus, oder alternativ der Fiber-Schaft und das Fiber-Knob, durch eine Fiber bzw. durch einen Fiber-Schaft und ein Fiber-Knob ersetzt wurde(n), welche einen kürzeren Schaft aufweist/aufweisen als die Fiber des entsprechenden natürlich vorkommenden Adenovirus, und wobei der Schaft nicht mehr als 12 β-Repeats umfasst.
  13. Adenovirus nach Anspruch 12, wobei der Schaft und das Knob der Fiber von unterschiedlichen adenoviralen Serotypen sind.
  14. Adenovirus nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei das Adenovirus ferner ein rekombinantes Pentonbasis-Protein umfasst, und wobei das rekombinante Pentonbasis-Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die in einem adenoviralen Pentonbasis-Protein des Serotyps bzw. der Serotypen des Adenovirus nicht vorkommt.
  15. Adenovirus nach Anspruch 14, wobei die Aminosäuresequenz des rekombinanten Pentonbasis-Proteins eine Zellrezeptor-Bindungssequenz oder eine bispezifische oder multispezifische Protein-Bindungssequenz ist.
  16. Adenovirus nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei das Adenovirus ein Pentonbasis-Protein aufweist, welches die Bindung des Adenovirus an eine Zelle bewirkt.
  17. Adenovirus nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei das Adenovirus der Untergruppe C angehört.
  18. Verfahren zur Zielsteuerung der Anheftung eines Adenovirus an eine Zelle in vitro, um einen Zelleintritt des Adenovirus zu bewirken, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen der Zelle mit dem Adenovirus nach einem der Ansprüche 11 bis 17 umfasst.
  19. Verfahren zur Zielsteuerung der Anheftung eines Adenovirus nach einem der Ansprüche 11 bis 17, umfassend: (a) Inkontaktbringen des Adenovirus mit einem bispezifischen oder multispezifischen Bindungsagens, wobei das Agens umfasst: (i) eine erste Komponente, die selektiv eine Aminosäuresequenz des Adenovirus bindet, welche in einem adenoviralen Fiber-Knob oder Pentonbasis-Protein des Serotyps bzw. der Serotypen des Adenovirus nicht vorkommt, und (ii) eine zweite Komponente, die selektiv eine Zelloberflächen-Bindungsstelle auf der Zelle bindet, um so einen Komplex aus dem Adenovirus und dem Agens zu bilden; und (b) Inkontaktbringen der Zelle mit dem Komplex aus (a) in vitro, so dass der Eintritt des Adenovirus in die Zelle bewirkt wird.
  20. Verwendung eines Adenovirus nach einem der Ansprüche 11 bis 17 bei der Herstellung eines Pharmazeutikums zum Einbringen eines nicht adenoviralen Gens in eine Zelle in vivo, wobei die Zelle mit dem Adenovirus in Kontakt zu bringen ist.
  21. Verwendung eines Adenovirus nach einem der Ansprüche 11 bis 17 bei der Herstellung eines Pharmazeutikums zum Einbringen eines nicht adenoviralen Gens in eine Zelle in vivo, wobei das Pharmazeutikum ferner ein bispezifisches oder multispezifisches Bindungsagens umfasst, wobei das Agens umfasst: (i) eine erste Komponente, die selektiv eine Aminosäuresequenz des Adenovirus bindet, welche in einem adenoviralen Fiber-Knob oder einem Pentonbasis-Protein des Serotyps bzw. der Serotypen des Adenovirus nicht vorkommt, und (ii) eine zweite Komponente, die selektiv eine Zelloberflächen-Bindungsstelle auf der Zelle bindet, um so einen Komplex aus dem Adenovirus und dem Agens zu bilden.
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