DE69734574T2

DE69734574T2 - Rekombinante adenovirenvektoren zur gentherapie der menschlichen krebse

Info

Publication number: DE69734574T2
Application number: DE69734574T
Authority: DE
Inventors: Falleur Boon; Marie-Therèse DUFFOUR; Hedi Haddada; Christophe Lurquin; Michel Perricaudet; Catherine Uyttenhoveghesquiere; Guy Warnier
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Centelion SAS; Ludwig Institute for Cancer Research London
Current assignee: CENTELION, VITRY SUR SEINE, FR; Ludwig Institute for Cancer Research London
Priority date: 1996-03-14
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2017-03-13
Also published as: AU732288B2; ES2252779T3; JP2000507229A; DK0889969T3; BR9707994A; KR19990087718A; US20030082150A1; EP0889969A1; DE69734574D1; EP0889969B1; SK124698A3; CZ295967B6; HUP9902150A2; WO1997034009A1; HUP9902150A3; NO984052D0; AU2164197A; IL126152A0; FR2746110A1; ATE309382T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zu Behandlung menschlicher Tumoren mittels Gentherapie. Sie betrifft insbesondere die Verwendung rekombinanter defektiver Viren, die eine Sequenz tragen, die für ein spezifisches Antigen der menschlichen Tumoren kodieren, zur vorbeugenden oder heilenden Behandlung menschlicher Tumoren sowie um in vitro oder ex vivo spezifische CTL zu erzeugen. Sie betrifft ebenfalls pharmazeutische Verbindungen, die den Virus umfassen, im Besonderen in injizierbarer Form.
Die Gentherapie besteht in der Korrektur einer Schädigung oder Anomalie, indem eine genetische Information in die betroffene Zelle oder das betroffene Organ eingeführt wird. Diese Information kann entweder in vitro in eine Zelle eingeführt werden, die dem Organ entnommen wurde, und dann wieder in den Organismus injiziert wird, oder in vivo, direkt in dem betreffenden Gewebe. Da es sich um ein Molekül mit hohem Molekulargewicht und negativer Ladung handelt, hat die DNA Schwierigkeiten, die Phospholipid-Zellmembranen spontan zu durchdringen. Es werden also verschiedene Vektoren verwendet, um einen Transfer der Gene zu ermöglichen: Virale Vektoren einerseits, chemische und/oder biochemische, natürliche oder synthetische Vektoren, andererseits. Chemische und/oder biochemische Vektoren sind zum Beispiel Kationen (Calciumphosphat, DEAE-dextran, ...), die wirken, indem sie Präzipitate mit der DNA bilden, welche durch die Zellen „phagozytiert" werden. Es kann sich ebenfalls um Liposome handeln, in denen die DNA inkorporiert ist und die mit der Plasmidmembran fusionieren. Die synthetischen Gentransfervektoren sind im Allgemeinen Lipide oder kationische Polymere, die die DNA komplexieren und mit ihr ein Partikel bilden, das auf der Oberfläche positive Ladungen trägt. Diese Partikel sind in der Lage, mit den negativen Ladungen der Zellmembran zu interagieren, und diese dann zu überwinden. Als Beispiele für diese Vektoren können Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam^TM) oder N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]- N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA, Lipofectin^TM) zitiert werden. Es wurden auch chimäre Proteine entwickelt: Sie bestehen aus einem polykationischen Teil, der die DNA kondensiert, gebunden an einen Liganden, der sich an einen Membranrezeptor fixiert, und den Komplex durch Endozytose in die Zellen mitnimmt. So ist es theoretisch möglich ein Gewebe oder bestimmte Zellpopulationen „ins Visier zu nehmen", um die Bioverfügbarkeit in vivo des transferierten Gens zu verbessern (für eine Beurteilung, vgl. Behr, 1993, Cotten und Wagner, 1993). Unter den potentiell als Vektoren für den Gentransfer verwendbaren Viren, können insbesondere die Retroviren (RSV, HMS, MMS, etc.), der HSV-Virus, die adeno-assoziierten Viren und die Adenoviren zitiert werden. Diese Viren wurden alle verwendet, um verschiedene Zelltypen zu infizieren.
Gentherapeutische Ansätze wurden zur Behandlung verschiedener Arten von Krankheiten, einschließlich Störungen des Nervensystems, kardiovaskulärer Erkrankungen oder Krebsarten, entwickelt. Insbesondere bezüglich der Domäne der Krebsarten wurden im Stand der Technik verschiedene Ansätze vorgeschlagen. So beschreiben die Studien die Verwendung von aktiven Lymphozyten ex vivo durch Kultur in Gegenwart von Interleukin-2 oder durch Transfektion mit dem Interleukin-2-Gen. Es wurden ebenfalls Studien zur adoptiven Immuntherapie mit Monozyten-Makrophagen durchgeführt, die ex vivo durch Interferon gereinigt und aktiviert wurden, um ihr tumorizides Potential zu erhöhen, und den Patienten dann wieder injiziert wurden (Andressen et al., Cancer Res. 50 (1990) 7450). Die Möglichkeit, gentechnisch modifizierte Makrophagen zu verwenden, wurde ebenfalls beschrieben (WO95/06120). Eine andere Reihe von Ansätzen basiert auf dem Transfer toxischer Gene, die in der Lage sind, auf direkte oder indirekte Weise, das Absterben der kanzerösen Zellen zu induzieren. Dies Art des Ansatzes wurde zum Beispiel mit dem Thymidinkinasegen beschrieben, das in vivo entweder durch einen adenoviralen Vektor (PCT/FR94/01284; PCT/FR94/01285), oder durch Transplantation der Produktionszellen eines retroviralen Vektors (Caruso et al., PNAS 90 (1993) 7024) transferiert wird. Andere Gene, die verwendet wurden, sind zum Beispiel das Cytosindesaminasegen.
Die vorliegende Patentanmeldung betrifft ein neues Verfahren zur Behandlung von Krebs. Sie richtet sich ganz besonders auf die Behandlung von Melanomen. Das Verfahren der Erfindung beruht auf dem Transfer und der Expression in vivo der spezifischen Antigene der Melanome, die in der Lage sind, (i) einen Immunschutz gegen das Auftreten dieser Krebsart und (ii) eine Expansion der Population der zytotoxischen T-Zellen (CTL), die spezifisch für die Zellen sind, die diese Antigene aufweisen, und so eine Zerstörung durch das Immunsysteme der entsprechenden Tumorzellen induzieren.
Das Immunsystem hat neben anderen Funktionen die Fähigkeit, einen Schutz gegen Virusinfektionen zu gewährleisten. Diese Fähigkeit wird durch die zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) gewährleistet. Die CTL weisen zwei bemerkenswerte Charakteristiken auf: sie sind höchst spezifisch und von hoher Wirksamkeit. Sie zerstören die infizierten Zellen nachdem sie ein virales Antigen an deren Oberfläche geortet haben. Das fragliche Antigen manifestiert sich in Form eines Peptids, das mit einem Molekül des Haupt-Histokompatibilitätskomplex der Klasse I (CMH-I) assoziiert ist. Im Rahmen der Tumore wurde anfangs bei den Mäusen beobachtet, dass diese malignen Zellen Peptidmolekülkomplexe von CMH-I aufweisen, die in der Lage sind, wie im Rahmen der antiviralen Antworten, eine durch die CTL vermittelte Immunantwort zu provozieren. Diese Peptide stammen insbesondere von Proteinen, die durch mutierte oder in den Tumorzellen selektiv aktive Zellen kodiert sind. Diese Proteine werden als tumorspezifische Antigene bezeichnet. Unlängst wurden die von den CTL erkannten Differenzierungsantigene auf menschlichen Tumoren charakterisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Behandlung menschlicher Tumoren. Es ergibt sich im Besonderen aus der Entwicklung von Vektoren viralen Ursprungs, die in der Lage sind, menschliche tumor- oder melanomspezifische Antigene in vivo zu transferieren und zu exprimieren. Es beruht insbesondere auf dem Nachweis, bei den murinen Modellen, dass die rekombinanten defektiven Adenoviren in der Lage sind, eine Immunisierung gegen diese Art von Antigenen zu induzieren, die es ermöglicht, in vivo die lymphozytären Antworten gegen diese Antigene und im Besonderen gegen die Tumorzellen, die sie tragen, zu erhalten. Dieses Verfahren gemäß der Erfindung, ermöglicht es also, durch den Transfer dieser Gene auf eine besonders wirkungsvolle Art auf die Entwicklung der menschlichen Tumore einzuwirken, indem ihr Fortschritt gestoppt wird, was zur Ausrottung führen kann.
Die vorliegende Erfindung beschreibt also einen rekombinanten defektiven Adenovirus, der, in sein Genom eingefügt, eine Nukleinsäure enthält, die ganz oder teilweise ein Protein oder ein tumorspezifisches Peptid und insbesondere ein melanomspezifisches Antigene kodiert.
Bevorzugt handelt es sich um ein menschliches melanomspezifisches Antigen. Gans besonders bevorzugt handelt es sich um ein Fragment eines menschlichen melanomspezifischen Antigens, umfassend den Teil, der den CTL in Assoziation mit den Molekülen von CMH-I präsentiert wird. Die menschlichen tumorspezifischen Antigene wurden von Thierry Boon et al. (US5,342,774; US5,405,940; WO92/20356; WO94/23031; WO94/21126) beschrieben. Diese Antigene, die mit dem Begriff MAGE bezeichnet werden, werden in den Tumorzellen, hauptsächlich in den menschlichen Tumoren selektiv exprimiert. Verschiedene menschliche MAGE-Gene wurden beschrieben, und im Besonderen die Gene MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11, MAGE-12. Repräsentativ für die homologen murinen Gene lassen sich ebenfalls die Gene S-MAGE-1 und S-MAGE-2 aufführen. Was insbesondere die Gene BAGE, GAGE und RAGE betrifft, sind sie repräsentativ für andere verwandten Genfamilien.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter defektiver Adenovirus beschrieben, der, eingefügt in sein Genom, eine Nukleinsäure für Protein oder ein von diesem abgeleiteten Peptid kodiert, ausgewählt aus den Proteinen Mage-1, Mage-3, Bage, Gage und Rage. Diese Antigene sind nämlich die selektivsten, in dem Sinne, dass sie für den allergrößten Teil auf keiner somatischen, nicht tumoralen Zelle nachgewiesen wurden. Die Sequenz des Antigens Mage-1 und des entsprechenden Gens wurde im Besondern in Van der Bruggen et al., Science 254 (1991) 1644) beschrieben. Die Sequenz der cDNA kodierend für Mage-1 und Mage-3 wurde zum Beispiel in Gaugler et al. (J. Exp. Med. 179 (1994) 921) beschrieben.
Wie oben angegeben, wird ein rekombinanter defektiver Adenovirus beschrieben, der, eingefügt in sein Genom, eine Nukleinsäure enthält, die für ein Peptid der Proteine Mage-1, Mage-3, Bage oder Gage kodiert, umfassend den Teil, der den CTL in Assoziation mit den Molekülen von CMH-I präsentiert wird. Die Gene Mage, Bage und Gage kodieren nämlich für Proteine von beträchtlicher Größe. Diese Proteine werden mittels enzymatischer Digestion in der Zelle abgebaut, wodurch Peptide erzeugt werden. Das sind die Peptide, die dann auf der Oberfläche der Zellen präsentiert werden, und die von den CTL in Assoziation mit den Molekülen von CMH-I erkannt werden (Vgl. 2). Ganz besonders bevorzugt betrifft die Erfindung einen rekombinanten Adenovirus, der, eingefügt in sein Genom, eine Nukleinsäure enthält, die für ein Peptid der Proteine Mage-1 oder Mage-3 kodiert, umfassend den Teil, der den CTL präsentiert wird.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform wird ein rekombinanter Adenovirus beschrieben, der, eingefügt in sein Genom, die Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst. Diese Sequenz umfasst die Sequenz, die für das Nonapeptid (27 pb) von Mage-1 kodiert, die den zytotoxischen T-Lymphozyten durch das Molekül HLA.A1 präsentiert wird. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um die Sequenz zwischen den Resten 55 bis 82 der Sequenz SEQ ID Nr. 1.
Gemäß einer anderen spezifischen Ausführungsform wird ein rekombinanter Adenovirus beschrieben, der, eingefügt in sein Genom, die Sequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst. Diese Sequenz umfasst die Sequenz, die für das Nonapeptid (27 pb) von Mage-3 kodiert, die den zytotoxischen T-Lymphozyten durch das Molekül HLA.A1 präsentiert wird.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein rekombinanter Adenovirus beschrieben, der eingefügt in sein Genom, eine Nukleinsäure für das antigene Peptid des Gens P1A des Mastozytom p815 der Maus DBA/2 (SEQ ID n° 3) umfasst.
Wie zuvor angegeben, ermöglichen die Adenoviren einen Transfer und eine wirkungsvolle Expression dieser antigenen Peptide in vivo. So ermöglichen sie auf ganz bemerkenswerte Weise, in vivo das Auftreten von für diese Antigene spezifischer zytotoxische T-Lymphozyten zu stimulieren, die selektiv jede Zelle zerstören, die auf ihrer Oberfläche dieses Antigen aufweist.
Die Viren, die im Rahmen der Erfindung beschrieben wurden, sind also für die Herstellung pharmazeutischer Verbindungen verwendbar, die für die Behandlung von Krebsarten bestimmt sind, deren Zellen die Mage-Antigene auf ihrer Oberfläche aufweisen. Um diese Verbindungen herzustellen, werden bevorzugt die Tumorzellen (im Allgemeinen von einem Melanom) eines Patienten entnommen und analysiert, um (i) die Expression eines Mage-Gens, zum Beispiel, mittels RT-PCR zu bestimmen und (ii) gegebenenfalls, dieses Mage-Antigen zu typisieren. Ein Adenovirus, der eine Nukleinsäure enthält, die für das gesamte oder einen Teil des entsprechenden Antigens kodiert, wird für die Administration konstruiert und verwendet.
Die Viren können ebenfalls in vitro (oder ex vivo) verwendet werden, um zytotoxische T-Zellpopulationen zu erzeugen, die spezifisch für ein gegebenes Tumorantigen sind. Zu diesem Zweck wird eine Zellpopulation durch einen Virus der Erfindung infiziert, und dann mit den Vorläufern der CTL-Zellen in Kontakt gebracht. Die CTL-spezifischen Zellen der Antigene können dann in vitro selektioniert, amplifiziert, dann als Medikament verwendet werden, um spezifisch die entsprechenden Tumore zu zerstören. Vorteilhafterweise umfasst die Zellpopulation, die mit dem Virus der Erfindung infiziert ist, Antigene aufweisende Zellen (APC): Es kann sich insbesondere um Makrophagen (WO95/06120) oder B-Zellen handeln.
In den Adenoviren, die im Rahmen der Erfindung beschrieben werden, kann die eingefügte Nukleinsäure ein komplementäres DNA-Fragment (cDNA), eine genomische DNA (gDNA) oder eine hybride Konstruktion, bestehend zum Beispiel aus einer cDNA sein, in die eine oder mehrere Introns eingefügt sind. Er kann sich ebenfalls um synthetische oder semisynthetische Sequenzen handeln. Wie zuvor angegeben, handelt es sich um eine Nukleinsäure, kodierend für ein ganzes Protein oder Peptid, abgeleitet von diesem Protein, ausgewählt unter Mage-1, Mage-3, Bage und Gage. Im Sinne der vorliegenden Erfindung, bedeutet die Peptidexpression, die von diesem Protein abgeleitet ist, dass die Nukleinsäure nur für ein Fragment des Proteins kodieren kann, wobei dieses Fragment geeignet sein muss, CTL zu erzeugen. Das Fragment gemäß der Erfindung trägt also mindestens einen Antigendeterminanten, der von einem spezifischen CTL erkannt wird. Diese Fragmente können mittels jeder dem Fachmann bekannten Technik erhalten werden, und im Besonderen mittels genetischer und/oder chemischer und/oder enzymatischer Modifikationen, oder auch mittels Klonen durch Expression, die die Selektion von Varianten in Abhängigkeit von ihrer biologischen Aktivität ermöglichen. Die genetischen Modifikationen schließen die Suppressionen, Deletionen, Mutationen usw. ein.
Die eingefügte Nukleinsäure ist bevorzugt eine cDNA oder eine gDNA.
Im Allgemeinen umfasst die eingefügte Nukleinsäure ebenfalls Sequenzen, die die Expression in der mit dem Antigen infizierten Zelle oder dem Antigenfragment ermöglichen. Es kann sich um Sequenzen handeln, die natürlich für die Expression des betreffenden Antigens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen geeignet sind, in der infizierten Zelle zu funktionieren. Es kann sich ebenfalls um Sequenzen verschiedenen Ursprungs handeln, die als heterologe Sequenzen bezeichnet werden, (verantwortlich für die Expression anderer oder sogar synthetischer Proteine). Im Besonderen kann es sich um Promoter von Eukaryotengenen oder viralen Genen oder um abgeleitete Sequenzen handeln, die die Transkription eines Gens auf spezifische Weise oder nicht und auf induzierbare Weise oder nicht, stimulieren oder reprimieren. Als Beispiel kann es sich um Promotersequenzen, die aus dem Genom der Zelle stammen, die infiziert werden soll oder aus des Genoms eines Virus handeln, und im Besonderen um Promoter der Gene E1A, einen MPL des Adenovirus, den Promoter CMV, LTR-RSV, SRα, usw. Unter den Eukariotenpromotern können ebenfalls die ubiquitären Promoter (HPRT, Vimentin, α-Actin, Tubulin usw.), die Promoter der Intermediärfilamente (Desmin, Neurofilamente, Keratin, GFAP usw.), die Promoter der therapeutischen Gene (Typ MDR, CFTR, Faktor VIII usw.), die gewebespezifischen Promoter (Pyruvatkinase, Villin, Promoter des intestinalen Bindungsproteins der Fettsäuren, Promoter des α-Actins glatter Muskelzellen, leberspezifische Promoter; Apo AI, Apo AII, menschliches Albumin usw.) zitiert werden, oder auch die Promoter, die auf eine Stimulus antworten (Steroidhormonrezeptor, Retinolsäurerezeptor usw.). Außerdem können die Expressionssequenzen modifiziert werden durch Addition von Aktivationssequenzen, von Regulationssequenzen usw. Wenn die eingefügte Nukleinsäure im Übrigen keine Expressionssequenzen enthält, kann sie in das Genom des defektiven Virus stromabwärts einer solchen Sequenz eingefügt werden.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Viren sind defektiv, das heißt, sie sind nicht in der Lage, sich autonom in der Targetzelle zu replizieren. Im Allgemeinen mangelt es also dem, im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Genom der defektiven Viren mindestens an den für die Replikation des genannten Virus in der infizierten Zelle notwendigen Sequenzen. Diese Regionen können entweder (ganz oder teilweise) entfernt, oder unbrauchbar gemacht werden, oder durch andere Sequenzen, und im Besondern durch das eingefügte Gen ersetzt werden. Bevorzugt bewahrt der defektive Virus dennoch die Sequenzen seines Genoms, die für die Enkapsidation der Viruspartikel notwendig sind.
Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Viren können aus verschiedenen Adenovirusserotypen erhalten werden. Es existieren verschiedene Adenovirusserotypen, deren Struktur und Eigenschaften sich etwas unterscheiden. Unter den Serotypen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt die menschlichen Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad2 oder Ad5) oder die Adenoviren tierischen Ursprungs verwendet (vgl. Patentanmeldung WO94/26914). Unter den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Adenoviren tierischen Ursprungs, können die Adenoviren zitiert werden, die vom Hund, vom Rind, von der Maus, stammen, (Beispiel Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), vom Schaf, vom Schwein, von Geflügel oder auch vom Affen stammen, (Beispiel: SAV). Der Adenovirus tierischen Ursprungs ist bevorzugt ein Adenovirus vom Hund, besonders bevorzugt ein Adenovirus CAV2 [zum Beispiel Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800)]. Im Rahmen der Erfindung werden bevorzugt Adenoviren vom Menschen oder vom oder aus diesen gemischte verwendet.
Die im Rahmen der Erfindung verwendeten defektiven Adenoviren, umfassen vorzugsweise ITR, eine Sequenz, die die Enkapsidation ermöglicht und die interessierende Nukleinsäure. Noch mehr bevorzugt im Genom der Adenoviren, die im Rahmen der Erfindung verwendet werden, mindestens die Region E1 unbrauchbar. Das entsprechende virale Gen kann unbrauchbar gemacht werden durch jede dem Fachmann bekannte Technik, und im Besonderen durch Totalsuppression, Substitution, partielle Deletion, oder die Addition einer oder mehrerer Basen in das oder die entsprechenden Gene. Diese Modifikationen können in vitro (auf der isolierten DNA) oder in situ erhalten werden, zum Beispiel, mittels Gentechnologie oder auch durch Behandlung mittels mutationsauslösender Wirkfaktoren. Andere Regionen können ebenfalls modifiziert werden, und im Besondern die Region E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) und L5 (WO95/02697). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Einsatzes des im Rahmen der Erfindung verwendeten Adenovirus umfasst eine Deletion in den Regionen E1 und E4. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst e reine Deletion in der Region E1, in deren Höhe die Region E4 und die Nukleinsäure eingefügt werden (Vgl. FR94 13355 ). Vorteilhafterweise richtet sich die Deletion in der Region E1 auf die Nukleotide 454 bis 3328 (Fragment PvuII-BgIII) oder 382 bis 3446 (Fragment HinfII-Sau3A). Vorteilhafterweise umfasst die Deletion in der Region E4 mindestens die Phasen ORF3 et ORF6.
Die interessierende Nukleinsäure kann in verschiedene Regionen des Genoms des Adenovirus eingefügt werden. Das Genom eines Adenovirus besteht aus einer linearen doppelsträngigen DNA mit einer Länge von etwa 36 kb. Es umfasst im Besonderen eine invertierte terminale Wiederholungssequenz (ITR) an jedem Ende, eine Enkapsidationssequenz (Psl), frühe und späte Gene (Vgl. 1). Die wichtigsten frühen Gene sind in den Regionen E1, E2, E3 und E4 enthalten. Unter diesen sind die Gene, die in der Region E1 enthalten sind, für die virale Propagation notwendig. Die wichtigsten späten Gene sind in den Regionen L1 bis L5 enthalten. Das Genom des Adenovirus Ad5 wurden vollständig sequenziert und ist in der Datenbank verfügbar (vgl. im Besonderen Genebank M73260).
Ebenso wurden Teile bzw. die Gesamtheit der anderen adenoviralen Genome (Ad2, Ad7, Ad12, etc.) ebenfalls sequenziert.
Die interessierende Nukleinsäure wird bevorzugt in eine für die Produktion des rekombinanten defektiven Virus nicht wesentliche Region eingefügt. Daher wird er bevorzugt in Höhe der Region E1 eingefügt, die im Virus defektiv und durch die Produktionslinie komplementiert ist, in Höhe der Region E3, die für die Produktion der rekombinanten Viren nicht wesentlich ist (ihre Inaktivierung darf nicht transkomplementiert werden), oder auch in Höhe der Region E4. Im letzten Fall ist es notwendig, bei der Produktion die Funktionen E4 zu komplementieren, entweder durch Cotransfektion mit einem Plasmid oder Virus Helper, oder mittels einer geeigneten Linie. Es versteht sich, dass andere Orte verwendet werden können. Insbesondere der Zugang zur Nukleotidsequenz des Genoms ermögliche es dem Fachmann, die Regionen zu identifizieren, die es ermöglichen, die interessierende Nukleinsäure einzufügen.
Die im Rahmen der Erfindung verwendeten rekombinanten defektiven Adenoviren können mit der dem Fachmann bekannten Technik hergestellt werden (Levrero et. al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Im Allgemeinen werden die Adenoviren durch Transfektion der DNA des rekombinanten Virus in einer geeigneten Enkapsidationszelllinie hergestellt. Es kann sich um eine einfache Transfektion handeln, wenn eine Konstruktion zur Verfügung steht, die das gesamte Genom des rekombinanten Virus trägt, oder, wie es häufiger der Fall ist, um eine Cotransfektion mehrerer DNA-Fragmente, die die verschiedenen Teile des rekombinanten viralen Genoms einbringen. In diesem Fall umfasst der Vorgang eine oder mehrere homologe Rekombinationsschritte zwischen den verschiedenen Konstruktionen in der Enkapsidationszelllinie, um die DNA des rekombinanten Virus zu erzeugen. Die verschiedenen für die Produktion des Virus verwendeten Fragmente können auf verschiedene Arten hergestellt werden. Die Technik, die zumeist verwendet wird, besteht darin, die virale DNA zu isolieren, und sie dann in vitro mittels herkömmlicher Verfahren der Molekularbiologie (Digestion, Ligation usw.) zu modifizieren. Die erhaltenen Konstruktionen werden dann gereinigt und für die Transfektion der Enkapsidationslinien verwendet Eine andere Technik beruht auf der Verwendung eine Plasmids, das einen Teil des Genoms des rekombinanten Virus trägt, das mit einem Virus cotransfektiert wird, der den fehlenden Teil des Genoms einbringt. Eine andere Möglichkeit liegt in der Verwendung von prokaryoten Plasmiden, um die viralen DNAs, die für die Transfektion verwendbar sind, herzustellen (vgl. Bett et al., PNAS 91 (1994) 8802; FR95 01632 ).
Die verwendete Zelllinie muss bevorzugt (i) durch die genannten Elemente transformierbar sein, und (ii), die Sequenzen umfassen, die in der Lage sind, den Teil des Genoms des defektiven Adenovirus zu komplementieren, bevorzugt in integrierter Form, um Rekombinationsrisiken zu vermeiden. Als Beispiel für eine Linie ist die menschliche embryonale Nierenlinie 293 zu nennen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die im Besonderen, integriert in ihr Genom, die linke Seite des Genoms eines Adenovirus Ad5 (12%) enthält, oder Linien, die in der Lage sind, die Funktionen E1 und E4 zu komplementieren, wie im Besonderen in den Patentanmeldungen Nr. WO 94/26914 und WO95/02697 beschreiben.
Dann werden die Adenoviren, die sich multipliziert haben, gemäß den herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie rückgewonnen und gereinigt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls jede pharmazeutische Verbindung, die einen oder mehrere rekombinante defektive Adenoviren umfasst, wie oben beschrieben. Die pharmazeutischen Verbindungen der Erfindung können im Hinblick auf eine Administration auf oralem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, transkutanem, intratrachealem, intraperitonealem usw. Weg formuliert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls jede pharmazeutische Verbindung, die durch einen rekombinanten Adenovirus infizierte Zellen umfasst, wie oben beschrieben. Vorteilhafterweise umfasst die Verbindung der Erfindung Antigene aufweisende Zellen (APC), die durch einen rekombinanten defektiven Adenovirus infiziert sind, wie oben beschrieben. Als besonderes Beispiel können die Makrophagen oder die G-Lymphozyten genannt werden. Die Erfindung betrifft auch eine Verbindung, die tumorantingenspezifische zytotoxische T-Zellen (CTL) umfasst, hergestellt durch die Kultur von Vorläuferzellen in Gegenwart von Antigene aufweisenden Zellen (APC), infiziert durch einen rekombinanten defektiven Adenovirus, wie oben beschrieben.
Bevorzugt enthält die pharmazeutische Verbindung der Erfindung pharmazeutisch annehmbare Vehikel für eine injizierbare Formulierung. Es kann sich insbesondere um salzhaltige Lösungen handeln (Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Natriumchlorid, Kalium, Calcium oder Magnesium usw., oder Mischungen dieser Salze), um sterile oder isotonische Lösungen oder um trockene, im Besonderen lyophilisierte Verbindungen, die gegebenenfalls durch die Addition von sterilisierten Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung, die Bildung von injizierbaren Lösungen ermöglichen.
Die für die Injektion verwendeten Virus-Dosen können, abhängig von verschiedenen Parametern, und im Besonderen abhängig von der verwendeten Administrationsart, der betreffenden Krankheit, des zu exprimierenden Gens, oder auch der angestrebten Behandlungsdauer, angepasst werden. Ganz Allgemein werden die rekombinanten Adenoviren gemäß der Erfindung in Form von Dosen zwischen 10⁴ und 10¹⁴ pfu, und bevorzugt zwischen 10⁶ und 10¹⁰ pfu formuliert und verabreicht. Der Begriff pfu (<<plaque forming unit>>) entspricht dem infektiösen Potential einer Viruslösung und wird festgelegt durch die Infektion einer geeigneten Zellkultur und, im Allgemeinen nach 15 Tagen gemessen, wobei Anzahl der infizierten Zellplaques gemessen wird. Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Werts einer viralen Lösung sind in der Literatur gut dokumentiert.
Gemäß dem betreffenden Antigen können die Adenoviren der Erfindung für die Behandlung und die Vorbeugung von Krebsarten verwendet werden, einschließlich im Besonderen der menschlichen Tumore (für die Antigene Mage-1 bis Mage-12, Gage und Bage und Rage) und der Sarkome (für die Antigene Mage-1).
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele umfassender beschrieben, wobei diese der Erläuterung dienen und nicht beschränkend sind.
Allgemeine Techniken des Klonens und der Molekularbiologie.
Die herkömmlichen Verfahren der Molekularbiologie, wie die Zentrifugierung von Plasmid-DNA im Cäsiumchlorid-Ethidiumbromgradienten, die Digestionen durch die Restriktionsenzyme, die Elektrophorese auf Gel, die Transformation in E. coli, die Fällung der Nukleinsäuren usw., werden in der Literatur beschrieben (Maniatis et al., 1989).
Die Enzyme wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) bereitgestellt.
Für die Ligaturen werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe auf Agarosegel von 0,8 bis 1,5% separiert, durch GeneClean (BIO101, LaJolla CA) gereinigt und nachts bei 14°C in einer Base Tris-HCl bei einem pH-Wert von 7,4 50 mM, MgCl₂ 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, in Gegenwart von DNA-Ligase von Phage T4 inkubiert.
Die Amplifikation durch PCR, (Polymerase Chain Reaction) wurden ebenfalls gemäß Maniatis et al., 1989, mit den folgenden Spezifikationen durchgeführt:

– Konzentration in MgCl₂ auf 8 mM gebracht.
– Denaturierungstemperatur 95°C, Hybridisierungstemperatur 55°C, Verlängerungstemperatur 72°C. Dieser Zyklus wurde 25 Mal in einem PE9600 Thermal cycler (Perkin Elmer, Norwalk CO) wiederholt.

Die Oligonukleotide werden unter Verwendung der Phosphoramid-Chemie, wobei β durch eine Cyanoethylgruppe geschützt wird, (Sinha et al., 1984, Giles 1985), mit dem automatischen DNA-Synthetisator, Applied Biosystem, Modell 394, (Applied Biosystem, Foster City CA), nach den Empfehlungen des Herstellers synthetisiert.
Die Sequenzierung wurde auf doppelsträngigen Matrizen mittels des Kettenendenverfahrens unter Verwendung fluoreszierender Bausteine hergestellt. Wir haben das Sequenzier-Kit Taq Dye Primer Kit von Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) gemäß den Spezifikationen des Herstellers verwendet.
Beispiel 1: Konstruktion eine rekombinanten defektiven Adenovirus, der für eine P1A-Antigenfragment kodiert.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten defektiven Adenovirus gemäß der Erfindung, der für ein P1A-Antigen kodiert. Besonders bevorzugt trägt der Adenovirus die Sequenz SEQ ID Nr. 3. Der konstruierte Adenovirus ist ein Adenovirus vom Serotyp 5, der eine Deletion in den Regionen E1 und E3 besitzt, wobei die interessierende Nukleinsäure in die Region E1 in Höhe der Deletion eingefügt ist.
Die in Höhe der Region E1 eingefügte Nukleinsäure umfasst besonders bevorzugt:

– den Promoter SRα. Der Promoter SRα umfasst den frühen Replikationsursprung von SV40 und einen Teil der LTR von HTLV1 (der der Domäne R einem Teil von U5 entspricht), gefolgt von der Spleißstelle 16S von SV40 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
– ein Minigen P1A von 44 pb (SEQ ID Nr. 3).
– die Polyadenylierungsstelle des Virus SV40.

Diese Nukleinsäure wurde aus dem Plasmid pcD-SRα-P1A extrahiert, das dem Plasmid pcD-SRα entspricht, in dem das Minigen P1A an der Stelle EcoRI geklont wurde. Die erhaltene Einfügung wurde dann in dem Plasmid pAd.RSV-βGal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) geklont, wobei es anstelle des Fragments, die LTR von RSV und das Gen LacZ enthält.
Das so erhaltene Plasmid pAd-SRα-P1A wurde dann verwendet, um den rekombinanten Adenovirus herzustellen. Zu diesem Zweck wurden die Zellen der Linie 293 cotransfiziert durch 5 μg des Plasmids pAd-5Rα-P1A und durch 5 μg der DNA des Adenovirusmutanten dl 324 in Gegenwart von Calciumphosphat. Die hergestellten rekombinanten Adenoviren wurden durch Reinigung auf Plaque selektioniert. Nach der Isolierung wurde der rekombinante Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand führte, der den nicht gereinigten rekombinanten Adenovirus in einem Wert von etwa 10¹⁰ pfu/ml enthielt.
Die Viruspartikel werden dann durch Zentrifugierung auf dem Cäsiumchloridgradienten gemäß der bekannten Techniken (vgl. im Besonderen Graham et al., Virology 52 (1973) 456) gereinigt. Die Analyse der viralen DNA durch Digestion mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI zeigt die Gegenwart der Einfügung im Genom. Der Adenovirus kann bei –80°C in 10% Glycerol konserviert werden.
Beispiel 2: Konstruktion eine rekombinanten defektiven Adenovirus, der für ein Antigenfragment Mage-1 kodiert.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten defektiven Adenovirus gemäß der Erfindung, der für ein Antigenfragment Mage-1 kodiert. Besonders bevorzugt trägt der Adenovirus die Sequenz SEQ ID Nr. 1, die für ein Fragment kodiert, das das antigene Monopeptid von Mage-1 trägt. Der konstruierte Adenovirus ist ein Adenovirus vom Serotyp 5, der eine Deletion in den Regionen E1 und E3 besitzt, wobei die interessierende Nukleinsäure in die Region E1 in Höhe der Deletion eingefügt ist.
Die in Höhe der Region E1 eingefügte Nukleinsäure umfasst besonders bevorzugt:

– den Promoter SRα. Der Promoter SRα umfasst den frühen Replikationsursprung von SV40 und einen Teil der LTR von HTLV1 (der der Domäne R einem Teil von U5 entspricht), gefolgt von der Spleißstelle 16S von SV40 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
– ein Minigen MAGE-1 von 116 pb (SEQ ID Nr. 1). Dieses Fragment wurde mittels PCR aus dem vollständigen Mage-1-Gen erhalten. Es umfasst ein ATG an Position 15, einen Stop-Codon an Position 121 und einen Teil des Exon 3 des Mage-1-Gens. Es umfasst die Sequenz, die dem Nonapeptid (27 pb) entspricht, das den zytotoxischen T-Lymphozyten durch das Molekül HLA.A1 präsentiert wird.
– die Polyadenylierungsstelle des Virus SV40.

Diese Nukleinsäure wurde aus dem Plasmid pcD-SRα-MAGE-1 extrahiert, das dem Plasmid pcD-SRα entspricht, in dem das Minigen Mage-1 an der Stelle EcoRI geklont wurde. Die erhaltene Einfügung wurde dann in dem Plasmid pAd.RSV-βGal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) geklont, wobei es anstelle des Fragments, die LTR von RSV und das Gen LacZ enthält.
Das so erhaltene Plasmid pAd-SRα-MAGE-1 wurde dann verwendet, um den rekombinanten Adenovirus herzustellen. Zu diesem Zweck wurden die Zellen der Linie 293 cotransfiziert durch das Plasmid pAd-SRα-MAGE-1 und durch die DNA des Adenovirusmutanten dl 324 in Gegenwart von Calciumphosphat. Die hergestellten rekombinanten Adenoviren wurden durch Reinigung auf Plaque selektioniert. Nach der Isolierung wurde der rekombinante Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand führte, der den nicht gereinigten rekombinanten Adenovirus in einem Wert von etwa 10¹⁰ pfu/ml enthielt.
Die Viruspartikel werden dann durch Zentrifugierung auf dem Cäsiumchloridgradienten gemäß der bekannten Techniken (vgl. im Besonderen Graham et al., Virology 52 (1973) 456) gereinigt. Die Analyse der viralen DNA durch Digestion mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI zeigt die Gegenwart der Einfügung im Genom. Der Adenovirus kann bei –80°C in 10% Glycerol konserviert werden.
Beispiel 3: Konstruktion eine rekombinanten defektiven Adenovirus, der für ein Antigenfragment Mage-3 kodiert.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten defektiven Adenovirus gemäß der Erfindung, der für ein Mage-3-Antigen kodiert. Besonders bevorzugt trägt der Adenovirus die Sequenz SEQ ID Nr. 2. Der konstruierte Adenovirus ist ein Adenovirus vom Serotyp 5, der eine Deletion in den Regionen E1 und E3 besitzt, wobei die interessierende Nukleinsäure in die Region E1 in Höhe der Deletion eingefügt ist.
Die in Höhe der Region E1 eingefügte Nukleinsäure umfasst besonders bevorzugt:

– den Promoter SRα. Der Promoter SRα umfasst den frühen Replikationsursprung von SV40 und einen Teil der LTR von HTLV1 (der der Domäne R einem Teil von U5 entspricht), gefolgt von der Spleißstelle 16S von SV40 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
– ein Minigen MAGE-3 von 44 pb (SEQ ID Nr. 2). Dieses Fragment wurde mittels PCR aus dem vollständigen Mage-3-Gen erhalten. Es umfasst ein ATG an Position 12, einen Stop-Codon an Position 44 und die Sequenz, die dem Nonapeptid (27 pb) entspricht, die den zytotoxischen T-Lymphozyten durch das Molekül HLA.A1 präsentiert wird.
– die Polyadenylierungsstelle des Virus SV40.

Diese Nukleinsäure wurde aus dem Plasmid pcD-SRα-MAGE-3 extrahiert, das dem Plasmid pcD-SRα entspricht, in dem das Minigen Mage-3 an der Stelle EcoRI geklont wurde. Die erhaltene Einfügung wurde dann in dem Plasmid pAd.RSV-βGal anstelle des Fragments geklont, das die LTR von RSV und das Gene LacZ enthält.
Das so erhaltene Plasmid pAd-SRα-MAGE-3 wurde dann verwendet, um den rekombinanten Adenovirus herzustellen. Zu diesem Zweck wurden die Zellen der Linie 293 cotransfiziert durch das Plasmid pAd-SRα-MAGE-3 und durch die DNA des Adenovirusmutanten dl 324 in Gegenwart von Calciumphosphat. Die hergestellten rekombinanten Adenoviren wurden durch Reinigung auf Plaque selektioniert. Nach der Isolierung wurde der rekombinante Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand führte, der den nicht gereinigten rekombinanten Adenovirus in einem Wert von etwa 10¹⁰ pfu/ml enthielt.
Die Viruspartikel werden dann durch Zentrifugierung auf dem Cäsiumchloridgradienten gemäß der bekannten Techniken (vgl. im Besonderen Graham et al., Virology 52 (1973) 456) gereinigt. Die Analyse der viralen DNA durch Digestion mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI zeigt die Gegenwart der Einfügung im Genom. Der Adenovirus kann bei –80°C in 20% Glycerol konserviert werden.
Beispiel 4: Funktionelle Charakterisierung des Adenovirus der Erfindung
Dieses Beispiel zeigt, dass die Viren gemäß der Erfindung in der Lage sind, die Expression des interessierenden Gens zu induzieren, das für ein Protein kodiert, dessen Abbau zur Expression eines antigenen Peptids an der Oberfläche der Targetzellen führt.
Die Expression des Minigens MAGE-1 und die Präsentation des Peptids wurden auf den, durch Ad-Mage (4.1.) infizierten Zellen, sichtbar gemacht, durch Bestimmung der spezifischen Lyse (4.2.) und Stimulierung der Produktion von TNF (4.3.).
4.1. Zelllinien
Es wurden folgende Zelllinien infiziert:

– C1R.A1: B-Lymphozyt-Linie transferiert durch EBV (Ref. Storkus, W. J., Howell, D. N., Salter, R. D., Dawson, J. R., and Cresswell, P.: NK susceptibility varies inversely with target cells class I HLA antigen expression. J. Immunol. 138: 1675 – 1659, 1987) und transfeziert durch das Gen HLA.A1, das in dem Plasmid pHEBO geklont wurde.
– Gen III β E^–F^–: Menschliche Melanomzellen HLA.A1, die für den Verlust des Antigens MAGE-1 (in den Tabellen 1 und 2 als Gerlach E bezeichnet) immunselektiert wurden.

Diese beiden Linien exprimieren also das Molekül HLA.A1, aber nicht das Antigen MAGE-1.
4.2. Bestimmung der spezifischen Lyse
Dieses Beispiel beweist die Existenz einer spezifischen Lyse in den Zellen durch einen Klon von antigenspezifischen CTL (Aussalzungstest mit radioaktivem Chrom). Zu diesem Zweck wurden die unter 4.1. genannten Zellen mit dem Adenovirus Ad-Mage1 (Beispiel 2) oder durch den Kontrolladenovirus (Ad-βGal) mit einer Infektionsmultiplizität von 500 pfu/Zelle infiziert. Die infizierten Zellen wurden dann mit Chrom 51 markiert, danach 4 Stunden lang mit 1000 Zellen/Mikrotiter inkubiert, mit der spezifischen CTL (Klon 82:30) in unterschiedlichen Effektorzellen/Targetzellen-Verhältnissen (E/T). Danach wurde der Prozentwert der Lyse bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 1 präsentiert. Sie zeigen eindeutig, dass die durch die Viren gemäß der Erfindung infizierten Zellen eine Lyse-Sensibilität durch die spezifischen CTL aufweisen, die deutlich höher ist, als jene der mit dem Kontrolladenovirus infizierten Zellen. Die Zellen weisen im Vergleich zu den direkt durch das Antigen Mage-1 transfizierten Zellen ebenfalls eine deutlich gesteigerte Sensibilität auf, was die therapeutische Wirksamkeit der Vektoren der Erfindung beweist.
Diese Ergebnisse zeigen also eindeutig, dass die Viren der Erfindung in der Lage sind, den Zellen über die spezifischen CTL eine hohe Lysesensibilität zu verleihen.
4.3. Stimulierung der Produktion von TNF
In diesem Beispiel wurde die Fähigkeit der Zellen Gerl III β E^–F^–, die Produktion von TNF durch den gleichen CTL-Klon zu stimulieren, bewertet. Zu diesem Zweck wurden die Zellen Gerl III β E^–F^– mit dem Adenovirus Ad-Mage1 (Beispiel 2) oder durch den Kontrolladenovirus (Ad-βGal) mit einer Infektionsmultiplizität von 50 bis 100 pfu/Zelle infiziert und dann mit dem CTL-Klon inkubiert. Nach 24 Stunden wurde die in den Überständen vorhandene Menge an TNF durch Bestimmung ihrer Zytotoxizität auf einer TNF-sensiblen Linie TNF (Linie WEHI-164-13) gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zelle wurde mittels eines kolorimetrischen Tests (MTT) gemessen. Die Ergebnisse werden in optischer Dichte ausgedrückt und dann in der TNF-Menge (pg/ml). Dieser Test wurde nicht an den Zellen C1R.A1 durchgeführt, da diese natürlich TNF sekretieren. Die Kontrollzellen Gerlach E^– sind Melanomzellen die Mage-1 und HLA-A1 exprimieren.
Die erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 2 präsentiert. Sie zeigen eindeutig, dass die mit den Viren gemäß der Erfindung infizierten Zellen durch die CTL eine TNF-Produktion induzieren, was unzweideutig die biologischen und therapeutischen Eigenschaften der Viren der Erfindung bestätigt.
Beispiel 5: In-vivo-Aktivität der P1A-Viren der Erfindung
Beispiel 4 hat gezeigt, dass, in vitro oder ex vivo, die mit einem Adenovirus gemäß der Erfindung infizierten Zellen in einem TNF-Test gut erkannt, und in einem Aussalzungstest mit radioaktiven Chrom durch eine spezifische CTL lysiert werden.
Dieses Beispiel beweist nun, dass die Adenoviren gemäß der Erfindung, in der Lage sind, in vivo eine spezifische CTL-Antwort zu erzeugen. Insbesondere zeigt dieses Beispiel dass 2 Injektionen in einem Abstand von einer Woche von 10⁹ Viralpartikeln (pfu) in die Mäuse DBA/2, bei einem Teil von ihnen eine starke CTL-spezifische Antwort erzeugen.
Es wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt. In der ersten Versuchsreihe wurden die Viralpartikel zur Hälfte in die Peritonealhöhle und zur anderen Hälfte unter die Haut administriert (an 4 Stellen). In der zweiten Versuchsreihe wurden die Viralpartikel durch subkutante, intraperitoneale, intranasale und intratracheale Injektionen administriert. Diese zwei Versuchreihen wurden gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt. Die Mäuse wurden 15 Tage nach der zweiten Serie von Adenovirusinjektionen geopfert. Die Splenozyten dieser Mäuse wurden dann der Gegenwart des Antigens P815A mittels der Zellen L1210A+ (syngenische Leukämie, transfiziert mit dem Gen P₁A des Mastozytoms P815) ausgesetzt und 8 Tage lang bestrahlt. Am Ende dieser gemischten Tumor-Lymphozytenkultur (MLTC), proliferierten die gegen das Antigen P815A gerichteten Lymphozyten und differenzierten sich in Killer-T-Lymphozyten. Diese wurden dann der Gegenwart von Markerzellen mit radioaktivem Chrom ausgesetzt. Es handelt sich um P511-Zellen, eine Azaguanin-Variante, die gegenüber dem Mastozytom der Maus P815, das das Antigen A trägt, und gegenüber Pl.204, einer Variante des gleichen Mastozytoms, die das Antigen A verloren hat, resistent ist. Letztere dient der Negativkontrolle. Um jede Möglichkeit einer nicht-spezifischen Reaktion auszuschalten, wurden die mit dem radioaktiven Chrom markierten Targetzellen ebenfalls der Gegenwart der syngenischen Zellen (L1210) ausgesetzt, die auf ihrer Oberfläche die Antigene der stimulierenden Zellen in der MLTC tragen, mit Ausnahme des Antigens A von P815.
Die aus der ersten Versuchsreihe erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt im Prozentwert der spezifischen Lyse, werden in den Tabellen 3A und 3B präsentiert.
Die aus der zweiten Versuchsreihe erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt im Prozentwert der spezifischen Lyse, werden in den Tabellen 4A und 4B präsentiert.
In beiden Fällen zeigen die präsentierten Ergebnisse, Maus für Maus, die Lyse-Level proportional zum den Verhältnissen Effektor/Target (Mittel der Duplikate). Es wurden unabhängig von der Adenovirus-Injektionsstelle CTL erhalten (Tabelle 4A + B). Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Adenoviren der Erfindung, in der Lage sind, in vivo eine Immunität Zellen zu erzeugen, die en Tumorantigen tragen.
Tabelle 4A
Tabelle 4A (Fortsetzung)
Tabelle 4A (Fortsetzung)
Tabelle 4B 2. Mäuse, denen Adβgal injiziert wurde
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verbindung mit durch einen mit in seinem Genom eingefügter, ganz oder teilweise einen Code eines spezifischen Antigens eines aus den Proteinen Mage-1, Mage-3, Bage, Rage und Gage ausgewählten menschlichen Melanoms kodierenden Nukleinsäure defektiven rekombinanten Adenovirus infizierten Zellen, mit dem den zytotoxischen Lymphozyten T in Verbindung mit den Molekülen des CMH-I präsentierten Teil, die zur Induktion eines Immunschutzes und einer Zerstörung der entsprechenden Tumorzellen durch das Immunsystem fähig ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die infizierten Zellen Antigene aufweisende Zellen (APC) umfassen.
Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die infizierten Zellen für menschliche Tumoren spezifische zytotoxische Lymphozyten umfassen.
Verbindung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus die Sequenz SEQ ID Nr. 1 in seinem Genom eingefügt umfasst.
Verbindung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus die zwischen den Resten 55 bis 82 der Sequenz SEQ ID Nr. 1 inbegriffene Sequenz eingefügt in seinem Genom umfasst.
Verbindung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus die Sequenz SEQ ID Nr. 2 eingefügt in seinem Genom umfasst.
Verbindung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus aus den menschlichen Serotypen Ad2 und Ad5 ausgewählt ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus aus den Hunde-Serotypen ausgewählt ist.
Verbindung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus eine Defizienz in der Region E1 umfasst.
Verbindung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Adenovirus darüber hinaus eine Defizienz in der Region E4 umfasst.
Verbindung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in der Region E1 oder E3 oder E4 eingefügt ist.