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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zu Behandlung menschlicher
Tumoren mittels Gentherapie. Sie betrifft insbesondere die Verwendung
rekombinanter defektiver Viren, die eine Sequenz tragen, die für ein spezifisches
Antigen der menschlichen Tumoren kodieren, zur vorbeugenden oder
heilenden Behandlung menschlicher Tumoren sowie um in vitro oder
ex vivo spezifische CTL zu erzeugen. Sie betrifft ebenfalls pharmazeutische
Verbindungen, die den Virus umfassen, im Besonderen in injizierbarer
Form.
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Die
Gentherapie besteht in der Korrektur einer Schädigung oder Anomalie, indem
eine genetische Information in die betroffene Zelle oder das betroffene
Organ eingeführt
wird. Diese Information kann entweder in vitro in eine Zelle eingeführt werden,
die dem Organ entnommen wurde, und dann wieder in den Organismus injiziert
wird, oder in vivo, direkt in dem betreffenden Gewebe. Da es sich
um ein Molekül
mit hohem Molekulargewicht und negativer Ladung handelt, hat die
DNA Schwierigkeiten, die Phospholipid-Zellmembranen spontan zu durchdringen.
Es werden also verschiedene Vektoren verwendet, um einen Transfer
der Gene zu ermöglichen:
Virale Vektoren einerseits, chemische und/oder biochemische, natürliche oder
synthetische Vektoren, andererseits. Chemische und/oder biochemische
Vektoren sind zum Beispiel Kationen (Calciumphosphat, DEAE-dextran, ...), die
wirken, indem sie Präzipitate
mit der DNA bilden, welche durch die Zellen „phagozytiert" werden. Es kann
sich ebenfalls um Liposome handeln, in denen die DNA inkorporiert
ist und die mit der Plasmidmembran fusionieren. Die synthetischen
Gentransfervektoren sind im Allgemeinen Lipide oder kationische
Polymere, die die DNA komplexieren und mit ihr ein Partikel bilden,
das auf der Oberfläche
positive Ladungen trägt.
Diese Partikel sind in der Lage, mit den negativen Ladungen der
Zellmembran zu interagieren, und diese dann zu überwinden. Als Beispiele für diese
Vektoren können
Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS, TransfectamTM)
oder N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]- N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA,
LipofectinTM) zitiert werden. Es wurden
auch chimäre
Proteine entwickelt: Sie bestehen aus einem polykationischen Teil,
der die DNA kondensiert, gebunden an einen Liganden, der sich an
einen Membranrezeptor fixiert, und den Komplex durch Endozytose
in die Zellen mitnimmt. So ist es theoretisch möglich ein Gewebe oder bestimmte
Zellpopulationen „ins
Visier zu nehmen",
um die Bioverfügbarkeit
in vivo des transferierten Gens zu verbessern (für eine Beurteilung, vgl. Behr,
1993, Cotten und Wagner, 1993). Unter den potentiell als Vektoren für den Gentransfer
verwendbaren Viren, können
insbesondere die Retroviren (RSV, HMS, MMS, etc.), der HSV-Virus,
die adeno-assoziierten Viren und die Adenoviren zitiert werden.
Diese Viren wurden alle verwendet, um verschiedene Zelltypen zu
infizieren.
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Gentherapeutische
Ansätze
wurden zur Behandlung verschiedener Arten von Krankheiten, einschließlich Störungen des
Nervensystems, kardiovaskulärer
Erkrankungen oder Krebsarten, entwickelt. Insbesondere bezüglich der
Domäne
der Krebsarten wurden im Stand der Technik verschiedene Ansätze vorgeschlagen.
So beschreiben die Studien die Verwendung von aktiven Lymphozyten
ex vivo durch Kultur in Gegenwart von Interleukin-2 oder durch Transfektion
mit dem Interleukin-2-Gen. Es wurden ebenfalls Studien zur adoptiven
Immuntherapie mit Monozyten-Makrophagen
durchgeführt,
die ex vivo durch Interferon gereinigt und aktiviert wurden, um
ihr tumorizides Potential zu erhöhen,
und den Patienten dann wieder injiziert wurden (Andressen et al.,
Cancer Res. 50 (1990) 7450). Die Möglichkeit, gentechnisch modifizierte
Makrophagen zu verwenden, wurde ebenfalls beschrieben (WO95/06120).
Eine andere Reihe von Ansätzen
basiert auf dem Transfer toxischer Gene, die in der Lage sind, auf
direkte oder indirekte Weise, das Absterben der kanzerösen Zellen
zu induzieren. Dies Art des Ansatzes wurde zum Beispiel mit dem
Thymidinkinasegen beschrieben, das in vivo entweder durch einen
adenoviralen Vektor (PCT/FR94/01284; PCT/FR94/01285), oder durch
Transplantation der Produktionszellen eines retroviralen Vektors
(Caruso et al., PNAS 90 (1993) 7024) transferiert wird. Andere Gene,
die verwendet wurden, sind zum Beispiel das Cytosindesaminasegen.
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Die
vorliegende Patentanmeldung betrifft ein neues Verfahren zur Behandlung
von Krebs. Sie richtet sich ganz besonders auf die Behandlung von
Melanomen. Das Verfahren der Erfindung beruht auf dem Transfer und
der Expression in vivo der spezifischen Antigene der Melanome, die
in der Lage sind, (i) einen Immunschutz gegen das Auftreten dieser
Krebsart und (ii) eine Expansion der Population der zytotoxischen
T-Zellen (CTL), die spezifisch für
die Zellen sind, die diese Antigene aufweisen, und so eine Zerstörung durch
das Immunsysteme der entsprechenden Tumorzellen induzieren.
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Das
Immunsystem hat neben anderen Funktionen die Fähigkeit, einen Schutz gegen
Virusinfektionen zu gewährleisten.
Diese Fähigkeit
wird durch die zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) gewährleistet.
Die CTL weisen zwei bemerkenswerte Charakteristiken auf: sie sind
höchst
spezifisch und von hoher Wirksamkeit. Sie zerstören die infizierten Zellen
nachdem sie ein virales Antigen an deren Oberfläche geortet haben. Das fragliche
Antigen manifestiert sich in Form eines Peptids, das mit einem Molekül des Haupt-Histokompatibilitätskomplex
der Klasse I (CMH-I) assoziiert ist. Im Rahmen der Tumore wurde
anfangs bei den Mäusen
beobachtet, dass diese malignen Zellen Peptidmolekülkomplexe
von CMH-I aufweisen, die in der Lage sind, wie im Rahmen der antiviralen
Antworten, eine durch die CTL vermittelte Immunantwort zu provozieren.
Diese Peptide stammen insbesondere von Proteinen, die durch mutierte
oder in den Tumorzellen selektiv aktive Zellen kodiert sind. Diese
Proteine werden als tumorspezifische Antigene bezeichnet. Unlängst wurden
die von den CTL erkannten Differenzierungsantigene auf menschlichen
Tumoren charakterisiert.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Behandlung
menschlicher Tumoren. Es ergibt sich im Besonderen aus der Entwicklung
von Vektoren viralen Ursprungs, die in der Lage sind, menschliche
tumor- oder melanomspezifische Antigene in vivo zu transferieren
und zu exprimieren. Es beruht insbesondere auf dem Nachweis, bei
den murinen Modellen, dass die rekombinanten defektiven Adenoviren
in der Lage sind, eine Immunisierung gegen diese Art von Antigenen
zu induzieren, die es ermöglicht,
in vivo die lymphozytären
Antworten gegen diese Antigene und im Besonderen gegen die Tumorzellen,
die sie tragen, zu erhalten. Dieses Verfahren gemäß der Erfindung,
ermöglicht
es also, durch den Transfer dieser Gene auf eine besonders wirkungsvolle
Art auf die Entwicklung der menschlichen Tumore einzuwirken, indem
ihr Fortschritt gestoppt wird, was zur Ausrottung führen kann.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt also einen rekombinanten defektiven
Adenovirus, der, in sein Genom eingefügt, eine Nukleinsäure enthält, die
ganz oder teilweise ein Protein oder ein tumorspezifisches Peptid
und insbesondere ein melanomspezifisches Antigene kodiert.
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Bevorzugt
handelt es sich um ein menschliches melanomspezifisches Antigen.
Gans besonders bevorzugt handelt es sich um ein Fragment eines menschlichen
melanomspezifischen Antigens, umfassend den Teil, der den CTL in
Assoziation mit den Molekülen
von CMH-I präsentiert
wird. Die menschlichen tumorspezifischen Antigene wurden von Thierry
Boon et al. (US5,342,774; US5,405,940; WO92/20356; WO94/23031; WO94/21126)
beschrieben. Diese Antigene, die mit dem Begriff MAGE bezeichnet
werden, werden in den Tumorzellen, hauptsächlich in den menschlichen
Tumoren selektiv exprimiert. Verschiedene menschliche MAGE-Gene
wurden beschrieben, und im Besonderen die Gene MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3,
MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11,
MAGE-12. Repräsentativ
für die
homologen murinen Gene lassen sich ebenfalls die Gene S-MAGE-1 und
S-MAGE-2 aufführen.
Was insbesondere die Gene BAGE, GAGE und RAGE betrifft, sind sie
repräsentativ
für andere
verwandten Genfamilien.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter defektiver
Adenovirus beschrieben, der, eingefügt in sein Genom, eine Nukleinsäure für Protein
oder ein von diesem abgeleiteten Peptid kodiert, ausgewählt aus
den Proteinen Mage-1, Mage-3, Bage, Gage und Rage. Diese Antigene
sind nämlich
die selektivsten, in dem Sinne, dass sie für den allergrößten Teil
auf keiner somatischen, nicht tumoralen Zelle nachgewiesen wurden.
Die Sequenz des Antigens Mage-1 und des entsprechenden Gens wurde
im Besondern in Van der Bruggen et al., Science 254 (1991) 1644)
beschrieben. Die Sequenz der cDNA kodierend für Mage-1 und Mage-3 wurde zum
Beispiel in Gaugler et al. (J. Exp. Med. 179 (1994) 921) beschrieben.
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Wie
oben angegeben, wird ein rekombinanter defektiver Adenovirus beschrieben,
der, eingefügt
in sein Genom, eine Nukleinsäure
enthält,
die für
ein Peptid der Proteine Mage-1,
Mage-3, Bage oder Gage kodiert, umfassend den Teil, der den CTL
in Assoziation mit den Molekülen
von CMH-I präsentiert
wird. Die Gene Mage, Bage und Gage kodieren nämlich für Proteine von beträchtlicher
Größe. Diese
Proteine werden mittels enzymatischer Digestion in der Zelle abgebaut,
wodurch Peptide erzeugt werden. Das sind die Peptide, die dann auf
der Oberfläche
der Zellen präsentiert
werden, und die von den CTL in Assoziation mit den Molekülen von
CMH-I erkannt werden (Vgl. 2). Ganz
besonders bevorzugt betrifft die Erfindung einen rekombinanten Adenovirus,
der, eingefügt
in sein Genom, eine Nukleinsäure
enthält,
die für
ein Peptid der Proteine Mage-1 oder Mage-3 kodiert, umfassend den
Teil, der den CTL präsentiert
wird.
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Gemäß einer
spezifischen Ausführungsform
wird ein rekombinanter Adenovirus beschrieben, der, eingefügt in sein
Genom, die Sequenz SEQ ID Nr. 1 umfasst. Diese Sequenz umfasst die
Sequenz, die für
das Nonapeptid (27 pb) von Mage-1 kodiert, die den zytotoxischen
T-Lymphozyten durch das Molekül
HLA.A1 präsentiert
wird. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um die Sequenz zwischen
den Resten 55 bis 82 der Sequenz SEQ ID Nr. 1.
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Gemäß einer
anderen spezifischen Ausführungsform
wird ein rekombinanter Adenovirus beschrieben, der, eingefügt in sein
Genom, die Sequenz SEQ ID Nr. 2 umfasst. Diese Sequenz umfasst die
Sequenz, die für
das Nonapeptid (27 pb) von Mage-3 kodiert, die den zytotoxischen
T-Lymphozyten durch das Molekül HLA.A1
präsentiert
wird.
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Gemäß einer
anderen Ausführungsform
wird ein rekombinanter Adenovirus beschrieben, der eingefügt in sein
Genom, eine Nukleinsäure
für das
antigene Peptid des Gens P1A des Mastozytom p815 der Maus DBA/2
(SEQ ID n° 3)
umfasst.
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Wie
zuvor angegeben, ermöglichen
die Adenoviren einen Transfer und eine wirkungsvolle Expression dieser
antigenen Peptide in vivo. So ermöglichen sie auf ganz bemerkenswerte
Weise, in vivo das Auftreten von für diese Antigene spezifischer
zytotoxische T-Lymphozyten zu stimulieren, die selektiv jede Zelle
zerstören,
die auf ihrer Oberfläche
dieses Antigen aufweist.
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Die
Viren, die im Rahmen der Erfindung beschrieben wurden, sind also
für die
Herstellung pharmazeutischer Verbindungen verwendbar, die für die Behandlung
von Krebsarten bestimmt sind, deren Zellen die Mage-Antigene auf
ihrer Oberfläche
aufweisen. Um diese Verbindungen herzustellen, werden bevorzugt
die Tumorzellen (im Allgemeinen von einem Melanom) eines Patienten
entnommen und analysiert, um (i) die Expression eines Mage-Gens,
zum Beispiel, mittels RT-PCR
zu bestimmen und (ii) gegebenenfalls, dieses Mage-Antigen zu typisieren.
Ein Adenovirus, der eine Nukleinsäure enthält, die für das gesamte oder einen Teil des
entsprechenden Antigens kodiert, wird für die Administration konstruiert
und verwendet.
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Die
Viren können
ebenfalls in vitro (oder ex vivo) verwendet werden, um zytotoxische
T-Zellpopulationen zu erzeugen, die spezifisch für ein gegebenes Tumorantigen
sind. Zu diesem Zweck wird eine Zellpopulation durch einen Virus
der Erfindung infiziert, und dann mit den Vorläufern der CTL-Zellen in Kontakt
gebracht. Die CTL-spezifischen Zellen der Antigene können dann
in vitro selektioniert, amplifiziert, dann als Medikament verwendet
werden, um spezifisch die entsprechenden Tumore zu zerstören. Vorteilhafterweise
umfasst die Zellpopulation, die mit dem Virus der Erfindung infiziert
ist, Antigene aufweisende Zellen (APC): Es kann sich insbesondere
um Makrophagen (WO95/06120) oder B-Zellen handeln.
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In
den Adenoviren, die im Rahmen der Erfindung beschrieben werden,
kann die eingefügte
Nukleinsäure
ein komplementäres
DNA-Fragment (cDNA), eine genomische DNA (gDNA) oder eine hybride
Konstruktion, bestehend zum Beispiel aus einer cDNA sein, in die
eine oder mehrere Introns eingefügt
sind. Er kann sich ebenfalls um synthetische oder semisynthetische
Sequenzen handeln. Wie zuvor angegeben, handelt es sich um eine
Nukleinsäure,
kodierend für
ein ganzes Protein oder Peptid, abgeleitet von diesem Protein, ausgewählt unter
Mage-1, Mage-3, Bage und Gage. Im Sinne der vorliegenden Erfindung,
bedeutet die Peptidexpression, die von diesem Protein abgeleitet
ist, dass die Nukleinsäure
nur für
ein Fragment des Proteins kodieren kann, wobei dieses Fragment geeignet
sein muss, CTL zu erzeugen. Das Fragment gemäß der Erfindung trägt also
mindestens einen Antigendeterminanten, der von einem spezifischen
CTL erkannt wird. Diese Fragmente können mittels jeder dem Fachmann
bekannten Technik erhalten werden, und im Besonderen mittels genetischer
und/oder chemischer und/oder enzymatischer Modifikationen, oder
auch mittels Klonen durch Expression, die die Selektion von Varianten
in Abhängigkeit
von ihrer biologischen Aktivität
ermöglichen.
Die genetischen Modifikationen schließen die Suppressionen, Deletionen,
Mutationen usw. ein.
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Die
eingefügte
Nukleinsäure
ist bevorzugt eine cDNA oder eine gDNA.
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Im
Allgemeinen umfasst die eingefügte
Nukleinsäure
ebenfalls Sequenzen, die die Expression in der mit dem Antigen infizierten
Zelle oder dem Antigenfragment ermöglichen. Es kann sich um Sequenzen
handeln, die natürlich
für die
Expression des betreffenden Antigens verantwortlich sind, wenn diese
Sequenzen geeignet sind, in der infizierten Zelle zu funktionieren.
Es kann sich ebenfalls um Sequenzen verschiedenen Ursprungs handeln,
die als heterologe Sequenzen bezeichnet werden, (verantwortlich
für die
Expression anderer oder sogar synthetischer Proteine). Im Besonderen
kann es sich um Promoter von Eukaryotengenen oder viralen Genen
oder um abgeleitete Sequenzen handeln, die die Transkription eines
Gens auf spezifische Weise oder nicht und auf induzierbare Weise
oder nicht, stimulieren oder reprimieren. Als Beispiel kann es sich um
Promotersequenzen, die aus dem Genom der Zelle stammen, die infiziert
werden soll oder aus des Genoms eines Virus handeln, und im Besonderen
um Promoter der Gene E1A, einen MPL des Adenovirus, den Promoter
CMV, LTR-RSV, SRα,
usw. Unter den Eukariotenpromotern können ebenfalls die ubiquitären Promoter
(HPRT, Vimentin, α-Actin,
Tubulin usw.), die Promoter der Intermediärfilamente (Desmin, Neurofilamente, Keratin,
GFAP usw.), die Promoter der therapeutischen Gene (Typ MDR, CFTR,
Faktor VIII usw.), die gewebespezifischen Promoter (Pyruvatkinase,
Villin, Promoter des intestinalen Bindungsproteins der Fettsäuren, Promoter
des α-Actins
glatter Muskelzellen, leberspezifische Promoter; Apo AI, Apo AII,
menschliches Albumin usw.) zitiert werden, oder auch die Promoter,
die auf eine Stimulus antworten (Steroidhormonrezeptor, Retinolsäurerezeptor
usw.). Außerdem
können
die Expressionssequenzen modifiziert werden durch Addition von Aktivationssequenzen,
von Regulationssequenzen usw. Wenn die eingefügte Nukleinsäure im Übrigen keine
Expressionssequenzen enthält,
kann sie in das Genom des defektiven Virus stromabwärts einer
solchen Sequenz eingefügt
werden.
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Die
im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Viren sind defektiv,
das heißt,
sie sind nicht in der Lage, sich autonom in der Targetzelle zu replizieren.
Im Allgemeinen mangelt es also dem, im Rahmen der vorliegenden Erfindung
verwendeten Genom der defektiven Viren mindestens an den für die Replikation des
genannten Virus in der infizierten Zelle notwendigen Sequenzen.
Diese Regionen können
entweder (ganz oder teilweise) entfernt, oder unbrauchbar gemacht
werden, oder durch andere Sequenzen, und im Besondern durch das
eingefügte
Gen ersetzt werden. Bevorzugt bewahrt der defektive Virus dennoch
die Sequenzen seines Genoms, die für die Enkapsidation der Viruspartikel
notwendig sind.
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Die
im Rahmen der Erfindung verwendeten Viren können aus verschiedenen Adenovirusserotypen
erhalten werden. Es existieren verschiedene Adenovirusserotypen,
deren Struktur und Eigenschaften sich etwas unterscheiden. Unter
den Serotypen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt
die menschlichen Adenoviren vom Typ 2 oder 5 (Ad2 oder Ad5) oder
die Adenoviren tierischen Ursprungs verwendet (vgl. Patentanmeldung
WO94/26914). Unter den im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren
Adenoviren tierischen Ursprungs, können die Adenoviren zitiert
werden, die vom Hund, vom Rind, von der Maus, stammen, (Beispiel
Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), vom Schaf, vom Schwein,
von Geflügel
oder auch vom Affen stammen, (Beispiel: SAV). Der Adenovirus tierischen
Ursprungs ist bevorzugt ein Adenovirus vom Hund, besonders bevorzugt
ein Adenovirus CAV2 [zum Beispiel Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800)].
Im Rahmen der Erfindung werden bevorzugt Adenoviren vom Menschen
oder vom oder aus diesen gemischte verwendet.
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Die
im Rahmen der Erfindung verwendeten defektiven Adenoviren, umfassen
vorzugsweise ITR, eine Sequenz, die die Enkapsidation ermöglicht und
die interessierende Nukleinsäure.
Noch mehr bevorzugt im Genom der Adenoviren, die im Rahmen der Erfindung
verwendet werden, mindestens die Region E1 unbrauchbar. Das entsprechende
virale Gen kann unbrauchbar gemacht werden durch jede dem Fachmann
bekannte Technik, und im Besonderen durch Totalsuppression, Substitution,
partielle Deletion, oder die Addition einer oder mehrerer Basen
in das oder die entsprechenden Gene. Diese Modifikationen können in
vitro (auf der isolierten DNA) oder in situ erhalten werden, zum
Beispiel, mittels Gentechnologie oder auch durch Behandlung mittels
mutationsauslösender
Wirkfaktoren. Andere Regionen können
ebenfalls modifiziert werden, und im Besondern die Region E3 (WO95/02697),
E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) und L5
(WO95/02697). Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
des Einsatzes des im Rahmen der Erfindung verwendeten Adenovirus
umfasst eine Deletion in den Regionen E1 und E4. Gemäß einer
anderen bevorzugten Ausführungsform
umfasst e reine Deletion in der Region E1, in deren Höhe die Region
E4 und die Nukleinsäure
eingefügt
werden (Vgl.
FR94 13355 ).
Vorteilhafterweise richtet sich die Deletion in der Region E1 auf
die Nukleotide 454 bis 3328 (Fragment PvuII-BgIII) oder 382 bis
3446 (Fragment HinfII-Sau3A). Vorteilhafterweise umfasst die Deletion
in der Region E4 mindestens die Phasen ORF3 et ORF6.
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Die
interessierende Nukleinsäure
kann in verschiedene Regionen des Genoms des Adenovirus eingefügt werden.
Das Genom eines Adenovirus besteht aus einer linearen doppelsträngigen DNA
mit einer Länge
von etwa 36 kb. Es umfasst im Besonderen eine invertierte terminale
Wiederholungssequenz (ITR) an jedem Ende, eine Enkapsidationssequenz
(Psl), frühe
und späte
Gene (Vgl. 1). Die wichtigsten frühen Gene sind
in den Regionen E1, E2, E3 und E4 enthalten. Unter diesen sind die
Gene, die in der Region E1 enthalten sind, für die virale Propagation notwendig.
Die wichtigsten späten
Gene sind in den Regionen L1 bis L5 enthalten. Das Genom des Adenovirus
Ad5 wurden vollständig
sequenziert und ist in der Datenbank verfügbar (vgl. im Besonderen Genebank
M73260).
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Ebenso
wurden Teile bzw. die Gesamtheit der anderen adenoviralen Genome
(Ad2, Ad7, Ad12, etc.) ebenfalls sequenziert.
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Die
interessierende Nukleinsäure
wird bevorzugt in eine für
die Produktion des rekombinanten defektiven Virus nicht wesentliche
Region eingefügt.
Daher wird er bevorzugt in Höhe
der Region E1 eingefügt,
die im Virus defektiv und durch die Produktionslinie komplementiert
ist, in Höhe
der Region E3, die für
die Produktion der rekombinanten Viren nicht wesentlich ist (ihre
Inaktivierung darf nicht transkomplementiert werden), oder auch
in Höhe
der Region E4. Im letzten Fall ist es notwendig, bei der Produktion
die Funktionen E4 zu komplementieren, entweder durch Cotransfektion
mit einem Plasmid oder Virus Helper, oder mittels einer geeigneten
Linie. Es versteht sich, dass andere Orte verwendet werden können. Insbesondere
der Zugang zur Nukleotidsequenz des Genoms ermögliche es dem Fachmann, die
Regionen zu identifizieren, die es ermöglichen, die interessierende
Nukleinsäure
einzufügen.
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Die
im Rahmen der Erfindung verwendeten rekombinanten defektiven Adenoviren
können
mit der dem Fachmann bekannten Technik hergestellt werden (Levrero
et. al., Gene 101 (1991) 195,
EP
185 573 ; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Im Allgemeinen
werden die Adenoviren durch Transfektion der DNA des rekombinanten
Virus in einer geeigneten Enkapsidationszelllinie hergestellt. Es
kann sich um eine einfache Transfektion handeln, wenn eine Konstruktion
zur Verfügung
steht, die das gesamte Genom des rekombinanten Virus trägt, oder,
wie es häufiger
der Fall ist, um eine Cotransfektion mehrerer DNA-Fragmente, die
die verschiedenen Teile des rekombinanten viralen Genoms einbringen.
In diesem Fall umfasst der Vorgang eine oder mehrere homologe Rekombinationsschritte
zwischen den verschiedenen Konstruktionen in der Enkapsidationszelllinie,
um die DNA des rekombinanten Virus zu erzeugen. Die verschiedenen
für die
Produktion des Virus verwendeten Fragmente können auf verschiedene Arten
hergestellt werden. Die Technik, die zumeist verwendet wird, besteht
darin, die virale DNA zu isolieren, und sie dann in vitro mittels
herkömmlicher
Verfahren der Molekularbiologie (Digestion, Ligation usw.) zu modifizieren.
Die erhaltenen Konstruktionen werden dann gereinigt und für die Transfektion
der Enkapsidationslinien verwendet Eine andere Technik beruht auf
der Verwendung eine Plasmids, das einen Teil des Genoms des rekombinanten
Virus trägt,
das mit einem Virus cotransfektiert wird, der den fehlenden Teil
des Genoms einbringt. Eine andere Möglichkeit liegt in der Verwendung
von prokaryoten Plasmiden, um die viralen DNAs, die für die Transfektion
verwendbar sind, herzustellen (vgl. Bett et al., PNAS 91 (1994)
8802;
FR95 01632 ).
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Die
verwendete Zelllinie muss bevorzugt (i) durch die genannten Elemente
transformierbar sein, und (ii), die Sequenzen umfassen, die in der
Lage sind, den Teil des Genoms des defektiven Adenovirus zu komplementieren,
bevorzugt in integrierter Form, um Rekombinationsrisiken zu vermeiden.
Als Beispiel für
eine Linie ist die menschliche embryonale Nierenlinie 293 zu nennen
(Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die im Besonderen,
integriert in ihr Genom, die linke Seite des Genoms eines Adenovirus
Ad5 (12%) enthält,
oder Linien, die in der Lage sind, die Funktionen E1 und E4 zu komplementieren,
wie im Besonderen in den Patentanmeldungen Nr. WO 94/26914 und WO95/02697
beschreiben.
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Dann
werden die Adenoviren, die sich multipliziert haben, gemäß den herkömmlichen
Techniken der Molekularbiologie rückgewonnen und gereinigt.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls jede pharmazeutische
Verbindung, die einen oder mehrere rekombinante defektive Adenoviren
umfasst, wie oben beschrieben. Die pharmazeutischen Verbindungen
der Erfindung können
im Hinblick auf eine Administration auf oralem, parenteralem, intranasalem,
intravenösem,
intramuskulärem,
subkutanem, transkutanem, intratrachealem, intraperitonealem usw.
Weg formuliert werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls jede pharmazeutische Verbindung,
die durch einen rekombinanten Adenovirus infizierte Zellen umfasst,
wie oben beschrieben. Vorteilhafterweise umfasst die Verbindung
der Erfindung Antigene aufweisende Zellen (APC), die durch einen
rekombinanten defektiven Adenovirus infiziert sind, wie oben beschrieben.
Als besonderes Beispiel können
die Makrophagen oder die G-Lymphozyten genannt werden. Die Erfindung
betrifft auch eine Verbindung, die tumorantingenspezifische zytotoxische T-Zellen
(CTL) umfasst, hergestellt durch die Kultur von Vorläuferzellen
in Gegenwart von Antigene aufweisenden Zellen (APC), infiziert durch
einen rekombinanten defektiven Adenovirus, wie oben beschrieben.
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Bevorzugt
enthält
die pharmazeutische Verbindung der Erfindung pharmazeutisch annehmbare
Vehikel für
eine injizierbare Formulierung. Es kann sich insbesondere um salzhaltige
Lösungen
handeln (Mononatriumphosphat, Dinatriumphosphat, Natriumchlorid,
Kalium, Calcium oder Magnesium usw., oder Mischungen dieser Salze),
um sterile oder isotonische Lösungen
oder um trockene, im Besonderen lyophilisierte Verbindungen, die
gegebenenfalls durch die Addition von sterilisierten Wasser oder
physiologischer Kochsalzlösung, die
Bildung von injizierbaren Lösungen
ermöglichen.
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Die
für die
Injektion verwendeten Virus-Dosen können, abhängig von verschiedenen Parametern,
und im Besonderen abhängig
von der verwendeten Administrationsart, der betreffenden Krankheit,
des zu exprimierenden Gens, oder auch der angestrebten Behandlungsdauer,
angepasst werden. Ganz Allgemein werden die rekombinanten Adenoviren
gemäß der Erfindung
in Form von Dosen zwischen 104 und 1014 pfu, und bevorzugt zwischen 106 und 1010 pfu formuliert
und verabreicht. Der Begriff pfu (<<plaque forming unit>>) entspricht dem infektiösen Potential
einer Viruslösung
und wird festgelegt durch die Infektion einer geeigneten Zellkultur
und, im Allgemeinen nach 15 Tagen gemessen, wobei Anzahl der infizierten
Zellplaques gemessen wird. Die Techniken zur Bestimmung des pfu-Werts
einer viralen Lösung
sind in der Literatur gut dokumentiert.
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Gemäß dem betreffenden
Antigen können
die Adenoviren der Erfindung für
die Behandlung und die Vorbeugung von Krebsarten verwendet werden,
einschließlich
im Besonderen der menschlichen Tumore (für die Antigene Mage-1 bis Mage-12, Gage und Bage
und Rage) und der Sarkome (für
die Antigene Mage-1).
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Die
vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele umfassender
beschrieben, wobei diese der Erläuterung
dienen und nicht beschränkend
sind.
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Allgemeine Techniken des
Klonens und der Molekularbiologie.
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Die
herkömmlichen
Verfahren der Molekularbiologie, wie die Zentrifugierung von Plasmid-DNA
im Cäsiumchlorid-Ethidiumbromgradienten,
die Digestionen durch die Restriktionsenzyme, die Elektrophorese
auf Gel, die Transformation in E. coli, die Fällung der Nukleinsäuren usw.,
werden in der Literatur beschrieben (Maniatis et al., 1989).
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Die
Enzyme wurden von New England Biolabs (Beverly, MA) bereitgestellt.
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Für die Ligaturen
werden die DNA-Fragmente nach ihrer Größe auf Agarosegel von 0,8 bis
1,5% separiert, durch GeneClean (BIO101, LaJolla CA) gereinigt und
nachts bei 14°C
in einer Base Tris-HCl bei einem pH-Wert von 7,4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, in Gegenwart
von DNA-Ligase von Phage T4 inkubiert.
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Die
Amplifikation durch PCR, (Polymerase Chain Reaction) wurden ebenfalls
gemäß Maniatis
et al., 1989, mit den folgenden Spezifikationen durchgeführt:
- – Konzentration
in MgCl2 auf 8 mM gebracht.
- – Denaturierungstemperatur
95°C, Hybridisierungstemperatur
55°C, Verlängerungstemperatur
72°C. Dieser
Zyklus wurde 25 Mal in einem PE9600 Thermal cycler (Perkin Elmer,
Norwalk CO) wiederholt.
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Die
Oligonukleotide werden unter Verwendung der Phosphoramid-Chemie,
wobei β durch
eine Cyanoethylgruppe geschützt
wird, (Sinha et al., 1984, Giles 1985), mit dem automatischen DNA-Synthetisator,
Applied Biosystem, Modell 394, (Applied Biosystem, Foster City CA),
nach den Empfehlungen des Herstellers synthetisiert.
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Die
Sequenzierung wurde auf doppelsträngigen Matrizen mittels des
Kettenendenverfahrens unter Verwendung fluoreszierender Bausteine
hergestellt. Wir haben das Sequenzier-Kit Taq Dye Primer Kit von
Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) gemäß den Spezifikationen
des Herstellers verwendet.
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Beispiel 1: Konstruktion
eine rekombinanten defektiven Adenovirus, der für eine P1A-Antigenfragment
kodiert.
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Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten defektiven
Adenovirus gemäß der Erfindung,
der für
ein P1A-Antigen kodiert. Besonders bevorzugt trägt der Adenovirus die Sequenz
SEQ ID Nr. 3. Der konstruierte Adenovirus ist ein Adenovirus vom
Serotyp 5, der eine Deletion in den Regionen E1 und E3 besitzt,
wobei die interessierende Nukleinsäure in die Region E1 in Höhe der Deletion
eingefügt
ist.
-
Die
in Höhe
der Region E1 eingefügte
Nukleinsäure
umfasst besonders bevorzugt:
- – den Promoter
SRα. Der
Promoter SRα umfasst
den frühen
Replikationsursprung von SV40 und einen Teil der LTR von HTLV1 (der
der Domäne
R einem Teil von U5 entspricht), gefolgt von der Spleißstelle
16S von SV40 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
- – ein
Minigen P1A von 44 pb (SEQ ID Nr. 3).
- – die
Polyadenylierungsstelle des Virus SV40.
-
Diese
Nukleinsäure
wurde aus dem Plasmid pcD-SRα-P1A
extrahiert, das dem Plasmid pcD-SRα entspricht, in dem das Minigen
P1A an der Stelle EcoRI geklont wurde. Die erhaltene Einfügung wurde
dann in dem Plasmid pAd.RSV-βGal
(Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) geklont,
wobei es anstelle des Fragments, die LTR von RSV und das Gen LacZ
enthält.
-
Das
so erhaltene Plasmid pAd-SRα-P1A
wurde dann verwendet, um den rekombinanten Adenovirus herzustellen.
Zu diesem Zweck wurden die Zellen der Linie 293 cotransfiziert durch
5 μg des
Plasmids pAd-5Rα-P1A
und durch 5 μg
der DNA des Adenovirusmutanten dl 324 in Gegenwart von Calciumphosphat. Die
hergestellten rekombinanten Adenoviren wurden durch Reinigung auf
Plaque selektioniert. Nach der Isolierung wurde der rekombinante
Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert, was zu einem Kulturüberstand
führte,
der den nicht gereinigten rekombinanten Adenovirus in einem Wert
von etwa 1010 pfu/ml enthielt.
-
Die
Viruspartikel werden dann durch Zentrifugierung auf dem Cäsiumchloridgradienten
gemäß der bekannten
Techniken (vgl. im Besonderen Graham et al., Virology 52 (1973)
456) gereinigt. Die Analyse der viralen DNA durch Digestion mit
Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI zeigt die Gegenwart der Einfügung im
Genom. Der Adenovirus kann bei –80°C in 10%
Glycerol konserviert werden.
-
Beispiel 2: Konstruktion
eine rekombinanten defektiven Adenovirus, der für ein Antigenfragment Mage-1
kodiert.
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten defektiven
Adenovirus gemäß der Erfindung,
der für
ein Antigenfragment Mage-1 kodiert. Besonders bevorzugt trägt der Adenovirus
die Sequenz SEQ ID Nr. 1, die für
ein Fragment kodiert, das das antigene Monopeptid von Mage-1 trägt. Der
konstruierte Adenovirus ist ein Adenovirus vom Serotyp 5, der eine
Deletion in den Regionen E1 und E3 besitzt, wobei die interessierende
Nukleinsäure in
die Region E1 in Höhe
der Deletion eingefügt
ist.
-
Die
in Höhe
der Region E1 eingefügte
Nukleinsäure
umfasst besonders bevorzugt:
- – den Promoter
SRα. Der
Promoter SRα umfasst
den frühen
Replikationsursprung von SV40 und einen Teil der LTR von HTLV1 (der
der Domäne
R einem Teil von U5 entspricht), gefolgt von der Spleißstelle
16S von SV40 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
- – ein
Minigen MAGE-1 von 116 pb (SEQ ID Nr. 1). Dieses Fragment wurde
mittels PCR aus dem vollständigen
Mage-1-Gen erhalten. Es umfasst ein ATG an Position 15, einen Stop-Codon an Position
121 und einen Teil des Exon 3 des Mage-1-Gens. Es umfasst die Sequenz, die dem
Nonapeptid (27 pb) entspricht, das den zytotoxischen T-Lymphozyten
durch das Molekül
HLA.A1 präsentiert
wird.
- – die
Polyadenylierungsstelle des Virus SV40.
-
Diese
Nukleinsäure
wurde aus dem Plasmid pcD-SRα-MAGE-1
extrahiert, das dem Plasmid pcD-SRα entspricht, in dem das Minigen
Mage-1 an der Stelle EcoRI geklont wurde. Die erhaltene Einfügung wurde dann
in dem Plasmid pAd.RSV-βGal
(Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) geklont,
wobei es anstelle des Fragments, die LTR von RSV und das Gen LacZ
enthält.
-
Das
so erhaltene Plasmid pAd-SRα-MAGE-1
wurde dann verwendet, um den rekombinanten Adenovirus herzustellen.
Zu diesem Zweck wurden die Zellen der Linie 293 cotransfiziert durch
das Plasmid pAd-SRα-MAGE-1
und durch die DNA des Adenovirusmutanten dl 324 in Gegenwart von
Calciumphosphat. Die hergestellten rekombinanten Adenoviren wurden
durch Reinigung auf Plaque selektioniert. Nach der Isolierung wurde
der rekombinante Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert, was
zu einem Kulturüberstand
führte,
der den nicht gereinigten rekombinanten Adenovirus in einem Wert
von etwa 1010 pfu/ml enthielt.
-
Die
Viruspartikel werden dann durch Zentrifugierung auf dem Cäsiumchloridgradienten
gemäß der bekannten
Techniken (vgl. im Besonderen Graham et al., Virology 52 (1973)
456) gereinigt. Die Analyse der viralen DNA durch Digestion mit
Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI zeigt die Gegenwart der Einfügung im
Genom. Der Adenovirus kann bei –80°C in 10%
Glycerol konserviert werden.
-
Beispiel 3: Konstruktion
eine rekombinanten defektiven Adenovirus, der für ein Antigenfragment Mage-3
kodiert.
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion eines rekombinanten defektiven
Adenovirus gemäß der Erfindung,
der für
ein Mage-3-Antigen kodiert. Besonders bevorzugt trägt der Adenovirus
die Sequenz SEQ ID Nr. 2. Der konstruierte Adenovirus ist ein Adenovirus
vom Serotyp 5, der eine Deletion in den Regionen E1 und E3 besitzt,
wobei die interessierende Nukleinsäure in die Region E1 in Höhe der Deletion
eingefügt
ist.
-
Die
in Höhe
der Region E1 eingefügte
Nukleinsäure
umfasst besonders bevorzugt:
- – den Promoter
SRα. Der
Promoter SRα umfasst
den frühen
Replikationsursprung von SV40 und einen Teil der LTR von HTLV1 (der
der Domäne
R einem Teil von U5 entspricht), gefolgt von der Spleißstelle
16S von SV40 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
- – ein
Minigen MAGE-3 von 44 pb (SEQ ID Nr. 2). Dieses Fragment wurde mittels
PCR aus dem vollständigen
Mage-3-Gen erhalten. Es umfasst ein ATG an Position 12, einen Stop-Codon an Position
44 und die Sequenz, die dem Nonapeptid (27 pb) entspricht, die den
zytotoxischen T-Lymphozyten durch das Molekül HLA.A1 präsentiert wird.
- – die
Polyadenylierungsstelle des Virus SV40.
-
Diese
Nukleinsäure
wurde aus dem Plasmid pcD-SRα-MAGE-3
extrahiert, das dem Plasmid pcD-SRα entspricht, in dem das Minigen
Mage-3 an der Stelle EcoRI geklont wurde. Die erhaltene Einfügung wurde dann
in dem Plasmid pAd.RSV-βGal
anstelle des Fragments geklont, das die LTR von RSV und das Gene LacZ
enthält.
-
Das
so erhaltene Plasmid pAd-SRα-MAGE-3
wurde dann verwendet, um den rekombinanten Adenovirus herzustellen.
Zu diesem Zweck wurden die Zellen der Linie 293 cotransfiziert durch
das Plasmid pAd-SRα-MAGE-3
und durch die DNA des Adenovirusmutanten dl 324 in Gegenwart von
Calciumphosphat. Die hergestellten rekombinanten Adenoviren wurden
durch Reinigung auf Plaque selektioniert. Nach der Isolierung wurde
der rekombinante Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert, was
zu einem Kulturüberstand
führte,
der den nicht gereinigten rekombinanten Adenovirus in einem Wert
von etwa 1010 pfu/ml enthielt.
-
Die
Viruspartikel werden dann durch Zentrifugierung auf dem Cäsiumchloridgradienten
gemäß der bekannten
Techniken (vgl. im Besonderen Graham et al., Virology 52 (1973)
456) gereinigt. Die Analyse der viralen DNA durch Digestion mit
Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI zeigt die Gegenwart der Einfügung im
Genom. Der Adenovirus kann bei –80°C in 20%
Glycerol konserviert werden.
-
Beispiel 4: Funktionelle
Charakterisierung des Adenovirus der Erfindung
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die Viren gemäß der Erfindung in der Lage
sind, die Expression des interessierenden Gens zu induzieren, das
für ein
Protein kodiert, dessen Abbau zur Expression eines antigenen Peptids
an der Oberfläche
der Targetzellen führt.
-
Die
Expression des Minigens MAGE-1 und die Präsentation des Peptids wurden
auf den, durch Ad-Mage (4.1.) infizierten Zellen, sichtbar gemacht,
durch Bestimmung der spezifischen Lyse (4.2.) und Stimulierung der
Produktion von TNF (4.3.).
-
4.1. Zelllinien
-
Es
wurden folgende Zelllinien infiziert:
- – C1R.A1:
B-Lymphozyt-Linie transferiert durch EBV (Ref. Storkus, W. J., Howell,
D. N., Salter, R. D., Dawson, J. R., and Cresswell, P.: NK susceptibility
varies inversely with target cells class I HLA antigen expression.
J. Immunol. 138: 1675 – 1659,
1987) und transfeziert durch das Gen HLA.A1, das in dem Plasmid pHEBO
geklont wurde.
- – Gen
III β E–F–:
Menschliche Melanomzellen HLA.A1, die für den Verlust des Antigens
MAGE-1 (in den Tabellen 1 und 2 als Gerlach E bezeichnet) immunselektiert
wurden.
-
Diese
beiden Linien exprimieren also das Molekül HLA.A1, aber nicht das Antigen
MAGE-1.
-
4.2. Bestimmung der spezifischen
Lyse
-
Dieses
Beispiel beweist die Existenz einer spezifischen Lyse in den Zellen
durch einen Klon von antigenspezifischen CTL (Aussalzungstest mit
radioaktivem Chrom). Zu diesem Zweck wurden die unter 4.1. genannten
Zellen mit dem Adenovirus Ad-Mage1 (Beispiel 2) oder durch den Kontrolladenovirus
(Ad-βGal)
mit einer Infektionsmultiplizität
von 500 pfu/Zelle infiziert. Die infizierten Zellen wurden dann
mit Chrom 51 markiert, danach 4 Stunden lang mit 1000 Zellen/Mikrotiter
inkubiert, mit der spezifischen CTL (Klon 82:30) in unterschiedlichen
Effektorzellen/Targetzellen-Verhältnissen
(E/T). Danach wurde der Prozentwert der Lyse bestimmt. Die erhaltenen
Ergebnisse werden in Tabelle 1 präsentiert. Sie zeigen eindeutig,
dass die durch die Viren gemäß der Erfindung
infizierten Zellen eine Lyse-Sensibilität durch die spezifischen CTL
aufweisen, die deutlich höher
ist, als jene der mit dem Kontrolladenovirus infizierten Zellen.
Die Zellen weisen im Vergleich zu den direkt durch das Antigen Mage-1
transfizierten Zellen ebenfalls eine deutlich gesteigerte Sensibilität auf, was
die therapeutische Wirksamkeit der Vektoren der Erfindung beweist.
-
Diese
Ergebnisse zeigen also eindeutig, dass die Viren der Erfindung in
der Lage sind, den Zellen über die
spezifischen CTL eine hohe Lysesensibilität zu verleihen.
-
4.3. Stimulierung der
Produktion von TNF
-
In
diesem Beispiel wurde die Fähigkeit
der Zellen Gerl III β E–F–,
die Produktion von TNF durch den gleichen CTL-Klon zu stimulieren,
bewertet. Zu diesem Zweck wurden die Zellen Gerl III β E–F– mit
dem Adenovirus Ad-Mage1 (Beispiel 2) oder durch den Kontrolladenovirus
(Ad-βGal)
mit einer Infektionsmultiplizität von
50 bis 100 pfu/Zelle infiziert und dann mit dem CTL-Klon inkubiert.
Nach 24 Stunden wurde die in den Überständen vorhandene Menge an TNF
durch Bestimmung ihrer Zytotoxizität auf einer TNF-sensiblen Linie TNF
(Linie WEHI-164-13) gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zelle wurde mittels
eines kolorimetrischen Tests (MTT) gemessen. Die Ergebnisse werden
in optischer Dichte ausgedrückt
und dann in der TNF-Menge (pg/ml). Dieser Test wurde nicht an den
Zellen C1R.A1 durchgeführt,
da diese natürlich
TNF sekretieren. Die Kontrollzellen Gerlach E– sind
Melanomzellen die Mage-1 und HLA-A1 exprimieren.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 2 präsentiert. Sie zeigen eindeutig,
dass die mit den Viren gemäß der Erfindung
infizierten Zellen durch die CTL eine TNF-Produktion induzieren, was unzweideutig die
biologischen und therapeutischen Eigenschaften der Viren der Erfindung
bestätigt.
-
Beispiel 5: In-vivo-Aktivität der P1A-Viren
der Erfindung
-
Beispiel
4 hat gezeigt, dass, in vitro oder ex vivo, die mit einem Adenovirus
gemäß der Erfindung
infizierten Zellen in einem TNF-Test gut erkannt, und in einem Aussalzungstest
mit radioaktiven Chrom durch eine spezifische CTL lysiert werden.
-
Dieses
Beispiel beweist nun, dass die Adenoviren gemäß der Erfindung, in der Lage
sind, in vivo eine spezifische CTL-Antwort zu erzeugen. Insbesondere zeigt
dieses Beispiel dass 2 Injektionen in einem Abstand von einer Woche
von 109 Viralpartikeln (pfu) in die Mäuse DBA/2,
bei einem Teil von ihnen eine starke CTL-spezifische Antwort erzeugen.
-
Es
wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt. In der ersten Versuchsreihe
wurden die Viralpartikel zur Hälfte
in die Peritonealhöhle
und zur anderen Hälfte
unter die Haut administriert (an 4 Stellen). In der zweiten Versuchsreihe
wurden die Viralpartikel durch subkutante, intraperitoneale, intranasale
und intratracheale Injektionen administriert. Diese zwei Versuchreihen
wurden gemäß dem folgenden
Protokoll durchgeführt.
Die Mäuse
wurden 15 Tage nach der zweiten Serie von Adenovirusinjektionen
geopfert. Die Splenozyten dieser Mäuse wurden dann der Gegenwart
des Antigens P815A mittels der Zellen L1210A+ (syngenische Leukämie, transfiziert
mit dem Gen P1A des Mastozytoms P815) ausgesetzt
und 8 Tage lang bestrahlt. Am Ende dieser gemischten Tumor-Lymphozytenkultur
(MLTC), proliferierten die gegen das Antigen P815A gerichteten Lymphozyten
und differenzierten sich in Killer-T-Lymphozyten. Diese wurden dann
der Gegenwart von Markerzellen mit radioaktivem Chrom ausgesetzt.
Es handelt sich um P511-Zellen, eine Azaguanin-Variante, die gegenüber dem
Mastozytom der Maus P815, das das Antigen A trägt, und gegenüber Pl.204,
einer Variante des gleichen Mastozytoms, die das Antigen A verloren
hat, resistent ist. Letztere dient der Negativkontrolle. Um jede
Möglichkeit
einer nicht-spezifischen Reaktion auszuschalten, wurden die mit
dem radioaktiven Chrom markierten Targetzellen ebenfalls der Gegenwart
der syngenischen Zellen (L1210) ausgesetzt, die auf ihrer Oberfläche die
Antigene der stimulierenden Zellen in der MLTC tragen, mit Ausnahme
des Antigens A von P815.
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Die
aus der ersten Versuchsreihe erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt im Prozentwert
der spezifischen Lyse, werden in den Tabellen 3A und 3B präsentiert.
-
Die
aus der zweiten Versuchsreihe erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt im Prozentwert
der spezifischen Lyse, werden in den Tabellen 4A und 4B präsentiert.
-
In
beiden Fällen
zeigen die präsentierten
Ergebnisse, Maus für
Maus, die Lyse-Level proportional zum den Verhältnissen Effektor/Target (Mittel
der Duplikate). Es wurden unabhängig
von der Adenovirus-Injektionsstelle CTL erhalten (Tabelle 4A + B).
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Adenoviren der Erfindung, in
der Lage sind, in vivo eine Immunität Zellen zu erzeugen, die en
Tumorantigen tragen.
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Tabelle
4B 2.
Mäuse,
denen Adβgal
injiziert wurde
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