CN1520303B - 利用基于α病毒且靶向高亲和性层粘连蛋白受体的载体进行肿瘤治疗 - Google Patents

利用基于α病毒且靶向高亲和性层粘连蛋白受体的载体进行肿瘤治疗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用优先地靶向肿瘤细胞的载体***的方法和组合物。具体而言，本发明涉及基于甲病毒(优选基于辛德比斯病毒)的载体和基于非甲病毒的载体，它们对于高亲和性层粘连蛋白受体(HALR)具有优先的亲和性。这些载体有效地靶向肿瘤并且具有引起肿瘤坏死的能力。

Description

利用基于α病毒且靶向高亲和性层粘连蛋白受体的载体进行肿瘤治疗
根据35U.S.C.§119(e)的规定，本申请要求美国临时专利申请系列号60/279,051(2001年3月27日提交)和系列号60/311(2001年8月10日提交)的优先权，这些申请均整体并入本文中作参考。
本发明研究的一部分是由国家癌症协会通过专项拨款CA68498支持的，所以，美国政府在本发明中具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及癌症的病毒载体疗法，特别是相对于体内的正常细胞来说，可以一种特异性方式来诱导肿瘤细胞凋亡。
背景技术
癌症基因治疗在很大程度上受益于一种载体(vector)的提供，这种载体具有一种高效率的基因表达能力并且具有靶向肿瘤细胞的能力。已经开发了大量的转染***来传递异源基因进入体内肿瘤以研究癌症基因治疗，但是所有这些***都有局限性。例如，因为逆转录病毒载体可以介导稳定的基因传递，同时可能具有低的免疫原性，所以它们已经被用作基因传递；然而，它们的传递效率相对较低(见，例如，Di Ianni等J.Hematother.Stem.Cell Res.，1999，8：645-652；Morling等，Gene Ther.，1995，2：504-508；Lam等，Hum.Gene Ther.，1996，7：1415-1422；Kume等，Stem Cells，1999，17：226-232)，而且微生物系变异也是一个潜在的问题(见Thompson，Science，1992，257：1854)。另外，逆转录病毒载体(只有少数例外)易被人类血液中的血清组***解(见Miyao等，Hum Gene Ther，1997，8：1575-1583；Russell等，Hum Gene Ther，1995，6：635-641和Rother等，J Exp Med，1995，182：1345-55)。这一点很大程度地限制了它们在体内的应用。腺病毒载体似乎可以更有效地进行体内基因的传递，但是这些载体只能以一种局限性的方式应用，这是因为它们缺乏通过血流被传递的能力(见Duncan等，J GenVirol.，1978，40：45-61；Alemany等，J Gen Virol.，2000，81Pt11：2605-2609和Alemany等，Nat Biotechnol.，2000，18：723-727)，并且由于腺病毒蛋白的高免疫原性而可能会对病人造成毒性(见Ginsberg，Bulletin ofthe New York Acad.Med.，1996，73：53-58和Sparer等，J.Virol.，1997.71：2277-2284)。
尽管有上述这些进展，但是癌症仍旧是一个需要新的解决方案的主要的公共健康问题。目前，发展治疗载体的努力在于解决载体安全性和治疗基因表达有效性的问题。
α病毒载体的许多性质使它们成为其它正在开发的病毒衍生的基因传递***的所希望的替代选择，这些性质包括如下能力：(i)快速地设计表达构建物，(ii)生产高效价感染粒子原种，(iii)感染不***细胞，和(iv)获得高水平的表达(Strauss and Strauss，Microbiol.Rev.1994，58：491-562；Liljestr
Figure S02807228619960403D000021
m等，Biotechnology1991，9：1356-1361；Bredenbeek等，Semin.Virol.1992，3：297-310；Xiong等，Science1993，243：1188-1191)。缺陷型的辛德比斯病毒载体已经用来保护哺乳动物免受原生寄生虫，蠕虫寄生虫，体外寄生虫、真菌、细菌和病毒损害(PCT公开号WO94/17813)。
对于一种编码委内瑞拉马脑炎(VEE)的cDNA和制备减毒的外衣病毒的方法已有描述(美国专利号5,185,440)。缺陷型辛德比斯病毒载体已经通过将异源序列***到基因组的结构区域中制备得到了(美国专利号5,217,879)。另外，基于具有异源序列的新德比斯缺陷型干扰(DI)粒子的RNA载体也已有描述(美国专利号5,091,309)。α病毒，特别是塞姆利基森林病毒，被用于医疗中来传递编码外源性RNA的异源基因，例如，一种抗原的抗原决定部位或决定簇(PCT公开号WO95/27069和WO95/07994)。也已经公开了从一个α病毒碱基序列的下游异源序列的增强的表达载体(PCT公开号WO95/31565)。基于α病毒的载体也用于免疫蛋白产生或蛋白序列表达(PCT公开号WO92/10578)。一种用于α病毒载体的cDNA构建物可以被引入并在动物或人类细胞中转录(PCT公开号WO95/27044)。
辛德比斯病毒是α病毒属中的一员，自其发现以来从1953年开始在世界各地对其已经进行了广泛的研究(见Taylor等，Egypt.Med Assoc.，1953，36：489-494；Taylor等，Am.J.Trop.Med Hyg，1955，4：844-862和Shah等，Ind.J.Med.Res，1960，48：300-308)。像许多其它α病毒一样，辛德比斯病毒可以通过蚊向脊椎动物宿主传递。α病毒体由一种壳核组成，里面包裹着一脂质双层，在其上具有包膜蛋白。包膜蛋白是与宿主细胞受体结合的媒介，由此导致病毒体的胞吞作用。胞吞后，壳核(衣壳蛋白和染色体组病毒RNA的一种复合物)沉积入宿主细胞的细胞质。辛德比斯病毒基因组是一种11703n的单链49S RNA(Strauss等，1984，Virology，133：92-110)，在5’末端盖帽并在3’末端聚腺苷酰化。基因组RNA是(+)-义的并具传染性，在受感染的细胞中作为mRNA。基因组RNA的翻译产生了非结构蛋白，nsP1，nsP2，nsP3和nsP4，它们被生产作为聚蛋白并且是经过蛋白水解加工的。感染早期，非结构蛋白，可能与宿主一起利用基因组(+)-义RNA作为模板来生成一个全长的、互补(-)链RNA。(-)链是合成全长基因组RNA的模板。(-)链上的一个内部启动子被用于亚基因组的26S mRNA的转录，此mRNA和三分之一的基因组RNA的3’末端是共线性的。这一26S亚基因组mRNA被翻译来产生一种结构聚蛋白，它经历共翻译和翻译后裂解来生产结构蛋白：C(壳体)，E2和E1(包膜)。壳体蛋白C使基因组RNA包壳来形成壳核。这些与细胞表面结合病毒包膜蛋白的胞浆功能域相互作用，导致了壳核包裹入包含包膜蛋白的膜双层和病毒体后代从受感染细胞出芽。辛德比斯病毒感染已经显示在宿主细胞内诱导细胞凋亡(Levine等，Nature，1993，361；739-742；Jan AND GRIFFIN，J.Virol.，1999，73：10296-10302)。
虽然基于辛德比斯病毒的基因转导在体外已经有了很好的研究(见Straus等，Microbiol.Rev.，1994，58：491-562；Altman-Hamamdzic等，Gene Ther.，1997，4；815-822；Gwag等，Mole.Brain Research.，1998，63：53-61；Bredenbeek等，J Virol，1993，67；6439-6446；Liljestrom等，Biotechnology，1991，9：1356-1361；Piper等，Meth.Cell Biol.，1994，43：55-78和Grusby等，Proc Natl.Acad.Sci U S A.，1993，90：3913-3917)，并且有许多关于在体内辛德比斯病毒转移入中枢神经***的报道(Duncan等，J Gen Virol.，1978，40：45-61；Alemany等，J Gen Virol.，2000，81Pt11：2605-2609和Alemany等，Nat Biotechnol.，2000，18：723-727)和抗原呈递细胞(见Tsuji等，J Virol，1998，72：6907-6910；Hariharan等，J Virol，1998，72：950-958；Pugachev等，Virology，1995，212：587-594和Xiong等，Science，1989，243：1188-1191)的报告，但是在体内辛德比斯病毒***的应用很受限制。
然而，基于辛德比斯病毒的载体的应用的一个主要的缺点在于这些载体被认为缺乏有用的靶细胞特异性(在本发明之前)。对于哺乳动物细胞而言，至少一种辛德比斯病毒受体是一种先前被认为是高亲和性的层粘连蛋白受体(HALR)的蛋白，它的广分布和高保存性可能是病毒有广泛宿主范围的部分原因(Strauss and Strauss，1994，supra；Wang等，J.Virol.1992，66：4992-5001)。因此人们考虑希望能通过改变辛德比斯病毒载体的向性来达到向特定靶细胞类型的基因传递的特异性(见PCT公开号WO98/44132)。这种向性的改变暗示着需要内源性的病毒向性的消融和新向性的引入，例如，通过设计一个包括一个蛋白A的IgG结合域的嵌合的病毒包膜蛋白。
在成熟的辛德比斯病毒体内，一个(+)-义病毒基因组RNA和壳体蛋白C复合来形成被有两个整体膜糖蛋白的脂质双层包围的二十面体的壳核，E1和E2埋置在其中(Strauss and Strauss，1994，supra)。虽然E1和E2形成了一个作为一个单元起作用的异质二聚体，但是E2结构域似乎对于与细胞的结合尤其重要。能够中和病毒感染性的单克隆抗体(mAbs)通常是E2种特异性的，在E2中，而不是在E1中的突变通常与改变的宿主范围和毒性有关(Stanley等，J.Virol.1985，56：110-119；Olmsted等，Virology1986，148：245-254；Polo等，J.Virol.1988，62：2124：2133；Lustig等，J.Virol.，1988，62：2329-2336)。一种辛德比斯病毒突变体也被鉴别了出来，它包含一个在E2中的***部分并显示与哺乳动物细胞的缺陷型结合(Dubuisson等，J.Virol.1993，67：3363-3374)。
总而言之，在此领域仍需要有效的癌症治疗方法。特别是，此领域需要一种有效的治疗，它特异性地靶向并破坏肿瘤细胞而对于正常细胞没有重大的不利的后果。本发明满足了此领域的所有这些及其它需求。
发明概述
本发明提供了一种治疗患肿瘤的哺乳动物(例如人类)的新方法，与具有相同品系的正常细胞相比，此肿瘤表达较高水平的高亲和性层粘连蛋白受体(HALR)。本发明的方法包括向患此肿瘤的哺乳动物施用***有效量的一种载体以***，其中的载体同HALR具有一种优先的亲和性。优选地，此载体是一种基于病毒的载体。当在这里公开时，用在本发明方法中的优选的基于病毒的载体是一种基于α病毒的载体(例如，一种复制缺陷型基于α病毒的载体)，更优选地，一种复制缺陷型基于辛德比斯病毒的载体。
当在这里公开时，除了同HALR具有天然亲和性和天然细胞凋亡诱导功能的基于α-病毒的载体，本发明的载体可以从任何能被有效改造成与HALR具有一种优先的亲和性和具有抗肿瘤活性的粒子或病毒衍生而来。因此，在一个单独的实施方案中，本发明包括一种治疗患肿瘤的哺乳动物的方法，利用与HALR具有一种优先亲和性并编码一个抗肿瘤基因的载体。在这里公开时，这种抗肿瘤基因可以是***基因、细胞凋亡诱导基因、肿瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、肿瘤抑制因子效应基因、反义低聚核苷酸编码序列、核糖酶编码序列或免疫原性肽编码序列。在一种优选的实施方案中，这种抗肿瘤基因是一种细胞凋亡诱导基因或一种细胞因子编码基因。
在另一实施方案中，本发明提供了一种利用基于α病毒的载体治疗一种患肿瘤的哺乳动物(例如人类)的方法，其中载体没有被修饰来特异性地靶向肿瘤细胞。优选基于α病毒的载体是一种辛德比斯病毒载体，更优选是一种复制缺陷型基于辛德比斯病毒的载体。在这里公开时，基于α-病毒的载体可以被修饰来编码一种异源抗肿瘤基因。
本发明也包括一种利用被修饰为靶向一特定肿瘤的基于α病毒的载体来治疗患肿瘤哺乳动物的方法。因此，当在这里公开时，本发明方法中使用的载体可以被修饰来编码一种分子，此分子特异性地与肿瘤细胞中的配体相互作用。根据具体的实施方案，载体可以被改造来编码，例如，包含一个肿瘤特异性受体结合序列的嵌和的包膜蛋白，与肿瘤特异性结合位点有亲和性的肽模拟物，识别一种肿瘤特异性抗原的免疫球蛋白分子或它的片段，或可与抗病毒受体(例如，抗-HALR)抗体一同施用的蛋白A的IgG-结合域。
本发明的方法可以被用来治疗各种肿瘤和转移瘤，这一点在发明详述和实施例部分说明。在一特殊的实施方案中，本发明的方法被用来治疗实体瘤，特别是肝癌、黑素瘤、表皮样癌、胰腺癌、脑恶性肿瘤(例如成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、听觉神经瘤、少突神经胶质细胞瘤和脑脊膜瘤)、乳腺癌、肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢腺癌、结肠癌、***癌、膀胱癌和肾癌。
按照本发明，抗肿瘤载体优选地通过胃肠外途径施用给哺乳动物，例如，腹膜内给药。
本发明进一步提供了证据，即如果接受治疗的哺乳动物具有至少部分的免疫***功能，则此公开的***的方法(特别是用α病毒载体)是特别有效的。在一具体实施方案中，本发明提供了在功能性自然杀伤(NK)细胞的存在下利用基于辛德比斯病毒的载体的***的方法更有效的证据。
本发明还提供杀死肿瘤细胞的方法(体内或体外)，包括使肿瘤细胞和杀死肿瘤细胞有效量的载体接触，其中的载体与HALR具有优先的亲和性并且可以或可以不编码一种异源抗肿瘤基因。优选地，载体是一种复制缺陷型基于α病毒的载体，更优选地是一种复制缺陷型基于辛德比斯病毒的载体。
此外，本发明还有利地提供了治疗患肿瘤的哺乳动物用的药物组合物，包括一个载体和一种药学上可接受的媒介物(carrier)(为了便于区别，在本文中，将vector译作载体，而将carrier译作媒介物)或稀释剂，其中的载体具有同HALR优先的亲和性并能有效地杀死肿瘤，前提是，如果载体是一种基于α病毒的载体，它没有被修饰用来靶向一种肿瘤特异性细胞决定簇。这些药物组合物可被用来治疗与具有相同品系的正常细胞相比表征为提高的水平的HALR表达的各种肿瘤和转移瘤。在这里公开时，本发明的载体可以从与HALR无天然亲和性的粒子或病毒(如逆转录病毒或腺病毒)衍生得到，通过修饰它们的靶向分子使其包含辛德比斯病毒包膜蛋白的HALR结合域。可选择的，载体可以是一种基于α病毒的载体，更优选的是一种复制缺陷型辛德比斯病毒的载体，它具有天然靶向性，并且没有被修饰来靶向一个肿瘤特异性细胞决定簇。
本发明的药物组合物中使用的载体可以被修饰来包含一种异源抗肿瘤基因，例如但不限于***基因、细胞凋亡诱导基因、肿瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、肿瘤抑制因子效应基因、反义低聚核苷酸编码序列、核糖酶编码序列或免疫原性肽编码序列。在一个优选的实施方案中，这种抗肿瘤基因是一种细胞凋亡诱导基因或一种细胞因子编码基因。
本发明的组合物可以被用来治疗各种实体瘤，特别是肝癌、黑素瘤、表皮样癌、胰腺癌、脑恶性肿瘤(例如成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、听觉神经瘤、少突神经胶质细胞瘤和脑脊膜瘤)、乳腺癌、肺癌(例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢的恶性腺瘤、结肠癌、***癌、膀胱癌和肾癌。
在一个独立的实施方案中，本发明的组合物，特别是包含α病毒载体的组合物，如果施用给具有至少一种部分的免疫***功能的哺乳动物(例如通过胃肠外途径)会特别有效，优选包含功能性天然杀伤(NK)细胞的免疫***。
本发明达到了发明的这些和其它的目标，这一点在发明详述和实施例(包括附图)中会更详细地描述。
附图说明
图1.基于辛德比斯病毒表达和辅助载体的代表图示。SinRep/LacZ是一种基于辛德比斯病毒的表达载体，它包括包装信号、用于复制RNA转录物的非结构蛋白基因和LacZ基因。DH-BB是一个亲本的辅助质粒，它包括用来包装辛德比斯病毒基因组必需的结构蛋白(壳体、E3、E2、6K和E1)的基因。缩写词：PSG，辛德比斯病毒亚基因组启动子；C，壳体；NSP1-4，非结构蛋白基因1-4；POLY A，聚腺苷酸化信号。没有显示的是SinRep/Luc和SinRep/IL12载体，它们与SinRep/LacZ基本相似。SinRep/Luc包括一个编码萤火虫荧光酶基因(Luc)而不是LacZ的DNA片段(亚克隆至SinRep载体的Xba I位点)。SinRep/IL12包含鼠的IL12α-亚单位和β-亚单位基因(亚克隆至在Sph I位点下游的Mlu I位点和Stu I位点)和一个位于Sin Rep/LacZ原始亚基因组启动子下游的第二亚基因组启动子DNA。
发明详述
本发明有利地利用简单的α病毒载体和现有的抗肿瘤载体来进行有效的抗肿瘤治疗。本发明部分是基于这样一个意想不到的发现，即一种复制缺陷型α病毒载体是一种有效的抗癌治疗剂。因此，本发明提供一种利用一种基于α病毒的载体治疗患肿瘤哺乳动物(如人类)的方法，其中的载体没有被修饰去特异性地靶向肿瘤。优选地，基于α病毒的载体是一种基于辛德比斯病毒的载体，更优选地，是一种复制缺陷型基于辛德比斯病毒的载体。
特别地，本发明部分是基于这样一个对一种复制缺陷型辛德比斯病毒载体的观察，它其中的结构基因被删除并被例如与一种邻近编码序列5’末端的辛德比斯病毒亚基因组和一种在编码序列3’末端的多聚腺苷酸化信号操作性地相联系的一种异源报告基因(例如β-半乳糖苷酶或荧光素酶)所替代，它能够有效地在体内靶向肿瘤细胞。已经出乎意料地发现未被进行关于靶向的修饰的辛德比斯载体，显示与体外或体内生长的肿瘤细胞的高亲和性并且能够有效地诱导导致肿瘤衰退的它们的死亡，并使试验的患肿瘤的动物具有长的存活期(甚至在缺少任何异源抗肿瘤基因有效负荷的情况下)。
在这方面，本发明提供一种出乎意料地有效的利用病毒载体与标准基因治疗相违背的方法。在基因治疗中，载体是一种输送治疗基因的介质。在癌症基因治疗的情况下，治疗基因对肿瘤细胞产生不利影响。用于癌症基因治疗的典型治疗基因(“肿瘤治疗基因”)的例子包括但不限于，肿瘤抑制基因(如p53和RB)；抗致癌基因细胞内抗体(如抗-Ras和抗-Raf抗体)；一种能够酶促地将一种前药转化成对肿瘤细胞有毒的一种化合物的蛋白(如单纯疱疹病毒胸苷激酶[HSV-tk]，它与更昔洛韦形成一种毒素)；水痘带状疱疹病毒胸苷激酶[VZV-tk]，它与6-甲氧基嘌呤***糖苷形成一种毒素；或一种细菌的胞嘧啶脱氨酶，它与5-氟胞嘧啶形成一种毒素)；或一种能够提高抗肿瘤免疫性的免疫刺激蛋白(如FLT-3配体、GM-CSF、II-2、IL-7、IL-12和IL-13)。虽然本发明载体中的任何这种“肿瘤治疗基因”的存在都能够提高抗肿瘤作用(如通过比较一种编码一种标记基因[LacZ]的载体和一种编码一种细胞因子基因[IL12]的载体所示；见实施例1，下文)，但是在此公开时如果载体是一种天然凋亡的α病毒载体，则这种基因的存在对于获得治疗有效性不是必需的。因此，本发明的基于辛德比斯病毒的载体根本不需要携带任何异源编码序列。然而，在一个具体的实施方案中，本发明的用于治疗的活性辛德比斯病毒载体编码一种异源标记基因，如β-半乳糖苷酶、荧光素酶或潮霉素-EGFP。在另一个实施方案中，这些载体编码一种异源抗肿瘤治疗基因，例如一种细胞凋亡诱导基因或一种细胞因子编码基因。
本发明第一次利用一种α病毒(特别是辛德比斯病毒)对肿瘤细胞(特别是与具有相同品系的正常细胞相比表达更高水平高亲和性层粘连蛋白受体(HALRs)的肿瘤细胞)的天然亲和性。术语“高亲和性层粘连蛋白受体”即“HALR”具有本领域所知的普通含义，即可以作为辛德比斯病毒进入细胞的受体的Mr67,000层粘连蛋白受体(见Wang等，J.Virol.1992，66：4992-5001；Strauss等，Arch.Virol.Suppl.1994，9：473-84)。基于这一发现，很清楚的是修饰任何载体使其靶向HALR都在本发明的范围内。
因此，本发明提供治疗患肿瘤的哺乳动物(如人类)的方法，在该患者中，与相同品系的正常细胞相比，表达高水平高亲和性层粘连蛋白受体(HALR)。所述方法包括给予患肿瘤的哺乳动物***有效量的载体，其中所述载体优先亲合HALR。该载体衍生自被有效改性而对HALR具有优先亲合性并具有抗肿瘤活性的任何粒子或病毒。
尽管，不被任何具体的理论所限制，但是先前没有一同考虑的三项观察，可以说明本发明的基于辛德比斯载体治疗的显著的抗肿瘤效果的原因。第一，HALR可以作为辛德比斯病毒进入多数物种细胞的受体(Wang等，J.Virol.，1992，66：4992-5001；和Strauss等，Arch.Virol.Suppl.，1994，9：473-484)。第二，广泛认为HALR(Mr67,000)的表达在多种癌症中有显著地提高(Menard等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52：137-145)。实际上，在提高的Mr67,000HALR表达与多种癌症相关：乳腺癌(Menard等，1998，supra；Paolo Viacava等，J.Pathol.，1997，182：36-44；Martignone等，J.Natl.Cancer Inst.，1993，85：398-402)、甲状腺癌(Basolo等，Clin.CancerRes.，1996，2：1777-1780)、结肠癌(Sanjuan et al，J Pathol.，1996，179：376-380)、***癌(Menard S等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52：137-145)、胃癌(de Manzoni等，Jpn J Clin.Oncol.，1998，28：534-537)、胰腺癌(Pelosi et aL，J Pathol.，1997，183：62-69)、卵巢癌(Menard等，BreastCancer Res.Treat，1998，52：137-145和van den Brule等，Eur J Cancer，1996，32A：1598-1602.)、黑素细胞癌(Taraboletti等，J Natl.Cancer Inst.，1993，85：235-240)、肺癌(Menard等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52：137-145)、肝癌(Ozaki等，Gut，1998，43：837-842)、子宫内膜癌和子宫癌(van den Brule等，Hum Pathol，1996，27：1185-1191)。实际上，超过4000例的通过免疫组织化学研究的不同器官中不同肿瘤的数据表明都与HALR在侵入、转移和肿瘤生长中的作用相符(Menard等，Breast Cancer Res.Treat.，1998，52：137-145)。天然的血液生成的辛德比斯载体能够容易地在血液循环中移动，并是表达提高了的水平的HALR的生长和转移肿瘤的发源地。最后，众所周知辛德比斯病毒能使哺乳动物细胞更高程度的凋亡(Levine等，Nature1993，739-742；Jan等J Virol.，1999；10296-10302；Jan等J Virol.，20006425-6432)。细胞死亡在感染几小时后开始，事实上到48-96小时所有被感染细胞都死亡了(Sawai等，Mol Genet Metab.1999，67：36-42；Griffin等，Ann.Rev.，1997，Microbiol.51：565-592)。
虽然HALR参与以辛德比斯病毒介导的肿瘤细胞感染中的证据有些牵强，但是本发明的基于辛德比斯病毒的载体和其它基于α病毒的载体与其它肿瘤特异性细胞内决定簇(例如受体)相互作用却是可能的。换句话说，尽管公开的载体优先靶向表达增强水平的HALRs的肿瘤细胞，但这可能反映出细胞的一种特征，而不一定是载体感染细胞的机制。本发明包含任何这种涉及以α病毒介导的感染和肿瘤细胞细胞毒性的机制。
如上所述，如果需要的话，本发明的载体也可以携带一种或多种能够用来提高细胞毒性的基因的有效负荷。因此，本发明进一步涉及利用载体来传递抗肿瘤治疗基因。
重要的是，与肿瘤细胞相比，本发明的载体(特别是辛德比斯载体)，好像在体内不会感染正常细胞至相同的程度。这一点允许了在载体治疗中的不同的效应，例如，被辛德比斯载体感染产生肿瘤细胞死亡会导致肿瘤消失，但对于被治疗者的其它组织和器官没有明显的有害作用。这一现象可以通过此观察解释，即与正常细胞相对比肿瘤细胞中增高数量的HALR导致在肿瘤细胞上有高数量的暴露的即未占据的受体(Liotta，L.A.CancerResearch，1986，46：1-7；Aznavoorian等，1992，Molecular Aspects ofTumor Cell Invasion and Metastasis，pp.1368-1383)。例如，已经证明与良性损伤相比，乳腺癌和结肠癌组织包括更高数量的暴露的(未占据的)HALR受体(Liotta等，1985，Exp.Cell Res.，156：117-26；Barsky等，Breast CancerRes.Treat.，1984，4：181-188；Terranova等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80：444-448)。这些在正常细胞中未发现的、多余的未占据的HALR受体可以被用来与辛德比斯病毒结合感染和诱导细胞死亡。
公认具有未修饰的细胞特异性的复制缺陷型辛德比斯病毒载体具有内在的抗肿瘤活性，这允许利用辛德比斯载体的大量的其它的重要性质。因此，辛德比斯载体显示基因传递的极高的有效性。它们是(+)-链RNA病毒，通过一个在受感染的细胞的细胞质中的扩增过程，它可以在感染后的几个小时内表达每细胞105或更高活性的RNA种。RNA扩增的这一水平也允许传递的基因产品的非常高水平的表达，这将依次导致不是病毒的凋亡性质的延长的表达(Levine等，1993，Nature，361：739-742；Jan等，JVirol.，1999，73：10296-10302；Jan等，J Virol.，2000，74：6425-6432；Balachandran等，J.Virol.，2000，74：1513-1523)。基于在实验室中处理α病毒和其它虫媒病毒的推荐(The Subcommittee on Arbovirus LaboratorySafety of the American Committee on Arthropod-Borne Viruses，Am.J.Trop.Med.Hyg，1980，29：1359-1381)，辛德比斯被认为是相当安全的。大多数α病毒需要3级规范和防范和/或接种疫苗，然而辛德比斯只需要2级规范和防范，这归因于那些感染不致病或导致自我限制性疾病的病毒。这里举例说明的从辛德比斯衍生得到的复制缺陷型辛德比斯载体更安全，这是因为它们感染和复制引起病毒血或疾病的能力实际上是不存在的。感染和复制引起病毒血的能力只能通过重组获得，它能被缩小和监控。辛德比斯载体也避免了与染色体整合相关的潜在的并发症(Xiong等，Science，1989，243：1188-1191)。近来的方法中使设计新的能够非复制感染的辛德比斯载体更加容易并进一步提高了载体的安全性(Straus等，Microbiol.Rev.，1994，58：491-562，1994)。因为辛德比斯病毒是一种产自血液的病毒(Turrell，1988，CRC Press，Inc.Boca Raton，FL)并且可以穿过血脑屏障((Altman-Hamamdzic等，Gene Ther.，1997，4；815-822)，因此基于这种病毒的载体是少数可获得的能够在血流中移动至机体的各种细胞的载体之一。在这方面，它们具有优于许多其它载体的重要优点并且例如可以被用来治疗脑恶性肿瘤(例如成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、胶质神经瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、听觉神经瘤、少突神经胶质细胞瘤和脑脊膜瘤)。
除了“天然靶向”的基于α病毒的载体之外，本申请也公开了诱导肿瘤坏死的基于α病毒的载体，它携带更多特异性的肿瘤靶向分子，例如，包括一种肿瘤特异性受体结合序列的嵌合的包膜蛋白，与肿瘤特异性结合位点具有亲和性的肽模拟物，识别肿瘤特异性抗体的免疫球蛋白分子/片段或可与抗病毒受体(例如抗-HALR)抗体一同施用的蛋白A的IgG结合域。在一个具体实施方案中，本发明提供基于辛德比斯的载体，由于经修饰的嵌合的E2包膜蛋白的存在此载体特异性地靶向肿瘤细胞，例如包括五种高同源58氨基酸长蛋白A的Fc IgG结合域中的一种或多种，即域E、D、A、B、C或域Z，一种设计的B域的类似物，包括两个氨基酸替代Alal->Val和Gly29->Ala(见共同拥有的PCT公开号WO98/44132；Uhlen等，J.Biol.Chem.，1984，259：1695；Moks等，Eur.J.Biochem.，1986，156：637-43)。在另一个实施方案中，本发明提供了包括嵌合的包膜蛋白的基于辛德比斯病毒的载体，它被修饰成包括一个能够结合其它种类的在靶肿瘤细胞表面表达高水平的决定簇的区域(例如，EGF受体在许多癌症细胞上超表达或αyβ3整联蛋白在黑素瘤细胞上超表达，见Dmitriev等，J.Virol.，2000，6875-84；Bonnie等，Virol.，2000，269：717)，或可选择的，一个与在特异性癌细胞类型(例如，乳腺癌中的导管上皮细胞)上在一个相对较高的水平上表达的受体相互作用的区域。因此，在一个具体的实施方案，本发明提供包括通过α和β-hCG序列的***修饰的嵌合的E2包膜蛋白的基于辛德比斯病毒的载体(被本发明的发明人在Sawai和Meruelo公开，1998，Biochem.Biophys.Res.Com.，248：315-323)，并且具有选择性地感染和向绒膜癌细胞以及其它具有LH/CG受体的肿瘤细胞(但是不向缺乏这些受体的细胞)传递一种报告基因的能力。
与许多其他包含嵌合的靶向分子的病毒载体相反，本发明的包含嵌合的E2蛋白的基于α病毒的载体对于***到E2嵌合的蛋白中的异源靶向片段的特异性结构和/或尺寸是高度耐受的。这一性质似乎归因于E2和E1蛋白在细胞靶向和融合中功能角色的分离。特别的，已经建立了更广泛的试验表明E2蛋白主要与病毒和细胞表面受体的结合有关，然而病毒的侵入则主要与低pH值诱导在E1中的融合域的暴露，然后是和内体的膜融合、胞吞入披网格小泡并转移入核内体有关(Hoekstra等，Biosci Rep.，1989，9：273-305；Kielian and Helnius，pp.91-119，In S.Schlesinger and M.J.Schlesinger(ed.)，The Togaviridae and Flaviviridae.Plenum PublishingCorp.，New York，1986；Kielian等，J.Virol.，1990，64：4614-24；Marsh，Biochem J.，1984，218：1-10；Stegmann等，Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem.，1989，18：187-211；Helenius et aL，J.Cell Biol.，1980，84：404-20；Marsh等，Cell，1983，32：931-940)。
本发明的嵌合的包膜蛋白载体的肿瘤特异性靶包括但不限于任何肿瘤细胞特异性蛋白、肽、低聚核苷酸、脂类、多糖和小分子量配体。
最重要的是，本发明并不限于天然靶向的α病毒衍生的抗肿瘤载体。如在这里说明的那样，使用本领域公知的方法，本发明的载体可以从病毒衍生得到(例如逆转录病毒、腺病毒、与腺相关的病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、杆状病毒、***瘤病毒等等)或与HALR不具有天然亲和性的非病毒颗粒(例如脂质体、微球体、蛋白基体等)，通过修饰它们的靶向分子来包含辛德比斯病毒包膜蛋白的HALR结合域(优选的是E2的HALR结合域)，或识别HALR的免疫球蛋白片段，或可以与抗-HALR抗体一同施用的蛋白A的IgG结合域，或层粘连蛋白(或其中的HALR结合部分)。例如，在一个具体的实施方案中，发明提供一种抗肿瘤的基于腺病毒的载体，该载体中的编码壳体蛋白纤维的末端结的序列被删除以除去与CAR和其它腺病毒受体的天然结合性，而同时地***负责与HALR结合的序列(见，例如Alemany等，Nat.Biotechnol.，2000，18：723-727)。在另一个可选择的实施方案中，肿瘤特异性基于腺病毒的载体同一种重组生产的双特异性杂合衔接蛋白一同施用，此蛋白包括CAR蛋白氨基末端的细胞外域(见例如Dmitriev等，J.Virol.，2000，74：6875-84；Ebbinghaus等，J.Virol.，2001，75：480-489)和一个辛德比斯病毒E2的HALR结合域，或一个识别HALR的免疫球蛋白片段，或可以和抗-HALR抗体一同施用的蛋白A的IgG结合域。在另一个实施方案中，本发明相似地提供了基于逆转录病毒的抗肿瘤载体，由于用HALR结合域替代了env蛋白(例如在基于鼠的白血病逆转录病毒(MLV)的载体的env的N-末端区域)的受体结合域此载体已经改变了靶向性质(见e.g.，Ohno and Meruelo，Biochem.Mol.Med.，1997，62：123-127)。
总的来说，本发明有利地提供了一种治疗患肿瘤哺乳动物的方法，其中肿瘤细胞与具有相同品系的正常细胞相比表达更高水平的HALR。不同水平的HALR导致靶介导的传递，就是说本发明载体与肿瘤细胞优先结合。“更高水平”的表达在这里通常指被肿瘤细胞(与非肿瘤细胞相比)表达的水平和产生的这种优先的结合，例如至少高3倍的结合，优选至少高30倍结合，最优选的至少高300倍的结合。肿瘤细胞表达增高的水平可以用一个绝对尺度来评价，就是说，相对于任何其它所述的表达HALR的非肿瘤细胞，或以一种相对的尺度，就是说相对于与转化的癌细胞有相同品系的未转化的细胞的表达水平(例如，在黑素瘤情况下的黑素细胞，在肝癌情况下的肝细胞，在卵巢腺癌情况下的卵巢内皮细胞，在肾癌情况下的肾内皮细胞或肾上皮细胞)。
一般定义
术语“载体”，“克隆载体”，“表达载体”和“辅助载体”指这样的载体，即通过将一种DNA或RNA序列(例如一种外源基因)引入一种宿主细胞，以便促进表达(例如转录和/或翻译)引入的序列。载体包括质粒、噬菌体、病毒等。在关于本发明的病毒载体描述中使用的，“表达载体”最通常是一般被用作指一种能够感染宿主细胞的载体，然而术语“辅助载体”被用来指能够介导“表达基因”适当包装入病毒类颗粒的载体。
在此使用的术语“异源序列或基因”指一种核酸(RNA或DNA序列)，它没有被发现与特定分子的核酸序列(例如一种α病毒基因组)有天然的联系。相似的，术语“异源蛋白或肽”指一种没有天然存在于α病毒基因组中的编码的蛋白、肽和/或核酸序列。在本发明的含义内，一种包含在基于α病毒的载体中的异源基因典型地是一种非病毒的基因。然而，此术语也包括α病毒序列，此序列已经被用来引起核酸一级序列的变化(例如核酸缺失、替换和/或增加)和/或在天然的(例如自然发生)病毒分子上的定位的人工处理改变了。本发明优选的异源基因包括但不限于报告基因(例如β-半乳糖苷酶和荧光素酶基因)、抗肿瘤基因(例如***基因、细胞凋亡诱导基因、肿瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、肿瘤抑制因子效应基因、反义低聚核苷酸编码序列、核糖酶编码序列或免疫原性肽编码序列)和编码肿瘤靶向分子的基因(例如编码包含一种肿瘤特异性受体结合序列的嵌合的包膜蛋白的基因、编码与肿瘤特异性结合位点具有亲和性的肽模拟物的序列、编码识别肿瘤特异性抗原的免疫球蛋白分子/片段的基因，或编码可以和抗病毒的受体[如抗-HALR]抗体一起施用的蛋白A的IgG结合域的基因)。
在此使用的术语“感染的”，当用来描述一种基于α病毒的RNA分子时，是指一种自我复制并在宿主细胞中提供转录的RNA分子。术语“复制”，当与一种α病毒基因组RNA或一种重组的基于α病毒的载体RNA分子一同使用时，指利用(-)-链RNA作为模板产生(+)-链RNA全长等同物。
在此使用的术语“转染”被理解为包括任何例如但不限于吸附、微量注射、电穿孔、脂转染等将一种外源核酸分子引入一个宿主细胞的方法。术语“转染的”或“转化的”，当用来描述一种细胞时，指一种包括一个外源引入的核酸分子的细胞和/或一种遗传组成已经通过引入一种外源核酸分子改变的细胞。
在此使用的术语“优先的结合”或“优先的亲和性”指病毒载体与一种给定的细胞受体(例如HALR)相互作用的能力，由此导致表达这种受体的细胞的感染增加。接下来，本发明的载体与HALR受体具有优先的亲和力，将会特别有效地感染表达增加数量的HALR的肿瘤细胞。
在此使用的术语“肿瘤”指一种包括生长失控的转染细胞的一种恶性的组织。肿瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、浆细胞瘤和其它类似瘤；和实体瘤。本发明可以治疗的实体瘤的实例包括肉瘤和癌，例如但不限于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、***肉瘤、***内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、鳞状上皮细胞癌、基底细胞癌、表皮样癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆导管癌、绒膜癌、***瘤、胚胎性癌、维尔姆斯氏瘤、子***、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听觉神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和成视网膜细胞瘤。如上所述，本发明的方法依赖于治疗靶向的肿瘤细胞的HALR表达。
术语“肿瘤特异性细胞决定簇”或“肿瘤特异性靶”在这里被用来广义的定义一种肿瘤细胞表面的任何分子，此分子可以被本发明的载体用来选择性的或优先的靶向此细胞。本发明载体对应的肿瘤特异性细胞决定簇包括但不限于任何肿瘤细胞表面蛋白、肽、低聚核苷酸、脂类、多糖和一种小分子配体。本发明优选的肿瘤特异性细胞决定簇是肿瘤特异性细胞膜蛋白例如ErbB受体、Melan A[MART1]、gap100、酪氨酸酶、TRP-1/gp75和TRP-2(在黑素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱、头部、颈部和非小细胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在子***中)；粘蛋白[MUC-1](在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和***癌中)；***特异性抗原[PSA](在***癌中)；胚胎癌抗原[CEA](在结肠癌、乳腺癌和胃肠道癌中)、LH/CG受体(在绒膜癌中)和这种共有的肿瘤特异性抗原如MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1、2、8、CAGE-3到7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV和TRP2-INT2等。与相同品系的正常细胞相比在特定的肿瘤细胞表面被在较高的水平表达的HALR和其它决定簇(e.g.，EGF受体或αvβ3整联蛋白)也包括在术语“肿瘤特异性细胞决定簇”中。
在此使用的术语“哺乳动物”具有它普通的含义，并且特别地包括灵长类，更特别地包括人类。其它可以被治疗的患肿瘤的哺乳动物包括但不限于犬、猫、啮齿动物(racine、鼠科动物、狼等)、马、牛、绵羊、山羊和猪类。
术语“患者”在这里使用时指一种脊椎动物，优选一种哺乳动物(例如啮齿动物如鼠)。特别的，此术语指人类。
术语“约”或“大约”通常指对于测定的数值和方法的类型而言在一个可接受的误差范围内。例如，它可指在一个给定值或范围的20％内，更优选在10％内，最优选在5％内。可选择的，尤其在生物体系中，术语“约”指约在一个对数值(即数量级)内，优选在给定值的上下100％内(within afactor of two of a given value)。
术语“治疗”当用在这里时指缓解或减轻患者的疾病的至少一种症状。在本发明的含义内，术语“治疗”也可以指延长潜伏期，即一种疾病在感染和临床表现之间的时期。术语“保护”当用在这里时指适当的预防或治疗(或它们两者)一患者的疾病的发展或继续。在本发明的含义内，疾病是癌症。
短语“药学上可接受的”，当述及本发明的组合物使用时指这种组合物的分子实体和其它组份，当施用给人时它们是生理上可耐受且通常不产生不适当的反应。优选在这里使用时，术语“药学上可接受的”指联邦或国家政府的管理机构批准的，或列在美国药典中或其它公认的药典中的用于哺乳动物(更特别是人类)的。
术语“治疗有效的”应用于剂量或量时指一种化合物或药物组合物的量，当施用于需要此化合物或药物组合物的哺乳动物时，此量足够产生所需的活性。在当关于本发明的病毒载体描述中使用的术语“治疗有效量/剂量”指当施用于哺乳动物时，载体或包括载体的药物组合物足够产生有效的抗肿瘤反应的量/剂量。
术语“抗体”使用其最广的含义，并且具体不仅涵盖单独的天然抗体也涵盖单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)和具有多表位特异性的抗体组合物和抗体片段(例如Fab、F(ab＇)2、scFv和Fv)，只要它们具有所需的生物活性即可。
术语“先天免疫”或“天然免疫”指先天的免疫应答，它不被与抗原的在先接触所影响。先天的免疫的保护机制之二包括，天然杀伤(NK)细胞，它破坏微生物和特定的肿瘤细胞并攻击特定的病毒感染细胞，和炎性反应，它动用白细胞(如巨噬细胞和树枝状的细胞)来吞噬侵入者。
载体
本发明最优选的载体是基于α病毒的载体，特别是复制缺陷型天然靶向的基于辛德比斯病毒的载体，本发明在体外、体内和离体的其它优选的载体是病毒载体，例如逆转录病毒(包括慢病毒)、疱疹病毒、腺病毒、与腺相关的病毒、痘苗病毒、***状瘤病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、杆状病毒和其它具有或被修饰成有所需的细胞向性(就是说优先地与高亲和性层粘连蛋白受体(HALR)结合)的重组体病毒。
在现有技术中已知构建和利用病毒载体的方法(见，例如Miller andRosman，BioTechniques1992，7：980-990)。根据本发明，在本领域技术范围内可以应用传统的分子生物学，微生物学和重组DNA技术。这些技术是公知的并且在文献中已经说明的很充分。见如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆：实验室手册，第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(在此称＂Sambrook等，1989.＂)；DNA克隆：一种实践途径，卷I和II(D.N.Glover ed.1985)；低聚核苷酸合成(M.J.Gait ed.1984)；核酸杂交[B.D.Hames&S.J.Higginseds.(1985)]；转录和翻译[B.D.Hames&S.J.Higgins，eds.(1984)]；动物细胞培养[R.I.Freshney，ed.(1986)]；固定细胞和酶[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，分子克隆实验指南(1984)；F.M.Ausubel等(eds.)，分子生物学流行草案，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。
各种公司生产商用病毒载体，包括但不限于Avigen公司(Alameda，CA；AAV载体)，细胞Genesys(Foster City，CA；逆转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)，Clontech(逆转录病毒和杆状病毒载体)，Genovo公司.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV载体)，Genvec(腺病毒载体)，IntroGene(莱顿，荷兰；腺病毒载体)，分子医学(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)，Norgen(腺病毒载体)，牛津生物医学(牛津，英国；慢病毒载体)和转基因(斯特拉斯堡，法国；腺病毒、牛痘、逆转录病毒和慢病毒载体)。
优选地，本发明的病毒载体是复制缺陷型，就是说，它们不能在靶细胞中自主地复制。优选地，复制缺陷型病毒是一种极小的病毒，也就是它只保留了它的基因组的序列，此序列对于靶细胞识别和病毒基因组的壳体化是必需的。复制缺陷型病毒在引入一个细胞以后是不感染的。复制缺陷型病毒载体的使用允许在一个特定的，固定的区域施用给细胞，而不必担心载体是否会感染其它细胞。因此，一个具体的组织能被特定的靶向。除了复制缺陷型α病毒载体外，特定载体的实例包括但不限于缺陷型疱疹病毒载体(见例如Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.1991，2：320-330；专利公布RD371005A；PCT公开号WO94/21807和WO92/05263)，缺陷型腺病毒载体(见例如Stratford-Perricaudet等，J.Clin.Invest.1992，90：626-630；La Salle等，Science1993，259：988-990；PCT公开号WO94/26914，WO95/02697，WO94/28938，WO94/28152，WO94/12649，WO95/02697和WO96/22378)和缺陷型与腺有关的病毒载体(Samulski等，J.Virol.1987，61：3096-3101；Samulski等，J.Virol.1989，63：3822-3828；Lebkowski等，Mol.Cell.Biol.1988，8：3988-3996；PCT公开号WO91/18088和WO93/09239；美国专利号4,797,368和5,139,941；欧洲专利公开号EP488528)。
这一点在上面已说明，可以实施各种策略来将载体靶向到HALR，包括但不限于通过将一个HALR结合序列(例如一种辛德比斯病毒E2蛋白)引入病毒来做病毒载体的假型；通过修饰病毒的壳体或包膜蛋白来包括一个HALR结合序列；通过利用一个可以与载体和HALR结合的双特异的试剂；或利用这些途径的结合。
基于腺病毒的载体。腺病毒是真核DNA病毒，它可以被修饰成能有效地将本发明的一种核酸传递给多种类型的细胞。存在各种血清型的腺病毒。在这些血清型中，在本发明的范围内优先选择利用2型或5型人类腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒(见PCT公开号WO94/26914)。这些可以用在本发明范围内的动物来源腺病毒包括犬的、牛的、鼠的(例如Mavl[Beard等，Virology，1990，75：81])绵羊的、猪的、鸟的和猿源(例如SAV)的腺病毒。优选动物来源的腺病毒是一种犬的腺病毒，更优选的是一种CAV2腺病毒(例如曼哈顿或A26/61株[ATCC保藏号VR-800])。各种的复制缺陷型腺病毒和最小的腺病毒载体已有描述(PCT公开号WO94/26914、WO95/02697，WO94/28938，WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697、WO96/22378)。根据本发明的复制缺陷型重组腺病毒可以通过任何本领域技术人员已知的技术方法来制备(Levrero等，Gene，1991，101：195；EP公开号185573；Graham，EMBO J.，1984，3：2917；Graham等，J.Gen.Virol.，1977，36：59)。利用标准的分子生物学技术回收和纯化重组的腺病毒，这对于本领域普通技术人员来说是众所周知的。
基于与腺有关的病毒的载体。与腺有关的病毒(AAV)是具有相对较小的尺寸的DNA病毒，它能够通过一个稳定且位点特异性的方式整合入它们感染的细胞的基因组。它们能够感染广谱的细胞而对细胞生长、形态学和分化不产生任何诱导作用，并且它们似乎与人类病理学无关。AAV基因组已经被克隆，排序和表征。用来在体外和体内转移基因的由AAV衍生的载体的利用已有描述(见PCT公开号WO91/18088和WO93/09239；美国专利号4,797,368和5,139,941；EP公布号488528)。本发明的复制缺陷型重组AAV可以通过将一个包含目标核酸序列(此序列侧面与两个AAV反向末端重复(ITR)区域连接)的质粒和一个携带AAV壳体化基因(rep和cap基因)的质粒共转染入一个被一种人类辅助病毒(如一种腺病毒)感染的细胞系来制备。然后将生产的AAV重组体用标准技术纯化。
逆转录病毒载体。在另一实施方案中，本发明提供逆转录病毒载体，例如，在Mann等，Cell1983，33：153；美国专利号4,650,764，4,980,289，5,124,263和5,399,346；Markowitz等，J.Virol.1988，62：1120；EP公布号453242和178220；Bernstein等Genet.Eng.1985，7：235；McCormick，BioTechnology1985，3：689；和Kuo等，1993，Blood，82：845中描述的。逆转录病毒是整合病毒，它感染分化的细胞。逆转录病毒基因组包括两个LTR，一个壳体化的序列和三个编码区域(gag、pol和env)。复制缺陷型非感染的逆转录病毒载体***纵以破坏病毒包装信号，但是保留需要用来包装共引入病毒的结构基因，此病毒被设计包含异源基因和包装信号。因此，在重组的复制缺陷型逆转录病毒载体中，gag、pol和env基因通常被全部或部分的删除并且被一个目标异源核酸序列取代。这些载体可以从不同类型的逆转录病毒来构建，例如HIV(人免疫缺陷病毒)、MoMuLV(鼠莫洛尼白血病病毒)、MSV(鼠莫洛尼肉瘤病毒)、HaSV(哈维肉瘤病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(鲁斯氏肉瘤病毒)和弗罗德病毒。适合的包装细胞系已经在先前的技术中描述了，特别是，细胞系PA317(美国专利号4,861,719)；PsiCRIP细胞系(PCT公开号WO90/02806)和GP+envAm-12细胞系(PCT公开号WO89/07150)。另外，重组逆转录病毒载体可以包含在用来抑制转录活性的LTR的修饰和可能包含部分gag基因的广泛的壳体化序列(Bender等，J.Virol.1987，61：1639)。重组的逆转录病毒载体用本领域普通技术人员已知的标准方法来纯化。
逆转录病毒载体也能被DNA病毒引入，它允许逆转录病毒复制一个周期和放大转染效率(见PCT公开号WO95/22617，WO95/26411，WO96/39036，WO97/19182)。
在本发明的一个特别的实施方案中，慢病毒载体可以在许多组织类型中被用作直接传递和持续表达一种转基因的药物，组织类型包括脑、视网膜、肌肉、肝和血液。逆转录病毒载体的亚型可以有效地转导这些组织中的分化和不分化的细胞并且维持目标基因长期表达(综述可参见Naldini，Curr.Opin.Biotechnol.1998，9：457-63；Zufferey等，J.Virol.1998，72：9873-80)。慢病毒包装细胞系在本领域中是可获得的并普遍已知的。
非病毒载体。在另一实施方案中，本发明提供能被引入体内的非病毒载体，只要这些载体包括特异性地结合HALR的靶向的肽、蛋白、抗体等即可。例如，合成的阳离子脂类(能被用来制备在体内转染一个携带一种抗肿瘤治疗因子的载体的脂质体)的组合物在Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1987，84：7413-7417；Felgner and Ringold，Science1989，337：387-388；Mackey，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1988，85：8027-8031和Ulmer等，Science1993，259：1745-1748中已有描述。用来传递核酸的有用的脂类化合物和组合物已有描述，例如在PCT公开号WO95/18863和WO96/17823中和在美国专利号5,459,127中。靶向肽(例如，层粘连蛋白或HALR结合层粘连蛋白肽)和蛋白(例如抗-HALR抗体)或非肽分子可以和脂质体共价地(例如，将肽与磷脂或胆固醇接合，也见Mackey等，supra)或非共价地(例如经由一个膜结合域或部分***到双层膜中)偶合。
α病毒载体，特别是辛德比斯病毒载体
α病毒在本领域是众所周知的，其包括但不限于马脑炎病毒、塞姆利基森林病毒和相关的种属；辛德比斯病毒和重组体或未分组的种属(见Strauss and Strauss，Microbiol.Rev.1994，58：491-562，Table1，p.493)。
优选本发明的α病毒被作为一个复制缺陷型病毒来制备。当在这里使用时，术语“复制缺陷型病毒”具有它通常的含义，就是说由于它的基因组被修饰，所以此病毒是繁殖机能不全的。因此，一旦这种重组的病毒感染一个细胞，其结果只能是表达任何包括在它的基因组中的病毒和异源蛋白，并且在辛德比斯和其它α病毒的情况下，诱导细胞凋亡。在一个具体的实施方案下，本发明的复制缺陷型基于α病毒的载体包括编码非结构蛋白的基因并且对于RNA转录和基因表达是自给自足的。然而，这些载体缺乏编码结构蛋白的基因，因此一种辅助基因组是必需的以使它们被包装入传染的颗粒。除了提供治疗学上安全的载体，结构蛋白的移去增加了这些载体并入超过6kb的异源序列的能力。在另一实施方案中，本发明的繁殖机能不全的α病毒载体被间接地得到，例如通过移除包装信号，从而使结构蛋白被包装入从包装细胞系释放的病毒体。
因为辛德比斯病毒不会引起重大的健康危害，所以它也可以以繁殖机能不全的形式使用。换句话说，不像大部分病毒载体，使辛德比斯病毒载体有缺陷或复制机能不全不是必需的，虽然对于严格的安全原因来说这是优选的。因此，本发明既包括复制缺陷型又包括有繁殖能力的辛德比斯病毒载体。
如上所述，α病毒，特别是辛德比斯病毒载体，天然地可以诱导细胞凋亡，也叫作“程序性细胞死亡”。细胞凋亡是一种内在的细胞过程，它导致核的破坏、DNA消化和最终的细胞坏死和消融。本发明的有促使细胞凋亡潜力的载体可以利用在组织培养物中的细胞来试验(例如，任何在实施例1中讨论的宿主细胞，下文)。
各种用来制备本发明α病毒载体的方法都是本领域已知的。在基于辛德比斯病毒载体的情况下，一般而言，载体制备包括一种具有包含辛德比斯非结构基因的盖帽mRNA的包装细胞系以及，可选择的，一种在辛德比斯亚基因组启动子控制下的异源基因和一个表达辛德比斯结构基因的辅助质粒载体的共转染(见图1)。盖帽mRNA可以通过体外转录来生产。
各种细胞系可以被用作包装细胞。这些包括哺乳动物的细胞系例如CHO(中国仓鼠卵巢)、BHK(婴儿仓鼠肾脏)、HuH7(人类肝细胞癌)等。这些细胞系的一个缺点是辛德比斯病毒载体的生产诱导细胞凋亡，结果是在共转染后的几小时或几天内包装细胞破坏。因此，新的包装细胞必须在一个正在进行的(ongoing)基础上制备。另外，由哺乳动物细胞产生的基于辛德比斯病毒的载体似乎能有效地与带阴电荷的葡糖胺聚糖硫酸乙酰肝素相互作用导致增加的病毒清除和下降的感染性(见，如Byrnes and Griffin，2000，J.Virol.，74：644-651)。
为了避免这些问题，目前的发明人已经发展了一种从昆虫细胞衍生的辛德比斯病毒包装细胞系，优选C6/36蚊细胞(共同拥有悬而未决的PCT申请号PCT/US02/，[代理人内部参考号5986/2H995-WO0]，与此申请在同一日期提交，题目为“用作α病毒载体连续生产的包装细胞系”，基于美国临时专利申请序列号60/279,048，2001年3月27日提交，它们都特别在这里全文并入参考)。为了产生昆虫包装细胞系，本发明发明人已经稳定地将C6/36细胞用两个DNA载体进行了转化，一个编码用来复制病毒RNA的非结构基因nsp1-4，另一个(辅助)编码结构蛋白(壳体蛋白C、E1、E2、E3和6K)和包装信号。本发明的发明人出乎意料地发现，这些昆虫衍生的包装细胞基本上能抵抗辛德比斯载体的诱导细胞凋亡的性质并且能被设计来建立长期的产生载体的培养物，这些培养物产生始终如一的高病毒滴度。除了C6/36蚊细胞外，用在本发明中的其它昆虫细胞系的非限制实例包括u4.4细胞、High FiveTM细胞、施奈德氏果蝇细胞系2、Spodoptera frugiperda SF9细胞和C7-10细胞。
在各种情况下，通过本领域已知的任何技术，可以从包装细胞培养物上清液中收获包含复制缺陷型病毒基因组的α病毒、特别是辛德比斯病毒体，将其浓缩并纯化。这些技术包括但不限于离心和超速离心；在离子交换、分子排阻、疏水相互作用和亲水相互作用或其它类型柱上的色谱法；过滤和超滤；亲合纯化或本领域已知的各种其它技术。本发明的分离的病毒体可以保存在溶液中或优选冻干并以粉末形式保存。
抗肿瘤治疗基因
本发明的治疗载体可以携带一种抗肿瘤治疗基因，这一点在这里公开。特别是，因为本发明的α病毒载体，尤其是辛德比斯病毒载体能携带一种治疗基因有效负载，所以它们可以被修饰来包含任何如下所述的基因疗法。
在这里使用的术语“抗肿瘤基因治疗”指靶向一种肿瘤的基因治疗，这会引起肿瘤坏死、凋亡、生长调节，也就是肿瘤衰退或抑制。抗肿瘤基因治疗的实例包括但是决不限于一种***基因的引入、一种凋亡基因的引入、一种肿瘤抑制基因的引入和一种致癌基因拮抗基因的引入。优选的抗肿瘤基因由免疫刺激基因补充来增强免疫效应细胞(包括动员树状细胞)对肿瘤的募集和活化。
因此，“基因治疗”特别地指传递一种编码效应分子的基因进入细胞，在此情况下，进入肿瘤细胞。
***基因疗法。编码能够给予肿瘤细胞对化学治疗物质敏感性的酶的基因(***基因)的引入已经被证明是一种有效地抗肿瘤基因疗法。本发明提供了一种治疗癌症的方法，部分地通过引入一个基因载体，编码一个能够酶促地转化一种前药(一种无毒的化合物)成一种有毒的化合物的蛋白。在本发明的方法中，治疗用的核酸序列是一种编码一个产物的核酸，其中产物在它自己或其它药物的存在下引起细胞死亡。这种治疗用的核酸的一个有代表性的例子是一种编码单纯疱疹病毒(HSV-tk)的胸腺嘧啶核苷激酶的核酸。另外的例子是水痘带状疱疹病毒(UZV-tk)的胸腺嘧啶核苷激酶和细菌的基因胞嘧啶脱氨酶。
本发明方法中有用的前药是任何可以被转化为一种有毒的产品的物质，也就是对肿瘤细胞有毒的那些。这种前药的有代表性的例子是更昔洛韦，它在体内被HSV-tk转化成一种有毒的化合物(Chen等，Cancer Res.1996，56：3758-3762)。其它有代表性的前药的实例包括无环鸟苷，FIAU[1-(2-脱氧-2-氟-p-D-呋喃***糖基)-5-碘代尿嘧啶]，6-甲氧基嘌呤***糖苷(被VZV-tk转化)和5-氟胞嘧啶(通过胞嘧啶脱氨酶转化)。
前药，可以被具有本领域普通技术的医生容易地施用给患者。利用本领域已知的方法，这些医生也将能够决定施用前药的最合适的剂量和途径。例如，更昔洛韦优选地以约1-20mg/天/kg体重的剂量施用；阿昔洛韦以约1-100mg/天/kg体重的剂量施用，FIAU以约1-50mg/天/kg体重的剂量施用。
细胞凋亡诱导、抗致癌基因和肿瘤抑制基因疗法。在许多癌症类型中肿瘤的发生和恶化都与致癌基因(例如ras、myc)和肿瘤抑制基因(Rb、p53)的突变有关。许多途径正在追踪，利用包括单克隆单链抗体、反义低聚核苷酸、核糖酶、类似物和免疫原性肽的抗致癌基因和/或肿瘤抑制效应分子(Chen，Mol.Med.Today1997，3：160-167；Spitz，等，Anticancer Res.1996，16：3415-3422；Indolfi等，Nat.Med.1996，2：634-635；Kijima等，Pharmacol.Ther.1995，68：247-267；PCT公开号WO94/24297和WO97/16547；法国专利申请号FR08729)。这些分子特异性地抑制肿瘤生长和增加肿瘤细胞中细胞凋亡率。它们的作用机制需要抑制或抗致癌基因分子的持续存在以持续的应答，然而，它们还没有显示出会诱导肿瘤特异性免疫，它具有必须用来保护抵抗疾病的复发的记忆潜力。这些肿瘤生长特异性策略与免疫刺激疗法的结合将会在细胞衰退和诱导保护性免疫应答上产生协同作用。
免疫刺激疗法。本发明也提供免疫细胞刺激，例如一种树状细胞(DC)活动法，来产生一种强抗肿瘤免疫应答。术语“树状细胞(DC)动员剂”指一种活化DC机能活动的分子。一种众所周知的DC动员剂是flt-3配体(flt-3L)。基于抗肿瘤的免疫治疗功效能通过多种细胞因子的加入被增强。细胞因子例如IL-12放大抗原呈递和DC的免疫调制的能力并且抑制肿瘤血管发生，这一点能连续地诱导肿瘤的免疫敏感性。相反的，细胞因子例如IL-7在体内会诱导更强的T细胞应答和有效地逆转T细胞缺陷。当在这里公开时，其它细胞因子，例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-2、IL-3、IL-4、TNF-α和c-kit配体也能与DC动员剂结合使用。
这些细胞因子可以以可溶的或微粒包裹的蛋白形式施用或通过将基因引入病毒或非病毒载体(包括本发明的载体)来施用。这种细胞因子的全身传递和局部抗肿瘤基因疗法一起使用会增加这些细胞因子在肿瘤中的分布，这一点在T细胞缺陷的长期逆转和有效的肿瘤应答中可能需要。这些细胞因子，取决于施用的方式，会在用作有效的抗肿瘤免疫应答的免疫炎性反应中起关键的作用。
肿瘤生长抑制剂。在这里使用的术语“肿瘤生长抑制剂”指一种抑制肿瘤生长的蛋白，例如但不限于干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β和相似的细胞因子。可选择的，一种肿瘤生长抑制剂可以是一种肿瘤生长因子的拮抗剂。这种拮抗剂包括但不限于肿瘤生长因子(TGF)-β和IL-10拮抗剂。本发明包括全身地将肿瘤生长抑制蛋白给药或可选择地通过基因治疗。
抗血管发生因子。肿瘤血管发生是肿瘤生长的一个不可缺少的部分，并且多种的靶向来抑制血管发生的治疗剂作为癌症治疗剂正在开发中。抗血管发生治疗主要是逆转了肿瘤的生长/凋亡平衡和诱导休眠。一旦这些治疗剂给药被停止，血管发生能够重新开始，肿瘤生长继续进行。抗血管发生是一种强大的机制来特异地减少肿瘤的体积而不会在病人身上产生不利的副作用。由抗血管发生诱发的休眠治疗通过减少肿瘤、改变肿瘤微环境、消除免疫抑制作用和使肿瘤对免疫调节的清除更敏感而为其它治疗计划方案的成功铺平了道路。
“抗血管发生因子”是一种抑制血管发生的分子，特别地阻止内皮细胞迁移。这些因子包括但不限于抑制性的血管发生蛋白的片段(例如尿激酶的氨基末端片段[PCT公开号WO93/15199])；制管张素(O＇Reilly等，Cell1994，79：315-328)；内皮生长抑素；血管发生因子受体的可溶形式，例如尿激酶受体或FGF/VEGF受体(Wilhem等，FEBS Letters1994，337：131-134)；阻塞内皮细胞生长因子受体的分子(O＇Reilly等Cell1997，88：277-285；O＇Reilly，Nat.Med.1996，2：689-692)和Tie-1或Tie-2抑制剂。本发明包含全身地来施用抗血管发生因子或可选择的通过基因治疗。优选用在本发明中的抗血管发生因子是一种蛋白或多肽，其被包含在本发明载体中的一个基因编码。
载体治疗
如上所述，本发明的基于α病毒的载体，特别是基于辛德比斯病毒的载体可以被用来治疗各种癌症。本发明的基于非α病毒的载体也可以治疗各种其肿瘤细胞表达提高的HALR水平的癌症。
可以将如上所述得到的分离并优选纯化的病毒载体能配制进一个药物组合物中来施用给病人。在此使用的“药物组合物”包活性药物(即病毒载体)和一种药学上可接受的媒介物(carrier)、赋形剂或稀释剂。短语“药学上可接受的”指分子和组合物，当施用给人类时，该分子和组合物是生理上可耐受的并且一般不会产生过敏或相似的不适当的反应(例如胃肠不适眩晕等)。优选在此使用的术语“药学上可接受的”指由联邦或政府部门管理机构批准的或列在美国药典或其它公认的药典的那些可用于动物、更优选用于人身上的那些。术语“媒介物”指一种稀释剂、辅料、赋形剂或用于化合物给药的赋形剂。这些药物媒介物可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选采用水或盐水溶液以及葡萄糖和甘油溶液作媒介物，特别对于注射用溶液。适合的药物媒介物在E.W.Martin著的“Remington’sPharmaceutical Sciences”中有描述。
用于人类治疗时，病毒载体应依照食品药品监督管理局(FDA)制定的生产规范(GMP)标准来制备。质量保证(QA)和质量控制(QC)标准将包括测试病毒的复制能力(如果病毒载体是复制缺陷型)、活性(病毒颗粒的集落形成单位[CFU]，通过引起细胞凋亡或致细胞病变作用(CPE)来测试，或通过一种标记基因例如β-半乳糖苷酶的表达来测试)，毒性和其它标准指标。
为了***细胞，药物组合物可以以任何能够允许载体向肿瘤细胞自动导引的途径给药。优选以胃肠外途径给药，包括，但不限于静脉内、小动脉内、肌肉内、皮内、皮下、腹膜内和心室内给药。当在这里公开时，病毒载体也可以通过鼻内的或口服途径给予患肿瘤的动物(见Hardy，In：The Arbiviruses：Epidemiology and Ecology，Ch.4，pp.87-126)。然而，重要的是，与基因治疗中的其它病毒载体相比，施用本发明的HALR靶向的α病毒和非α病毒载体不必定位在肿瘤上。实际上，本发明优点中的一个即是载体对于癌细胞(甚至是对不能用标准技术定位或切除的微转移瘤)的高特异性和亲和性。
在本发明的疗法中，一种治疗学上有效量的载体被施予给一个病人。在此使用的术语“治疗有效量”指足够减少至少约15％、优选至少50％、更优选至少90％、最优选预防(宿主在临床上显著缺乏活性、功能和应答症状)的量。或者，治疗有效量为足以引起宿主临床有意义的状态的改善的量。具体而言，治疗有效量为引起一种或多种下述情况的量：肿瘤细胞凋亡；肿瘤细胞坏死；肿瘤转移的消除或预防；肿瘤生长速率的降低；肿瘤大小降低或肿瘤收缩；皮肤肿瘤疤的形成；肿瘤的消除；癌症的缓解；癌症复发时间的延长及病人存活期的延长。载体治疗的频率和剂量可以由普通临床医生利用标准剂量-反应技术来决定，但是通常在每天、每周、每两周或每月至少两次、并优选至少三次给药，每剂量106到1012病毒体。
结合疗法
疫苗：为了增加肿瘤抗原特异性免疫应答，可以在***中引入定义是与肿瘤相关的抗原(TAA)来特异性地增加抗原的水平。这些TAA能作为蛋白，肽或作为被本发明病毒载体编码的异源基因被引入。用这些抗原诱导的免疫会在DC动员和抗肿瘤基因治疗方案期间或其后出现。实质上，这一策略增强了特异性抗原的有效的免疫应答以及总的免疫应答。特异性免疫会导致免疫增强细胞因子的表达，它会促进对由肿瘤坏死因子释放的抗原的应答。这种免疫可以与免疫激活细胞因子(蛋白或基因)结合来进一步提高效果。
除了定义的基于抗原的疫苗，许多疫苗策略正在实验室和临床开发。一个在动物模型上充分研究的策略是利用细胞因子基因(例如，IL-2、GM-CSF、IL-12、IL-4)和一些关键的辅助刺激分子基因(例如B7.1、B7.2)来改变同体的或异体的肿瘤细胞。这些基因改变了的肿瘤疫苗证明了利用免疫的机制来破坏外周的耐受性和无反应性的概念(Clary等CancerGene Ther.1997，4：97-104；Gilboa，Semin.Oncol.1996，23：101-107)。其它相似的途径包括利用肿瘤溶胞产物，蛋白或RNA脉冲的DC和肿瘤细胞与DC融合来诱导一种有效的肿瘤免疫应答。所有这些途径由一个普遍的主题，就是将抗原的分子传递到DC来诱导这些抗原对T细胞的有效的处理和呈递。由于这些主题基于DC的提供，因此，预期DC动员会增加这些途径中观察到的效果。
化学治疗剂、辐射疗法和外科手术(肿瘤切除术)。虽然本发明的方法在抑制肿瘤生长和转移上是有效的，但是本发明的载体和方法最好与其它治疗形式一起使用，包括但不限于外科手术、辐射疗法、化学治疗和其它基因治疗。例如，本发明载体可以与一氧化氮抑制剂一同施用，这些抑制剂具有血管收缩的活性，因此可以减少血液流向肿瘤。在另一个实施方案中，本发明的载体可以和化学治疗剂一起施用，例如但不限于红豆杉醇、泰索帝和其它紫杉类(例如在美国专利号4,857,653；4,814,470；4,924，011；5,290,957；5,292,921；5,438,072；5,587,493；欧洲专利号0253738；和PCT公开号WO91/17976，WO93/00928，WO93/00929和WO96/01815中公开的)或其它化学治疗剂，例如顺铂(和其它铂嵌入化合物)、依托泊苷和依托泊苷磷酸酯、博莱霉素、丝裂霉素C、CCNU、阿霉素、柔红霉素、伊达比星、异环磷酰胺等。
实施例
下面的实施例说明了本发明，但是不限制本发明的范围。
实施例1：辛德比斯载体介导有效的抗肿瘤活性
材料和方法
细胞系。婴儿仓鼠肾脏(BHK-21，ATCC保藏号CCL-10)和卵巢癌(ES-2，ATCC保藏号CRL-1978)细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC，马纳萨斯，VA)处得到，并保存在补充有5％胎牛血清(FBS，GeminiBioproducts，Inc.，Calabasas，CA)的最低必需α-改良培养基(αMEM，JRH Bioscience，Lenexa，KS)中。一种人肝细胞癌细胞系HuH7从H.Yamamoto博士(Hyogo医学院，日本)处得到，并保存在补充有10％FBS的Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM，JRH生物科学，Lenexa，KS)中。HT29人类结直肠腺癌细胞(ATCC登记号HTB-38)从ATCC获得，并保存在补充有10％FBS的McCoy＇s5A培养基(Iwakata & Gracemodification，Mediatech，Inc，Herndon，VA)中。CFPAC-1胰癌细胞(ATCC保藏号CRL-1918)、SKOV-3卵巢腺癌细胞(ATCC保藏号HTB-77)和A431表皮样癌细胞(ATCC登记号CRL-2592)从ATCC得到并保存在补充有10％FBS的DMEM/低改良培养基中。A498肾癌细胞(ATCC登记号HTB-44)、HT1197膀胱癌细胞(ATCC登记号CRL-1473)和LS174T结肠癌细胞(ATCC保藏号CL-188)从ATCC得到并保存在补充有10％FBS含Earle＇s盐和L-谷氨酸盐的最低必需培养基Eagle(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中。所有上述基础培养基都补充有100μg/mL的青霉素-链霉素(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和0.5μg/ml两性霉素(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)。
载体。图1是衍生的辛德比斯病毒的表达和辅助载体的图示(也见Bredenbeek等，J.Virol.，1993，67：6439-6446，Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)。一种基于辛德比斯病毒表达载体的SinRep/LacZ编码病毒包装信号、复制DNA转录物所必需的非结构蛋白nsp1-4、用作亚基因组转录的病毒启动子和LacZ报告基因。一种辅助质粒DH-BB编码辛德比斯结构基因，即壳体(C)、E3、E2、6K和E1，它们是病毒包装所必需的。没有显示在图1中的还有在本实施例中使用的两个其它基于辛德比斯病毒的表达载体，SinRep/Luc和SinRep/IL12。为了构建SinRep/IL12载体，一种包括萤火虫荧光素酶基因(Luc)的DNA片段从pGL3质粒(Promega Co.，麦迪逊，WI)Nhe I位点和Xba I位点被切离出来并被亚克隆入SinRep载体(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)的Xba I位点。为了构建SinRep/IL12载体，一种包含两个亚基因组启动子(SinRep/2PSG)的辛德比斯载体首先是通过将第二亚基因组启动子DNA***到原始亚基因组启动子的多克隆位点(MCS)下游来构建。脱氧寡核苷酸包括PSG序列5＇-CGCGTAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAATAGTGCATG-3＇(SEQ ID NO：1)在连接到用MluI和Sph I消化的SinRep质粒之前被退火到它的互补序列5＇-CACTATTAGGACCACCGTCGAGATGCTTTA-3＇(SEQ ID NO：2)。鼠IL12α-亚单位基因(mP35，ATCC保藏号87596)和IL12β-亚单位基因(mP40，ATCC登记号87595)分别被亚克隆入SinRep/2PSG的MluI位点和Stu I位点(Sph I位点下游)，最终的构建物被命名为SinRep/IL12。
用于辛德比斯病毒生产的体外转录和转染。用于体外转录的质粒用QIAGEN质粒试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)来制备。将质粒DH-BB、SinRep/LacZ和SinRep/IL12利用XhoI限制性内切酶来线性化。因为Luc基因包括一个内在的Xho I位点，所以将质粒SinRep/Luc利用NotI限制性内切酶来线性化。线性化的质粒进一步用苯酚/氯仿抽提纯化，然后用乙醇沉淀。在体外，从SP6启动子开始，利用InvitroScript CapKit(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)或mESSAGE mMACHINETM高产量盖帽RNA转录试剂盒(Ambion Inc.，Austin，TX)来进行转录反应，从而生产大量盖帽mRNA转录物。在1％琼脂糖凝胶上检查mRNA的质量。对于共转染辅助DH-BB和SinRep/LacZ、SinRep/Luc或SinRep/IL12入BHK细胞，可采用前面所述的电穿孔法(Ohno等，Nature Biotechnol.，1997，15：763-767)。电穿孔细胞被转入10ml包含5％FBS的αMEM中并温育12小时。然后用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞并在10ml不含FBS的Opti-MEMI培养基(GIBCO-BRL)中温育。在24小时后，采集培养物上清液并将等分试样在-80℃储存。
感染测定和病毒定量。病毒上清液稀释液(300μl)被加入到在12孔板中的2×105细胞中。在室温下温育1小时，将细胞用PBS洗涤并在培养基中温育24小时。用X-gal染色来评价病毒感染：将被感染的细胞在包含0.5％戊二醛的PBS中固定20分钟，然后用PBS洗涤三次；然后将细胞用包含1mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-β-D-呋喃半乳糖苷，Fisher Scientific)、5mM高铁***、5mM亚铁***和1mM MgSO4的PBS在37℃染色3小时。病毒滴度以每毫升LacZ集落形成单位(CFU)表示。CFU依据细胞被X-gal染为蓝色的数目来定义。对于SinRep/IL12载体，相对的CFU用RT-PCR来决定，RT-PCR具有与辛德比斯基因组RNA：
5＇-AGCTTCCCGCAATTTGAGGT-3＇(序列识别号：3)、
5＇-ACGCATGGGGCAGACACAAT-3＇(序列识别号：4)有特异性的引物对。病毒RNA从300μl包括SinRep/LacZ(对照)或SinRep/IL12载体和1ml TRIzolTM试剂(GIBCO BRL)的Opti-MEM培养基来纯化。在用乙醇沉淀后，所有RNA样品在50μl不含核糖核酸酶的水中悬浮。利用PlatinumTM定量的RT-PCR ThermoScripTM一步***(GIBCO BRL)来进行RT-PCR。相对的CFU通过比较SinRep/LacZ RNA和SinRep/IL12RNA的系列稀释液的RT-PCR带强度来获得。然后，将RT-PCR结果与对SinRep/LacZ的X-gal染色分析结果相联系。SinRep/Luc载体的滴度通过用300μl含病毒的Opti-MEM系列稀释液感染BHK细胞在12孔板上分析。经过整晚的温育后，从各样品中得到的细胞溶胞产物的荧光酶活性用一种LUMI-ONE手提式荧光计(Bioscan，Inc.，华盛顿，DC)测定30秒。
辛德比斯感染性体外分析。为了评价辛德比斯病毒对仓鼠和人细胞的感染性，将300μl SinRep/LacZ或SinRep/Luc病毒与2×105BHK、HuH7、LS174T、ES-2、HT29、CFPAC-1、PC-3、HuH7、SKOV-3、A498、HT1197或A431细胞一起在12孔板中温育，MOI约为100。第二天，用X-gal染色法或Steady-GloTM荧光酶分析***(Promega Co.)来分析细胞。在Steady-GloTM荧光酶分析中，将细胞吸出，并加入200μl基础培养基和200μl Steady-GloTM试剂。在轻柔摇动下将细胞温育5分钟直到它们从板上分离下来。然后将细胞溶菌产物转移到12×47mm2比色皿中(PharMingen Co.)，利用一个LUMI-ONE手提式荧光计(Bioscan，Inc.，Washington，DC)测定每一个的荧光酶活性30秒。对每个细胞系，做2-4个独立的实验。
辛德比斯感染后细胞存活力分析。在第0天，将300μl包含约107SinRep/LacZ载体的培养基加入到2×105BHK、CFPAC-1、ES-2、HT29、LS174T或SKOV-3细胞中，并在12孔板中培养一个小时。将板用PBS冲洗，再加入1ml基础培养基并温育。在指定的天(第0天、1天、2天、3天、4天)，收集细胞培养基，留在板中的细胞用200μl1×胰蛋白酶EDTA(Mediatech，Inc.)进行胰蛋白酶化。将从培养基和板中获得的细胞合并，在600rcf(相对离心力)下离心5分钟。将细胞沉淀再悬浮于100μl PBS中，将10μl悬浮液转移到90μl台盼蓝溶液(Mediatech Inc.)中。用血细胞计数法来对10μl台盼蓝细胞混合物进行计数并利用下列公式来计算存活力：透明细胞/(透明细胞+蓝细胞)×100％。
动物模型和体内转染。所使用的所有具有严重结合免疫有缺陷(SCID)的小鼠(C.B-17-SCID或C.B-17-SCID/BG)都是从TACONIC(GERMANTOWN，NY)处获得的，并且在试验开始时都是6-8周龄。BHK和ES-2细胞都是作为皮下的肿瘤从5×106细胞的原始接种体生长起来的。在大约10天后，肿瘤达到至少1cm2的大小，治疗开始并指定为第1天。将患肿瘤的小鼠分成三个组：对照组(n＝5)，SinREP/LacZ组(n＝5)和SinREP/IL12组(n＝5)。将0.5CC包含107-108CFU的SinREP/LacZ载体或SinREP/IL13载体的OPTI-MEM皮下注射(I.P.)到各试验组中。对照组不进行治疗或注射PBS。每天测量肿瘤的尺寸并用公式计算：(长，cm)×(宽，cm)×(高，cm)。SinREP/IL12载体制剂在OPTI-MEM中含有高水平的MIL12(10ng/ml)。
至于人类肿瘤模型，4×106肿瘤细胞例如LS174T、HT29和CFPAC-1都在治疗前作为皮下肿瘤生长大约4周。将患肿瘤的小鼠分成对照组(未治疗)和实验组(每天用0.5cc包含107-108CFU病毒的SinNREP/LacZ治疗)。每天利用公式(长，cm)×(宽，cm)×(高，cm)计算肿瘤大小。LS174T试验和CFPAC-1试验在对照和试验组中都有4只小鼠，而HT29试验在对照和试验组中都有5只小鼠。
肝HuH7肿瘤用先前描述的方法建立(Kozlowski等，Cancer Res.，1984，44：3522-3529)。将SCID小鼠(6周龄；Taconic，Germantown，NY)被麻醉，并穿过皮肤和腹膜在左侧横腹部做一个横向的切口，露出脾：利用一个27.5规格的针(Becton Dickenson)通过脾门给小鼠门静脉注射在包括10％PBS的250μl DMEM中的2×106HuH7细胞。在肿瘤注射八个星期后，当肿瘤可触知时，通过i.p.给小鼠注射250μl辛德比斯载体一次或连续三天。对照组小鼠采用同样的方法注射Opti-MEM。在这项实验中，在最后一次注射后的第二天，将所有小鼠处死。
β-gal免疫染色。β-半乳糖苷酶蛋白(β-gal)的免疫组织化学的检测在***固定、石蜡包埋的组织上进行，采用标准链霉抗生物素辣根过氧化物酶复合物，利用3，3-二氨基联苯胺(DAB)作为一种发色原和一种自动化的免疫色料(NexES，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ检测)。并采用适当的阳性对照(用β-半乳糖苷酶转染的细胞系)和阴性对照。简要地，使转染的细胞系在合适的条件下生长到细胞密度约为106细胞/ml。轻轻压挤这些细胞并重新悬浮于少量的培养基中。向该悬浮液中加入等比例的纤维蛋白和凝血酶，形成一种纤维蛋白/凝血酶/细胞凝块，将其固定在10％中性缓冲的***中。肝/肿瘤标本被从动物中切离出来并固定在10％中性缓冲***中。细胞凝块和组织都在***中固定12小时并处理用来进行石蜡包埋。制备5μm厚的组织切片，放在静电电荷的玻璃载玻片上并在60℃烘烤过夜。玻片用二甲苯冲洗三次脱蜡，然后用梯度乙醇(100％、90％和70％)再水合。对于每一样品，一个玻片用苏木精和曙红染色，而其它的玻片通过用一种抗-β-半乳糖苷酶小鼠单克隆抗体(BIODESIGN，Kennebunk，ME)对细胞进行染色来进行β-gal检测，所述抗体以1∶50稀释温育过夜后使用。β-gal蛋白的细胞定位在胞浆。
β-gal分析。组织中β-gal蛋白的表达利用All-in-OneTMβ-gal分析试剂盒(PIERCE，Rockford，IL)来研究。利用使用B型研杵(30击)的玻璃Pyrex匀浆器使组织在3ml PBS中形成均匀分布的微粒。将搅匀的样品在1000rcf4℃离心10分钟。收集上清液，将沉淀部分再悬浮在2ml PBS中，收集等分试样，作为组织成分。将每份50μl的等分试样与50μlβ-gal分析试剂在一个96孔板的孔中混合。在37℃温育30分钟后，利用一个分光光度计在405nm处读取吸光度。每一蛋白浓度通过BIORAD试剂(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)来确定，每100μg蛋白校准结果。
数据统计分析。体外感染数据利用标准学生t检验来分析。从不同小鼠模型中获得的肿瘤大小数据，利用Macintosh使用GraphPad Prism3.0版的双因素重复测量方差分析法来分析。每一因素变化的显著性通过F比值来测定，F比值等于(特异性因素的均方)/(剩余均方)。F值以下列形式出现：F(因素df，残余df)，其决定F分布。P值是计算为正无穷大的F比值的特殊的F分布的积分。例如，测定如果SinRep/LacZ引起了显著的BHK肿瘤的减少，那么因素SinRep/LacZ的F比值是F(1，32)＝5.915，并且基于F(1，32)分布的P值是0.0208，它小于0.05。因此，SinRep/LacZ在BHK肿瘤上的效果被认为是显著的。另一方面，因为F(32，32)＝0.3712并且P＝0.9968，所以由不同的个体患者引起的效果是不显著的。
两因素之间相互作用的统计学分析也可以通过F比值来测定。如果从SinRep/LacZ和治疗时间得到的结果是相加的，那么在这两个因素之间没有相互作用。如下所公开的，比较未治疗动物和用SinRep/LacZ治疗的动物的肿瘤大小的缩减量，在SinRep/LacZ和治疗时间之间的交互作用是有显著性差异的(F(7，32)＝5.14，P＝0.0005)。相反，当将用SinRep/LacZ治疗的动物与用SinRep/IL12治疗的动物比较时，在病毒和治疗时间之间没有显著的交互作用(F(14，60)＝0.8290，P＝0.6303)，说明肿瘤消退的相同的动力学。
结果
辛德比斯载体在体外感染许多人肿瘤细胞系。基于辛德比斯病毒的载体SinRep/LacZ(图1)(它携带β-半乳糖苷酶(LacZ)基因)和SinRep/Luc(它携带萤火虫荧光酶(Luc)基因)，有效地感染大多数试验的人肿瘤细胞系：LS174T(结肠)、ES-2(卵巢的)、HT29(结肠)、CFPAC-1(胰腺的)、PC-3(***)、HuH7(肝)和SKOV-3(卵巢的)。SinRep/Luc也显示低、但却是显著的对A498(肾)和HT1197(膀胱)细胞(P<0.0001)的感染性，并且显示中等水平的对A431(表皮样癌)细胞(P<0.0001)的感染性。所有人细胞系都在约100MOI被感染并且在第二天分析在细胞溶胞产物中的标记酶(β-gal)活性，如材料和方法部分所述。上述人肿瘤细胞系的模拟感染导致非常低的约150的相对荧光单位(RLU)读数。
在肿瘤细胞感染后辛德比斯病毒诱导细胞死亡。由于病毒诱导的细胞凋亡，哺乳动物细胞的辛德比斯病毒感染先前已经被报道有极强的细胞毒性(LEVINE等，NATURE，361：739-742，1993；JAN AND GRIFFIN，J.VIROL.73：10296-10302，1999；JAN等，J.VIRIL.，74：6425-6432，2000；BALACHANDRAN等，J.VIROL.，74：1513-1523，2000)。为了确定对于肿瘤细胞的这一观察，本发明发明人在将不同肿瘤细胞系感染后，用台盼蓝排除分析试验了不同肿瘤细胞系的变化。在用约100MOI的辛德比斯载体SinRep/LacZ感染6种不同的肿瘤细胞系后，在一个5天周期(第0天-第4天)后快速细胞死亡发生。BHK细胞对于SinRep/LacZ诱导的细胞凋亡是非常敏感的，并且它们中的大多数在感染后两天死亡。在ES-2细胞上观察到了相似的结果。LS174T、CFPAC-1、HT29和SKOV-3细胞还需要两或三天才达到在BHK细胞上观察到的相同的细胞死亡水平。在对照试验中，所有细胞系都只在培养基中温育，没有显著的细胞死亡现像。
在体内辛德比斯载体显示抗肿瘤效应。为了评价辛德比斯载体的抗肿瘤效应，将5×106BHK细胞皮下接种到具有严重混合免疫缺陷型(SCID)的小鼠(8-10周龄)的右下腹部。BHK的选择基于它们对于辛德比斯病毒感染和辛德比斯诱导的细胞死亡的高易感性。在接种10天后，BHK肿瘤通常已长到1cm2大小。然后将小鼠分成试验和对照组。实验组接受携带β-半乳糖苷酶报告基因的约107SinRep/LacZ载体或携带两个编码鼠IL12亚单位(mP35和mP40)基因的SinRep/IL12载体的腹腔内(i.p.)注射，一周五次注射入左腹部(远离肿瘤的位点)，而对照组小鼠不接受治疗或被注射PBS。在治疗的第12天，将所有对照组小鼠处死，因为此时肿瘤负担已开始损害它们的行走能力和其它功能。相反，实验组中的小鼠在治疗的第6到7天开始显示肿瘤减小。重复测定的双向方差分析(RM双向方差分析)表明，辛德比斯载体显著地减小了BHK肿瘤尺寸。实际上，大多数BHK肿瘤小鼠在治疗30天后都变得没有肿瘤了。虽然SinRep/LacZ和SinRep/IL12具有抗肿瘤活性的相似的动力学，但是与SinRep/LacZ相比，SinRep/IL12对于BHK细胞具有更高的抗肿瘤活性(P＝0.0167)。
给另一组小鼠植入5×106BHK细胞，在7天后肿瘤长大至约5×5mm2。将患肿瘤的小鼠分为对照组(不治疗)和实验组(每天用SinRep/LacZ治疗)，在连续治疗三天后，制备对照组和试验组的肿瘤切片。用苏木精和曙红染色表明出现了两个显著不同的肿瘤组；一组中，大约90-95％的肿瘤坏死，而另一组大约30％的肿瘤坏死(分别相应于治疗的和未治疗的肿瘤)。治疗的肿瘤比未治疗的肿瘤小。血管供应用对因子VIII的免疫组织化学来证明。这些血管的尺寸为中等尺寸至小尺寸，并且在存活的肿瘤区域有小尺寸的血管。坏死的肿瘤细胞被曙红染色，并且失去了细胞组织和细胞膜。未***的坏死区域是集中的，然而，在被治疗的肿瘤中，大多数都是存活细胞的一个边的坏死。免疫组织化学β-半乳糖苷酶(β-gal)染色只在被治疗的动物和坏死区域获得。在活的肿瘤区域没有检测到β-gal。另外，β-gal-阳性染色的面积相应于因子VIII阳性染色的面积，证明辛德比斯病毒存在并通过血液通道被传送到肿瘤。此外，坏死和β-gal的分布表明，有活力的辛德比斯病毒只存在于被***的周围。在被治疗的肿瘤中，强烈但受限的通道(Tunnel)阳性信号在被***的有活力区和坏死区边缘被观察到。在对照肿瘤中，在对照肿瘤的有活力的-坏死边界上的凋亡信号不那么强烈，并且是更加弥散的。而且，大量的尖锐并清晰的凋亡体在被***的边界区域被观察到。在控制和***的中心坏死区域都没有观察到通道信号。
SinRep/IL12载体的注射也导致了在SCID小鼠上BHK肿瘤的减小(P＝0.0167)。
也皮下接种人肿瘤细胞LS174T(结肠)、HT29(结肠)和CFPAC-1(胰腺)，并在治疗前使其生长到一定的尺寸。用SinRep/LacZ对实验组进行治疗，一周五次，对照组不接受治疗或注射PBS。在具有BHK肿瘤的实验中，在SCID小鼠中治疗引起了显著的LS174T和CFPAC-1肿瘤减小(P<0.0001)。治疗约两周后，辛德比斯载体在LS174T和CFPAC-1肿瘤中引起显著的肿瘤生长抑制，并且许多无肿瘤的小鼠也对治疗产生相应。SinRep/LacZ的抗肿瘤活性虽然较低但仍是非常有显著性的(P<0.0001)。基于RM双向方差分析，所有人类肿瘤模型表明在不同的个体患者之间没有显著性差异。
辛德比斯病毒能够靶向SCID小鼠肝中的HuH7肿瘤。HuH7肝肿瘤通过穿过脾门的门静脉植入肝细胞癌HuH7细胞(2×106)来诱导。在大约8个星期后，肿瘤已明显可触及，对小鼠i.p.注射(1或3次)SinRep/LacZ载体。用SinRep/LacZ载体治疗患肿瘤的小鼠一次或连续三天，在最后一次注射后的第二天，将小鼠处死。在正常肝组织和未感染的对照部分的肿瘤中没有发现β-gal阳性细胞。在只用辛德比斯载体感染了一次的肝肿瘤中也没有清晰地检测到β-gal。然而，在连续三天感染的肝肿瘤中很容易检测到。在用SinRep/LacZ注射三次的肿瘤中，也可以观察到坏死。
在另一个实验中，在一次或三次治疗后，对β-gal蛋白在各种组织中的表达进行定量。与前面的实验相同，在一次感染小鼠和对照小鼠的肿瘤细胞之间没有显著的差异，但是接受三次治疗的小鼠比对照组小鼠的肿瘤细胞上清液中显示12到18倍高的β-gal水平，比组织样品显示19到38倍高的水平。无论动物是接受了一次还是三次辛德比斯载体注射，在肝、心脏、肺、肾和睾丸中β-gal的活性均没有显著地升高。在被注射小鼠的脑中观察到了低但却显著的β-gal水平。尽管对脑细胞具有感染性，但是所有接受了一次和三次SinRep/LacZ注射的小鼠都能保持健康并且没有异常行为。
NK细胞提高辛德比斯载体的抗肿瘤效应。在C.B-17-SCID小鼠和C.B-17-SCID/bg小鼠中诱导皮下BHK肿瘤。C.B-17-SCID/bg同C.B-17-SCID类似，仅是除了缺乏T和B细胞之外，还包括beige(bg)常染色体隐性突变，它产生削弱的巨噬细胞趋向性和活动性，并且缺乏天然杀伤(NK)细胞。与SCID/bg相比，在SCID小鼠中用辛德比斯载体进行的每天治疗似乎更有效(P>0.0001)。因此，只在SCID小鼠中获得了肿瘤的完全退化。
讨论
在这里公开的结果表明，基于辛德比斯病毒的复制缺陷型载体(即SinRep/LacZ、SinRep/Luc和SinRep/IL12)能够在体外和体内感染广谱的人肿瘤细胞。如在本实施例中公开的那样，辛德比斯载体不但在体外在各种哺乳动物肿瘤细胞系中而且在体内在人或啮齿动物源的移入的肿瘤中均可以诱导凋亡。因此，即使不加入任何外源性基因，基于辛德比斯病毒的载体本身也能够作为抗恶性肿瘤的治疗剂。
的确，在本研究中，引入辛德比斯载体在体内产生了BHK肿瘤细胞的高度凋亡和坏死并伴随着肿瘤的完全衰退。用辛德比斯载体进行多次注射(从三次到超过十五次)治疗，对实验动物没有显现出毒性，这表明这些载体介导肿瘤细胞的选择性感染。实际上，在心脏、肺、正常肝脏细胞和肾中没有观察到显著的感染。虽然能探测到很少量的脑感染，但是在成年(6-8周龄)实验小鼠中没有引起可观察到的临床CNS紊乱，已知它们能抵抗辛德比斯病毒诱导的神经毒性作用(Griffin，J.Infect.Dis.，133：456-464，1976)。
当在这里进一步公开时，在经用SinRep/LacZ载体三次注射进行治疗后对BHK肿瘤进行免疫染色证明，在肿瘤***出现广泛的坏死区域。这与由缺氧和营养不良引起的在肿瘤中心看到的典型坏死相反，由缺氧和营养不良引起的在肿瘤中心看到的典型坏死可以容易地在未治疗小鼠中看到。进一步，在肿瘤中感染载体和血管的共定位证明，辛德比斯病毒的由血液而生的特征在载体运输中起了很重要的作用。
载体在血液中的清除率是另一个重要的因素，它决定了由载体介导的肿瘤靶向的成功。最广泛使用的病毒载体，即逆转录病毒载体和腺病毒载体在血流中是不稳定的(Miyao等，Hum.Gene Ther.，8：1575-1583，1997；Russell等，Hum.Gene Ther.，6：635-641，1995，Rother等，J.Exp.Med.，182：1345-1355，1995；Alemany等，J.Gen.Virol.，81：2605-2609，2000)。相反，由血液产生的α病毒，包括辛德比斯病毒和基于辛德比斯病毒的载体，在血流中是稳定的(Byrnes and Griffin，J.Virol.，74：644-65l，2000；Bernard等，Virology，276：93-103，2000；Klimstra等，J.Virol.，72：7357-7366，1998)。
尽管体外辛德比斯在各种细胞系中诱导的感染性和细胞毒性是相似的，但是在体内观察到了抗肿瘤活性的差异。这些差异可能由肿瘤组织中血管数目和透过性的不同、HALR的水平不同和/或对病毒具有特异性的另外的肿瘤受体的存在所导致。
如下公开的体内试验结果表明，除了辛德比斯感染诱导的肿瘤细胞的直接杀死外，宿主的免疫***、特别是天然杀伤(NK)细胞(对于先天的免疫是很重要的)对于肿瘤消除也有贡献。实际上，NK细胞对于肿瘤(Gumperzand Parham，Nature，378：245-248，1995；Trinchieri，Adv.Immunol.，47：187-376，1989)和被病毒感染的细胞(Biron等，Annu.Rev.Immunol.，17：189-220，1999)的细胞毒性是众所周知的。有人还认为，当宿主抗病毒机制被激活时，可以发出信号，例如干扰素，它导致NK细胞激活(Biron等，1999，supra)。NK细胞激活也可能由肿瘤细胞坏死导致的炎症和细胞内容物的释放激活。已经表明，IL12为一种潜在的NK细胞刺激因子，并且表明，施用IL12能产生对抗某些实体瘤的强有力的抗肿瘤和抗转移的活性(Biron等，1999，supra；Brunda等，J.Exp.Med.178：1223-1230，1993；Nastala等，J.Immunol.，153：1697-1706，1994；Takeda等，J.Immunol.，156：3366-3373，1996；Tsung等，J.Immunol.，158：3359-3365，1997)。当在这里公开时，与不编码IL12的辛德比斯载体(SinRep/LacZ)相比，编码IL12的重组辛德比斯载体(SinRep/IL12)具有提高的抗肿瘤细胞毒性。因为本发明的辛德比斯载体在一个很高的水平上表达外源基因，所以其他抗肿瘤治疗基因例如肿瘤抑制基因、细胞毒素和细胞因子基因可能是增加辛德比斯载体的抗肿瘤效力的理想候补物质。
上述在体内实验中使用的SCID小鼠(它缺乏B和T细胞)不能确切地证明是细胞毒性T细胞和中和抗体是增加还是降低本发明的辛德比斯载体的抗肿瘤活性。然而，即使这些免疫细胞具有负面的影响，这些影响还是可以被容易地减少。例如，先前报道的成功用基于α病毒载体的连续接种表明，载体注射后引出的中和抗体的水平可以被合适的载体设计减少(Kamrud等，Virology，263：209-219，1999；Pushko等，Virology，239：389-401，1997；Pushko等，Virology，239：389-401，1997)。
证明基于辛德比斯病毒的载体可以天然靶向肿瘤(可能利用了在肿瘤与正常细胞中存在的HALR表达的天然差异)。除了辛德比斯载体这一天然的优点外，靶向的辛德比斯载体还可以识别细胞型或肿瘤特异性细胞表面分子，它保留了高感染性和滴度，也已由本发明人开发(见例如Ohno等，Nat.Biotechnol.，15：763-767，1997)，并且可能允许体内靶向的进一步提高。上面提供的实验数据表明，无论是单独还是结合其他治疗形式，辛德比斯载体均是有效的癌症基因治疗的新工具。
实施例2：利用辛德比斯载体来治疗人类肿瘤
复制缺陷型基于辛德比斯病毒的载体SinRep/LacZ和SinRep/IL12按照实施例1的描述来制备并对患有晚期(转移性)黑素瘤或晚期(转移性)肾、脑、结肠、***、膀胱、肺或卵巢癌的病人静脉内给药(约500μl载体制剂，107CFU/ml)。治疗每周进行5次，持续三周或更多星期。肿瘤的尺寸通过MRI和CAT扫描持续不断的监测，然后进行肿瘤坏死的组织学分析和肿瘤细胞转移行为的活组织检查(当可能的时候)。
                 ＊             ＊                ＊
本发明不限于在这里描述的具体的实施方案的范围。实际上，除了在这里描述的，从前述的说明和附图中，各种关于本发明的修改对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些修改也包括在权利要求范围内。
还可以理解，所有碱基对的大小和氨基酸的大小、合成浓度以及分子量和摩尔数值均是近似的，仅是用于说明。
所有在此引用的专利、申请、出版物、实验方法、文献和其他材料都在此并入本文中作参考。

Claims (10)

1.对高亲和性层粘连蛋白受体(HALR)有优先亲和性的用于全身施用的复制缺陷型辛德比斯病毒载体的用途，用于制备治疗患肿瘤的哺乳动物的药物，其中所述肿瘤与相同品系的正常细胞相比，肿瘤表达较高水平的HALR，其中所述药物包含***的所述载体，其中所述载体包含包装信号、编码辛德比斯病毒非结构蛋白nsp1-4的基因和辛德比斯病毒结构蛋白E1、E2、E3、6K、衣壳蛋白，且所述载体没有经过靶向肿瘤特异性细胞决定簇的修饰。
2.根据权利要求1的用途，其中的载体没有经过携带抗肿瘤基因的修饰。
3.根据权利要求1的用途，其中的载体编码抗肿瘤基因。
4.根据权利要求3的用途，其中的抗肿瘤基因选自***基因、细胞凋亡诱导基因、肿瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、肿瘤抑制因子效应基因、反义寡核苷酸编码序列、核酶编码序列和免疫原性肽编码序列。
5.根据权利要求3的用途，其中的抗肿瘤基因是细胞凋亡诱导基因。
6.根据权利要求3的用途，其中的抗肿瘤基因是细胞因子编码基因。
7.根据权利要求1的用途，其中的哺乳动物具有至少部分的功能免疫***。
8.根据权利要求1的用途，其中的哺乳动物是人。
9.根据权利要求1的用途，其中的肿瘤是实体瘤。
10.根据权利要求9的用途，其中的实体瘤选自肝癌、黑素瘤、表皮样癌、胰腺癌、脑恶性肿瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、结肠癌、***癌、膀胱癌和肾癌。
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