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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Reagenzkit zum Amplifizieren
und Nachweisen von Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7)
und auch ein Verfahren zum einfachen und schnellen Amplifizieren
und Nachweisen einer Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung eines solchen Reagenz.
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Cytomegalovirus
(hier im Folgenden als CMV abgekürzt)
ist ein Virus, das zu einer Familie Herpesviridae und zu β-Herpesvirus
hinsichtlich seines Zelltropismus, Proliferationszyklus und Latenzzustandes
gehört.
Das charakteristische Merkmal ist, dass CMV nach seiner Primärinfektion
eine latente Infektion in einem Wirt bis zu dessen Lebensende verursacht,
und dieses Virus wird durch die physiologischen Änderungen in dem Wirt reaktiviert.
In den Patienten, die an Krebs und AIDS leiden und in Transplantatempfängern, von
denen angenommen wird, dass sie in der Zukunft ansteigen, ist der
immungeschwächte
Zustand eine Ursache der Reaktivierung von CMV, was zu einem Problem
mit einem Beginn von interstitieller Pneumonie, Hepatitis, Retinitis,
Enzephalitis oder Nephritis, führt.
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Als
solches sind die Infektion und Reaktivierung von CMV große Probleme
als gegenwärtige
Krankheiten, und es ist wichtig für eine frühe Therapie, ein diagnostisches
Verfahren in einem frühen
Stadium zu etablieren. Bis jetzt ist ein Viruskulturverfahren als
ein diagnostisches Verfahren für
CMV-Infektion bekannt, aber es benötigt einen Zeitraum von einigen
Wochen, und es fehlt ihm deshalb an Schnelligkeit. In einem Serum-diagnostischen
Verfahren, in dem ein anti-CMV-Antikörper aus dem Serum des Patienten
nachgewiesen wird, gibt es Probleme, dass eine Reaktion, die nicht
spezifisch für
den Antikörper
ist, auftritt, und dass eine hohe Sensitivität nicht erzielt wird, und zusätzlich besteht
ein Nachteil, weil es schwierig ist, das Virus aufgrund der Veränderungen
in Antikörperwerten
zu verfolgen.
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Als
ein Ergebnis des Fortschritts der Molekularbiologie in den letzten
Jahren ist es möglich
geworden, CMV-DNA durch eine in situ DNA-Hybridisierung oder durch
eine Polymerasekettenreaktion (PCR) nachzuweisen. Das zuerst Genannte
ist ein Verfahren, in dem eine markierte DNA-Sonde, die komplementär zu einer CMV-Sequenz ist, verwendet
wird, um mit Gewebeproben oder kultivierten Zellen zu hybridisieren,
wodurch ein virale DNA identifiziert wird. Das zuletzt Genannte,
d.h. eine PCR, ist ein Verfahren, in dem ein CMV-spezifischer Primer
verwendet wird, wodurch virale DNA in einer kleinen Menge durch
eine Polymerasereaktion amplifiziert wird. Das PCR-Verfahren ist
besonders gekennzeichnet durch seine sehr hohe Sensitivität und außerordentliche
Schnelligkeit. Leider infiziert CMV latent verschiedene Organe in
einer Form von DNA, und es ist deshalb nicht möglich, zwischen aktiver Infektion
und latenter Infektion nur durch den Nachweis von CMV-DNA durch
eine PCR zu unterscheiden.
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Unter
solchen Umständen
wurde ein Verfahren zum Nachweisen der CMV-DNA aus zellfreiem Serum durch
eine PCR vorgeschlagen, aber es ist nicht nützlich für die Diagnose in einem frühen Zustand.
Zusätzlich wurde
ein Verfahren einer reversen Transkriptions-PCR in Betracht gezogen,
in dem mRNA, die während
der viralen Replikation anwesend ist, nachgewiesen wird, aber in
diesem Verfahren ist es notwendig, die DNA, die in der Probe vorliegt,
vor der PCR vollständig
zu entfernen und die mRNA in DNA durch reverse Reaktion umzuwandeln.
Deshalb ist dieses Verfahren beschwerlich. Darüber hinaus besteht ein Risiko,
dass wenn DNA selbst in geringen Mengen zurückbleibt, das Ergebnis als
positiv bewertet wird, selbst wenn mRNA nicht vorliegt.
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Andererseits
hat eine NASBA (Nukleinsäuresequenz-basierte
Amplifikation) in den letzten Jahren öffentliche Aufmerksamkeit als
ein Amplifikationsverfahren erhalten, das ein RNA-Polymerase verwendet,
die spezifisch die RNA amplifiziert (es wird Bezug genommen auf
die japanische Patent-Offenlegungsschriften Hei-2/5864 und Hei-4/501057).
In einem NASBA-Verfahren wird RNA (–) nur von RNA (+) amplifiziert,
die grundsätzlich
eine Matrize ist, und wenn deshalb mRNA, die nicht in latenter Infektion
exprimiert wird sondern nur in aktiver Infektion exprimiert wird,
ausgewählt
wird, dann ist es möglich,
spezifisch das aktive CMV nachzuweisen. Die mRNA, die von der DNA
transkribiert wird, existiert in einer größeren Menge im Vergleich zu
der genomischen DNA, und folglich kann die Konstruktion des Systems
mit einer höheren
Sensitivität
erwartet werden. Darüber
hinaus ist ein System zum Nachweisen der mRNA in der aktiven Infektion
nützlich
in der Überwachung
der therapeutischen Wirkung durch Ganciclovir, etc.
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Wu
et al., Am. J. of Pathology, Vol. 141 (5), S. 1247–1254, 1992
beschreibt ein in situ Hybridisierungsverfahren unter Verwendung
einer Ribosonde, die vom HCMV 2.7 kb major early β-Gen abgeleitet
ist.
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Es
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bereitzustellen,
das in der Lage ist eine CMV-Nukleinsäure durch ein NASBA-Verfahren
in einer einfachen, schnellen und spezifischen Weise mit einer hohen
Sensitivität
zu amplifizieren und nachzuweisen. Genauer stellt die vorliegende
Erfindung Amplifikationsprimer, die für das NASBA-Verfahren geeignet
sind und auch eine Einfang-Sonde
oder eine Nachweis-Sonde zum Identifizieren des amplifizierten Produkts
bereit, das durch die Primer erhalten wurde, wodurch die Probleme
in den herkömmlichen
klinischen Testverfahren für
CMV jetzt gelöst
sind.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben eine intensive Studie
an Genen von CMV durchgeführt und
als ein Ergebnis haben sie ihre Aufmerksamkeit der Tatsache gewidmet,
dass das β 2.7
Transkript von CMV nicht in latenter Infektion exprimiert wird sondern
in einer großen
Menge nur in aktiver Infektion exprimiert wird, und sie haben ein
Nachweisverfahren unter Verwendung von Amplifikationsprimern und
einer Einfang-Sonde und/oder Nachweis-Sonde mit einer Sequenz etabliert,
das in der Lage ist, in einer einfachen, schnellen und spezifischen
Weise mit einer hohen Sensitivität
von RNA zu amplifizieren, die ein Transkript des β 2.7 Gens
von CMV ist, woraufhin die vorliegende Erfindung erreicht wurde.
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So
betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligonukleotid zum Amplifizieren
einer Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7),
wobei das Oligonukleotid eine Nukleinsäure enthält, die aus mindestens fünfzehn zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, besteht.
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Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligonukleotid zum Amplifizieren
einer Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7),
wobei das Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz enthält, die
aus mindestens fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt aus
der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4, besteht.
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Noch
weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Oligonukleotid,
wie oben beschrieben, zum Amplifizieren einer Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7),
wobei das Oligonukleotid eine Promotorsequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase
am 5'-Ende des oben
erwähnten
Oligonukleotids aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen Oligonukleotid-Satz zum
Amplifizieren einer Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7),
wobei der Oligonukleotid-Satz ein Oligonukleotid, welches eine Nukleinsäuresequenz,
bestehend aus mindestens fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, enthält,
und ein Oligonukleotid, welches eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden Basen,
ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4, enthält, umfasst, wobei mindestens
eines der Oligonukleotide eine Promotorsequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase
am 5'-Ende aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Reagenzkit zum Amplifizieren
einer Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), wobei das Reagenzkit
- (a)
einen ersten Primer zum Amplifizieren einer Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, enthält,
und eine Promotorsequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase
am 5'-Ende aufweist,
- (b) einen zweiten Primer zum Amplifizieren einer Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4, enthält,
- (c) eine Substanz mit RNA-abhängiger DNA-Polymerase-Aktivität,
- (d) eine Substanz mit Ribonuklease H-Aktivität,
- (e) eine Substanz mit DNA-abhängiger DNA-Polymerase-Aktivität,
- (f) eine Substanz mit einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase-Aktivität,
- (g) Ribonukleosidtriphosphate und
- (h) Desoxyribonukleosidtriphosphate
umfasst.
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Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung ein Reagenzkit zum Amplifizieren
einer Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), wobei das Reagenzkit
- (a)
einen ersten Primer zum Amplifizieren einer Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäure sequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4, enthält und eine Promotorsequenz
einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase am 5'-Ende
aufweist,
- (b) einen zweiten Primer zum Amplifizieren einer Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, enthält,
- (c) eine Substanz mit einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität,
- (d) eine Substanz mit einer Ribonuklease H-Aktivität,
- (e) eine Substanz mit einer DNA-abhängigen DNA-Polymerase-Aktivität,
- (f) eine Substanz mit einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase-Aktivität,
- (g) Ribonukleosidtriphosphate und
- (h) Desoxyribonukleosidtriphosphate
umfasst.
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Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung ein Reagenzkit zum Amplizifieren
einer Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), wobei das Reagenzkit
- (a)
einen ersten Primer zum Amplifizieren einer Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, enthält,
und eine Promotorsequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase
am 5'-Ende aufweist,
- (b) einen zweiten Primer zum Amplifizieren einer Nukleinsäure von
Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4, enthält, und eine Promotorsequenz
einer DNA-abhängigen
RNA-Polymerase am 5'-Ende
aufweist,
- (c) eine Substanz mit RNA-abhängiger DNA-Polymerase-Aktivität,
- (d) eine Substanz mit Ribonuklease H-Aktivität,
- (e) eine Substanz mit DNA-abhängiger DNA-Polymerase-Aktivität,
- (f) eine Substanz mit einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase-Aktivität,
- (g) Ribonukleosidtriphosphate und
- (h) Desoxyribonukleosidtriphosphate
umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Amplifizieren
einer Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7),
wobei das Verfahren die folgenden Schritte (1) bis (10) umfasst:
- (1) Extrahieren einer aus RNA (+) bestehenden
Zielnukleinsäure
aus einer Probe, wenn erforderlich,
- (2) Hybridisieren eines ersten Primers zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, enthält
und eine Promotorsequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase am 5'-Ende aufweist, mit einer
RNA (+) als Matrize zum Verlängern
des Primers durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase,
woraufhin ein verlängertes
RNA/DNA-Hybrid erhalten wird,
- (3) Verdauen der RNA in dem verlängerten RNA/DNA-Hybrid durch
eine Ribonuklease H, die speziell nur die RNA des verlängerten
RNA/DNA-Hybrids verdaut, woraufhin eine einzelsträngige DNA
erhalten wird,
- (4) Hybridisieren eines zweiten Primers zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4, enthält, mit der einzelsträngigen DNA
als Matrize zum Durchführen
einer DNA-Verlängerungsreaktion
durch die DNA-abhängige
DNA-Polymerase, woraufhin ein doppelsträngiges DNA-Zwischenprodukt
mit einer funktionsfähigen
Promotorsequenz stromaufwärts
vom 5'-Ende erzeugt
wird,
- (5) Transkribieren einer einzelsträngigen RNA (–), zunehmend
von dem doppelsträngigen
DNA-Zwischenprodukt durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, die befähigt ist, die vorstehend erwähnte Promotorsequenz
zu erkennen,
- (6) Hybridisieren des zweiten Primers zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 und NR: 4, enthält, mit der im vorstehenden Schritt
erhaltenen, einzelsträngigen
RNA (–)
als Matrize zum Durchführen
einer DNA-Verlängerungsreaktion
durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase,
woraufhin ein verlängertes
RNA/DNA-Hybrid erhalten wird,
- (7) Verdauen der RNA in dem verlängerten RNA/DNA-Hybrid durch
eine Ribonuklease H, die speziell nur die RNA des verlängerten
RNA/DNA-Hybrids verdaut, woraufhin eine einzelsträngige DNA
erhalten wird,
- (8) Hybridisieren des ersten Primers zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt aus
der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, enthält
und eine Promotorsequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase am 5'-Ende aufweist, mit
der einzelsträngigen
DNA als Matrize zum Durchführen
einer DNA-Verlängerungsreaktion
durch eine DNA-abhängige
DNA-Polymerase, woraufhin ein doppelsträngiges DNA-Zwischenprodukt
mit einer funktionsfähigen
Promotorsequenz stromaufwärts
vom 5'-Ende erzeugt
wird,
- (9) Transkribieren der einzelsträngigen RNA (–), zunehmend
von dem doppelsträngigen
DNA-Zwischenprodukt, durch die DNA-abhängige RNA-Polymerase, die zum Erkennen der vorstehend
erwähnten
Promotorsequenz befähigt
ist, und,
- (10) wenn erforderlich, Wiederholen der vorstehend erwähnten Schritte
(6) bis (9), unter Verwendung der resultierenden einzelsträngigen RNA
(–) als
Matrize.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7),
wobei das Verfahren die folgenden Schritte (1) bis (10) umfasst,
- (1) Extrahieren einer aus RNA (+) bestehenden
Zielnukleinsäure
aus einer Probe, wenn erforderlich,
- (2) Hybridisieren eines ersten Primers zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, enthält
und eine Promotorsequenz einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase am 5'-Ende aufweist, mit
einer RNA (+) als Matrize zum Verlängern des Primers durch eine
RNA-abhängige DNA-Polymerase,
woraufhin ein verlängertes
RNA/DNA-Hybrid erhalten wird,
- (3) Verdauen der RNA in dem verlängerten RNA/DNA-Hybrid durch
eine Ribonuklease H, die speziell nur die RNA des verlängerten
RNA/DNA-Hybrids verdaut, woraufhin eine einzelsträngige DNA
erhalten wird,
- (4) Hybridisieren eines zweiten Primers zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4, enthält, und eine Promotorsequenz
für eine
DNA-abhängige
RNA-Polymerase am 5'-Ende aufweist, mit
der einzelsträngigen
DNA als Matrize zum Durchführen
einer DNA-Verlängerungsreaktion
durch eine DNA-abhängige
DNA-Polymerase, woraufhin
ein doppelsträngiges
DNA-Zwischenprodukt mit einer funktionsfähigen Promotorsequenz stromaufwärts des
5'-Endes erzeugt
wird,
- (5) Transkribieren einer einzelsträngigen RNA (–), zunehmend
von dem doppelsträngigen
DNA-Zwischenprodukt, durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, die befähigt ist, die vorstehend erwähnte Promotorsequenz
zu erkennen,
- (6) Hybridisieren des zweiten Primers zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 1, enthält
und eine Promotorsequenz für
eine DNA-abhängige
RNA-Polymerase am 5'-Ende
aufweist, mit der im vorstehenden Schritt erhaltenen, einzelsträngigen RNA
(–) als
Matrize zum Durchführen
der DNA-Verlängerungsreaktion
durch eine RNA-abhängige DNA-Polymerase,
woraufhin ein verlängertes
RNA/DNA-Hybrid erhalten wird,
- (7) Verdauen der RNA in dem verlängerten RNA/DNA-Hybrid durch
eine Ribonuklease H, die speziell nur die RNA des verlängerten
RNA/DNA-Hybrids verdaut, woraufhin eine einzelsträngige DNA
erhalten wird,
- (8) Hybridisieren des ersten Primers zum Amplifizieren einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), der eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt aus
der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4, enthält und eine Promotorsequenz
für eine
DNA-abhängige
RNA-Polymerase am 5'-Ende aufweist, mit
der einzelsträngigen
DNA als Matrize zum Durchführen
einer DNA-Verlängerungsreaktion
durch eine DNA-abhängige
DNA-Polymerase,
woraufhin ein doppelsträngiges
DNA-Zwischenprodukt mit einer funktionsfähigen Promotorsequenz stromaufwärts von
beiden Enden erzeugt wird,
- (9) Transkribieren der einzelsträngigen RNA (–) und RNA
(+), zunehmend von dem doppelsträngigen DNA-Zwischenprodukt
durch eine DNA-abhängige
RNA-Polymerase, die zum Erkennen der vorstehend erwähnten Promotorsequenz
befähigt
ist, und,
- (10) wenn erforderlich, Wiederholen der vorstehend erwähnten Schritte
(6) bis (9) unter Verwendung der resultierenden einzelsträngigen RNA
(–) und
RNA (+) als Matrize.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Sonde zum Nachweisen und/oder
Einfangen einer Nukleinsäure
des Cytomegalovirus (CMV), wobei die Sonde eine Nukleinsäuresequenz,
bestehend aus mindestens fünfzehn
zusammenhängenden Basen,
ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 5, NR: 6 und/oder NR: 7 oder einer komplementären Nukleinsäure davon
oder einer, wenn erforderlich, modifizierten Nukleinsäure, enthält.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Reagenzkit zum Nachweisen
einer Nukleinsäure
des Cytomegalovirus (CMV), wobei das Reagenzkit einen Reagenzkit
zum Amplifizieren einer Nukleinsäure
des oben genannten Cytomegalovirus (CMV) und ferner eine Sonde zum
Nachweisen und/oder Einfangen einer Nukleinsäure des Cytomegalovirus (CMV),
die eine Nukleinsäuresequenz,
bestehend aus der Nukleinsäuresequenz von
SEQ ID NR: 5, NR: 6 und/oder NR: 7 oder einer komplementären Nukleinsäure davon
oder einer, wenn erforderlich, modifizierten Nukleinsäure, enthält.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweisen
einer Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV), unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7),
umfassend das Nachweisen von Nukleinsäuren, die mit den oben genannten
Verfahren amplifiziert wurden, mit einer Sonde zum Nachweisen und/oder
Einfangen einer Nukleinsäure
des Cytomegalovirus (CMV), die eine Nukleinsäuresequenz, bestehend aus mindestens
fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 5, NR: 6 und/oder NR: 7, oder einer komplementären Nukleinsäuresequenz
davon oder einer, wenn erforderlich, durch eine Markierung modifizierten
Nukleinsäure,
enthält.
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Weiterhin
betritt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen einer
Nukleinsäure
von Cytomegalovirus (CMV) unter Verwendung einer Nukleinsäuresequenz
(β 2.7),
wobei das Verfahren das Hybridisieren von Nukleinsäuren, die
mit dem oben genannten Verfahren amplifiziert wurden, mit einer
Einfang-Sonde, die an einem festen Träger absorbiert oder gebunden
ist, wobei eine Nukleinsäuresequenz,
bestehend aus mindestens fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
ist aus der Nukleinsäure
von SEQ ID NR: 5, NR: 6 und/oder NR: 7 und gegebenenfalls modifiziert
ist, und mit einer Nachweis-Sonde, wobei eine Nuklein säuresequenz,
bestehend aus mindestens fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
ist aus der Nukleinsäuresequenz
von SEQ ID NR: 5, NR: 6 und/oder NR: 7, die durch eine Markierung
modifiziert ist, danach das Abtrennen der nicht reagierten Nachweise-Sonde
und das Messen der Markierung eines Konjugats der Einfang-Sonde,
der amplifizierten Nukleinsäuren
und der Nachweis-Sonde umfasst.
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Anschließend werden
die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe im Folgenden
erklärt werden.
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"Promotorsequenz" ist eine Nukleinsäuresequenz,
an welche die DNA-abhängige
RNA-Polymerase spezifisch bindet. Die DNA-abhängige RNA-Polymerase synthetisiert
die RNA, die homolog ist zu der DNA-Sequenz, die unterhalb von der
Promotorsequenz angeordnet ist.
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"Ein Verfahren zum
Amplifizieren der Nukleinsäure
unter Verwendung einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase" bedeutet, dass die
Promotorsequenz der DNA-abhängigen RNA-Polymerase-Sequenz
in dem Primer enthalten ist, der für die Synthese einer doppelsträngigen DNA
von einer Zielnukleinsäure
(DNA) verwendet wird, woraufhin aufgrund des Erfolgs der Synthese
der doppelsträngigen
DNA, die RNA, die der Zielnukleinsäure (DNA) entspricht, durch
eine DNA-abhängige
RNA-Polymerase unter Verwendung der synthetisierten doppelsträngigen DNA
als Matrize synthetisiert wird.
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Dies
ist auch ein Verfahren zum Durchführen einer RNA-Transkriptionsreaktion
zum Synthetisieren der RNA, wobei ein DNA/RNA-Hybrid von der synthetisierten
RNA unter Verwendung einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase synthetisiert
wird, anschließend
wird die RNA dieses Hybrids verdaut, um eine einzelsträngige DNA
und schließlich
eine doppelsträngige
DNA zu ergeben, und schließlich
wird eine doppelsträngige DNA
mit einer Promotorsequenz der DNA-abhängigen RNA-Polymerase von der so hergestellten
einzelsträngigen
DNA und dem Primer mit der oben genannten Promotorsequenz synthetisiert.
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"NASBA-Verfahren" bedeutet, dass ein
RNA/DNA-Hybrid durch die RNA-abhängige DNA-Polymerase von
einer Zielnukleinsäure
(RNA) mit einem Primer (P1) mit einer Promotorsequenz der DNA-abhängigen RNA-Polymerase
synthetisiert wird, und anschließend wird ein RNA-Strang dieses
Hybrids durch Ribonuklease H verdaut, um den DNA-Strang zu erhalten.
Eine doppelsträngige
DNA wird von der verbleibenden RNA des Hybrids mit einem anderen
Primer (P2), der von dem oben genannten Primer verschieden ist,
und der DNA-abhängigen
DNA-Polymerase synthetisiert.
Eine Vielzahl von RNAs, die zu der Zielnukleinsäure komplementär sind,
werden von der doppelsträngigen
DNA durch DNA-abhängige
RNA-Polymerase transkribiert. Als nächstes wird das RNA/DNA-Hybrid
von der komplementären
RNA mit einem Primer (P2) durch RNA-abhängige DNA-Polymerase synthetisiert, und anschließend wird
der RNA-Strang dieses Hybrids durch Ribonuklease H verdaut, wodurch
eine einzelsträngige
DNA erhalten wird. Von dieser einzelsträngigen DNA und dem Primer (P1)
mit einer Promotorsequenz der DNA-abhängigen RNA-Polymerase wird
eine doppelsträngige DNA
mit der Promotorsequenz synthetisiert, und eine RNA-Transkription,
die RNA komplementär
zu der Zielnukleinsäure
bildet, wird erneut durchgeführt.
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Das
NASBA-Verfahren schließt
ein Verfahren ein, bei dem eine Zielnukleinsäure (DNA) in RNA transkribiert
wird, und anschließend
wird ein herkömmliches
NASBA-Verfahren durchgeführt.
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Das
NASBA-Verfahren ist gekennzeichnet durch die Verwendung von Ribonuklease
H in einem Verfahren zum Trennen der DNA auf einer duplizierten
RNA-Base. Gemäß diesem
Verfahren ist es möglich
einige zehn bis einige tausend Moleküle RNA von einem Molekül einer
doppelsträngigen
Nukleinsäure
(DNA) unter Verwendung einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase zu transkribieren,
und eine Amplifikationseffizienz der Nukleinsäure pro Zyklus ist hoch im
Vergleich zu dem PCR-Verfahren. Zusätzlich ist, als ein Ergebnis
der Verwendung von Ribonuklease H, der Temperaturzyklus, der in
dem PCR-Verfahren notwendig ist, nicht länger notwendig, wodurch es
möglich
ist, die Nukleinsäure
(RNA) in einer leichteren und einfacheren Weise zu amplifizieren.
-
"Modifikation" bedeutet, dass ein
anderes Nukleotid hinzugefügt
wird oder gegen mindestens ein Nukleotid in dem Oligonukleotid substituiert
wird. Der Begriff "hinzufügen/hinzugefügt" bedeutet, dass das
Nukleotid, oligo-dGTP, oligo-dATP, oligo-dTTP, oligo-dCTP, etc.
mit Fluoreszenzsubstanz, Verknüpfungsarm,
Biotin, etc. an ein 5'-Ende
oder ein 3'-Ende
der Oligonukleotidsequenz gebunden sind. Der Begriff "substituiert(e)" bedeutet, dass ein
Nukleotid mit Fluoreszenzsubstanz, Verknüpfungsarm, Biotin, etc. als
ein Austausch für
mindestens ein Nukleotid in das Oligonukleotid eingeführt wird.
Das Einführen
von bekannten Markierungen, wie radiaktive Substanzen, Enzyme, Fluoreszenzsubstanzen,
etc. nach der Synthese des Oligonukleotids ist hier auch eingeschlossen.
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"Markierung" ist eine Substanz,
die nachweisbar ist, wie radioaktive Substanzen, Enzyme, Fluoreszenzsubstanzen,
etc. Sie deckt auch eine Substanz ab, die zur Bindung mit einer
solchen nachweisbaren Substanz fähig
ist.
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1 zeigt
eine Lagebeziehung zwischen dem ersten Primer für Amplifikation, dem zweiten
Primer für
Amplifikation, der Nachweis-Sonde und der Einfang-Sonde.
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2 zeigt
das Ergebnis der Untersuchung der Kombination von jedem der Primer
mit jeder der Sonden.
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Die
erfindungsgemäße nachzuweisende
Zielnukleinsäure
ist entweder DNA oder RNA. Sie wird einer Amplifikationsreaktion
unterzogen, nachdem sie in eine einzelsträngige Kette durch eine modifizierende
Behandlung, wie Erhitzen oder Behandeln mit Säure oder Alkali im Fall einer
doppelsträngigen
Kette oder sogar im Fall einer einzelsträngigen Kette, wenn sie eine
Struktur höherer
Ordnung aufweist, verändert
wurde.
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Wenn
die Zielnukleinsäure
in einer Mischung aus Protein, Lipid, Saccharid, etc. oder in einer
biologischen Probe vorliegt, wird die Zielnukleinsäure durch
herkömmliche
Verfahren extrahiert und anschließend für das Amplifizieren und Nachweisen
der vorliegenden Erfindung verwendet.
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Ein
spezifisches Beispiel des Extraktionsverfahrens ist, dass eine Lösung mit
Proteinase, Detergenz, etc. zu der Probe hinzugefügt wird,
eine Inkubation für
ungefähr
30 Minuten durchgeführt
wird, die resultierende Lösung
mit Phenol, Chloroform oder ähnlichem
extrahiert wird, und der Extrakt mit Ethanol behandelt wird, um
die Nukleinsäure
zu präzipitieren.
Ein anderes Beispiel ist es, ein Verfahren zu verwenden, das durch
Boom et al. (siehe J. Clin. Microbiol. 28:495–503), beschreiben wurde. So
wird zum Beispiel eine kultivierte Zellflüssigkeit der Zellen, die durch
CMV (AD 169 Stamm) infiziert wurden, in einem Puffer zur Lösung behandelt,
der Triton X-100 und Guanidinthiocyanat (GuSCN) enthält, und
Silikapartikel werden hinzugefügt
um die mRNA zu adsorbieren. Anschließend werden die Silikapartikel,
welche die mRNA adsorbieren, zwei bis dreimal mit einem Waschpuffer
gewaschen, der GuSCN enthält,
anschließend
wird GuSCN mit Aceton entfernt, und der Rückstand wird getrocknet. Die
Elution wird durchgeführt
unter Verwendung von destilliertem Wasser, das weder Ribonuklease
(RNase) noch Desoxyribonuklease (DNase) enthält. Das Eluat kann einer Gradientenverdünnung mit
demselben destillierten Wasser unterzogen werden.
-
Der
erfindungsgemäße Primer
zum Amplifizieren schließt
eine Nukleinsäuresequenz
ein, die aus mindestens fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäureseqeuenz,
die in SEQ ID NR: 1 des Sequenzprotokolls erwähnt ist, besteht oder eine
Nukleinsäuresequenz,
die aus mindestens fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz,
die in SEQ ID NR: 2, NR: 3 oder NR: 4 des Sequenzprotokolls erwähnt ist,
besteht.
-
Die
erfindungsgemäße Einfang-Sonde
oder die Nachweis-Sonde schließt
eine Nukleinsäuresequenz ein,
die aus mindestens fünfzehn
zusammenhängenden
Basen ausgewählt
aus der Nukleinsäuresequenz,
die in SEQ ID NR: 5, NR: 6 oder NR: 7 des Sequenzprotokolls erwähnt ist,
besteht, wobei die Nukleinsäure
modifiziert sein kann, wenn erforderlich.
-
1 zeigt
die Lagebeziehung der Zielnukleinsäuresequenz (β 2.7-Gen
der CMV-Nukleinsäure)
mit den Basensequenzen, die in SEQ ID NR: 1 bis NR: 7 des Sequenzprotokolls
erwähnt
sind.
-
Der
erste Primer für
die CMV-Amplifikation, der in der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, weist eine Nukleinsäuresequenz
auf, die ausreichend komplementär
ist zu der Zielnukleinsäuresequenz
und einer Promotorsequenz an der Seite ihres 5'-Endes.
-
Weiterhin
ist der zweite Primer für
die CMV-Amplifikation eine Nukleinsäuresequenz, die ausreichend homolog
ist zu der Zielnukleinsäuresequenz,
und ihr 3'-Ende ist auf das
3'-Ende des ersten
Primers auf der komplementären
Kette gerichtet.
-
Die
Einfang-Sonde oder Nachweis-Sonde ist derart aufgebaut, dass sie
zum Hybridisieren mit dem amplifizierten Produkt oder irgendeiner
Kombination des ersten und des zweiten Primers für die CMV-Amplifikation fähig ist.
-
Der
erfindungsgemäße Primer
zum Amplifizieren des CMV kann Desoxyribonukleinsäure (DNA)
sein und kann durch chemische Synthese hergestellt werden. Zum Beispiel
kann er durch ein Phosphoamidit-Verfahren unter Verwendung eines
DNA-Synthetisiergeräts
(Typ 391) von Perkin-Elmer synthetisiert werden. Das Entblockieren
von verschiedenen Oligonukleotiden wird durch wässrigen Ammoniak durchgeführt. Die
Reinigung kann durch eine FPLC unter Verwendung einer reversen Phase
Säule durchgeführt werden.
Beispiele von anderen synthetischen Verfahren sind das Phosphorsäuretriester-Verfahren,
H-Phosphonat-Verfahren und Thiophosphit-Verfahren. Wenn die Zielnukleinsäuresequenz
eine Variation aufweist oder wenn das Ziel eine herkömmliche
Amplifikation mit einer anderen Amplifikationsdomäne oder
mit einem anderen ähnlichen Virus
ist, kann es eine Punktmutation, wie eine Deletion, Insertion und
Substitution im Primer geben.
-
Der
erfindungsgemäße Primer
ist eine synthetische Substanz und deshalb ist es möglich, ein
Oligonukleotid einer konstanten Qualität in einer einfachen Weise
und auch in großen
Mengen herzustellen.
-
Es
gibt keine besondere Limitierung für die Promotorsequenz des ersten
Primers für
die CMV-Amplifikation, der in der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, aber sie muss funktionsfähig
sein, so dass die DNA-abhängige
RNA-Polymerase wirkt. Bezüglich
einer solchen Promotorsequenz ist 5'-AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G-3' bekannt im Fall
von z.B. T7 RNA-Polymerase.
-
Zusätzlich kann
die Promotorsequenz einen Spacer bis zu dem Initiationspunkt für die Amplifikation enthalten.
Zum Beispiel kann ein Teil einer Sequenz, wie 5'-AGG A-3'an das 3'-Ende der Promotorsequenz gebunden sein.
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Beispiele
von anderen Promotorsequenzen sind wie folgt.
5'-ATT AAC CCT CAC
TAA AG-3' für T3 RNA-Polymerase;
und
5'-ATT
TAG GTG ACA CTA TA-3' für SP6 RNA-Polymerase.
-
Darüber hinaus
weist der zweite Primer für
die CMV-Amplifikation in der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäuresequenz
auf, die komplementär
ist zu der Nukleinsäuresequenz
des verlängerten
ersten Primers, und sie ist ausreichend homolog zu der Zielnukleinsäuresequenz.
Zusätzlich
zu der ergänzenden
Nukleinsäuresequenz
zu dem verlängerten
ersten Primer kann der zweite Primer eine Promotorsequenz auf der
Seite seines 5'-Endes
aufweisen, wenn erforderlich.
-
Wenn
der zweite Primer eine Promotorsequenz aufweist, kann sie gleich
oder verscheiden von der Promotorsequenz des ersten Primers sein.
Wenn sie verschieden ist, können
plurale DNA-abhängige RNA-Polymerasen,
die auf jeden der Pro motoren wirken, verwendet werden, wenn erforderlich.
Wenn zum Beispiel der T7-Promotor,
T3-Promotor oder SP6-Promotor als die Promotorsequenz des zweiten
Primers verwendet wird, dann wird jeweils die T7 RNA-Polymerase,
T3 RNA-Polymerase
oder SP6 RNA-Polymerase verwendet.
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Bezüglich der
DNA-abhängigen
RNA-Polymerasen und den begleitenden Promotorsequenzen, sind die
oben genannten drei Typen bevorzugt, obwohl sie nicht darauf beschränkt sind.
Es ist besonders bevorzugt, die T7 RNA-Polymerase und ihre Promotorsequenz
zu verwenden.
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Es
ist weiter bevorzugt, dass, wenn der zweite Primer eine Promotorsequenz
aufweist, sowohl der erste als auch der zweite Primer mit der Promotorsequenz
der T7 RNA-Polymerase verbunden sind, wodurch die Kopienzahl durch
die T7 RNA-Polymerase
erhöht
wird.
-
Die
Domäne,
an der die Hybridisierung mit Zielnukleinsäuresequenzen oder komplementären Sequenzen
des ersten und des zweiten Primer oder der verlängerten Primer stattfindet,
benötigt
eine Nukleinsäuresequenz,
die aus mindestens fünfzehn
Basen jeder der Sequenzen des Sequenzprotokolls besteht.
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Gemäß der Publikation
von Fahy et al. (PCR Methods and Applications, 1991; 1:S. 25–33) wird
berichtet, dass die Verwendung der Basen von 15 bis 30 in einem
3SR-Verfahren bevorzugt ist, das eine ähnliche Technik wie ein NASBA-Verfahren
ist. Demzufolge kann in Abhängigkeit
von einem Verfahren zum Herstellen einer Zielnukleinsäuresequenz
und auch einem Verfahren zum Amplifizieren unter Verwendung einer
RNA-Polymerase, eine optimale Sequenz und optimale Sequenzlänge von
15 bis 30 Basen ausgewählt
werden. Vorzugsweise ist die Sequenz auf der Seite des 3'-Endes eine Nukleinsäuresequenz,
die aus mindestens fünfzehn zusammenhängenden
Basen der Sequenz besteht, die in dem Sequenzprotokoll gezeigt ist.
Die ideale Länge der
Domäne,
an der die Hybridisierung stattfindet, ist vorzugsweise von 15 Basen
bis zu der gesamten Sequenzlänge,
wie in dem Sequenzprotokoll gezeigt, weiter bevorzugt die gesamte
Sequenzlänge.
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In
der vorliegenden Erfindung stehen die folgenden Kombinationen als
Primer für
Amplifikationen zur Verfügung.
-
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Die
RNA-abhängige
DNA-Polymerase (eine reverse Transkriptase), die in der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, ist ein Enzym, das DNA von einem Oligodesoxyribonukleotid
Primer und RNA-Matrize synthetisiert. Zusätzlich kann dieses Enzym DNA-abhängige DNA-Polymerase
(DNA-Polymerase) und Ribonuklease H (RNase H) Aktivität enthalten.
Beispiele für
ein solches Enzym sind jene, die von einem anderen Retrovirus, wie
Avian Myoblast Virus-Polymerase (AMV-reverse Transkriptase) und
Maloney Maus Leukämie
Virus, abgeleitet sind.
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Bezüglich der
thermostabilen RNA-abhängigen
DNA-Polymerase (reverse Transkriptase), ist auch bekannt, dass die
DNA-abhängigen
DNA-Polymerasen, die von Thermus thermophilus und von Thermus aquaticus
abgeleitet sind, die Enzymaktivität zeigen.
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Die
Ribonuklease H (RNase H), die in der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, ist ein Enzym, das fähig
ist die RNA, die an eine komplementäre DNA gebunden ist, zu hydrolysieren.
Dieses Enzym sollte nicht in der Lage sein, die einzelsträngige oder
doppelsträngige
RNA oder alle DNA zu hydrolysieren. Beispiele des bevorzugten Enzyms
sind RNase H, die von Escherichia coli und RNase H, die von Rinderthymus
abgeleitet sind. Beispiele der thermostabilen RNase H sind RNase
H, die von Thermus thermophilus abgeleitet sind. Es wurde auch gefunden,
dass die DNA-abhängige
DNA-Polymerase die von Thermus thermophilus abgeleitet ist, auch
eine RNase H-Aktivität
besitzt und, wenn das Enzym verwendet wird, ist es jetzt möglich, drei
Arten von enzymatischer Aktivität
durch die Verwendung einer einzelnen Substanz (Enzym) zu verwenden,
anstelle der Verwendung von thermostabiler RNA-abhängiger DNA-Polymerase
(reverse Transkriptase) und thermostabiler RNase H.
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Die
DNA-abhängige
DNA-Polymerase (DNA-Polymerase), die in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, ist ein Enzym, das fähig ist DNA von einem Oligodesoxyribonukleotid
Primer und einer DNA-Matrize zu synthetisieren. Beispiele eines
solchen Enzyms sind AMV-reverse Transkriptase, DNA-Polymerase, die
von Geweben von Säugetieren,
wie Rinderthymus isoliert wurden, Klenow-Fragment der DNA-Polymerase
I, die von Escherichia coli abgeleitet ist und DNA-Polymerase, die
von Bakteriophage T7 abgeleitet ist.
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Andere
Beispiele sind die DNA-Polymerasen, die von Thermus thermophilus,
Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus und Thermococcus litoralis
abgeleitet sind.
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Die
DNA-abhängige
RNA-Polymerase (RNA-Polymerase), die in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, ist ein Enzym, das an eine Promotorsequenz bindet
und das fähig
ist, spezifisch die Synthese von RNA an der Initiationsstelle zu
initiieren, die in der Nähe
dieser Promotorsequenz reguliert ist. Das Enzym ist fähig, einige
RNA-Kopien pro Kopie zu synthetisieren, was funktionsfähig gegenüber der
Matrize innerhalb einer geeigneten Zeit ist. Beispiele des geeigneten
Enzyms sind andere Bakteriophagen T7 RNA-Polymerasen, wie Bakteriophage
T7 RNA-Polymerase,
Phage T3, Phage XII, Salmonella Phage SP6 oder Pseudomonas Phage
gh-1. Zusätzlich
können
die RNA-Polymerasen, die von anderen prokaryoten und eukaryoten
Zellen abgeleitet sind, auch verwendet werden.
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Es
ist zum Beispiel bekannt, dass die DNA-Polymerasen, die von Thermus
thermophilus und Thermus aquaticus abgeleitet sind, eine RNA-Polymerase-Aktivität aufweisen,
und eine Art von DNA-Polymerase, die beide Aktivitäten aufweist,
kann für
gewöhnlich
auch verwendet werden.
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Das
Durchführen
eines NASBA-Verfahrens unter Verwendung der vorliegenden Erfindung,
kann getan werden unter Bezugnahme zum Beispiel auf eine Literaturstelle
(J. Virol. Methods 35:273–286).
Ein Beispiel ist, dass in einer Reaktionsmischung von 25 μl eine Anordnung
durchgeführt
wird, um die Endkonzentrationen nach dem Hinzufügen des Enzyms wie folgt zu
gestalten. Es sind dies 40 mM Tris (pH 8,5); 20 mM Magnesiumchlorid;
40 mM Kaliumchlorid; 5 mM DTT; 15% DMSO; 1 mM dNTP; 4,1 mM rNTP;
0,2 μM des
ersten Primers; und 0,2 μM
des zweiten Primers. Anschließend
wird die Reaktionsmischung mit der extrahierten RNA gemischt und
bei 65°C
für fünf Minuten
erhitzt. Danach werden 2,5 μg
BSA, 12 U RNA Guard, 20 U T7 RNA-Polymerase, 4 U AMV reverse Transkriptase
und 0,2 U Ribonuklease H (RNase H), die von Escherichia coli abgeleitet
ist, hinzugefügt,
was 25 μl
ergibt, gefolgt von Inkubieren für
drei Stunden. Unter dieser Amplifikationsbedingung kann es einen
Fall geben, wo eine Modifikation der Sequenz des Primers in Abhängigkeit von
dem Extraktionsverfahren der Zielnukleinsäure und auch von den Bedingungen
der Extraktion notwendig ist. In diesem Fall können die Konzentrationen von
DMSO, rNTP, etc. in der oben genannten Bedingung optimiert werden.
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In
der Nachweis-Sonde oder Einfang-Sonde die in der vorliegenden Erfindung
verwendet wird, ist eine Nukleinsäuresequenz notwendig, die aus
mindestens fünfzehn
zusammenhängenden
Basen, wie in SEQ ID NR: 5, NR: 6 oder NR: 7 des Sequenzprotokolls
gezeigt, besteht.
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Wie
der Primer für
die Amplifikation kann die Nachweis-Sonde oder die Einfang-Sonde Desoxyribonukleinsäure (DNA)
sein und kann durch chemische Synthese hergestellt werden. Zum Beispiel
kann sie durch ein Phosphoamidit-Verfahren unter Verwendung eines
DNA-Synthetisiergeräts
(Typ 391) von Perkin-Elmer synthetisiert werden. Das Entblockieren
wird in wässrigem
Ammoniak durchgeführt.
Die Reinigung kann mit Hilfe einer FPLC unter Verwendung einer MONO-Q-Säule o der
einer reversen Phase Säule
durchgeführt
werden. Beispiele von anderen synthetischen Verfahren sind das Phosphorsäuretriester-Verfahren,
H-Phosphonat-Verfahren
und Triphosphit-Verfahren.
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Darüber hinaus
kann beim Synthetisieren der Oligonukleotide oligo-dCTP, oligo-dTTP, oligo-dATP,
oligo-dGTP oder ein Nukleotid mit Fluoreszenzsubstanz, Verknüpfungsarm,
Biotin, etc. an dem 5'-Ende
oder dem 3'-Ende
hinzugefügt
werden.
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Alternativ
dazu kann die Synthese durch Substituieren eines Nukleotids mit
Fluoreszenzsubstanz, Verknüpfungsarm,
Biotin, etc. gegen das Nukleotid in dem Oligonukleotid durchgeführt werden.
Darüber
hinaus können
bekannte Markierungen, wie radioaktive Substanzen, Enzyme oder Fluoreszenzsubstanzen
in das synthetisierte Nukleotid eingeführt werden.
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Beispiele
eines solchen Markierungsverfahrens, wenn das Oligonukleotid mit
einem Enzym markiert wird, sind derart, dass das Nukleotid mit einem
Verknüpfungsarm
chemisch aus Desoxyuridin synthetisiert wird, um als ein Mitglied
des Oligonukleotids substituiert oder hinzugefügt zu werden (japanische Patent-Offenlegungsschrift
Sho-60/500,717), und alkalische Phosphatase oder Peroxidase ist
an die Verknüpfung
gebunden (Nucleic Acids Research, Volumen 14, Seite 6115, 1986).
Wenn es eine Variation in der Zielnukleinsäuresequenz und dem amplifizierten
Produkt gibt, kann eine Punktmutation, wie eine Deletion, Insertion
oder Substitution in der Sonde anwesend sein.
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Es
ist notwendig, dass die Nachweis-Sonde der vorliegenden Erfindung
durch eine Markierung, wie ein Enzym, Biotin, Fluoreszenzsubstanz
oder radioaktive Substanz oder durch eine Substanz, die fähig ist
die Markierung über
das oben genannte Verfahren zu binden, modifiziert ist. Und ein
Nachweis-Vorgang kann unter Verwendung der Natur der jeweiligen
Markierung durchgeführt
werden.
-
In
einem Nachweis-Verfahren wird das amplifizierte Produkt von der
Zielnukleinsäure,
die von CMV abgeleitet ist, einer Elektrophorese unter Verwendung
eines Agarosegels unterzogen, anschließend wird die Nukleinsäure auf
einer Membran durch Southern Blotten immobilisiert und einer Hybridisierung
mit einer markierten Nachweis-Sonde unterzogen, woraufhin ein Nachweis-Vorgang
in Abhängigkeit
von der Natur der Markierung durchgeführt werden kann. Alternativ
dazu kann ein Nachweis-Vorgang durch das oben genannte Verfahren
nach dem Immobilisieren des amplifizierten Produkts so wie es ist
auf der Membran, gefolgt durch Modifizieren durch ein Alkali, durchgeführt werden.
-
Ein
anderes Nachweis-Verfahren ist eine Sandwich-Technik unter Verwendung
einer Nachweis-Sonde und Einfang-Sonde. Wie bereits erwähnt wurde,
ist es notwendig, dass die Nachweis-Sonde durch ein Enzym, Biotin,
Fluoreszenzsubstanz oder radioaktive Substanz oder durch eine Substanz,
welche fähig
ist an die Markierung zu binden, markiert ist. Obwohl die Einfang-Sonde
unmarkiert bleiben kann, wenn sie an einen Träger adsorbiert ist, kann sie
zusammen mit oder substituiert durch ein Nukleotid mit Biotin, Verknüpfungsarm,
Fluoreszenzsubstanz, etc. hinzugefügt werden, oder sie kann mit
einem oligo-dGTP, oligo-dATP, oligo-dTTP, oligo-dCTP, etc. in Abhängigkeit
von der Natur des Trägers
hinzugefügt
werden.
-
Beispiele
der anwendbaren praktischen Verfahren sind eine Flüssigphasen-Sandwich-Technik
mit einer Zielnukleinsäure,
Nachweis-Sonde und Einfang-Sonde,
in einer flüssigen
Phase, mit einer Einfang-Sonde, die derart modifiziert ist, um das
Einfangen zu ermöglichen,
und anschließend
wird diese modifizierte Einfang-Sonde durch einen Fänger eingefangen,
der auf dem Träger
fixiert ist (japanische Patent-Offenlegungsschriften Sho-61/195699,
Sho-61/274699, Sho-62/229068,
Hei-01/104200, Hei-01/501399, etc.); eine Festphasen-Sandwich-Technik, in der eine
Einfang-Sonde direkt an den Träger
fixiert ist und einer Nachweis-Sonde, die durch eine Markierung
oder eine Substanz, die zur Bindung mit einer Markierung fähig ist,
modifiziert ist (japanische Patent-Offenlegungsschriften Sho-60/188100,
Sho-60/188397, Sho-61/264240, Sho-62/851564, etc.); und Ähnliches.
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Insbesondere
bevorzugt ist eine Einfang-Sonde mit einem Verknüpfungsarm in einer festen Phase
immobilisiert (japanische Patent-Offenlegungsschrift Hei-06/329694), und das
amplifizierte Produkt wird mit einer Nachweis-Sonde hybridisiert,
wodurch der Nachweis durchgeführt
werden kann.
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Als
ein Ergebnis der Verwendung des erfindungsgemäßen Amplifikationsprimers,
der für
ein NASBA-Verfahren geeignet ist, und der Nachweis- und Einfang-Sonden, die das amplifizierte
Produkt, das durch den Primer erhalten wird, bewerten, ist es jetzt
möglich,
die Probleme in herkömmlichen
klinischen Testverfahren für
CMV zu lösen
und das CMV in einer einfachen, schnellen und spezifischen Weise
und auch mit einer hohen Sensitivität nachzuweisen.
-
BEISPIELE
-
Die
vorliegende Erfindung wird jetzt weiter durch die folgenden Beispiele
dargestellt.
-
Beispiel 1
-
(Synthese von Primern)
-
Ein
Phosphoamidit-Verfahren wurde unter Verwendung eines DNA-Synthetisiergeräts Typ 391
(hergestellt von ABI) durchgeführt,
wodurch der erste Primer (SEQ ID NR: 1) mit einer Sequenz, die in
dem Sequenzprotokoll gezeigt ist, (d.h. einer Sequenz, die komplementär ist zu
mRNA von Cytomegalovirus, wobei die Promotorsequenz von T7 RNA-Polymerase
an das 5'-Ende gebunden
ist) und die zweiten Primer (SEQ ID NR: 2, NR: 3 und NR: 4) mit
einer Sequenz, die homolog ist zu mRNA von Cytomegalovirus, synthetisiert
wurden. Das spezifische Mittel in Übereinstimmung mit dem Handbuch
von ABI wurde in einem Maßstab
von 0,2 M durchgeführt.
Das Entblockieren von verschiedenen Oligonukleotiden wurde mit wässrigem
Ammoniak über
Nacht bei 55°C
durchgeführt.
Die Reinigung wurde mit Hilfe einer FPLC (hergestellt von Pharmacia)
unter Verwendung einer reversen Phase Säule durchgeführt.
-
(Herstellung von RNA von
mit CMV infizierten Zellen)
-
Nach
einem Verfahren von Boom et al. (J. Clin. Microbiol. 28:495–503) wurde
RNA von den Zellen hergestellt, die mit CMV (AD 169 Stamm) infiziert
waren. So wurde kultivierte Zellflüssigkeit in einem Puffer zum Lösen behandelt,
der Triton X-100 und Guanidinthiocyanat (GuSCN) enthält, und
Silikapartikel wurden dazu hinzugefügt, um mRNA daran zu adsorbieren.
Die mRNA-adsorbierten Silikapartikel wurden zweimal mit einem Waschpuffer
mit GuSCN, zweimal mit 70% Ethanol und einmal mit Aceton gewaschen,
und der Rückstand
wurde getrocknet. Die Elution wurde unter Verwendung von destilliertem
Wasser, das weder Ribonuklease (RNase) noch Desoxyribonuklease (DNase)
enthielt, durchgeführt.
Das Eluat wurde einer Gradientenverdünnung mit demselben destillierten
Wasser unterzogen.
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(Herstellung einer Nachweis-Sonde)
-
(1) Synthese von CMV-nachweisendem
Oligonukleotid mit einem Verknüpfungsarm
-
Nukleinsäuresequenzen,
die in dem Sequenzprotokoll gezeigt sind, d.h. die Nachweis-Sonden
(SEQ ID NR: 5, NR: 6 und NR: 7) wurden durch ein Phosphoamidit-Verfahren
unter Verwendung eines Synthetisiergeräts (Typ 391, hergestellt von
Perkin-Elmer) synthetisiert. Zu dieser Zeit wurde ein DNA-Synthetisierverfahren,
das in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift Sho-60/500717 erwähnt ist,
durchgeführt,
wodurch das Uridin mit einem Verknüpfungsarm an der 5'-Position und das
chemisch aus Desoxyuridin synthetisiert wurde, in das oben genannte
Oligonukleotid eingeführt.
Dieses Uridin kann gegen irgendein T in dem Oligonukleotid substituiert
werden, aber in diesem Beispiel war es an ein 5'-Ende gebunden. Das Entblockieren des
synthetisierten Verknüpfungs-Oligonukleotids
wurde bei 55°C über Nacht
unter Verwendung von wässrigem
Ammoniak durchgeführt.
Die Reinigung wurde mit Hilfe einer FPLC (hergestellt von Pharmacia)
unter Verwendung einer reversen Phase Säule durchgeführt.
-
(2) Markieren von Verknüpfungs-Oligonukleotid
mit alkalischer Phosphatase
-
Eine
alkalische Phosphatase wurde über
eine Verknüpfungsstelle
des oben genannten Verknüpfungs-Oligonukleotids
gemäß einem
Literaturverfahren gebunden (Nucleic Acids Research, Vol. 14, S.
6114, 1986). Das Verknüpfungs-Oligonukleotid 1,5
A260 wurde in 12,5 μl 0,2 M Natriumbicarbonat gelöst, 25 μl 10 mg Succinimidylsuberat
(DSS) wurde dazu hinzugefügt,
und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für zwei Minuten durchgeführt. Die
Reaktionslösung
wurde einer Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex G-25 Säule, die
mit 1 mM Natriumacetat (pH = 5,0) äquilibriert worden war, um
einen Überschuss
an DSS zu entfernen, unterzogen.
-
Das
Verknüpfungs-Oligonukleotid,
in dem die endständige
Aminogruppe aktiviert war, wurde weiter bei Raumtemperatur für 16 Stunden
mit einer alkalischen Phosphatase (die in 100 mM Natriumbicarbonat
und 3M HCl gelöst
war) in einer 2-fachen Menge bezüglich
des molaren Verhältnisses
umgesetzt, was eine Sonde, die mit einer alkalischen Phosphatase
markiert war, ergab. Die resultierende markierte Sonde wurde mit
Hilfe einer FPLC (hergestellt von Pharmacia) unter Verwendung einer
Säule eines
Anionenaustauschharzes gereinigt, und die Fraktionen, welche die
gereinigte markierte Sonde enthielten, wurden gesammelt, und mit
Hilfe einer Ultrafiltration unter Verwendung von Centricon 30K (Amicon)
konzentriert.
-
(Amplifikationsreaktion)
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Die
Amplifikationsreaktion wurde gemäß einer
Literaturstelle durchgeführt
(J. Virol. Methods 35:273–286).
So wurde in einem Reaktionssystem von 25 μl eine Anordnung durchgeführt, um
die Endkonzentrationen nach Hinzufügen des Enzyms wie folgt zu
gestalten. Es sind dies 40 mM Tris (pH 8,5); 20 mM Magnesiumchlorid;
40 mM Kaliumchlorid; 5 mM DTT; 15% DMSO; 1 mM dNTP; 4,1 mM rNTP;
0,2 μM des
ersten Primers; und 0,2 μM
des zweiten Primers. Dann wurde es mit der extrahierten RNA gemischt,
gefolgt von Erhitzen bei 65°C
für fünf Minuten.
Anschließend
wurden 2,5 μg
BSA, 12 U RNA Guard, 20 U T7 RNA-Polymerase, 4 U AMV reverse Transkriptase
und 0,2 U Ribonuklease H (RNase H) hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von
25 μl zu
ergeben, gefolgt von Inkubieren für drei Stunden.
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(Nachweis)
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Die
Reaktionslösung
(1 μl auf
eine Nylonmembran getropft, und die Nukleinsäure wurde unter einer alkalischen
Bedingung immobilisiert. Diese Membran wurde neutralisiert und unter
einer alkalischen Bedingung immobilisiert. Danach wurde die Membran
neutralisiert, sie wurde in einen Hybridisierungsbeutel transferiert,
ein Hybridisierungspuffer (5 × SSC;
0,5% BSA, 0,5% PVP und 1% SDS) mit der oben genannten Nukleinsäure-Sonde,
die mit einer alkalischen Phosphatase markiert war, wurde hinzugefügt, und
eine Hybridisierung wurde bei 50°C
für 15
Minuten durchgeführt.
Die Nylonmembran wurde aus dem Hybridisierungsbeutel herausgenommen
und einem osmotischem Waschen mit einer Detergenzlösung 1 (1 × SSC; 1%
SDS) bei 50°C
für zehn
Minuten unterzogen. Sie wurde weiterhin einem osmotischem Waschen
mit einer Detergenzlösung
2 (1 × SSC)
bei Raumtemperatur für
zehn Minuten unterzogen. Die Membran wurde in einen neuen Hybridisierungsbeutel
transferiert, eine Substratlösung
(0,1 M Tris, 0,1 M Natriumchlorid, 0,1 M Magnesiumchlorid, 0,3 M
Magnesiumchlorid, Nitroblau-Tetrazolium und 0,3 mg/ml Bromchlorphenylphosphat;
pH 7,5) wurde dazu hinzugefügt,
und die Mischung wurde versiegelt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert.
-
(Ergebnisse)
-
Die
Ergebnisse der Untersuchung der Kombination von jedem der Primer
mit jeder der Sonden ist in Figur angegeben. Die Nachweis-Sensitivität war am
höchsten,
wenn die Sequenz von SEQ ID NR: 1 des Sequenzprotokolls als der
erste Primer und jene von SEQ ID NR: 3 oder NR: 4 des Sequenzprotokolls
als der zweite Pri mer verwendet wurden. Wenn die Sequenz von SEQ
ID NR: 2 des Sequenzprotokolls als der zweite Primer verwendet wurde,
war die Nachweis-Sensitivität
sehr gering, aber in dem Nachweis von CMV gibt es einige Fälle, in
denen eine niedrige Sensitivität
bevorzugt ist, was von dem Zustand einer Krankheit abhängt. Demzufolge
ist eine optimale Kombination in Abhängigkeit von der benötigten Nachweis-Sensitivität auszuwählen.
-
Beispiel 2
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(Synthese von Primern)
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Der
erste Primer (SEQ ID NR: 1) mit einer Sequenz, die in dem Sequenzprotokoll
angegeben ist, d.h. einer Sequenz komplementär zu mRNA von Cytomegalovirus,
die eine Promotorsequenz (AAT TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG GA)
der T7 RNA-Polymerase an dem 5'-Ende
bindet, und der zweite Primer (SEQ ID NR: 4) mit einer Sequenz homolog
zu mRNA von Cytomegalovirus wurden durch ein Phosphoamidit-Verfahren
unter Verwendung eines DNA-Synthetisiergeräts (Typ 391), das von Perkin-Elmer
hergestellt wurde, synthetisiert. Spezifische Mittel wurden in Übereinstimmung
mit dem Anleitungshandbuch von Perkin-Elmer durchgeführt, und
sie wurden in einem 0,2 M Maßstab
durchgeführt.
Das Entblockieren von verschiedenen Oligonukleotiden wurde bei 55°C über Nacht
unter Verwendung von wässrigem
Ammoniak durchgeführt.
Die Reinigung wurde unter Verwendung einer FPLC (hergestellt von
Pharmacia) unter Verwendung einer reversen Phase Säule durchgeführt.
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(Synthese der Einfang-Sonde)
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Sequenzen,
die in dem Sequenzprotokoll gezeigt sind, d.h. Einfang-Sonden (SEQ
ID NR: 5, NR: 6 und NR: 7) wurden durch ein Phosphoamidit-Verfahren
unter Verwendung eines DNA-Synthetisiergeräts (Modell 391), das von Perkin-Elmer
hergestellt wurde, hergestellt. In dieser Synthese wurde Uridin
mit einem Verknüpfungsarm
an der 5-Position und chemisch aus Desoxyuridin synthetisiert, in
das oben genannte Oligonukleotid gemäß einem synthetischen Verfahren,
das in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift Sho-60/500717
erwähnt
ist, eingeführt.
Dieses Uridin kann gegen irgendein T in dem Oligonukleotid ausgetauscht
werden und, in diesem Beispiel, war es an das 5'-Ende gebunden. Das Entblockieren des
synthetisierten Verknüpfungs-Oligonukleotids
wurde bei 55°C über Nacht
unter Verwendung von wässrigem
Ammoniak durchgeführt.
Die Reinigung wurde mit Hilfe einer FPLC (hergestellt von Pharmacia)
unter Verwendung einer reversen Phase Säule durchgeführt.
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(Bindung der Einfang-Sonde
an den Festphasen-Träger)
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Eine
Mikrotiterplatte aus Polystyren (Mikrolite 2, hergestellt von Dynatec)
wurde als ein Festphasen-Träger
verwendet. Die Einfang-Sonde wurde zu einem Ausmaß von 10
pmol/ml unter Verwendung von 50 mM Boratpuffer verdünnt. Jeweils
100 μl der
Lösung
wurden in eine Vertiefung der Mikrotiterplatte gegeben und bei Raumtemperatur
für eine
Nacht inkubiert. Die Einfang-Sondenlösung wurde von der resultierenden Platte
unter Verwendung eines Aspirators entfernt und, um eine unspezifische
Bindung zu vermeiden, wurde jeweils 150 μl Blockpuffer hinzugefügt, gefolgt
von Stehen lassen bei Raumtemperatur für zwei Stunden zum Blocken.
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(Amplifikationsreaktion)
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Für die Zielnukleinsäure wurde
die 1000-fach verdünnte
Lösung
der verdünnten
Gradientenlösung
der Nukleinsäure,
die im Beispiel 1 verwendet wurde, verwendet. Die Zielnukleinsäure wurde
einer Amplifikationsreaktion auf dieselbe Weise wie in Beispiel
1 unterzogen.
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(Nachweis mit Hilfe einer
Sandwich-Hybridisierungs-Technik)
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Das
resultierende amplifizierte Produkt wurde mit einer äquivalenten
Menge an 0,6 N NaOH bei Raumtemperatur für eine Minute denaturiert.
Der Blockpuffer wurde von einer Platte entfernt, die mit einer Einfang-Sonde
fixiert wurde, und 10 μl
der denaturierten Sonde wurden dazu hinzugefügt. Anschließend wurden 100 μl eines Hybridisierungspuffers
hinzugefügt,
und eine Hybridisierung wurde bei 50°C für 60 Minuten durchgeführt. Die
Lösung
wurde aus der Vertiefung entfernt und mit 200 μl einer Detergenzlösung 1 (2 × SSC; 1% Natriumlaurylsulfat)
bei 50°C
für fünf Minuten
gewaschen. Anschließend
wurde die Detergenzlösung
1 entfernt, die Innenseite der Vertiefung wurde mit 200 μl 1 × SSC gespült, anschließend wurden
100 μl einer
Sondenlösung,
die mit einer alkalischen Phosphatase markiert war, hinzugefügt, und
eine Hybridisierung wurde bei 50°C
für 60
Minuten durchgeführt.
Die Sondenlösung
wurde aus der Vertiefung entfernt, 200 μl der Detergenzlösung 1 wurden
hinzugefügt,
ein Waschen wurde bei 50°C
für zehn
Minuten durchgeführt,
anschließend wurden
200 μl Detergenzlösung 2 (1 × SSC; 0,5%
Triton X-100) hinzugefügt, und
ein Waschschritt wurde bei Raumtemperatur für zehn Minuten durchgeführt. Schließlich wurde
die Innenseite der Vertiefung mit 200 μl 1 × SSC gespült, 100 μl Lumiphos 480 (hergestellt
von Wako Pure Chemical; eine Chemolumineszenzsubstanz, die ein Substrat
für eine
alkalische Phosphatase ist) wurde hinzugefügt, und eine Lumineszenzreaktion
wurde an einem dunklen Ort bei 37°C
für 15
Minuten durchgeführt.
Die Lumineszenzmenge wurde durch eine Mikrolite 1000 (hergestellt
von Dynatec) gemessen.
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(Wirkungen)
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Kombinationen
jeder der Nachweis-Sonden mit jeder der Einfang-Sonden wurden untersucht
(Tabelle 2). Obwohl es einige Unterschiede in dem nachgewiesenen
Mengen unter den Kombinationen gab, konnte das amplifizierte Produkt
in allen der Kombinationen nachgewiesen werden. Die höchste Nachweis-Sensitivität wurde
in dem Fall erreicht, in dem SEQ ID NR: 5 eine Einfang-Sonde und
SEQ ID NR: 7 eine Nachweis-Sonde war. In einem Nachweis-System,
in dem eine geringe Nachweismenge notwendig ist, müssen Kombinationen verwendet
werden, die niedrige Nachweiswerte ergeben. Mit anderen Worten muss
eine Kombination gewählt werden,
die optimal ist für
die notwendige Nachweis-Sensitivität.
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