JP2002142765A - 新規ゲノム解析法 - Google Patents
新規ゲノム解析法Info
- Publication number
- JP2002142765A JP2002142765A JP2000334935A JP2000334935A JP2002142765A JP 2002142765 A JP2002142765 A JP 2002142765A JP 2000334935 A JP2000334935 A JP 2000334935A JP 2000334935 A JP2000334935 A JP 2000334935A JP 2002142765 A JP2002142765 A JP 2002142765A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- dna
- sequence
- amplification
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】新規なトランスクリプトーム解析法を提供する
とともに、かかる方法によって見出される遺伝子や該遺
伝子がコードする蛋白質を提供する。 【解決手段】任意生物種のゲノム中に存在する、連続し
た任意のＤＮＡ配列であって、塩基配列は既知であるが
遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮＡ配列（特
定領域）について、前記生物種由来のＲＮＡ中に該領域
の塩基配列に対応する塩基配列が存在するか否かを検出
することにより、該特定領域が遺伝子発現部位であるか
否かを決定する方法、そして該方法を繰り返し行うこと
による、ゲノム上の任意の領域又はゲノム全体を対象と
する遺伝子発現部位決定法。
とともに、かかる方法によって見出される遺伝子や該遺
伝子がコードする蛋白質を提供する。 【解決手段】任意生物種のゲノム中に存在する、連続し
た任意のＤＮＡ配列であって、塩基配列は既知であるが
遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮＡ配列（特
定領域）について、前記生物種由来のＲＮＡ中に該領域
の塩基配列に対応する塩基配列が存在するか否かを検出
することにより、該特定領域が遺伝子発現部位であるか
否かを決定する方法、そして該方法を繰り返し行うこと
による、ゲノム上の任意の領域又はゲノム全体を対象と
する遺伝子発現部位決定法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、塩基配列は既知
であるが遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮＡ
配列（特定領域）に対する遺伝子発現部位決定法、及
び、それを繰り返し行うことによるゲノム上の任意の領
域あるいはゲノム全体を対象とした遺伝子発現部位決定
法に関するものである。また本願発明は、かかる方法に
基づいて遺伝子発現部位であることが決定されたゲノム
中の遺伝子及び該遺伝子がコードする蛋白質に関するも
のである。
であるが遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮＡ
配列（特定領域）に対する遺伝子発現部位決定法、及
び、それを繰り返し行うことによるゲノム上の任意の領
域あるいはゲノム全体を対象とした遺伝子発現部位決定
法に関するものである。また本願発明は、かかる方法に
基づいて遺伝子発現部位であることが決定されたゲノム
中の遺伝子及び該遺伝子がコードする蛋白質に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】３０億塩基から成るヒトゲノムを含め、
各生物種のゲノムの塩基配列が明らかになりつつあると
ともに、いわゆるポストゲノムが展開されている。ポス
トゲノムの目標は、生物が一生涯にわたって生成するす
べての蛋白質の種類と活性を理解することである。更
に、ヒトのポストゲノムの主要な目標は、遺伝子機能解
析に基づく新規医薬の開発（ゲノム創薬）やテーラーメ
ード医療の基盤確立である（ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２７８巻、６８０頁、１９９７年参照）。
各生物種のゲノムの塩基配列が明らかになりつつあると
ともに、いわゆるポストゲノムが展開されている。ポス
トゲノムの目標は、生物が一生涯にわたって生成するす
べての蛋白質の種類と活性を理解することである。更
に、ヒトのポストゲノムの主要な目標は、遺伝子機能解
析に基づく新規医薬の開発（ゲノム創薬）やテーラーメ
ード医療の基盤確立である（ＤｅＲｉｓｉら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２７８巻、６８０頁、１９９７年参照）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】ポストゲノムにおい
て、特にＲＮＡの発現様式はトランスクリプトームと呼
ばれている。トランスクリプトーム解析において、ゲノ
ム上の全遺伝子を同定することは重要な問題である。ゲ
ノムのＤＮＡ配列が明らかになったからといって、遺伝
子は同定されない。
て、特にＲＮＡの発現様式はトランスクリプトームと呼
ばれている。トランスクリプトーム解析において、ゲノ
ム上の全遺伝子を同定することは重要な問題である。ゲ
ノムのＤＮＡ配列が明らかになったからといって、遺伝
子は同定されない。
【０００４】ヒトゲノム上の遺伝子はおよそ１０万と推
定されているが、現在までのところ明らかになったもの
は６千に過ぎない。残りの遺伝子の中に重要な役割をも
つものがあったとしても、これらを同定することは困難
である。
定されているが、現在までのところ明らかになったもの
は６千に過ぎない。残りの遺伝子の中に重要な役割をも
つものがあったとしても、これらを同定することは困難
である。
【０００５】（１）例えば、２次元電気泳動において
は、希少な蛋白質は大量に存在するハウスキーピング蛋
白質の中に容易に紛れ込み、見分けることは実際上不可
能である。またｃＤＮＡライブラリーの解析においても
同様で、希少なｃＤＮＡが選択され、塩基配列決定に供
されることは確率的に極めて低い。しかも、これらの方
法では、全遺伝子の同定を目標とした場合の、現時点で
の到達度を知ることはできない。
は、希少な蛋白質は大量に存在するハウスキーピング蛋
白質の中に容易に紛れ込み、見分けることは実際上不可
能である。またｃＤＮＡライブラリーの解析においても
同様で、希少なｃＤＮＡが選択され、塩基配列決定に供
されることは確率的に極めて低い。しかも、これらの方
法では、全遺伝子の同定を目標とした場合の、現時点で
の到達度を知ることはできない。
【０００６】（２）例えば、マイクロアレイは、数千種
のｃＤＮＡを結合したチップを用いて同定を行おうとす
るものであるが、結合されたｃＤＮＡはすでに同定され
たものだけであるから、従来知られていない新たな遺伝
子が同定されることはない。
のｃＤＮＡを結合したチップを用いて同定を行おうとす
るものであるが、結合されたｃＤＮＡはすでに同定され
たものだけであるから、従来知られていない新たな遺伝
子が同定されることはない。
【０００７】（３）また例えば、コンピューターにより
新たに遺伝子を同定する試みも報告され（Ｂｏｒｋら、
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１８巻、３１３頁、１９
９８年参照）、これを行うためのプログラムとしてＧＲ
ＡＩＬ、ＨＥＸＯＮ、ＧＥＮＳＣＡＮ等が提供されてい
る。しかし、トランスクリプトーム解析では、予想では
なく実験データに基づく遺伝子の同定が強く望まれるこ
とは言うまでもない。
新たに遺伝子を同定する試みも報告され（Ｂｏｒｋら、
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．、１８巻、３１３頁、１９
９８年参照）、これを行うためのプログラムとしてＧＲ
ＡＩＬ、ＨＥＸＯＮ、ＧＥＮＳＣＡＮ等が提供されてい
る。しかし、トランスクリプトーム解析では、予想では
なく実験データに基づく遺伝子の同定が強く望まれるこ
とは言うまでもない。
【０００８】そこで本願発明の目的は、新規トランスク
リプトーム解析法を提供するとともに、かかる方法によ
って見出される遺伝子や該遺伝子がコードする蛋白質を
提供しようとするものである。
リプトーム解析法を提供するとともに、かかる方法によ
って見出される遺伝子や該遺伝子がコードする蛋白質を
提供しようとするものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、任意生物種のゲノム
中に存在する、連続した任意のＤＮＡ配列であって、塩
基配列は既知であるが遺伝子発現部位であるか否か不明
であるＤＮＡ配列（特定領域）について、前記生物種由
来のＲＮＡ中に該領域の塩基配列に対応する塩基配列が
存在するか否かを検出することにより、該特定領域が遺
伝子発現部位であるか否かを決定する方法である。本願
請求項２の発明は、請求項１の発明に関し、前記特定領
域が１００〜２００塩基のＤＮＡ領域であることを特徴
とする。
になされた本願請求項１の発明は、任意生物種のゲノム
中に存在する、連続した任意のＤＮＡ配列であって、塩
基配列は既知であるが遺伝子発現部位であるか否か不明
であるＤＮＡ配列（特定領域）について、前記生物種由
来のＲＮＡ中に該領域の塩基配列に対応する塩基配列が
存在するか否かを検出することにより、該特定領域が遺
伝子発現部位であるか否かを決定する方法である。本願
請求項２の発明は、請求項１の発明に関し、前記特定領
域が１００〜２００塩基のＤＮＡ領域であることを特徴
とする。
【００１０】本願請求項３の発明は、前記請求項１又は
２の発明に関し、前記検出が、前記特定領域中の５’端
に位置する、連続した少なくとも１０塩基以上から成る
配列と相同なオリゴヌクレオチド、及び、前記特定領域
中の３’端に位置する、連続した少なくとも１０塩基以
上から成る配列と相補的なオリゴヌクレオチド、を用
い、前記生物種由来であるＲＮＡに基づくＤＮＡ又はＲ
ＮＡの増幅操作により、ＤＮＡ又はＲＮＡが増幅された
か否かを検出することからなる。本願請求項４の発明
は、前記請求項３又は４の発明に関し、前記増幅がＲＮ
Ａの増幅であり、前記オリゴヌクレオチドであって、い
ずれか一方はその５’端にＲＮＡを転写可能なプロモー
ター配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、（１）Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記生物種由来
であるＲＮＡを鋳型として、前記一方のオリゴヌクレオ
チドから前記生物種由来のＲＮＡの一部に相補的なＤＮ
Ａを合成し、その結果ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが生
成され、（２）リボヌクレエースＨによって前記ＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリッドの前記生物種由来であるＲＮＡを
分解して１本鎖ＤＮＡが生成され、（３）ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースにより、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、前記他方のオリゴヌクレオチドから前記１本鎖Ｄ
ＮＡに相補的なＤＮＡが合成され、その結果前記生物種
由来のＲＮＡの一部であるＲＮＡ又はその一部に相補的
なＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖
ＤＮＡが生成され、（４）ＲＮＡポリメレースにより、
前記２本鎖ＤＮＡからＲＮＡ転写産物が生成され、そし
て（５）該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記（１）から
（４）が繰り返される、とのＲＮＡ増幅であることを特
徴とする。
２の発明に関し、前記検出が、前記特定領域中の５’端
に位置する、連続した少なくとも１０塩基以上から成る
配列と相同なオリゴヌクレオチド、及び、前記特定領域
中の３’端に位置する、連続した少なくとも１０塩基以
上から成る配列と相補的なオリゴヌクレオチド、を用
い、前記生物種由来であるＲＮＡに基づくＤＮＡ又はＲ
ＮＡの増幅操作により、ＤＮＡ又はＲＮＡが増幅された
か否かを検出することからなる。本願請求項４の発明
は、前記請求項３又は４の発明に関し、前記増幅がＲＮ
Ａの増幅であり、前記オリゴヌクレオチドであって、い
ずれか一方はその５’端にＲＮＡを転写可能なプロモー
ター配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、（１）Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記生物種由来
であるＲＮＡを鋳型として、前記一方のオリゴヌクレオ
チドから前記生物種由来のＲＮＡの一部に相補的なＤＮ
Ａを合成し、その結果ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが生
成され、（２）リボヌクレエースＨによって前記ＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリッドの前記生物種由来であるＲＮＡを
分解して１本鎖ＤＮＡが生成され、（３）ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースにより、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、前記他方のオリゴヌクレオチドから前記１本鎖Ｄ
ＮＡに相補的なＤＮＡが合成され、その結果前記生物種
由来のＲＮＡの一部であるＲＮＡ又はその一部に相補的
なＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖
ＤＮＡが生成され、（４）ＲＮＡポリメレースにより、
前記２本鎖ＤＮＡからＲＮＡ転写産物が生成され、そし
て（５）該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記（１）から
（４）が繰り返される、とのＲＮＡ増幅であることを特
徴とする。
【００１１】本願請求項５の発明は、前記請求項３又は
４の発明に関し、前記ＤＮＡ又はＲＮＡが増幅されたか
否かの検出が、前記増幅を、増幅により生成されるＤＮ
Ａ又はＲＮＡと特異的に結合可能であり、かつ、インタ
ーカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチ
ドプローブ（ただし該オリゴヌクレオチドは前記オリゴ
ヌクレオチドのいずれとも相補結合を形成しない配列で
ある）存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定
することによって行うことを特徴とする。本願請求項６
の発明は、前記請求項５の発明に関し、前記プローブが
増幅により生じるＤＮＡ転写産物又はＲＮＡ転写産物の
少なくとも一部の配列と相補結合し、複合体を形成して
いない場合と比較して蛍光特性が変化するものであるこ
とを特徴とする。
４の発明に関し、前記ＤＮＡ又はＲＮＡが増幅されたか
否かの検出が、前記増幅を、増幅により生成されるＤＮ
Ａ又はＲＮＡと特異的に結合可能であり、かつ、インタ
ーカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチ
ドプローブ（ただし該オリゴヌクレオチドは前記オリゴ
ヌクレオチドのいずれとも相補結合を形成しない配列で
ある）存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定
することによって行うことを特徴とする。本願請求項６
の発明は、前記請求項５の発明に関し、前記プローブが
増幅により生じるＤＮＡ転写産物又はＲＮＡ転写産物の
少なくとも一部の配列と相補結合し、複合体を形成して
いない場合と比較して蛍光特性が変化するものであるこ
とを特徴とする。
【００１２】本願請求項７の発明は、前記請求項１〜６
の発明を繰り返し行うことによる、ゲノム上の任意の領
域あるいはゲノム全体を対象とした遺伝子発現部位決定
法である。本願請求項８の発明は、前記請求項１〜７の
発明により遺伝子発現部位であることが決定された、ゲ
ノム中の遺伝子である。そして本願請求項９の発明は、
請求項８の遺伝子がコードする蛋白質である。以下、本
願発明を詳細に説明する。
の発明を繰り返し行うことによる、ゲノム上の任意の領
域あるいはゲノム全体を対象とした遺伝子発現部位決定
法である。本願請求項８の発明は、前記請求項１〜７の
発明により遺伝子発現部位であることが決定された、ゲ
ノム中の遺伝子である。そして本願請求項９の発明は、
請求項８の遺伝子がコードする蛋白質である。以下、本
願発明を詳細に説明する。
【００１３】本願発明の方法は、任意生物種のゲノム中
に存在する、連続した任意のＤＮＡ配列であって、塩基
配列は既知であるが遺伝子発現部位であるか否か不明で
あるＤＮＡ配列（特定領域）に適用される。かかる特定
領域は、公開されているゲノムのＤＮＡ配列から選択
し、設定することができる。
に存在する、連続した任意のＤＮＡ配列であって、塩基
配列は既知であるが遺伝子発現部位であるか否か不明で
あるＤＮＡ配列（特定領域）に適用される。かかる特定
領域は、公開されているゲノムのＤＮＡ配列から選択
し、設定することができる。
【００１４】前記特定領域の長さは特に制限されない
が、２００塩基以下、特に１００〜２００塩基の範囲が
好ましい。本願発明の方法では、任意に設定した特定領
域全体がひとつのエキソンに含まれる場合のみ、該特定
領域が遺伝子発現部位であるか否かを決定することが可
能である。遺伝子上のエキソンの数や各エキソンの長さ
は、遺伝子の種類によって大きく異なるが、終止コドン
とポリＡ連結シグナルを含むエキソンはどの遺伝子にも
ひとつあり、通常、他のエキソンよりも長く、４００塩
基対を超える。従って、任意のゲノム領域を２００塩基
対以下の特定領域に断片化すれば、少なくともひとつの
断片はエキソンに含まれるため、見落とすことがないの
である。
が、２００塩基以下、特に１００〜２００塩基の範囲が
好ましい。本願発明の方法では、任意に設定した特定領
域全体がひとつのエキソンに含まれる場合のみ、該特定
領域が遺伝子発現部位であるか否かを決定することが可
能である。遺伝子上のエキソンの数や各エキソンの長さ
は、遺伝子の種類によって大きく異なるが、終止コドン
とポリＡ連結シグナルを含むエキソンはどの遺伝子にも
ひとつあり、通常、他のエキソンよりも長く、４００塩
基対を超える。従って、任意のゲノム領域を２００塩基
対以下の特定領域に断片化すれば、少なくともひとつの
断片はエキソンに含まれるため、見落とすことがないの
である。
【００１５】本願発明では、ゲノム上に存在する、連続
した任意のＤＮＡ配列を特定領域として以下のような検
出を実施するものであるが、ゲノム上の任意の領域又は
ゲノム全体を断片化し、各断片を特定領域として検出を
繰り返せば、当該任意の領域あるいはゲノム全体につい
て、遺伝子発現部位を決定することができる。
した任意のＤＮＡ配列を特定領域として以下のような検
出を実施するものであるが、ゲノム上の任意の領域又は
ゲノム全体を断片化し、各断片を特定領域として検出を
繰り返せば、当該任意の領域あるいはゲノム全体につい
て、遺伝子発現部位を決定することができる。
【００１６】本願発明は、同一生物種由来のＲＮＡ中
に、前記特定領域の塩基配列に対応する塩基配列が存在
するか否かを検出することにより、該特定領域が遺伝子
発現部位であるか否かを決定するものである。本願発明
に用いるＲＮＡはｍＲＮＡであり、遺伝子発現部位を決
定しようとするゲノムと同一の生物種由来のものを用い
る。特に前記ゲノムが高等生物のゲノムである場合に
は、多種類の、好ましくは全組織由来のｍＲＮＡを用い
ることが好ましい。この場合、ｍＲＮＡは組織ごとに個
別に用いてもよいし、混合して用いてもよい。後者にお
いて遺伝子発現部位であることがわかった場合は、その
後にｍＲＮＡを組織ごとのｍＲＮＡを用いて個別に用い
れば、遺伝子発現部位であることが決定されたゲノム中
の遺伝子が、どの組織で発現しているかを知ることがで
きる。ｍＲＮＡを混合することが可能な理由は以下の通
りである。ｍＲＮＡの平均分子量を３００，０００とす
ると、１ｎｇのｍＲＮＡは２×１０9個のｍＲＮＡを含
む。すると、１０００種類の組織のうち１種類において
のみ発現する遺伝子で、その発現量が該組織中のｍＲＮ
Ａの１０万分の１という割合であっても、該組織を含む
１０００種類の組織からそれぞれ得られたｍＲＮＡの等
量混合物１μｇ中には２×１０4コピー存在することに
なる。このコピー数は、後の実施例に示すように、十分
検出可能である。
に、前記特定領域の塩基配列に対応する塩基配列が存在
するか否かを検出することにより、該特定領域が遺伝子
発現部位であるか否かを決定するものである。本願発明
に用いるＲＮＡはｍＲＮＡであり、遺伝子発現部位を決
定しようとするゲノムと同一の生物種由来のものを用い
る。特に前記ゲノムが高等生物のゲノムである場合に
は、多種類の、好ましくは全組織由来のｍＲＮＡを用い
ることが好ましい。この場合、ｍＲＮＡは組織ごとに個
別に用いてもよいし、混合して用いてもよい。後者にお
いて遺伝子発現部位であることがわかった場合は、その
後にｍＲＮＡを組織ごとのｍＲＮＡを用いて個別に用い
れば、遺伝子発現部位であることが決定されたゲノム中
の遺伝子が、どの組織で発現しているかを知ることがで
きる。ｍＲＮＡを混合することが可能な理由は以下の通
りである。ｍＲＮＡの平均分子量を３００，０００とす
ると、１ｎｇのｍＲＮＡは２×１０9個のｍＲＮＡを含
む。すると、１０００種類の組織のうち１種類において
のみ発現する遺伝子で、その発現量が該組織中のｍＲＮ
Ａの１０万分の１という割合であっても、該組織を含む
１０００種類の組織からそれぞれ得られたｍＲＮＡの等
量混合物１μｇ中には２×１０4コピー存在することに
なる。このコピー数は、後の実施例に示すように、十分
検出可能である。
【００１７】前記検出には種々の方法が適用可能であ
る。例えばハイブリダイゼーション法や核酸増幅法を適
用することが例示できる。増幅法を用いる場合には、Ｄ
ＮＡ増幅であれ、ＲＮＡ増幅であれ、特定領域に基づい
てデザインされた少なくとも２種類のオリゴヌクレオチ
ド（プライマー）を用いることになるが、一方は特定領
域中の５’端に位置する、連続した少なくとも１０塩基
以上から成る配列と相同なオリゴヌクレオチドであり、
他方は特定領域中の３’端に位置する、連続した少なく
とも１０塩基以上から成る配列と相補的なオリゴヌクレ
オチドである。１０塩基以上のオリゴヌクレオチドを使
用するのは、オリゴヌクレオチドの特定領域への結合に
関して特異性を維持するためである。
る。例えばハイブリダイゼーション法や核酸増幅法を適
用することが例示できる。増幅法を用いる場合には、Ｄ
ＮＡ増幅であれ、ＲＮＡ増幅であれ、特定領域に基づい
てデザインされた少なくとも２種類のオリゴヌクレオチ
ド（プライマー）を用いることになるが、一方は特定領
域中の５’端に位置する、連続した少なくとも１０塩基
以上から成る配列と相同なオリゴヌクレオチドであり、
他方は特定領域中の３’端に位置する、連続した少なく
とも１０塩基以上から成る配列と相補的なオリゴヌクレ
オチドである。１０塩基以上のオリゴヌクレオチドを使
用するのは、オリゴヌクレオチドの特定領域への結合に
関して特異性を維持するためである。
【００１８】核酸増幅法としては、プライマーと逆転写
酵素を用いて前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後
に、プライマーとＤＮＡポリメレースを用いてＤＮＡを
鋳型とするプライマーの伸長反応によりＤＮＡ（特定領
域からなるＤＮＡ）を増幅するＲＴ−ＰＣＲに代表され
るＤＮＡ増幅法や、プライマーと逆転写酵素を用いて前
記ｍＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを
合成した後に、該ＤＮＡに相補的な部分を有するプロモ
ーター・プライマーと結合させ、ＤＮＡの伸長反応を行
い、こうして合成された２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメレ
ースを作用させてＲＮＡ（特定領域からなるＲＮＡ）を
大量に合成するＲＮＡ増幅がある。前者は既に広く一般
に知られた方法であり、後者としては例えばＮＡＳＢＡ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａ
ｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、３ＳＲ法、
後述する実施例の方法が例示できる。
酵素を用いて前記ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後
に、プライマーとＤＮＡポリメレースを用いてＤＮＡを
鋳型とするプライマーの伸長反応によりＤＮＡ（特定領
域からなるＤＮＡ）を増幅するＲＴ−ＰＣＲに代表され
るＤＮＡ増幅法や、プライマーと逆転写酵素を用いて前
記ｍＲＮＡを鋳型として該ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを
合成した後に、該ＤＮＡに相補的な部分を有するプロモ
ーター・プライマーと結合させ、ＤＮＡの伸長反応を行
い、こうして合成された２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメレ
ースを作用させてＲＮＡ（特定領域からなるＲＮＡ）を
大量に合成するＲＮＡ増幅がある。前者は既に広く一般
に知られた方法であり、後者としては例えばＮＡＳＢＡ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａ
ｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、３ＳＲ法、
後述する実施例の方法が例示できる。
【００１９】ＮＡＳＢＡ法や実施例に記載した方法の概
略を説明すれば、前記オリゴヌクレオチドであって、い
ずれか一方はその５’端にＲＮＡを転写可能なプロモー
ター配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、（１）Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記生物種由来
であるＲＮＡを鋳型として、前記一方のオリゴヌクレオ
チドから前記生物種由来のＲＮＡの一部に相補的なＤＮ
Ａを合成し、その結果ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが生
成され、（２）リボヌクレエースＨによって前記ＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリッドの前記生物種由来であるＲＮＡを
分解して１本鎖ＤＮＡが生成され、（３）ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースにより、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、前記他方のオリゴヌクレオチドから前記１本鎖Ｄ
ＮＡに相補的なＤＮＡが合成され、その結果前記生物種
由来のＲＮＡの一部であるＲＮＡ又はその一部に相補的
なＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖
ＤＮＡが生成され、（４）ＲＮＡポリメレースにより、
前記２本鎖ＤＮＡからＲＮＡ転写産物が生成され、そし
て（５）該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記（１）から
（４）が繰り返される、とのＲＮＡ増幅である。
略を説明すれば、前記オリゴヌクレオチドであって、い
ずれか一方はその５’端にＲＮＡを転写可能なプロモー
ター配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、（１）Ｒ
ＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースにより、前記生物種由来
であるＲＮＡを鋳型として、前記一方のオリゴヌクレオ
チドから前記生物種由来のＲＮＡの一部に相補的なＤＮ
Ａを合成し、その結果ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが生
成され、（２）リボヌクレエースＨによって前記ＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリッドの前記生物種由来であるＲＮＡを
分解して１本鎖ＤＮＡが生成され、（３）ＤＮＡ依存性
ＤＮＡポリメレースにより、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、前記他方のオリゴヌクレオチドから前記１本鎖Ｄ
ＮＡに相補的なＤＮＡが合成され、その結果前記生物種
由来のＲＮＡの一部であるＲＮＡ又はその一部に相補的
なＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖
ＤＮＡが生成され、（４）ＲＮＡポリメレースにより、
前記２本鎖ＤＮＡからＲＮＡ転写産物が生成され、そし
て（５）該ＲＮＡ転写産物を鋳型として前記（１）から
（４）が繰り返される、とのＲＮＡ増幅である。
【００２０】実施例に記載した方法は、１０分というき
わめて短時間で増幅が完了するため、短時間内に本願発
明の決定が可能であること、特定領域を含む数ｐｇのＲ
ＮＡをも増幅し得るという、高感度であること、そして
ＲＮＡに混入し得るＤＮＡの影響を排除し得る、という
観点から、特に好ましい検出法として例示できる。
わめて短時間で増幅が完了するため、短時間内に本願発
明の決定が可能であること、特定領域を含む数ｐｇのＲ
ＮＡをも増幅し得るという、高感度であること、そして
ＲＮＡに混入し得るＤＮＡの影響を排除し得る、という
観点から、特に好ましい検出法として例示できる。
【００２１】以上の増幅で生成されるＤＮＡやＲＮＡ
は、電気泳動等の既知の検出方法で検出することができ
るが、特に好ましくは、増幅により生成されるＤＮＡ又
はＲＮＡと特異的に結合可能であり、かつ、インターカ
レーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ存在下で前記増幅を実施し、反応液の蛍光特性の
変化を測定することである。このプローブは、当然なが
ら増幅に使用するオリゴヌクレオチドと相補結合を形成
しない配列である。このオリゴヌクレオチドプローブと
しては、オリゴヌクレオチドのリンにリンカーを介し
て、インターカレーター性蛍光色素を結合させたもの等
を例示できる。この好適なプローブでは、生成されたＤ
ＮＡ又はＲＮＡ、即ち特定領域（又は特定領域と相補的
な配列）と相補結合して２本鎖を形成するとインターカ
レーター性蛍光色素がこの２本鎖部分にインターカレー
トして蛍光特性が変化するため、相補結合を形成しなか
ったプローブを分離する必要がない（Ｉｓｈｉｇｕｒ
ｏ，Ｔ．ら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７）。
は、電気泳動等の既知の検出方法で検出することができ
るが、特に好ましくは、増幅により生成されるＤＮＡ又
はＲＮＡと特異的に結合可能であり、かつ、インターカ
レーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ存在下で前記増幅を実施し、反応液の蛍光特性の
変化を測定することである。このプローブは、当然なが
ら増幅に使用するオリゴヌクレオチドと相補結合を形成
しない配列である。このオリゴヌクレオチドプローブと
しては、オリゴヌクレオチドのリンにリンカーを介し
て、インターカレーター性蛍光色素を結合させたもの等
を例示できる。この好適なプローブでは、生成されたＤ
ＮＡ又はＲＮＡ、即ち特定領域（又は特定領域と相補的
な配列）と相補結合して２本鎖を形成するとインターカ
レーター性蛍光色素がこの２本鎖部分にインターカレー
トして蛍光特性が変化するため、相補結合を形成しなか
ったプローブを分離する必要がない（Ｉｓｈｉｇｕｒ
ｏ，Ｔ．ら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２４（２４）４９９２−４９９７）。
【００２２】前記オリゴヌクレオチドプローブの塩基配
列は、生成されるＤＮＡ又はＲＮＡと相補結合可能な配
列を有すれば特に限定されないが、生成されたＤＮＡ又
はＲＮＡへの結合に関する特異性を維持するため、該Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡ中に存在する、連続した少なくとも１０
塩基と相補的な１０塩基程度のものが好ましい。なお、
オリゴヌクレオチドプローブ存在下で増幅を行う場合に
は、当該プローブをプライマーとした伸長反応を抑える
ために、プローブの３’末端の水酸基を化学的に修飾
（例えばグリコール酸付加）することが好ましい。
列は、生成されるＤＮＡ又はＲＮＡと相補結合可能な配
列を有すれば特に限定されないが、生成されたＤＮＡ又
はＲＮＡへの結合に関する特異性を維持するため、該Ｄ
ＮＡ又はＲＮＡ中に存在する、連続した少なくとも１０
塩基と相補的な１０塩基程度のものが好ましい。なお、
オリゴヌクレオチドプローブ存在下で増幅を行う場合に
は、当該プローブをプライマーとした伸長反応を抑える
ために、プローブの３’末端の水酸基を化学的に修飾
（例えばグリコール酸付加）することが好ましい。
【００２３】特に上記したように、オリゴヌクレオチド
プローブ共存下で増幅を行うことにより、本願発明にお
ける検出の操作を、一反応容器内、一定温度、一段階で
実施することが可能となり、自動化への適用も容易であ
る。
プローブ共存下で増幅を行うことにより、本願発明にお
ける検出の操作を、一反応容器内、一定温度、一段階で
実施することが可能となり、自動化への適用も容易であ
る。
【００２４】本願発明の、遺伝子発現部位決定法を繰り
返し行うことによるゲノム解析法の詳細は以下の通りで
あるが、ゲノム配列が決定されていれば、どの生物種に
も適用可能である。該生物種のゲノムを、例えば２００
塩基対ごとの特定領域に区分する。検出方法として核酸
増幅を利用する場合には、各特定領域を増幅するのに必
要な２種類のオリゴヌクレオチドを含む、必要なプライ
マーセットを準備する。なお、必要なプライマーの数や
その配列は用いる核酸増幅法により異なる。また、過去
の研究において遺伝子発現部位であることがわかってい
る領域に存在する特定領域や、そのＤＮＡ配列から遺伝
子発現部位でありえないことが明白な領域に存在する特
定領域は対象から外すことは、作業の効率を高めるため
に有効である。次に、前述のＲＮＡに対し、特定領域毎
のプライマーセットを用いて検出を行う。
返し行うことによるゲノム解析法の詳細は以下の通りで
あるが、ゲノム配列が決定されていれば、どの生物種に
も適用可能である。該生物種のゲノムを、例えば２００
塩基対ごとの特定領域に区分する。検出方法として核酸
増幅を利用する場合には、各特定領域を増幅するのに必
要な２種類のオリゴヌクレオチドを含む、必要なプライ
マーセットを準備する。なお、必要なプライマーの数や
その配列は用いる核酸増幅法により異なる。また、過去
の研究において遺伝子発現部位であることがわかってい
る領域に存在する特定領域や、そのＤＮＡ配列から遺伝
子発現部位でありえないことが明白な領域に存在する特
定領域は対象から外すことは、作業の効率を高めるため
に有効である。次に、前述のＲＮＡに対し、特定領域毎
のプライマーセットを用いて検出を行う。
【００２５】本願発明の方法によりゲノムを解析すれ
ば、その生物種のすべての遺伝子を同定することもでき
る。また更には、遺伝子発現部位と決定された遺伝子を
単離し、該遺伝子がコードする蛋白質を決定したり、該
蛋白質を前記単離したＤＮＡを利用して製造することが
可能となる。例えば、本願発明の方法により増幅した核
酸をプローブとして用い、常法により完全長のｃＤＮＡ
を単離し、塩基配列を決定することが例示できる。これ
により、該遺伝子発現部位についてのイントロンやエキ
ソンの関係を含むゲノム構造が解明される。これとは別
に、前記増幅された核酸をプローブとして用い、常法に
よりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ｃＤＮ
Ａを単離すれば、該遺伝子がコードする蛋白質を知るこ
とができる。また更にこの蛋白質を発現させる場合は、
常法により、微生物や動物細胞を宿主として、前記ｃＤ
ＮＡを用いて組換え体を調製し、発現させればよい。
ば、その生物種のすべての遺伝子を同定することもでき
る。また更には、遺伝子発現部位と決定された遺伝子を
単離し、該遺伝子がコードする蛋白質を決定したり、該
蛋白質を前記単離したＤＮＡを利用して製造することが
可能となる。例えば、本願発明の方法により増幅した核
酸をプローブとして用い、常法により完全長のｃＤＮＡ
を単離し、塩基配列を決定することが例示できる。これ
により、該遺伝子発現部位についてのイントロンやエキ
ソンの関係を含むゲノム構造が解明される。これとは別
に、前記増幅された核酸をプローブとして用い、常法に
よりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ｃＤＮ
Ａを単離すれば、該遺伝子がコードする蛋白質を知るこ
とができる。また更にこの蛋白質を発現させる場合は、
常法により、微生物や動物細胞を宿主として、前記ｃＤ
ＮＡを用いて組換え体を調製し、発現させればよい。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下に、発明を更に詳細に説明す
るために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限
定されるものではない。
るために実施例を示すが、本願発明はこれら実施例に限
定されるものではない。
【００２７】実施例１ 領域の設定 本願発明で提供される遺伝子発現部位決定法の実現可能
性を示すために、以下のモデル実験を行った。
性を示すために、以下のモデル実験を行った。
【００２８】ゲノム上の領域として、遺伝子工学的に形
質転換されたメタノール資化性酵母の株で、本発明者ら
により特願平１１−１８８６５０号に記載された方法で
樹立したＧ１株由来の９００塩基対から成る領域を選ん
だ。Ｇ１株は、メタノールによる誘導を受けると、３９
７アミノ酸残基の１本のポリペプチド鎖から成るヒトＩ
Ｌ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質（特願平１１−１８８６
５０号参照）を発現する。
質転換されたメタノール資化性酵母の株で、本発明者ら
により特願平１１−１８８６５０号に記載された方法で
樹立したＧ１株由来の９００塩基対から成る領域を選ん
だ。Ｇ１株は、メタノールによる誘導を受けると、３９
７アミノ酸残基の１本のポリペプチド鎖から成るヒトＩ
Ｌ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質（特願平１１−１８８６
５０号参照）を発現する。
【００２９】図１に示すように、該９００塩基対から成
る領域を１８０塩基対から成る５つの特定領域に区分し
た。また、図２には特願平１１−１８８６５０から既に
明らかである、該領域のｍＲＮＡの発現様式を示した。
図１、図２から明らかなように、特定領域１（塩基番号
１〜１８０）は非転写領域１５９塩基対と転写領域２１
塩基対を含む。特定領域２（塩基番号１８１〜３６
０）、特定領域３（塩基番号３６１〜５４０）、特定領
域４（塩基番号５４１〜７２０）、特定領域５（塩基番
号７２１〜９００）はいずれも転写領域のみを含む。
る領域を１８０塩基対から成る５つの特定領域に区分し
た。また、図２には特願平１１−１８８６５０から既に
明らかである、該領域のｍＲＮＡの発現様式を示した。
図１、図２から明らかなように、特定領域１（塩基番号
１〜１８０）は非転写領域１５９塩基対と転写領域２１
塩基対を含む。特定領域２（塩基番号１８１〜３６
０）、特定領域３（塩基番号３６１〜５４０）、特定領
域４（塩基番号５４１〜７２０）、特定領域５（塩基番
号７２１〜９００）はいずれも転写領域のみを含む。
【００３０】上記５つの特定領域それぞれに対し、図１
及び配列番号１〜１５で示されるオリゴヌクレオチド
（プライマー）セット（フォワードプライマー；Ｆ、リ
バースプライマー；Ｒ、シザープローブ；Ｓ）を合成し
た。ＤＮＡ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う場合には、この
うち、フォワードプライマーとリバースプライマーを使
用した。また、ＲＮＡ増幅（ＴＲＣ；Ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｉｎｇ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ；転写逆転写協奏増幅反応と略す）を行う場合に
は、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び
シザープローブを使用した。ＴＲＣでは、特定領域がｍ
ＲＮＡの５’端に位置していないとこれを増幅できな
い。シザープローブは、かかる場合に特定領域の５’側
に相補結合し、リボヌクレアーゼの働きにより相補結合
部分を切断することによって特定領域がｍＲＮＡの５’
側に位置するためのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）であ
る。
及び配列番号１〜１５で示されるオリゴヌクレオチド
（プライマー）セット（フォワードプライマー；Ｆ、リ
バースプライマー；Ｒ、シザープローブ；Ｓ）を合成し
た。ＤＮＡ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う場合には、この
うち、フォワードプライマーとリバースプライマーを使
用した。また、ＲＮＡ増幅（ＴＲＣ；Ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｉｎｇ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ；転写逆転写協奏増幅反応と略す）を行う場合に
は、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び
シザープローブを使用した。ＴＲＣでは、特定領域がｍ
ＲＮＡの５’端に位置していないとこれを増幅できな
い。シザープローブは、かかる場合に特定領域の５’側
に相補結合し、リボヌクレアーゼの働きにより相補結合
部分を切断することによって特定領域がｍＲＮＡの５’
側に位置するためのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）であ
る。
【００３１】実施例２ ｍＲＮＡの調製 以下の方法でＧ１株のｍＲＮＡを調製した。
【００３２】３ｍｌのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓ
ｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔ
ｏｎｅ ２０ｇ／ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
１．３４ｇ／ｌ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
６．０、グリセロール１０ｇ／ｌ、ビオチン０．４ｍｇ
／ｌ）培地に接種し、浸透培養器にて２８℃で２４時間
前培養を行った。
ｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １０ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔ
ｏｎｅ ２０ｇ／ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ
Ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
１．３４ｇ／ｌ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
６．０、グリセロール１０ｇ／ｌ、ビオチン０．４ｍｇ
／ｌ）培地に接種し、浸透培養器にて２８℃で２４時間
前培養を行った。
【００３３】３ｍｌのＢＭＧＹ（Ｂａｃｔｏ Ｙｅａｓ
ｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １５ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔ
ｏｎｅ ３０ｇ／ｌ、その他は上記ＢＭＧＹと同一組
成）培地に前記培養液１００μｌを接種し、２８℃で１
６時間培養を行った。
ｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １５ｇ／ｌ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔ
ｏｎｅ ３０ｇ／ｌ、その他は上記ＢＭＧＹと同一組
成）培地に前記培養液１００μｌを接種し、２８℃で１
６時間培養を行った。
【００３４】メタノールの枯渇を確認後、培地にメタノ
ールを１００μｌ添加し、ヒトＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融
合蛋白質の発現を誘導した。メタノール添加２時間後に
細胞を集め、５×１０7個を直ぐに液体窒素で凍結し
た。
ールを１００μｌ添加し、ヒトＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融
合蛋白質の発現を誘導した。メタノール添加２時間後に
細胞を集め、５×１０7個を直ぐに液体窒素で凍結し
た。
【００３５】これを、市販のキット（Ｙｅａｓｔ ｃｅ
ｌｌ ｌｙｓｉｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ、
ＢＩＯ ０１ Ｉｎｃ．社製）で細胞壁を溶解した。次
に、市販のキット（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アマシャムファルマ
シア社製）を用いてｍＲＮＡを調製した。
ｌｌ ｌｙｓｉｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ、
ＢＩＯ ０１ Ｉｎｃ．社製）で細胞壁を溶解した。次
に、市販のキット（ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アマシャムファルマ
シア社製）を用いてｍＲＮＡを調製した。
【００３６】実施例３ ＤＮＡ増幅によるによる遺伝子
発現部位の決定 実施例２で得られたｍＲＮＡを用いて、ＤＮＡ増幅が遺
伝子発現部位のみから成る領域由来のプライマーに特異
的であるかどうかを調べた。
発現部位の決定 実施例２で得られたｍＲＮＡを用いて、ＤＮＡ増幅が遺
伝子発現部位のみから成る領域由来のプライマーに特異
的であるかどうかを調べた。
【００３７】ＲＴ−ＰＣＲは市販のキット（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ ｂｅａｄｓ、アマシャムファルマシア社製）を用い
た。
Ｒ ｂｅａｄｓ、アマシャムファルマシア社製）を用い
た。
【００３８】すなわち、ｍＲＮＡ ２００ｎｇからオリ
ゴｄＴをプライマーとして４２℃１５分間の反応でｃＤ
ＮＡを合成した。次に、フォワードプライマーとリバー
スプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。サーマルサ
イクラーを用い、約３時間をかけて９５℃１分、５５℃
１分、７２℃２分から成るサイクルを３０サイクル反応
させた。反応後、直ちに４％アガロースで電気泳動を行
い、サイバーグリーンで染色した。
ゴｄＴをプライマーとして４２℃１５分間の反応でｃＤ
ＮＡを合成した。次に、フォワードプライマーとリバー
スプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。サーマルサ
イクラーを用い、約３時間をかけて９５℃１分、５５℃
１分、７２℃２分から成るサイクルを３０サイクル反応
させた。反応後、直ちに４％アガロースで電気泳動を行
い、サイバーグリーンで染色した。
【００３９】図３から明らかなように、特定領域１由来
のプライマーでは増幅は見られなかったが、特定領域２
〜５由来のプライマーではいずれも増幅が見られた。
のプライマーでは増幅は見られなかったが、特定領域２
〜５由来のプライマーではいずれも増幅が見られた。
【００４０】以上の結果は、ＤＮＡ増幅が、遺伝子発現
部位のみから成る特定領域に対するプライマーに特異的
であること、すなわち、任意生物種のゲノム中に存在す
る、連続した任意のＤＮＡ配列であって、塩基配列は既
知であるが遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮ
Ａ配列（特定領域）について、前記生物種由来のＲＮＡ
中に該領域の塩基配列に対応する塩基配列が存在するか
否かをＲＴ−ＰＣＲに代表されるＤＮＡ増幅によって検
出することにより、遺伝子発現部位であるか否かを決定
できることを示す。
部位のみから成る特定領域に対するプライマーに特異的
であること、すなわち、任意生物種のゲノム中に存在す
る、連続した任意のＤＮＡ配列であって、塩基配列は既
知であるが遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮ
Ａ配列（特定領域）について、前記生物種由来のＲＮＡ
中に該領域の塩基配列に対応する塩基配列が存在するか
否かをＲＴ−ＰＣＲに代表されるＤＮＡ増幅によって検
出することにより、遺伝子発現部位であるか否かを決定
できることを示す。
【００４１】 実施例４ ＲＮＡ増幅法による遺伝子発現部位の決定 実施例２で得られたｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ増幅が遺
伝子発現部位のみから成る特定領域由来のプライマーに
特異的であるかどうかを調べた。
伝子発現部位のみから成る特定領域由来のプライマーに
特異的であるかどうかを調べた。
【００４２】（１）ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用い、
２００ｎｇ／５μｌとなるよう希釈した。
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用い、
２００ｎｇ／５μｌとなるよう希釈した。
【００４３】（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを
０．５ｍｌ容のチューブに分注し、これに上記ＲＮＡ試
料５μｌを添加した。
０．５ｍｌ容のチューブに分注し、これに上記ＲＮＡ試
料５μｌを添加した。
【００４４】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１３ｍＭ
ＭｇＣｌ2、９０ｍＭ ＫＣｌ、３９Ｕ ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１ｍＭ ＤＴＴ、各０．２５ｍＭ
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、３．６ｍ
Ｍ ＩＴＰ、各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、
ＴＴＰ、０．１６μＭ シザープローブ、１μＭ フォ
アードプライマー、１μＭ リバースプライマー、１
３％ ＤＭＳＯ、容量調整用蒸留水。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１３ｍＭ
ＭｇＣｌ2、９０ｍＭ ＫＣｌ、３９Ｕ ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１ｍＭ ＤＴＴ、各０．２５ｍＭ
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、３．６ｍ
Ｍ ＩＴＰ、各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、
ＴＴＰ、０．１６μＭ シザープローブ、１μＭ フォ
アードプライマー、１μＭ リバースプライマー、１
３％ ＤＭＳＯ、容量調整用蒸留水。
【００４５】（３）この反応液を６５℃で１５分間保温
し、次に４１℃で５分間保温した後、以下の組成の酵素
液４．２μｌを添加した。
し、次に４１℃で５分間保温した後、以下の組成の酵素
液４．２μｌを添加した。
【００４６】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ソルビトール、３μｇ 牛血清アルブミン、１
４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ社製）、８Ｕ
ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）、容量調整用蒸
留水。
μｌにおける濃度） １．７％ソルビトール、３μｇ 牛血清アルブミン、１
４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ社製）、８Ｕ
ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）、容量調整用蒸
留水。
【００４７】（４）引き続きチューブを４１℃で１０
分、２０分、あるいは３０分保温した。反応後、直ちに
４％アガロースで電気泳動を行い、サイバーグリーンで
染色した。
分、２０分、あるいは３０分保温した。反応後、直ちに
４％アガロースで電気泳動を行い、サイバーグリーンで
染色した。
【００４８】図４から明らかなように、１０分間の反応
（図４ａ）、２０分間の反応（図４ｂ）、３０分間の反
応（図４ｃ）のいずれにおいても、特定領域１に対する
プライマーを用いた場合は増幅は見られなかったが、特
定領域２〜５に対するプライマーを用いた場合はいずれ
も増幅が見られた。
（図４ａ）、２０分間の反応（図４ｂ）、３０分間の反
応（図４ｃ）のいずれにおいても、特定領域１に対する
プライマーを用いた場合は増幅は見られなかったが、特
定領域２〜５に対するプライマーを用いた場合はいずれ
も増幅が見られた。
【００４９】以上の結果は、ＲＮＡ増幅が遺伝子発現部
位のみから成る領域由来のプライマーに特異的であるこ
と、すなわち、任意生物種のゲノム中に存在する、連続
した任意のＤＮＡ配列であって、塩基配列は既知である
が遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮＡ配列
（特定領域）について、前記生物種由来のＲＮＡ中に該
領域の塩基配列に対応する塩基配列が存在するか否かを
前記したＴＲＣに代表されるＲＮＡ増幅によって検出す
ることにより、遺伝子発現部位であるか否かを決定でき
ることを示す。
位のみから成る領域由来のプライマーに特異的であるこ
と、すなわち、任意生物種のゲノム中に存在する、連続
した任意のＤＮＡ配列であって、塩基配列は既知である
が遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮＡ配列
（特定領域）について、前記生物種由来のＲＮＡ中に該
領域の塩基配列に対応する塩基配列が存在するか否かを
前記したＴＲＣに代表されるＲＮＡ増幅によって検出す
ることにより、遺伝子発現部位であるか否かを決定でき
ることを示す。
【００５０】また、実施例３で示したＲＴ−ＰＣＲによ
る増幅がサーマルサイクラーを使用した場合で３時間を
要したのに対し、ＴＲＣによる増幅は１０分でも十分で
あった。
る増幅がサーマルサイクラーを使用した場合で３時間を
要したのに対し、ＴＲＣによる増幅は１０分でも十分で
あった。
【００５１】実施例５ インターカレーター性蛍光色素
で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによる測定 実施例２で得られたｍＲＮＡを用いて、インターカレー
ター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプロー
ブによる測定を行った。
で標識されたオリゴヌクレオチドプローブによる測定 実施例２で得られたｍＲＮＡを用いて、インターカレー
ター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプロー
ブによる測定を行った。
【００５２】（１）ＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用い、
２００ｎｇ／５μｌとなるよう希釈した。
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用い、
２００ｎｇ／５μｌとなるよう希釈した。
【００５３】（２）以下の組成の反応液２０．８μｌを
０．５ｍｌ容のチューブに分注し、これに上記ＲＮＡ試
料５μｌを添加した。
０．５ｍｌ容のチューブに分注し、これに上記ＲＮＡ試
料５μｌを添加した。
【００５４】反応液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１３ｍＭ
ＭｇＣｌ2、９０ｍＭ ＫＣｌ、３９Ｕ ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１ｍＭ ＤＴＴ、各０．２５ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、３．６
ｍＭ ＩＴＰ、各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ、０．１６μＭ シザープローブ（３Ｓ、
配列番号９、３’末端の水酸基はアミノ化されてい
る）、１μＭ フォアードプライマー（３Ｆ、配列番号
７）、１μＭ リバースプライマー（３Ｒ、配列番号
８）、２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識
されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−３、配列番号１６、
５’末端から６番目の「Ｔ」と７番目の「Ｔ」の間のリ
ンにインターカレーター性蛍光色素が標識されている、
また３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されてい
る）、１３％ ＤＭＳＯ、容量調整用蒸留水。
μｌにおける濃度） ６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１３ｍＭ
ＭｇＣｌ2、９０ｍＭ ＫＣｌ、３９Ｕ ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１ｍＭ ＤＴＴ、各０．２５ｍ
Ｍ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、３．６
ｍＭ ＩＴＰ、各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ、０．１６μＭ シザープローブ（３Ｓ、
配列番号９、３’末端の水酸基はアミノ化されてい
る）、１μＭ フォアードプライマー（３Ｆ、配列番号
７）、１μＭ リバースプライマー（３Ｒ、配列番号
８）、２５ｎＭのインターカレーター性蛍光色素で標識
されたオリゴヌクレオチド（ＹＯ−３、配列番号１６、
５’末端から６番目の「Ｔ」と７番目の「Ｔ」の間のリ
ンにインターカレーター性蛍光色素が標識されている、
また３’末端の水酸基はグリコール基で修飾されてい
る）、１３％ ＤＭＳＯ、容量調整用蒸留水。
【００５５】（３）この反応液を６５℃で１５分間保温
し、次に４１℃で５分間保温した後、以下の組成の酵素
液４．２μｌを添加した。
し、次に４１℃で５分間保温した後、以下の組成の酵素
液４．２μｌを添加した。
【００５６】酵素液の組成（各濃度は最終反応液量３０
μｌにおける濃度） １．７％ソルビトール、３μｇ 牛血清アルブミン、１
４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ社製）、８Ｕ
ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）、容量調整用蒸
留水。
μｌにおける濃度） １．７％ソルビトール、３μｇ 牛血清アルブミン、１
４２Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコ社製）、８Ｕ
ＡＭＶ逆転写酵素（宝酒造（株）製）、容量調整用蒸
留水。
【００５７】（４）引き続きチューブを直接測定可能な
温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温
して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反
応溶液を経時的に測定した。
温度調節機能付き蛍光分光光度計を用い、４１℃で保温
して、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反
応溶液を経時的に測定した。
【００５８】酵素添加時の時刻を０分として、試料の蛍
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図５に示した。
光増加比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの
蛍光強度値）の経時変化を図５に示した。
【００５９】図５より、ｍＲＮＡ２００ｎｇ中に含まれ
る標的ＲＮＡは約６分で検出された。更に、ｍＲＮＡの
量を０．０２ｎｇに減らしても、標的ＲＮＡは約１１分
で検出された。以上より、インターカレーター性蛍光色
素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いるこ
とにより、迅速・高感度な測定が可能であることが示さ
れた。
る標的ＲＮＡは約６分で検出された。更に、ｍＲＮＡの
量を０．０２ｎｇに減らしても、標的ＲＮＡは約１１分
で検出された。以上より、インターカレーター性蛍光色
素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを用いるこ
とにより、迅速・高感度な測定が可能であることが示さ
れた。
【００６０】実施例６ 感度 ＲＴ−ＰＣＲ及びＴＲＣの感度を比較した。実施例２で
得られたｍＲＮＡ ０〜２００ｎｇに対して、ＲＴ−Ｐ
ＣＲは実施例３に示す方法で３０サイクル、ＴＲＣは実
施例４に示す方法で３０分間、それぞれＤＮＡ又はＲＮ
Ａの増幅を行った。
得られたｍＲＮＡ ０〜２００ｎｇに対して、ＲＴ−Ｐ
ＣＲは実施例３に示す方法で３０サイクル、ＴＲＣは実
施例４に示す方法で３０分間、それぞれＤＮＡ又はＲＮ
Ａの増幅を行った。
【００６１】図６から明らかなように、０．００２ｎｇ
のｍＲＮＡに対しては、ＲＴ−ＰＣＲでは増幅されたこ
とを検知できなかったが、ＴＲＣでは増幅されたことを
検知し得た。このことから、ＴＲＣがＲＴ−ＰＣＲより
１０倍高い感度を達成し得ることが示された。
のｍＲＮＡに対しては、ＲＴ−ＰＣＲでは増幅されたこ
とを検知できなかったが、ＴＲＣでは増幅されたことを
検知し得た。このことから、ＴＲＣがＲＴ−ＰＣＲより
１０倍高い感度を達成し得ることが示された。
【００６２】実施例７ ＤＮＡ混入の影響 ＲＴ−ＰＣＲ及びＴＲＣにおける、mＲＮＡへのＤＮＡ
混入の影響を調べた。
混入の影響を調べた。
【００６３】まず、実施例１に記載する方法で得られた
細胞壁が溶解されたＧ１細胞株から、市販のキット（Ｇ
Ｎｏｍｅ、ＢＩＯ １０１ ＩＮｃ．社製）を用いて
ゲノムＤＮＡを調製した。上記ＤＮＡ ０〜２００ｎｇ
と実施例２で得られたｍＲＮＡ ０あるいは２００ｎｇ
に対して、ＲＴ−ＰＣＲは実施例３に示す方法で３０サ
イクル、ＴＲＣは実施例４に示す方法で３０分間行っ
た。図７から明らかなように、ＲＴ−ＰＣＲではｍＲＮ
Ａ非存在下でもゲノムＤＮＡが２〜２００ｎｇ存在する
と増幅が見られた。一方、ＴＲＣではｍＲＮＡ非存在下
ではゲノムＤＮＡが２〜２００ｎｇ存在しても、増幅は
生じなかった。
細胞壁が溶解されたＧ１細胞株から、市販のキット（Ｇ
Ｎｏｍｅ、ＢＩＯ １０１ ＩＮｃ．社製）を用いて
ゲノムＤＮＡを調製した。上記ＤＮＡ ０〜２００ｎｇ
と実施例２で得られたｍＲＮＡ ０あるいは２００ｎｇ
に対して、ＲＴ−ＰＣＲは実施例３に示す方法で３０サ
イクル、ＴＲＣは実施例４に示す方法で３０分間行っ
た。図７から明らかなように、ＲＴ−ＰＣＲではｍＲＮ
Ａ非存在下でもゲノムＤＮＡが２〜２００ｎｇ存在する
と増幅が見られた。一方、ＴＲＣではｍＲＮＡ非存在下
ではゲノムＤＮＡが２〜２００ｎｇ存在しても、増幅は
生じなかった。
【００６４】次に、ＴＲＣにおける変性条件とゲノムＤ
ＮＡ由来の増幅との関係を調べた。上記ゲノムＤＮＡ２
００ｎｇを用いて、実施例５に示す方法で、インターカ
レーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ（ＹＯ−３、配列番号１６）による測定を行っ
た。ここで、シザープローブは３Ｓ（配列番号９）の代
わりに１Ｓ（配列番号３）を、フォアードプライマーは
３Ｆ（配列番号７）の代わりに１Ｆ（配列番号１）を、
それぞれ用いた。シザープローブとフォアードプライマ
ーを変えた理由は、増幅領域を非転写領域１５９塩基対
を含む特定領域１、２、３から成る５４０塩基対の領域
にし、ＲＮＡからの増幅を起こらないようにしたためで
ある。また、反応液の酵素液添加前の処理条件を一定条
件（６５℃で１５分間保温し、次に４１℃で５分間保
温）の代わりに、下記の３条件とした。
ＮＡ由来の増幅との関係を調べた。上記ゲノムＤＮＡ２
００ｎｇを用いて、実施例５に示す方法で、インターカ
レーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ（ＹＯ−３、配列番号１６）による測定を行っ
た。ここで、シザープローブは３Ｓ（配列番号９）の代
わりに１Ｓ（配列番号３）を、フォアードプライマーは
３Ｆ（配列番号７）の代わりに１Ｆ（配列番号１）を、
それぞれ用いた。シザープローブとフォアードプライマ
ーを変えた理由は、増幅領域を非転写領域１５９塩基対
を含む特定領域１、２、３から成る５４０塩基対の領域
にし、ＲＮＡからの増幅を起こらないようにしたためで
ある。また、反応液の酵素液添加前の処理条件を一定条
件（６５℃で１５分間保温し、次に４１℃で５分間保
温）の代わりに、下記の３条件とした。
【００６５】 （１）９５℃で１５分間保温し、次に４１℃で５分間保
温 （２）６５℃で１５分間保温し、次に４１℃で５分間保
温 （３）４１℃で５分間保温 図８から明らかなように、蛍光増加比が１．２を超えた
時間は（１）では約２８分、（２）では約４０分であっ
たのに対し、（３）では立ち上がりが見られなかった。
温 （２）６５℃で１５分間保温し、次に４１℃で５分間保
温 （３）４１℃で５分間保温 図８から明らかなように、蛍光増加比が１．２を超えた
時間は（１）では約２８分、（２）では約４０分であっ
たのに対し、（３）では立ち上がりが見られなかった。
【００６６】この結果は、変性条件を強くすることでＤ
ＮＡからも増幅が起こりうることを示す。ここで、反応
液の酵素液添加前の処理条件を（３）に示すような条件
にすると、ＤＮＡからの増幅を抑えることには好都合で
ある。しかしながら、ＲＮＡが２次構造をとることによ
り、ＲＮＡからの増幅が阻害されることが予想される。
また、図５と図８を比較することにより、ＲＮＡからの
増幅とＤＮＡからの増幅では、蛍光増加比の経時変化が
大きく異なり、両者の区別はきわめて容易である。
ＮＡからも増幅が起こりうることを示す。ここで、反応
液の酵素液添加前の処理条件を（３）に示すような条件
にすると、ＤＮＡからの増幅を抑えることには好都合で
ある。しかしながら、ＲＮＡが２次構造をとることによ
り、ＲＮＡからの増幅が阻害されることが予想される。
また、図５と図８を比較することにより、ＲＮＡからの
増幅とＤＮＡからの増幅では、蛍光増加比の経時変化が
大きく異なり、両者の区別はきわめて容易である。
【００６７】以上の結果を総合すると、本発明の実施に
おいては、反応液の酵素液添加前の処理条件として、６
５℃で１５分間保温し、次に４１℃で５分間保温する条
件が適当であると考えられる。
おいては、反応液の酵素液添加前の処理条件として、６
５℃で１５分間保温し、次に４１℃で５分間保温する条
件が適当であると考えられる。
【００６８】
【発明の効果】本願発明で提供される方法を用いること
により、ゲノム全体中の遺伝子発現部位を明らかにする
ことが可能であるとともに、イントロンやエキソンの関
係を含むゲノム構造が明らかにすることができるから、
任意生物種で発現し得る全蛋白質の配列決定を容易にで
きる。
により、ゲノム全体中の遺伝子発現部位を明らかにする
ことが可能であるとともに、イントロンやエキソンの関
係を含むゲノム構造が明らかにすることができるから、
任意生物種で発現し得る全蛋白質の配列決定を容易にで
きる。
【００６９】従って本願発明によれば、ポストゲノムを
飛躍的に発展させることになり、生命現象を網羅的に理
解することが可能になると考えられる。また、ヒトのポ
ストゲノムにおいては、新規治療薬、診断薬の開発につ
ながるとともに、オーダーメード医療の展開にも大きく
寄与することが期待できる。また、極限環境に生きる微
生物から産業上有用な蛋白質を同定し、これを利用する
ことにも大きく寄与しうる。
飛躍的に発展させることになり、生命現象を網羅的に理
解することが可能になると考えられる。また、ヒトのポ
ストゲノムにおいては、新規治療薬、診断薬の開発につ
ながるとともに、オーダーメード医療の展開にも大きく
寄与することが期待できる。また、極限環境に生きる微
生物から産業上有用な蛋白質を同定し、これを利用する
ことにも大きく寄与しうる。
【００７０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tosoh Corporation <120> 新規ゲノム解析法 <130> PA210-0313 <160> 17 <210> 1 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー１Ｆ <400> 1 aattctaata cgactcacta tagggagatg cttccaagat tctggtggga ata 53 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー１Ｒ <400> 2 agtaagctaa taatgatgat 20 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー１Ｓ <400> 3 aagcatacaa tgtggagaca atgcataatc atcca 35 <210> 4 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> プライマー２Ｆ <400> 4 aattctaata cgactcacta tagggagagc ttttgatttt aacgactttt aac 53 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー２Ｒ <400> 5 tgtagtgttg actggagcag 20 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー２Ｓ <400> 6 aaagcttgtc aattggaacc agtcgcaatt atgaa 35 <210> 7 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー３Ｆ <400> 7 aattctaata cgactcacta tagggagaga agctgtcatc ggttactcag att 53 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー３Ｒ <400> 8 cctcttctcg agagataccc 20 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー３Ｓ <400> 9 gcttcagccg gaatttgtgc cgtttcatct tctgt 35 <210> 10 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー４Ｆ <400> 10 aattctaata cgactcacta tagggagatt ccggaagagc cccctcagca atg 53 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー４Ｒ <400> 11 ggactctctgg gaatactggc 20 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー４Ｓ <400> 12 ccctccggga ctgctaactg gcaggagaac ttctg 35 <210> 13 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー５Ｆ <400> 13 aattctaata cgactcacta tagggagaga gggagacagc tctttctaca tag 53 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー５Ｒ <400> 14 ggggtttctg gccacggcag 20 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> プライマー５Ｓ <400> 15 ccctccggga ctgctaactg gcaggagaac ttctg 35 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ＹＯ−３ <400> 16 cttctttagc agcaatgctg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ＡＹＯ−３ <400> 20 cagcattgct gctaaagaag 20
【図１】図１は、特定領域１〜５の各塩基配列と、プラ
イマー１Ｆ、プライマー１Ｒ、プライマー１Ｓ、プライ
マー２Ｆ、プライマー２Ｒ、プライマー２Ｓ、プライマ
ー３Ｆ、プライマー３Ｒ、プライマー３Ｓ、プライマー
４Ｆ、プライマー４Ｒ、プライマー４Ｓ、プライマー５
Ｆ、プライマー５Ｒ、プライマー５Ｓが相補結合する位
置の関係を示す。
イマー１Ｆ、プライマー１Ｒ、プライマー１Ｓ、プライ
マー２Ｆ、プライマー２Ｒ、プライマー２Ｓ、プライマ
ー３Ｆ、プライマー３Ｒ、プライマー３Ｓ、プライマー
４Ｆ、プライマー４Ｒ、プライマー４Ｓ、プライマー５
Ｆ、プライマー５Ｒ、プライマー５Ｓが相補結合する位
置の関係を示す。
【図２】図２は、特定領域１〜５の非転写領域と転写領
域を示す。
域を示す。
【図３】図３は、実施例３に示す方法で特定領域１〜５
に対するプライマーを用いて、２００ｎｇのｍＲＮＡに
対してＲＴ−ＰＣＲを３０サイクル行ったときの、電気
泳動のパターンを示す。
に対するプライマーを用いて、２００ｎｇのｍＲＮＡに
対してＲＴ−ＰＣＲを３０サイクル行ったときの、電気
泳動のパターンを示す。
【図４】図４は、実施例４に示す方法で特定領域１〜５
に対するのプライマーを用いて、２００ｎｇのｍＲＮＡ
に対してＴＲＣを１０分間、２０分間、及び３０分間行
ったときの、それぞれの電気泳動のパターンを示す。
に対するのプライマーを用いて、２００ｎｇのｍＲＮＡ
に対してＴＲＣを１０分間、２０分間、及び３０分間行
ったときの、それぞれの電気泳動のパターンを示す。
【図５】図５は、実施例５に示す方法で特定領域３に対
するプライマーを用いて、０〜２００ｎｇのｍＲＮＡに
対してＴＲＣを行ったときの、反応時間とＲＮＡの生成
とともに増大する蛍光増加比のグラフである。
するプライマーを用いて、０〜２００ｎｇのｍＲＮＡに
対してＴＲＣを行ったときの、反応時間とＲＮＡの生成
とともに増大する蛍光増加比のグラフである。
【図６】図６は、実施例６に示す方法で特定領域３に対
するプライマーを用いて、０〜２００ｎｇのｍＲＮＡに
対してＲＴ−ＰＣＲを３０サイクル、あるいはＴＲＣを
３０分間行ったときの、それぞれの電気泳動のパターン
を示す。
するプライマーを用いて、０〜２００ｎｇのｍＲＮＡに
対してＲＴ−ＰＣＲを３０サイクル、あるいはＴＲＣを
３０分間行ったときの、それぞれの電気泳動のパターン
を示す。
【図７】図７は、実施例７に示す方法で特定領域３に対
するプライマーを用いて、０あるいは２ｎｇのｍＲＮＡ
及び０〜２００ｎｇのゲノムＤＮＡに対してＲＴ−ＰＣ
Ｒを３０サイクル、あるいはＴＲＣを３０分間行ったと
きの、それぞれの電気泳動のパターンを示す。
するプライマーを用いて、０あるいは２ｎｇのｍＲＮＡ
及び０〜２００ｎｇのゲノムＤＮＡに対してＲＴ−ＰＣ
Ｒを３０サイクル、あるいはＴＲＣを３０分間行ったと
きの、それぞれの電気泳動のパターンを示す。
【図８】図８は、実施例７に示す方法で特定領域１、
２、３から成る領域に対するプライマーを用いて、２０
０ｎｇのゲノムＤＮＡに対してＴＲＣを行ったときの、
反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加比の
グラフである。
２、３から成る領域に対するプライマーを用いて、２０
０ｎｇのゲノムＤＮＡに対してＴＲＣを行ったときの、
反応時間とＲＮＡの生成とともに増大する蛍光増加比の
グラフである。
Claims (9)
- 【請求項１】任意生物種のゲノム中に存在する、連続し
た任意のＤＮＡ配列であって、塩基配列は既知であるが
遺伝子発現部位であるか否か不明であるＤＮＡ配列（特
定領域）について、前記生物種由来のＲＮＡ中に該領域
の塩基配列に対応する塩基配列が存在するか否かを検出
することにより、該特定領域が遺伝子発現部位であるか
否かを決定する方法。 - 【請求項２】前記特定領域は、１００〜２００塩基のＤ
ＮＡ領域であることを特徴とする請求項１の方法。 - 【請求項３】前記検出は、前記特定領域中の５’端に位
置する、連続した少なくとも１０塩基以上から成る配列
と相同なオリゴヌクレオチド、及び、前記特定領域中の
３’端に位置する、連続した少なくとも１０塩基以上か
ら成る配列と相補的なオリゴヌクレオチド、を用い、前
記生物種由来であるＲＮＡに基づくＤＮＡ又はＲＮＡの
増幅操作により、ＤＮＡ又はＲＮＡが増幅されたか否か
を検出することからなる、請求項１又は２に記載の方
法。 - 【請求項４】前記増幅はＲＮＡの増幅であり、前記オリ
ゴヌクレオチドであって、いずれか一方はその５’端に
ＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有するオリゴヌ
クレオチドを用い、（１）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメレ
ースにより、前記生物種由来であるＲＮＡを鋳型とし
て、前記一方のオリゴヌクレオチドから前記生物種由来
のＲＮＡの一部に相補的なＤＮＡを合成し、その結果Ｒ
ＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが生成され、（２）リボヌク
レエースＨによって前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの
前記生物種由来であるＲＮＡを分解して１本鎖ＤＮＡが
生成され、（３）ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメレースによ
り、前記１本鎖ＤＮＡを鋳型として、前記他方のオリゴ
ヌクレオチドから前記１本鎖ＤＮＡに相補的なＤＮＡが
合成され、その結果前記生物種由来のＲＮＡの一部であ
るＲＮＡ又はその一部に相補的なＲＮＡを転写可能なプ
ロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成され、
（４）ＲＮＡポリメレースにより、前記２本鎖ＤＮＡか
らＲＮＡ転写産物が生成され、そして（５）該ＲＮＡ転
写産物を鋳型として前記（１）から（４）が繰り返され
る、とのＲＮＡ増幅であることを特徴とする、請求項３
に記載の方法。 - 【請求項５】前記ＤＮＡ又はＲＮＡが増幅されたか否か
の検出は、前記増幅を、増幅により生成されるＤＮＡ又
はＲＮＡと特異的に結合可能であり、かつ、インターカ
レーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブ（ただし該オリゴヌクレオチドは前記オリゴヌク
レオチドのいずれとも相補結合を形成しない配列であ
る）存在下で実施し、反応液の蛍光特性の変化を測定す
ることによって行うことを特徴とする、請求項３又は４
に記載の方法。 - 【請求項６】前記プローブは、増幅により生じるＤＮＡ
転写産物又はＲＮＡ転写産物の少なくとも一部の配列と
相補結合し、複合体を形成していない場合と比較して蛍
光特性が変化するものであることを特徴とする請求項５
に記載の検出方法。 - 【請求項７】請求項１〜６に記載の方法を繰り返し行う
ことによる、ゲノム上の任意の領域あるいはゲノム全体
を対象とした遺伝子発現部位決定法。 - 【請求項８】請求項１〜７に記載の方法により遺伝子発
現部位であることが決定された、ゲノム中の遺伝子。 - 【請求項９】請求項８の遺伝子がコードする蛋白質。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000334935A JP2002142765A (ja) | 2000-07-14 | 2000-10-30 | 新規ゲノム解析法 |
| US09/904,557 US20030027142A1 (en) | 2000-07-14 | 2001-07-16 | Novel genome analyzing method |
| DE60109002T DE60109002T2 (de) | 2000-07-14 | 2001-07-16 | Methode zum Nachweis von transkribierten genomischen DNA-Sequenzen |
| EP01116674A EP1174521B1 (en) | 2000-07-14 | 2001-07-16 | Method for detecting transcribed genomic DNA sequences |
| US10/939,468 US20050064486A1 (en) | 2000-07-14 | 2004-09-14 | Novel genome analyzing method |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000218737 | 2000-07-14 | ||
| JP2000-218737 | 2000-08-28 | ||
| JP2000-263248 | 2000-08-28 | ||
| JP2000263248 | 2000-08-28 | ||
| JP2000334935A JP2002142765A (ja) | 2000-07-14 | 2000-10-30 | 新規ゲノム解析法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002142765A true JP2002142765A (ja) | 2002-05-21 |
Family
ID=27344112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000334935A Pending JP2002142765A (ja) | 2000-07-14 | 2000-10-30 | 新規ゲノム解析法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030027142A1 (ja) |
| EP (1) | EP1174521B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002142765A (ja) |
| DE (1) | DE60109002T2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2003297301A1 (en) | 2002-11-25 | 2004-06-18 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services, Nih | Method and apparatus for performing multiple simultaneous manipulations of biomolecules in a two-dimensional array |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999010537A1 (en) * | 1997-08-26 | 1999-03-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | A tumor suppressor designated ts10q23.3 |
| JP2000014400A (ja) * | 1998-07-01 | 2000-01-18 | Tosoh Corp | 標的核酸の定量方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1340807C (en) * | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
| US6040138A (en) * | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
| US5652128A (en) * | 1993-01-05 | 1997-07-29 | Jarvik; Jonathan Wallace | Method for producing tagged genes, transcripts, and proteins |
| US5559023A (en) * | 1994-02-10 | 1996-09-24 | Cancer Institute | Tumor suppressor gene |
| JP3189000B2 (ja) * | 1994-12-01 | 2001-07-16 | 東ソー株式会社 | 特定核酸配列の検出方法 |
| US5986054A (en) * | 1995-04-28 | 1999-11-16 | The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
| US5872237A (en) * | 1996-04-04 | 1999-02-16 | Mercator Genetics, Inc. | Megabase transcript map: novel sequences and antibodies thereto |
| JPH09289900A (ja) * | 1996-04-26 | 1997-11-11 | Toyobo Co Ltd | 核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸増幅ならびに検出用試薬キット |
| FR2756845B1 (fr) * | 1996-12-06 | 1999-02-26 | Genset Sa | Sequence nucleotidique codant pour une flavine monooxygenase , proteine correspondante et composition destinee au diagnostic et a la therapie du glaucome |
| JP3785517B2 (ja) * | 1997-06-05 | 2006-06-14 | 東ソー株式会社 | 核酸融解温度測定法 |
| US6080576A (en) * | 1998-03-27 | 2000-06-27 | Lexicon Genetics Incorporated | Vectors for gene trapping and gene activation |
| US6087112A (en) * | 1998-12-30 | 2000-07-11 | Oligos Etc. Inc. | Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions |
| US6303305B1 (en) * | 1999-03-30 | 2001-10-16 | Roche Diagnostics, Gmbh | Method for quantification of an analyte |
| US6582906B1 (en) * | 1999-04-05 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Proportional amplification of nucleic acids |
| CA2311201A1 (en) * | 1999-08-05 | 2001-02-05 | Genset S.A. | Ests and encoded human proteins |
-
2000
- 2000-10-30 JP JP2000334935A patent/JP2002142765A/ja active Pending
-
2001
- 2001-07-16 US US09/904,557 patent/US20030027142A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-16 DE DE60109002T patent/DE60109002T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-16 EP EP01116674A patent/EP1174521B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-09-14 US US10/939,468 patent/US20050064486A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999010537A1 (en) * | 1997-08-26 | 1999-03-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | A tumor suppressor designated ts10q23.3 |
| JP2000014400A (ja) * | 1998-07-01 | 2000-01-18 | Tosoh Corp | 標的核酸の定量方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1174521A2 (en) | 2002-01-23 |
| EP1174521A3 (en) | 2002-04-10 |
| DE60109002T2 (de) | 2005-07-14 |
| EP1174521B1 (en) | 2005-02-23 |
| DE60109002D1 (de) | 2005-03-31 |
| US20050064486A1 (en) | 2005-03-24 |
| US20030027142A1 (en) | 2003-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10704091B2 (en) | Genotyping by next-generation sequencing | |
| WO2020056924A1 (zh) | 核酸检测方法 | |
| US8999677B1 (en) | Method for differentiation of polynucleotide strands | |
| US20030175908A1 (en) | Methods and means for manipulating nucleic acid | |
| US20080318801A1 (en) | Method and kit for evaluating rna quality | |
| EP1231281A1 (en) | Method of detecting variation or polymorphism | |
| US20220033811A1 (en) | Method and kit for preparing complementary dna | |
| CN108220400A (zh) | 一种基于CRISPR-Cas10核酸蛋白复合物的快捷核酸检测定量法 | |
| US20200270697A1 (en) | Method for predicting organ transplant rejection using next-generation sequencing | |
| US20060115851A1 (en) | Artificial genes for use as controls in gene expression analysis systems | |
| EP4060049B1 (en) | Methods for accurate parallel quantification of nucleic acids in dilute or non-purified samples | |
| CN110818757A (zh) | 核苷酸类似物以及筛选dna聚合酶的方法 | |
| JP2002142765A (ja) | 新規ゲノム解析法 | |
| US20060121461A1 (en) | Methods for identifying and isolating unique nucleic acid sequences | |
| US20210164020A1 (en) | Degradable carrier nucleic acid for use in the extraction, precipitation and/or purification of nucleic acids | |
| EP4332238A1 (en) | Methods for accurate parallel detection and quantification of nucleic acids | |
| CN117247919A (zh) | 突变型mmlv逆转录酶、编码基因、表达载体、宿主菌及其应用 | |
| CN117964713A (zh) | 一种t4gp32蛋白突变体及其应用 | |
| WO2012150455A1 (en) | Sensitive preparation and amplification of eukaryotic derived nucleic acid for transcriptional profiling | |
| WO2003010516A1 (en) | Method for identifying a nucleic acid sequence | |
| WO2003046126A2 (en) | Artificial genes for use as controls in gene expression analysis systems |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070910 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100818 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101214 |