-
Technischer
Bereich der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutisch nutzvolle Apoptosis
induzierende Stoffe und Antikrebsstoffe, die physiologisch aktive
Substanz als effektive Komponente(n) gewonnen aus Tieren, Mikroorganismen
oder Pflanzen enthält,
die zur Verbesserung der Gesundheit geeignet sind; ein funktionelles
Nahrungsmittel oder Getränk,
das die physiologisch aktive Substanz enthält; und ein Verfahren zu ihrer
Herstellung.
-
Stand der
Technik
-
In
den vergangenen Jahren hat ein Apoptosismodus die Aufmerksamkeit
auf den Zellgewebetod gezogen.
-
Im
Gegensatz zur Nekrose, die ein pathologischer Zelltod ist, wird
angenommen, dass Apoptosis ein Tod ist, der von Anfang an im Genom
der Zelle selbst integriert ist. Daher wird angenommen, dass das
Gen, das die Apoptosis programmiert, aktiviert wird, wo eine externe
oder interne Ursache als Auslöser
wirkt, ausgehend von dem Gen ein programmiertes Todesgenprotein
biosynthetisiert wird, und die Zelle selbst durch das produzierte
programmierte Todesgenprotein zersetzt wird, wodurch der Tod der
Zelle erfolgt.
-
Wenn
eine solche Apoptosis in gewünschtem
Gewebe oder in Zellen exprimiert werden kann, wird es nun möglich, unnötige oder
pathogene Zellen aus dem lebenden Körper in ihrer natürlichen
Form auszuschließen,
und das wird signifikante Bedeutung haben.
-
In
den letzten Jahren hat der Zusammenhang zwischen Apoptosis und Sphingolipid
wie Ceramid Aufmerksamkeit erregt und es wurde berichtet, dass eine
de novo Synthese von Ceramid durch Palmitinsäure und Stearinsäure stattfindet,
wodurch Apoptosis induziert wird [Journal of Biological Chemistry,
Band 272, Seiten 3324–3329
(1997)].
-
Durch die
Erfindung zu lösende
Probleme
-
Obwohl
erwartet wird, dass Ceramid und freie Fettsäuren als Apoptosis induzierende
Stoffe entwickelt werden, ist eine Apoptosis induzierende Wirkung
anderer fettlöslicher
Substanzen, die aus dem lebenden Körper gewonnen werden, ganz
unklar.
-
Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist, eine hochsichere Extraktionsfraktion
gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren zu entwickeln,
die eine Apoptosis induzierende Wirkung aufweist und einen Apoptosis
induzierenden Stoff anzubieten und einen Antikrebsstoff, der diese
Fraktion enthält,
ein funktionelles Nahrungsmittel oder Getränk, das die Fraktion als Bestandteil
enthält,
und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
-
Mittel zum
Lösen der
Probleme
-
Die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine intensive Untersuchung
durchgeführt,
um ein solches Ziel zu erreichen und als Ergebnis haben sie gefunden,
dass aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren erhaltenes Glycerolipid
starke Apoptosis induzierende Wirkung und Antikrebswirkung zeigt,
worauf die vorliegende Erfindung gemacht wurde.
-
Daher
betrifft das erste Merkmal der vorliegenden Erfindung die Verwendung
von Glycerolipid bestehend aus Fettsäure und Glycerol resten bei
der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs.
-
Das
zweite Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
von Glycerolipid bestehend aus Fettsäure und Glycerolresten bei
der Herstellung eines Lebensmittels oder Getränks für die Behandlung von Krebs.
-
Kurze Erläuterung
der Zeichnungen
-
1 ist
eine Abbildung, die ein Elutionsmuster der inneren Lösung nach
Dialyse durch eine Schnelldurchlaufsäule mit DEAE-Sepharose zeigt.
-
2 ist
eine Abbildung, die eine Apoptosis induzierende Wirkung der Fraktion
B und der reinen Substanz zeigt.
-
3 ist
eine Abbildung, die ein NMR-Spektrum der reinen Substanz zeigt.
-
4 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Probe A zeigt.
-
5 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Probe B zeigt.
-
6 ist
eine Abbildung, die eine Säulenchromatographie
mit Sepharose LH-60 zeigt.
-
7 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
der Fraktion Nr. 20 zeigt.
-
8 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
der Fraktion Nr. 21 zeigt.
-
9 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
der Fraktion Nr. 23 zeigt.
-
10 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
der Fraktion Nr. 20 zeigt.
-
11 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
der Fraktion Nr. 21 zeigt.
-
12 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
der Fraktion Nr. 23 zeigt.
-
13 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
der Fraktion eluiert mit Chloroform zeigt.
-
14 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
einer Fraktion eluiert mit Chloroform und Aceton in einem Verhältnis von
80 : 20 zeigt.
-
15 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
der Fraktion eluiert mit Chloroform zeigt.
-
16 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
einer Fraktion eluiert mit Chloroform und Aceton in einem Verhältnis von
80 : 20 zeigt.
-
17 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
eines Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt.
-
18 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
eines Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt.
-
19 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
eines Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt.
-
20 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
eines Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt.
-
21 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
eines ethanolischen Extrakts von Bunashimeji (Lyophyllum ulmarium)
zeigt.
-
22 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
eines ethanolischen Extrakts von Bunashimeji zeigt.
-
23 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
eines ethanolischen Extrakts von Matcha (pulverisiertem grünem Tee)
zeigt.
-
24 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
eines ethanolischen Extrakts von Matcha zeigt.
-
25 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente
eines 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie zeigt.
-
26 ist
eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente
eines 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie zeigt.
-
Verfahrensweise
zur Ausführung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung wird nachfolgend spezifisch erläutert.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für das
bei der vorliegenden Erfindung verwendete Glycerolipid, vorausgesetzt,
dass es/sie von Phosphatester und Phosphonatester in molekularer
Struktur frei ist, und es/sie aus Pflanzen, Mikroorganismen oder
Tieren hergestellt oder chemisch synthetisiert werden kann/können.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für die
Pflanzen, Mikroorganismen oder Tiere, die bei der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können,
so lange sie Glycerolipid enthaltende Dinge sind, die Glycerolipid
enthalten. Beispiele für
Pflanzen sind Gemüse
wie Spinat, Karotte und Zwiebel; zweikeimblättige Pflanzen wie Tee; einkeimblättrige Pflanzen
wie Gerste und Reis; Gewürzstoffe
wie Pfeffer, Muskatnuss, Knoblauch, Lorbeerblatt, Sellerie, Senf,
Ingwer, Schotenpfeffer (roter Pfeffer), Thymian, Saffran, Zimt,
Vanille, Nelkenpfeffer, Karashi (japanischer Senf), Brunnenkresse,
Sansho (japanischer Pfeffer), Blutpflanze, Kraut, Sternanis, Basilikum,
Nira (japanischer Lauch), Hops und Wasabi (japanischer Merrettich);
aus diesen Pflanzen hergestellte Produkte wie Getreiderückstände; Algen
wie Braunalgen (Phaeophyceae), Rotalgen (Rhodophyceae), Grünalgen (Chlorophyceae)
und einzellige Grünalgen;
Mikroorganismen wie Pilze, Hefe, Fadenpilze (z. B. Aspergillus)
und Bakterien (z. B. Bacillus natto und Milchsäurebakterien); und Tiere wie
Wirbeltiere und Wirbellose (Vertebraten und Invertebraten).
-
Der
Ausdruck „Tee" wie er in der vorliegenden
Beschreibung verwendet wird, kann alles sein, das üblicherweise
als Tee bezeichnet wird und Beispiele hierfür sind nicht fermentierter
Tee wie grüner
Tee, Sencha (grüner
Tee mittlerer Qualität),
Bancha (Tee niedriger Qualität),
Hojicha (gerösteter
Tee) und Matcha (pulverisierter grüner Tee); halbfermentierter
Tee wie Paipaotee, Oolongtee und Paochongtee; und nachfermentierter Tee
wie Puertee. Außerdem
umfasst der Ausdruck „Tee" Matetee, Kukotee
(chinesischer Hochzeitswein), Adlaytee und Barleytee.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für die
Pilze, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet können, obwohl
diejenigen, die üblicherweise
gegessen werden, bevorzugt sind und Beispiele sind Basidiomysetes
wie Bunashimeji (Lyophyllum ulmarium), Hatakeshimeji (Lyophyllum
decastes); Shiitake (Lentinus edodes), Matsutake (Tricholowa matsutake),
Honshimeji (Lyophyllum shimeji), Enokitake (Flammulina velutipes),
Nameko (Pholiota nameko), Iwatake (Gyrophora esculenta), Kikurage
(Auricularia auricula), Kinugasadake (Dictyophora indusiata), Kuritake
(Naematoloma sublateritium), Kurokawa (Boletopsis leucomelas), Koutake
(Sarcodon aspratus), Shoro (Rhizopogon rubescens), Tamagodake (Amanita
hemibapha), Chichitake (Lactarius volemus), Naratake (Armillaria
mellea), Hatsutake (Lactarius hatsudake), Hiratake (Pleurotus ostreatus),
Maitake (Grifola frondosa), Matsuoji (Lentinus lepideus) und gemeiner
Pilz (Agaricus bisporus oder dergleichen); und Ascomycetes wie Tochukaso
(vegetative Wespe oder Pflanzenwurm).
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für die
Algen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet können und
Beispiele hierfür
sind Braunalgen wie Fukuronori (Colpomenia sinusosa), Mozuku (Nema cystus decipiens
und andere Spezies bei Chordariaceae), Makombu (Laminaria japonica),
Gagome Kombu (Kjellmaniella crassifolia), Wakame (Undaria pinnatifida),
Arame (Eisenia pinnatifida) und Hijiki (Hizikia fusiforme); Rotlagen
wie Tengusa (Gelidium) und Igisu (Ceramium kondoi); Grünalgen wie
Aosa (Ulva pertusa), Kawanori (Prasiola japonica) und Miru (Codium
fragile); und einzellige Grünalgen
wie Kurorera (Chlorella).
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für die
Getreiderückstände, die
bei der vorliegenden Erfindung verwendet können und Beispiele hierfür sind Reiskleie,
Weizenkleie, Gerstenwurzel und Okara (Bodensatz von Tofu (Bohnenkäse)).
-
Es
ist in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass Glycerolipid aus
Tee, Pilzen, Algen oder Getreiderückständen gewonnen wird und als
wirksame Komponente(n) für
ein Apoptosis induzierendes Mittel, ein Antikrebsmittel oder ein
funktionelles Lebensmittel oder Getränk verwendet wird.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für das
Glycerolipid mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung wie es in
der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und Beispiele des verwendbaren
Glycerolipids sind Mono-, Di- und Triacylglycerol.
-
Beispiele
der Fettsäure,
die das in der vorliegenden Erfindung verwendete Glycerolipid bildet,
sind gesättigte
und/oder ungesättigte
Fettsäuren
wie Tetradecansäure
(Myristinsäure,
C14:0), Hexedecansäure
(Palmitinsäure,
C16:0), Tetradecensäure
(Myristoleinsäure,
C14:1), Hexadecensäure
(Palmitoleinsäure,
C16:1), Octadecensäure
(Oleinsäure,
C18:1), cis-9,cis-l2-Octadecadiensäure (Linoleinsäure, C18:2)
und 9,12,15-Octadecatriensäure
(Linolensäure,
C18:3).
-
Das
Glycerolipid mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung, das in der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen
oder Tieren kann leicht nach einem Verfahren hergestellt werden,
bei dem ein Schritt zum Extrahieren mit einem organischen Lösemittel
wie einem Wasser enthaltenden hydrophilen organischen Lösemittel
(zum Beispiel wässriges
Ethanol) eingesetzt wird. Es gibt jedoch keine besondere Einschränkung für das Herstellungsverfahren
für das
Glycerolipid. Auf diese Weise kann nicht nur eine reine Extraktion
mit Wasser, sondern auch bekannte Verfahren, die zur Reinigung des
Glycerolipids verwendet werden können,
verwendet werden. Es ist auch möglich,
dass eine Substanz, die aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren
gewonnenes Glycerolipid enthält,
chemisch, physikalisch oder enzymatisch behandelt und dann das angezielte
Glycerolipid gereinigt wird. Bei der Reinigung können die physikalisch-chemische
Eigenschaften oder physiologische Aktivität (Apoptosis induzierende Wirkung
usw.) des Glycerolipids als Index für die Reinigung verwendet werden.
-
Bei
der vorliegenden Erfindung kann aus Pflanzen, Mikroorganismen oder
Tieren gewonnenes Glycerolipid mit einem organischen Lösemittel
wie Hexan, Chloroform, Ethylacetat, einem hydrophilen organischen Lösemittel
(zum Beispiel Aceton, Propanol, Ethanol und Methanol) und einer
Mischung davon oder einem Lösemittelgemisch
davon mit Wasser und eine essbare Substanz, die Glycerolipid enthält, leicht
nach einem Herstellungsverfahren hergestellt werden, das einen Schritt
zum Extrahieren, zum Beispiel mit einem wässrigen Ethanol umfasst. Bei
Verwendung als Nahrungsmittel oder Getränk wird die Extraktion bevorzugt
unter solchen Extraktionsbedingungen durchgeführt, wo ein organisches Lösemittel,
insbesondere ein hydrophiles organisches Lösemittel wie 10–95% oder
bevorzugt 20–80%
wässriges
Ethanol üblicherweise über einige
Minuten bis einige Tage, oder bevorzugt über einige Dutzend Minuten
bis einige Dutzend Stunden, üblicherweise
bei 10 bis 70°C, oder
bevorzugt bei 20 bis 60°C
verwendet wird, worauf Glycerolipid, das/die Apoptosis induzierende/r
Wirkstoff/e ist/sind, effizient extrahiert werden kann/können. Wenn
Glycerolipid gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren
vor der Extraktion mit organischem Lösemittel oder insbesondere
mit hydrophilem organischem Lösemittel,
mit einer Säure
oder einem Alkali behandelt wird, ist es möglich, dass Glycerolipid, das
Apoptosis induzierende Verbindung/en ist/sind, effizienter extrahiert
werden kann/können.
-
In
Hinblick auf Verfahren zum Aufnehmen von reinem Glycerolipid, das/die
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Verfahren bekannt
wie das Bligh-Dyer-Verfahren und das Folch-Trennverfahren (siehe „Shin Seikagaku
Jikken Koza (New Textbook on Experiments of Biochemistry)", Band 4, Lipid III,
Seiten 104–109,
1990 herausgegeben von Japan Biochemical Society, veröffentlicht
von Tokyo Kagaku Dojin) und jedes davon, das für den Zweck geeignet ist, kann
für die
Extraktion des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Glycerolipids
verwendet werden.
-
Bei
der Reinigung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Glycerolipids
wird der oben genannte Extrakt einer Chromatographie unter Verwendung
eines hydrophoben Trägers,
eines Umkehrphasenträgers,
eines Normalphasenträgers
usw. unterzogen, wodurch eine effizientere Trennung durchgeführt werden kann.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für den
hydrophoben Träger,
sondern es kann jeglicher bekannte Träger verwendet werden. Beispiele
für einen
solchen Träger
sind das Harz eines Sephacryltyps, ein Sepharosetyp, ein Toyopearltyp
usw., worin Butyl-, Octyl- oder Phenylgruppen eingeführt sind,
und ein Amberlit-Adsorptionsharz XAD-1, -2, -4, -200, -7 oder -8.
Es gibt keine besondere Einschränkung
für den
Umkehrphasenträger,
sondern jeglicher bekannte Träger
kann verwen det werden und ein Beispiel eines solchen Trägers ist
Silicagel, bei dem eine Alkylkette kovalent gebunden ist. Es gibt
keine besondere Einschränkung
für den
Normalphasenträger,
sondern jeglicher bekannte Träger
kann verwendet werden und ein Beispiel eines solchen Trägers ist
Silicagel. Bei Durchführung
der Reinigung können
physikalische und chemische Eigenschaften des Glycerolipids oder
physiologische Aktivität
wie eine Apoptosis induzierende Wirkung als Index verwendet werden.
-
Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete, aus Pflanzen, Mikroorganismen
oder Tieren gewonnene Glycerolipid kann zum Beispiel aus einem wässrigen
ethanolischen Extrakt aus essbaren Pflanzen, essbaren Mikroorganismen,
essbaren Tieren usw. mittels herkömmlicher Ionenaustauscherharzbehandlung,
hydrophober chromatographischer Behandlung, Gelfiltrationsbehandlung
usw. gereinigt werden.
-
Üblicherweise
gibt es viele Fälle,
wo das Glycerolipid in Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren in Form
einer hochmolekularen Substanz gebunden mit Saccharid und/oder Protein
nahe der Membran vorhanden ist/sind, und zum Beispiel bei Extraktion
mit heißem
Wasser eine Glycerolipid enthaltende Substanz erhalten werden kann,
bei der das Glycerolipid mit Saccharid und/oder Protein gebunden
ist. Übrigens
bedeutet der Ausdruck Saccharid ein Saccharid, das in Pflanzen,
Mikroorganismen oder Tieren vorhanden ist, und umfasst Monosaccharid,
Oligosaccharid, Polysaccharid und Glycokonjugate.
-
Bei
der vorliegenden Erfindung kann die hochmolekulare Substanz, die
das als solches hergestellte Glycerolipid enthält, verwendet werden wie es
ist, obwohl in Abhängigkeit
vom Ziel der Verwendung, Saccharid und/oder Protein enzymatisch,
chemisch und/oder physikalisch behandelt wird/werden, um das Glycerolipid zu
reinigen und aufzu nehmen, wodurch es möglich ist, das Glycerolipid
in einem höheren
Reinheitszustand zu erhalten.
-
Das
Glycerolipid, das nach dem oben genannten Verfahren erhalten und
in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist/sind die hoch
sichere Substanz(en), die aus der Natur erhalten sind und besonders
als Nahrungsmittel und/oder Getränk
geeignet sind.
-
Wenn
das erhaltene Glycerolipid an einen Liganden gebunden ist, der die
Zielzellen wie monoklonale Antikörper
erkennt, ist es möglich,
die Apoptosis in jeglichen Zielzellen spezifisch zu induzieren.
Wenn außerdem
die Zielzellen Krebszellen sind, ist es möglich, eine Antikrebswirkung
als Folge der Induktion von Apoptosis in den gewünschten Krebszellen zu erreichen.
Wenn ferner die Verbindung der vorliegenden Erfindung an einen Träger wie
Albumin gebunden ist, kann eine Substanz mit einer höheren Absorptionseigenschaft
angeboten werden.
-
Der
Apoptosis induzierende Stoff der vorliegenden Erfindung kann durch
Kombinieren des Glycerolipids, wie das/die von Pflanzen, Mikroorganismen
oder Tieren gewonnene, das/die Wirkkomponente(n) ist/sind, mit einem
bekannten pharmazeutischen Träger
in eine pharmazeutisches Präparat
eingebracht werden. Allgemein werden die Apoptosis induzierenden
Stoff(e) der vorliegenden Erfindung wie Glycerolipide mit einer pharmazeutisch
akzeptablen Flüssigkeit
oder einem festen Träger
formuliert, falls nötig
gefolgt vom Zusatz von Lösemittel,
Dispersionsmittel, Emulgator, Puffer, Stabilisator, Vehikel, Bindemittel,
Sprengmittel, Gleitmittel usw., worauf ein festes Präparat wie
Tabletten, Granulat, gestrecktes Pulver, Pulverpräparat und
Kapseln und flüssiges
Präparat
wie normales Flüssigpräparat, Suspension
und Emulsion hergestellt werden kann. Alternativ kann/können die
Verbindungen) in ein trockenes Präparat formuliert werden, das
durch Zusatz eines geeigne ten Trägers
dazu vor der tatsächlichen
Anwendung in Flüssigkeit
verwandelt werden kann.
-
Der
Apoptosis induzierende Stoff der vorliegenden Erfindung kann mittels
irgendeines oralen Mittels und parenteralen Mittels wie durch Injektionsmittel
und Instillationsmittel verabreicht werden.
-
Es
können
in Abhängigkeit
von den oben genannten Dosierungsformen und Präparatformen pharmazeutische
Träger
ausgewählt
werden. Im Fall von oralen Mitteln können Stärke, Lactose, Sucrose, Mannitol, Carboxymethylcellulose,
Maisstärke,
anorganische Salze usw. verwendet werden. Bei der Herstellung von oralen
Mitteln können
Bindemittel, Sprengmittel, Tensid, Gleitmittel, Fließverbesserer,
Korrigens, Färbemittel, Duftstoff
usw. ferner dazu formuliert werden.
-
Andererseits
können
im Fall von parenteralen Mitteln das/die zum Beispiel von Pflanzen,
Mikroorganismen oder Tieren gewonnene Glycerolipid(e), das/die Wirkkomponente(n)
in der vorliegenden Erfindung mit einer Apoptosis induzierenden
Wirkung ist/sind, in einem Verdünnungsmittel
wie destilliertes Wasser zur Injektion, physiologischer Kochsalzlösung, wässriger
Glucoselösung,
Pflanzenöl
zur Injektion, Sesamöl,
Erdnussöl, Sojabohnenöl, Propylenglycol
und Polyethylenglycol gelöst
oder suspendiert werden, falls nötig
gefolgt vom Zusatz von Bakterizid, Stabilisator, isotonischem Stoff,
Anästhesierungsmittel
usw.
-
Der
Apoptosis induzierende Stoff der vorliegenden Erfindung kann in
Abhängigkeit
von der Präparatform
auf einem geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden. Es gibt
auch keine besondere Einschränkung
für das
Verabreichungsverfahren und jegliche interne oder externe Verabreichung
und Injektion kann angewendet werden. Injektionspräparate können zum
Beispiel intravenös,
intramuskulär,
subkutan, intrakutan usw. verabreicht werden. Externe Präparate umfassen
Suppositorien und dergleichen.
-
Eine
Dosis des Apoptosis induzierenden Stoffs der vorliegenden Erfindung
kann in geeigneter Weise gemäß Präparatform,
Verabreichungsverfahren und Ziel der Verabreichung sowie Alter,
Körpergewicht
und Symptom des Patienten bestimmt werden, dem das Induktionsmittel
verabreicht wird, und ist nicht festgelegt, obwohl üblicherweise
die Menge an im Präparat
enthaltener Wirkkomponente 0,1 bis 200 mg/kg pro Tag für einen
Erwachsenen beträgt.
Es versteht sich von selbst, dass die Dosis in Abhängigkeit
von verschiedenen Bedingungen schwankt, und deshalb kann in einigen
Fällen
eine geringere Dosis als der oben genannte Bereich ausreichend sein,
während
in anderen Fällen
eine höhere
Dosis als der oben genannte Bereich notwendig sein kann. Der pharmazeutische
Stoff der vorliegenden Erfindung wird nicht nur oral verabreicht
wie er ist, sondern kann auch täglich
durch Zusatz zu irgendeinem Nahrungsmittel oder Getränk genommen
werden.
-
Das
in der vorliegenden Erfindung verwendete Glycerolipid weist eine
Aktivität
zur Unterdrückung
des Wachstums von Krebszellen auf. Der Wirkmechanismus des in der
vorliegenden Erfindung verwendeten Glycerolipids zur Unterdrückung des
Wachstums von Krebszellen schränkt
die vorliegende Erfindung überhaupt nicht
ein und zum Beispiel wird eine Apoptosis induzierende Wirkung auf
Krebszellen ebenso von der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
-
Das
Glycerolipid mit einer Antikrebswirkung wie zum Beispiel von Pflanzen,
Mikroorganismen oder Tieren gewonnenes Glycerolipid kann als Wirkkomponente(n)
verwendet werden und kann durch Formulierung mit einem bekannten
pharmazeutischen Träger
in ein pharmazeutisches Präparat
eingebracht werden, worauf ein Antikrebswirkstoff hergestellt werden
kann. Die Herstellung des Antikrebswirkstoffs kann gemäß dem oben
genannten Verfahren durchgeführt
werden. Allgemein wird das Glycerolipid mit einem pharmazeutisch
akzeptablen flüssigen
oder festen Träger
formuliert, falls nötig
gefolgt von Zusatz von Lösemittel,
Dispersionsmittel, Emulgator, Puffer, Stabilisator, Vehikel, Bindemittel,
Sprengmittel, Gleitmittel usw., worauf ein festes Präparat wie
Tabletten, Granulat, gestrecktes Pulver, Pulverpräparat und
Kapseln und ein flüssiges
Präparat
wie normales Flüssigpräparat, Suspension
und Emulsion hergestellt werden kann. Alternativ kann die Verbindung
in ein trockenes Präparat
formuliert werden, das durch Zusatz eines geeigneten Trägers vor
der tatsächlichen
Anwendung in Flüssigkeit
verwandelt werden kann.
-
Der
Antikrebswirkstoff kann mittels jeglicher oraler Mittel oder parenteraler
Mittel wie Injektionsmittel und Installationsmittel verabreicht
werden.
-
Pharmazeutische
Träger
können
in Abhängigkeit
von den oben genannten Dosierungsformen und Präparatformen ausgewählt werden
und können
gemäß dem oben
genannten Fall des Apoptosis induzierenden Stoffs verwendet werden.
-
Der
Antikrebswirkstoff der vorliegenden Erfindung kann auf einem geeigneten
Verabreichungsweg verabreicht werden, der den Präparatformen entspricht. Es
gibt auch keine besondere Einschränkung für das Verabreichungsverfahren
und jegliche interne oder externe Verabreichung und Injektion kann
angewendet werden. Injektionspräparate
können
zum Beispiel intravenös,
intramuskulär,
subkutan, intrakutan usw. verabreicht werden. Externe Präparate umfassen
Suppositorien und dergleichen.
-
Eine
Dosis des Antikrebsstoffs der vorliegenden Erfindung kann in geeigneter
Weise gemäß Präparatform,
Verabreichungsverfahren und Ziel der Verabreichung sowie Alter,
Körpergewicht
und Symptom des Patienten bestimmt werden, dem das Induktionsmittel
verabreicht wird, und ist nicht festgelegt, obwohl üblicherweise
die Menge an im Präparat
enthaltener Wirkkomponente 0,1 bis 200 mg/kg pro Tag für einen
Erwachsenen beträgt.
Es versteht sich von selbst, dass die Dosis in Abhängigkeit
von verschiedenen Bedingungen schwankt, und deshalb kann in einigen
Fällen
eine geringere Dosis als der oben genannte Bereich ausreichend sein,
während
in anderen Fällen
eine höhere
Dosis als der oben genannte Bereich notwendig sein kann. Der pharmazeutische
Stoff der vorliegenden Erfindung wird nicht nur oral verabreicht
wie er ist, sondern kann auch täglich
durch Zusatz zu irgendeinem Nahrungsmittel oder Getränk genommen
werden.
-
Der
pharmazeutische Stoff der vorliegenden Erfindung kann als therapeutisches
Mittel für
Krebserkrankungen und dergleichen verwendet werden. Außerdem ist
das Verfahren zur Induktion von Apoptosis, das vom Apoptosis induzierenden
Stoff der vorliegenden Erfindung angeboten wird, geeignet zur Untersuchung des
Mechanismus von Biophylaxis, Immunfunktion oder Zusammenhang mit
Krankheiten wie Krebs und auch zur Entwicklung eines Inhibitors
der Induzierung von Apoptosis. Insbesondere das Glycerolipid, das
Apoptosis induzierende Verbindung ist/sind, hergestellt aus Pflanzen,
Mikroorganismen oder Tieren mit langer Geschichte als Nahrungsmittel
besitzen bei oraler Verabreichung hohe Sicherheit. Außerdem sind
Nahrungsmittel oder Getränke,
in die das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung, wie das aus
Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnene, enthalten, zugesetzt
und/oder darin verdünnt
ist, natürlich
hohe Sicherheit und ist ziemlich geeignet zur Verbesserung von Symptomen
und zur Vorbeugung von gastrointestinalem Krebs oder dergleichen,
wegen seiner Apoptosis induzierenden Wirkung und Antikrebswirkung
durch die Apoptosis induzierende Wirkung.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für das
Nahrungsmittel oder Getränk
der vorliegenden Erfindung und Beispiele sind verarbeitete landwirtschaftliche/forstwirtschaftliche
Produkte, verarbeitete Schlachtprodukte, verarbeitete Fischereiprodukte
usw. einschließlich
verarbeitete Getreideprodukte wie verarbeitete Weizenprodukte, verarbeitete
Stärkeprodukte,
verarbeitete Mischprodukte, Nudeln, Makkaroni, Brot, Bohnenpasten,
Soba (japanische Buchweizennudeln), Fu (japanisches Weizenglutenbrot),
Bifun (chinesische Bohnengeleestäbchen),
Harusame (japanische Bohnengeleestäbchen) und verpackte Mochi
(Reiskuchen); verarbeitete Fett/Ölprodukte
wie plastisches Fett/Öl, Öl für Tempura
(fritierte Speisen), Salatöl,
Mayonnaise und Dressing; verarbeitete Sojabohnenprodukte wie Tofu
(Sojabohnenquark), Miso (fermentierte Sojabohnenpaste) und Natto
(fermentierte Sojabohnen); verarbeitete Fleischprodukte wie Schinken,
Schinkenspeck, Pressschinken und Wurst; Fischprodukte wie gefrorene
Surimi (gehacktes Fischfleisch), Kamaboko (gekochte Fischpaste),
Chikuwa (japanische Fischpaste gekocht in bambusartiger Form), Hampen
(leichter Fischkuchen), Satsumaage (gebratene Fischbällchen),
Tsumire (gekochte Fischpaste mit Beilagen), Suji (Fischprodukte),
Fischfleischschinken, Wurst, Katsuobushi (getrockneter Bonito),
verarbeitete Fischeiprodukte, Fischprodukte in Dosen und Tsukudani
(konservierte Fischspeisen in Sojasauce gekocht); Milchprodukte
wie Milch, Sahne, Joghurt, Butter, Käse, Kondensmilch, Milchtrockenpulver
und Eiscreme; verarbeitete Gemüse/Fruchtprodukte
wie Pasten, Marmeladen, Konserven, Fruchtgetränke, Gemüsegetränke und Mixgetränke; Süßwaren wie
Schokolade, Buskuit, Törtchen;
Kuchen, Mochigashi (Reiskugelkuchen) und Reiskräcker; alkoholische Getränke wie
Sake (japanischer Reiswein), chinesischer Wein, Wein, Whisky, Shochu
(japanischer Branntwein), Wodka, Brandy, Gin, Bock, Bier, alkoholische
Mischgetränke,
Fruchtwein und Likör;
Genußmittel
wie grüner
Tee, schwarzer Tee, Oolongtee, Kaffee, alkoholfreie Getränke und
Milchsäuregetränke; Würzen wie
Sojabohnensauce, Worcestersauce, Essig und Mirin (süßer Sake);
Gewürze
wie Extrakte von Knoblauch, Pfeffer, rotem Pfeffer, Muskatnuss,
Ingwer, Sternanis, Kräuter
und Basilikum, Nahrungsmittel in Dosen, Flaschen oder Beuteln wie
gekochter Reis mit gewürztem
Rindfleisch, Kamameshi (gekochter Reis in einem kleinen kesselförmigen Behälter), Sekihan
(Reis gekocht mit roten Bohnen), Curry und Reis, und andere schon
verarbeitete Nahrungsmittel; halbgetrocknete oder konzentrierte
Nahrungsmittel wie Leberpastete oder andere Aufstriche, Suppe für Soba und
Udon (beides japanische Nudeln) und Suppenkonzentrat; getrocknete
Nahrungsmittel wie Instantnudeln, Instantcurry, Instantkaffee, Saftpulver,
Suppenpulver, Instantmisosuppe, Retortennahrung, Retortengetränk und Retortensuppe;
Tiefkühlnahrung
wie Sukiyaki, Chawan-mushi (Eintopf), Unagi Kabayaki (gegrillter
Aal), Hamburger, Shao-mai (chinesischer Dampfknödel), Gyoza (gebratener Knödel gefüllt mit Schweinehack
usw.), verschiedene Arten von Stäbchen
und Fruchtcocktail; feste Nahrungsmittel; flüssige Nahrungsmittel wie Suppe;
und Gewürze.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für das
Herstellungsverfahren von Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden
Erfindung und Beispiele dafür
sind Kochen, Verarbeitung und üblicherweise
verwendete Verfahren bei der Herstellung von Nahrungsmitteln oder
Getränken,
wo jegliches Verfahren angewendet werden kann, so lange das hergestellte
Nahrungsmittel oder Getränk
als solches das Glycerolipid enthält, wie das aus Pflanzen, Mikroorganismen
und Tieren gewonnene, das/die Apoptosis induzierende Verbindungen) ist/sind.
-
In
Hinblick auf das Kochen und Verarbeiten genügt es, dass das Produkt nach
dem Kochen oder Verarbeiten Glycerolipid mit Apoptosis induzierender
Eigenschaft enthält.
-
Daher
kann das Glycerolipid mit Apoptosis induzierender Eigenschaft vor,
während
oder nach dem Kochen oder Verarbeiten zugesetzt werden. Alternativ
kann das gekochte oder verarbeitete Produkt oder ein Rohmaterial
dafür einer
Substanz zugesetzt werden, die das Glycerolipid enthält, so dass
das Glycerolipid verdünnt
wird.
-
Bei
der Herstellung von Nahrungsmittel oder Getränk kann das Glycerolipid mit
Apoptosis induzierender Wirkung in irgendeinem der Schritte hinzugefügt werden.
In Hinblick auf ein Zugabeverfahren kann das Glycerolipid hinzugefügt werden
oder Nahrungsmittel, Getränk
oder ein Material hierfür
kann dem Glycerolipid hinzugefügt
werden, so dass das Glycerolipid verdünnt wird. Das Hinzufügen kann
entweder auf einmal oder mehrmals erfolgen. Dementsprechend kann
das Nahrungsmittel oder Getränk
mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung leicht hergestellt werden.
Wenn irgendeiner dieser Schritte angewendet wird, ist das Nahrungsmittel
oder Getränk,
das das Glycerolipid mit Apoptosis induzierender Eigenschaft enthält, oder
das Nahrungsmittel oder Getränk,
wo das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung zugesetzt oder darin
verdünnt
ist, als das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung
definiert.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für die
Menge des Glycerolipids der vorliegenden Erfindung mit einer Apoptosis
induzierenden Wirkung (wie Glycerolipid, das die Apoptosis induzierende
Verbindungen) der vorliegenden Erfindung gewonnen aus Pflanzen,
Mikroorganismen oder Tieren ist/sind) in der Nahrung, sondern die
Menge kann in geeigneter Weise vom Gesichtspunkt der Organoleptik
und physiologischen Aktivität
gewählt
werden. Zum Beispiel beträgt
die Menge an Glycerolipid nicht weniger als 10–9 Teile
auf 100 Teile des Nahrungsmittels und in Hinblick auf die Organoleptik
und physiologische Wirkung als Nahrungsmittel beträgt sie bevorzugt
10–8 Teile
auf 5 Teile, und besonders bevorzugt 10–7 Teile
auf 2 Teile.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für die
Menge des Glycerolipids der vorliegenden Erfindung mit einer Apoptosis
induzierenden Wirkung (wie Glycerolipid, das die Apoptosis induzierende
Verbindung(en) der vorliegenden Erfindung gewonnen aus Pflanzen,
Mikroorganismen oder Tieren ist/sind) im Getränk, sondern die Menge kann
in geeigneter Weise vom Gesichtspunkt der Organoleptik und physiologischen
Aktivität gewählt werden.
Zum Beispiel beträgt
die Menge an Glycerolipid nicht weniger als 10–9 Teile
auf 100 Teile des Getränks
und in Hinblick auf die Organoleptik und physiologische Wirkung
als Getränk
beträgt
sie bevorzugt 10–8 Teile auf 5 Teile,
und besonders bevorzugt 10–7 Teile auf 2 Teile. Übrigens
steht in der vorliegenden Beschreibung der Ausdruck „Teil(e)" für Gewichtsteile.
-
Es
gibt keine besondere Einschränkung
für die
Form des Nahrungsmittels oder Getränks der vorliegenden Erfindung,
so lange das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung mit einer Apoptosis
induzierenden Eigenschaft darin enthalten, zugesetzt und/oder darin
verdünnt
ist, sondern kann jegliche Form abdecken, die oral eingenommen werden
kann wie Tabletten, Granulat, Kapseln, Gel und Sol.
-
Das
Nahrungsmittel oder Getränk
der vorliegenden Erfindung enthält
eine große
Menge an Glycerolipid, das Apoptosis induzierende Verbindungen)
der vorliegenden Erfindung mit einer physiologischen Aktivität ist/sind,
und ist insbesondere ein gesundes Nahrungsmittel oder Getränk, das
wegen der Apoptosis induzierenden Wirkung des Glycerolipids zur
Erhaltung guter Gesundheit von Magen und Darm geeignet ist.
-
Das
Antikrebsnahrungsmittel oder Antikrebsgetränk, wo das Glycerolipid der
vorliegenden Erfindung wie das von Pflanzen, Mikroorganismen oder
Tieren gewonnene darin enthalten, hinzugefügt oder darin verdünnt ist,
kann gemäß dem oben
genannten Verfahren zur Herstellung eines Apoptosis induzierenden
Nahrungsmittels oder eines Apoptosis induzierenden Getränks unter
Verwendung der Antikrebswirkung als Index hergestellt werden.
-
Das
Glycerolipid, das Apoptosis induzierende Verbindung(en) der vorliegenden
Erfindung ist, wird/werden gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen
oder Tieren und die Verwendung des Glycerolipids, insbesondere gewonnen
aus essbaren Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren, für Nahrungsmittel
oder Getränk
ist ziemlich sicher, wo die Apoptosis induzierende Verbindungen)
keine Toxizität
für Tiere
bei der Konzentration zum Erreichen der physiologischen Funktion
zeigt/zeigen.
-
Das
Glycerolipid der vorliegenden Erfindung in essbaren Pflanzen, Mikroorganismen
oder Tieren weist eine lange Geschichte als Nahrungsmittel auf und
die daraus hergestellte Substanz, die das Giycerolipid gemäß der vorliegenden
Erfindung enthält,
weist eine ziemlich hohe Sicherheit auf, wenn sie oral verabreicht wird.
Dementsprechend ist es natürlich,
dass das Nahrungsmittel oder Getränk, wo das Glycerolipid hinzugefügt und/oder
darin verdünnt
ist, eine hohe Sicherheit aufweist.
-
Nun
ist klar, dass wie oben erwähnt,
das Glycerolipid, das im lebenden Körper verfügbares Lipid ist, gemäß der Erfindung
eine Apoptosis induzierende Wirkung aufweist.
-
Das
Glycerolipid, das in der vorliegenden Erfindung verwendete Apoptosis
induzierende Verbindungen) ist/sind, ist in großen Mengen in Membranfraktionen
von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren vorhanden, und insbesondere
kann es zu geringen Kosten und auf einfache Weise aus essbaren Pflanzen
oder Mikroorganismen hergestellt werden. Außerdem kann das Glycerolipid,
das die gewünschte
Apoptosis induzierende Verbindungen) ist/sind, durch Auswählen eines
geeigneten Lösemittels
gemäß seines
Hydrophobiegrades selektiv gereinigt werden.
-
Das
Glycerolipid, das in der vorliegenden Erfindung verwendete Apoptosis
induzierende Verbindungen) ist/sind (wie das/die gewonnen aus Pflanzen,
Mikroorganismen oder Tieren) kann leicht seine Apoptosis induzierende
Wirkung an Nahrungsmittel oder Getränk übertragen und das Glycerolipid
der vorliegenden Erfindung mit der Apoptosis induzierenden Eigenschaft
und Antikrebseigenschaft ist ziemlich geeignet als Zusatz zu Nahrungsmittel
oder Getränk.
-
Beispiele
-
Die
vorliegende Erfindung wird nun spezieller durch die folgenden Beispiele
erläutert,
obwohl die vorliegende Erfindung überhaupt nicht auf diese Beispiele
beschränkt
ist. Übrigens
bedeutet der Ausdruck % in den Beispielen Gewichts-%.
-
Beispiel 1
-
Herstellung der Zusammensetzung
mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung aus Seetang
-
(1)
Gagome Kombu (Kjellmaniella crassifolia) wird gut getrocknet und
20 kg des getrockneten Produkts werden mit einer offenen Mühle (hergestellt
von Nara Kikai Seisakusho) gemahlen.
-
Calciumchloriddihydrat
(hergestellt von Nippon Soda) (7,3 kg) wurde in 900 ml Leitungswasser
gelöst und
dann 20 kg des gemahlenen Gagome Kombu damit vermischt. Die Temperatur
der Flüssigkeit
wurde durch Einblasen von Dampf über
40 Minuten von 12°C
auf 90°C
erhöht
und die Mischung wurde unter Rühren eine
Stunde lang auf 90–95°C gehalten
und abgekühlt,
so dass 1100 Liter abgekühltes
Produkt erhalten wurden.
-
Dann
wurde die abgekühlte
Lösung
einer Fest-Flüssig-Trennung
unter Verwendung eines Fest-Flüssig-Separators
(Typ CNA; hergestellt von Westfalier Separator) unterzogen, so dass
nach der Fest-Flüssig-Trennung ungefähr 900 Liter Überstandflüssigkeit
erhalten wurden.
-
Die Überstandflüssigkeit
(360 Liter) nach der Fest-Flüssig-Trennung
wurde unter Verwendung von FE10-FC-FUS 0382 (Fraktioniermolekulargewicht:
30000) (hergestellt von Daicel) auf 20 Liter aufkonzentriert. Dann
wurden 20 Liter Leitungswasser hinzugefügt, die Mischung auf 20 Liter
aufkonzentriert und solche Behandlungen zum Entsalzen fünf Mal wiederholt,
worauf 25 Liter Extraktderivat von Gagome Kombu erhalten wurden.
-
Ein
Liter der Lösung
wurde gefriergetrocknet, so dass 13 g Trockenprodukt erhalten wurden.
-
(2)
Der in Beispiel 1-(1) genannte Extrakt (1,4 Liter) wurde gegen 20
mM Acetatpuffer (pH 6) mit 0,2 M CaCl2 dialysiert,
so dass nach der Dialyse eine interne Flüssigkeit erhalten wurde. Eine
DEAE-Sepharose-Schnelldurchlaufkolonne
(14 cm Durchmesser × 45,5
cm Höhe)
wurde mit dem selben Puffer ins Gleichgewicht gebracht, die innere
Flüssigkeit
nach der Dialyse aufgegeben, mit dem selben Puffer gewaschen und nach
dem Konzentrationsgradientenverfahren mit dem Puffer mit 2 M NaCl
eluiert. Die Gesamtmenge an Zucker und Uronsäure wurde mittels eines Phenol-Schwefelsäureverfahrens
und eines Carbazol-Schwefelsäureverfahrens
bestimmt, so dass Fraktionen A, B und C in der Elutionsfolge erhalten
wurden. Sie wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet,
so dass 760 mg einer Fraktion B erhalten wurden.
-
Die
Fraktion B zeigte eine Apoptosis induzierende Wirkung.
-
1 zeigt
Elutionsmuster des Extrakts aus der DEAE-Sepharose-Schnelldurchlaufkolonne.
Daher ist 1 eine Abbildung, die die Elutionsmuster
des aus Meeresalgen aus der DEAE-Sepharose-Schnelldurchlaufkolonne (14 cm Durchmesser × 45,5 cm
Höhe) gewonnenen
Extrakts, in der die Ordinate die Absorption bei 530 nm nach einem
Carbazol-Schwefelsäureverfahren
und die bei 480 nm nach einem Phenol-Schwefelsäureverfahren zeigt sowie die
Leitfähigkeit
(mS/cm), während
die Abszisse Fraktionszahlen zeigt. In der Abbildung sind offene
Kreise Absorptionen bei 480 nm nach einem Phenol-Schwefelsäureverfahren, schwarze Punkte
die bei 530 nm nach einem Carbazol-Schwefelsäureverfahren und eine durchgezogene
Linie ist Leitfähigkeit. Übrigens
beträgt
die Menge an Flüssigkeit
für eine
Fraktion 1000 ml.
-
(3)
Die nach dem obigen Verfahren fraktionierte Fraktion B (8,6 g) wurde
auf eine Phenyl-Sepharose 6 Schnelldurchlaufkolonne (4,4 cm Durchmesser × 20 cm
Höhe) aufgegeben,
die mit 1 M NaCl ins Gleichgewicht gebracht ist, worin die Endkonzentration
an NaCl auf 1 M eingestellt wurde. Die Säule wurde mit 1 M NaCl gewaschen
und es wurde eine Fraktion erhalten, die mittels eines Konzentrationsgradienten
zu Wasser eluiert wurde. Diese wurde mittels eines Rotationsverdampfers
aufkonzentriert und gegen destilliertes Wasser dialysiert, so dass
ungefähr
6,5 ml reine Fraktion erhalten wurden. Die reine Fraktion wurde
gefriergetrocknet, so dass 60 mg reines Produkt erhalten wurden.
Dieses reine Produkt zeigte eine Apoptosis induzierende Wirkung.
-
(4) Messung der Apoptosis
induzierenden Wirkung des reinen Produkts
-
Die
Apoptosis induzierende Wirkung der obigen Fraktion B und des in
Beispiel 1-(3) genannten reinen Produkts wurden wie folgt gemessen.
Es wurden 0,5 ml wässrige
Lösung
der Fraktion B oder des reinen Produkts zu 2,5 × 105 Zellen/4,5
ml HL-60 (ATCC CL-240) hinzugegeben, die in einem RPMI 1640 Medium
kultiviert wurden, das 10% fetales Kalbsserum enthält und bei
37°C 48
Stunden lang inkubiert. Gleichzeitig wurden destilliertes Wasser
und eine Lösung
von Actinomycin D (10 μg/ml),
wovon bekannt ist, dass es eine Apoptosis induzierende Wirkung besitzt,
hinzugefügt,
um Kontrollproben herzustellen. Die Bildung von apoptischen Körpern, Zellkontraktion
und Kernaggregation wurden mit unbewaffnetem Auge unter einem Mikroskop
betrachtet, wobei die lebenden Zellen ausgezählt wurden. Wenn solche Phänomene beobachtet
wurden und eine Reduktion der Anzahl lebender Zellen erkannt wurde,
wurde bestimmt, dass eine Apoptosis induzierende Wirkung positiv
ist.
-
Die
Apoptosis induzierende Wirkung wurde in dem Fall bestätigt, wo
die Fraktion B, das gereinigte Produkt oder Actinomycin D zugesetzt
war. Das Ergebnis ist in 2 angegeben. 2 ist
eine Abbildung, die das Verhältnis
zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl lebender Zellen im
Medium zeigt, wenn die Fraktion B oder das reine Produkt dem oben
genannten Medium von HL-60-Zellen auf eine Endkonzentration von 2
mg/ml bzw. 0,9 mg/ml zugesetzt wurde. Die Abszisse ist eine Inkubationsdauer
(Stunden), während
die Ordinate die Anzahl lebender Zellen (× 105/5
ml) im Medium angibt. In der Abbildung sind offene Kreise die Kontrolle,
wo Wasser zugesetzt ist, offene Rhomben sind der Fall, wo die Fraktion
B zugesetzt ist und offene Kreise sind der Fall, wo das reine Produkt
zugesetzt ist.
-
(5) Physikalische und
chemische Eigenschaften des reinen Produkts mit Apoptosis induzierender
Wirkung
-
Physikalische
und chemische Eigenschaften des im obigen Beispiel 1-(3) genannten reinen
Produkts wurden gemessen.
-
(i) NMR-Analyse
-
Das 1H-NMR-Spektrum wurde mit einem JNM-A500
Nuklearmagnetresonanzgerät
(hergestellt von Nippon Denshi) gemessen.
-
Das
Ergebnis ist durch das in 3 angegebene 1H-NMR-Spektrum
dargestellt. In 3 zeigt die Ordinate die Signalintensität, während die
Abszisse chemische Verschiebung (ppm) zeigt. Übrigens ist die chemische Verschiebung
im 1H-NMR derart dargestellt, dass die chemische
Verschiebung von HOD als 4,65 ppm definiert ist.
1H-NMR
(D2O)
δ 0,7 (N von Methyl am Ende der
Fettsäure),
1,1 (Methylen der Fettsäure
und H von Methyl an der C-5-Position von Fucose), 3,1–5,6 (H
vom Zucker).
-
(II) GC-MS-Analyse
-
Eine
5% methanolische Lösung
von HCl (1 ml) wurde zu 2 mg des in Beispiel 1-(3) genannten reinen Produkts
hinzugefügt
und die Mischung in einem Röhrchen
eingeschlossen und drei Stunden lang bei 85°C erwärmt. Nach dem Abkühlen, wurde
mit 1 ml n-Hexan dreimal extrahiert und der erhaltene Extrakt mit
n-Hexan auf ungefähr
500 μl in
einem Stickstoffstrom aufkonzentriert, so dass eine Probe A erhalten
wurde.
-
Die
verbleibende methanolische Schicht wurde durch Zusatz von Silbercarbonat
neutralisiert und filtriert, Stickstoffdampf wurde auf das Filtrat
geblasen, um es zur Trockene zu verdampfen und der Rückstand wurde
vier Stunden lang unter Verwendung einer Vakuumpumpe getrocknet.
Nach dem Trocknen wurden fünf Tropfen
eines TMS-Regens (das wie folgt hergestellt wurde: 2,6 ml Hexamethyldisilazan
wurden zu 2,0 ml trocknem Pyridin zugegeben, dann 1,6 ml Trimethylchlorsilan
hin zugefügt,
die erhaltene trübe
Substanz durch Zentrifugieren entfernt und der flüssige Überstand
als Reagens verwendet) dem Rückstand
zugesetzt und die Mischung bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen
gelassen. Danach wurde die Mischung zehn Minuten lang auf 50°C erwärmt, abgekühlt und
nach Zusatz von 1 ml Chlorofom gerührt und die Chloroformschicht
mit 1 ml Wasser dreimal gewaschen. Die erhaltene Chloroformlösung wurden
als Probe B verwendet.
-
Die
oben hergestellten Proben A und B wurden unter den folgenden Bedingungen
unter Verwendung eines DX-302 Massenspektrometers (hergestellt von
Nippon Denshi) einer GC-MS-Analyse unterzogen.
-
Probe A
-
- Säule:
TC-1 (G. L. Science), 30 m × 0,25
mm Innendurchmesser
- Temperatur: erhöht
von 130°C
auf 250°C
mit einer Rate von 4°C
pro Minute und über
fünf Minuten
auf 250°C gehalten
- Strömungsrate:
1,2 ml Heliumgas pro Minute
- Massenbereich für
die massenspektrometrische Messung: m/z 50–500
- Wiederholungszeit für
die massenspektrometrische Messung: 3 Sekunden
-
Probe B
-
- Säule:
TC-1 (G. L. Science), 30 m × 0,25
mm Innendurchmesser
- Temperatur: erhöht
von 130°C
auf 300°C
mit einer Rate von 4°C
pro Minute und über
fünf Minuten
auf 300°C gehalten
- Strömungsrate:
1,2 ml Heliumgas pro Minute
- Massenbereich für
die massenspektrometrische Messung: m/z 50–800
- Wiederholungszeit für
die massenspektrometrische Messung: 3 Sekunden
-
Das
Ergebnis zeigt, dass die Proben A und B die in den 4 bzw. 5 dargestellten
Gesamtionenchromatrogramme zeigen. In jeder der abbildungen ist
die Ordinate eine relative Intensität (%), während die oberen und unteren
Teile der Abszisse Retentionszeit (Minuten) bzw. Rasterzahlen sind.
-
Eine
Bestätigung
der Peaks in den von den Proben A und B erhaltenen Chromatogrammen
wurde durch Analyse des Massenspektrums für jeden der Peaks erhalten.
-
Methylester
von Tetradecansäure
(Myristinsäure)
(Peak 2), Hexadecansäure
(Palmitinsäure)
(Peak 3) und Tetradecensäure
(Peak 1) wurden als Hauptkomponenten aus Probe A bestätigt.
-
Aus
Probe B wurden ein Peak (Peak 1) abgeleitet von Glycerin, Peaks
(Peaks 2, 3 und 4) abgeleitet von Fucose, Peaks (Peaks 5 und 6)
abgeleitet von Xylose, ein Peak (Peak 7) abgeleitet von Mannose,
Peaks (Peaks 8, 9 und 10) abgeleitet von Galactose und ein Peak
(Peak 11) abgeleitet von Glucuronsäure bestätigt.
-
Dementsprechend
wurde gefunden, dass das oben genannte reine Produkt Glycerolipid
und/oder Glyceroglycolipid enthält.
-
Beispiel 2
-
(1)
Gemahlenes Produkt (2 kg) aus getrocknetem Gagome Kombu wurde in
20 Litern 80% Ethanol suspendiert, bei 25°C drei Stunden lang gerührt und
filtriert, um lösliche
Stoffe zu entfernen. Der erhaltene Rückstand wurde in 20 Litern
eines Puffers (pH 8,2) suspendiert, der 1,5 Einheiten eines endo-sulfatieren
Fucose enthaltenden Polysaccharids ent hält (siehe WO 97126896), 10%
Ethanol, 100 mM Natriumchlorid und 50 mM Calciumchlorid und bei
25°C 24
Stunden lang gerührt.
Dann wurde diese gerührte
Lösung
filtriert und der Rückstand
mit 10% Ethanol, das 50 mM Natriumchlorid enthält, gewaschen. Der gewaschene
Rückstand wurde
in 40 Litern eines Puffers (pH 6,6) suspendiert, der 4 g Alginsäurelyase
(hergestellt von Nagase Seikagaku Kogyo) enthält, 100 mM Natriumdihydrogenphosphat,
100 mM Natriumchlorid und 10% Ethanol und bei 25°C 96 Stunden lang gerührt. Die
Lösung
wurde zentrifugiert und der erhaltene flüssige Überstand aufkonzentriert unter
Verwendung eines Ultrafilters mit einer Hohlfaser mit einem Exklusionsmolekulargewicht
von 100000 und mit 10% Ethanol substituiert, das 100 mM Natriumchlorid
enthält.
Zu dieser Lösung
wurde eine 0,4 M Calciumacetatlösung
des selben Volumens zugesetzt, die Mischung 30 Minuten lang gerührt und
zentrifugiert und der erhaltene flüssige Überstand unter den selben Bedingungen
wie oben einer Ultrafiltration unterzogen und mit 100 mM Natriumchlorid
substituiert. Zu dieser Lösung
wurde Natriumchlorid zugesetzt, um eine Konzentration von 1 M zu
erreichen und der pH wurde auf 8 eingestellt, worauf 1,4 Liter eines
Extrakts von Gagome Kombu erhalten wurden.
-
Der
Extrakt wurde mit einer Säule
von 2,9 Litern Phenylcellulofine (hergestellt von Seikagaku Kogyo) behandelt
und mit 6 Litern 1 M Natriumchlorid, 6 Litern Wasser und 8 Litern
Ethanol in dieser Reihenfolge eluiert.
-
Die
Apoptosis induzierende Wirkung jeder der eluierten Fraktionen wurden
nach einem in Beispiel 1-(4) genannten Verfahren gemessen, worauf
eine Apoptosis induzierende Wirkung und eine Unterdrückungswirkung
bei Krebszellen in der mit Ethanol eluierten Fraktion festgestellt
wurde.
-
Die
mit Ethanol eluierte Fraktion wurde aufkonzentriert und zur Trockene
eingedampft, der Rückstand in
Ethanol aufgelöst,
so dass eine Lösung
von 175 ml erhalten wurde, 58 ml der erhaltenen Lösung wurden mit
einer Säule
von 1130 ml Sepharose LH-60 (hergestellt von Pharmacia) behandelt,
die zuvor mit Ethanol ins Gleichgewicht gebracht wurde, die Säule wurde
mit Ethanol eluiert und das Eluat wurde in jeweils 60 ml aufgefangen.
-
Das
Elutionsmuster ist in 6 angegeben. 6 ist
eine Abbildung, die das Ergebnis einer Chromatographie mit einer
Säule von
Sepharose LH-60
zeigt, in der die Ordinate die Absorption bei 230 nm ist und die
Abszisse die Fraktionszahlen angibt.
-
Die
Apoptosis induzierende Wirkung jeder der eluierten Fraktionen wurden
nach dem in Beispiel 1-(4) genannten Verfahren gemessen, worauf
gefunden wurde, dass die Fraktionen mit den Nummern 8–15 und 27–49 keine
Wirkung zeigten, während
die Fraktionen mit den Nummern 16–21 und 22–26 eine Apoptosis induzierende
Wirkung und eine Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen
zeigten.
-
Unter
diesen Fraktionen, die eine potente Wirkung zeigten, wurden drei
Fraktionen (Fraktionen der Nr. 20, 21 und 23) einer Analyse der
Bestandteile nach einem in Beispiel 1 genannten Verfahren unterzogen.
-
Die 7, 8, 9, 10, 11 und 12 zeigen
die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten
jeder der Fraktionen Nr. 20, 21 und 23. Die 7, 8 und 9 sind
Abbildungen, die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten
jeder der Fraktionen Nr. 20, 21 und 23 zeigen, während die 10, 11 und 12 Abbildungen
sind, die Gesamtionenchromatogramme der Zuckerkomponenten jeder
der Fraktionen Nr. 20, 21 und 23 zeigen. In jeder der Abbildungen
ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der o bere Teil und der
untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen
angeben.
-
In
den 7 und 10 ist gezeigt, dass Peaks von
Methylestern von Tetradecansäure
(Myristinsäure)
(Peak 1), Hexadecansäure
(Palmitinsäure)
(Peak 3 in 7), Hexadecensäure (Peak
2 in 7) und Octadecensäure (Oleinsäure) (Peak 4 in 7),
ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 10)
und von Galactose (Peaks 2, 3 und 4 in 10) abgeleitete
Peaks in der Fraktion mit der Nr. 20 erfasst wurden. Ferner ist
in den 8 und 11 gezeigt, dass Peaks von Methylestern
von Tetradecansäure
(Myristinsäure)
(Peak 1 in 8), Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
3 in 8), Hexadecensäure
(Peak 2 in 8) und Octadecensäure (Oleinsäure) (Peak
4 in 8), ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1
in 11) und von Galactose (Peaks 2, 3 und 4 in 11)
abgeleitete Peaks in der Fraktion mit der Nr. 21 erfasst wurden.
-
Außerdem ist
in den 9 und 12 gezeigt, dass Peaks von Methylestern
von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
1 in 9) und Octadecensäure (Oleinsäure) (Peak 2 in 9),
ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 12)
und von Galactose (Peaks 2, 3 und 4 in 12) abgeleitete
Peaks in der Fraktion mit der Nr. 23 erfasst wurden.
-
Auf
diese Weise wurde bestätigt,
dass die obigen Fraktionen Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid enthalten
und es wurde klargestellt, dass Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid
eine Aopotosis induzierende Wirkung und eine Wirkung zur Unterdrückung des
Wachstums von Krebszellen aufweist/aufweisen.
-
(2)
Fraktionen Nr. 16–26
der wie in Beispiel 2-(1) erwähnt
aus der Säule
mit Sepharose LH-60 eluierten Fraktionen wurden aufgenommen, aufkonzentriert
und zur Trockene eingedampft, der getrocknete Rückstand wurde in Chloroform
aufgelöst,
die Lösung
mit einer Säule
von 200 ml latrobeads 6RS-8060 (hergestellt von latron) behandelt,
die zuvor mit Chloroform ins Gleichgewicht gebracht wurde, und die
Säule wurde
mit Chloroform eluiert und dann mit einer Mischung von Chloroform
und Aceton in einem Verhältnis
von 80 : 20, 60 : 40, 40 : 60 und 20 : 80 nacheinander eluiert.
Als Ergebnis wurde bestätigt,
dass die mit Chloroform und mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform
und Aceton eluierten Fraktionen eine starke Apoptosis induzierende Wirkung
zeigen.
-
Die
Fraktionen, in denen eine Apoptosis induzierende Wirkung gefunden
wurde, wurden einer Analyse der Bestandteile nach einem in Beispiel
1 genannten Verfahren unterzogen.
-
Die 13, 14, 15 und 16 zeigen
die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten
jeder der mit Chloroform und mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform
und Aceton eluierten Fraktionen. Die 13 und 14 sind
die Abbildungen, die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten
jeder der mit Chloroform und mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform
und Aceton eluierten Fraktionen, während die 15 und 16 die
Abbildungen sind, die Gesamtionenchromatogramme der Zuckerkomponenten
jeder der mit Chloroform und mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform
und Aceton eluierten Fraktionen zeigen. In jeder der Abbildungen
ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der obere Teil und der
untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen
angeben.
-
In
den 13 und 15 ist
gezeigt, dass ein Peak von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
1 in 13) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak
1 in 15) aus der mit Chloroform eluierten Fraktion
erfasst wurden, während
in den 14 und 16 gezeigt
ist, dass Peaks von Methylestern von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak
1 in 14) und Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
2 in 14) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak
1 in 16) aus der mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform
und Aceton eluierten Fraktion erfasst wurden.
-
Damit
wurde bestätigt,
dass die obigen Fraktionenen Glycerolipid enthalten und es wurde
klargestellt, dass das Glycerolipid eine Aopotosis induzierende
Wirkung und eine Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen
aufweist.
-
Beispiel 3
-
(1)
Wasser wurde zu 230 ml eines 40-fachen Konzentrats des in Beispiel
1-(1) genannten aus Gagome Kombu gewonnenen Extrakts zugesetzt,
so dass sich 910 ml ergeben, dann wurden 490 ml Ethanol dazugegeben
und die Mischung zwei Stunden lang gerührt und zentrifugiert, so dass
eine in 35% Ethanol lösliche Substanz
gebildet wird. Die 35% ethanolisch lösliche Substanz wurde aufkonzentriert
und zur Trockene eingedampft, 100 ml Wasser hinzugefügt, dann
400 ml einer 2 : 1 Mischung von Chloroform und Methanol zugegeben,
die Mischung gut gerührt
und der dabei abgeschiedene flüssige Überstand
aufgenommen. Die untere organische Lösemittelphase wurde verdampft,
Wasser hinzugefügt,
so dass 100 ml erhalten werden und diese Vorgänge dreimal wiederholt. Die
erhaltene Lösung
der oberen Schicht wurde aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft
und 10 ml Chloroform zugegeben, so dass eine Substanz erhalten wurde,
die in Chloroform löslich
ist. Diese chloroformlösliche
Substanz wurde aufkonzentriert und in einer Säule mit 200 ml latrobeads 6RS-8060
(hergestellt von latron) behandelt, die zuvor mit Chloroform ins
Gleichgewicht gebracht wurde, und die Säule wurde mit Chloroform eluiert
und dann mit Mischungen von Chloroform und Aceton in Verhältnissen von
90 : 10, 70 : 30, 40 : 60 und 20 : 80 nacheinander eluiert.
-
Als
Ergebnis wurde für
die mit Chloroform und mit einer 40 : 60 Mischung von Chloroform
und Aceton eluierten Fraktionen eine starke Apoptosis induzierende
Wirkung bestätigt.
-
(2)
Die mit Chloroform eluierte Fraktion wurde auf eine Silicagelplatte
60F254 (hergestellt von Merck) aufgetüpfelt und
einer Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung einer 9 : 1 Mischung von Hexan und Ether als Entwickler
unterzogen, worauf ein einziger Spot mit einer Apoptosis induzierenden
Wirkung und einer Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen
an der Stelle erfasst wurde, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25
beträgt.
-
Es
wurde eine Analyse verschiedener Bestandteile für diesen Spot nach einem in
Beispiel 1 genannten Verfahren durchgeführt.
-
Die 17 und 18 zeigen
die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten
des Spots, wo der Rf-Wert ungefähr
0,25 beträgt. 17 ist
eine Abbildung, die das Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponenten
des Spots zeigt, wo der Rf-Wert
ungefähr
0,25 beträgt,
während 18 eine
Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten
des Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt. In jeder
der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der
obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten)
bzw. die Rasterzahlen angeben.
-
In
den 17 und 18 ist
gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak
1 in 17), Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
2 in 17) und Octadecansäure (Oleinsäure) (Peak 3 in 17)
und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 18)
aus dem Spot erfasst wurden, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25
beträgt.
-
(3)
die mit einer 40 : 60 Mischung von Chloroform und Aceton eluierte
Fraktion wurde einer Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung einer 95 : 12 Mischung von Chloroform und Methanol
als Entwickler unterzogen, worauf ein Spot mit einer Apoptosis induzierenden
Wirkung an der Stelle erfasst wurde, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33
beträgt.
-
Es
wurde eine Analyse verschiedener Bestandteile für diesen Spot nach einem in
Beispiel 1 genannten Verfahren durchgeführt.
-
Die 19 und 20 zeigen
die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten
des Spots, wo der Rf-Wert ungefähr
0,33 beträgt. 19 ist
eine Abbildung, die das Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponenten
des Spots zeigt, wo der Rf-Wert
ungefähr
0,33 beträgt,
während 20 eine
Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten
des Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt. In jeder
der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der
obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten)
bzw. die Rasterzahlen angeben.
-
In
den 19 und 20 ist
gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak
1 in 19) und Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
2 in 19) und von Galactose abgeleitete Peaks (Peaks
2, 3 und 4 in 20) und ein von Glycerin abgeleiteter
Peak (Peak 1 in 20) von dem Spot erfasst wurden,
wo der Rf-Wert ungefähr
0,33 beträgt.
-
Damit
wurde bestätigt,
dass die im oben angegebenen Beispiel 3-(2) und Beispiel 3-(3) erwähnten Spots
das Glycerolipid und Glyceroglycoli pid enthalten und es wurde klargestellt,
dass das Glycerolipid und Glyceroglycolipid eine Apoptosis induzierende
Wirkung und eine Wirkung- zur
Unterdrückung
des Wachstums von Krebszellen aufweisen.
-
Beispiel 4
-
Ein
zehnfaches Volumen an Wasser wurde zu 2,5 kg getrocknetem Gagome
Kombu zerkleinert in Würfel
von 1 mm zugegeben und nachdem diese Seetangstücke gequollen sind, wurde die überstehende Flüssigkeit
durch Zentrifugieren entfernt. Ethanol und Wasser wurden zu dem
gequollenen Seetang hinzugegeben, so dass schließlich ein 10-faches Volumen an
60% Ethanol vorhanden ist und dann wurde die Mischung bei 37°C drei Stunden
lang gerührt
und zentrifugiert, so dass die Überstandflüssigkeit
erhalten wird. Der flüssige Überstand
wurde aufkonzentriert, dann wurden zu 750 ml der wässrigen
Lösung
Chloroform und Methanol zugegeben, wodurch das Verhältnis von
Chloroform : Methanol : Wasser 2 : 4 : 0,8 beträgt, die Mischung wurde gut
gerührt
und die Lösung
der organischen Phase, die die untere Schicht darstellt, wurde abgetrennt.
-
Die
Lösung
der unteren Schicht wurde aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft,
eine chloroformlösliche
Substanz wurde daraus hergestellt und mit 200 ml einer Säule von
latrobeads 6RS-8060 (hergestellt von latron) behandelt, die zuvor
mit Chloroform ins Gleichgewicht gebracht wurde, und die Säule wurde mit
Chloroform eluiert und dann mit einer Mischung von Chloroform und
Aceton (40 : 60), Aceton und Methanol nacheinander eluiert.
-
Jede
der eluierten Fraktionen wurde aufkonzentriert, auf eine Silicagelplatte
60F254 aufgetüpfelt und Erfassung des Glycolipids
wurde unter Verwendung eines Primulinreagens und eines Orcinolsulfatreagens durchgeführt, worauf
das Vorhandensein von Glycolipid(en) in beiden Fraktionen bestätigt wurde.
Das Ergebnis zeigt, dass die mit einem Lösemittel mit einer geringeren
Polarität
eluierte Fraktion höhere
Mengen an Lipiden enthält
und eine stärkere
Wirkung in Hinblick auf eine Apoptosis induzierende Wirkung und
eine Wirkung zur Unterdrückung
des Wachstums von Krebszellen zeigt.
-
Beispiel 5
-
Trockenes
Gagome Kombu wurde in einem Mixer zerkleinert. Zu 0,5 g des erhaltenen
Seetangpulvers wurden 25 ml (1) 60 mM HCl, (2) 1 M Essigsäure, (3)
1% NaHCO3, (4) 1% Na2CO3, (5) 1% Na2CO3, (6) einer 2 : 1 Mischung von Chloroform
und Methanol, (7) 75% wässrige
Ethanollösung,
(8) 0,1% SDS oder (9) 0,01% SDS zugegeben und es wurde eine Extraktion über drei
Stunden bei 60°C
für (1),
(2), (3), (4) und (7) oder bei 37°C
für alle
anderen durchgeführt.
Nachfolgend werden die Lösungen
von (1) bis (9) als primäre
Extrakte bezeichnet. (1) und (2) wurden mit Na2CO3 neutralisiert, (4) und (5) wurden mit HCl
neutralisiert und alle anderen wurden zentrifugiert wie sie sind
und dann den folgenden Behandlungen unterzogen.
- A.
Zu dem Niederschlag wurden 25 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung zugegeben,
eine Extraktion wurde bei 60°C über zwei
Stunden durchgeführt,
nach Zentrifugieren wurde der flüssige Überstand
aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft und der Rückstand
wurde in 1 ml einer 75% wässrigen
Ethanollösung
aufgelöst.
- B. Zu 10 ml des flüssigen Überstands
wurden 30 ml Ethanol zugegeben gefolgt vom Vermischen, nach Zentrifugieren
wurde der flüssige Überstand
aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand
wurde in 0,4 ml einer 75% wässrigen
Ethanollösung
aufgelöst.
- C. Der flüssige Überstand
wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand
wurde in 1 ml einer 75% wässrigen
Ethanollösung
aufgelöst.
-
Der
hergestellte Extrakt wurde mit einer 75% wässrigen Ethanollösung verdünnt, jeweils
5 μl davon wurden
in je eine Vertiefung einer 96-Loch Mikrotiterplatte gegeben und
luftgetrocknet, 100 μl
eines RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60
Zellen wurden hinzugegeben und eine Wirkung zum Unterdrücken des
Wachstums von Krebszellen nach einem MTT-Verfahren gemessen, wie
in Beispiel 7 beschrieben, das später erläutert wird.
-
Das
erhaltene Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 zeigt das
Verhältnis
zwischen dem Extraktionsverfahren und der Wirkung zum Unterdrücken des
Wachstums von Krebszellen, wo die Zahlen in der Tabelle die Verdünnungsraten
der verdünnten
Lösung
mit der Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen zeigt. Vor dem Extrahieren mit einer
75% wässrigen
Ethanollösung
wurde der pulverisierte Seetang mit der sauren ((1)A) oder alkalischen
((3)A, (4)A, (5)A) Lösung
für den
primären
Extrakt behandelt, wodurch im Vergleich zum nicht behandelten Fall
((7)C) eine Substanz mit einer zweifach stärkeren Wirkung zum Unterdrücken des
Wachstums von Krebszellen extrahiert wurde. Außerdem wurde nach dem Verfahren
von Beispiel 8, das später
erläutert
wird, eine Apoptosis induzierende Wirkung dieser Fraktionen gemessen,
um die Apoptosis induzierende Wirkung dieser Fraktionen mit einer
Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen zu bestätigen.
-
-
Beispiel 6
-
(1)
Lyophyllum ulmarium M-8171 (FERM BP-1415) wurden gemäß einem
in der geprüften
japanischen Patentveröffentlichung
(Kokoku) Hei-06/34,660
genannten Verfahren kultiviert, so dass ein Fruchtkörper gebildet
wurde. Übrigens
ist der erhaltene Fruchtkörper
der selbe wie der Fruchtkörper,
der als „Yamabiko
Honshimeji" auf
dem japanischen Markt erhältlich
st. Außerdem
wurde Lyophyllum decastes K-3304 (FERM BP-4348) gemäß einem in der japanischen
Offenlegungsschrift (Kokai) Hei-03/65,261
genannten Verfahren kultiviert, so dass ein Fruchtkörper gebildet
wurde (japanischer Name Hatakeshimeji). Jeder dieser Fruchtkörper und
im Handel erhältliche
Maitake, Enokitake, Shiitake und Nameko wurden gefriergetrocknet
und dann wurden die erhaltenen gefriergetrockneten Produkte gemahlen,
so dass sich ihre gemahlenen Produkte ergeben.
-
Ein
75% wässriges
Ethanol (25 ml) wurde zu jeweils 0,5 g der oben hergestellten gemahlenen
Produkte hinzugefügt
und eine Extraktion bei Raumtemperatur über zwei Stunden durchgeführt. Nachdem
durch Zentrifugieren ein Extrakt erhalten ist, wurde der Extrakt
aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, so dass
ein trockenes Produkt erhalten wurde. Dieses Trockenprodukt wurde
in 1 ml Wasser aufgelöst,
so dass ein ethanolischer Extrakt hergestellt wird.
-
(2)
Eine Wirkung des im obigen Beispiel 6-(1) genannten ethanolischen
Extrakts zum Unterdrücken des
Wachstums von Krebszellen wurde gemessen.
-
Jeder
der ethanolischen Extrakte wurde durch Filtern durch ein GD/X PES
Filter (hergestellt von Whatman) sterilisiert und eine Verdünnungsreihe
unter Verwendung von sterilisiertem Wasser hergestellt. Jeweils 10 μl der verdünnten Lösung wurden
in eine der Vertiefungen einer 96-Loch Mikrotiterplatte gegeben, 100 μl eines RPMI
1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60 Zellen wurden
hinzugegeben und Inkubation bei 37°C 48 Stunden lang in Gegenwart
von 5% Kohlendioxidgas durchgeführt.
Die Form der Zellen wurde unter einem optischen Mikroskop beobachtet,
10 μl einer
phosphatgepufferten wässrigen
Salzlösung mit
5 mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, hergestellt
von Sigma) zugegeben, die Inkubation für weitere vier Stunden fortgesetzt
und der Zustand des Wachstums der Zellen unter einem Mikroskop beobachtet.
In der Zwischenzeit wurden 100 μl
2-Propylalkohol mit 0,04 N HCl hinzugefügt, gefolgt von gutem Rühren und
die Absorption bei 530 nm wurde gemessen und als Grad des Zellwachstums herangezogen.
-
In
Hinblick auf die Wirkung dieser ethanolischen Extrakte von Pilzen
zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen wurde gefunden, dass die Zellen bei
einer 30-fach verdünnten
Lösung
von Lyophyllum ulmarium und einer 10-fach verdünnten Lösung von Lyophyllum decastes
abgetötet
wurden, wodurch eine starke Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen
festgestellt wurde und Apoptosiskörper gefunden wurden. Im Falle
einer 3-fach verdünnten
Lösung
von Maitake, Enokitake, Shiitake und Nameko wurden die Zellen abgetötet, während im
Falle von 10-fach verdünnten
Lösungen
Apoptosiskörper
gefunden wurden, wodurch jeder der ethanolischen Extrakte dieser
Pilze starke Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen und Apoptosis induzierende Wirkung
zeigte.
-
(3)
In Hinblick auf den ethanolischen Extrakt von Lyophyllum ulmarium
wurde eine Analyse der Bestandteile nach einem in Beispiel 1 genannten
Verfahren durchgeführt.
-
Die 21 und 22 zeigen
die Gesamtionenchromatogramme von Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten
im ethanolischen Extrakt von Lyophyllum ulmarium. 21 ist
eine Abbildung des Gesamtionenchromatogramms der Lipidkomponenten
des ethanolischen Extrakts von Lyophyllum ulmarium, während 22 eine
Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten
des ethanolischen Extrakts von Lyophyllum ulmarium zeigt. In jeder
der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der
obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten)
bzw. die Rasterzahlen angeben.
-
In
den 21 und 22 ist
gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
1 in 21) und cis-9,cis-12-Octadecadiensäure (Linolensäure) (Peak
2 in 21), von Glucose abgeleitete Peaks (Peaks 2, 3
und 4 in 22), ein von Mannitol abgeleiteter
Peak (Peak 5 in 22) und ein von Glycerin abgeleiteter
Peak (Peak 1 in 22) im ethanolischen Extrakt
von Lyophyllum ulmarium nachgewiesen wurden.
-
Das
Vorhandensein von Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid wurde
auch in den ethanolischen Extrakten von anderen Pilzen bestätigt.
-
Beispiel 7
-
In
Beispiel 6 genanntes gefrorenes gemahlenes Lyophyllum ulmarium (5
g) wurde in 250 ml einer 75% wässrigen
Ethanollösung
suspendiert und die Suspension bei Raumtemperatur zwei Stunden lang
geschüttelt, um
sie durch Zentrifugieren in einen flüssigen Überstand und einen Niederschlag
zu trennen, worauf ein Extrakt hergestellt wurde. Der Extrakt wurde
aufkonzentriert und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers (30°C) zur Trockene
eingedampft und der Rückstand
wurde in 20 ml einer 75% wässrigen
Ethanollösung
aufgelöst,
so dass ein konzentrierter Extrakt von Lyophyllum ulmarium erhalten
wurde. Zu einem Teil dieses konzentrierten Extrakts von Lyophyllum
ulmarium wurde ein halbes Volumen Wasser hinzugefügt und das
selbe Volumen an Chloroform und die erhaltene Suspension wurde stehen
gelassen, so dass sie sich in eine obere und eine untere Schicht
trennt. Jede der fraktionierten oberen und unteren Schichten wurde
aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft, der Rückstand
in einem halben Volumen (des verwendeten konzentrierten Extrakts
von Lyophyllum ulmarium) einer 75% wässrigen Ethanollösung aufgelöst und die
Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen jeder der Fraktionen wie folgt gemessen.
-
Verdünnungsreihen
der aufgelösten
Lösung
jeder der Fraktionen in 75% wässrigem
Ethanol wurden unter Verwendung einer 75% wässrigen Ethanollösung hergestellt.
Jeweils 5 μl
der verdünnten
Lösungen
wurden in eine 96-Loch Mikrotiterplatte gegeben und getrocknet,
100 μl eines
RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60 Zellen (ATCC CCL-240)
wurden hinzugegeben und eine Inkubation bei 37°C über 48 Stunden durchgeführt. Nachdem
die Form der Zellen unter einem optischen Mikroskop beobachtet wurde,
wurden 10 μl
einer gepufferten wässrigen
Salzlösung
mit 5 mg/ml MTT zugegeben, die Inkubation für weitere vier Stunden fortgesetzt
und der Zustand des Wachstums der Zellen unter einem Mikroskop beobachtet.
In der Zwischenzeit wurden 100 μl
2-Propylalkohol mit 0,04 N HCl hinzugefügt, gefolgt von gutem Rühren und
die Absorption bei 590 nm wurde gemessen und als Grad des Zellwachstums
herangezogen (ein MTT-Verfahren).
-
Das
Ergebnis zeigt, dass die Zellen von einer 20-fach verdünnten Lösung der
obigen Fraktion von der unteren Schicht abgetötet wurden, worauf eine starke
Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen festgestellt wurde und Apoptosiskörper bestätigt wurden.
Damit wurde dieser konzentrierte Extrakt von Lyophyllum ulmarium
einer Fraktionierung mit Chloroform auf die selbe Weise unterzogen,
anstelle der Auflösung
in einer 75% wässrigen
Ethanollösung
in einer mobilen Phase für
eine Silicagelsäulenchromatographie aufgelöst und einer
Silicagelsäulenchromatographie
unterzogen. Die Silicagelsäulenchromatographie
wurde unter zwei Bedingungen unter Verwendung einer mobilen Phase
bestehend aus Chloroform : Methanol : Wasser = 65 : 25 : 4 (Bedingung
Nr. 1) und der aus Chloroform : Methanol = 65 : 25 (Bedingung Nr.
2) unabhängig voneinander
durchgeführt.
Jede der Fraktionen der Silicagelsäulenchromatographie wurde aufkonzentriert und
zur Trockene eingedampft, der Rückstand
in einer 75% wässrigen
Ethanollösung
in 1/20 des ursprünglichen
Flüssigkeitsvolumens
aufgelöst,
seine Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen nach dem selben MTT-Verfahren wie
oben gemessen und die Fraktion, wo Wirkung bestätigt wurde, wurde mittels einer
TLC (Chloroform : Methanol : Wasser = 65 : 25 : 4) analysiert. Das
Ergebnis zeigt, dass unter Bedingung Nr. 1 die Wirkung in einer
Fraktion A verfügbar
ist, in der auf Primulinreagens (Lipide) ansprechende Spots, auf
Ninhydrinreagens (Aminogruppe) an sprechende Spots, auf Orcinolsulfatreagens
(Zucker) ansprechende Spots und auf Dittmerreagens (Phospholipide)
ansprechende Spots vorhanden sind, und in einer Fraktion B, in der
auf Primulinreagens ansprechende Spots und auf Orcinolsulfatreagens
ansprechende Spots vorhanden sind. Unter der Bedingung Nr. 2 war
die Wirkung in einer Fraktion C verfügbar, in der auf ein Orcinolsulfatreagens
ansprechende Spots vorhanden sind, in einer Fraktion D, in der auf
ein Primulinreagens ansprechende Spots und auf ein Orcinolsulfatreagens
ansprechende Spots vorhanden sind und in einer Fraktion E, in der
auf ein Primulinreagens ansprechende Spots, auf Ninhydrinreagens
ansprechende Spots und auf ein Orcinolsulfatreagens ansprechende
Spots vorhanden sind. Ferner wurde die Fraktion A und der Bedingung
Nr. 1 aufgenommen, aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft,
in einer mobilen Phase aufgelöst
und einer Silicagelsäulenchromatographie
unterzogen. Eine Mischung aus Chloroform und Methanol in einem Verhältnis von
95 : 5 wurde als mobile Phase verwendet (Bedingung Nr. 3). Jede
der Fraktionen wurden nach einem MTT-Verfahren in der selben Weise
wie zuvor untersucht und die Fraktionen, wo die Wirkung bestätigt wurde,
wurden durch eine TLC analysiert (Chloroform : Methanol = 95 : 5).
Das Ergebnis zeigt, dass unter Bedingung Nr. 3 die Wirkung in einer
Fraktion F verfügbar
war, in der auf ein Primulinreagens ansprechende Spots vorhanden sind,
in einer Fraktion G, in der auf ein Primulinreagens ansprechende
Spots und auf ein Orcinolsulfatreagens ansprechende Spots vorhanden
sind und in einer Fraktion H, in der auf ein Orcinolsulfatreagens
ansprechende Spots vorhanden sind. Die Apoptosis induzierende Wirkung
dieser Fraktionen, die zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen
wirksam sind, wurde durch die Bildung von Apoptosiskörpern betätigt.
-
Beispiel 8
-
Das
in Beispiel 6 genannte gemahlene gefriergetrocknete Produkt (1 g)
von Lyophyllum ulmarium wurde in 50 ml einer 75% wässrigen
Ethanollösung
oder einer 50% wässrigen
Ethanollösung
suspendiert, bei 37°C
zwei Stunden lang geschüttelt
und zentrifugiert, um es in einen flüssigen Überstand und einen Niederschlag
zu trennen, worauf jeder Extrakt hergestellt wurde. Jeder Extrakt
wurde aufkonzentriert und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers
(30°C) zur
Trockene eingedampft und in 8 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung oder
einer 50% wässrigen
Ethanollösung
aufgelöst,
so dass ein konzentrierter Extrakt von Lyophyllum ulmarium erhalten
wurde.
-
Jeder
der konzentrierten Extrakte von Lyophyllum ulmarium wurde mit einer
75% oder 50% wässrigen Ethanollösung verdünnt. Die
verdünnte
Lösung
wurde mit einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren untersucht. Zelltod wurde
in einem Abschnitt mit einer 10-fach verdünnten Lösung des Extrakts mit einer
75% oder 50% wässrigen
Ethanollösung
festgestellt und eine Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen
wurde bestätigt.
Damit wurde bestätigt,
dass unter den Bedingungen der Extraktion mit einer 75% wässrigen
Ethanollösung
und einer 50% wässrigen
Ethanollösung
Substanzen, die zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen wirksam sind, extrahiert wurden. Ferner
wurde eine Apoptosis induzierende Wirkung unter Verwendung dieser
konzentrierten Extrakte von Lyophyllum ulmarium gemessen. 25 μl jedes der oben
genannten konzentrierten Extrakte wurde als Probe verwendet, Ethanol
daraus verdampft, der Rückstand
zu 2,5 × 105 HL-60 Zellen/4,5 ml zugegeben, die in einem
RPMI 1640 Medium mit 10% fetalem Kalbsserum inkubiert wurden, und
die Inkubation wurde bei 37°C
48 Stunden lang durchgeführt.
Gleichzeitig wurden Kontrollproben unter Verwendung von destilliertem
Wasser und einer Lösung
von Actinomycin D (10 μg/ml) hergestellt,
von dem bekannt ist, dass es eine Apoptosis induzierende Wirkung
aufweist. Die Bildung von Apoptosiskörpern, Kontraktion von Zellen
und Aggregation von Kernen wurde mit unbewaffnetem Auge unter einem
optischen Mikroskop beobachtet und die Anzahl der lebenden Zellen
ausgezählt.
Wenn ein solches Phänomen
beobachtet wurde und eine Reduzierung der Anzahl lebender Zellen
festgestellt wurde, wurde der Probe eine Apoptosis induzierende
Wirkung zugesprochen. Das Ergebnis zeigt, dass die Extrakte mit
einer 75% wässrigen
Ethanollösung
und einer 50% wässrigen
Ethanollösung
eine Apoptosis induzierende Substanz enthalten.
-
Beispiel 9
-
(1)
Eine 75% wässrige
Ethanollösung
(25 ml) wurde zu jeweils 0,5 g von gefriergetrocknetem Pulver von
im Handel erhältlichem
Hiratake (Pleurotus ostreatus) und gemeinem Pilz (Agarius bisporus
oder dergleichen) zugegeben und eine Extraktion bei 37°C über zwei
Stunden durchgeführt.
Der flüssige Überstand
nach der Zentrifugierung wurde aufkonzentriert und im Vakuum zur
Trockene eingedampft, der Rückstand
in 1 ml einer 75% wässrigen
Ethanollösung
aufgelöst
und die Lösung
mit einer 75% wässrigen
Ethanollösung
verdünnt.
Zu 1 μl
der verdünnten
Lösung
wurden 100 μl
eines RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60
Zellen hinzugegeben und die Mischung einer Messung auf Wirkung zum
Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen nach einem in Beispiel 7 genannten
MTT-Verfahren unterzogen und auch einer Messung einer Apoptosis
induzierenden Wirkung nach einem in Beispiel 8 genannten Verfahren.
Das Ergebnis zeigt, dass eine zweifach verdünnte Lösung von Hiratake und eine
nicht verdünnte
Lösung
von gemeinem Pilz beide Wirkung zeigten.
-
(2)
Zu 40 g von in Beispiel 6 genanntem Bunashimeji (Lyophyllum ulmarium)
wurden 0 (0%), 50 (25%), 100 (50%) oder 150 ml (75%) Ethanol und
160, 110, 60 oder 10 ml Wasser zugegeben, die Mischung 30 Sekunden
lang in einem Mixer homogenisiert, bei Raumtemperatur zwei Stunden
lang geschüttelt
und filtriert, so dass ein Extrakt erhalten wurde. Der Extrakt wurde
mit einer 75% wässrigen
Ethanollösung
verdünnt
und eine Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen und eine Apoptosis induzierende Wirkung
nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren bzw. nach einem
in Beispiel 8 genannten Verfahren gemessen. Das Ergebnis zeigt,
dass beide Wirkungen in einer zweifach verdünnten Lösung der Extrakte mit 0,25
und 50% wässrigen
Ethanollösungen
und auch in einer fünffach
verdünnten
Lösung
einer 75% wässrigen
Ethanollösung verfügbar waren.
-
Zu
40 Gramm des oben genanten Bunashimeji, in 3–5 mm Würfel geschnitten, wurden 50
(25%), 100 (50%) oder 150 ml (75%) Ethanol und 110, 60 oder 10 ml
Wasser zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur zwei Stunden
lang geschüttelt
und filtriert, so dass es einen Extrakt ergibt. Der Extrakt wurde
mit einer 75% wässrigen
Ethanollösung
verdünnt
und seine Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen nach einem in Beispiel 7 genannten
MTT-Verfahren gemessen, während
seine Apoptosis induzierende Wirkung nach einem in Beispiel 8 genannten
Verfahren gemesssen wurde. Das Ergebnis zeigt, dass beide Wirkungen
in der ursprünglichen
(nicht verdünnten)
Lösung
des Extrakts mit 25% Ethanol und in der zweifach verdünnten Lösung der
Extrakte mit 50% und 75% Ethanol verfügbar waren.
-
(3)
Im Handel erhältlicher
Shiitake (Cortinellius shiitake) wurde gefriergetrocknet und gemahlen
und das erhaltene Pulver zwei Stunden lang unter den in Tabelle
2 genannten Bedingungen extrahiert.
-
-
Nach
der Extraktion wurden unlösliche
Stoffe durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand aufkonzentriert und
im Vakuum zur Trockene eingedampft und in 1 ml einer wässrigen
Ethanollösung
mit der selben Konzentration aufgelöst, wie sie für die Extraktion
verwendet wurde. Die Lösung
wurde mit einer 75% wässrigen
Ethanollösung
verdünnt
und ihre Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen nach einem in Beispiel 7 genannten
MTT-Verfahren gemessen, während
seine Apoptosis induzierende Wirkung nach einem in Beispiel 8 genannten
Verfahren gemesssen wurde, worauf beide Wirkungen in einer zehnfach
verdünnten
Lösung
von (1), einer zweifach verdünnten
Lösung
von (2), einer fünffach
verdünnten
Lösung
von (3) und einer fünffach
verdünnten
Lösung
von (4) verfügbar
waren.
-
(4)
Im Handel erhältlicher
Shiitake wurde in Köpfe
und Stengel getrennt. Beide wurden getrennt gefriergetrocknet und
gemahlen. Zu 0,5 g des erhaltenen Pulvers wurden 25 ml einer 75%
wässrigen
Ethanollösung
zugegeben gefolgt vom Extrahieren bei 37°C über zwei Stunden. Der flüssige Überstand
nach dem Zentrifugieren wurde aufkonzentriert und im Vakuum zur
Trockene eingedampft, der Rückstand
in 1 ml einer 75% wässrigen
Ethanollösung
aufgelöst
und die erhaltene Lösung
mit einer 75% wässrigen
Ethanollösung
verdünnt.
Eine Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen und eine Apoptosis induzierende Wirkung
wurden nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren bzw. einem
in Beispiel 8 genannten Verfahren gemessen, worauf beide Wirkungen
in einer zweifach verdünnten
Lösung
des Extrakts der Köpfe
und in einer 20-fach verdünnten
Lösung
des Extrakts der Stengel verfügbar
waren. Getrockneter chinesischer Shiitake einer hohen Qualität und auch
Köpfe und
Stengel des chinesischen Shiitake einer mittleren Qualität wurden
mit einem Mixer zerkleinert und die selbe Extraktion und die selben
Messungen auf Apoptosis induzierende Wirkung durchgeführt, worauf
fünffach
verdünnte
Lösungen
aller Extrakte der hohen Qualität
und Köpfe
und Stengel der mittleren Qualität
beide Wirkungen zeigten.
-
Beispiel 10
-
(1)
Zu 0,5 g von im Handel erhältlichen
Matcha (gepulverter grüner
Tee) wurden 25 ml Wasser einer 75% wässrigen Ethanollösung zugegeben
und die Mischung zwei Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Der
Extrakt wurde zentrifugiert und der flüssige Überstand aufkonzentriert und
im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 1 ml Wasser aufgelöst.
-
Der
Extrakt wurde in einer Reihe von 1-fach bis 100-fach verdünnt. Zehn μl jeder der
verdünnten
Lösungen
und 100 μl
eines RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60
Zellen wurden in jeweils eine Vertiefung einer 96-Loch Mikrotiterplatte
gegeben und 48 Stunden inkubiert und der Wachstumszustand der Zellen
unter einem optischen Mikroskop betrachtet. Das Ergebnis zeigt,
dass die Zellen in allen Fällen
der verdünnten
Lösungen
abgetötet
wurden, sowohl bei den Extrakten mit Wasser als auch bei einer 75%
wässrigen
Ethanollösung
und dass sowohl wässrige
wie ethanolische Extrakte von Tee eine starke Wirkung zum Unterdrücken des
Wachstums von Krebszellen aufweisen. Außerdem wurde ihre Apoptosis
induzierende Wirkung aufgrund der Bildung von Apoptosiskörpern bestätigt.
-
(2)
Eine Analyse verschiedener Bestandteile des ethanolischen Extrakts
des in Beispiel 10-(1) genannten Matcha wurde nach einem in Beispiel
1 angegebenen Verfahren vorgenommen.
-
Die 23 und 24 zeigen
Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten
des ethanolischen Extrakts von Matcha. 23 ist
eine Abbildung, die das Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponenten
des ethanolischen Extrakts von Matcha zeigt, während 24 eine
Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten
des ethanolischen Extrakts von Matcha zeigt. In jeder der Abbildungen
zeigt die Ordinate die relative Intensität (%), während der obere Teil und der
untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen
angeben.
-
In
den 23 und 24 ist
gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
1 in 23) und 9,12,15-Octadecatriensäure (Linolensäure) (Peak
2 in 23), von Glucose abgeleitete Peaks (Peaks 3 und
4 in 24) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak
1 in 24) im ethanolischen Extrakt von Matcha nachgewiesen
wurden, wodurch das Vorhandensein von Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid
bestätigt
wurde. Ein von Myoinositol abgeleiteter Peak (Peak 5 in 24)
und ein von Chinasäure
abgeleiteter Peak (Peak 2 in 24) wurden
ebenso nachgewiesen.
-
Beispiel 11
-
(1)
Zu 0,5 g Reiskleie wurden Wasser, eine 75% wässrige Ethanollösung oder
eine 90% wässrige Ethanollösung zugegeben
gefolgt vom Schütteln
bei Raumtemperatur über
zwei Stunden. Der Extrakt wurde zentrifugiert, der flüssige Überstand
aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand
in 1 ml Wasser aufgelöst.
Im Falle eines Extrakts mit einer 90% wässrigen Ethanollösung, wurden
die wasserunlöslichen
Stoffe in Ethanol gelöst.
Diese Proben wurden verdünnt
und ihre Wirkung zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen und ihre Apoptosis induzierende Wirkung
nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfarhen bzw. einem in Beispiel
8 genannten Verfahren gemessen. Das Ergebnis zeigt, dass beide Wirkungen
in einer fünffach
verdünnten
Lösung
des wässrigen
Extrakts, einer nicht verdünnten
Lösung des
Extrakts mit 75% Ethanol und in zehnfach verdünnter Lösung der ethanollöslichen
Fraktion des Extrakts mit 90% Ethanol verfügbar waren, worauf die ethanolischen
Extrakte von Reiskleie eine starke Wirkung zum Unterdrücken des
Wachstums von Krebszellen und Apoptosis induzierende Wirkung zeigten.
-
(2)
Eine Analyse verschiedener Bestandteile im Extrakt mit 75% Ethanol
der im Beispiel 11-(1) genannten Reiskleie wurde nach einem in Beispiel
1 angegebenen Verfahren vorgenommen.
-
Die 25 und 26 zeigen
Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten
des 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie. 25 ist
eine Abbildung, die das Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponenten
des 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie zeigt, während 26 eine
Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten
des 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie zeigt. In jeder der
Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der
obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten)
bzw. die Rasterzahlen angeben.
-
In
den 25 und 26 ist
gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak
1 in 25), Octadecensäure (Oleinsäure) (Peak 3 in 25)
und cis-9,cis-l2-Octadecadiensäure
(Linolsäure)
(Peak 2 in 25), von Glucose abgeleitete
Peaks (Peaks 2 und 3 in 26) und
ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 26)
im 75% ethanolischen Extrakt von Reiskleie nachgewiesen wurden, wodurch
das Vorhandensein von Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid bestätigt wurde.
-
Beispiel 13
-
Monogalactosyldiglycerid
(hergestellt von Wako Pure Chemical) gewonnen aus Spinat, Monogalactosyldiglycerid
(hergestellt von Funakoshi) gewonnen aus Weizen und Digalactosyldiglycerid
gewonnen aus Weizen wurden in geringen Mengen n-Decan suspendiert,
die Suspension mittels einer Ultraschallbehandlung weiter dispergiert
und Ethanol zugegeben, so dass ein Verhältnis von n-Decan : Ethanol
= 2 : 98 entsteht. Die Lösung
wurde mit einem RPM) 1640 Medium auf das 50-fache verdünnt, 0,5
ml davon zu 4,5 ml eines Mediums mit 2,5 × 105 HL-60
Zellen zugegeben, das in einem RPMI 1640 Medium inkubiert wurde,
das 10% fetales Kalbsserum enthält.
Dieses wurde bei 37°C
48 Stunden lang inkubiert und eine Apoptosis induzierende Wirkung
von jedem nach einem in Beispiel 1-(4) genannten Verfahren gemessen,
worauf eine starke Apoptosis induzierende Wirkung und eine Wirkung
zum Unterdrücken
des Wachstums von Krebszellen bestätigt wurde.
-
Beispiel 14
-
Im
Handel erhältlicher
Kohl, Schalen der Eierfrucht, geschälte Eierfrucht und Spinatblätter wurden
gefriergetrocknet, gemahlen, auf die selbe Weise wie in Beispiel
9-(4) extrahiert und Messung einer Wirkung zum Unterdrücken des
Wachstums von Krebszellen und eine Apoptosis induzierende Wirkung
wurden nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren bzw. einem in Beispiel 8 genannten
Verfahren vorgenommen, worauf beide Wirkungen in zweifach verdünnten Lösungen der
Extrakte von Kohl, Eierfruchtschalen und Spinatblättern und
in einer fünffach
verdünnten
Lösung
von geschälter
Eierfrucht verfügbar
waren.
-
Vorteile der
Erfindung
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann ein Apoptosis induzierender Stoff, in dem Glycerolipid
(wie das Glycerolipid mit einer starken Apoptosis induzierenden
Wirkung gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren) wirksame
Komponente(n) ist/sind, angeboten werden, und außerdem kann aufgrund dieser Apoptosis
induzierenden Wirkung auch ein Antikrebsmittel angeboten werden.
Das Glycerolipid ist in Membrankomponenten von Pflanzen, Mikroorganismen
oder Tieren reichlich vorhanden und kann mit einem wässrigen
Ethanol oder dergleichen effizient extrahiert werden, worauf die
wirksame(n) Komponente(n) der vorliegenden Erfindung leicht erhalten
werden kann/können.
Vor dem Extrahieren mit einem Lösemittel
kann eine saure oder alkalische Behandlung vorgenommen werden, so
dass eine effizientere Extraktion erfolgen kann. Ferner kann die
Polarität
des Extraktionslösemittels,
Chromatographieträgers
zur Trennung usw. in Abhängigkeit
von der Hydrophobie ausgewählt
werden, wodurch das gewünschte
Glycerolipid selektiv hergestellt werden kann. Nahrungsmittel oder
Getränk,
worin das Glycerolipid, das Apoptosis induzierende Komponente(n) der
vorliegenden Erfindung ist/sind, extrahiert und/oder gereinigt insbesondere aus
essbaren Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren enthalten, zugesetzt
und/oder verdünnt
ist, sind sehr geeignet als gesundes Nahrungsmittel, weil ihre tägliche Aufnahme
die Gesundheit fördert.