DE69729471T2

DE69729471T2 - Induktoren der apoptose

Info

Publication number: DE69729471T2
Application number: DE69729471T
Authority: DE
Inventors: Takeshi-Biomedical Group Sakai; Nobuto-Central Research Laboratories Koyama; Yoko-Central Research Laboratories Tatsumi; Hiroaki-Central Research Laboratorie Sagawa; Fu-Gong-Biomedical Group Yu; Katsushige-Central Research Laborato Ikai; Ikunoshin-Central Research Laborator Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 2005-06-30
Anticipated expiration: 2017-11-01
Also published as: WO1998020884A1; CN1233961A; EP0941737B1; AU727026B2; CN1380077A; EP0941737A1; CN1100561C; EA199900450A1; TW482672B; AU4726997A; CA2271705A1; EA002024B1; ATE268601T1; US20020016299A1; KR20000053108A; DE69729471D1; EP0941737A4

Description

Technischer Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutisch nutzvolle Apoptosis induzierende Stoffe und Antikrebsstoffe, die physiologisch aktive Substanz als effektive Komponente(n) gewonnen aus Tieren, Mikroorganismen oder Pflanzen enthält, die zur Verbesserung der Gesundheit geeignet sind; ein funktionelles Nahrungsmittel oder Getränk, das die physiologisch aktive Substanz enthält; und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Stand der Technik
In den vergangenen Jahren hat ein Apoptosismodus die Aufmerksamkeit auf den Zellgewebetod gezogen.
Im Gegensatz zur Nekrose, die ein pathologischer Zelltod ist, wird angenommen, dass Apoptosis ein Tod ist, der von Anfang an im Genom der Zelle selbst integriert ist. Daher wird angenommen, dass das Gen, das die Apoptosis programmiert, aktiviert wird, wo eine externe oder interne Ursache als Auslöser wirkt, ausgehend von dem Gen ein programmiertes Todesgenprotein biosynthetisiert wird, und die Zelle selbst durch das produzierte programmierte Todesgenprotein zersetzt wird, wodurch der Tod der Zelle erfolgt.
Wenn eine solche Apoptosis in gewünschtem Gewebe oder in Zellen exprimiert werden kann, wird es nun möglich, unnötige oder pathogene Zellen aus dem lebenden Körper in ihrer natürlichen Form auszuschließen, und das wird signifikante Bedeutung haben.
In den letzten Jahren hat der Zusammenhang zwischen Apoptosis und Sphingolipid wie Ceramid Aufmerksamkeit erregt und es wurde berichtet, dass eine de novo Synthese von Ceramid durch Palmitinsäure und Stearinsäure stattfindet, wodurch Apoptosis induziert wird [Journal of Biological Chemistry, Band 272, Seiten 3324–3329 (1997)].
Durch die Erfindung zu lösende Probleme
Obwohl erwartet wird, dass Ceramid und freie Fettsäuren als Apoptosis induzierende Stoffe entwickelt werden, ist eine Apoptosis induzierende Wirkung anderer fettlöslicher Substanzen, die aus dem lebenden Körper gewonnen werden, ganz unklar.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, eine hochsichere Extraktionsfraktion gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren zu entwickeln, die eine Apoptosis induzierende Wirkung aufweist und einen Apoptosis induzierenden Stoff anzubieten und einen Antikrebsstoff, der diese Fraktion enthält, ein funktionelles Nahrungsmittel oder Getränk, das die Fraktion als Bestandteil enthält, und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Mittel zum Lösen der Probleme
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben eine intensive Untersuchung durchgeführt, um ein solches Ziel zu erreichen und als Ergebnis haben sie gefunden, dass aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren erhaltenes Glycerolipid starke Apoptosis induzierende Wirkung und Antikrebswirkung zeigt, worauf die vorliegende Erfindung gemacht wurde.
Daher betrifft das erste Merkmal der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Glycerolipid bestehend aus Fettsäure und Glycerol resten bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs.
Das zweite Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Glycerolipid bestehend aus Fettsäure und Glycerolresten bei der Herstellung eines Lebensmittels oder Getränks für die Behandlung von Krebs.
Kurze Erläuterung der Zeichnungen
1 ist eine Abbildung, die ein Elutionsmuster der inneren Lösung nach Dialyse durch eine Schnelldurchlaufsäule mit DEAE-Sepharose zeigt.
2 ist eine Abbildung, die eine Apoptosis induzierende Wirkung der Fraktion B und der reinen Substanz zeigt.
3 ist eine Abbildung, die ein NMR-Spektrum der reinen Substanz zeigt.
4 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Probe A zeigt.
5 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Probe B zeigt.
6 ist eine Abbildung, die eine Säulenchromatographie mit Sepharose LH-60 zeigt.
7 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente der Fraktion Nr. 20 zeigt.
8 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente der Fraktion Nr. 21 zeigt.
9 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente der Fraktion Nr. 23 zeigt.
10 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente der Fraktion Nr. 20 zeigt.
11 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente der Fraktion Nr. 21 zeigt.
12 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente der Fraktion Nr. 23 zeigt.
13 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente der Fraktion eluiert mit Chloroform zeigt.
14 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente einer Fraktion eluiert mit Chloroform und Aceton in einem Verhältnis von 80 : 20 zeigt.
15 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente der Fraktion eluiert mit Chloroform zeigt.
16 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente einer Fraktion eluiert mit Chloroform und Aceton in einem Verhältnis von 80 : 20 zeigt.
17 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente eines Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt.
18 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente eines Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt.
19 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente eines Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt.
20 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente eines Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt.
21 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente eines ethanolischen Extrakts von Bunashimeji (Lyophyllum ulmarium) zeigt.
22 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente eines ethanolischen Extrakts von Bunashimeji zeigt.
23 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente eines ethanolischen Extrakts von Matcha (pulverisiertem grünem Tee) zeigt.
24 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente eines ethanolischen Extrakts von Matcha zeigt.
25 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponente eines 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie zeigt.
26 ist eine Abbildung, die ein Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponente eines 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie zeigt.
Verfahrensweise zur Ausführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend spezifisch erläutert.
Es gibt keine besondere Einschränkung für das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Glycerolipid, vorausgesetzt, dass es/sie von Phosphatester und Phosphonatester in molekularer Struktur frei ist, und es/sie aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren hergestellt oder chemisch synthetisiert werden kann/können.
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Pflanzen, Mikroorganismen oder Tiere, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, so lange sie Glycerolipid enthaltende Dinge sind, die Glycerolipid enthalten. Beispiele für Pflanzen sind Gemüse wie Spinat, Karotte und Zwiebel; zweikeimblättige Pflanzen wie Tee; einkeimblättrige Pflanzen wie Gerste und Reis; Gewürzstoffe wie Pfeffer, Muskatnuss, Knoblauch, Lorbeerblatt, Sellerie, Senf, Ingwer, Schotenpfeffer (roter Pfeffer), Thymian, Saffran, Zimt, Vanille, Nelkenpfeffer, Karashi (japanischer Senf), Brunnenkresse, Sansho (japanischer Pfeffer), Blutpflanze, Kraut, Sternanis, Basilikum, Nira (japanischer Lauch), Hops und Wasabi (japanischer Merrettich); aus diesen Pflanzen hergestellte Produkte wie Getreiderückstände; Algen wie Braunalgen (Phaeophyceae), Rotalgen (Rhodophyceae), Grünalgen (Chlorophyceae) und einzellige Grünalgen; Mikroorganismen wie Pilze, Hefe, Fadenpilze (z. B. Aspergillus) und Bakterien (z. B. Bacillus natto und Milchsäurebakterien); und Tiere wie Wirbeltiere und Wirbellose (Vertebraten und Invertebraten).
Der Ausdruck „Tee" wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, kann alles sein, das üblicherweise als Tee bezeichnet wird und Beispiele hierfür sind nicht fermentierter Tee wie grüner Tee, Sencha (grüner Tee mittlerer Qualität), Bancha (Tee niedriger Qualität), Hojicha (gerösteter Tee) und Matcha (pulverisierter grüner Tee); halbfermentierter Tee wie Paipaotee, Oolongtee und Paochongtee; und nachfermentierter Tee wie Puertee. Außerdem umfasst der Ausdruck „Tee" Matetee, Kukotee (chinesischer Hochzeitswein), Adlaytee und Barleytee.
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Pilze, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet können, obwohl diejenigen, die üblicherweise gegessen werden, bevorzugt sind und Beispiele sind Basidiomysetes wie Bunashimeji (Lyophyllum ulmarium), Hatakeshimeji (Lyophyllum decastes); Shiitake (Lentinus edodes), Matsutake (Tricholowa matsutake), Honshimeji (Lyophyllum shimeji), Enokitake (Flammulina velutipes), Nameko (Pholiota nameko), Iwatake (Gyrophora esculenta), Kikurage (Auricularia auricula), Kinugasadake (Dictyophora indusiata), Kuritake (Naematoloma sublateritium), Kurokawa (Boletopsis leucomelas), Koutake (Sarcodon aspratus), Shoro (Rhizopogon rubescens), Tamagodake (Amanita hemibapha), Chichitake (Lactarius volemus), Naratake (Armillaria mellea), Hatsutake (Lactarius hatsudake), Hiratake (Pleurotus ostreatus), Maitake (Grifola frondosa), Matsuoji (Lentinus lepideus) und gemeiner Pilz (Agaricus bisporus oder dergleichen); und Ascomycetes wie Tochukaso (vegetative Wespe oder Pflanzenwurm).
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Algen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet können und Beispiele hierfür sind Braunalgen wie Fukuronori (Colpomenia sinusosa), Mozuku (Nema cystus decipiens und andere Spezies bei Chordariaceae), Makombu (Laminaria japonica), Gagome Kombu (Kjellmaniella crassifolia), Wakame (Undaria pinnatifida), Arame (Eisenia pinnatifida) und Hijiki (Hizikia fusiforme); Rotlagen wie Tengusa (Gelidium) und Igisu (Ceramium kondoi); Grünalgen wie Aosa (Ulva pertusa), Kawanori (Prasiola japonica) und Miru (Codium fragile); und einzellige Grünalgen wie Kurorera (Chlorella).
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Getreiderückstände, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet können und Beispiele hierfür sind Reiskleie, Weizenkleie, Gerstenwurzel und Okara (Bodensatz von Tofu (Bohnenkäse)).
Es ist in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass Glycerolipid aus Tee, Pilzen, Algen oder Getreiderückständen gewonnen wird und als wirksame Komponente(n) für ein Apoptosis induzierendes Mittel, ein Antikrebsmittel oder ein funktionelles Lebensmittel oder Getränk verwendet wird.
Es gibt keine besondere Einschränkung für das Glycerolipid mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und Beispiele des verwendbaren Glycerolipids sind Mono-, Di- und Triacylglycerol.
Beispiele der Fettsäure, die das in der vorliegenden Erfindung verwendete Glycerolipid bildet, sind gesättigte und/oder ungesättigte Fettsäuren wie Tetradecansäure (Myristinsäure, C14:0), Hexedecansäure (Palmitinsäure, C16:0), Tetradecensäure (Myristoleinsäure, C14:1), Hexadecensäure (Palmitoleinsäure, C16:1), Octadecensäure (Oleinsäure, C18:1), cis-9,cis-l2-Octadecadiensäure (Linoleinsäure, C18:2) und 9,12,15-Octadecatriensäure (Linolensäure, C18:3).
Das Glycerolipid mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren kann leicht nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem ein Schritt zum Extrahieren mit einem organischen Lösemittel wie einem Wasser enthaltenden hydrophilen organischen Lösemittel (zum Beispiel wässriges Ethanol) eingesetzt wird. Es gibt jedoch keine besondere Einschränkung für das Herstellungsverfahren für das Glycerolipid. Auf diese Weise kann nicht nur eine reine Extraktion mit Wasser, sondern auch bekannte Verfahren, die zur Reinigung des Glycerolipids verwendet werden können, verwendet werden. Es ist auch möglich, dass eine Substanz, die aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnenes Glycerolipid enthält, chemisch, physikalisch oder enzymatisch behandelt und dann das angezielte Glycerolipid gereinigt wird. Bei der Reinigung können die physikalisch-chemische Eigenschaften oder physiologische Aktivität (Apoptosis induzierende Wirkung usw.) des Glycerolipids als Index für die Reinigung verwendet werden.
Bei der vorliegenden Erfindung kann aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnenes Glycerolipid mit einem organischen Lösemittel wie Hexan, Chloroform, Ethylacetat, einem hydrophilen organischen Lösemittel (zum Beispiel Aceton, Propanol, Ethanol und Methanol) und einer Mischung davon oder einem Lösemittelgemisch davon mit Wasser und eine essbare Substanz, die Glycerolipid enthält, leicht nach einem Herstellungsverfahren hergestellt werden, das einen Schritt zum Extrahieren, zum Beispiel mit einem wässrigen Ethanol umfasst. Bei Verwendung als Nahrungsmittel oder Getränk wird die Extraktion bevorzugt unter solchen Extraktionsbedingungen durchgeführt, wo ein organisches Lösemittel, insbesondere ein hydrophiles organisches Lösemittel wie 10–95% oder bevorzugt 20–80% wässriges Ethanol üblicherweise über einige Minuten bis einige Tage, oder bevorzugt über einige Dutzend Minuten bis einige Dutzend Stunden, üblicherweise bei 10 bis 70°C, oder bevorzugt bei 20 bis 60°C verwendet wird, worauf Glycerolipid, das/die Apoptosis induzierende/r Wirkstoff/e ist/sind, effizient extrahiert werden kann/können. Wenn Glycerolipid gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren vor der Extraktion mit organischem Lösemittel oder insbesondere mit hydrophilem organischem Lösemittel, mit einer Säure oder einem Alkali behandelt wird, ist es möglich, dass Glycerolipid, das Apoptosis induzierende Verbindung/en ist/sind, effizienter extrahiert werden kann/können.
In Hinblick auf Verfahren zum Aufnehmen von reinem Glycerolipid, das/die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Verfahren bekannt wie das Bligh-Dyer-Verfahren und das Folch-Trennverfahren (siehe „Shin Seikagaku Jikken Koza (New Textbook on Experiments of Biochemistry)", Band 4, Lipid III, Seiten 104–109, 1990 herausgegeben von Japan Biochemical Society, veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin) und jedes davon, das für den Zweck geeignet ist, kann für die Extraktion des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Glycerolipids verwendet werden.
Bei der Reinigung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Glycerolipids wird der oben genannte Extrakt einer Chromatographie unter Verwendung eines hydrophoben Trägers, eines Umkehrphasenträgers, eines Normalphasenträgers usw. unterzogen, wodurch eine effizientere Trennung durchgeführt werden kann.
Es gibt keine besondere Einschränkung für den hydrophoben Träger, sondern es kann jeglicher bekannte Träger verwendet werden. Beispiele für einen solchen Träger sind das Harz eines Sephacryltyps, ein Sepharosetyp, ein Toyopearltyp usw., worin Butyl-, Octyl- oder Phenylgruppen eingeführt sind, und ein Amberlit-Adsorptionsharz XAD-1, -2, -4, -200, -7 oder -8. Es gibt keine besondere Einschränkung für den Umkehrphasenträger, sondern jeglicher bekannte Träger kann verwen det werden und ein Beispiel eines solchen Trägers ist Silicagel, bei dem eine Alkylkette kovalent gebunden ist. Es gibt keine besondere Einschränkung für den Normalphasenträger, sondern jeglicher bekannte Träger kann verwendet werden und ein Beispiel eines solchen Trägers ist Silicagel. Bei Durchführung der Reinigung können physikalische und chemische Eigenschaften des Glycerolipids oder physiologische Aktivität wie eine Apoptosis induzierende Wirkung als Index verwendet werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete, aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnene Glycerolipid kann zum Beispiel aus einem wässrigen ethanolischen Extrakt aus essbaren Pflanzen, essbaren Mikroorganismen, essbaren Tieren usw. mittels herkömmlicher Ionenaustauscherharzbehandlung, hydrophober chromatographischer Behandlung, Gelfiltrationsbehandlung usw. gereinigt werden.
Üblicherweise gibt es viele Fälle, wo das Glycerolipid in Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren in Form einer hochmolekularen Substanz gebunden mit Saccharid und/oder Protein nahe der Membran vorhanden ist/sind, und zum Beispiel bei Extraktion mit heißem Wasser eine Glycerolipid enthaltende Substanz erhalten werden kann, bei der das Glycerolipid mit Saccharid und/oder Protein gebunden ist. Übrigens bedeutet der Ausdruck Saccharid ein Saccharid, das in Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren vorhanden ist, und umfasst Monosaccharid, Oligosaccharid, Polysaccharid und Glycokonjugate.
Bei der vorliegenden Erfindung kann die hochmolekulare Substanz, die das als solches hergestellte Glycerolipid enthält, verwendet werden wie es ist, obwohl in Abhängigkeit vom Ziel der Verwendung, Saccharid und/oder Protein enzymatisch, chemisch und/oder physikalisch behandelt wird/werden, um das Glycerolipid zu reinigen und aufzu nehmen, wodurch es möglich ist, das Glycerolipid in einem höheren Reinheitszustand zu erhalten.
Das Glycerolipid, das nach dem oben genannten Verfahren erhalten und in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist/sind die hoch sichere Substanz(en), die aus der Natur erhalten sind und besonders als Nahrungsmittel und/oder Getränk geeignet sind.
Wenn das erhaltene Glycerolipid an einen Liganden gebunden ist, der die Zielzellen wie monoklonale Antikörper erkennt, ist es möglich, die Apoptosis in jeglichen Zielzellen spezifisch zu induzieren. Wenn außerdem die Zielzellen Krebszellen sind, ist es möglich, eine Antikrebswirkung als Folge der Induktion von Apoptosis in den gewünschten Krebszellen zu erreichen. Wenn ferner die Verbindung der vorliegenden Erfindung an einen Träger wie Albumin gebunden ist, kann eine Substanz mit einer höheren Absorptionseigenschaft angeboten werden.
Der Apoptosis induzierende Stoff der vorliegenden Erfindung kann durch Kombinieren des Glycerolipids, wie das/die von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnene, das/die Wirkkomponente(n) ist/sind, mit einem bekannten pharmazeutischen Träger in eine pharmazeutisches Präparat eingebracht werden. Allgemein werden die Apoptosis induzierenden Stoff(e) der vorliegenden Erfindung wie Glycerolipide mit einer pharmazeutisch akzeptablen Flüssigkeit oder einem festen Träger formuliert, falls nötig gefolgt vom Zusatz von Lösemittel, Dispersionsmittel, Emulgator, Puffer, Stabilisator, Vehikel, Bindemittel, Sprengmittel, Gleitmittel usw., worauf ein festes Präparat wie Tabletten, Granulat, gestrecktes Pulver, Pulverpräparat und Kapseln und flüssiges Präparat wie normales Flüssigpräparat, Suspension und Emulsion hergestellt werden kann. Alternativ kann/können die Verbindungen) in ein trockenes Präparat formuliert werden, das durch Zusatz eines geeigne ten Trägers dazu vor der tatsächlichen Anwendung in Flüssigkeit verwandelt werden kann.
Der Apoptosis induzierende Stoff der vorliegenden Erfindung kann mittels irgendeines oralen Mittels und parenteralen Mittels wie durch Injektionsmittel und Instillationsmittel verabreicht werden.
Es können in Abhängigkeit von den oben genannten Dosierungsformen und Präparatformen pharmazeutische Träger ausgewählt werden. Im Fall von oralen Mitteln können Stärke, Lactose, Sucrose, Mannitol, Carboxymethylcellulose, Maisstärke, anorganische Salze usw. verwendet werden. Bei der Herstellung von oralen Mitteln können Bindemittel, Sprengmittel, Tensid, Gleitmittel, Fließverbesserer, Korrigens, Färbemittel, Duftstoff usw. ferner dazu formuliert werden.
Andererseits können im Fall von parenteralen Mitteln das/die zum Beispiel von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnene Glycerolipid(e), das/die Wirkkomponente(n) in der vorliegenden Erfindung mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung ist/sind, in einem Verdünnungsmittel wie destilliertes Wasser zur Injektion, physiologischer Kochsalzlösung, wässriger Glucoselösung, Pflanzenöl zur Injektion, Sesamöl, Erdnussöl, Sojabohnenöl, Propylenglycol und Polyethylenglycol gelöst oder suspendiert werden, falls nötig gefolgt vom Zusatz von Bakterizid, Stabilisator, isotonischem Stoff, Anästhesierungsmittel usw.
Der Apoptosis induzierende Stoff der vorliegenden Erfindung kann in Abhängigkeit von der Präparatform auf einem geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden. Es gibt auch keine besondere Einschränkung für das Verabreichungsverfahren und jegliche interne oder externe Verabreichung und Injektion kann angewendet werden. Injektionspräparate können zum Beispiel intravenös, intramuskulär, subkutan, intrakutan usw. verabreicht werden. Externe Präparate umfassen Suppositorien und dergleichen.
Eine Dosis des Apoptosis induzierenden Stoffs der vorliegenden Erfindung kann in geeigneter Weise gemäß Präparatform, Verabreichungsverfahren und Ziel der Verabreichung sowie Alter, Körpergewicht und Symptom des Patienten bestimmt werden, dem das Induktionsmittel verabreicht wird, und ist nicht festgelegt, obwohl üblicherweise die Menge an im Präparat enthaltener Wirkkomponente 0,1 bis 200 mg/kg pro Tag für einen Erwachsenen beträgt. Es versteht sich von selbst, dass die Dosis in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen schwankt, und deshalb kann in einigen Fällen eine geringere Dosis als der oben genannte Bereich ausreichend sein, während in anderen Fällen eine höhere Dosis als der oben genannte Bereich notwendig sein kann. Der pharmazeutische Stoff der vorliegenden Erfindung wird nicht nur oral verabreicht wie er ist, sondern kann auch täglich durch Zusatz zu irgendeinem Nahrungsmittel oder Getränk genommen werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Glycerolipid weist eine Aktivität zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen auf. Der Wirkmechanismus des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Glycerolipids zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen schränkt die vorliegende Erfindung überhaupt nicht ein und zum Beispiel wird eine Apoptosis induzierende Wirkung auf Krebszellen ebenso von der vorliegenden Erfindung abgedeckt.
Das Glycerolipid mit einer Antikrebswirkung wie zum Beispiel von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnenes Glycerolipid kann als Wirkkomponente(n) verwendet werden und kann durch Formulierung mit einem bekannten pharmazeutischen Träger in ein pharmazeutisches Präparat eingebracht werden, worauf ein Antikrebswirkstoff hergestellt werden kann. Die Herstellung des Antikrebswirkstoffs kann gemäß dem oben genannten Verfahren durchgeführt werden. Allgemein wird das Glycerolipid mit einem pharmazeutisch akzeptablen flüssigen oder festen Träger formuliert, falls nötig gefolgt von Zusatz von Lösemittel, Dispersionsmittel, Emulgator, Puffer, Stabilisator, Vehikel, Bindemittel, Sprengmittel, Gleitmittel usw., worauf ein festes Präparat wie Tabletten, Granulat, gestrecktes Pulver, Pulverpräparat und Kapseln und ein flüssiges Präparat wie normales Flüssigpräparat, Suspension und Emulsion hergestellt werden kann. Alternativ kann die Verbindung in ein trockenes Präparat formuliert werden, das durch Zusatz eines geeigneten Trägers vor der tatsächlichen Anwendung in Flüssigkeit verwandelt werden kann.
Der Antikrebswirkstoff kann mittels jeglicher oraler Mittel oder parenteraler Mittel wie Injektionsmittel und Installationsmittel verabreicht werden.
Pharmazeutische Träger können in Abhängigkeit von den oben genannten Dosierungsformen und Präparatformen ausgewählt werden und können gemäß dem oben genannten Fall des Apoptosis induzierenden Stoffs verwendet werden.
Der Antikrebswirkstoff der vorliegenden Erfindung kann auf einem geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden, der den Präparatformen entspricht. Es gibt auch keine besondere Einschränkung für das Verabreichungsverfahren und jegliche interne oder externe Verabreichung und Injektion kann angewendet werden. Injektionspräparate können zum Beispiel intravenös, intramuskulär, subkutan, intrakutan usw. verabreicht werden. Externe Präparate umfassen Suppositorien und dergleichen.
Eine Dosis des Antikrebsstoffs der vorliegenden Erfindung kann in geeigneter Weise gemäß Präparatform, Verabreichungsverfahren und Ziel der Verabreichung sowie Alter, Körpergewicht und Symptom des Patienten bestimmt werden, dem das Induktionsmittel verabreicht wird, und ist nicht festgelegt, obwohl üblicherweise die Menge an im Präparat enthaltener Wirkkomponente 0,1 bis 200 mg/kg pro Tag für einen Erwachsenen beträgt. Es versteht sich von selbst, dass die Dosis in Abhängigkeit von verschiedenen Bedingungen schwankt, und deshalb kann in einigen Fällen eine geringere Dosis als der oben genannte Bereich ausreichend sein, während in anderen Fällen eine höhere Dosis als der oben genannte Bereich notwendig sein kann. Der pharmazeutische Stoff der vorliegenden Erfindung wird nicht nur oral verabreicht wie er ist, sondern kann auch täglich durch Zusatz zu irgendeinem Nahrungsmittel oder Getränk genommen werden.
Der pharmazeutische Stoff der vorliegenden Erfindung kann als therapeutisches Mittel für Krebserkrankungen und dergleichen verwendet werden. Außerdem ist das Verfahren zur Induktion von Apoptosis, das vom Apoptosis induzierenden Stoff der vorliegenden Erfindung angeboten wird, geeignet zur Untersuchung des Mechanismus von Biophylaxis, Immunfunktion oder Zusammenhang mit Krankheiten wie Krebs und auch zur Entwicklung eines Inhibitors der Induzierung von Apoptosis. Insbesondere das Glycerolipid, das Apoptosis induzierende Verbindung ist/sind, hergestellt aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren mit langer Geschichte als Nahrungsmittel besitzen bei oraler Verabreichung hohe Sicherheit. Außerdem sind Nahrungsmittel oder Getränke, in die das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung, wie das aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnene, enthalten, zugesetzt und/oder darin verdünnt ist, natürlich hohe Sicherheit und ist ziemlich geeignet zur Verbesserung von Symptomen und zur Vorbeugung von gastrointestinalem Krebs oder dergleichen, wegen seiner Apoptosis induzierenden Wirkung und Antikrebswirkung durch die Apoptosis induzierende Wirkung.
Es gibt keine besondere Einschränkung für das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung und Beispiele sind verarbeitete landwirtschaftliche/forstwirtschaftliche Produkte, verarbeitete Schlachtprodukte, verarbeitete Fischereiprodukte usw. einschließlich verarbeitete Getreideprodukte wie verarbeitete Weizenprodukte, verarbeitete Stärkeprodukte, verarbeitete Mischprodukte, Nudeln, Makkaroni, Brot, Bohnenpasten, Soba (japanische Buchweizennudeln), Fu (japanisches Weizenglutenbrot), Bifun (chinesische Bohnengeleestäbchen), Harusame (japanische Bohnengeleestäbchen) und verpackte Mochi (Reiskuchen); verarbeitete Fett/Ölprodukte wie plastisches Fett/Öl, Öl für Tempura (fritierte Speisen), Salatöl, Mayonnaise und Dressing; verarbeitete Sojabohnenprodukte wie Tofu (Sojabohnenquark), Miso (fermentierte Sojabohnenpaste) und Natto (fermentierte Sojabohnen); verarbeitete Fleischprodukte wie Schinken, Schinkenspeck, Pressschinken und Wurst; Fischprodukte wie gefrorene Surimi (gehacktes Fischfleisch), Kamaboko (gekochte Fischpaste), Chikuwa (japanische Fischpaste gekocht in bambusartiger Form), Hampen (leichter Fischkuchen), Satsumaage (gebratene Fischbällchen), Tsumire (gekochte Fischpaste mit Beilagen), Suji (Fischprodukte), Fischfleischschinken, Wurst, Katsuobushi (getrockneter Bonito), verarbeitete Fischeiprodukte, Fischprodukte in Dosen und Tsukudani (konservierte Fischspeisen in Sojasauce gekocht); Milchprodukte wie Milch, Sahne, Joghurt, Butter, Käse, Kondensmilch, Milchtrockenpulver und Eiscreme; verarbeitete Gemüse/Fruchtprodukte wie Pasten, Marmeladen, Konserven, Fruchtgetränke, Gemüsegetränke und Mixgetränke; Süßwaren wie Schokolade, Buskuit, Törtchen; Kuchen, Mochigashi (Reiskugelkuchen) und Reiskräcker; alkoholische Getränke wie Sake (japanischer Reiswein), chinesischer Wein, Wein, Whisky, Shochu (japanischer Branntwein), Wodka, Brandy, Gin, Bock, Bier, alkoholische Mischgetränke, Fruchtwein und Likör; Genußmittel wie grüner Tee, schwarzer Tee, Oolongtee, Kaffee, alkoholfreie Getränke und Milchsäuregetränke; Würzen wie Sojabohnensauce, Worcestersauce, Essig und Mirin (süßer Sake); Gewürze wie Extrakte von Knoblauch, Pfeffer, rotem Pfeffer, Muskatnuss, Ingwer, Sternanis, Kräuter und Basilikum, Nahrungsmittel in Dosen, Flaschen oder Beuteln wie gekochter Reis mit gewürztem Rindfleisch, Kamameshi (gekochter Reis in einem kleinen kesselförmigen Behälter), Sekihan (Reis gekocht mit roten Bohnen), Curry und Reis, und andere schon verarbeitete Nahrungsmittel; halbgetrocknete oder konzentrierte Nahrungsmittel wie Leberpastete oder andere Aufstriche, Suppe für Soba und Udon (beides japanische Nudeln) und Suppenkonzentrat; getrocknete Nahrungsmittel wie Instantnudeln, Instantcurry, Instantkaffee, Saftpulver, Suppenpulver, Instantmisosuppe, Retortennahrung, Retortengetränk und Retortensuppe; Tiefkühlnahrung wie Sukiyaki, Chawan-mushi (Eintopf), Unagi Kabayaki (gegrillter Aal), Hamburger, Shao-mai (chinesischer Dampfknödel), Gyoza (gebratener Knödel gefüllt mit Schweinehack usw.), verschiedene Arten von Stäbchen und Fruchtcocktail; feste Nahrungsmittel; flüssige Nahrungsmittel wie Suppe; und Gewürze.
Es gibt keine besondere Einschränkung für das Herstellungsverfahren von Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung und Beispiele dafür sind Kochen, Verarbeitung und üblicherweise verwendete Verfahren bei der Herstellung von Nahrungsmitteln oder Getränken, wo jegliches Verfahren angewendet werden kann, so lange das hergestellte Nahrungsmittel oder Getränk als solches das Glycerolipid enthält, wie das aus Pflanzen, Mikroorganismen und Tieren gewonnene, das/die Apoptosis induzierende Verbindungen) ist/sind.
In Hinblick auf das Kochen und Verarbeiten genügt es, dass das Produkt nach dem Kochen oder Verarbeiten Glycerolipid mit Apoptosis induzierender Eigenschaft enthält.
Daher kann das Glycerolipid mit Apoptosis induzierender Eigenschaft vor, während oder nach dem Kochen oder Verarbeiten zugesetzt werden. Alternativ kann das gekochte oder verarbeitete Produkt oder ein Rohmaterial dafür einer Substanz zugesetzt werden, die das Glycerolipid enthält, so dass das Glycerolipid verdünnt wird.
Bei der Herstellung von Nahrungsmittel oder Getränk kann das Glycerolipid mit Apoptosis induzierender Wirkung in irgendeinem der Schritte hinzugefügt werden. In Hinblick auf ein Zugabeverfahren kann das Glycerolipid hinzugefügt werden oder Nahrungsmittel, Getränk oder ein Material hierfür kann dem Glycerolipid hinzugefügt werden, so dass das Glycerolipid verdünnt wird. Das Hinzufügen kann entweder auf einmal oder mehrmals erfolgen. Dementsprechend kann das Nahrungsmittel oder Getränk mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung leicht hergestellt werden. Wenn irgendeiner dieser Schritte angewendet wird, ist das Nahrungsmittel oder Getränk, das das Glycerolipid mit Apoptosis induzierender Eigenschaft enthält, oder das Nahrungsmittel oder Getränk, wo das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung zugesetzt oder darin verdünnt ist, als das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung definiert.
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Menge des Glycerolipids der vorliegenden Erfindung mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung (wie Glycerolipid, das die Apoptosis induzierende Verbindungen) der vorliegenden Erfindung gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren ist/sind) in der Nahrung, sondern die Menge kann in geeigneter Weise vom Gesichtspunkt der Organoleptik und physiologischen Aktivität gewählt werden. Zum Beispiel beträgt die Menge an Glycerolipid nicht weniger als 10^–9 Teile auf 100 Teile des Nahrungsmittels und in Hinblick auf die Organoleptik und physiologische Wirkung als Nahrungsmittel beträgt sie bevorzugt 10^–8 Teile auf 5 Teile, und besonders bevorzugt 10^–7 Teile auf 2 Teile.
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Menge des Glycerolipids der vorliegenden Erfindung mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung (wie Glycerolipid, das die Apoptosis induzierende Verbindung(en) der vorliegenden Erfindung gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren ist/sind) im Getränk, sondern die Menge kann in geeigneter Weise vom Gesichtspunkt der Organoleptik und physiologischen Aktivität gewählt werden. Zum Beispiel beträgt die Menge an Glycerolipid nicht weniger als 10^–9 Teile auf 100 Teile des Getränks und in Hinblick auf die Organoleptik und physiologische Wirkung als Getränk beträgt sie bevorzugt 10^–8 Teile auf 5 Teile, und besonders bevorzugt 10^–7 Teile auf 2 Teile. Übrigens steht in der vorliegenden Beschreibung der Ausdruck „Teil(e)" für Gewichtsteile.
Es gibt keine besondere Einschränkung für die Form des Nahrungsmittels oder Getränks der vorliegenden Erfindung, so lange das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung mit einer Apoptosis induzierenden Eigenschaft darin enthalten, zugesetzt und/oder darin verdünnt ist, sondern kann jegliche Form abdecken, die oral eingenommen werden kann wie Tabletten, Granulat, Kapseln, Gel und Sol.
Das Nahrungsmittel oder Getränk der vorliegenden Erfindung enthält eine große Menge an Glycerolipid, das Apoptosis induzierende Verbindungen) der vorliegenden Erfindung mit einer physiologischen Aktivität ist/sind, und ist insbesondere ein gesundes Nahrungsmittel oder Getränk, das wegen der Apoptosis induzierenden Wirkung des Glycerolipids zur Erhaltung guter Gesundheit von Magen und Darm geeignet ist.
Das Antikrebsnahrungsmittel oder Antikrebsgetränk, wo das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung wie das von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren gewonnene darin enthalten, hinzugefügt oder darin verdünnt ist, kann gemäß dem oben genannten Verfahren zur Herstellung eines Apoptosis induzierenden Nahrungsmittels oder eines Apoptosis induzierenden Getränks unter Verwendung der Antikrebswirkung als Index hergestellt werden.
Das Glycerolipid, das Apoptosis induzierende Verbindung(en) der vorliegenden Erfindung ist, wird/werden gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren und die Verwendung des Glycerolipids, insbesondere gewonnen aus essbaren Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren, für Nahrungsmittel oder Getränk ist ziemlich sicher, wo die Apoptosis induzierende Verbindungen) keine Toxizität für Tiere bei der Konzentration zum Erreichen der physiologischen Funktion zeigt/zeigen.
Das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung in essbaren Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren weist eine lange Geschichte als Nahrungsmittel auf und die daraus hergestellte Substanz, die das Giycerolipid gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, weist eine ziemlich hohe Sicherheit auf, wenn sie oral verabreicht wird. Dementsprechend ist es natürlich, dass das Nahrungsmittel oder Getränk, wo das Glycerolipid hinzugefügt und/oder darin verdünnt ist, eine hohe Sicherheit aufweist.
Nun ist klar, dass wie oben erwähnt, das Glycerolipid, das im lebenden Körper verfügbares Lipid ist, gemäß der Erfindung eine Apoptosis induzierende Wirkung aufweist.
Das Glycerolipid, das in der vorliegenden Erfindung verwendete Apoptosis induzierende Verbindungen) ist/sind, ist in großen Mengen in Membranfraktionen von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren vorhanden, und insbesondere kann es zu geringen Kosten und auf einfache Weise aus essbaren Pflanzen oder Mikroorganismen hergestellt werden. Außerdem kann das Glycerolipid, das die gewünschte Apoptosis induzierende Verbindungen) ist/sind, durch Auswählen eines geeigneten Lösemittels gemäß seines Hydrophobiegrades selektiv gereinigt werden.
Das Glycerolipid, das in der vorliegenden Erfindung verwendete Apoptosis induzierende Verbindungen) ist/sind (wie das/die gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren) kann leicht seine Apoptosis induzierende Wirkung an Nahrungsmittel oder Getränk übertragen und das Glycerolipid der vorliegenden Erfindung mit der Apoptosis induzierenden Eigenschaft und Antikrebseigenschaft ist ziemlich geeignet als Zusatz zu Nahrungsmittel oder Getränk.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun spezieller durch die folgenden Beispiele erläutert, obwohl die vorliegende Erfindung überhaupt nicht auf diese Beispiele beschränkt ist. Übrigens bedeutet der Ausdruck % in den Beispielen Gewichts-%.
Beispiel 1
Herstellung der Zusammensetzung mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung aus Seetang
(1) Gagome Kombu (Kjellmaniella crassifolia) wird gut getrocknet und 20 kg des getrockneten Produkts werden mit einer offenen Mühle (hergestellt von Nara Kikai Seisakusho) gemahlen.
Calciumchloriddihydrat (hergestellt von Nippon Soda) (7,3 kg) wurde in 900 ml Leitungswasser gelöst und dann 20 kg des gemahlenen Gagome Kombu damit vermischt. Die Temperatur der Flüssigkeit wurde durch Einblasen von Dampf über 40 Minuten von 12°C auf 90°C erhöht und die Mischung wurde unter Rühren eine Stunde lang auf 90–95°C gehalten und abgekühlt, so dass 1100 Liter abgekühltes Produkt erhalten wurden.
Dann wurde die abgekühlte Lösung einer Fest-Flüssig-Trennung unter Verwendung eines Fest-Flüssig-Separators (Typ CNA; hergestellt von Westfalier Separator) unterzogen, so dass nach der Fest-Flüssig-Trennung ungefähr 900 Liter Überstandflüssigkeit erhalten wurden.
Die Überstandflüssigkeit (360 Liter) nach der Fest-Flüssig-Trennung wurde unter Verwendung von FE10-FC-FUS 0382 (Fraktioniermolekulargewicht: 30000) (hergestellt von Daicel) auf 20 Liter aufkonzentriert. Dann wurden 20 Liter Leitungswasser hinzugefügt, die Mischung auf 20 Liter aufkonzentriert und solche Behandlungen zum Entsalzen fünf Mal wiederholt, worauf 25 Liter Extraktderivat von Gagome Kombu erhalten wurden.
Ein Liter der Lösung wurde gefriergetrocknet, so dass 13 g Trockenprodukt erhalten wurden.
(2) Der in Beispiel 1-(1) genannte Extrakt (1,4 Liter) wurde gegen 20 mM Acetatpuffer (pH 6) mit 0,2 M CaCl₂ dialysiert, so dass nach der Dialyse eine interne Flüssigkeit erhalten wurde. Eine DEAE-Sepharose-Schnelldurchlaufkolonne (14 cm Durchmesser × 45,5 cm Höhe) wurde mit dem selben Puffer ins Gleichgewicht gebracht, die innere Flüssigkeit nach der Dialyse aufgegeben, mit dem selben Puffer gewaschen und nach dem Konzentrationsgradientenverfahren mit dem Puffer mit 2 M NaCl eluiert. Die Gesamtmenge an Zucker und Uronsäure wurde mittels eines Phenol-Schwefelsäureverfahrens und eines Carbazol-Schwefelsäureverfahrens bestimmt, so dass Fraktionen A, B und C in der Elutionsfolge erhalten wurden. Sie wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, so dass 760 mg einer Fraktion B erhalten wurden.
Die Fraktion B zeigte eine Apoptosis induzierende Wirkung.
1 zeigt Elutionsmuster des Extrakts aus der DEAE-Sepharose-Schnelldurchlaufkolonne. Daher ist 1 eine Abbildung, die die Elutionsmuster des aus Meeresalgen aus der DEAE-Sepharose-Schnelldurchlaufkolonne (14 cm Durchmesser × 45,5 cm Höhe) gewonnenen Extrakts, in der die Ordinate die Absorption bei 530 nm nach einem Carbazol-Schwefelsäureverfahren und die bei 480 nm nach einem Phenol-Schwefelsäureverfahren zeigt sowie die Leitfähigkeit (mS/cm), während die Abszisse Fraktionszahlen zeigt. In der Abbildung sind offene Kreise Absorptionen bei 480 nm nach einem Phenol-Schwefelsäureverfahren, schwarze Punkte die bei 530 nm nach einem Carbazol-Schwefelsäureverfahren und eine durchgezogene Linie ist Leitfähigkeit. Übrigens beträgt die Menge an Flüssigkeit für eine Fraktion 1000 ml.
(3) Die nach dem obigen Verfahren fraktionierte Fraktion B (8,6 g) wurde auf eine Phenyl-Sepharose 6 Schnelldurchlaufkolonne (4,4 cm Durchmesser × 20 cm Höhe) aufgegeben, die mit 1 M NaCl ins Gleichgewicht gebracht ist, worin die Endkonzentration an NaCl auf 1 M eingestellt wurde. Die Säule wurde mit 1 M NaCl gewaschen und es wurde eine Fraktion erhalten, die mittels eines Konzentrationsgradienten zu Wasser eluiert wurde. Diese wurde mittels eines Rotationsverdampfers aufkonzentriert und gegen destilliertes Wasser dialysiert, so dass ungefähr 6,5 ml reine Fraktion erhalten wurden. Die reine Fraktion wurde gefriergetrocknet, so dass 60 mg reines Produkt erhalten wurden. Dieses reine Produkt zeigte eine Apoptosis induzierende Wirkung.
(4) Messung der Apoptosis induzierenden Wirkung des reinen Produkts
Die Apoptosis induzierende Wirkung der obigen Fraktion B und des in Beispiel 1-(3) genannten reinen Produkts wurden wie folgt gemessen. Es wurden 0,5 ml wässrige Lösung der Fraktion B oder des reinen Produkts zu 2,5 × 10⁵ Zellen/4,5 ml HL-60 (ATCC CL-240) hinzugegeben, die in einem RPMI 1640 Medium kultiviert wurden, das 10% fetales Kalbsserum enthält und bei 37°C 48 Stunden lang inkubiert. Gleichzeitig wurden destilliertes Wasser und eine Lösung von Actinomycin D (10 μg/ml), wovon bekannt ist, dass es eine Apoptosis induzierende Wirkung besitzt, hinzugefügt, um Kontrollproben herzustellen. Die Bildung von apoptischen Körpern, Zellkontraktion und Kernaggregation wurden mit unbewaffnetem Auge unter einem Mikroskop betrachtet, wobei die lebenden Zellen ausgezählt wurden. Wenn solche Phänomene beobachtet wurden und eine Reduktion der Anzahl lebender Zellen erkannt wurde, wurde bestimmt, dass eine Apoptosis induzierende Wirkung positiv ist.
Die Apoptosis induzierende Wirkung wurde in dem Fall bestätigt, wo die Fraktion B, das gereinigte Produkt oder Actinomycin D zugesetzt war. Das Ergebnis ist in 2 angegeben. 2 ist eine Abbildung, die das Verhältnis zwischen der Inkubationsdauer und der Anzahl lebender Zellen im Medium zeigt, wenn die Fraktion B oder das reine Produkt dem oben genannten Medium von HL-60-Zellen auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml bzw. 0,9 mg/ml zugesetzt wurde. Die Abszisse ist eine Inkubationsdauer (Stunden), während die Ordinate die Anzahl lebender Zellen (× 10⁵/5 ml) im Medium angibt. In der Abbildung sind offene Kreise die Kontrolle, wo Wasser zugesetzt ist, offene Rhomben sind der Fall, wo die Fraktion B zugesetzt ist und offene Kreise sind der Fall, wo das reine Produkt zugesetzt ist.
(5) Physikalische und chemische Eigenschaften des reinen Produkts mit Apoptosis induzierender Wirkung
Physikalische und chemische Eigenschaften des im obigen Beispiel 1-(3) genannten reinen Produkts wurden gemessen.
(i) NMR-Analyse
Das ¹H-NMR-Spektrum wurde mit einem JNM-A500 Nuklearmagnetresonanzgerät (hergestellt von Nippon Denshi) gemessen.
Das Ergebnis ist durch das in 3 angegebene ¹H-NMR-Spektrum dargestellt. In 3 zeigt die Ordinate die Signalintensität, während die Abszisse chemische Verschiebung (ppm) zeigt. Übrigens ist die chemische Verschiebung im ¹H-NMR derart dargestellt, dass die chemische Verschiebung von HOD als 4,65 ppm definiert ist.
¹H-NMR (D₂O)
δ 0,7 (N von Methyl am Ende der Fettsäure), 1,1 (Methylen der Fettsäure und H von Methyl an der C-5-Position von Fucose), 3,1–5,6 (H vom Zucker).
(II) GC-MS-Analyse
Eine 5% methanolische Lösung von HCl (1 ml) wurde zu 2 mg des in Beispiel 1-(3) genannten reinen Produkts hinzugefügt und die Mischung in einem Röhrchen eingeschlossen und drei Stunden lang bei 85°C erwärmt. Nach dem Abkühlen, wurde mit 1 ml n-Hexan dreimal extrahiert und der erhaltene Extrakt mit n-Hexan auf ungefähr 500 μl in einem Stickstoffstrom aufkonzentriert, so dass eine Probe A erhalten wurde.
Die verbleibende methanolische Schicht wurde durch Zusatz von Silbercarbonat neutralisiert und filtriert, Stickstoffdampf wurde auf das Filtrat geblasen, um es zur Trockene zu verdampfen und der Rückstand wurde vier Stunden lang unter Verwendung einer Vakuumpumpe getrocknet. Nach dem Trocknen wurden fünf Tropfen eines TMS-Regens (das wie folgt hergestellt wurde: 2,6 ml Hexamethyldisilazan wurden zu 2,0 ml trocknem Pyridin zugegeben, dann 1,6 ml Trimethylchlorsilan hin zugefügt, die erhaltene trübe Substanz durch Zentrifugieren entfernt und der flüssige Überstand als Reagens verwendet) dem Rückstand zugesetzt und die Mischung bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen gelassen. Danach wurde die Mischung zehn Minuten lang auf 50°C erwärmt, abgekühlt und nach Zusatz von 1 ml Chlorofom gerührt und die Chloroformschicht mit 1 ml Wasser dreimal gewaschen. Die erhaltene Chloroformlösung wurden als Probe B verwendet.
Die oben hergestellten Proben A und B wurden unter den folgenden Bedingungen unter Verwendung eines DX-302 Massenspektrometers (hergestellt von Nippon Denshi) einer GC-MS-Analyse unterzogen.
Probe A

Säule: TC-1 (G. L. Science), 30 m × 0,25 mm Innendurchmesser
Temperatur: erhöht von 130°C auf 250°C mit einer Rate von 4°C pro Minute und über fünf Minuten auf 250°C gehalten
Strömungsrate: 1,2 ml Heliumgas pro Minute
Massenbereich für die massenspektrometrische Messung: m/z 50–500
Wiederholungszeit für die massenspektrometrische Messung: 3 Sekunden

Probe B

Säule: TC-1 (G. L. Science), 30 m × 0,25 mm Innendurchmesser
Temperatur: erhöht von 130°C auf 300°C mit einer Rate von 4°C pro Minute und über fünf Minuten auf 300°C gehalten
Strömungsrate: 1,2 ml Heliumgas pro Minute
Massenbereich für die massenspektrometrische Messung: m/z 50–800
Wiederholungszeit für die massenspektrometrische Messung: 3 Sekunden

Das Ergebnis zeigt, dass die Proben A und B die in den 4 bzw. 5 dargestellten Gesamtionenchromatrogramme zeigen. In jeder der abbildungen ist die Ordinate eine relative Intensität (%), während die oberen und unteren Teile der Abszisse Retentionszeit (Minuten) bzw. Rasterzahlen sind.
Eine Bestätigung der Peaks in den von den Proben A und B erhaltenen Chromatogrammen wurde durch Analyse des Massenspektrums für jeden der Peaks erhalten.
Methylester von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak 2), Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 3) und Tetradecensäure (Peak 1) wurden als Hauptkomponenten aus Probe A bestätigt.
Aus Probe B wurden ein Peak (Peak 1) abgeleitet von Glycerin, Peaks (Peaks 2, 3 und 4) abgeleitet von Fucose, Peaks (Peaks 5 und 6) abgeleitet von Xylose, ein Peak (Peak 7) abgeleitet von Mannose, Peaks (Peaks 8, 9 und 10) abgeleitet von Galactose und ein Peak (Peak 11) abgeleitet von Glucuronsäure bestätigt.
Dementsprechend wurde gefunden, dass das oben genannte reine Produkt Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid enthält.
Beispiel 2
(1) Gemahlenes Produkt (2 kg) aus getrocknetem Gagome Kombu wurde in 20 Litern 80% Ethanol suspendiert, bei 25°C drei Stunden lang gerührt und filtriert, um lösliche Stoffe zu entfernen. Der erhaltene Rückstand wurde in 20 Litern eines Puffers (pH 8,2) suspendiert, der 1,5 Einheiten eines endo-sulfatieren Fucose enthaltenden Polysaccharids ent hält (siehe WO 97126896), 10% Ethanol, 100 mM Natriumchlorid und 50 mM Calciumchlorid und bei 25°C 24 Stunden lang gerührt. Dann wurde diese gerührte Lösung filtriert und der Rückstand mit 10% Ethanol, das 50 mM Natriumchlorid enthält, gewaschen. Der gewaschene Rückstand wurde in 40 Litern eines Puffers (pH 6,6) suspendiert, der 4 g Alginsäurelyase (hergestellt von Nagase Seikagaku Kogyo) enthält, 100 mM Natriumdihydrogenphosphat, 100 mM Natriumchlorid und 10% Ethanol und bei 25°C 96 Stunden lang gerührt. Die Lösung wurde zentrifugiert und der erhaltene flüssige Überstand aufkonzentriert unter Verwendung eines Ultrafilters mit einer Hohlfaser mit einem Exklusionsmolekulargewicht von 100000 und mit 10% Ethanol substituiert, das 100 mM Natriumchlorid enthält. Zu dieser Lösung wurde eine 0,4 M Calciumacetatlösung des selben Volumens zugesetzt, die Mischung 30 Minuten lang gerührt und zentrifugiert und der erhaltene flüssige Überstand unter den selben Bedingungen wie oben einer Ultrafiltration unterzogen und mit 100 mM Natriumchlorid substituiert. Zu dieser Lösung wurde Natriumchlorid zugesetzt, um eine Konzentration von 1 M zu erreichen und der pH wurde auf 8 eingestellt, worauf 1,4 Liter eines Extrakts von Gagome Kombu erhalten wurden.
Der Extrakt wurde mit einer Säule von 2,9 Litern Phenylcellulofine (hergestellt von Seikagaku Kogyo) behandelt und mit 6 Litern 1 M Natriumchlorid, 6 Litern Wasser und 8 Litern Ethanol in dieser Reihenfolge eluiert.
Die Apoptosis induzierende Wirkung jeder der eluierten Fraktionen wurden nach einem in Beispiel 1-(4) genannten Verfahren gemessen, worauf eine Apoptosis induzierende Wirkung und eine Unterdrückungswirkung bei Krebszellen in der mit Ethanol eluierten Fraktion festgestellt wurde.
Die mit Ethanol eluierte Fraktion wurde aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft, der Rückstand in Ethanol aufgelöst, so dass eine Lösung von 175 ml erhalten wurde, 58 ml der erhaltenen Lösung wurden mit einer Säule von 1130 ml Sepharose LH-60 (hergestellt von Pharmacia) behandelt, die zuvor mit Ethanol ins Gleichgewicht gebracht wurde, die Säule wurde mit Ethanol eluiert und das Eluat wurde in jeweils 60 ml aufgefangen.
Das Elutionsmuster ist in 6 angegeben. 6 ist eine Abbildung, die das Ergebnis einer Chromatographie mit einer Säule von Sepharose LH-60 zeigt, in der die Ordinate die Absorption bei 230 nm ist und die Abszisse die Fraktionszahlen angibt.
Die Apoptosis induzierende Wirkung jeder der eluierten Fraktionen wurden nach dem in Beispiel 1-(4) genannten Verfahren gemessen, worauf gefunden wurde, dass die Fraktionen mit den Nummern 8–15 und 27–49 keine Wirkung zeigten, während die Fraktionen mit den Nummern 16–21 und 22–26 eine Apoptosis induzierende Wirkung und eine Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen zeigten.
Unter diesen Fraktionen, die eine potente Wirkung zeigten, wurden drei Fraktionen (Fraktionen der Nr. 20, 21 und 23) einer Analyse der Bestandteile nach einem in Beispiel 1 genannten Verfahren unterzogen.
Die 7, 8, 9, 10, 11 und 12 zeigen die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten jeder der Fraktionen Nr. 20, 21 und 23. Die 7, 8 und 9 sind Abbildungen, die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten jeder der Fraktionen Nr. 20, 21 und 23 zeigen, während die 10, 11 und 12 Abbildungen sind, die Gesamtionenchromatogramme der Zuckerkomponenten jeder der Fraktionen Nr. 20, 21 und 23 zeigen. In jeder der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der o bere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen angeben.
In den 7 und 10 ist gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak 1), Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 3 in 7), Hexadecensäure (Peak 2 in 7) und Octadecensäure (Oleinsäure) (Peak 4 in 7), ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 10) und von Galactose (Peaks 2, 3 und 4 in 10) abgeleitete Peaks in der Fraktion mit der Nr. 20 erfasst wurden. Ferner ist in den 8 und 11 gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak 1 in 8), Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 3 in 8), Hexadecensäure (Peak 2 in 8) und Octadecensäure (Oleinsäure) (Peak 4 in 8), ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 11) und von Galactose (Peaks 2, 3 und 4 in 11) abgeleitete Peaks in der Fraktion mit der Nr. 21 erfasst wurden.
Außerdem ist in den 9 und 12 gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 1 in 9) und Octadecensäure (Oleinsäure) (Peak 2 in 9), ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 12) und von Galactose (Peaks 2, 3 und 4 in 12) abgeleitete Peaks in der Fraktion mit der Nr. 23 erfasst wurden.
Auf diese Weise wurde bestätigt, dass die obigen Fraktionen Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid enthalten und es wurde klargestellt, dass Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid eine Aopotosis induzierende Wirkung und eine Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen aufweist/aufweisen.
(2) Fraktionen Nr. 16–26 der wie in Beispiel 2-(1) erwähnt aus der Säule mit Sepharose LH-60 eluierten Fraktionen wurden aufgenommen, aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft, der getrocknete Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst, die Lösung mit einer Säule von 200 ml latrobeads 6RS-8060 (hergestellt von latron) behandelt, die zuvor mit Chloroform ins Gleichgewicht gebracht wurde, und die Säule wurde mit Chloroform eluiert und dann mit einer Mischung von Chloroform und Aceton in einem Verhältnis von 80 : 20, 60 : 40, 40 : 60 und 20 : 80 nacheinander eluiert. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die mit Chloroform und mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform und Aceton eluierten Fraktionen eine starke Apoptosis induzierende Wirkung zeigen.
Die Fraktionen, in denen eine Apoptosis induzierende Wirkung gefunden wurde, wurden einer Analyse der Bestandteile nach einem in Beispiel 1 genannten Verfahren unterzogen.
Die 13, 14, 15 und 16 zeigen die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten jeder der mit Chloroform und mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform und Aceton eluierten Fraktionen. Die 13 und 14 sind die Abbildungen, die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten jeder der mit Chloroform und mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform und Aceton eluierten Fraktionen, während die 15 und 16 die Abbildungen sind, die Gesamtionenchromatogramme der Zuckerkomponenten jeder der mit Chloroform und mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform und Aceton eluierten Fraktionen zeigen. In jeder der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen angeben.
In den 13 und 15 ist gezeigt, dass ein Peak von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 1 in 13) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 15) aus der mit Chloroform eluierten Fraktion erfasst wurden, während in den 14 und 16 gezeigt ist, dass Peaks von Methylestern von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak 1 in 14) und Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 2 in 14) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 16) aus der mit einer 80 : 20 Mischung von Chloroform und Aceton eluierten Fraktion erfasst wurden.
Damit wurde bestätigt, dass die obigen Fraktionenen Glycerolipid enthalten und es wurde klargestellt, dass das Glycerolipid eine Aopotosis induzierende Wirkung und eine Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen aufweist.
Beispiel 3
(1) Wasser wurde zu 230 ml eines 40-fachen Konzentrats des in Beispiel 1-(1) genannten aus Gagome Kombu gewonnenen Extrakts zugesetzt, so dass sich 910 ml ergeben, dann wurden 490 ml Ethanol dazugegeben und die Mischung zwei Stunden lang gerührt und zentrifugiert, so dass eine in 35% Ethanol lösliche Substanz gebildet wird. Die 35% ethanolisch lösliche Substanz wurde aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft, 100 ml Wasser hinzugefügt, dann 400 ml einer 2 : 1 Mischung von Chloroform und Methanol zugegeben, die Mischung gut gerührt und der dabei abgeschiedene flüssige Überstand aufgenommen. Die untere organische Lösemittelphase wurde verdampft, Wasser hinzugefügt, so dass 100 ml erhalten werden und diese Vorgänge dreimal wiederholt. Die erhaltene Lösung der oberen Schicht wurde aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft und 10 ml Chloroform zugegeben, so dass eine Substanz erhalten wurde, die in Chloroform löslich ist. Diese chloroformlösliche Substanz wurde aufkonzentriert und in einer Säule mit 200 ml latrobeads 6RS-8060 (hergestellt von latron) behandelt, die zuvor mit Chloroform ins Gleichgewicht gebracht wurde, und die Säule wurde mit Chloroform eluiert und dann mit Mischungen von Chloroform und Aceton in Verhältnissen von 90 : 10, 70 : 30, 40 : 60 und 20 : 80 nacheinander eluiert.
Als Ergebnis wurde für die mit Chloroform und mit einer 40 : 60 Mischung von Chloroform und Aceton eluierten Fraktionen eine starke Apoptosis induzierende Wirkung bestätigt.
(2) Die mit Chloroform eluierte Fraktion wurde auf eine Silicagelplatte 60F₂₅₄ (hergestellt von Merck) aufgetüpfelt und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer 9 : 1 Mischung von Hexan und Ether als Entwickler unterzogen, worauf ein einziger Spot mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung und einer Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen an der Stelle erfasst wurde, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt.
Es wurde eine Analyse verschiedener Bestandteile für diesen Spot nach einem in Beispiel 1 genannten Verfahren durchgeführt.
Die 17 und 18 zeigen die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten des Spots, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt. 17 ist eine Abbildung, die das Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponenten des Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt, während 18 eine Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten des Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt. In jeder der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen angeben.
In den 17 und 18 ist gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak 1 in 17), Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 2 in 17) und Octadecansäure (Oleinsäure) (Peak 3 in 17) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 18) aus dem Spot erfasst wurden, wo der Rf-Wert ungefähr 0,25 beträgt.
(3) die mit einer 40 : 60 Mischung von Chloroform und Aceton eluierte Fraktion wurde einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung einer 95 : 12 Mischung von Chloroform und Methanol als Entwickler unterzogen, worauf ein Spot mit einer Apoptosis induzierenden Wirkung an der Stelle erfasst wurde, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt.
Es wurde eine Analyse verschiedener Bestandteile für diesen Spot nach einem in Beispiel 1 genannten Verfahren durchgeführt.
Die 19 und 20 zeigen die Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten des Spots, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt. 19 ist eine Abbildung, die das Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponenten des Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt, während 20 eine Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten des Spots zeigt, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt. In jeder der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen angeben.
In den 19 und 20 ist gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Tetradecansäure (Myristinsäure) (Peak 1 in 19) und Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 2 in 19) und von Galactose abgeleitete Peaks (Peaks 2, 3 und 4 in 20) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 20) von dem Spot erfasst wurden, wo der Rf-Wert ungefähr 0,33 beträgt.
Damit wurde bestätigt, dass die im oben angegebenen Beispiel 3-(2) und Beispiel 3-(3) erwähnten Spots das Glycerolipid und Glyceroglycoli pid enthalten und es wurde klargestellt, dass das Glycerolipid und Glyceroglycolipid eine Apoptosis induzierende Wirkung und eine Wirkung- zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen aufweisen.
Beispiel 4
Ein zehnfaches Volumen an Wasser wurde zu 2,5 kg getrocknetem Gagome Kombu zerkleinert in Würfel von 1 mm zugegeben und nachdem diese Seetangstücke gequollen sind, wurde die überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren entfernt. Ethanol und Wasser wurden zu dem gequollenen Seetang hinzugegeben, so dass schließlich ein 10-faches Volumen an 60% Ethanol vorhanden ist und dann wurde die Mischung bei 37°C drei Stunden lang gerührt und zentrifugiert, so dass die Überstandflüssigkeit erhalten wird. Der flüssige Überstand wurde aufkonzentriert, dann wurden zu 750 ml der wässrigen Lösung Chloroform und Methanol zugegeben, wodurch das Verhältnis von Chloroform : Methanol : Wasser 2 : 4 : 0,8 beträgt, die Mischung wurde gut gerührt und die Lösung der organischen Phase, die die untere Schicht darstellt, wurde abgetrennt.
Die Lösung der unteren Schicht wurde aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft, eine chloroformlösliche Substanz wurde daraus hergestellt und mit 200 ml einer Säule von latrobeads 6RS-8060 (hergestellt von latron) behandelt, die zuvor mit Chloroform ins Gleichgewicht gebracht wurde, und die Säule wurde mit Chloroform eluiert und dann mit einer Mischung von Chloroform und Aceton (40 : 60), Aceton und Methanol nacheinander eluiert.
Jede der eluierten Fraktionen wurde aufkonzentriert, auf eine Silicagelplatte 60F₂₅₄ aufgetüpfelt und Erfassung des Glycolipids wurde unter Verwendung eines Primulinreagens und eines Orcinolsulfatreagens durchgeführt, worauf das Vorhandensein von Glycolipid(en) in beiden Fraktionen bestätigt wurde. Das Ergebnis zeigt, dass die mit einem Lösemittel mit einer geringeren Polarität eluierte Fraktion höhere Mengen an Lipiden enthält und eine stärkere Wirkung in Hinblick auf eine Apoptosis induzierende Wirkung und eine Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen zeigt.
Beispiel 5
Trockenes Gagome Kombu wurde in einem Mixer zerkleinert. Zu 0,5 g des erhaltenen Seetangpulvers wurden 25 ml (1) 60 mM HCl, (2) 1 M Essigsäure, (3) 1% NaHCO₃, (4) 1% Na₂CO₃, (5) 1% Na₂CO₃, (6) einer 2 : 1 Mischung von Chloroform und Methanol, (7) 75% wässrige Ethanollösung, (8) 0,1% SDS oder (9) 0,01% SDS zugegeben und es wurde eine Extraktion über drei Stunden bei 60°C für (1), (2), (3), (4) und (7) oder bei 37°C für alle anderen durchgeführt. Nachfolgend werden die Lösungen von (1) bis (9) als primäre Extrakte bezeichnet. (1) und (2) wurden mit Na₂CO₃ neutralisiert, (4) und (5) wurden mit HCl neutralisiert und alle anderen wurden zentrifugiert wie sie sind und dann den folgenden Behandlungen unterzogen.

A. Zu dem Niederschlag wurden 25 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung zugegeben, eine Extraktion wurde bei 60°C über zwei Stunden durchgeführt, nach Zentrifugieren wurde der flüssige Überstand aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in 1 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung aufgelöst.
B. Zu 10 ml des flüssigen Überstands wurden 30 ml Ethanol zugegeben gefolgt vom Vermischen, nach Zentrifugieren wurde der flüssige Überstand aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in 0,4 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung aufgelöst.
C. Der flüssige Überstand wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in 1 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung aufgelöst.

Der hergestellte Extrakt wurde mit einer 75% wässrigen Ethanollösung verdünnt, jeweils 5 μl davon wurden in je eine Vertiefung einer 96-Loch Mikrotiterplatte gegeben und luftgetrocknet, 100 μl eines RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60 Zellen wurden hinzugegeben und eine Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen nach einem MTT-Verfahren gemessen, wie in Beispiel 7 beschrieben, das später erläutert wird.
Das erhaltene Ergebnis ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 zeigt das Verhältnis zwischen dem Extraktionsverfahren und der Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen, wo die Zahlen in der Tabelle die Verdünnungsraten der verdünnten Lösung mit der Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen zeigt. Vor dem Extrahieren mit einer 75% wässrigen Ethanollösung wurde der pulverisierte Seetang mit der sauren ((1)A) oder alkalischen ((3)A, (4)A, (5)A) Lösung für den primären Extrakt behandelt, wodurch im Vergleich zum nicht behandelten Fall ((7)C) eine Substanz mit einer zweifach stärkeren Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen extrahiert wurde. Außerdem wurde nach dem Verfahren von Beispiel 8, das später erläutert wird, eine Apoptosis induzierende Wirkung dieser Fraktionen gemessen, um die Apoptosis induzierende Wirkung dieser Fraktionen mit einer Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen zu bestätigen.
Tabelle 1
Beispiel 6
(1) Lyophyllum ulmarium M-8171 (FERM BP-1415) wurden gemäß einem in der geprüften japanischen Patentveröffentlichung (Kokoku) Hei-06/34,660 genannten Verfahren kultiviert, so dass ein Fruchtkörper gebildet wurde. Übrigens ist der erhaltene Fruchtkörper der selbe wie der Fruchtkörper, der als „Yamabiko Honshimeji" auf dem japanischen Markt erhältlich st. Außerdem wurde Lyophyllum decastes K-3304 (FERM BP-4348) gemäß einem in der japanischen Offenlegungsschrift (Kokai) Hei-03/65,261 genannten Verfahren kultiviert, so dass ein Fruchtkörper gebildet wurde (japanischer Name Hatakeshimeji). Jeder dieser Fruchtkörper und im Handel erhältliche Maitake, Enokitake, Shiitake und Nameko wurden gefriergetrocknet und dann wurden die erhaltenen gefriergetrockneten Produkte gemahlen, so dass sich ihre gemahlenen Produkte ergeben.
Ein 75% wässriges Ethanol (25 ml) wurde zu jeweils 0,5 g der oben hergestellten gemahlenen Produkte hinzugefügt und eine Extraktion bei Raumtemperatur über zwei Stunden durchgeführt. Nachdem durch Zentrifugieren ein Extrakt erhalten ist, wurde der Extrakt aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, so dass ein trockenes Produkt erhalten wurde. Dieses Trockenprodukt wurde in 1 ml Wasser aufgelöst, so dass ein ethanolischer Extrakt hergestellt wird.
(2) Eine Wirkung des im obigen Beispiel 6-(1) genannten ethanolischen Extrakts zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen wurde gemessen.
Jeder der ethanolischen Extrakte wurde durch Filtern durch ein GD/X PES Filter (hergestellt von Whatman) sterilisiert und eine Verdünnungsreihe unter Verwendung von sterilisiertem Wasser hergestellt. Jeweils 10 μl der verdünnten Lösung wurden in eine der Vertiefungen einer 96-Loch Mikrotiterplatte gegeben, 100 μl eines RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60 Zellen wurden hinzugegeben und Inkubation bei 37°C 48 Stunden lang in Gegenwart von 5% Kohlendioxidgas durchgeführt. Die Form der Zellen wurde unter einem optischen Mikroskop beobachtet, 10 μl einer phosphatgepufferten wässrigen Salzlösung mit 5 mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, hergestellt von Sigma) zugegeben, die Inkubation für weitere vier Stunden fortgesetzt und der Zustand des Wachstums der Zellen unter einem Mikroskop beobachtet. In der Zwischenzeit wurden 100 μl 2-Propylalkohol mit 0,04 N HCl hinzugefügt, gefolgt von gutem Rühren und die Absorption bei 530 nm wurde gemessen und als Grad des Zellwachstums herangezogen.
In Hinblick auf die Wirkung dieser ethanolischen Extrakte von Pilzen zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen wurde gefunden, dass die Zellen bei einer 30-fach verdünnten Lösung von Lyophyllum ulmarium und einer 10-fach verdünnten Lösung von Lyophyllum decastes abgetötet wurden, wodurch eine starke Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen festgestellt wurde und Apoptosiskörper gefunden wurden. Im Falle einer 3-fach verdünnten Lösung von Maitake, Enokitake, Shiitake und Nameko wurden die Zellen abgetötet, während im Falle von 10-fach verdünnten Lösungen Apoptosiskörper gefunden wurden, wodurch jeder der ethanolischen Extrakte dieser Pilze starke Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen und Apoptosis induzierende Wirkung zeigte.
(3) In Hinblick auf den ethanolischen Extrakt von Lyophyllum ulmarium wurde eine Analyse der Bestandteile nach einem in Beispiel 1 genannten Verfahren durchgeführt.
Die 21 und 22 zeigen die Gesamtionenchromatogramme von Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten im ethanolischen Extrakt von Lyophyllum ulmarium. 21 ist eine Abbildung des Gesamtionenchromatogramms der Lipidkomponenten des ethanolischen Extrakts von Lyophyllum ulmarium, während 22 eine Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten des ethanolischen Extrakts von Lyophyllum ulmarium zeigt. In jeder der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen angeben.
In den 21 und 22 ist gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 1 in 21) und cis-9,cis-12-Octadecadiensäure (Linolensäure) (Peak 2 in 21), von Glucose abgeleitete Peaks (Peaks 2, 3 und 4 in 22), ein von Mannitol abgeleiteter Peak (Peak 5 in 22) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 22) im ethanolischen Extrakt von Lyophyllum ulmarium nachgewiesen wurden.
Das Vorhandensein von Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid wurde auch in den ethanolischen Extrakten von anderen Pilzen bestätigt.
Beispiel 7
In Beispiel 6 genanntes gefrorenes gemahlenes Lyophyllum ulmarium (5 g) wurde in 250 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung suspendiert und die Suspension bei Raumtemperatur zwei Stunden lang geschüttelt, um sie durch Zentrifugieren in einen flüssigen Überstand und einen Niederschlag zu trennen, worauf ein Extrakt hergestellt wurde. Der Extrakt wurde aufkonzentriert und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers (30°C) zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde in 20 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung aufgelöst, so dass ein konzentrierter Extrakt von Lyophyllum ulmarium erhalten wurde. Zu einem Teil dieses konzentrierten Extrakts von Lyophyllum ulmarium wurde ein halbes Volumen Wasser hinzugefügt und das selbe Volumen an Chloroform und die erhaltene Suspension wurde stehen gelassen, so dass sie sich in eine obere und eine untere Schicht trennt. Jede der fraktionierten oberen und unteren Schichten wurde aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft, der Rückstand in einem halben Volumen (des verwendeten konzentrierten Extrakts von Lyophyllum ulmarium) einer 75% wässrigen Ethanollösung aufgelöst und die Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen jeder der Fraktionen wie folgt gemessen.
Verdünnungsreihen der aufgelösten Lösung jeder der Fraktionen in 75% wässrigem Ethanol wurden unter Verwendung einer 75% wässrigen Ethanollösung hergestellt. Jeweils 5 μl der verdünnten Lösungen wurden in eine 96-Loch Mikrotiterplatte gegeben und getrocknet, 100 μl eines RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60 Zellen (ATCC CCL-240) wurden hinzugegeben und eine Inkubation bei 37°C über 48 Stunden durchgeführt. Nachdem die Form der Zellen unter einem optischen Mikroskop beobachtet wurde, wurden 10 μl einer gepufferten wässrigen Salzlösung mit 5 mg/ml MTT zugegeben, die Inkubation für weitere vier Stunden fortgesetzt und der Zustand des Wachstums der Zellen unter einem Mikroskop beobachtet. In der Zwischenzeit wurden 100 μl 2-Propylalkohol mit 0,04 N HCl hinzugefügt, gefolgt von gutem Rühren und die Absorption bei 590 nm wurde gemessen und als Grad des Zellwachstums herangezogen (ein MTT-Verfahren).
Das Ergebnis zeigt, dass die Zellen von einer 20-fach verdünnten Lösung der obigen Fraktion von der unteren Schicht abgetötet wurden, worauf eine starke Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen festgestellt wurde und Apoptosiskörper bestätigt wurden. Damit wurde dieser konzentrierte Extrakt von Lyophyllum ulmarium einer Fraktionierung mit Chloroform auf die selbe Weise unterzogen, anstelle der Auflösung in einer 75% wässrigen Ethanollösung in einer mobilen Phase für eine Silicagelsäulenchromatographie aufgelöst und einer Silicagelsäulenchromatographie unterzogen. Die Silicagelsäulenchromatographie wurde unter zwei Bedingungen unter Verwendung einer mobilen Phase bestehend aus Chloroform : Methanol : Wasser = 65 : 25 : 4 (Bedingung Nr. 1) und der aus Chloroform : Methanol = 65 : 25 (Bedingung Nr. 2) unabhängig voneinander durchgeführt. Jede der Fraktionen der Silicagelsäulenchromatographie wurde aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft, der Rückstand in einer 75% wässrigen Ethanollösung in 1/20 des ursprünglichen Flüssigkeitsvolumens aufgelöst, seine Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen nach dem selben MTT-Verfahren wie oben gemessen und die Fraktion, wo Wirkung bestätigt wurde, wurde mittels einer TLC (Chloroform : Methanol : Wasser = 65 : 25 : 4) analysiert. Das Ergebnis zeigt, dass unter Bedingung Nr. 1 die Wirkung in einer Fraktion A verfügbar ist, in der auf Primulinreagens (Lipide) ansprechende Spots, auf Ninhydrinreagens (Aminogruppe) an sprechende Spots, auf Orcinolsulfatreagens (Zucker) ansprechende Spots und auf Dittmerreagens (Phospholipide) ansprechende Spots vorhanden sind, und in einer Fraktion B, in der auf Primulinreagens ansprechende Spots und auf Orcinolsulfatreagens ansprechende Spots vorhanden sind. Unter der Bedingung Nr. 2 war die Wirkung in einer Fraktion C verfügbar, in der auf ein Orcinolsulfatreagens ansprechende Spots vorhanden sind, in einer Fraktion D, in der auf ein Primulinreagens ansprechende Spots und auf ein Orcinolsulfatreagens ansprechende Spots vorhanden sind und in einer Fraktion E, in der auf ein Primulinreagens ansprechende Spots, auf Ninhydrinreagens ansprechende Spots und auf ein Orcinolsulfatreagens ansprechende Spots vorhanden sind. Ferner wurde die Fraktion A und der Bedingung Nr. 1 aufgenommen, aufkonzentriert und zur Trockene eingedampft, in einer mobilen Phase aufgelöst und einer Silicagelsäulenchromatographie unterzogen. Eine Mischung aus Chloroform und Methanol in einem Verhältnis von 95 : 5 wurde als mobile Phase verwendet (Bedingung Nr. 3). Jede der Fraktionen wurden nach einem MTT-Verfahren in der selben Weise wie zuvor untersucht und die Fraktionen, wo die Wirkung bestätigt wurde, wurden durch eine TLC analysiert (Chloroform : Methanol = 95 : 5). Das Ergebnis zeigt, dass unter Bedingung Nr. 3 die Wirkung in einer Fraktion F verfügbar war, in der auf ein Primulinreagens ansprechende Spots vorhanden sind, in einer Fraktion G, in der auf ein Primulinreagens ansprechende Spots und auf ein Orcinolsulfatreagens ansprechende Spots vorhanden sind und in einer Fraktion H, in der auf ein Orcinolsulfatreagens ansprechende Spots vorhanden sind. Die Apoptosis induzierende Wirkung dieser Fraktionen, die zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen wirksam sind, wurde durch die Bildung von Apoptosiskörpern betätigt.
Beispiel 8
Das in Beispiel 6 genannte gemahlene gefriergetrocknete Produkt (1 g) von Lyophyllum ulmarium wurde in 50 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung oder einer 50% wässrigen Ethanollösung suspendiert, bei 37°C zwei Stunden lang geschüttelt und zentrifugiert, um es in einen flüssigen Überstand und einen Niederschlag zu trennen, worauf jeder Extrakt hergestellt wurde. Jeder Extrakt wurde aufkonzentriert und unter Verwendung eines Rotationsverdampfers (30°C) zur Trockene eingedampft und in 8 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung oder einer 50% wässrigen Ethanollösung aufgelöst, so dass ein konzentrierter Extrakt von Lyophyllum ulmarium erhalten wurde.
Jeder der konzentrierten Extrakte von Lyophyllum ulmarium wurde mit einer 75% oder 50% wässrigen Ethanollösung verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde mit einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren untersucht. Zelltod wurde in einem Abschnitt mit einer 10-fach verdünnten Lösung des Extrakts mit einer 75% oder 50% wässrigen Ethanollösung festgestellt und eine Wirkung zur Unterdrückung des Wachstums von Krebszellen wurde bestätigt. Damit wurde bestätigt, dass unter den Bedingungen der Extraktion mit einer 75% wässrigen Ethanollösung und einer 50% wässrigen Ethanollösung Substanzen, die zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen wirksam sind, extrahiert wurden. Ferner wurde eine Apoptosis induzierende Wirkung unter Verwendung dieser konzentrierten Extrakte von Lyophyllum ulmarium gemessen. 25 μl jedes der oben genannten konzentrierten Extrakte wurde als Probe verwendet, Ethanol daraus verdampft, der Rückstand zu 2,5 × 10⁵ HL-60 Zellen/4,5 ml zugegeben, die in einem RPMI 1640 Medium mit 10% fetalem Kalbsserum inkubiert wurden, und die Inkubation wurde bei 37°C 48 Stunden lang durchgeführt. Gleichzeitig wurden Kontrollproben unter Verwendung von destilliertem Wasser und einer Lösung von Actinomycin D (10 μg/ml) hergestellt, von dem bekannt ist, dass es eine Apoptosis induzierende Wirkung aufweist. Die Bildung von Apoptosiskörpern, Kontraktion von Zellen und Aggregation von Kernen wurde mit unbewaffnetem Auge unter einem optischen Mikroskop beobachtet und die Anzahl der lebenden Zellen ausgezählt. Wenn ein solches Phänomen beobachtet wurde und eine Reduzierung der Anzahl lebender Zellen festgestellt wurde, wurde der Probe eine Apoptosis induzierende Wirkung zugesprochen. Das Ergebnis zeigt, dass die Extrakte mit einer 75% wässrigen Ethanollösung und einer 50% wässrigen Ethanollösung eine Apoptosis induzierende Substanz enthalten.
Beispiel 9
(1) Eine 75% wässrige Ethanollösung (25 ml) wurde zu jeweils 0,5 g von gefriergetrocknetem Pulver von im Handel erhältlichem Hiratake (Pleurotus ostreatus) und gemeinem Pilz (Agarius bisporus oder dergleichen) zugegeben und eine Extraktion bei 37°C über zwei Stunden durchgeführt. Der flüssige Überstand nach der Zentrifugierung wurde aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 1 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung aufgelöst und die Lösung mit einer 75% wässrigen Ethanollösung verdünnt. Zu 1 μl der verdünnten Lösung wurden 100 μl eines RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60 Zellen hinzugegeben und die Mischung einer Messung auf Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren unterzogen und auch einer Messung einer Apoptosis induzierenden Wirkung nach einem in Beispiel 8 genannten Verfahren. Das Ergebnis zeigt, dass eine zweifach verdünnte Lösung von Hiratake und eine nicht verdünnte Lösung von gemeinem Pilz beide Wirkung zeigten.
(2) Zu 40 g von in Beispiel 6 genanntem Bunashimeji (Lyophyllum ulmarium) wurden 0 (0%), 50 (25%), 100 (50%) oder 150 ml (75%) Ethanol und 160, 110, 60 oder 10 ml Wasser zugegeben, die Mischung 30 Sekunden lang in einem Mixer homogenisiert, bei Raumtemperatur zwei Stunden lang geschüttelt und filtriert, so dass ein Extrakt erhalten wurde. Der Extrakt wurde mit einer 75% wässrigen Ethanollösung verdünnt und eine Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen und eine Apoptosis induzierende Wirkung nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren bzw. nach einem in Beispiel 8 genannten Verfahren gemessen. Das Ergebnis zeigt, dass beide Wirkungen in einer zweifach verdünnten Lösung der Extrakte mit 0,25 und 50% wässrigen Ethanollösungen und auch in einer fünffach verdünnten Lösung einer 75% wässrigen Ethanollösung verfügbar waren.
Zu 40 Gramm des oben genanten Bunashimeji, in 3–5 mm Würfel geschnitten, wurden 50 (25%), 100 (50%) oder 150 ml (75%) Ethanol und 110, 60 oder 10 ml Wasser zugegeben und die Mischung bei Raumtemperatur zwei Stunden lang geschüttelt und filtriert, so dass es einen Extrakt ergibt. Der Extrakt wurde mit einer 75% wässrigen Ethanollösung verdünnt und seine Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren gemessen, während seine Apoptosis induzierende Wirkung nach einem in Beispiel 8 genannten Verfahren gemesssen wurde. Das Ergebnis zeigt, dass beide Wirkungen in der ursprünglichen (nicht verdünnten) Lösung des Extrakts mit 25% Ethanol und in der zweifach verdünnten Lösung der Extrakte mit 50% und 75% Ethanol verfügbar waren.
(3) Im Handel erhältlicher Shiitake (Cortinellius shiitake) wurde gefriergetrocknet und gemahlen und das erhaltene Pulver zwei Stunden lang unter den in Tabelle 2 genannten Bedingungen extrahiert.
Tabelle 2
Nach der Extraktion wurden unlösliche Stoffe durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft und in 1 ml einer wässrigen Ethanollösung mit der selben Konzentration aufgelöst, wie sie für die Extraktion verwendet wurde. Die Lösung wurde mit einer 75% wässrigen Ethanollösung verdünnt und ihre Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren gemessen, während seine Apoptosis induzierende Wirkung nach einem in Beispiel 8 genannten Verfahren gemesssen wurde, worauf beide Wirkungen in einer zehnfach verdünnten Lösung von (1), einer zweifach verdünnten Lösung von (2), einer fünffach verdünnten Lösung von (3) und einer fünffach verdünnten Lösung von (4) verfügbar waren.
(4) Im Handel erhältlicher Shiitake wurde in Köpfe und Stengel getrennt. Beide wurden getrennt gefriergetrocknet und gemahlen. Zu 0,5 g des erhaltenen Pulvers wurden 25 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung zugegeben gefolgt vom Extrahieren bei 37°C über zwei Stunden. Der flüssige Überstand nach dem Zentrifugieren wurde aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand in 1 ml einer 75% wässrigen Ethanollösung aufgelöst und die erhaltene Lösung mit einer 75% wässrigen Ethanollösung verdünnt. Eine Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen und eine Apoptosis induzierende Wirkung wurden nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren bzw. einem in Beispiel 8 genannten Verfahren gemessen, worauf beide Wirkungen in einer zweifach verdünnten Lösung des Extrakts der Köpfe und in einer 20-fach verdünnten Lösung des Extrakts der Stengel verfügbar waren. Getrockneter chinesischer Shiitake einer hohen Qualität und auch Köpfe und Stengel des chinesischen Shiitake einer mittleren Qualität wurden mit einem Mixer zerkleinert und die selbe Extraktion und die selben Messungen auf Apoptosis induzierende Wirkung durchgeführt, worauf fünffach verdünnte Lösungen aller Extrakte der hohen Qualität und Köpfe und Stengel der mittleren Qualität beide Wirkungen zeigten.
Beispiel 10
(1) Zu 0,5 g von im Handel erhältlichen Matcha (gepulverter grüner Tee) wurden 25 ml Wasser einer 75% wässrigen Ethanollösung zugegeben und die Mischung zwei Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Extrakt wurde zentrifugiert und der flüssige Überstand aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 1 ml Wasser aufgelöst.
Der Extrakt wurde in einer Reihe von 1-fach bis 100-fach verdünnt. Zehn μl jeder der verdünnten Lösungen und 100 μl eines RPMI 1640 Mediums mit 10% fetalem Kalbsserum und 5000 HL-60 Zellen wurden in jeweils eine Vertiefung einer 96-Loch Mikrotiterplatte gegeben und 48 Stunden inkubiert und der Wachstumszustand der Zellen unter einem optischen Mikroskop betrachtet. Das Ergebnis zeigt, dass die Zellen in allen Fällen der verdünnten Lösungen abgetötet wurden, sowohl bei den Extrakten mit Wasser als auch bei einer 75% wässrigen Ethanollösung und dass sowohl wässrige wie ethanolische Extrakte von Tee eine starke Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen aufweisen. Außerdem wurde ihre Apoptosis induzierende Wirkung aufgrund der Bildung von Apoptosiskörpern bestätigt.
(2) Eine Analyse verschiedener Bestandteile des ethanolischen Extrakts des in Beispiel 10-(1) genannten Matcha wurde nach einem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren vorgenommen.
Die 23 und 24 zeigen Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten des ethanolischen Extrakts von Matcha. 23 ist eine Abbildung, die das Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponenten des ethanolischen Extrakts von Matcha zeigt, während 24 eine Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten des ethanolischen Extrakts von Matcha zeigt. In jeder der Abbildungen zeigt die Ordinate die relative Intensität (%), während der obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen angeben.
In den 23 und 24 ist gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 1 in 23) und 9,12,15-Octadecatriensäure (Linolensäure) (Peak 2 in 23), von Glucose abgeleitete Peaks (Peaks 3 und 4 in 24) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 24) im ethanolischen Extrakt von Matcha nachgewiesen wurden, wodurch das Vorhandensein von Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid bestätigt wurde. Ein von Myoinositol abgeleiteter Peak (Peak 5 in 24) und ein von Chinasäure abgeleiteter Peak (Peak 2 in 24) wurden ebenso nachgewiesen.
Beispiel 11
(1) Zu 0,5 g Reiskleie wurden Wasser, eine 75% wässrige Ethanollösung oder eine 90% wässrige Ethanollösung zugegeben gefolgt vom Schütteln bei Raumtemperatur über zwei Stunden. Der Extrakt wurde zentrifugiert, der flüssige Überstand aufkonzentriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 1 ml Wasser aufgelöst. Im Falle eines Extrakts mit einer 90% wässrigen Ethanollösung, wurden die wasserunlöslichen Stoffe in Ethanol gelöst. Diese Proben wurden verdünnt und ihre Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen und ihre Apoptosis induzierende Wirkung nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfarhen bzw. einem in Beispiel 8 genannten Verfahren gemessen. Das Ergebnis zeigt, dass beide Wirkungen in einer fünffach verdünnten Lösung des wässrigen Extrakts, einer nicht verdünnten Lösung des Extrakts mit 75% Ethanol und in zehnfach verdünnter Lösung der ethanollöslichen Fraktion des Extrakts mit 90% Ethanol verfügbar waren, worauf die ethanolischen Extrakte von Reiskleie eine starke Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen und Apoptosis induzierende Wirkung zeigten.
(2) Eine Analyse verschiedener Bestandteile im Extrakt mit 75% Ethanol der im Beispiel 11-(1) genannten Reiskleie wurde nach einem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren vorgenommen.
Die 25 und 26 zeigen Gesamtionenchromatogramme der Lipidkomponenten oder Zuckerkomponenten des 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie. 25 ist eine Abbildung, die das Gesamtionenchromatogramm der Lipidkomponenten des 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie zeigt, während 26 eine Abbildung ist, die das Gesamtionenchromatogramm der Zuckerkomponenten des 75% ethanolischen Extrakts von Reiskleie zeigt. In jeder der Abbildungen ist die Ordinate die relative Intensität (%), während der obere Teil und der untere Teil der Abszisse die Retentionszeit (Minuten) bzw. die Rasterzahlen angeben.
In den 25 und 26 ist gezeigt, dass Peaks von Methylestern von Hexadecansäure (Palmitinsäure) (Peak 1 in 25), Octadecensäure (Oleinsäure) (Peak 3 in 25) und cis-9,cis-l2-Octadecadiensäure (Linolsäure) (Peak 2 in 25), von Glucose abgeleitete Peaks (Peaks 2 und 3 in 26) und ein von Glycerin abgeleiteter Peak (Peak 1 in 26) im 75% ethanolischen Extrakt von Reiskleie nachgewiesen wurden, wodurch das Vorhandensein von Glycerolipid und/oder Glyceroglycolipid bestätigt wurde.
Beispiel 13
Monogalactosyldiglycerid (hergestellt von Wako Pure Chemical) gewonnen aus Spinat, Monogalactosyldiglycerid (hergestellt von Funakoshi) gewonnen aus Weizen und Digalactosyldiglycerid gewonnen aus Weizen wurden in geringen Mengen n-Decan suspendiert, die Suspension mittels einer Ultraschallbehandlung weiter dispergiert und Ethanol zugegeben, so dass ein Verhältnis von n-Decan : Ethanol = 2 : 98 entsteht. Die Lösung wurde mit einem RPM) 1640 Medium auf das 50-fache verdünnt, 0,5 ml davon zu 4,5 ml eines Mediums mit 2,5 × 10⁵ HL-60 Zellen zugegeben, das in einem RPMI 1640 Medium inkubiert wurde, das 10% fetales Kalbsserum enthält. Dieses wurde bei 37°C 48 Stunden lang inkubiert und eine Apoptosis induzierende Wirkung von jedem nach einem in Beispiel 1-(4) genannten Verfahren gemessen, worauf eine starke Apoptosis induzierende Wirkung und eine Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen bestätigt wurde.
Beispiel 14
Im Handel erhältlicher Kohl, Schalen der Eierfrucht, geschälte Eierfrucht und Spinatblätter wurden gefriergetrocknet, gemahlen, auf die selbe Weise wie in Beispiel 9-(4) extrahiert und Messung einer Wirkung zum Unterdrücken des Wachstums von Krebszellen und eine Apoptosis induzierende Wirkung wurden nach einem in Beispiel 7 genannten MTT-Verfahren bzw. einem in Beispiel 8 genannten Verfahren vorgenommen, worauf beide Wirkungen in zweifach verdünnten Lösungen der Extrakte von Kohl, Eierfruchtschalen und Spinatblättern und in einer fünffach verdünnten Lösung von geschälter Eierfrucht verfügbar waren.
Vorteile der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Apoptosis induzierender Stoff, in dem Glycerolipid (wie das Glycerolipid mit einer starken Apoptosis induzierenden Wirkung gewonnen aus Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren) wirksame Komponente(n) ist/sind, angeboten werden, und außerdem kann aufgrund dieser Apoptosis induzierenden Wirkung auch ein Antikrebsmittel angeboten werden. Das Glycerolipid ist in Membrankomponenten von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren reichlich vorhanden und kann mit einem wässrigen Ethanol oder dergleichen effizient extrahiert werden, worauf die wirksame(n) Komponente(n) der vorliegenden Erfindung leicht erhalten werden kann/können. Vor dem Extrahieren mit einem Lösemittel kann eine saure oder alkalische Behandlung vorgenommen werden, so dass eine effizientere Extraktion erfolgen kann. Ferner kann die Polarität des Extraktionslösemittels, Chromatographieträgers zur Trennung usw. in Abhängigkeit von der Hydrophobie ausgewählt werden, wodurch das gewünschte Glycerolipid selektiv hergestellt werden kann. Nahrungsmittel oder Getränk, worin das Glycerolipid, das Apoptosis induzierende Komponente(n) der vorliegenden Erfindung ist/sind, extrahiert und/oder gereinigt insbesondere aus essbaren Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren enthalten, zugesetzt und/oder verdünnt ist, sind sehr geeignet als gesundes Nahrungsmittel, weil ihre tägliche Aufnahme die Gesundheit fördert.

Claims

Verwendung von Glycerolipid bestehend aus Fettsäure und Glycerolresten bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Krebs.
Verwendung von Glycerolipid bestehend aus Fettsäure und Glycerolresten bei der Herstellung eines Lebensmittels oder Getränks für die Behandlung von Krebs.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das genannte Glycerolipid von Pflanzen, Mikroorganismen oder Tieren abgeleitet ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das genannte Glycerolipid von Tee-, Pilz- oder Getreideresten abgeleitet ist.