ES2216169T3 - Molecula de acido nucleico aislado que codifica un antigeno asociado al cancer, al antigeno en si mismo y utilizaciones del mismo. - Google Patents
Molecula de acido nucleico aislado que codifica un antigeno asociado al cancer, al antigeno en si mismo y utilizaciones del mismo.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE AL AISLAMIENTO DE UNA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA PARA UN ANTIGENO ASOCIADO AL CANCER (COMO SE MUESTRA EN LA FIGURA). ASIMISMO, UNA PARTE DE LA INVENCION ES EL ANTIGENO EN SI MISMO, Y LAS UTILIZACIONES DE LA MOLECULA DE ACIDO NUCLEICO Y DEL ANTIGENO, Y PEPTIDOS DERIVADOS DEL MISMO.
Description
Molécula de ácido nucleico aislado que codifica
un antígeno asociado al cáncer, el antígeno en sí mismo y
utilizaciones del mismo.
La presente invención se refiere a un antígeno
asociado con el cáncer, y a la molécula de ácido nucleico que lo
codifica, así como a las utilizaciones de estos.
Está bastante bien establecido que muchos estados
patológicos, tales como infecciones, cáncer, alteraciones
autoinmunes, etc, se caracterizan por la expresión inapropiada de
determinadas moléculas. De esta manera, estas moléculas sirven como
"marcadores" de un estado patológico o anormal concreto. Aparte
de este uso como "dianas" de diagnóstico, es decir materiales a
ser identificados para diagnosticar estas alteraciones anormales,
las moléculas sirven como reactivos que se pueden utilizar para
generar agentes de diagnósticos y/o terapéuticos. Un ejemplo no
limitativo de esto es la utilización los marcadores del cáncer para
producir anticuerpos específicos para un determinado marcador.
Todavía otro ejemplo no limitativo es la utilización de un péptido
que se compleja con una molécula MHC para generar células T
citolíticas contra células anormales.
La preparación de dichos materiales, por
supuesto, presupone una fuente de reactivos utilizados para
generarlos. La purificación a partir de células es un procedimiento
de realización laborioso, lejos de ser seguro. Otro procedimiento
preferido es el aislamiento de moléculas de ácido nucleico que
codifican un marcador concreto, seguido de la utilización de la
molécula codificante aislada para expresar la molécula deseada.
Hasta la fecha, se han utilizado dos estrategias
para la detección de dichos antígenos, en, p.e. tumores humanos.
Estos serán referidos como la aproximación genética y la
aproximación bioquímica. La aproximación genética se ejemplifica
por, p.e., dePlaen et al. Proc. Natl. Sci. USA 85:2275
(1988), incorporada aquí por referencia. En esta aproximación,
varios cientos de pools de plásmidos de una librería de cDNA
obtenida a partir de un tumor se transfieren a células receptoras,
como las células COS, o a variantes negativas de antígeno de líneas
celulares tumorales que se ensayan por la expresión del antígeno
específico. La aproximación bioquímica, ejemplificada, p.e., por
Kawakami, et al., Nature 369:69 (1994) incorporada aquí por
referencia, se basa en la elución acídica de péptidos que se han
unido a moléculas de MHC de clase I de células tumorales, seguido de
cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (HPLC). Los
péptidos antigénicos se identifican después de que se unan a
moléculas de MHC de clase I vacías de líneas celulares mutantes,
defectuosas en el procesamiento de antígeno e inducen reacciones
específicas con linfocitos T citotóxicos. Estas reacciones incluyen
la inducción de la proliferación CTL, la liberación de TNF, y la
lisis de células diana, medibles en un ensayo MTT o un ensayo de
liberación de Cr^{51}.
Estas dos aproximaciones a la definición
molecular de los antígenos tienen las siguientes desventajas:
primero, son enormemente pesadas, consumen tiempo y son caras; y
segundo, dependen del establecimiento de líneas de células T
citotóxicas (CTLs) con una especificidad predefinida.
Los problemas inherentes en dos aproximaciones
conocidas para la identificación y definición molecular de antígenos
se demuestra mejor por el hecho de que ambos procedimientos han
tenido éxito, hasta ahora, en la definición, únicamente, de unos
pocos antígenos nuevos en tumores humanos. Véase, p.e., van der
Bruggen et al., Science 254: 1643-1647
(1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178:
489-495 (1993); Coulie et al., J. Exp. Med.
180: 35-42 (1994); Kawakami, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91: 3515-3519 (1994). Se ha
identificado una nueva familia de precursores de antígeno de rechazo
tumoral, en WO-A-96 21673.
Además, las metodologías descritas se basan en la
disponibilidad de líneas celulares permanentes, establecidas del
tipo de cáncer en consideración. Es muy difícil establecer líneas
celulares a partir de determinados tipos de cáncer, como se muestra,
p.e., en Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am.
10: 607-637 (1990). También es conocido que algunos
cánceres de tipo celular epitelial son pobremente susceptibles a
CTLs in vitro, incluyendo análisis rutinarios. Estos
problemas han estimulado la técnica para desarrollar metodologías
adicionales para la identificación de antígenos asociados al
cáncer.
Una metodología clave se describe en Sahin et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11810-11913
(1995). Resumiendo, el procedimiento implica la expresión de
librerías de cDNA en un hospedador procariota. (Las librerías se
obtienen de una muestra de un tumor). Las librerías expresadas se
inmunocriban, a continuación, con suero diluido y absorbido, con el
fin de detectar aquellos antígenos que provocan respuestas humorales
de titulación elevada. La metodología es conocida como el método
SEREX ("Identificación Serológica de antígenos mediante clonación
de Expresión Recombinante"). La metodología se ha utilizado para
confirmar la expresión de antígenos asociados a tumor identificados
previamente, así como para detectar otros nuevos. Véase la patente
anteriormente referida y Sahin et al., supra, así como
Crew et al., EMBO J 144: 2333-2340
(1995).
La metodología SEREX se ha aplicado a muestras de
cáncer esofágicos y se ha identificado ahora un antígeno y su
molécula de ácido nucleico codificante aislada y clonada. Se ha
encontrado que el antígeno tiene una distribución del cáncer más
extendido, pero no se ha encontrado en células no cancerosas. Esto,
entre otros, es el objeto de la invención, la cual se describe con
más detalle en la descripción que sigue.
La Figura 1 muestra el patrón de expresión de RNA
para el antígeno NY-ESO-1 en
diversos tipos de tejidos.
La Figura 2 muestra un análisis de transferencia
Northern del mRNA de NY-ESO-1, el
cual se encontró en testículos y en la línea celular
SK-MEL-19 pero no en otras muestras
de tejidos y células.
La Figura 3 muestra los sitios potenciales para
la modificación de la secuencia de aminoácidos deducida de
NY-ESO-1.
La Figura 4 es una transferencia de
hidrofilicidad de NY-ESO-1, que
muestra los dominios hidrofílicos en la región amino terminal y una
extensión hidrofóbica larga cercana al extremo carboxilo.
La Figura 5 muestra los resultados de los
estudios de lisis de CTL utilizando diversas células que son
HLA-A2 positivas,
NY-ESO-1 positivas, positivas para
ambas o ninguna positiva.
La Figura 6 representa los datos que establecen
que la HLA-A2 es la molécula presentadora para la
presentación de los péptidos derivados de la SEC ID NO:1.
Se extrajo el RNA total a partir de un espécimen
congelado de partida de células escamosas de cáncer de esófago, de
bien a moderadamente diferenciadas, utilizando procedimientos bien
conocidos. Véase, p.e., Chomzynski, J. Analyt. Biochem. 162:
156-159 (1987), para dicho método. Se utilizó este
DNA para preparar una librería de cDNA que se transfectó, a
continuación, en vectores fágicos \lambdaZAP, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La librería \lambdaZAP se
transfectó, a continuación, en E. coli, consiguiendo
1,6x10^{6} aislados primarios.
A continuación, se utilizó la metodología SEREX
de Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
11810-11813 (1995), incorporada aquí por referencia.
Brevemente, del suero autológo se extrajeron los anticuerpos contra
moléculas que son endógenas para E. coli mediante combinación
del suero con lisados de E. coli transfectadas con el fago
\lambdaZAP el cual no contenía los clones de cDNA procedentes de
células de cáncer esofágico.
El suero agotado se diluyó, a continuación, y se
mezcló con membranas de nitrocelulosa que contenían placas de fago.
Las placas se incubaron durante toda la noche, a temperatura
ambiente. Se lavaron, a continuación, y después se incubaron los
filtros con fosfatasa alcalina conjugada a anticuerpos secundarios
FC\gamma antihumanos de cabra y se visualizaron las placas
reactivas de fagos mediante incubación con
5-bromo-4-cloroindoilo
fosfato y nitroblue de tetrazolio. Se encontraron un total de 13
clones positivos.
Después de la identificación, los clones
reactivos se subclonaron para obtener monoclonales mediante
clonación de dilución y ensayo con suero humano. A continuación,
estos clones se purificaron, se rompieron in vitro y se
convirtieron en formas plasmídicas pBK-CMV,
utilizando las instrucciones del fabricante. El DNA insertado se
examinó, a continuación, utilizando el mapeo de restricción con
EcoRI-XbaI para determinar los diferentes insertos.
Se identificaron ocho insertos diferentes, en el rango de tamaño de
aproximadamente 500 a aproximadamente 1,3 kilopares de bases. Los
clones se secuenciaron utilizando un secuenciador automatizado ABI
PRISM.
La Tabla 1 resume los resultados. Se representó
un gen mediante solapamiento de cuatro clones, un segundo mediante
solapamiento de tres clones y los seis restantes mediante un solo
clon.
Una búsqueda por homología reveló que los clones
referidos como NY-ESO-2, 3, 6, 7 ya
eran conocidos. Véase Elisei et al., J. Endocrin. Invest. 16:
533-540 (1993); Spritz et al., Nucl. Acids
Res. 15: 10373-10391 (1987); Rabbits et al.,
Nature Genetics 4: 175-180 (1993); Crozat, et
al., Nature 363: 640-644 (1993); GenBank H18368
y D25606. Se ha demostrado previamente que dos de los clones
(NY-ESO-3 y
NY-ESO-6) se expresan en diversos
tejidos humanos normales. No se ha encontrado ninguna evidencia de
restricción de linaje. NY-ESO-6
(cDNA) parece ser la región 3' no traducida del gen FUS/TLS. En
experimentos no aportados aquí, la secuenciación y el análisis por
transferencia Southern del NY-ESO-6
no mostró evidencias de translocación o mutaciones puntuales en el
cáncer. Cuatro de los clones, es decir,
NY-ESO-1, 4, 5 y 8 no mostraron una
homología fuerte con las secuencias en las bases de datos examinadas
y de esta manera se estudiaron más.
Se llevaron a cabo estudios para evaluar la
expresión del mRNA de los clones
NY-ESO-1, 4, 5 y 8. Para hacer esto,
se diseñaron cebadores de oligonucleótidos específicos para cada
secuencia, de tal manera que los segmentos de cDNA de
300-400 pares de bases se pudieran amplificar y, de
tal manera, que la temperatura de fusión del cebador se encontrara
en el rango de 65-70ºC. A continuación, se llevó a
cabo la PCR de transcripción inversa utilizando materiales
comercialmente asequibles y protocolos estándar. Se ensayaron una
diversidad de tipos celulares normales y tumorales. Los clones
NY-ESO-4 y
NY-ESO-8 estaban omnipresentes y no
se estudiaron más. La NY-ESO-5
mostró un nivel elevado de expresión en el tumor original y en
tejido esofágico normal, sugiriendo que este era un marcador de
diferenciación.
Se encontró que
NY-ESO-1 se expresaba en mRNA
tumoral y en testículos, pero no en tejido normal de colon, riñón,
hígado o cerebro. Este patrón de expresión es coherente con otros
precursores de antígeno tumorales de rechazo.
El ensayo de RT-PCR indicado en
supra se llevó a cabo con
NY-ESO-1 para un conjunto de tejidos
normales y tumorales mucho más completo. Las Tablas 2, 3 y 4
muestran estos resultados. Brevemente, se encontró que
\hbox{NY-ESO-1}se expresaba altamente en testículos normales y en células de ovarios. Se encontraron pequeñas cantidades de la producción de RT-PCR en el miometrio uterino normal y no en el endometrio, pero el positivo que se mostraba no era coherente. También fueron negativos los diferentes tipos celulares escamosos de epitelio, incluyendo las de esófago y piel normales.
Cuando se ensayaron los tumores de linajes de
células no relacionadas, 2 de las 11 líneas celulares de melanomas
mostraron una expresión fuerte, como hacían 16 de los 67 especímenes
de melanoma, 6 de los 33 especímenes de cáncer de pecho y 4 de los 4
cánceres de vejiga. Existía expresión esporádica en otros tipos
tumorales.
Se llevó a cabo un conjunto más de experimentos
para discernir si la presencia de anticuerpo
anti-NY-ESO-1 en los
sueros de pacientes con cáncer se podía determinar mediante un
ELISA. Brevemente, la proteína
NY-ESO-1, producida mediante los
procedimientos indicados más abajo, se cubrió sobre superficies
sólidas, utilizando procedimientos estándar. Las muestras de suero
se extrajeron de pacientes normales y de pacientes con varios
cánceres. Los anticuerpos
anti-NY-ESO-1
deberían unirse a estos. A continuación, estos se pusieron en
contacto con IgG antihumana de cabra, marcada con peroxidasa
alcalina y, a continuación, se visualizó con el sustrato. Los
resultados se presentan en la siguiente tabla:
Eso 1+ / ensayado total | % | |
Cáncer de pacientes: melanoma | 11/127 | 8,7 |
Cáncer de ovarios | 4/31 | 12,9 |
Cáncer de pulmón | 1/24 | 4,0 |
Donantes de sangre | 0/70 | 0 |
A continuación, se llevó a cabo el análisis de
transferencia Northern para investigar el tamaño del transcrito
NY-ESO-1 y para confirmar los
patrones de expresión en el tejido. Se utilizó la metodología de
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology
(John Wiley & Sons, 1995). Especificando, se disolvieron 20 ug
de RNA total por carril con formamida y formaldehído que contenía un
tampón, se calentó a 65ºC y, a continuación, se separó en gel de
agarosa al 1,2%, con un 3% de formaldehído, seguido de la
transferencia a papel de nitrocelulosa. A continuación, se llevó a
cabo la hibridación utilizando una sonda marcada con P^{32},
seguida de un lavado altamente riguroso. El lavado final fue con
0,1xSSC, 0,1% SDS, 60ºC durante 15 minutos.
El RNA procedente de los testículos y de una
línea celular de melanoma
(SK-MEL-19) que había sido positivo
para NY-ESO-1 en los ensayos
anteriores, mostró un transcrito de RNA de aproximadamente
0,8-0,9 kb. Un espécimen de carcinoma esofágico
mostró una mancha en el rango de 0,4-0,9 kb, que
reflejaba una degradación parcial. El RNA procedente de tejidos
adicionales o de líneas celulares ensayadas no mostraron
transcrito.
Para conseguir el cDNA codificante del transcrito
completo, la librería de cDNA esofágica se volvió a cribar,
utilizando hibridación de placa, y el clon de cDNA original como la
sonda de hibridación. Cuando se cribaron 3x10^{5} clones, se
encontraron seis clones positivos. Los tres clones más largos se
secuenciaron. El análisis de marcos de lectura abierto mostró que
los tres contenían la región codificante entera y regiones en 5' no
traducidas de tamaño variable. El clon más largo, de 755 pares de
bases de longitud (excluyendo el poliA), contiene una región
codificante de 543 pares de bases, junto con 53 bases no traducidas
en el extremo 5' y 151 pares de bases no traducidas en el extremo
3'. Véase SEC ID NO:1 (también Figura 3).
El ORF largo indicaba que la secuencia deducida
de la proteína NY-ESO-1 es de 180
aminoácidos. El único clon inmunopositivo contenía una secuencia que
codificaba 173 de estos. La masa molecular deducida es de 17995
daltons.
El análisis muestra que existe una abundancia en
residuos de glicina en la región N-terminal (30 de
los primeros 80, 4 en los 100 restantes). El análisis de
hidrofilicidad indicó que existían secuencias antigénicas
hidrofílicas en la mitad N-terminal de la molécula,
con secuencias hidrofóbicas e hidrofílicas alternadas, que
finalizaban con una cola hidrofóbica C-terminal
larga (aminoácidos 152-172), seguida de una cola
corta hidrofílica. Este patrón sugiere un dominio transmembrana.
Existen diversos puntos potenciales de
N-miristorilación, 3 puntos de fosforilación y
ninguna evidencia de puntos de N-glicosilación.
Se estableció en 1995 una línea celular de
melanoma "NW-MEL-38",
procedente de un paciente que sufría un melanoma maligno. Las
muestras de suero, linfocitos de sangre periférica y muestras de
tumor, se extrajeron del sujeto y se congelaron hasta llevar a cabo
el trabajo descrito en el presente documento. Para anticipar la
evaluación de la respuesta de células T antitumorales en este
paciente, el paciente se tipó como HLA-A1 y
HLA-A2.
Para determinar si el melanoma procedente de este
paciente expresaba o no NY-ESO-1, se
aisló el RNA total procedente tanto de muestras tumorales como de la
línea celular NW-MEL-38 utilizando
técnicas estándar. A continuación, se sometieron dos microgramos de
RNA total de cada una de las muestras a la síntesis de cDNA.
El cDNA se utilizó, a continuación, en
RT-PCR, utilizando los siguientes cebadores:
5'-CAACAGGAT CCATGGATGC
TGCAGATGCG G'-3' (SEQ ID NO: 2)
y
CACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC
TG-3' (SEQ ID NO: 3)
Estos cebadores deberían amplificar un segmento
de la SEC ID NO:1 que empalma los nucleótidos 271 a 599.
La amplificación se llevó a cabo durante 35
ciclos, utilizando una temperatura de hibridación de 60ºC. Los
productos de la PCR se visualizaron mediante tinción con bromuro de
etidio, en un gel de agarosa al 1,5%.
Los resultados indicaron que tanto el tumor como
la línea celular expresaban la SEC ID NO:1. Las muestras de la línea
celular y de tumor se utilizaron en los experimentos
subsiguientes.
La molécula de cDNA aislada, discutida en
supra, se utilizó, a continuación, para preparar la proteína
recombinante. Específicamente, se amplificó por PCR el cDNA,
utilizando técnicas estándar, y se clonó, a continuación, en un
vector plasmídico disponible comercialmente, es decir, pQE9, que
contiene etiquetas de His. En el trabajo no elaborado aquí, se
utilizó, también, un segundo vector pQE9K. Este difiere de PQE9 en
que la resistencia a kanamicina está impartida por pQE9K, más que la
resistencia a ampicilina.
El vector plasmídico se transformó en la cepa de
E.coli XL1-Blue y los transformantes
positivos se identificaron mediante mapeo por restricción y
secuenciación del DNA. La producción de proteína recombinante se
indujo utilizando isopropil
\beta-D-tiogalactósido y la
proteína se purificó en una columna de cromatografía iónica de
Ni^{2+}, siguiendo procedimientos bien conocidos. Cuando se
analizó la proteína mediante SDS-PAGE al 15% y
tinción con plata, se identificó como una proteína de un peso
molecular de aproximadamente 22 kilodaltons. Esto es coherente con
el tamaño predecido de la proteína a partir de su secuencia.
Los transfectantes eucarióticos fueron producidos
a continuación. Para hacer esto, la secuencia codificante de
NY-ESO-1 se aisló a partir del vector pQE9 descrito en supra, y, a continuación, se clonó en los puntos BamHI-HindIII del vector de expresión eucariota pcDNA 3.1. A continuación, las células COS-7 se transfectaron con este vector, poniendo en contacto las muestras de células con 150 ng del plásmido discutido en supra, y 150 ng del pcDNA plasmídico 1 Amp, que contenía o cDNA de HLA-A2.1 o el cDNA del HLA-A1. Se utilizó el procedimiento, bien conocido, de la DEAE-dextrano cloroquina. Las células se incubaron, a continuación, a 37ºC durante 48 horas, después de lo cual se ensayaron en un ensayo de estimulación de CTLs. Específicamente, el ensayo seguía Traversari et al., Immunogenetics 35: 145-148 (1992), incorporado aquí por referencia. Brevemente, 2500 CTLs (NW38-IVS-1, véase ejemplo 9, infra) en 100 uL de RPMI suplementado con suero humano al 100% y se añadieron 25 U/ml de IL-2 recombinante a los micropocillos que contenían células COS-7 transfectadas (20.000 células/pocillo). Después de 24 horas, se recogieron 50 ul de sobrenadante de cada pocillo, y se determinaron los niveles de TNF-\alpha en un ensayo estándar, es decir, uno en donde se ensayaba la citotoxicidad de 13 células contra el clon WEHI 164, utilizando MTT. Las células positivas se utilizaron en el análisis de transferencia Western, descrito en los ejemplos que siguen.
NY-ESO-1 se aisló a partir del vector pQE9 descrito en supra, y, a continuación, se clonó en los puntos BamHI-HindIII del vector de expresión eucariota pcDNA 3.1. A continuación, las células COS-7 se transfectaron con este vector, poniendo en contacto las muestras de células con 150 ng del plásmido discutido en supra, y 150 ng del pcDNA plasmídico 1 Amp, que contenía o cDNA de HLA-A2.1 o el cDNA del HLA-A1. Se utilizó el procedimiento, bien conocido, de la DEAE-dextrano cloroquina. Las células se incubaron, a continuación, a 37ºC durante 48 horas, después de lo cual se ensayaron en un ensayo de estimulación de CTLs. Específicamente, el ensayo seguía Traversari et al., Immunogenetics 35: 145-148 (1992), incorporado aquí por referencia. Brevemente, 2500 CTLs (NW38-IVS-1, véase ejemplo 9, infra) en 100 uL de RPMI suplementado con suero humano al 100% y se añadieron 25 U/ml de IL-2 recombinante a los micropocillos que contenían células COS-7 transfectadas (20.000 células/pocillo). Después de 24 horas, se recogieron 50 ul de sobrenadante de cada pocillo, y se determinaron los niveles de TNF-\alpha en un ensayo estándar, es decir, uno en donde se ensayaba la citotoxicidad de 13 células contra el clon WEHI 164, utilizando MTT. Las células positivas se utilizaron en el análisis de transferencia Western, descrito en los ejemplos que siguen.
Las CTLs utilizadas fueron CTL
NW38-IVS-1 preparadas de acuerdo con
Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:
3511-3515 (1984), incorporada aquí por referencia.
Específicamente, los cultivos de células T mezclados se produjeron,
mediante combinación de 10^{5} células tumorales autólogas NW38
MEL-1 y 10^{6} linfocitos de sangre periférica,
procedentes del sujeto. Se añadió la citoquina IL-2
y el cultivo mezclado se incubó durante una semana a 37ºC. Las
células tumorales se extrajeron y se añadió una nueva alícuota de
5x10^{4} células tumorales junto con la
IL-2. Este proceso se repitió semanalmente, hasta que se observó una fuerte respuesta cuando se ensayó con células NW-MEL-38 marcadas con Cr^{51}. Los contestadores (en inglés "responders") de células T se recogieron y se congelaron hasta su utilización en experimentos adicionales.
IL-2. Este proceso se repitió semanalmente, hasta que se observó una fuerte respuesta cuando se ensayó con células NW-MEL-38 marcadas con Cr^{51}. Los contestadores (en inglés "responders") de células T se recogieron y se congelaron hasta su utilización en experimentos adicionales.
Se llevó a cabo, a continuación, un análisis de
transferencia Western, utilizando las muestras de suero descritas
más arriba, así como los lisados celulares procedentes de la línea
celular NW-MEL-38, descrita más
arriba, y los transfectantes COS-7, descritos en
supra, y la proteína recombinante purificada, también
descrita en supra. Las muestras de suero se tomaron en
diversos momentos de la terapia del paciente.
En estos ensayos, se diluyeron 1 ug de la
proteína recombinante NY-ESO-1 ó 5
ul de lisados celulares de cualquier tipo en SDS y se hirvió durante
cinco minutos y, a continuación, se realizó la electroforesis en un
gel de SDS al 15%. Después de toda la noche de transferencia a
nitrocelulosa (0,45 um) y de bloquearlo con BSA al 3%, las manchas
se incubaron con suero, diluido al 1:1000, 1:10.000 y 1:100.000 o
con un anticuerpo monoclonal contra
\hbox{NY-ESO-1}diluido a 1:50 como control positivo. El anticuerpo monoclonal se preparó como sigue. Se inmunizaron ratones BALB/C mediante cinco inyecciones subcutáneas de la proteína recombinante NY-ESO-1 en intervalos de 2-3 semanas. La formulación de inmunización incluía 50 ug de proteína recombinante en un adyuvante. La primera inyección utilizaba Adyuvante de Freund Completo y se utilizó el Adyuvante de Freud Incompleto de ahí en adelante. De los ratones inmunizados se extrajeron células de bazo y se fusionaron con la línea celular SP2/0 de mieloma de ratón para generar hibridomas.
Una vez se generaron los hibridomas, estos se
clonaron y sus sobrenadantes se cribaron contra la proteína
recombinante, utilizando un ELISA en fase sólida estándar en placas
de microtitulación. El ensayo fue de acuerdo con Dippold et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114-6118
(1980), incorporado aquí por referencia. Se hicieron correr también
una serie de controles negativos, utilizando la
NY-ESO-1 recombinante. Los
anticuerpos del suero que se unían a la proteína recombinante
producida por E. coli, según se ha descrito más arriba, se
visualizaron utilizando IgG antihumano de cabra marcado con
fosfatasa alcalina en una dilución 1:10.000 y, a continuación, se
visualizaron con NBT-fosfato. Las células
COS-7 no transfectadas se utilizaron también como
control. También se utilizó el suero procedente de un individuo sano
como control.
La fuerte reactividad contra la proteína
recombinante se encontró en las diluciones por debajo de 1:100.000 y
existía también reactividad contra el lisado de
NW-MEL-38. No se encontró
reactividad contra las células COS-7 no
transfectadas ni se mostró reactividad en el suero de un individuo
sano.
En el ensayo de los tranfectantes de
COS-7, supra, y en los ensayos discutidos en
este ejemplo, se utilizó una línea de células T citolíticas
"NW38-IVS-1". Esta "CTL"
se generó mediante una estimulación in vitro de los
linfocitos de sangre periférica mencionados más arriba, utilizando
la línea de células tumorales
NW-MEL-38. Esto se hizo utilizando
técnicas estándar.
La CTL se utilizó en un ensayo de citotoxicidad
con NW-MEL-38 (el cual era
HLA-A1, A2 positivo y
NY-ESO-1 positivo), junto con dos
líneas celulares alogénicas que eran
NY-ESO-1 y HLA-A2
positivas (SK-MEL-37 y
MZ-MEL-19), una línea celular que es
de clase MHC I negativa (SK-MEL-19),
una línea celular que es HLA-A2 positiva, pero
NY-ESO-1 negativa
(NW-MEL-145) junto con las líneas
celulares control K562 y los blastos autólogos estimulados con
fitohemaglutinina. Se utilizaron diferentes relaciones efector/diana
y el parámetro de medida de la lisis fueron las células diana
marcadas con Cr^{51}. La Figura 5 muestra esto.
Los resultados indicaban que la CTL
NW38-IVS-1 lisaba tanto la línea
celular autóloga NW MEL-38 como las líneas celulares
alogénicas que eran HLA-A2 y ESO-1
positivas. De esta manera, la CTL era reactiva a materiales
alogénicos. Véase Figura 6.
Puesto que el paciente NW38 era
HLA-A1 y HLA-A2 positivo, se
llevaron a cabo experimentos para determinar qué molécula era la
molécula presentadora.
Se llevó a cabo el mismo experimento que el
descrito arriba con células COS-7, excepto en que en
estos experimentos, se debía de tener la seguridad de separar los
grupos de cotransformantes que habían sido transformados con
cualquiera cDNA de HLA-A1 o de
HLA-A2 pero no ambos. Estos resultados muestran que
las CTL NM38-IVS-1 lisaban los
transfectantes COS-7 que contenían tanto
NY-ESO-1 como HLA-A2
exclusivamente. Véase la Figura 6. El trabajo también confirmó la
especificidad de la CTL, puesto que las células
NY-ESO-1 negativa,
HLA-A2 positivas descritas en el Ejemplo 9 fueron
positivas para otras moléculas conocidas por ser procesadas a
péptidos presentados por moléculas HLA-A2.
Una vez se identificó la molécula presentadora
MHC como la HLA-A2, se llevó a cabo el cribado de la
secuencia de aminoácidos de la
NY-ESO-1, para identificar todos los
péptidos que satisfacen este motivo, utilizando el modelo descrito
por D'Amaro et al., Human Immunol. 43: 13-18
(1995) y Drijfhout, et al., Human Immunol. 43:
1-12 (1995) incorporados aquí por referencia. Se
sintetizaron los péptidos correspondientes a todas las secuencias de
aminoácidos deducidas a partir de éstos utilizando técnicas estándar
y, a continuación, se utilizaron en pruebas de citotoxicidad,
siguiendo Knuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:
3511-3515 (1984) incorporado aquí por referencia.
Específicamente, se utilizó la línea celular CEMX721.174.T2
("T2" de aquí en adelante) ya que este no procesa antígenos a
los péptidos complejados a MHC, haciéndole, de esta manera, ideal
para los experimentos del tipo descrito aquí. Las muestras de
células T se marcaron con 100 uCi de
Na(Cr^{51})O_{4}, utilizando métodos estándar, y
se lavaron, a continuación, tres veces, seguido de la incubación con
10 ug/ml de péptido y 2,5 ug/ml de
\beta-2-microglobulina. La
incubación fue de una hora, a temperatura ambiente. A continuación,
se añadieron las células de conestadores (100 Ul de una suspensión
de CTL NW38-IVS-1) en una relación
efector/diana de 90:1 y se incubaron durante cuatro horas en una
atmósfera saturada de agua, con un 5% de CO_{2}, a 37ºC. A
continuación, las placas se centrifugaron a 200xg durante cinco
minutos, se extrajeron 100 ul de sobrenadante y se midió la
radioactividad. El porcentaje de Cr^{51} liberado se determinó de
acuerdo con estrategias conocidas. Se encontró que los péptidos
SLLMWITQCFL (SEC ID NO:4), SLLMWITQC (SEC ID NO:5) y QLSLLMWIT (SEC
ID NO: 6) eran los tres estimuladores mejores de CTLs. Se
encontraron resultados comparables cuando se utilizaron como dianas
NW-MEL-38 y las líneas celulares
SK-MEL-37 y
MZ-MEL-19, como se ha mostrado en
supra.
Los ejemplos anteriores describen el aislamiento
de una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno asociado
con el cáncer de esófago. "Asociado" se utiliza aquí porque
mientras es evidente que la molécula importante se expresaba por el
cáncer esofágico, otros cánceres como el melanoma, el cáncer de
mama, próstata y pulmón también expresan el antígeno.
La invención se refiere a aquellas moléculas de
ácido nucleico que codifican antígenos según se ha descrito, y que
hibridan con una secuencia de referencia SEC ID NO: 1 bajo
condiciones rigurosas. "Condiciones rigurosas" según se utiliza
en el presente documento se refiere a condiciones tales como las
especificadas en la patente US Nº 5.342.774, es decir, 18 horas de
hibridación a 65ºC, seguido de cuatro lavados de una hora con 2xSSC,
0,1% SDS, y un lavado final con 0,2xSSC, más preferiblemente
0,1xSSC, 0,1% SDS durante 30 minutos, así como condiciones
alternadas que permitan el mismo nivel de rigurosidad y condiciones
más rigurosas.
También son otra parte de la invención vectores
de expresión que incorporan las moléculas de ácido nucleico de la
invención, en unión operativa ("unido operativamente") a un
promotor. La construcción de dichos vectores forma parte del
conocimiento del experto en la materia, como es la transformación o
transfección de células, para producir líneas de células eucariotas
o cepas de células procariotas que codifiquen la molécula de
interés. Ejemplos de células hospedadoras que se pueden utilizar de
esta manera son las células COS, células CHO, células de levadura,
células de insectos (p.e. Spodolptera frugiperda), células
NIH 3T3 y más. También se pueden utilizar células procariotas tales
como E. coli y otras bacterias.
También es parte de la invención el antígeno
descrito aquí, tanto en la forma de péptido original como en la
forma post-traduccional modificada. La molécula es
suficientemente larga como para ser antigénica sin cualquier
modificación post-traduccional y, de esta manera, es
útil como inmunogen, cuando se combina con un adyuvante (o sin
este), tanto en la forma de precursor como en la forma modificada de
manera post-traduccional. Los anticuerpos producidos
utilizando este antígeno, tanto poli como monoclonal, también forman
parte de la invención así como la hibridación que hace el anticuerpo
monoclonal. Esto se puede utilizar terapéuticamente como la proteína
entera, o en fragmentos, según se discute en infra. También
forman parte de la invención los anticuerpos contra el antígeno,
siendo estos policlonales, monoclonales, fragmentos reactivos, como
el Fab, F(ab)'_{2} y otros fragmentos, así como quimeras,
anticuerpos humanizados, anticuerpos producidos de manera
recombinante, y más.
Como resulta evidente de la descripción, uno
puede utilizar proteínas y las moléculas de ácido nucleico de la
invención para el diagnóstico. La metodología SEREX discutida aquí
está basada en una respuesta inmune para un antígeno asociado a una
patología. De esta manera, uno puede ensayar para la patología
relevante mediante, por ejemplo, ensayo de la reactividad con un
antígeno per se de un fluido corporal en una muestra de un fluido
corporal de un sujeto, como suero. La reactividad sería considerada
indicativa de la posible presencia de la patología, por lo que
también, uno podría ensayar la expresión del antígeno mediante
cualquier de los ensayos estándar de hibridación de ácido nucleico
que son bien conocidos en la materia y no necesitan ser elaborados a
partir de aquí. Uno podría probar los anticuerpos contra la molécula
objeto, utilizando también inmunoensayos estándar.
El análisis de la SEC ID NO:1 mostrará que
existen regiones no codificantes en 3' y 5' presentadas allí. La
invención se refiere a aquellas moléculas de ácido nucleico aisladas
que contienen por lo menos el segmento codificante, es decir, los
nucleótidos 54-593 y que pueden contener cualquier o
todos los nucleótidos 1-53 y/o
594-747 de la SEC ID NO:1.
Un análisis adicional, según se ha discutido en
supra, revela que la molécula se procesa a péptidos que
provocan la lisis mediante células T citolíticas. El Ejemplo 7
mostraba como este tipo de análisis del motivo se puede llevar a
cabo para moléculas HLA-A2. Se ha realizado un gran
trabajo en motivos de diversas moléculas MHC o HLA, que es aplicable
aquí. De esta manera, la invención se refiere a composiciones útiles
en un método terapéutico, en donde se administra al paciente uno o
más péptidos que se unen a una molécula de HLA en la superficie de
células tumorales de un paciente, en una cantidad suficiente para
que los péptidos se unan a las moléculas MHC/HLA y provocar la lisis
mediante células T. La ejemplificación dada más arriba para las
moléculas HLA-A2 no es de ninguna manera el único
tipo de esta administración que se puede utilizar. Cualquier
combinación de péptidos se puede utilizar. Estos péptidos, que se
pueden utilizar solos o en combinación, así como la proteína entera
o porciones inmunoreactivas de la misma, se pueden administrar a un
sujeto que necesite de estas, utilizando cualquiera de los tipos
estándar de administración, tales como la administración
intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, rectal y transdérmica.
Los portadores farmacéuticos estándar, adyuvantes, como las
saponinas, GM-CSF e interleuquinas y demás también
se pueden utilizar. Además, estos péptidos y proteínas se pueden
formular en vacunas con el material listado, como células
dendríticas u otras células que presentan complejos MHC/péptido
relevantes.
De manera similar, la invención se refiere a
composiciones útiles en terapias en donde la molécula de ácido
nucleico que codifica la NY-ESO-1,
se incorpora en un vector, como un vector basado en un adenovirus,
para volverlo transfectable en células eucariotas, como las células
humanas. De manera similar, las moléculas de ácido nucleico que
codifican uno o más de los péptidos se pueden incorporar en estos
vectores, que son, entonces, el constituyente principal de las
terapias a base de ácido nucleico.
Cualquiera de estos ensayos se puede utilizar
también en estudios de progresión/regresión. Uno puede seguir el
transcurso de una anormalidad que implique la expresión de
NY-ESO-1, simplemente mediante el
seguimiento de los niveles de proteína, su expresión y demás
utilizando cualquiera o todos los métodos indicados en
supra.
Debería ser evidente que estas metodologías se
pueden utilizar también para rastrear la eficacia de un régimen
terapéutico. Esencialmente, uno puede tomar un valor de línea base
para la proteína NY-ESO-1,
utilizando cualquiera de los ensayos discutidos más arriba,
administrar un agente terapéutico determinado y, a continuación,
seguir los niveles de la proteína de aquí en adelante, observando
los cambios en los niveles de ESO-1 como indicio de
la eficacia del régimen.
Como se indicaba en supra, la invención
implica, entre otros, el reconocimiento de una respuesta inmune
"integrada" para la molécula NY-ESO. Una
ramificación de esto es la capacidad para seguir el transcurso de la
terapia del cáncer. En este procedimiento, un sujeto que necesite la
terapia recibe una vacuna de un tipo descrito aquí. Dicha vacuna
resulta, p.e. en una respuesta de células T contra células que
presentan los complejos de péptido/HLA en sus células. La respuesta
también incluye una respuesta de anticuerpos, posiblemente un
resultado de la liberación de anticuerpo que provocan las proteínas
mediante la lisis de células a través de células T. De esta manera,
uno puede seguir el efecto de una vacuna, mediante seguimiento de la
respuesta del anticuerpo. Como se indicaba más arriba, un aumento en
la titulación de anticuerpos se puede tomar como un indicio del
progreso con un vacuna, y viceversa. De esta manera, un aspecto más
de la invención es un procedimiento de seguimiento de la eficacia de
una vacuna, siguiendo a la administración de la misma, mediante la
determinación de los niveles de anticuerpos en el sujeto que son
específicos para la vacuna en sí misma o moléculas grandes de las
que la vacuna es una parte.
La identificación de proteínas
NY-ESO-1 por estar implicadas en los
estados patológicos como el cáncer también sugiere una serie de
aproximaciones terapéuticas en suma a las discutidas más arriba. Los
experimentos indicados arriba establecen que los anticuerpos se
producen en respuesta a la expresión de la proteína. De esta manera,
la invención proporciona composiciones que se relacionan con el
tratamiento de estados que se caracterizan por niveles aberrantes o
anormales de proteínas NY-ESO-1,
mediante administración de anticuerpos, como anticuerpos
humanizados, fragmentos de anticuerpos y demás. Estos se pueden
etiquetar o marcar con reactivos citostáticos o citotóxicos.
Las composiciones de la invención se pueden
utilizar en procedimientos en donde las células T también se pueden
administrar. Cabe indicar que las células T se pueden estimular
in vitro utilizando las células de respuesta inmune tales
como células dendríticas, linfocitos, o cualquier otra célula de
respuesta inmune y, a continuación, se vuelven a prefusionar en el
sujeto a ser tratado.
Véase que la generación de células T y/o de
anticuerpos se puede llevar a cabo mediante administración de
células, preferiblemente tratadas para volverlas no proliferativas,
las cuales presentan epítopos de células B o T relevantes para la
respuesta, como los epítopos discutidos más arriba.
Las aproximaciones terapéuticas pueden incluir
también las terapias antisentido, en donde una molécula antisentido,
preferiblemente de 10 a 100 nucleótidos de longitud, se administra
al sujeto ya sea "arreglado" o en un portador, como un
liposoma, para facilitar la incorporación en una célula, seguido de
la inhibición de la expresión de la proteína. Dichas secuencias
antisentido también se pueden incorporar en vacunas apropiadas,
tales como en vectores virales (p.e. Vaccinia), construcciones
bacterianas, como variantes de la vacuna conocida BCG y demás.
También una parte de la invención son péptidos,
que pueden ser nonámeros, docámeros o undecámeros definidos por
tener una secuencia central:
LLMWIT (SEQ ID NO: 7)
que tiene por lo menos un residuo terminal
adicional respecto al primer residuo L, preferiblemente serina y
puede tener como mucho tres, en donde la Serina se une a L para
formar -SL-, y de 0-4 aminoácidos adicionales en
el
C-terminal, según se ha mostrado en supra, unido a moléculas HLA-A2, provocando de esta manera una respuesta CTL. Estos péptidos se pueden utilizar terapéuticamente, mediante administración a un paciente que es HLA-A2 positivo, y expresa NY-ESO-1 relacionada con una patología, así como de manera diagnóstica, es decir, para determinar si las células HLA-A2 positivas están presentes o si están presentes CTLs relevantes, y demás.
C-terminal, según se ha mostrado en supra, unido a moléculas HLA-A2, provocando de esta manera una respuesta CTL. Estos péptidos se pueden utilizar terapéuticamente, mediante administración a un paciente que es HLA-A2 positivo, y expresa NY-ESO-1 relacionada con una patología, así como de manera diagnóstica, es decir, para determinar si las células HLA-A2 positivas están presentes o si están presentes CTLs relevantes, y demás.
La molécula HLA-A2 es una
molécula MHC de clase I, y las células T que responden a complejos
de péptidos y moléculas de clase I son generalmente células CD8+.
Otro subconjunto de células T, las células CD4+, responden a los
complejos y péptidos de MHC de clase II y se han detectado
respuestas de células T CD4+ restringidas a MHC de clase II contra
la NY-ESO-1 recombinantes,
presentados por células dendríticas autólogas cultivadas, en
pacientes con melanoma. Específicamente, en resultados no descritos
aquí, las células CD4+ se separaron de las otras células a partir de
PBLs o muestras de suero, utilizando técnicas bien conocidas. A
continuación, se mezclaron con células dendríticas, las cuales se
habían pulsado con la proteína
NY-ESO-1. Se observó la
proliferación de células T CD4+, llevando otra faceta a la respuesta
inmune discutida más aquí. De esta manera, un aspecto más de la
presente invención son estas células T CD4+, péptidos que se unen a
las moléculas de MHC de clase II y su utilización en terapia.
Otras características y aplicaciones de la
invención serán evidentes para los expertos en la materia y no
necesitan ser expuestos aquí.
(1) INFORMACION GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTES: Yao-Tseng Chen; Scanlan, Matthew; Gure, Ali; Old, Lloyd; Knuth, Alexander; Jager, Elke; Drijfhout, Jan, W.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCION: Molécula de Ácido nucleico aislada que codifica un antígeno asociado con el cáncer de esófago, el antígeno en sí mismo y utilizaciones de los mismos.
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCION PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- A QUIEN SE HA DE DIRIGIR: Felfe & Linch
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 805 Third Avenue
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Ciudad de Nueva York
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- USA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: 10022
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMATO PARA LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete de 3,5 pulgadas, memoria de 144 Kb
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Wordperfect
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACION:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: US 08/752.182
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACION: 03 de Octubre de 1996
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: 935
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACION SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Hanson, Norman D.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NUMERO DE REGISTRO: 30.946
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NUMERO DE ACTA/REFERENCIA: LUD 5466.1-PCT
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACION PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELEFONO: (212) 688-9200
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212) 838-3884
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 752 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACACAGGAT CCATGGATGC TGCAGATGCG G
\hfill31
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACACAAAGC TTGGCTTAGC GCCTCTGCCC TG
\hfill32
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Phe
Leu}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA LA SECUENCIA Nº 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: Sec. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Met Trp Ile Thr}
Claims (69)
1. Molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un antígeno asociado con el cáncer, teniendo dicha molécula
de ácido nucleico aislada una secuencia de nucleótidos, la secuencia
complementaria de la cual híbrida, en condiciones rigurosas, con la
molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de
nucleótidos indicada en los nucleótidos 54-593 de la
SEC ID NO:1.
2. Molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1, que consiste en los nucleótidos
54-593 de la SEC ID NO:1.
3. Molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1, que consiste en cualquiera del nucleótido 1 hasta
el nucleótido 747 de la SEC ID NO:1, con la condición de que dicha
molécula de ácido nucleico aislada contiene por lo menos los
nucleótidos 54-593 de la SEC ID NO:1.
4. Vector de expresión que comprende la molécula
de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 o reivindicación 3,
unido operativamente a un promotor.
5. Vector de expresión que comprende un virus
mutado o atenuado y la molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1.
6. Vector de expresión de la reivindicación 5, en
donde dicho virus es un adenovirus o virus de la vacuna.
7. Vector de expresión de la reivindicación 4,
que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica
para un MHC o HLA.
8. Vector de expresión de la reivindicación 4,
que comprende además una molécula de ácido nucleico que codifica
para una citoquina.
9. Línea celular eucariota aislada o cepa celular
procariota transformada o transfectada con el vector de expresión de
la reivindicación 4.
10. Línea celular eucariota aislada o cepa
celular procariota transformada o transfectada con la molécula de
ácido nucleico aislada de la reivindicación 1.
11. Línea celular eucariota aislada de la
reivindicación 10, en donde dicha línea celular ha sido convertida
en no proliferativa.
12. Línea celular eucariota aislada de la
reivindicación 10, en donde dicha línea celular es una línea celular
de fibroblasto.
13. Línea celular eucariota aislada de la
reivindicación 10, en donde dicha línea celular está transfectada
también con una molécula de ácido nucleico que codifica para una
citoquina.
14. Línea celular eucariota aislada de la
reivindicación 13, en donde dicha línea celular está transfectada
además con una molécula de ácido nucleico que codifica para una
molécula de HLA.
15. Línea celular eucariota aislada de la
reivindicación 13 o del vector de expresión de la reivindicación 8,
en donde dicha citoquina es una interleuquina.
16. Línea celular eucariota aislada o vector de
expresión de la reivindicación 15, en donde dicha interleuquina es
IL-2, IL-4 o
IL-12.
17. Antígeno aislado asociado al cáncer que
comprende todo o parte de la secuencia de aminoácidos codificada por
los nucleótidos 54-593 de la SEC ID NO:1.
18. Sistema de expresión útil en la transfección
de una célula que comprende (i) un primer vector que contiene una
molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno aislado asociado
al cáncer de la reivindicación 17 y (ii) un segundo vector
seleccionado del grupo que consiste en (a) un vector que contiene
una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de MHC o
HLA que presenta un antígeno derivado de dicho antígeno asociado con
el cáncer y (b) un vector que contiene una molécula de ácido
nucleico que codifica para una interleuquina.
19. Composición inmunogénica que comprende el
antígeno aislado de la reivindicación 17 o un vector de expresión
que codifica dicho antígeno, y un adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
20. Composición inmunogénica que comprende por lo
menos un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de 8 a
12 aminoácidos concatenados uno con otro en un antígeno aislado
asociado con el cáncer de la reivindicación 17 que comprende toda la
secuencia de aminoácidos y un adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
21. Composición inmunogénica de la reivindicación
19 o reivindicación 20, en donde dicho adyuvante es una citoquina,
una saponina, o GM-CSF.
22. Composición inmunogénica de la reivindicación
20, en donde dicha composición comprende una pluralidad de péptidos
que complejan con una molécula específica de MHC.
23. Composición inmunogénica que comprende por lo
menos un vector de expresión que codifica para una pluralidad de
péptidos derivados de la secuencia de aminoácidos codificada por la
SEC ID NO:1 y un adyuvante o portador.
24. Péptido aislado derivado de la secuencia de
aminoácidos codificada por la SEC ID NO:1, en donde dicho péptido
aislado se une a una molécula HLA, es un nonámero, un docámero o un
undecámero, y comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
NO:7, de uno a tres aminoácidos adicionales en el
N-terminal y hasta cuatro aminoácidos adicionales en
el C-terminal.
25. Péptido aislado de la reivindicación 24,
seleccionado del grupo que consiste en SEC ID NO:4, SEC ID NO:5, SEC
ID NO:6.
26. Composición inmunogénica de la reivindicación
22 o el péptido aislado de la reivindicación 24, en donde dicha
molécula MHC o HLA es la HLA-A2.
27. Vacuna útil en el tratamiento de un sujeto
aquejado de un estado canceroso que comprende la línea celular
aislada de la reivindicación 14 y un adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
28. Vacuna de la reivindicación 27, en donde
dicha línea celular se vuelve no proliferativa.
29. Composición de materia útil para el
tratamiento de un estado canceroso que comprende (i) un péptido
derivado de la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID
NO:1, (ii) una molécula MHC o HLA y (iii) un portador
farmacéuticamente aceptable.
30. Composición de materia útil para el
tratamiento de un estado canceroso que comprende una línea celular
no proliferativa que tiene expresado en su superficie un péptido
derivado de la secuencia de aminoácidos codificada por la SEC ID
NO:1.
31. Composición de materia de la reivindicación
30 o la vacuna de la reivindicación 28, en donde dicha línea celular
es una línea celular humana.
32. Anticuerpo aislado o un fragmento de un
anticuerpo capaz de unirse a un antígeno, siendo específico dicho
anticuerpo o fragmento para el antígeno aislado asociado al cáncer
de la reivindicación 17.
33. Anticuerpo aislado o fragmento de la
reivindicación 32, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
34. Fragmento de anticuerpo aislado de la
reivindicación 32 ó reivindicación 33 el cual es un fragmento Fab o
un fragmento F(ab')_{2}.
35. Anticuerpo aislado o fragmento de la
reivindicación 32 que está producido de manera recombinante.
36. Anticuerpo aislado de la reivindicación 35,
en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
37. Anticuerpo aislado de la reivindicación 35,
en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
38. Procedimiento de cribado para el cáncer en
una muestra tomada de un sujeto, que comprende poner en contacto
dicha muestra con una molécula de ácido nucleico aislada que hibrida
específicamente con todo o parte de la SEC ID NO: 1 y determinar la
hibridación de la SEC ID NO:1 como indicación de células
cancerígenas en dicha muestra.
39. Procedimiento de cribado para el cáncer en
una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con el
anticuerpo aislado o el fragmento de cualquiera de las
reivindicaciones 32 a 37, y determinar la unión de dicho anticuerpo
o fragmento con una diana como indicador del cáncer.
40. Procedimiento de diagnóstico de un estado
canceroso en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula
reactiva inmune que contiene una muestra tomada de dicho paciente
con una línea celular transfectada con la molécula de ácido nucleico
aislada de la reivindicación 1, y determinar la interacción de dicha
línea celular transfectada con dicha célula inmunoreactiva, siendo
indicativa dicha interacción de dicho estado canceroso.
41. Procedimiento de la reivindicación 40, en
donde dicha célula inmune reactiva que contiene una muestra
comprende sangre o suero.
42. Procedimiento para determinar la regresión,
progresión o inicio de un estado canceroso que comprende seguir una
muestra tomada de un paciente con dicho estado canceroso por (i) una
proteína codificada por la molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, (ii) un
péptido derivado de dicha proteína o (iii) células T citolíticas
específicas de dicho péptido y una molécula MHC con la cual se
compleja de manera no covalente, en donde la cantidad de dicho
parámetro es indicativa de la progresión o regresión o inicio de
dicho estado canceroso.
43. Procedimiento de la reivindicación 42, en
donde dicha muestra aislada es un fluido corporal, exudado o una
muestra de tejido.
44. Procedimiento de la reivindicación 42, que
comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo o un
fragmento de anticuerpo que se une de manera específica con dicha
proteína o péptido.
45. Procedimiento de la reivindicación 44, en
donde dicho anticuerpo o fragmento está marcado con una etiqueta
radioactiva o un enzima.
46. Procedimiento de la reivindicación 44, en
donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
47. Procedimiento de la reivindicación 44 o
reivindicación 45, en donde dicho fragmento de anticuerpo es un
fragmento Fab o un fragmento F(ab)'_{2}.
48. Procedimiento de la reivindicación 44, en
donde el anticuerpo o fragmento está producido de manera
recombinante.
49. Procedimiento de la reivindicación 48, en
donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
50. Procedimiento de la reivindicación 48, en
donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
51. Procedimiento de la reivindicación 42, que
comprende amplificar el RNA que codifica dicha proteína.
52. Procedimiento de la reivindicación 42, en
donde dicha amplificación comprende llevar a cabo la reacción de la
polimerasa en cadena.
53. Procedimiento de la reivindicación 42, que
comprende poner en contacto dicha muestra con una molécula de ácido
nucleico que híbrida de manera específica con una molécula de ácido
nucleico que codifica para o expresa dicha proteína.
54. Procedimiento de la reivindicación 42, que
comprende ensayar dicha muestra para dicha proteína.
55. Procedimiento de diagnóstico de un estado
canceroso que comprende evaluar una muestra tomada de un sujeto por
una célula inmunoreactiva específica para un péptido derivado de una
proteína codificada por un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, complejada con una molécula MHC,
siendo indicativa la presencia de dicha célula inmunoreactiva de
dicho estado canceroso.
56. Procedimiento de preparación de un
medicamento para el tratamiento de un sujeto afectado por un estado
canceroso, que comprende poner en contacto una muestra que contiene
células inmunoreactivas extraída del sujeto con una línea celular de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 16 en condiciones
que favorezcan la proliferación de dichas células
inmunoreactivas.
57. Célula transfectada con (i) una secuencia de
ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3, (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica para una
molécula MHC o HLA que presenta un péptido procedente de una
proteína codificada por dicho ácido nucleico, para utilizar en el
tratamiento de un sujeto con un estado cancerosos, en donde dicho
péptido está presentado por células asociadas con dicho estado
canceroso.
58. Utilización de la célula de la reivindicación
57 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de
dicho estado canceroso, dicha utilización comprendiendo el
tratamiento de dichas células para volverlas no proliferativas.
59. Utilización de un reactivo que consiste
esencialmente en células no proliferativas que tienen expresadas en
su superficie el complejo no covalente de la molécula MHC y el
péptido procedente de una proteína codificada por el ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación
de un medicamento destinado al tratamiento de un sujeto que padece
un estado canceroso.
60. Utilización de un anticuerpo o fragmento de
anticuerpo, uniéndose de manera específica dicho anticuerpo o
fragmento a una proteína codificada por el ácido nucleico de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o un
péptido derivado de dicha proteína, expresada en una célula
cancerosa, para la fabricación de un medicamento destinado al
tratamiento de un sujeto que padece un estado canceroso, estando
acoplado dicho anticuerpo o fragmento a un agente anticanceroso, en
una cantidad suficiente para tratar dicho estado canceroso.
61. Utilización de la reivindicación 60, en donde
dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
62. Utilización de la reivindicación 60, en donde
dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab o un fragmento
F(ab')_{2}.
63. Utilización de la reivindicación 60, en donde
dicho anticuerpo o fragmento está producido de manera
recombinante.
64. Utilización de la reivindicación 63, en donde
dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico.
65. Utilización de la reivindicación 63, en donde
dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
66. Utilización de la composición inmunogénica de
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, la vacuna de la
reivindicación 27 o la composición de materia de la reivindicación
30 en la fabricación de un medicamento destinado a la prevención del
inicio de un estado canceroso.
67. Utilización del antígeno aislado asociado al
cáncer de la reivindicación 17, que comprende toda la secuencia de
aminoácidos para la fabricación de un medicamento destinado al
tratamiento de un estado canceroso.
68. Procedimiento para determinar la eficacia de
una vacuna de acuerdo con la reivindicación 27 ó 28, o de una vacuna
que comprende la composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 19 a 23 o la composición de materia de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, después de
la administración de dicha vacuna a un sujeto, que comprende
determinar los anticuerpos en una muestra tomada de dicho sujeto que
se une a dicha vacuna o a una molécula que comprende dicha vacuna,
en donde un cambio en el nivel de dichos anticuerpos después de la
administración de dicha vacuna respecto a dicho nivel antes de la
administración es indicativo de la eficacia o carencia de la
misma.
69. Procedimiento de la reivindicación 56, la
célula de la reivindicación 57, o la utilización de acuerdo con las
reivindicaciones 59-67 en donde un sujeto con dicho
estado canceroso tiene por lo menos uno de los anticuerpos contra la
proteína codificada por la molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 1 o células T citolíticas específicas para complejos
de moléculas de HLA y un péptido derivado de dicha proteína en un
fluido corporal de dicho sujeto.
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