DE69725754T2

DE69725754T2 - Eingekapselte Antikörper-produzierende Zellen

Info

Publication number: DE69725754T2
Application number: DE69725754T
Authority: DE
Inventors: Marc Piechaczyk; Mireia Pelegrin; Mariana Marin; Robert Saller; Brian Salmons
Original assignee: Bavarian Nordic Research Institute AS; CT NAT de la RECH SCIENT MONTP; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Bavarian Nordic AS; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1996-12-23
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: ATE252374T1; EP0948319A2; WO1998027966A3; JP4727768B2; US6426088B1; JP2009013182A; SI0948319T1; EP0948319B1; JP2001507344A; DE69725754D1; DK0948319T3; WO1998027966A2; ES2208973T3; AU6205998A; PT948319E

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft verkapselte Zellen, die Antikörper produzieren, insbesondere Antikörper, die zu den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen gehören: IgM, IgD, IgGs, IgE und IgA, und die Verwendung solcher verkapselten Zellen zur in-vivo-Implantation für eine Langzeitabgabe oder verzögerte Abgabe von Antikörpern mit therapeutischem Interesse.
HINTERGRUND
Die systemische Abgabe zytostatischer oder zytotoxischer tumorspezifischer Antikörper durch genetisch modifizierte Zellen, die Patienten implantiert werden, kann für Langzeitüberwachungsbehandlungen auf Krebserkrankungen sehr wertvoll sein, um einen Rückfall nach einer Primärbehandlung zu verhindern, wie Chirurgie, Chemo- oder Radiotherapie. Ein solcher Ansatz könnte auch zur Behandlung schwerer Viruserkrankungen, wie AIDS, verwendet werden, wenn virus-neutralisierende Antikörper oder Antikörper, die für virusproduzierende Zellen toxisch sind, abgegeben werden. Überdies kann die über lange Zeit erfolgende systemische Abgabe von Antikörpern auch zu eher grundlegenden Zwecken geeignet sein, wie zur Entwicklung neuer Tiermodelle für Autoimmunerkrankungen, in denen die humorale Reaktion zur Entwicklung der Erkrankung beiträgt (N. R. Rose und C. Bona, Immunol. Today, Band 14, 426 bis 430 (1993)). Eine weitere mögliche Anwendung beinhaltet die Entwicklung einer neuen Zellablationstechnik, die zur in-vivo-Untersuchung verschiedener Differenzierungswege und/oder der biologischen Bedeutung spezifischer Zelluntergruppen brauchbar ist, indem zytotoxische Antikörper in den Blutstrom abgegeben werden, die zelltypspezifische Membranmarker erkennen. In dieser Situation würden Antikörper die Zielzellen töten, beispielsweise nach einem spezifischen Differenzierungsschritt, der dem Erscheinen verwandter Antigene an der Oberfläche der differenzierenden Zellen unmittelbar folgt.
Es ist in neuerer Zeit gezeigt worden, dass unter Verwendung von retroviralem Gen-Transfer mehrere Zelltypen (einschließlich Hautfibroblasten, myogenen Zellen, Hepatozyten und Keratinozyten), die genetischer Modifizierung und Transplantation an Patienten zugänglich sind, Antikörper produzieren können, die die Spezifizität und die Affinität des Stamm-Antikörpers beibehalten (D. Noel et al., Hum. Gene. Ther., Band 8, 1219 bis 1229 (1997)). Das Transplantieren genetisch veränderter myogener Zellen ermöglicht des Weiteren die systemische Abgabe geklonter Antikörper in der Maus über mindestens mehrere Monate. Obwohl diese Beobachtungen die Idee unterstützen, dass die genetische Veränderung der Zellen des Patienten für Langzeit-Gentherapien auf Antikörperbasis brauchbar sein können, begrenzen mehrere offene Fragen möglicherweise die klinische Anwendbarkeit einer solchen Technologie. Erstens wäre ein derartiger therapeutischer Ansatz arbeitsintensiv und zeitraubend. Zweitens verwendet die stabile genetische Modifizierung von Patientenzellen momentan ex-vivo-retrovirale Infektion, gefolgt von autologer Transplantation, um die Abstoßung der nicht MHC-angepassten (MHC = Haupthistokompatibilitätskomplex) Zellen durch das Immunsystem zu vermeiden. Dies verringert die Vielseitigkeit des Ansatzes, da genetisch veränderte Zellen von einem Individuum nicht für ein anderes verwendet werden können. Drittens beinhalten effizienter Gen-Transfer und Langzeitexpression von Transgenen in Zellen, die in Gentherapieprotokollen verwendet werden können, offene Fragen, die noch nicht ausreichend geklärt worden sind (R. G. Crystal, Science, Band 270, 404 bis 410 (1995); J. D. Harris und N. R. Lemoine, Trends Genet., Band 12, 400 bis 405 (1996); R. G. Vile et al., Mol. Biotechnol., Band 5, 139 bis 158 (1996)).
In diesem Kontext kann die Implantation genetisch veränderter Zellen, die in immunschützenden Vorrichtungen verkapselt sind, in Patienten einen vielseitigeren und kostengünstigeren Ansatz darstellen. Einerseits sollte es möglich sein, dieselbe Charge nicht-MHC-angepasster Zellen (möglicherweise in vitro auf optimale Antikörperexpression ausgewählt) für mehrere Patienten zu verwenden, und andererseits ist die Implantation von Kapseln ein sehr einfacher chirurgischer Eingriff. Zusätzlich würde eine solche Technik auch die Möglichkeit der leichten chirurgischen Entfernung Antikörper produzierender Zellen bieten, falls die Behandlung beendet werden muss.
Die Kapsel muss für optimale Funktion zwei Kriterien erfüllen. Erstens muss sie ausreichend groß sein, damit interessierende Moleküle, wie Antikörper, austreten können, und damit das Eintreten und die effiziente Diffusion von Nährstoffen möglich sind, die für das Überleben der Zelle notwendig sind. Zweitens muss sie ausreichend klein sein, damit die verkapselten Zellen die Kapseln nicht verlassen können und Immunsystemzellen des Wirts nicht eintreten können.
Die Verkapselung von Zellen in permeablen Strukturen, die die Freisetzung bestimmter biologisch aktiver Moleküle zulassen, jedoch die Zellen, die diese Moleküle produzieren, vor dem Immunsystem des Wirts schützen, hat zu einigem Erfolg geführt (siehe als Übersicht P. L. Chang in Somatic Gene Therapy, Herausgeber P. L. Chang (CRC Press, Boca Raton), Seiten 203 bis 223 (1995)). Zellen, die genetisch modifiziert worden sind, so dass sie humanes Wachstumshormon (hGH) (I. T. Tai und A. M. Sun, FASEB J., 7, 1061 bis 1069 (1993)) oder eine sekretierte Form der humanen Adenosindeaminase (Hughes et al., Hum. Gene Ther. 5, 1445 bis 1455 (1994)) produzieren, sind verkapselt worden. In beiden dieser Studien wurden Zellen in Poly-L-lysin-alginat-Mikrokapseln verkapselt, und es wurde gezeigt, dass die Zellen lange Zeiträume in Kultur überlebten. Dies war von Langzeitproduktion des Enzyms oder Hormons begleitet. Es wurde des Weiteren gezeigt, dass die Zellen nach Transplantation der Mikrokapseln in Mäuse 1 Jahr lebensfähig blieben und weiter hGH produzierten, wodurch gezeigt wird, dass die Kapseln die transfektierten Zellen vor Zerstörung durch das Immunsystem des Wirts schützten. Es wurde jedoch auch berichtet, dass Polylysin-alginat-Kapseln zu einer entzündlichen Reaktion führten (M. E. Pueyo et al., J. Biomater. Sci, Polym. Ed., Band 5, 197 bis 203 (1993); G. M. Vandenbossche et al., J. Pharm. Pharmacol., Band 45, 115 bis 120 (1993)).
Es ist auch von Zellverkapselung unter Verwendung anderer Materialien berichtet worden. Babyhamsternierenzellen, die genetisch modifiziert wurden, um Nervenwachstumsfaktor zu produzieren, wurden in Polyacrylnitril/Vinylchlorid verkapselt und in Rattenhirn implantiert. Die verkapselten Zellen überlebten mindestens 6 Monate und produzierten weiter NGF (Winn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2324 bis 2328 (1994) und Degion et al., Gene Ther., 2, 563 (1995)).
Rattenhybridomzellen, die ein gegen Murin IL-4 gerichtetes mAb sekretierten, wurden in Alginat verkapselt und intraperitoneal und subkutan in Mäuse implantiert (H. F. Savelkout et al., J. Immunol. Methods, Band 170, 185 bis 196 (1994)). Die in den Blutstrom abgegebenen Antikörperkonzentrationen sanken nach 14 Tagen infolge der Kapselalterung ab. In diesem System wurde außerdem 30 Tage nach der Implantation als Ergebnis der von den Kapseln in die Bauchhöhle freigesetzten Zellen ein 100% Auftreten von Aszitesentwicklung beobachtet.
Hepatozyten sind erfolgreich in einem Polyelektrolytkomplex aus Cellulosesulfat und Polydimethyldiallylammonium verkapselt worden (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. 21, 3443 bis 352 (1993)). Mehr als 90% der verkapselten Hepatozyten behielten ihre Lebensfähigkeit und im Unterschied zu Hepatozyten, die als Monoschichten gezüchtet wurden, zeigten die verkapselten Zellen eine erhöhte metabolische Aktivität.
Die gleichen Verkapselungsmaterialien sind auch zur Verkapselung von Antikörper produzierenden Hybridomzellen verwendet worden (Merten et al., Cytotechnology 7: 121 bis 130, 1991). Die Kapseln wurden aus einer Lösung von Natriumcellulosesulfat (1,5%) und Polydimethyldiallylammoniumchlorid (2% Lösung) hergestellt. Der Einfluss der Veränderung von Verkapselungsverfahrensparametern auf die Kapselcharakteristika, das Zellwachstum und die Produktion monoklonaler Antikörper wurde untersucht, und es wurde gezeigt, dass Verkapselung unter Verwendung von Natriumcellulosesulfat als Polyanion und Polydimethyldiallylammoniumchlorid als Polykation ein geeignetes Instrument zur Herstellung von Kapseln ist, die zur Kultivierung von Säugetierzellen mit hohen Dichten brauchbar sind.
Zusammenfassend ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass in vivo-Implantation der verkapselten Zellen, die Antikörper produzieren, zur Langzeitabgabe und/oder verzögerten Abgabe von Antikörpern zur Therapie weder beschrieben noch auch nur vorgeschlagen wird, oder dass Implantation von Kapseln zu schweren Nebenwirkungen führte, wie z. B. Entzündungsreaktionen.
ZIEL DER ERFINDUNG
Es ist somit ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kapseln zu liefern, die Antikörper produzierende Zellen enthalten, die die Freisetzung der Antikörper aus den Kapseln ermöglichen und nach Implantation keine entzündliche Reaktion in einem Wirt hervorrufen.
KURZFASSUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst damit unter anderem das Folgende, allein oder in Kombination:
Kapseln, die Antikörper produzierende Zellen zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, welche auf die von den Zellen hergestellten Antikörper ansprechen, verkapseln, wobei die Kapsel einen Kern umfasst, der die Zellen enthält, und eine poröse, den Kern umgebende Kapselwand, die für die von den Zellen hergestellten Antikörper durchlässig ist, und worin die Kapsel von einem Sulfatgruppen enthaltenden Polysaccharid oder einem Polysaccharidderivat oder einem Sulfonatgruppen enthaltenden synthetischen Polymer und einem Polykation gebildet ist;
Kapseln wie oben, worin das Sulfatgruppen enthaltende Polysaccharid oder Polysaccharidderivat aus der Gruppe umfassend Cellulosesulfat, Celluloseacetatsulfat, Carboxymethylcellulosesulfat, Dextransulfat oder Stärkesulfat ausgewählt ist;
Kapseln wie oben, worin das Sulfonatgruppen enthaltende synthetische Polymer ein Polystyrolsulfonatsalz ist;
Kapseln wie oben, worin das Polykation ein Polymer mit quaternären Ammoniumgruppen ist;
Kapseln wie oben, worin das Polymer mit quaternären Ammoniumgruppen aus Polydimethyldiallylammonium oder Polyvinylbenzyltrimethylammonium ausgewählt ist;
Kapseln wie oben, worin das Sulfatgruppen enthaltende Polysaccharid Cellulosesulfat ist und das Polykation Polydimethyldiallylammonium ist;
Kapseln wie oben, worin die Antikörper produzierenden Zellen genetisch modifiziert wurden, um geklonte Antikörper herzustellen;
Kapseln wie oben, worin die Antikörper den Immunglobulinklassen IgA, IgM, IgG, IgD oder IgE angehören;
Kapseln wie oben, worin die Antikörper ausgewählt sind aus Antikörpern, die an einen viralen Oberflächenmarker, eine Krebszelle, einen T- oder B-Lymphozyten, der an der pathologischen Wirkung einer Autoimmunerkrankung beteiligt ist, an einen Oberflächenmarker eines Parasiten oder an ein schädliches, zirkulierendes Antigen binden;
Kapseln wie oben, worin der Antikörper neutralisierende Wirkung hat;
Kapseln wie oben zur Implantation in einen Tierkörper einschließlich eines Menschen;
Kapseln wie oben für die intraperitoneale oder subkutane Implantation;
Verwendung der Kapseln wie oben zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung;
pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Kapseln wie oben.
DIE ERFINDUNG
Erfindungsgemäß werden Kapseln geliefert, die Antikörper produzierende Zellen enthalten, die Freisetzung der Antikörper aus den Kapseln ermöglichen und keine entzündliche Reaktion nach Implantation in einen Wirt hervorrufen.
Die erfindungsgemäßen verkapselten Zellen können durch Suspendieren der Antikörper produzierenden Zellen in einer wässrigen Lösung eines Polyelektrolyten (z. B. ausgewählt aus den Sulfatgruppe enthaltenden Polysacchariden oder Polysaccharidderivaten oder von Sulfonatgruppe enthaltenden synthetischen Polymeren) hergestellt werden, wonach die Lösung in Form vorgebildeter Partikel in ein Ausfällungsbad eingebracht wird, das eine wässrige Lösung eines entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten enthält (beispielsweise ein Polymer mit quaternären Ammoniumgruppen).
Sulfatgruppen enthaltende Polysaccharide oder Polysaccharidderivate schließen Cellulosesulfat, Celluloseacetatsulfat, Carboxymethylcellulosesulfat, Dextransulfat oder Stärkesulfat in Form eines Salzes, insbesondere eines Natriumsalzes ein. Das Sulfonatgruppen enthaltende synthetische Polymer kann ein Polystyrolsulfonatsalz sein, vorzugsweise ein Natriumsalz.
Polymere mit quaternären Ammoniumgruppen schließen Polydimethyldiallylamonium oder Polyvinylbenzyltrimethylammonium in Form eines Salzes davon ein, vorzugsweise eines Chloridsalzes.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Antikörper produzierenden Zellen in einem Komplex verkapselt, der aus einem aus Cellulosesulfat und Polydimethyldiallylammonium gebildeten Komplex besteht.
Verfahren zur Herstellung der Cellulosesulfatkapseln, die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Kapseln verwendet werden, sind genau in DE-A1-40 21 050 beschrieben. Die Synthese des Cellulosesulfats ist in dieser Patentanmeldung auch beschrieben worden. Verfahren zur umfassenden Charakterisierung von Cellulosesulfatkapseln sind ausführlich von H. Dautzenberg et al., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., Band 21, 399 bis 405 (1993) behandelt worden. Cellulosesulfatkapseln und ihre Herstellung sind auch in GB 2 135 954 beschrieben worden. Die Eigenschaften der Cellulosekapseln, d. h. die Größe, die Porengröße, Wanddicke und mechanischen Eigenschaften, hängen von mehreren Faktoren ab, wie beispielsweise den physikalischen Bedingungen, unter denen die Kapseln hergestellt wurden, der Viskosität des Ausfällungsbades, dessen Ionenstärke, Temperatur, Schnelligkeit der Zugabe der Zell/Cellulosesulfat-Suspension, Konstitution des Cellulosesulfats sowie anderen Parametern, die von der Dautzenberg-Gruppe beschrieben wurden.
Die erfindungsgemäßen Kapseln können hergestellt werden, indem die Antikörper produzierenden Zellen in einer Lösung suspendiert werden, die 0,5 bis 50%, vorzugsweise 0,5 bis 5% Natriumcellulosesulfat und 5% fetales Kalbserum in wässriger Lösung enthält, vorzugsweise in einem Puffer. Diese Suspension wird. dann durch ein Abgabesystem (z. B. Luftstrahlsystem oder piezoelektrisches System) in ein Ausfällungsbad getropft, das eine gerührte Lösung von 0,5% bis 50%, vorzugsweise 0,5 bis 10% Polydimethyldiallylammoniumchlorid in einer wässrigen Lösung enthält, vorzugsweise einem Puffer. Die Kapselbildung findet innerhalb von Millisekunden statt, und die Zellen enthaltenden Kapseln werden 30 Sekunden bis 5 Minuten in dem Ausfällungsbad gehalten und dann gewaschen. Die Schnelligkeit dieses Verfahrens gewährleistet, dass die Zellen während des gesamten Verfahrens nicht unnötig belastet werden (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech, 21, 345 bis 352 (1993)).
Die erfindungsgemäßen Kapseln haben einen variablen Durchmesser zwischen 0,01 und 5 mm, liegen vorzugsweise jedoch zwischen 0,1 und 3 mm. Demzufolge können Kapseln so gefertigt werden, dass sie eine variable Anzahl von Zellen enthalten. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verkapselungsverfahrens können bis zu 10¹⁰ vorzugsweise jedoch 10³ bis 10⁷ Zellen, die Antikörper produzieren, in dem Polyelektrolytkomplex verkapselt werden.
Aus Cellulosesulfat und Polydimethyldiallylammonium zusammengesetzte Kapseln haben hervorragende mechanische Eigenschaften und können mit konsistentem Durchmesser und konsistenter Porengröße gefertigt werden.
Die verkapselten Zellen können in einem normalen Zellkulturmedium (dessen Art von den verkapselten Zellen abhängt) unter Standardbedingungen der Feuchtigkeit, Temperatur und CO₂-Konzentration kultiviert werden. Während dieser Kulturperiode kann die Produktion von Antikörpern aus den Kapseln in das Zellkulturmedium mit Western Blot- oder Elisa-Technik unter Verwendung spezifischer Antigene gezeigt werden und dann zudem unter Verwendung von zweiten Antikörpern quantifiziert werden, die mit fluorogenen Farbstoffen konjugiert sind.
Nach einer geeigneten Kulturperiode (normalerweise nicht weniger als eine Stunde und nicht mehr als 30 Tage) können die Zellen enthaltenden Kapseln entweder direkt oder durch Injektion unter Verwendung einer Spritze in verschiedene Bereiche des Körpers implantiert werden.
Die durch die erfindungsgemäßen verkapselten Zellen produzierten Antikörper können auf jeder Immunglobulinklasse basieren, die für die Therapie nützlich ist, einschließlich genetisch modifizierter Antikörper, aber nicht auf diese begrenzt.
Die erfindungsgemäßen verkapselten Zellen können Zellen sein, die von Patienten entnommen wurden, oder können aus jeder beliebigen anderen Quelle einschließlich menschlichen und tierischen Zellen stammen, die zur Herstellung geklonter Antikörper genetisch modifiziert wurden.
Die verkapselten Zellen beziehungsweise Kapseln werden insbesondere zur Implantation in einen lebenden Tierkörper, einschließlich den eines Menschen, zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen verwendet, welche auf die von den Kapseln abgegebenen Antikörpern ansprechen. Nach intraperitonealer und subkutaner Implantation von Kapseln in einen Tierkörper ist gefunden worden, dass die Kapseln, insbesondere Cellulosesulfatkapseln, einen offensichtlichen Vorteil in Bezug auf mechanische Beständigkeit gegenüber beispielsweise Alginatkapseln bieten, da gefunden wurde, dass sie unabhängig davon, ob sie subkutan oder intraperitoneal implantiert werden, bis zu 10 Monate nach der Implantation intakt blieben.
Es ist des Weiteren beobachtet worden, dass subkutane und intraperitoneale Implantationen von zellhaltigen Cellulosesulfatkapseln in Bezug auf mindestens zwei Punkte zu Unterschieden führte. Erstens war in der ersteren Situation die Menge der Antikörper, die an den Blutstrom abgegeben wurde, deutlich höher. Eine sehr wahrscheinliche Erklärung für diesen Unterschied liegt in der Tatsache, das Kapseln rasch vaskularisiert werden, wenn sie subkutan implantiert werden, und gar nicht vaskularisiert werden, wenn sie intraperitoneal implantiert werden. Die günstige Auswirkung der Vaskularisierung ist möglicherweise eine doppelte, wobei erstens die Antikörperaufnahme durch das Blut erleichtert wird und zweitens eine bessere Zufuhr von Nährstoffen gewährleistet ist, die das Überleben der Zelle begünstigt, da reproduzierbar beobachtet wurde, dass die Lebensfähigkeit von Zellen in intraperitoneal implantierten Kapseln niedriger war. Zusätzlich zu der ausgedehnten Vaskularisierung, die im Verlauf der nächsten 10 Monate in der Nachsorge keine erhebliche Änderung zeigte, würde die Clusterbildung der Zellen in einer Verbindungstasche nach der subkutanen Implantation die Entfernung der Kapseln durch eine einfache einstufige chirurgische Ablation des gesamten Neorgans ermöglichen, falls dies erforderlich sein sollte. Es sollte zudem betont werden, dass die Entwicklung der isolierenden Fibrose um implantierte Cellulosesulfatkapseln herum nicht systematisch ist. Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu dem, was im Fall der Alginat-Poly(L)-alginat-Mikrokapseln berichtet worden ist, wobei wahrscheinlich infolge der potenten Makrophagenaktivierung durch das verkapselnde Polymer eine Wirtreaktion mit Fibrose um die Mikrokapsel herum entwickelt wurde (M. E. Pueyo et al., J. Biomater. Sci. Polym. Ed., Band 5, 197 bis 203 (1993)).
Antiidiotypische Reaktionen werden oft bei Patienten beobachtet, die wiederholt mit hohen Dosen gereinigter monoklonaler Antikörper behandelt wurden, und kann mitunter die Wirkungen der Behandlung neutralisieren (J. D. Isaacs, Semin. Imunol., Band 2, 449 bis 456 (1990)). Zudem ist gezeigt worden, dass der Verabreichungsmodus der Antikörper ein entscheidender Parameter hinsichtlich der Auslösung der antiidiotypischen Reaktionen ist. Es ist beispielsweise berichtet worden, dass subkutane und intradermale Injektionen viel stärker immunogen als intravenöse Injektionen sind (L. G. Durrant et al., Cancer Immunol. Immunother., Band 28, 37 bis 42 (1989)). Es sollte daher betont werden, dass in Tierkörpern, denen cellulosesulfat-verkapselte Zellen implantiert wurden, die die Antikörper freisetzen, keine Entwicklung einer nachweisbaren antiidiotypischen Reaktion gegen monoklonale Antikörper beobachtet wurde.
Zusammengefasst zeigen die oben wiedergegebenen Daten eindeutig, dass die Implantation von verkapselten Zellen, die Antikörper freisetzen, für Langzeit-Gen/Zell-Therapieansätze auf Antikörperbasis geeignet ist, insbesondere gegen Krebserkrankungen und virale Erkrankungen.
Die verkapselten, Antikörper produzierenden Zellen werden in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung therapeutisch verwendet, wenn eine verzögerte Freisetzung von Antikörpern in einer Langzeitbehandlung erforderlich ist.
Solche Situationen sind beispielsweise Erkrankungen, die durch eine chronische Virusinfektion hervorgerufen werden, wie HIV, Hepatitis B, Herpex simplex und Herpes genitalis.
Bestimmte virale Infektionen führen zur Exposition spezifischer Marker oder Antigene an der Zelloberfläche. Solche Oberflächenmarker können selektiv durch spezifische Antikörper erkannt werden, die moduliert werden können, damit sie für die virusinfizierten Zellen toxisch sind. Verkapselte Zellen, die derartige Antikörper produzieren, können zur Langzeitbehandlung viraler Infektionen angewandt werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden verkapselte Zellen bereitgestellt, die neutralisierende Antikörper produzieren, die Marker oder virale Rezeptoren an der Zelloberfläche erkennen und sich an diese binden, wobei sie die Viren in den Anfangsphasen der viralen Reaktion beeinflussen, was für eine direkte oder indirekte neutralisierende Wirkung auf die virale Infektion sorgt.
Neutralisierende Wirkungen können in diesem Fall auf einem direkten Blockieren der Bindung und/oder des Eintretens des Virus in die Zelle basieren, und können somit weitere Infektion einer beliebigen Zielzelle verhindern, oder können indirekt über Lyse durch das patienteneigene Komplementsystem wirken, oder indem das Virus durch Antikörper Zellen des Immunsystems, wie Monozyten oder Makrophagen, kenntlich gemacht wird.
In einer speziellen Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen verkapselten Zellen zur Behandlung von Tumoren.
In jeder Situation, in der ein spezifischer Zelltyp oder eine spezifische Zelluntergruppe, die zur Selbsterneuerung in der Lage ist, sich als toxisch oder lebensbedrohlich für Menschen erweist, können zellspezifische toxische Antikörper, die normal oder genetisch zur Verbesserung ihrer Toxizität modifiziert worden sind, die durch verkapselte Zellen zur selektiven Zerstörung der Zellen produziert werden, zur Eliminierung der Tumorzellen verwendet werden.
Eine andere Anwendung der erfindungsgemäßen Kapseln liegt in der Behandlung schwerer Autoimmunerkrankungen, wie der multiplen Sklerose und rheumatischer Arthritis, wobei spezifische T- und B-Zellen, die für die pathologische Wirkung verantwortlich sind, in Langzeitbehandlungen durch zellspezifische toxische Antikörper, die durch verkapselte Zellen produziert werden, konstant eliminiert werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden verkapselte Zellen bereitgestellt, die Antikörper gegen Oberflächenmarker von Parasiten, wie Plasmodium falciparum, P. vivax oder P. malariae, produzieren.
Malaria ist neben TBC und HepB eine der drei Krankheiten, die die meisten Todesfälle pro Jahr verursachen. Die Verwendung von Antikörpern gegen Plasmodium, wodurch die Parasiten markiert werden und dadurch Zellen des Immunsystems anziehen, um die Parasiten zu zerstören, könnte als nicht-toxische, nicht-schädliche Prophylaxe für Reisende in Länder mit einem hohen Malariainfektionsrisiko verwendet werden.
Die verkapselten, Antikörper freisetzenden Zellen können auch zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, die eine therapeutisch wirksame Menge der Zellen zusammen mit mindestens einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel enthält.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sollen jedoch nicht als einschränkend angesehen werden:
Beispiel
Zellen und Zellkulturbedingungen
Die Hybridomzelllinie Tg 10, hergestellt durch Verschmelzung von Myelomzellen der Maus (P3-X63-Ag 8.653) mit Milzzellen von Mäusen, die mit hTg immunisiert waren (M. Piechaczyk, T. Chardes, M. C. Cot, B. Pau und J. M. Bastide, Hybridoma, Band 4, Nr. 4, 361 bis 367, (1985)), wurde zur Verkapselung verwendet. Tg 10-Zellen produzieren einen monoklonalen Antikörper (mAb), der auch als Tg 10 bezeichnet wird, gegen humanes Thyroglobulin. Die Zellen wurden in RPMI 1640 (Gibco/BRL) mit Zusatz von 10% FCS in Anwesenheit von 100 u. (= Einheiten)/ml Streptomycin, 100 μ/ml Penicillin und 2 mM L-Glutamin gezüchtet. Tg10-Zellen, die in der Cellulosesulfatmatrix (CSM) verkapselt waren, wurden unter den gleichen Bedingungen wie freie Zellen kultiviert.
Reinigung der Antikörper und F(ab)'2-Fragmente Tg 10 mAb wurde aus dem Überstand der Tg10-Zellkultur durch Affinitätschromatographie gereinigt (L. G. Durrant et al., Cancer Immunol. Immunother., Band 28, 37 bis 41 (1989)). Antiidiotypischer Antikörper des Kaninchens gegen das T10 mAb wurde wie beschrieben produziert (M. Del Rio et al., Immunol. Invest., Band 24, 655 bis 667 (1995)). Tg10 F(ab)'2-Fragment wurde elektrophoretisch nach Spaltung von Tg10 mAb durch Pepsin hergestellt, und die Reinheit der Ansätze wurde durch SDS-PAGE-Analyse kontrolliert (M. Del Rio et al., Immunol. Invest., Band 24, 655 bis 667 (1995)).
Zellverkapselung
10⁷ Zellen wurden in 1 ml gepufferter Salzlösung suspendiert, die 3,8% Natriumcellulosesulfat und 5% fetales Kalbserum enthielt. Die Suspension wurde mit einem Abgabesystem (Luftstrahlsystem) in ein Ausfällungsbad getropft, das 2,5% Polydimethyldiallylammonium (PDDMDAAC) in gepufferter Salzlösung enthielt. Die Kapselbildung erfolgte innerhalb von Millisekunden, gefolgt von weiterer Bildung einer inneren, poröseren Schicht für mechanischen Halt, die im Wesentlichen aus Cellulusesulfat bestand. Die Zellen enthaltenen Kapseln wurden 30 Sekunden bis 5 Minuten in dem Ausfällungsbad gehalten und dann in DMEM gewaschen (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech. 21, 3443 bis 352 (1993)).
Für biologische Untersuchungen wurden Chargen verwendet, die mit unterschiedlichen Parametern erhalten worden waren, d. h. Konzentration von Natriumcellulosesulfat, Strömung des Luftstrahlsystems und Zeit im Ausfällungsbad. Repräsentative Beispiele für Bedingungen sind beispielsweise: 2,5% Natriumcellulosesulfat, 2% Polydimethyldiallylammonium und 1 Minute im Ausfällungsbad, oder 1,5% Natriumcellulosesulfat, 2% Polydimethyldiallylammonium und 0,5 Minute im Ausfällungsbad, oder 3% Natriumcellulosesulfat, 3% Polydimethyldiallylammonium und 2 Minuten im Ausfällungsbad. Die genauen Parameter können so gewählt werden, dass auch die genaue gewünschte Größe der Kapseln, die Dicke der Kapselwand sowie andere Eigenschaften berücksichtigt werden können.
Implantation der Kapseln
Vier bis sechs Wochen alte O3H-Mäuse (IFFA-CREDO) wurden unter Verwendung von 0,01 ml einer Lösung, die 0,1% Xylazin (Rompun, Bayer) und 10 mg/ml Ketamin (Imalgene, Rhone Merieux) enthielt, pro Gramm Körpergewicht anästhesiert. Die Kapseln wurden vor der Implantation in phosphatgepufferter Salzlösung (0,15 M NaCl, 0,01 M Na-phosphat, pH 7) gewaschen. Sechs oder zwanzig CDM-Tg10-Kapseln wurden entweder intraperitoneal oder subkutan (Abdominalbereich) in Mäuse implantiert. Im letzteren Fall wurden sie an einer oder drei Stellen in Clustern von sechs oder sieben Kapseln pro Stelle implantiert.
Immunisierung der Mäuse
Zur Erzeugung von antiidiotypischen Tg10-Antikörpern wurden sechs Wochen alten, weiblichen B6D2F1 (IFFA CREDO) gereinigtes Tg10 mAb, emulgiert in einem 1 : 1-Volumenverhältnis von komplettem Freund'schen Adjuvans (Sigma), intradermal an mehreren Stellen unter Verwendung von 20 μg pro Maus injiziert. Zwei Booster-Injektionen von 20 μg gereinigtem Tg10 mAb (10 μg intraperitoneal und 10 μg intramuskulär) in inkomplettem Freund'schen Adjuvans (Sigma) wurden drei beziehungsweise vier Wochen nach der ersten Immunisierung gegeben. Den Mäusen wurden vor jeder Immunisierung und eine Wochen nach der letzten Immunisierung Blut abgenommen. Nach dem Gerinnen wurden die Blutproben 15 Minuten mit 6000 UpM zentrifugiert, und aliquote Mengen Serum wurden bis zum Gebrauch bei –20°C gelagert. Jede Serumprobe wurde auf Anwesenheit von antiidiotypischem Antikörper gegen Tg10 wie nachfolgend beschrieben bewertet.
Immunoassay von Tg10-Antikörpern. Analyse der antiidiotypischen Immunreaktion
Tg10-Antikörper in Überständen aus Zellkulturen und in Mausseren wurden mittels ELISA unter Verwendung von humanem Thyroglobulin (hTg) (UCB-Bioproducts) zur Beschichtung von Mikrotiterplatten (Maxisorb, Nunc) wie beschrieben (M. Piechaczyk et al., Hybridoma, Band 4, 361 bis 367 (1985); D. Noel et al., J. Immunol. Meth., Band 193, 177 bis 187 (1996)) geprüft, und die Extinktion bei 450 nm wurde unter Verwendung des automatisierten MR5000 Plattenablesers von Dynatech gemessen. Protein A sepharosegereinigtes Tg10 mAb wurde als Standard für die Konzentrationsbestimmung verwendet. Antiidiotypische Antikörper gegen das Tg10mAb wurden mittels ELISA unter Verwendung von Tg10F(ab)'2 für die Beschichtung der Mikrotiterplatten geprüft (M. Del Rio et al., Immunol. Invest., Band 24, 655 bis 677 (1995)). Ein antiidiotypisches Antiserum vom Kaninchen (M. Del Rio et al., Immunol. Invest., Band 24, 655 bis 667 (1995)) gegen das Tg10mAb wurde als positive Kontrolle in die Experimente eingeschlossen.
In vitro Antikörperproduktion durch Tg10-Zellen, verkapselt in Cellulosesulfat (CS)
Zuerst wurde bestimmt, ob das Verkapselungsverfahren und die CS-Matrix für Tg10-Hybridomzellen toxisch sein könnten oder die Antikörperproduktion beeinflussen könnten. Verkapselte Zellen, die unter Zellkulturbedingungen gehalten wurden, wurden zu unterschiedlichen Zeiten nach der Verkapselung nach Zerbrechen der Kapseln gezählt. Die Lebensfähigkeit der Zelle wurde unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens kontrolliert. Parallel wurde die Tg10mAb-Produktion mittels ELISA geprüft. Das Kulturmedium wurde alle 24 Stunden ersetzt.
Die Hauptbeobachtungen waren die folgenden:

(i) jede Kapsel, deren Durchmesser von 0,5 bis 2 mm mit einem Mittelwert von 1 mm variierte, enthielt durchschnittlich 2 × 10⁴ Tg10-Zellen im Moment der Verkapselung,
(ii) die Lebensfähigkeit der verkapselten Zellen 4 Tage nach der Verkapselung wurde auf mindestens 80% geschätzt,
(iii) Produktion des Tg10mAb war über einen Zeitraum von 50 Tagen nachweisbar,
(iv) ein Anfangsanstieg der Antikörperproduktion, der 10 Tage anhielt, wurde beobachtet und mit der begrenzten Proliferation von Tg10-Zellen in den Kapseln korreliert (die aufgrund von Raumbeschränkungen eine oder zwei Zellteilungen nicht überschreiten können),
(v) ein deutlicher Abfall der Antikörperproduktion, der mit dem Einsetzen des Zelltods korrelierte, begann zwischen Tag 10 und Tag 20.

Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass das Verkapselungsverfahren als solches für Tg10-Zellen nicht toxisch ist. Das Überleben der Zellen in der CS-Matrix schien eher begünstigt zu sein, da parallel unter Standardkulturbedingungen, jedoch ohne Passage kultivierte Tg10-Zellen innerhalb von 1 bis 2 Wochen starben.
In vivo-Abgabe von Tg10mAb nach Implantation von Tg10-Zellen enthaltenden CS-Kapseln in Mäuse
Als nächstes befasste man sich damit, ob die systemische Abgabe des Tg10 mAb nach Implantation der Kapseln in Mäuse erreicht werden konnte. Sowohl subkutane (Abdominalbereich) als auch intraperitoneale Implantationen wurden untersucht, um zu ermitteln, welche Stelle eine bessere Abgabe von Antikörpern in den Blutstrom ermöglichen würde. Drei C3H-Mäusen wurden intraperitoneal sechs Kapseln implantiert, und einer Maus wurden 20 Kapseln implantiert. In ähnlicher Weise wurden drei Mäusen subkutan sechs Kapseln implantiert, und drei Mäusen wurden 20 Kapseln implantiert. Die Tg10-Antikörperkonzentration im Blutstrom wurde nachfolgend mittels ELISA überwacht.
Es konnte beobachtet werden, dass die Antikörperproduktion

(i) direkt mit der Zahl der implantierten Kapseln korrelierte,
(ii) zwischen der zweiten und dritten Woche nach der Implantation einen Peak erreichte,
(iii) reproduzierbar höher war, wenn die Kapseln subkutan implantiert wurden, da ein Wert bis zu 12,5 μg/ml erreicht werden konnte, verglichen mit 2,5 μg/ml im Fall der intraperitonealen Implantation,
(iv) bis zu 4 Monate lang nachgewiesen werden konnte, obwohl die Tg10-Antikörperkonzentration im Blut progressiv auf nur einige Zehn ng/ml absank.

Schließlich schien die Abnahme der Antikörperproduktion mit dem progressiven Tod der verkapselten Zellen verknüpft zu sein. Die Lebensfähigkeit der verkapselten Zellen in Kapseln, die Mäusen 2 Monate nach der subkutanen Implantation entfernt worden waren, wurde auf 20 bis 30% geschätzt, ein Wert, der mit der Verringerung der Antikörperkonzentration korrelierte.
Nachsorge der Vaskularisation der Kapseln
Intraperitoneal und subkutan implantierte Kapseln verhielten sich in Hinsicht auf ihre Vaskularisation unterschiedlich. 2 Monate nach der Implantation schienen subkutan implantierte Kapseln in eine vaskularisierte Tasche gehüllt zu sein, die aus schlaffem Bindegewebe bestand. Die Bildung dieser Neorgane fand unabhängig davon statt, ob die Kapseln Hybridomzellen enthielten oder nicht. Wenn Kapseln Intraperitoneal implantiert wurden, bildeten sie im Unterschied dazu keine Cluster, sondern blieben mobil, und es wurde keine Vaskularisation beobachtet.
Als nächstes wurde der Beginn der Vaskularisation untersucht, und es wurde untersucht, ob die Behandlung der Kapseln mit angiogenen Faktoren die Vaskularisation von subkutan implantierten Kapseln beschleunigen und/oder verbessern konnte. Mit bFGF, einem Wachstumsfaktor, der seit langem durch seine angiogene Aktivität bekannt ist (R. Montasano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 83, 7297 bis 7301 (1986), J. A. Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 86, 7928 bis 7932 (1989)), behandelte Kapseln und/oder Rattenkollagen Typ I (Sigma) wie oben beschrieben wurden implantiert und in Bezug auf ihre Vaskularisation nachuntersucht. Es fand sich kein offensichtlicher Unterschied zwischen den verschiedenen untersuchten experimentellen Bedingungen. Drei Tage nach der Implantation waren sich um die Kapseln entwickelnde Blutgefäße leicht zu sehen, und die vollständige Vaskularisation war nach 2 bis 3 Wochen erreicht, wobei sich ein Netz von Blutgefäßen sowohl um das Neorgan herum als auch innerhalb von diesem befand, das mindestens 10 Monate stabil blieb.
Auf Höhe der implantierten, Tg10-Zellen enthaltenden CS-Kapseln entwickelte sich keine nachweisbare entzündliche Reaktion
Die Entwicklung möglicher entzündlicher Reaktionen, die durch implantierte Kapseln ausgelöst werden, wurde an Mäusen untersucht. Es wurde in der Nähe der Kapseln nach intraperitonealer oder subkutaner Implantation keine makroskopisch nachweisbare sofortige oder verzögerte entzündliche Reaktion beobachtet. Es fiel auch das Fehlen der Veränderung der Vaskularisation der Kapseln sogar 10 Monate nach der subkutanen Implantation auf.
Es war keine antiidiotypische humorale Reaktion gegen den von den verkapselten Zellen freigesetzten Tg10-Antikörper nachweisbar
Die Möglichkeit der Entwicklung einer humoralen Reaktion gegen den Tg10-Antikörper in Mäusen, denen verkapselte Hybridomzellen implantiert wurden, wurde ebenfalls untersucht. Ein zuvor charakterisiertes Kaninchenserum, das Anti-Tg10-Antikörper enthielt (M. Del Rio et al., Immunol. Invest, Band 24, 655 bis 667 (1995)), wurde als positive Kontrolle für diese Experimente verwendet. Zusätzlich wurde eine Reihe von Mäusen mit dem gereinigten monoklonalen Antikörper in Anwesenheit von Freund'schem Adjuvans wie oben beschrieben immunisiert. Sechs von dreizehn Mäusen entwickelten eine eindeutige antiidiotypische Reaktion, wodurch gezeigt wird, dass Mäuse nicht von sich aus resistent gegen die Herbeiführung einer derartigen Reaktion sind. Im Unterschied dazu wurde keine antiidiotypische Reaktion in irgendwelchen der Mäuse nachgewiesen, denen Kapseln implantiert worden waren, unabhängig von der Blutkonzentration des Antikörpers und der Implantationsstelle. Diese Daten zeigen, dass die Cellulosesulfatmatrix keine offensichtliche Adjuvanswirkung zeigt, die die Herbeiführung einer neutralisierenden humoralen Reaktion gegen den Tg10-Antikörper begünstigen würde.
Zusammengefasst ist gezeigt worden, dass Hybridomzellen enthaltende Cellulosesulfatkapseln zur Abgabe monoklonaler Antikörper in den Blutstrom immunkompetenter Mäuse für mindestens mehrere Monate verwendet werden können, wenn sie subkutan oder in die Bauchhöhle implantiert werden. Die zuvor wiedergegebenen Daten zeigen, dass die Implantation von Antikörper produzierende Zellen enthaltenden Kapseln in Patienten potentiell die systemische Langzeitabgabe von Antikörpern ermöglichen kann und somit zur Entwicklung von Monitoringbehandlungen von Krebserkrankungen und schweren viralen Erkrankungen nützlich sein kann. Zudem ist die Verkapselung von Antikörper produzierenden Zellen in Cellulosesulfat in Gen/Zell-Therapieansätzen auf Antikörperbasis brauchbar.

Claims

Kapsel, die Antikörper produzierende Zellen zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, welche auf die von den Zellen hergestellten Antikörper ansprechen, verkapselt, wobei die Kapsel einen Kern umfasst, der die Zellen enthält, und eine poröse, den Kern umgebende Kapselwand, die für die von den Zellen hergestellten Antikörper durchlässig ist, und worin die Kapsel von einem Sulfatgruppen enthaltenden Polysaccharid oder einem Polysaccharidderivat oder einem Sulfonatgruppen enthaltenden synthetischen Polymer und einem Polykation gebildet ist.
Kapsel nach Anspruch 1, worin das Sulfatgruppen enthaltende Polysaccharid oder Polysaccharidderivat aus der Gruppe umfassend Cellulosesulfat, Celluloseacetatsulfat, Carboxymethylcellulosesulfat, Dextransulfat oder Stärkesulfat ausgewählt ist.
Kapsel nach Anspruch 1, worin das Sulfonatgruppen enthaltende synthetische Polymer ein Polystyrolsulfonatsalz ist.
Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 3, worin das Polykation ein Polymer mit quaternären Ammoniumgruppen ist.
Kapsel nach Anspruch 4, worin das Polymer mit quaternären Ammoniumgruppen aus Polydimethyldiallylammonium oder Polyvenylbenzyltrimethylammonium ausgewählt ist.
Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 2 und 4 bis 5, worin das Sulfatgruppen enthaltende Polysaccharid Cellulosesulfat ist und das Polykation Polydimethyldiallylammonium ist.
Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 6, worin die Antikörper produzierenden Zellen genetisch modifiziert wurden, um geklonte Antikörper herzustellen.
Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 7, worin die Antikörper den Immunglobulinklassen IgA, IgM, IgG, IgD oder IgE angehören.
Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 8, worin die Antikörper ausgewählt sind aus Antikörpern, die an einen viralen Oberflächenmarker, eine Krebszelle, einen T- oder B-Lymphozyten, der an der pathologischen Wirkung einer Autoimmunerkrankung beteiligt ist, an einen Oberflächenmarker eines Parasiten oder an ein schädliches, zirkulierendes Antigen binden.
Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9, worin der Antikörper neutralisierende Wirkung hat.
Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 10 zur Implantation in einen Tierkörper, einschließlich eines Menschen.
Kapsel nach Anspruch 11 für die intraperitoneale oder subkutane Implantation.
Verwendung der Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 12 zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Kapsel nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 12.