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Die vorliegende Erfindung betrifft
verkapselte Zellen, die Antikörper
produzieren, insbesondere Antikörper,
die zu den verschiedenen Klassen von Immunglobulinen gehören: IgM,
IgD, IgGs, IgE und IgA, und die Verwendung solcher verkapselten
Zellen zur in-vivo-Implantation
für eine
Langzeitabgabe oder verzögerte
Abgabe von Antikörpern
mit therapeutischem Interesse.
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HINTERGRUND
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Die systemische Abgabe zytostatischer
oder zytotoxischer tumorspezifischer Antikörper durch genetisch modifizierte
Zellen, die Patienten implantiert werden, kann für Langzeitüberwachungsbehandlungen auf
Krebserkrankungen sehr wertvoll sein, um einen Rückfall nach einer Primärbehandlung
zu verhindern, wie Chirurgie, Chemo- oder Radiotherapie. Ein solcher
Ansatz könnte
auch zur Behandlung schwerer Viruserkrankungen, wie AIDS, verwendet
werden, wenn virus-neutralisierende Antikörper oder Antikörper, die
für virusproduzierende
Zellen toxisch sind, abgegeben werden. Überdies kann die über lange Zeit
erfolgende systemische Abgabe von Antikörpern auch zu eher grundlegenden
Zwecken geeignet sein, wie zur Entwicklung neuer Tiermodelle für Autoimmunerkrankungen,
in denen die humorale Reaktion zur Entwicklung der Erkrankung beiträgt (N. R.
Rose und C. Bona, Immunol. Today, Band 14, 426 bis 430 (1993)).
Eine weitere mögliche
Anwendung beinhaltet die Entwicklung einer neuen Zellablationstechnik, die
zur in-vivo-Untersuchung verschiedener Differenzierungswege und/oder
der biologischen Bedeutung spezifischer Zelluntergruppen brauchbar
ist, indem zytotoxische Antikörper
in den Blutstrom abgegeben werden, die zelltypspezifische Membranmarker
erkennen. In dieser Situation würden
Antikörper
die Zielzellen töten,
beispielsweise nach einem spezifischen Differenzierungsschritt,
der dem Erscheinen verwandter Antigene an der Oberfläche der
differenzierenden Zellen unmittelbar folgt.
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Es ist in neuerer Zeit gezeigt worden,
dass unter Verwendung von retroviralem Gen-Transfer mehrere Zelltypen
(einschließlich
Hautfibroblasten, myogenen Zellen, Hepatozyten und Keratinozyten), die
genetischer Modifizierung und Transplantation an Patienten zugänglich sind,
Antikörper
produzieren können,
die die Spezifizität
und die Affinität
des Stamm-Antikörpers
beibehalten (D. Noel et al., Hum. Gene. Ther., Band 8, 1219 bis
1229 (1997)). Das Transplantieren genetisch veränderter myogener Zellen ermöglicht des
Weiteren die systemische Abgabe geklonter Antikörper in der Maus über mindestens
mehrere Monate. Obwohl diese Beobachtungen die Idee unterstützen, dass
die genetische Veränderung
der Zellen des Patienten für
Langzeit-Gentherapien auf Antikörperbasis
brauchbar sein können,
begrenzen mehrere offene Fragen möglicherweise die klinische
Anwendbarkeit einer solchen Technologie. Erstens wäre ein derartiger
therapeutischer Ansatz arbeitsintensiv und zeitraubend. Zweitens
verwendet die stabile genetische Modifizierung von Patientenzellen
momentan ex-vivo-retrovirale Infektion, gefolgt von autologer Transplantation,
um die Abstoßung
der nicht MHC-angepassten (MHC = Haupthistokompatibilitätskomplex)
Zellen durch das Immunsystem zu vermeiden. Dies verringert die Vielseitigkeit
des Ansatzes, da genetisch veränderte
Zellen von einem Individuum nicht für ein anderes verwendet werden können. Drittens
beinhalten effizienter Gen-Transfer und Langzeitexpression von Transgenen
in Zellen, die in Gentherapieprotokollen verwendet werden können, offene
Fragen, die noch nicht ausreichend geklärt worden sind (R. G. Crystal,
Science, Band 270, 404 bis 410 (1995); J. D. Harris und N. R. Lemoine,
Trends Genet., Band 12, 400 bis 405 (1996); R. G. Vile et al., Mol.
Biotechnol., Band 5, 139 bis 158 (1996)).
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In diesem Kontext kann die Implantation
genetisch veränderter
Zellen, die in immunschützenden Vorrichtungen
verkapselt sind, in Patienten einen vielseitigeren und kostengünstigeren
Ansatz darstellen. Einerseits sollte es möglich sein, dieselbe Charge
nicht-MHC-angepasster Zellen (möglicherweise
in vitro auf optimale Antikörperexpression
ausgewählt) für mehrere
Patienten zu verwenden, und andererseits ist die Implantation von
Kapseln ein sehr einfacher chirurgischer Eingriff. Zusätzlich würde eine
solche Technik auch die Möglichkeit
der leichten chirurgischen Entfernung Antikörper produzierender Zellen bieten,
falls die Behandlung beendet werden muss.
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Die Kapsel muss für optimale Funktion zwei Kriterien
erfüllen.
Erstens muss sie ausreichend groß sein, damit interessierende
Moleküle,
wie Antikörper, austreten
können,
und damit das Eintreten und die effiziente Diffusion von Nährstoffen
möglich
sind, die für
das Überleben
der Zelle notwendig sind. Zweitens muss sie ausreichend klein sein,
damit die verkapselten Zellen die Kapseln nicht verlassen können und Immunsystemzellen
des Wirts nicht eintreten können.
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Die Verkapselung von Zellen in permeablen Strukturen,
die die Freisetzung bestimmter biologisch aktiver Moleküle zulassen,
jedoch die Zellen, die diese Moleküle produzieren, vor dem Immunsystem
des Wirts schützen,
hat zu einigem Erfolg geführt
(siehe als Übersicht
P. L. Chang in Somatic Gene Therapy, Herausgeber P. L. Chang (CRC
Press, Boca Raton), Seiten 203 bis 223 (1995)). Zellen, die genetisch
modifiziert worden sind, so dass sie humanes Wachstumshormon (hGH)
(I. T. Tai und A. M. Sun, FASEB J., 7, 1061 bis 1069 (1993)) oder
eine sekretierte Form der humanen Adenosindeaminase (Hughes et al.,
Hum. Gene Ther. 5, 1445 bis 1455 (1994)) produzieren, sind verkapselt
worden. In beiden dieser Studien wurden Zellen in Poly-L-lysin-alginat-Mikrokapseln
verkapselt, und es wurde gezeigt, dass die Zellen lange Zeiträume in Kultur überlebten.
Dies war von Langzeitproduktion des Enzyms oder Hormons begleitet.
Es wurde des Weiteren gezeigt, dass die Zellen nach Transplantation
der Mikrokapseln in Mäuse
1 Jahr lebensfähig
blieben und weiter hGH produzierten, wodurch gezeigt wird, dass
die Kapseln die transfektierten Zellen vor Zerstörung durch das Immunsystem
des Wirts schützten.
Es wurde jedoch auch berichtet, dass Polylysin-alginat-Kapseln zu
einer entzündlichen
Reaktion führten
(M. E. Pueyo et al., J. Biomater. Sci, Polym. Ed., Band 5, 197 bis 203
(1993); G. M. Vandenbossche et al., J. Pharm. Pharmacol., Band 45,
115 bis 120 (1993)).
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Es ist auch von Zellverkapselung
unter Verwendung anderer Materialien berichtet worden. Babyhamsternierenzellen,
die genetisch modifiziert wurden, um Nervenwachstumsfaktor zu produzieren, wurden
in Polyacrylnitril/Vinylchlorid verkapselt und in Rattenhirn implantiert.
Die verkapselten Zellen überlebten
mindestens 6 Monate und produzierten weiter NGF (Winn et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 2324 bis 2328 (1994) und Degion et al.,
Gene Ther., 2, 563 (1995)).
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Rattenhybridomzellen, die ein gegen
Murin IL-4 gerichtetes mAb sekretierten, wurden in Alginat verkapselt
und intraperitoneal und subkutan in Mäuse implantiert (H. F. Savelkout
et al., J. Immunol. Methods, Band 170, 185 bis 196 (1994)). Die
in den Blutstrom abgegebenen Antikörperkonzentrationen sanken
nach 14 Tagen infolge der Kapselalterung ab. In diesem System wurde
außerdem
30 Tage nach der Implantation als Ergebnis der von den Kapseln in
die Bauchhöhle freigesetzten
Zellen ein 100% Auftreten von Aszitesentwicklung beobachtet.
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Hepatozyten sind erfolgreich in einem
Polyelektrolytkomplex aus Cellulosesulfat und Polydimethyldiallylammonium
verkapselt worden (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech.
21, 3443 bis 352 (1993)). Mehr als 90% der verkapselten Hepatozyten
behielten ihre Lebensfähigkeit
und im Unterschied zu Hepatozyten, die als Monoschichten gezüchtet wurden,
zeigten die verkapselten Zellen eine erhöhte metabolische Aktivität.
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Die gleichen Verkapselungsmaterialien
sind auch zur Verkapselung von Antikörper produzierenden Hybridomzellen
verwendet worden (Merten et al., Cytotechnology 7: 121 bis 130,
1991). Die Kapseln wurden aus einer Lösung von Natriumcellulosesulfat
(1,5%) und Polydimethyldiallylammoniumchlorid (2% Lösung) hergestellt.
Der Einfluss der Veränderung
von Verkapselungsverfahrensparametern auf die Kapselcharakteristika,
das Zellwachstum und die Produktion monoklonaler Antikörper wurde
untersucht, und es wurde gezeigt, dass Verkapselung unter Verwendung
von Natriumcellulosesulfat als Polyanion und Polydimethyldiallylammoniumchlorid
als Polykation ein geeignetes Instrument zur Herstellung von Kapseln
ist, die zur Kultivierung von Säugetierzellen
mit hohen Dichten brauchbar sind.
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Zusammenfassend ist aus dem Stand
der Technik bekannt, dass in vivo-Implantation der verkapselten
Zellen, die Antikörper
produzieren, zur Langzeitabgabe und/oder verzögerten Abgabe von Antikörpern zur
Therapie weder beschrieben noch auch nur vorgeschlagen wird, oder
dass Implantation von Kapseln zu schweren Nebenwirkungen führte, wie
z. B. Entzündungsreaktionen.
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ZIEL DER ERFINDUNG
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Es ist somit ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, Kapseln zu liefern, die Antikörper produzierende Zellen enthalten,
die die Freisetzung der Antikörper
aus den Kapseln ermöglichen
und nach Implantation keine entzündliche
Reaktion in einem Wirt hervorrufen.
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KURZFASSUNG
DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung umfasst
damit unter anderem das Folgende, allein oder in Kombination:
Kapseln,
die Antikörper
produzierende Zellen zur Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen oder
Störungen,
welche auf die von den Zellen hergestellten Antikörper ansprechen,
verkapseln, wobei die Kapsel einen Kern umfasst, der die Zellen
enthält, und
eine poröse,
den Kern umgebende Kapselwand, die für die von den Zellen hergestellten
Antikörper durchlässig ist,
und worin die Kapsel von einem Sulfatgruppen enthaltenden Polysaccharid
oder einem Polysaccharidderivat oder einem Sulfonatgruppen enthaltenden
synthetischen Polymer und einem Polykation gebildet ist;
Kapseln
wie oben, worin das Sulfatgruppen enthaltende Polysaccharid oder
Polysaccharidderivat aus der Gruppe umfassend Cellulosesulfat, Celluloseacetatsulfat,
Carboxymethylcellulosesulfat, Dextransulfat oder Stärkesulfat
ausgewählt
ist;
Kapseln wie oben, worin das Sulfonatgruppen enthaltende
synthetische Polymer ein Polystyrolsulfonatsalz ist;
Kapseln
wie oben, worin das Polykation ein Polymer mit quaternären Ammoniumgruppen
ist;
Kapseln wie oben, worin das Polymer mit quaternären Ammoniumgruppen
aus Polydimethyldiallylammonium oder Polyvinylbenzyltrimethylammonium ausgewählt ist;
Kapseln
wie oben, worin das Sulfatgruppen enthaltende Polysaccharid Cellulosesulfat
ist und das Polykation Polydimethyldiallylammonium ist;
Kapseln
wie oben, worin die Antikörper
produzierenden Zellen genetisch modifiziert wurden, um geklonte Antikörper herzustellen;
Kapseln
wie oben, worin die Antikörper
den Immunglobulinklassen IgA, IgM, IgG, IgD oder IgE angehören;
Kapseln
wie oben, worin die Antikörper
ausgewählt sind
aus Antikörpern,
die an einen viralen Oberflächenmarker,
eine Krebszelle, einen T- oder B-Lymphozyten,
der an der pathologischen Wirkung einer Autoimmunerkrankung beteiligt
ist, an einen Oberflächenmarker
eines Parasiten oder an ein schädliches, zirkulierendes
Antigen binden;
Kapseln wie oben, worin der Antikörper neutralisierende
Wirkung hat;
Kapseln wie oben zur Implantation in einen Tierkörper einschließlich eines
Menschen;
Kapseln wie oben für die intraperitoneale oder
subkutane Implantation;
Verwendung der Kapseln wie oben zum
Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung;
pharmazeutische
Zusammensetzung, umfassend Kapseln wie oben.
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DIE ERFINDUNG
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Erfindungsgemäß werden Kapseln geliefert, die
Antikörper
produzierende Zellen enthalten, die Freisetzung der Antikörper aus
den Kapseln ermöglichen
und keine entzündliche
Reaktion nach Implantation in einen Wirt hervorrufen.
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Die erfindungsgemäßen verkapselten Zellen können durch
Suspendieren der Antikörper
produzierenden Zellen in einer wässrigen
Lösung
eines Polyelektrolyten (z. B. ausgewählt aus den Sulfatgruppe enthaltenden
Polysacchariden oder Polysaccharidderivaten oder von Sulfonatgruppe
enthaltenden synthetischen Polymeren) hergestellt werden, wonach die
Lösung
in Form vorgebildeter Partikel in ein Ausfällungsbad eingebracht wird,
das eine wässrige
Lösung
eines entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten enthält (beispielsweise
ein Polymer mit quaternären
Ammoniumgruppen).
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Sulfatgruppen enthaltende Polysaccharide oder
Polysaccharidderivate schließen
Cellulosesulfat, Celluloseacetatsulfat, Carboxymethylcellulosesulfat,
Dextransulfat oder Stärkesulfat
in Form eines Salzes, insbesondere eines Natriumsalzes ein. Das Sulfonatgruppen
enthaltende synthetische Polymer kann ein Polystyrolsulfonatsalz
sein, vorzugsweise ein Natriumsalz.
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Polymere mit quaternären Ammoniumgruppen
schließen
Polydimethyldiallylamonium oder Polyvinylbenzyltrimethylammonium
in Form eines Salzes davon ein, vorzugsweise eines Chloridsalzes.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden die Antikörper
produzierenden Zellen in einem Komplex verkapselt, der aus einem
aus Cellulosesulfat und Polydimethyldiallylammonium gebildeten Komplex
besteht.
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Verfahren zur Herstellung der Cellulosesulfatkapseln,
die für
die Herstellung der erfindungsgemäßen Kapseln verwendet werden,
sind genau in DE-A1-40 21 050 beschrieben. Die Synthese des Cellulosesulfats
ist in dieser Patentanmeldung auch beschrieben worden. Verfahren
zur umfassenden Charakterisierung von Cellulosesulfatkapseln sind ausführlich von
H. Dautzenberg et al., Biomat., Art. Cells & Immob. Biotech., Band 21, 399 bis
405 (1993) behandelt worden. Cellulosesulfatkapseln und ihre Herstellung
sind auch in GB 2 135 954 beschrieben worden. Die Eigenschaften
der Cellulosekapseln, d. h. die Größe, die Porengröße, Wanddicke
und mechanischen Eigenschaften, hängen von mehreren Faktoren
ab, wie beispielsweise den physikalischen Bedingungen, unter denen
die Kapseln hergestellt wurden, der Viskosität des Ausfällungsbades, dessen Ionenstärke, Temperatur,
Schnelligkeit der Zugabe der Zell/Cellulosesulfat-Suspension, Konstitution des
Cellulosesulfats sowie anderen Parametern, die von der Dautzenberg-Gruppe
beschrieben wurden.
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Die erfindungsgemäßen Kapseln können hergestellt
werden, indem die Antikörper
produzierenden Zellen in einer Lösung
suspendiert werden, die 0,5 bis 50%, vorzugsweise 0,5 bis 5% Natriumcellulosesulfat
und 5% fetales Kalbserum in wässriger Lösung enthält, vorzugsweise
in einem Puffer. Diese Suspension wird. dann durch ein Abgabesystem
(z. B. Luftstrahlsystem oder piezoelektrisches System) in ein Ausfällungsbad
getropft, das eine gerührte
Lösung
von 0,5% bis 50%, vorzugsweise 0,5 bis 10% Polydimethyldiallylammoniumchlorid
in einer wässrigen
Lösung
enthält,
vorzugsweise einem Puffer. Die Kapselbildung findet innerhalb von
Millisekunden statt, und die Zellen enthaltenden Kapseln werden
30 Sekunden bis 5 Minuten in dem Ausfällungsbad gehalten und dann
gewaschen. Die Schnelligkeit dieses Verfahrens gewährleistet,
dass die Zellen während des
gesamten Verfahrens nicht unnötig
belastet werden (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech,
21, 345 bis 352 (1993)).
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Die erfindungsgemäßen Kapseln haben einen variablen
Durchmesser zwischen 0,01 und 5 mm, liegen vorzugsweise jedoch zwischen
0,1 und 3 mm. Demzufolge können
Kapseln so gefertigt werden, dass sie eine variable Anzahl von Zellen
enthalten. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verkapselungsverfahrens
können
bis zu 1010 vorzugsweise jedoch 103 bis 107 Zellen,
die Antikörper
produzieren, in dem Polyelektrolytkomplex verkapselt werden.
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Aus Cellulosesulfat und Polydimethyldiallylammonium
zusammengesetzte Kapseln haben hervorragende mechanische Eigenschaften
und können mit
konsistentem Durchmesser und konsistenter Porengröße gefertigt
werden.
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Die verkapselten Zellen können in
einem normalen Zellkulturmedium (dessen Art von den verkapselten
Zellen abhängt)
unter Standardbedingungen der Feuchtigkeit, Temperatur und CO2-Konzentration kultiviert werden. Während dieser
Kulturperiode kann die Produktion von Antikörpern aus den Kapseln in das
Zellkulturmedium mit Western Blot- oder Elisa-Technik unter Verwendung
spezifischer Antigene gezeigt werden und dann zudem unter Verwendung
von zweiten Antikörpern
quantifiziert werden, die mit fluorogenen Farbstoffen konjugiert
sind.
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Nach einer geeigneten Kulturperiode
(normalerweise nicht weniger als eine Stunde und nicht mehr als
30 Tage) können
die Zellen enthaltenden Kapseln entweder direkt oder durch Injektion
unter Verwendung einer Spritze in verschiedene Bereiche des Körpers implantiert
werden.
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Die durch die erfindungsgemäßen verkapselten
Zellen produzierten Antikörper
können
auf jeder Immunglobulinklasse basieren, die für die Therapie nützlich ist,
einschließlich
genetisch modifizierter Antikörper,
aber nicht auf diese begrenzt.
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Die erfindungsgemäßen verkapselten Zellen können Zellen
sein, die von Patienten entnommen wurden, oder können aus jeder beliebigen anderen Quelle
einschließlich
menschlichen und tierischen Zellen stammen, die zur Herstellung
geklonter Antikörper
genetisch modifiziert wurden.
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Die verkapselten Zellen beziehungsweise Kapseln
werden insbesondere zur Implantation in einen lebenden Tierkörper, einschließlich den
eines Menschen, zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen verwendet,
welche auf die von den Kapseln abgegebenen Antikörpern ansprechen. Nach intraperitonealer
und subkutaner Implantation von Kapseln in einen Tierkörper ist
gefunden worden, dass die Kapseln, insbesondere Cellulosesulfatkapseln,
einen offensichtlichen Vorteil in Bezug auf mechanische Beständigkeit
gegenüber
beispielsweise Alginatkapseln bieten, da gefunden wurde, dass sie unabhängig davon,
ob sie subkutan oder intraperitoneal implantiert werden, bis zu
10 Monate nach der Implantation intakt blieben.
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Es ist des Weiteren beobachtet worden,
dass subkutane und intraperitoneale Implantationen von zellhaltigen
Cellulosesulfatkapseln in Bezug auf mindestens zwei Punkte zu Unterschieden
führte.
Erstens war in der ersteren Situation die Menge der Antikörper, die
an den Blutstrom abgegeben wurde, deutlich höher. Eine sehr wahrscheinliche
Erklärung für diesen
Unterschied liegt in der Tatsache, das Kapseln rasch vaskularisiert
werden, wenn sie subkutan implantiert werden, und gar nicht vaskularisiert
werden, wenn sie intraperitoneal implantiert werden. Die günstige Auswirkung
der Vaskularisierung ist möglicherweise
eine doppelte, wobei erstens die Antikörperaufnahme durch das Blut
erleichtert wird und zweitens eine bessere Zufuhr von Nährstoffen
gewährleistet
ist, die das Überleben
der Zelle begünstigt,
da reproduzierbar beobachtet wurde, dass die Lebensfähigkeit
von Zellen in intraperitoneal implantierten Kapseln niedriger war.
Zusätzlich
zu der ausgedehnten Vaskularisierung, die im Verlauf der nächsten 10
Monate in der Nachsorge keine erhebliche Änderung zeigte, würde die
Clusterbildung der Zellen in einer Verbindungstasche nach der subkutanen
Implantation die Entfernung der Kapseln durch eine einfache einstufige
chirurgische Ablation des gesamten Neorgans ermöglichen, falls dies erforderlich
sein sollte. Es sollte zudem betont werden, dass die Entwicklung
der isolierenden Fibrose um implantierte Cellulosesulfatkapseln
herum nicht systematisch ist. Diese Beobachtung steht im Gegensatz
zu dem, was im Fall der Alginat-Poly(L)-alginat-Mikrokapseln berichtet
worden ist, wobei wahrscheinlich infolge der potenten Makrophagenaktivierung
durch das verkapselnde Polymer eine Wirtreaktion mit Fibrose um
die Mikrokapsel herum entwickelt wurde (M. E. Pueyo et al., J. Biomater.
Sci. Polym. Ed., Band 5, 197 bis 203 (1993)).
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Antiidiotypische Reaktionen werden
oft bei Patienten beobachtet, die wiederholt mit hohen Dosen gereinigter
monoklonaler Antikörper
behandelt wurden, und kann mitunter die Wirkungen der Behandlung
neutralisieren (J. D. Isaacs, Semin. Imunol., Band 2, 449 bis 456
(1990)). Zudem ist gezeigt worden, dass der Verabreichungsmodus
der Antikörper
ein entscheidender Parameter hinsichtlich der Auslösung der antiidiotypischen
Reaktionen ist. Es ist beispielsweise berichtet worden, dass subkutane und
intradermale Injektionen viel stärker
immunogen als intravenöse
Injektionen sind (L. G. Durrant et al., Cancer Immunol. Immunother.,
Band 28, 37 bis 42 (1989)). Es sollte daher betont werden, dass
in Tierkörpern,
denen cellulosesulfat-verkapselte Zellen implantiert wurden, die
die Antikörper
freisetzen, keine Entwicklung einer nachweisbaren antiidiotypischen Reaktion
gegen monoklonale Antikörper
beobachtet wurde.
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Zusammengefasst zeigen die oben wiedergegebenen
Daten eindeutig, dass die Implantation von verkapselten Zellen,
die Antikörper
freisetzen, für Langzeit-Gen/Zell-Therapieansätze auf
Antikörperbasis
geeignet ist, insbesondere gegen Krebserkrankungen und virale Erkrankungen.
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Die verkapselten, Antikörper produzierenden Zellen
werden in einer bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung therapeutisch verwendet, wenn eine verzögerte Freisetzung
von Antikörpern
in einer Langzeitbehandlung erforderlich ist.
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Solche Situationen sind beispielsweise
Erkrankungen, die durch eine chronische Virusinfektion hervorgerufen
werden, wie HIV, Hepatitis B, Herpex simplex und Herpes genitalis.
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Bestimmte virale Infektionen führen zur
Exposition spezifischer Marker oder Antigene an der Zelloberfläche. Solche
Oberflächenmarker
können selektiv
durch spezifische Antikörper
erkannt werden, die moduliert werden können, damit sie für die virusinfizierten
Zellen toxisch sind. Verkapselte Zellen, die derartige Antikörper produzieren,
können
zur Langzeitbehandlung viraler Infektionen angewandt werden.
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In einer anderen Ausführungsform
der Erfindung werden verkapselte Zellen bereitgestellt, die neutralisierende
Antikörper
produzieren, die Marker oder virale Rezeptoren an der Zelloberfläche erkennen
und sich an diese binden, wobei sie die Viren in den Anfangsphasen
der viralen Reaktion beeinflussen, was für eine direkte oder indirekte
neutralisierende Wirkung auf die virale Infektion sorgt.
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Neutralisierende Wirkungen können in
diesem Fall auf einem direkten Blockieren der Bindung und/oder des
Eintretens des Virus in die Zelle basieren, und können somit
weitere Infektion einer beliebigen Zielzelle verhindern, oder können indirekt über Lyse
durch das patienteneigene Komplementsystem wirken, oder indem das
Virus durch Antikörper
Zellen des Immunsystems, wie Monozyten oder Makrophagen, kenntlich
gemacht wird.
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In einer speziellen Ausführungsform
betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen verkapselten
Zellen zur Behandlung von Tumoren.
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In jeder Situation, in der ein spezifischer
Zelltyp oder eine spezifische Zelluntergruppe, die zur Selbsterneuerung
in der Lage ist, sich als toxisch oder lebensbedrohlich für Menschen
erweist, können zellspezifische
toxische Antikörper,
die normal oder genetisch zur Verbesserung ihrer Toxizität modifiziert worden
sind, die durch verkapselte Zellen zur selektiven Zerstörung der
Zellen produziert werden, zur Eliminierung der Tumorzellen verwendet
werden.
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Eine andere Anwendung der erfindungsgemäßen Kapseln
liegt in der Behandlung schwerer Autoimmunerkrankungen, wie der
multiplen Sklerose und rheumatischer Arthritis, wobei spezifische
T- und B-Zellen, die für
die pathologische Wirkung verantwortlich sind, in Langzeitbehandlungen
durch zellspezifische toxische Antikörper, die durch verkapselte
Zellen produziert werden, konstant eliminiert werden können.
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In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden verkapselte Zellen bereitgestellt, die Antikörper gegen
Oberflächenmarker
von Parasiten, wie Plasmodium falciparum, P. vivax oder P. malariae,
produzieren.
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Malaria ist neben TBC und HepB eine
der drei Krankheiten, die die meisten Todesfälle pro Jahr verursachen. Die
Verwendung von Antikörpern
gegen Plasmodium, wodurch die Parasiten markiert werden und dadurch
Zellen des Immunsystems anziehen, um die Parasiten zu zerstören, könnte als nicht-toxische,
nicht-schädliche
Prophylaxe für
Reisende in Länder
mit einem hohen Malariainfektionsrisiko verwendet werden.
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Die verkapselten, Antikörper freisetzenden Zellen
können
auch zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet
werden, die eine therapeutisch wirksame Menge der Zellen zusammen
mit mindestens einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel
enthält.
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Die folgenden Beispiele veranschaulichen die
Erfindung, sollen jedoch nicht als einschränkend angesehen werden:
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Beispiel
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Zellen und
Zellkulturbedingungen
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Die Hybridomzelllinie Tg 10, hergestellt durch
Verschmelzung von Myelomzellen der Maus (P3-X63-Ag 8.653) mit Milzzellen von Mäusen, die mit
hTg immunisiert waren (M. Piechaczyk, T. Chardes, M. C. Cot, B.
Pau und J. M. Bastide, Hybridoma, Band 4, Nr. 4, 361 bis 367, (1985)),
wurde zur Verkapselung verwendet. Tg 10-Zellen produzieren einen
monoklonalen Antikörper
(mAb), der auch als Tg 10 bezeichnet wird, gegen humanes Thyroglobulin. Die
Zellen wurden in RPMI 1640 (Gibco/BRL) mit Zusatz von 10% FCS in
Anwesenheit von 100 u. (= Einheiten)/ml Streptomycin, 100 μ/ml Penicillin
und 2 mM L-Glutamin gezüchtet.
Tg10-Zellen, die in der Cellulosesulfatmatrix (CSM) verkapselt waren,
wurden unter den gleichen Bedingungen wie freie Zellen kultiviert.
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Reinigung der Antikörper und
F(ab)'2-Fragmente
Tg 10 mAb wurde aus dem Überstand
der Tg10-Zellkultur durch Affinitätschromatographie gereinigt
(L. G. Durrant et al., Cancer Immunol. Immunother., Band 28, 37
bis 41 (1989)). Antiidiotypischer Antikörper des Kaninchens gegen das
T10 mAb wurde wie beschrieben produziert (M. Del Rio et al., Immunol.
Invest., Band 24, 655 bis 667 (1995)). Tg10 F(ab)'2-Fragment wurde
elektrophoretisch nach Spaltung von Tg10 mAb durch Pepsin hergestellt, und
die Reinheit der Ansätze
wurde durch SDS-PAGE-Analyse kontrolliert (M. Del Rio et al., Immunol. Invest.,
Band 24, 655 bis 667 (1995)).
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Zellverkapselung
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107 Zellen
wurden in 1 ml gepufferter Salzlösung
suspendiert, die 3,8% Natriumcellulosesulfat und 5% fetales Kalbserum
enthielt. Die Suspension wurde mit einem Abgabesystem (Luftstrahlsystem)
in ein Ausfällungsbad
getropft, das 2,5% Polydimethyldiallylammonium (PDDMDAAC) in gepufferter
Salzlösung
enthielt. Die Kapselbildung erfolgte innerhalb von Millisekunden,
gefolgt von weiterer Bildung einer inneren, poröseren Schicht für mechanischen
Halt, die im Wesentlichen aus Cellulusesulfat bestand. Die Zellen
enthaltenen Kapseln wurden 30 Sekunden bis 5 Minuten in dem Ausfällungsbad
gehalten und dann in DMEM gewaschen (Stange et al., Biomat. Art. Cells & Immob. Biotech.
21, 3443 bis 352 (1993)).
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Für
biologische Untersuchungen wurden Chargen verwendet, die mit unterschiedlichen
Parametern erhalten worden waren, d. h. Konzentration von Natriumcellulosesulfat,
Strömung
des Luftstrahlsystems und Zeit im Ausfällungsbad. Repräsentative Beispiele
für Bedingungen
sind beispielsweise: 2,5% Natriumcellulosesulfat, 2% Polydimethyldiallylammonium
und 1 Minute im Ausfällungsbad,
oder 1,5% Natriumcellulosesulfat, 2% Polydimethyldiallylammonium
und 0,5 Minute im Ausfällungsbad,
oder 3% Natriumcellulosesulfat, 3% Polydimethyldiallylammonium und
2 Minuten im Ausfällungsbad.
Die genauen Parameter können
so gewählt
werden, dass auch die genaue gewünschte
Größe der Kapseln,
die Dicke der Kapselwand sowie andere Eigenschaften berücksichtigt
werden können.
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Implantation
der Kapseln
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Vier bis sechs Wochen alte O3H-Mäuse (IFFA-CREDO)
wurden unter Verwendung von 0,01 ml einer Lösung, die 0,1% Xylazin (Rompun,
Bayer) und 10 mg/ml Ketamin (Imalgene, Rhone Merieux) enthielt,
pro Gramm Körpergewicht
anästhesiert.
Die Kapseln wurden vor der Implantation in phosphatgepufferter Salzlösung (0,15
M NaCl, 0,01 M Na-phosphat, pH 7) gewaschen. Sechs oder zwanzig CDM-Tg10-Kapseln
wurden entweder intraperitoneal oder subkutan (Abdominalbereich)
in Mäuse
implantiert. Im letzteren Fall wurden sie an einer oder drei Stellen
in Clustern von sechs oder sieben Kapseln pro Stelle implantiert.
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Immunisierung
der Mäuse
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Zur Erzeugung von antiidiotypischen Tg10-Antikörpern wurden
sechs Wochen alten, weiblichen B6D2F1 (IFFA CREDO) gereinigtes Tg10 mAb,
emulgiert in einem 1 : 1-Volumenverhältnis von komplettem
Freund'schen Adjuvans
(Sigma), intradermal an mehreren Stellen unter Verwendung von 20 μg pro Maus
injiziert. Zwei Booster-Injektionen von
20 μg gereinigtem
Tg10 mAb (10 μg
intraperitoneal und 10 μg
intramuskulär)
in inkomplettem Freund'schen
Adjuvans (Sigma) wurden drei beziehungsweise vier Wochen nach der
ersten Immunisierung gegeben. Den Mäusen wurden vor jeder Immunisierung
und eine Wochen nach der letzten Immunisierung Blut abgenommen.
Nach dem Gerinnen wurden die Blutproben 15 Minuten mit 6000 UpM
zentrifugiert, und aliquote Mengen Serum wurden bis zum Gebrauch
bei –20°C gelagert.
Jede Serumprobe wurde auf Anwesenheit von antiidiotypischem Antikörper gegen
Tg10 wie nachfolgend beschrieben bewertet.
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Immunoassay von Tg10-Antikörpern. Analyse
der antiidiotypischen Immunreaktion
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Tg10-Antikörper in Überständen aus Zellkulturen und in
Mausseren wurden mittels ELISA unter Verwendung von humanem Thyroglobulin
(hTg) (UCB-Bioproducts) zur Beschichtung von Mikrotiterplatten (Maxisorb,
Nunc) wie beschrieben (M. Piechaczyk et al., Hybridoma, Band 4,
361 bis 367 (1985); D. Noel et al., J. Immunol. Meth., Band 193, 177
bis 187 (1996)) geprüft,
und die Extinktion bei 450 nm wurde unter Verwendung des automatisierten
MR5000 Plattenablesers von Dynatech gemessen. Protein A sepharosegereinigtes
Tg10 mAb wurde als Standard für
die Konzentrationsbestimmung verwendet. Antiidiotypische Antikörper gegen
das Tg10mAb wurden mittels ELISA unter Verwendung von Tg10F(ab)'2 für die Beschichtung
der Mikrotiterplatten geprüft
(M. Del Rio et al., Immunol. Invest., Band 24, 655 bis 677 (1995)).
Ein antiidiotypisches Antiserum vom Kaninchen (M. Del Rio et al.,
Immunol. Invest., Band 24, 655 bis 667 (1995)) gegen das Tg10mAb
wurde als positive Kontrolle in die Experimente eingeschlossen.
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In vitro Antikörperproduktion
durch Tg10-Zellen, verkapselt in Cellulosesulfat (CS)
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Zuerst wurde bestimmt, ob das Verkapselungsverfahren
und die CS-Matrix für
Tg10-Hybridomzellen toxisch sein könnten oder die Antikörperproduktion
beeinflussen könnten.
Verkapselte Zellen, die unter Zellkulturbedingungen gehalten wurden, wurden
zu unterschiedlichen Zeiten nach der Verkapselung nach Zerbrechen
der Kapseln gezählt.
Die Lebensfähigkeit
der Zelle wurde unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens
kontrolliert. Parallel wurde die Tg10mAb-Produktion mittels ELISA
geprüft.
Das Kulturmedium wurde alle 24 Stunden ersetzt.
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Die Hauptbeobachtungen waren die
folgenden:
- (i) jede Kapsel, deren Durchmesser
von 0,5 bis 2 mm mit einem Mittelwert von 1 mm variierte, enthielt
durchschnittlich 2 × 104 Tg10-Zellen im Moment der Verkapselung,
- (ii) die Lebensfähigkeit
der verkapselten Zellen 4 Tage nach der Verkapselung wurde auf mindestens
80% geschätzt,
- (iii) Produktion des Tg10mAb war über einen Zeitraum von 50 Tagen
nachweisbar,
- (iv) ein Anfangsanstieg der Antikörperproduktion, der 10 Tage
anhielt, wurde beobachtet und mit der begrenzten Proliferation von
Tg10-Zellen in den Kapseln korreliert (die aufgrund von Raumbeschränkungen
eine oder zwei Zellteilungen nicht überschreiten können),
- (v) ein deutlicher Abfall der Antikörperproduktion, der mit dem
Einsetzen des Zelltods korrelierte, begann zwischen Tag 10 und Tag
20.
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Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass
das Verkapselungsverfahren als solches für Tg10-Zellen nicht toxisch
ist. Das Überleben
der Zellen in der CS-Matrix
schien eher begünstigt
zu sein, da parallel unter Standardkulturbedingungen, jedoch ohne
Passage kultivierte Tg10-Zellen innerhalb von 1 bis 2 Wochen starben.
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In vivo-Abgabe von Tg10mAb
nach Implantation von Tg10-Zellen
enthaltenden CS-Kapseln in Mäuse
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Als nächstes befasste man sich damit,
ob die systemische Abgabe des Tg10 mAb nach Implantation der Kapseln
in Mäuse
erreicht werden konnte. Sowohl subkutane (Abdominalbereich) als
auch intraperitoneale Implantationen wurden untersucht, um zu ermitteln,
welche Stelle eine bessere Abgabe von Antikörpern in den Blutstrom ermöglichen
würde.
Drei C3H-Mäusen
wurden intraperitoneal sechs Kapseln implantiert, und einer Maus
wurden 20 Kapseln implantiert. In ähnlicher Weise wurden drei
Mäusen
subkutan sechs Kapseln implantiert, und drei Mäusen wurden 20 Kapseln implantiert.
Die Tg10-Antikörperkonzentration
im Blutstrom wurde nachfolgend mittels ELISA überwacht.
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Es konnte beobachtet werden, dass
die Antikörperproduktion
- (i) direkt mit der Zahl der implantierten Kapseln korrelierte,
- (ii) zwischen der zweiten und dritten Woche nach der Implantation
einen Peak erreichte,
- (iii) reproduzierbar höher
war, wenn die Kapseln subkutan implantiert wurden, da ein Wert bis
zu 12,5 μg/ml
erreicht werden konnte, verglichen mit 2,5 μg/ml im Fall der intraperitonealen
Implantation,
- (iv) bis zu 4 Monate lang nachgewiesen werden konnte, obwohl
die Tg10-Antikörperkonzentration im
Blut progressiv auf nur einige Zehn ng/ml absank.
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Schließlich schien die Abnahme der
Antikörperproduktion
mit dem progressiven Tod der verkapselten Zellen verknüpft zu sein.
Die Lebensfähigkeit der
verkapselten Zellen in Kapseln, die Mäusen 2 Monate nach der subkutanen
Implantation entfernt worden waren, wurde auf 20 bis 30% geschätzt, ein Wert,
der mit der Verringerung der Antikörperkonzentration korrelierte.
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Nachsorge
der Vaskularisation der Kapseln
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Intraperitoneal und subkutan implantierte Kapseln
verhielten sich in Hinsicht auf ihre Vaskularisation unterschiedlich.
2 Monate nach der Implantation schienen subkutan implantierte Kapseln
in eine vaskularisierte Tasche gehüllt zu sein, die aus schlaffem
Bindegewebe bestand. Die Bildung dieser Neorgane fand unabhängig davon
statt, ob die Kapseln Hybridomzellen enthielten oder nicht. Wenn
Kapseln Intraperitoneal implantiert wurden, bildeten sie im Unterschied
dazu keine Cluster, sondern blieben mobil, und es wurde keine Vaskularisation
beobachtet.
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Als nächstes wurde der Beginn der
Vaskularisation untersucht, und es wurde untersucht, ob die Behandlung
der Kapseln mit angiogenen Faktoren die Vaskularisation von subkutan
implantierten Kapseln beschleunigen und/oder verbessern konnte.
Mit bFGF, einem Wachstumsfaktor, der seit langem durch seine angiogene Aktivität bekannt
ist (R. Montasano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 83, 7297
bis 7301 (1986), J. A. Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Band 86, 7928 bis 7932 (1989)), behandelte Kapseln und/oder Rattenkollagen
Typ I (Sigma) wie oben beschrieben wurden implantiert und in Bezug
auf ihre Vaskularisation nachuntersucht. Es fand sich kein offensichtlicher
Unterschied zwischen den verschiedenen untersuchten experimentellen
Bedingungen. Drei Tage nach der Implantation waren sich um die Kapseln
entwickelnde Blutgefäße leicht
zu sehen, und die vollständige Vaskularisation
war nach 2 bis 3 Wochen erreicht, wobei sich ein Netz von Blutgefäßen sowohl
um das Neorgan herum als auch innerhalb von diesem befand, das mindestens
10 Monate stabil blieb.
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Auf Höhe der implantierten, Tg10-Zellen
enthaltenden CS-Kapseln entwickelte sich keine nachweisbare entzündliche
Reaktion
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Die Entwicklung möglicher entzündlicher
Reaktionen, die durch implantierte Kapseln ausgelöst werden,
wurde an Mäusen
untersucht. Es wurde in der Nähe
der Kapseln nach intraperitonealer oder subkutaner Implantation
keine makroskopisch nachweisbare sofortige oder verzögerte entzündliche
Reaktion beobachtet. Es fiel auch das Fehlen der Veränderung
der Vaskularisation der Kapseln sogar 10 Monate nach der subkutanen
Implantation auf.
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Es war keine antiidiotypische
humorale Reaktion gegen den von den verkapselten Zellen freigesetzten Tg10-Antikörper nachweisbar
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Die Möglichkeit der Entwicklung einer
humoralen Reaktion gegen den Tg10-Antikörper in Mäusen, denen verkapselte Hybridomzellen
implantiert wurden, wurde ebenfalls untersucht. Ein zuvor charakterisiertes Kaninchenserum,
das Anti-Tg10-Antikörper
enthielt (M. Del Rio et al., Immunol. Invest, Band 24, 655 bis 667
(1995)), wurde als positive Kontrolle für diese Experimente verwendet.
Zusätzlich wurde
eine Reihe von Mäusen
mit dem gereinigten monoklonalen Antikörper in Anwesenheit von Freund'schem Adjuvans wie
oben beschrieben immunisiert. Sechs von dreizehn Mäusen entwickelten eine
eindeutige antiidiotypische Reaktion, wodurch gezeigt wird, dass
Mäuse nicht
von sich aus resistent gegen die Herbeiführung einer derartigen Reaktion sind.
Im Unterschied dazu wurde keine antiidiotypische Reaktion in irgendwelchen
der Mäuse
nachgewiesen, denen Kapseln implantiert worden waren, unabhängig von
der Blutkonzentration des Antikörpers
und der Implantationsstelle. Diese Daten zeigen, dass die Cellulosesulfatmatrix
keine offensichtliche Adjuvanswirkung zeigt, die die Herbeiführung einer
neutralisierenden humoralen Reaktion gegen den Tg10-Antikörper begünstigen
würde.
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Zusammengefasst ist gezeigt worden,
dass Hybridomzellen enthaltende Cellulosesulfatkapseln zur Abgabe
monoklonaler Antikörper
in den Blutstrom immunkompetenter Mäuse für mindestens mehrere Monate
verwendet werden können,
wenn sie subkutan oder in die Bauchhöhle implantiert werden. Die
zuvor wiedergegebenen Daten zeigen, dass die Implantation von Antikörper produzierende
Zellen enthaltenden Kapseln in Patienten potentiell die systemische
Langzeitabgabe von Antikörpern
ermöglichen
kann und somit zur Entwicklung von Monitoringbehandlungen von Krebserkrankungen
und schweren viralen Erkrankungen nützlich sein kann. Zudem ist
die Verkapselung von Antikörper
produzierenden Zellen in Cellulosesulfat in Gen/Zell-Therapieansätzen auf
Antikörperbasis
brauchbar.