DE69723163T2

DE69723163T2 - Verfahren und Testsatz zur in vitro Bestätigung der Diagnose von Bauchkrankheit

Info

Publication number: DE69723163T2
Application number: DE69723163T
Authority: DE
Inventors: Antonio Picarelli
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2017-07-24
Also published as: US5817523A; EP0821238A2; EP0821238B1; EP0821238A3; DE69723163D1; ATE244409T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die in vitro Diagnose spezieller Pathologien der Bauchhöhlenkrankheit bzw. der Zöliakie.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren und einen Kit bzw. Testsatz zur Bestätigung der Diagnose der Zöliakie durch Nachweis antiendomysialer Antikörper in Kulturmedien, in denen bioptische Fragmente der humanen Darmschleimhaut bzw. Darmmukosa in Berührung mit Gliadin und insbesondere mit einem Gliadin-Peptid, das als das Peptid von Position 31 bis 43 der Aminosäuresequenz eines solchen Proteins identifiziert wurde, am Leben erhalten werden.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung des Gliadin-Peptids von Position 31 bis 43 in der Produktion antiendomysialer Antikörper in einem Medium zur Organkultur. Die Zöliakie ist eine häufige gastroenterologische Pathologie, deren Diagnose durch einen histologischen Test einer Darmbiopsie erfolgt.
Wie früher beschrieben (Ladinser, B., et al., 1994; De Ritis, G. et al., 1988; Maiuri, L., et al., 1996) wird die Diagnose gegenwärtig durch Überprüfung der Darmstruktur durchgeführt, die typischerweise einen villaren Typ aufweist: wenn die Schleimhaut geschädigt ist, ist sie im wesentlichen flach, d. h. ohne Villi, die normalerweise auf gesunder Schleimhaut vorliegen. Mit anderen Worten bringt eine solche Pathologie bzw. Symptomatik eine subtotale Atrophie der Darmschleimhaut mit sich.
Es wurde nahegelegt, dass die typischen Läsionen der Zöliakie nicht in einem Organ wie dem Dünndarm verteilt sind, das mehr als sechs Meter lang ist, sondern sich in abgegrenzten Arealen befinden. Deswegen kann der histologische Test unrealistische Daten ergeben, wenn die bioptischen Fragmente aus nicht atrophischen Teilen entnommen werden.
Überdies wurde kürzlich demonstriert (Picarelli et al., Gastroenterology 1996, im Druck), dass die Zöliakie sogar ohne die typischen histologischen Darmläsionen diagnostiziert werden kann. Dies ist durch eine immunhistochemische Überprüfung der Darmschleimhaut möglich, die es möglich macht, das Vorhandensein spezieller immunologischer Marker, beispielsweise CD 25 oder ICAM 1 nachzuweisen. Jedoch ist diese Technik sehr schwierig und anspruchsvoll. Es ist ebenfalls bekannt, dass das für die Krankheit verantwortliche Antigen Gluten ist, das ein in einigen Getreideprodukten enthaltenes Protein ist.
Es wurde weiterhin gezeigt, dass durch Aussetzen bioptischer Fragmente von Patienten, die sich in Remission befinden, gegenüber diesem Antigen in einer Organkultur diese Fragmente spezielle immunologische Marker einer solchen Pathologie zeigen, wie sie sich während der Phase der anerkannten Krankheit zeigen können (Maiuri, Picarelli et al., Gastroenterology, Mai 1996).
Es ist ebenfalls bekannt, dass antiendomysiale Antikörper (EMA) eine hohe Empfindlichkeit bzw. Sensitivität und Spezifität sowohl als Screeningmittel als auch Testmittel zur Verfolgung der Krankheit während der Behandlung aufweisen (Ladinser, B., et al., 1994).
Aus dem Vorhergehenden ergibt sich ein Bedarf, Mittel für die in vitro Diagnose zusätzlich zum histologischen Test der Darmschleimhaut bereitzustellen und/oder zu entwickeln, um eine Zöliakie nachzuweisen, zu bestätigen und/oder auszuschließen.
Die Erfinder gingen von der Tatsache aus, dass es möglich ist, die bioptischen Fragmente der Darmschleimhaut gemäß einem bereits bekannten Verfahren zu kultivieren (Picarelli et al., Gastroenterology, 1996, im Druck), jedoch besteht eine besondere Schwierigkeit darin, dass eine Laborausrüstung mit solchen technischen Anforderungen erforderlich ist, wie sie nicht leicht zu finden sind.
Gemäß der bekannten Technik wird eine Kultur aus bioptischen Fragmenten durch Eintauchen derselben in ein adaptiertes flüssiges Kulturmedium durchgeführt.
Dieselben Erfinder haben ebenfalls bewiesen, dass (Picarelli, A., et al., 1994):

1) Darmschleimhaut von Patienten, die von einer Zöliakie betroffen waren oder sind, antiendomysiale Antikörper in Gegenwart von Gliadin, einem Protein von Gluten, erzeugt;
2) Die Darmschleimhaut von kranken Patienten Antikörper sogar ohne Gliadin erzeugt;
3) Die Darmschleimhaut von Patienten, die gesund und/oder von anderen Pathologien befallen sind, jedoch keine antiendomysialen Antikörper erzeugen.

Deswegen kann das mögliche Vorliegen von antiendomysialen Antikörpern (EMA) in Flüssigkeiten durch typische Immunfluoreszenz-Techniken nach Eintauchen von Darmschleimhaut-Fragmenten in geeignete Nährmedien, die Gliadin enthalten, nachgewiesen werden.
Als solches erscheinen (EMA) Antikörper nur in der Schleimhaut, die zu Patienten gehört, die krank waren oder sind, wobei ein solches Verfahren als Diagnose-Bestätigungstest für Zöliakie verwendet werden kann.
Die Technik zur Durchführung eines solchen Verfahrens stellt im wesentlichen die nachfolgenden Schritte vor der Immunfluoreszenz bereit:

– Entnahme bioptischer Fragmente aus der Darmschleimhaut;
– Kultivieren der Darmschleimhaut in einem reinen Medium zur Kontrolle;
– Kultivieren der Darmschleimhaut in einem Medium unter Zusatz von PT (peptisch tryptischer Digest von Gliadin).

Diese Kulturen werden durchgeführt, indem lediglich bioptische Fragmente in Teströhrchen, die eine Menge an Kulturmedium zwischen 100 und 1000 Mikroliter (μl) enthalten, eingetaucht werden. Die Kulturzeit beträgt zwischen 24 und 72 Stunden unter einer sterilen Atmosphäre aus 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid und bei einer kontrollierten Temperatur von 37°C.
Die Zusammensetzung des Mediums ist diejenige, die üblicherweise in der Organ- und Zellkultur verwendet wird. Ein bevorzugtes Medium weist beispielsweise die folgende Zusammensetzung auf:
Die Gegenwart von EMA-Antikörpern wurde in beiden Kulturmedien von bioptischen Fragmenten mit oder ohne Gliadin nach 24 bis 48 Stunden durch eine Affen-Oesophagus-Immunfluoreszenz-Technik nachgewiesen.
Die mit einer Gruppe von 33 Patienten erzielten Ergebnisse, davon 10 krank, 10 gesund und 13 in Remission sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt:
Es ist aus der Tabelle zu erkennen, dass der Test dazu in der Lage ist, die Zöliakie bei allen kranken Patienten und bei ungefähr 70% der Patienten in Remission nachzuweisen. Nach 48 Stunden wird die Erkrankung bei 100% der Patienten erkannt, ebenfalls bei solchen in Remission.
Obwohl ein solches Verfahren sehr leicht durchzuführen ist, weist es jedoch den Nachteil auf, dass die Konzentrationen des peptisch-tryptischen Verdaus von Gliadin im Kulturmedium, die zur Erzeugung von Antikörpern erforderlich sind, sehr hoch sind, d. h. 1 mg/ml.
Unter Berücksichtigung, dass die hohe Konzentration des Verdaus im Medium auf die Tatsache zurückzuführen war, dass nur wenige Gliadin-Fragmente toxisch waren, d. h. dazu in der Lage waren, antiendomysiale Antikörper zu produzieren, wurden mehrere Fragmente der Aminosäuresequenz von Gliadin im menschlichen Dünndarm sowohl in vivo als auch in vitro aktiviert. Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise herausgefunden, dass die toxische Aminosäuresequenz GLN-GLN-GLN-PRO ist, die im Peptid in der Position 31 bis 43 enthalten ist und dass ein solches Peptid dazu in der Lage ist, antiendomysiale Antikörper in einem größeren Umfang als der peptisch-tryptische Verdau von Gliadin zu erzeugen, sogar bei sehr geringen Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,1 mg/ml. Dies erleichtert natürlich das vorherige Verfahren bei weitem, überwindet alle Probleme bezüglich der Verwendung des Gliadin-Verdaus, die durch die Behandlung des Proteins mit proteolytischen Enzymen (d. h. Trypsin) entstehen und senkt die Kosten.
Die Aminosäuresequenz des Peptids an Position 31 bis 43 ist wie folgt: LEU-GLY-GLN-GLN-GLN-PRO-PHE-PRO-PRO-GLN-GLN-PRO-TYR. Es ist offensichtlich, dass die Auswahl des Peptids an Position 31 bis 43 sowohl aus Gründen der Ökonomie als auch Spezifität signifikant ist, weil es das kürzeste in der Aminosäuresequenz enthaltende Fragment ist, das für die immunologische Wirkung verantwortlich ist. Es ist überdies offensichtlich, dass Peptidfragmente von Gliadin mit mehr als 31 bis 43 Fragmenten mit nicht unähnlichen Ergebnissen verwendet werden können.
Es ist deswegen eine Aufgabe der vorliegenden Endung, ein Verfahren des oben erwähnten Typs bereitzustellen, das die nachfolgenden Schritte einschließt:

– Entnahme bioptischer Fragmente aus der Darmschleimhaut;
– Kultivieren zuerst der Darmschleimhaut in einem reinen Medium zur Kontrolle;
– Kultivieren als zweites der Darmschleimhaut in einem Medium unter Zusatz eines Peptidfragmentes von Gliadin, das die Aminosäuresequenz GLN-GLN-GLN-PRO enthält;
– Entnahme beider Kulturmedien und Nachweisen der vorliegenden antiendomysialen Antikörper.

Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren des oben erwähnten Typs bereitzustellen, bei dem das verwendete Peptidfragment von Gliadin das Gliadinpeptid von Position 31 bis 43 ist, dessen Aminosäuresequenz LEU-GLY-GLN-GLN-GLN-PRO-PHE-PRO-PRO-GLN-GLN-PRO-TYR ist.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Kit bereitzustellen, der zur Durchführung des oben beschriebenen diagnostischen Verfahrens verwendet werden kann, der folgendes einschließt:

– ein Teströhrchen, das ein Kulturmedium des Organkulturtyps enthält;
– ein Teströhrchen, das dasselbe Kulturmedium wie oben unter Zusatz des Gliadinpeptids von Position 31 bis 43 enthält, dessen Aminosäuresequenz LEU-GLY-GLN-GLN-GLN-PRO-PHE-PRO-PRO-GLN-GLN-PRO-TYR ist, in einer Menge von 0,005 bis 0,1 mg/ml;
– zwei Gläser mit einem Affen-Oesophagus-Schnitt;
– einen sekundären anti-humanen IGA-Antikörper, der mit Fluoreszin behandelt ist;
– Spülflüssigkeiten (PBS-Phosphat-Puffer-Lösung);
– zwei Deckgläser.

Claims

Verfahren zur in vitro Diagnose einer Bauchhöhlenkrankheit unter Verwendung bioptischer Fragmente der enteralen Mucosa des distalen Duodenums, das folgende Schritte umfaßt: a) ein erstes bioptisches Fragment wird in ein OrganKultur-medium für die Kontrollgruppe getaucht; b) ein zweites bioptisches Fragment wird mit der Beigabe eines Peptidfragments von Gliadin in ein Organkulturmedium getaucht, das die Aminosäuresequenz GLN-GLN-GLN-PRO enthält; c) die Kulturen werden über eine Zeit zwischen 24 und 72 Stunden unter einer sterilen Atmosphäre von 95% Sauerstoff und 5% CO₂ auf einer Temperatur von etwa 37°C gehalten; d) die Flüssigkeiten der Kulturen werden der Immunofluoreszenz für antiendomysiale Antikörper unterworfen.
Verfahren der in vitro Diagnose nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß das im Schritt b) verwendete Peptidfragment das Peptid von Gliadin der Position 31–43 ist, dessen Aminosäure wie folgt ist: LEU-GLY-GLN-GLN-GLN-PRO-PHE-PRO-PRO-GLN-GLN-PRO-TYR.
Testsatz zur in vitro Diagnose einer Bauchhöhlenkrankheit, gekennzeichnet durch: – ein Teströhrchen, das ein Kulturmedium des Typs Organkultur enthält; – ein Teströhrchen, das das gleiche Kulturmedium wie oben mit einer Beigabe des Peptids von Gliadin der Position 31–43 ist, dessen Aminosäure wie folgt ist: LEU-GLY-GLN-GLN-GLN-PRO-PHE-PRO-PRO-GLN-GLN-PRO-TYR; in einer Menge von 0,002–0,005 mg/ml; – zwei Glaser mit einem Schnitt von Affenösophagus; – einen mit Fluoreszin behandelten sekundären antihumanen IgA-Antikörper; – Spülflüssigkeiten (PBS – Phosphatpufferlösung); – zwei Abdeckgläser.
Verwendung eines Peptidfragments von Gliadin, das die Aminosäuresequenz GLN-GLN-GLN-PRO enthält, bei der Herstellung antiendomysialer Antikörper in Kulturmedien bioptischer Fragmente enteraler Mucosa.
Verwendung des Peptidfragments von Gliadin der Position 31–43 bei der Herstellung antiendomysialer Antikörper in Organkulturmedien bioptischer Fragmente enteraler Mucosa.