DE10133308A1

DE10133308A1 - Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure

Info

Publication number: DE10133308A1
Application number: DE10133308A
Authority: DE
Inventors: Thomas Schmitt-John; Ralf Palmisano; Regina Plessow; Andreas Brockhinke; Juergen Weidner
Original assignee: Praenadia GmbH
Current assignee: Praenadia GmbH
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2001-07-12
Publication date: 2003-01-23
Also published as: WO2003008639A3; WO2003008639A2

Abstract

Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure mit mindestens einer ersten Sonde mit einem Donor-Fluorophor und einer zweiten Sonde mit Akzeptor-Fluorophor hybridisiert wird und das Emissionsspektrum des Donor-Fluorophors mit dem Anregungsspektrum des Akzeptor-Fluorophors mindestens überlappt. Das Donor-Fluorophor wird anschließend selektiv angeregt und die Emission des Akzeptor-Fluorophors nachgewiesen.

Description

Die Erfindung betrifft den Nachweis von Nukleinsäuren, insbesondere einen in situ Nachweis von Nukleinsäuren in Zellen zur Identifikation und Separierung der Zellen.
Für wissenschaftliche oder diagnostische Zwecke ist es häufig notwendig, definierte Zelltypen aus einer Gewebeprobe, die überwiegend ein Gemisch verschiedener Zellen darstellt, zweifelsfrei zu identifizieren und nachfolgend - als sog. Zielzellen oder target Zellen - von den übrigen zu separieren. So müssen ggf. Tumorzellen aus peripherem Blut oder Gewebe-Proben zunächst nachgewiesen und anschließend separiert werden. Gleiches gilt für den Nachweis Virus-infizierter oder von Parasiten befallener Zellen.
Die Notwendigkeit der Zellseparierung stellt sich insbesondere bei fötalen Zellen, wenn diese zu Zwecken der Pränatal-Diagnostik aus perpherem Blut zunächst von mütterlichen Zellen getrennt werden müssen. Diese Vorgehensweise wird alternativ zu invasiven Verfahren gewählt, die nicht selten zur körperlichen Schädigung des Fötus und sogar zu Spontanaborten führen können:
Beweggründe für eine pränatale Diagnostik liegen z. B. in der Sorge um das altersbedingte erhöhte Risiko unbalancierter und struktureller Chromosomenanomalien oder in der Erhebung auffälliger Sonographiebefunde während der Schwangerschaftsvorsorge, die z. B. von einem ungünstigen Befund bei der Hautdickenmessung des fötalen Nackenbereichs (nuchal translucency) (SNIJDERS UND NICOLAIDES, 1996) oder einem Serumscreening (WALD ET AL., 1995) unterstützt werden. Heute werden allerdings nur 25% (MINY ET AL., 1999) aller Aneuploidien von Neugeborenen bereits pränatal diagnostiziert.
Abhängig vom Zeitpunkt der Indikationstellung werden derzeit routinemäßig invasive Verfahren eingesetzt, um fötale Zellen für die weitere Diagnose zu gewinnen. Dabei wird die Amniozentese, d. h. die Punktion der Fruchtblase durch die Bauchwand und Gebärmutterwand, und die Chorionzottenbiopsie, bei der fötale Zellen des Choriongewebes, das sich durch Ausbildung von Zotten in die Schleimhaut der Gebärmutter eingesenkt hat, entnommen werden, eingesetzt. Die Amniozentese, die auf das Erlangen von Amnionflüssigkeit und darin befindlicher fötaler Zellen abzielt, wird im zweiten Trimenon der Schwangerschaft durchgeführt. Die sich anschließende Chromosomenuntersuchung der Fruchtwasserzellkulturen gilt heute als Standardverfahren pränataler cytogenetischer Untersuchung, deren Ergebnisse aber nicht vor dem Ablauf von 7 bis 14 Tagen erwartet werden können. Zur Aufdeckung bestimmter Aneuploidien bei spezifischem Risiko wird häufig die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) eingesetzt (EBEN ET AL., 1998).
Neben den unmittelbaren Risiken der invasiven Eingriffe für das Wohl des Kindes stellt der späte Zeitpunkt der möglichen Diagnosestellung einen wesentlichen Nachteil des Verfahrens dar, da mögliche Schwangerschaftsabbrüche in Folge der negativen Ergebnisse erst im späten zweiten Trimenon erfolgen können.
Um diese Nachteile der invasiven Methoden zu vermeiden, wird seit langem versucht, gezielt auf die im maternalen Blut zirkulierenden fötalen Zellen zuzugreifen, so z. B. unter anderem durch Proliferation und Selektion erythroider Zellen in Kultur (STAMATOYANNOPOULOS ET AL., 1997).
Daneben sind seit mehr als zwei Jahrzehnten Bemühungen bekannt, nukleierte fötale Zellen immunologisch aus maternalem Blut zu separieren (HERZENBERG ET AL., 1979). Der diesen Bemühungen zugrundeliegende Ansatz besteht überwiegend darin, Antikörper oder Liganden an fötale Zellen zu koppeln, die meist mit Fluorophoren (SEKIZAWA, 1999) oder Eisen (TROEGER ET AL., 1999) markiert werden. Nach der Kopplung dieser markierten Sonden an die gesuchten fötalen Zellen werden die Zellen über eine fluoreszenz oder magnetisch aktivierte Zellsortierung (fluorescence activated cell sorting (FACS), magnetic activated cell sorting (MACS)) separiert und stehen diagnostischen Methoden zur Verfügung.
Nach wie vor gibt es jedoch keine Routinemethode, um nukleierte fötale Zellen aus maternalem Blut (HOLZGREVE ET AL., 1992: BIANCHI, 1999) zu isolieren. Ursächlich dafür ist vor allem die Tatsache, daß die Anzahl nukleierter fötaler Zellen im maternalen Blut abhängig ist vom Stadium der Schwangerschaft und von individuellen Faktoren und somit starken Schwankungen (HAMADA ET AL., 1993) unterworfen ist. Bei der Verwendung von Antikörpern besteht ein zusätzliches Problem zudem häufig in der mangelhaften Verfügbarkeit und Spezifität der Antikörper. Diese binden nämlich meist auch unspezifisch an F_c-Rezeptoren anderer Zellen. Außerdem treten unerwünschte Kreuzreaktionen mit anderen Antigenen auf.
Eine Verbesserung der Spezifität wird durch die Verwendung von Liganden erreicht (SERLACHIUS ET AL., 2000), die aufgrund eines langen evolutionären Prozesses für ihren Rezeptor spezifisch sind. Somit sinkt die Wahrscheinlichkeit von unspezifischen Bindungen deutlich im Vergleich mit Antikörpern. Die derart erreichte Spezifität bleibt aber dennoch unzureichend.
Ein weiterer Ansatz basiert auf dem unterschiedlichen Hämoglobinprofil adulter und fötaler erythroider Vorläuferzellen aus maternalem peripheren Blut (BOHMER ET AL., 1998). Doch auch dabei werden fluoreszenzmarkierte Antikörper, nämlich PE-anti-HbF (Phycoerythrin) und FITC-anti-HbA (Fluorescein Isothiocyanate), eingesetzt, um die Zielzellen zu markieren.
Eine theoretische Möglichkeit zur Identifikation einer Zielzelle und ihrer anschließenden Isolation liegt in dem Nachweis einer für diese Zelle spezifischen Nukleinsäure. Dazu könnte die Hybridisierung mit einer markierten komplementären Sonde dienen. Diese Vorgehensweise eignet sich in der Praxis allerdings nicht, da bei einem in situ Nachweis nicht-gebundene, d. h. überschüssige Sonden, nicht aus der Zelle ausgewaschen werden können. Sie würden anschließend bei Detektion der Markierung zu unspezifischen und falsch positiven Ergebnissen führen.
Der Erfindung liegt demnach das Problem zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von Zellen bereitzustellen.
Dieses Problem wird gelöst mit einem Verfahren gemäß dem Hauptanspruch. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand jeweiliger Unteransprüche.
Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, eine Nukleinsäure durch die gleichzeitige Hybridisierung mit mindestens zwei markierten Oligonukleotidsonden nachzuweisen, bei denen die Markierung nur detektiert werden kann, wenn beide Sonden in räumlicher Nachbarschaft zueinander liegen. Sofern nur eine Sonde hybridisiert, erzeugt die Markierung in dem erfindungsgemäßen Verfahren dagegen kein Signal. Durch eine in-situ Hybridisierung kann mit dem Nachweis der Hybridisierung gleichzeitig die Identifikation der Zelle erfolgen, die die hybridisierten Nukleinsäuren anschließt.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem strahlungslosen Energie- Transfer von einem Fluorophor auf einen anderen. Dieser sog. Fluoreszenz- Resonanz-Energie-Transfer (FRET) wird auch häufig nach seinem Entdecker Förster-Resonanz-Energie-Transfer benannt. Hierbei kann ein angeregter Fluoreszenzfarbstoff (Donor) Energie auf ein räumlich benachbartes anderes Farbstoffmolekül (Akzeptor) übertragen und dieses zur Fluoreszenz- Emission anregen. Voraussetzung ist, daß Emissionsspektrum des Donors und Anregungsspektrum des Akzeptors überlappen. Die Effizienz des Transfers hängt im hohen Maß vom Abstand der beiden Fluorophor-Moleküle ab.
E_FRET = (1 + (R/R₀)⁶)^-1 (Murchie et al., 1989; Masuko et al., 2000)
E_FRET ist die Energie-Transfer-Effizienz, R ist der Abstand zwischen Donor und Akzeptor und R₀ ist der charakteristische Abstand für ein Donor-Akzeptor-Paar, bei dem E_FRET 0,5 beträgt. E_FRET nimmt demnach mit dem Abstand sehr schnell ab und kann für Messungen des Abstands auf molekularer Ebene eingesetzt werden (de Souza et al., 2000, Andrew und Barns, 2000; Norman et al., 2000).
Zum Nachweis einer Nukleinsäure (Ziel-Nukleinsäure) können zwei für diese Nukleinsäure spezifische Oligonukleotide als Sonden mit zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, wobei sich das Emissionsspektrum des einen Farbstoffs mit dem Absorptionsspektrum des anderen Farbstoffs überschneidet. Die Sonden sind so gewählt, daß sie bei einer Hybridisierung an ein und dieselbe Nukleinsäure in räumlicher Nachbarschaft zueinander liegen. Dadurch wird ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET, Förster-Resonanz-Energie-Transfer), d. h. ein strahlungsloser Energietransfer, von einem Fluorophor (Donor-Fluorophore) zum anderen (Akzeptor-Fluorophore) möglich. Wird nachfolgend der Donor selektiv angeregt, regt seine Emission seinerseits die Akzeptor-Fluorophore an. Die Emission der Akzeptor-Fluorophore kann anschließend nachgewiesen werden.
Der Nachweis der Hybridisierung - und somit indirekt der Nachweis der Ziel- Nukleinsäure - über das Erfassen der Akzeptor-Fluoreszenz nach einer selektiven Anregung der Donor-Fluorophore ermöglicht einen Nukleinsäure spezifischen Nachweis auch in situ, d. h. auch innerhalb der Zelle. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß die Akzeptorfluoreszenz nur nach einer tatsächlich erfolgten Hybridisierung beider Sonden durch die Donor-Emission angeregt werden kann. Findet dagegen keine Hybridisierung oder aber die Hybridisierung nur einer Sonde statt, ist die Akzeptorfluoreszenz nicht durch die selektive Anregung der Donor-Fluorophore anregbar. Damit wird - das bei der in situ Hybridisierung - Auswaschen nicht gebundener Sonden - überflüssig. Somit wird der erfindungsgemäße Nachweis hochspezifisch.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann der Identifikation von Zielzellen dienen. Dazu kann als Ziel-Nukleinsäure eine für die Zielzelle spezifische exprimierte mRNA ausgewählt werden. Die für die Ziel mRNA spezifischen Sonden können beispielsweise mit Fluorescein als Donor-Fluorophor und mit Rhodamin als Akzeptor-Fluorophor markiert werden. Diese Vorgehensweise eignet sich zur Identifikation fötaler Zellen in maternalem Blut.
In weiteren möglichen Ausführungsformen können die in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführten "Fluorophoren-Pärchen" verwendet werden:
Durch Anregungs-Emissions-Spektroskopie (AES) kann anschließend ein spezifischer FRET in einer Zellsuspensionen nachgewiesen werden und somit der eindeutige Nachweis der Zielzellen erfolgen. Vorteilhafterweise kann dazu eine Zellsuspension in einer Küvette im Anregungs-Emissions-Spekrometer analysiert werden. Die Anregung erfolgt dabei beispielsweise durch eine Xenon-Lichquelle mit Anregungs-Monochromator oder alternativ durch geeignete Laser (z. B. Argon-Laser zur Fluorescein-Anregung). Die Emission kann durch eine CCD-Kamera mit vorgeschaltetem Nachweismonochromator analysiert werden.
Ein FRET kann in einer alternativen Ausführunsgform des erfindungsgemäßen Verfahrens auch im Fluoreszenzmikroskop (z. B. Axiovert 135, Zeiss) bei einer geeigneten Filterkombination aus einem Anregungs-Filter und einem Emissions-Filter untersucht werden. Einzelne Zellen können somit im Mikroskop aufgrund einer Akzeptorfluoreszenz nach selektiver Donoranregung identifiziert werden.
Darüber hinaus ist es vorteilhaft, das Verfahren mit weiteren Fluoreszenz- Untersuchungen beispielsweise einer DAPI-Färbung der Zeltkerne, oder mit Antikörper-Färbungen oder einer weiteren mRNA-FRET-in situ-Hybridisierung zu kombinieren, um eine sehr hohe Zellspezifität zu erreichen.
Eine Identifikation und Auftrennung von Zielzellen aus einem Zellgemisch kann auch mittels eines Fluoreszenz-gestützten Durchflußzytometers (FACS) erfolgen. Diese sind besonders geeignet für die selektive Anregung und Emissions-Analyse auf Einzelzellebene. Hierbei kann die Anregung durch eine Xenon-Lichtquelle mit vorgeschaltetem Anregungsmonochromator oder durch einen geeigneten Laser (z. B. Argon-Laser zur Fluorescein- Anregung) erfolgen. Die Emission im Bereich der Akzeptor-Fluoreszenz wird als Separationskriterium eingesetzt. Nur Zellen mit Akzeptorfluoreszenz, mit einem FRET als Nachweis der spezifischen Nukleinsäure werden aussortiert. Weitere Kriterien, wie z. B. Zell-Größe (Forwardscatter) können zusätzlich zur Separation eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur spezifischen Detektion und Separierung fötaler Zellen (nukleierte Erythrozyten oder Trophoblasten) aus dem peripheren Blut schwangerer Frauen. Als fötalspezifische ZielmRNA eignet sich insbesondere die mRNA des g-Globingens (für fötale Erythrozyten) oder Trophoblasten-spezifische mRNAs (für Trophoblasten).
Dazu kann das periphere Blut der Schwangeren zunächst vorgereinigt werden, um anschließend die Fraktion mit fötalen Zellen mit den markierten Oligonukleotiden zu inkubieren. Anschließend werden die Zellen im Fluoreszenz-gestützten Durchflußzytometer (FACS) separiert. Hierbei wird spezifisch der Donor-Fluoreszenz-Farbstoff angeregt und die Emission des Akzeptors analysiert. Es können nur die Zellen, welche die Ziel mRNA hybridisiert mit beiden Oligonukleotiden enthalten, eine FRET-bedingte Akzeptor- Fluoreszenz zeigen.
Auf diese Weise können hochspezifisch die fötalen Zellen (mit Akzeptorfluoreszenz) aussortiert werden. Um die Empfindlichkeit der Methode zu steigern kann zur Anregung ein Laser eingesetzt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Fig. 1 bis 4 sowie anhand eines Ausführungsbeispiels des näheren erläutert.
Fig. 1 Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens:
Die Oligonukleotide (Sonden) mit dem Donor-Fluoreszenzfarbstoff (F = Flourescein) bzw. dem Akzeptor-Fluoreszenzfarbstoff (R = Rhodamin) hybridisieren mit der Ziel-Nukleinsäure (hier mRNA eines Zielgens) und erreichen damit eine enge räumliche Nachbarschaft. Wird der Donor selektiv angeregt, kommt es zu einem FRET, der eine meßbare Emission des Akzeptorfarbstoffs erzeugt.
Fig. 2 Fluoreszenzspektren und FRET-Messung

a) Anregungs- und Emissionsspektrum von Flurescein und Rhodamin. Der Bereich in dem Emissions-Spektrum von Fluorescein, der mit dem Anregungsspektrum von Rhodamin überlappt, ist grau hinterlegt. Die Pfeile zeigen die Anregung und Detektion der FRET-Messung.
b) Anregungs-Emissions-Spektroskopie (AES)

Fig. 3, 3a) Zweidimensionale Darstellung der FRET-Spektroskopie links: positiver FRET-Nachweis (siehe Pfeil); rechts: Kontrolle ohne Ziel-mRNA
3b) FRET-Spektroskopie Emissions- und Anregungs-Spektren links: Emissions-Spektrum bei Anregung bei 468 nm, positiver FRET mit Ziel-Transkript und Kontrolle ohne Ziel mRNA. Der FRET-Effekt zeigt sich in der Verschiebung der Emssion, der Reduktion der Fluorescein-Emission bei 520 nm um 35% und dem Anstieg der Rhodamin-Emission bei 620 nm gegenüber dem Kontrollexperiment. Rechts ist das Anregungsspektrum gezeigt, optimaler FRET wird bei Anregung mit 468 nm erreicht und nicht, wie erwartet, beim Anregungs-Optimum von Fluorescein (490 nm). Bei Anregung mit dem Argon-Laser (488 nm) ist ein sehr guter FRET nachweisbar.
Fig. 4 Flußdiagramm für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der nicht-invasiven Pränataldiagnostik

Ausführungsbeispiel

Nachweis und Deparation fötaler Zellen aus dem peripheren Blut von Schwangeren.
Als fötalspezifische Ziel-mRNAs eignet sich insbesondere die mRNA des γ- Globingens (für fötale Erythrozyten) oder Trophoblasten-spezifische mRNAs (für Trophoblasten).
Das periphere Blut der Schwangeren wird zunächst vorgereinigt, um anschließend die Fraktion mit fötalen Zellen mit den markierten Oligonukleotiden (Sonden) zu inkubieren.

Oligonukleotide

Geeignete Oligonukleotide sind:
Die Oligonukleotide können nach Vorgabe der Firma MWG-Biotech AG, Ebersberg hergestellt werden. Fötaler DNA-Seguenzabschnitt Homo sapiens Gamma-Globin am ersten Intron (SEQ. ID No. 3. SEQ. ID No. 4)

mRNA Gamma-Globin mit Markierung für 5 bp-Abstand (SEQ. ID. No. 5)

Zellinie

Die Zellinie K-562 (Chronische myelogene Leukämie, human) stammt von einer 53 jährigen, an chronischer myelogener Leukämie erkrankten Frau. Die Zellen wurden aus einer pleuralen Effusion (Lozzo und Lozzio, 1975) isoliert. Sie exprimieren fötales Hämoglobin (Hb F).
Die Zellinie dient als Modell für fötale Erythrozyten und kann von American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, USA bezogen werden.

Transfektion der Zellen

Zur Transfektion der Zellen mit den Oligonukleotiden (Sonden) wurde nach der Calciumphosphat-Methode gearbeitet. Der Standardansatz gestaltet sich wie folgt:
Als Kontrolle dient jeweils ein Ansatz mit nur je einer Sonde (γ-Globin-D und γ-Globin-A).
Die Oligonukleotide und Wasser werden gemischt und mit 2 M CaCl₂ versetzt. Unter ständigem Vortexen werden anschließend 150 µl 2 × HBS Phosphatpuffer langsam hineinpipettiert. Die Lösung sollte danach leicht trüb sein, verursacht durch das Calciumphosphat-DNA-Präzipitat. Dieser Ansatz wird 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Transfektionslösung wird nachfolgend langsam zu den zu transfizierende Zellen (Zeltzahl: 10⁶) zugeben.
Die Transfektionszeit beträgt 8 bis 16 Stunden. Die K-562-Zellen befinden sich in suspensorischer Lösung und müssen nicht trypsiniert werden. Die K-562-Zellen werden in Greinerröhrchen überführt und mit 1000 rpm für 3 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet mit 5 ml PBS resuspendiert. Der Ansatz wird erneut für 3 Minuten bei 1000 rpm zentrifugiert. Noch einmal wird der Überstand verworfen und das Pellet in 1,5 ml PBS (Phosphate Buffered Saline: 137 mM NaCL, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM KH₂PO₄, pH 7,1) resuspendiert. Die resuspendierten transflzierten K-562-Zellen werden im Anregungs-Emissionsspektrometer oder alternativ im Fluoreszenz-gestützten Durchflußzytometer analysiert.

Anregungs-Emissions-Spektrometie

Der gewaschene Transfektionsansatz mit 10⁶ K-562-Zellen wird direkt in die Messküvette des AE-Spektrometers überführt.
Die Anregungs-Emissions-Spektroskopie ist eine Fortführung und Erweiterung der etablierten statischen Fluoreszenz-Spektroskopie. Bei der AES wird beim Durchlaufen eines gewünschten Wellenlängenbereichs zur Anregung eines Fluorophors gleichzeitig für jede Anregungswellenlänge ein Emissionsspektrum im gewünschten Wellenlängenbereich aufgenommen. Die AE- Spektren enthalten wesentlich mehr Information über die statischen Fluoreszenzeigenschaften als herkömmliche Fluoreszenz-Spektren.
Der hier zugrunde liegende Aufbau des Meßsystems ist in Abb. 2b dargestellt. Licht mit einem kontinuierlichem Spektrum wird über Linsen auf den Eintrittsspalt des Anregungsmonochromators fokussiert. In diesem wird das Licht durch ein Plangitter spektral zerlegt und das Spektrum auf den Austrittsspalt abgebildet. Dessen Breite bestimmt den Ausschnitt des Spektrums, das durch den Spalt hindurchtreten kann. Von dort austretend wird das Licht über eine Fokussierlinse auf die Meßküvette gelenkt, welche durch eine verschiebbare Probenhalterung so eingestellt ist, daß das effektive Meßvolumen in der vorderen Ecke und der dem Nachweismonochromator zugewandten Seite liegt. Der gesamte Meßbereich liegt während der Messung unter einem mattschwarzen Gehäuse, welches nur Öffnungen für den Eintritts- und Austrittsstrahl besitzt.
Die Detektion des emittierten Lichts erfolgt rechtwinklig zum eintretenden Lichtstrahl und wird durch eine zwischengeschaltete Optik auf die Eintrittsöffnung des Nachweismonochromators fokussiert. In diesem wird das Licht wiederum durch ein Gitter spektral zerlegt. In der Austrittsebene des Nachweismonochromators ist ein Bildverstärker nachgeschaltet. Das Fluoreszenzlicht wird dann mit Hilfe einer CCD-Kamera detektiert.
Aus der mit Hilfe des Programms DaVis 5.1.2 rechnergesteuerten Bildaufnahme errechnet das Programm die Falschfarbendarstellung der Bilder. Um genügend Intensität zu erhalten wird ein Rohdatenbild über 300-500 Einzelbilder summiert. Aus diesen wird dann ein gemitteltes horizontales Profil erstellt, welches dem statischen Spektrum dieser Anregungswellenlänge entspricht. Durch das Aneinanderreihen der Profile verschiedener Anregungswellenlängen erhält man dann ein AE-Spektrum. Diese so erhaltenen Bilder enthalten die statischen Anregungsspektren in vertikaler Richtung und die statischen Emissionsspektren in horizontaler Richtung. Somit enthält ein AE-Spektrum (Abb. 3) aufgrund seiner Zweidimensionalität wesentlich mehr Informationen. Anhand des Nachweises eines FRET können somit die Zielzellen (z. B. 562-Zellen) qualitativ und hochspezifisch nachgewiesen werden.

Floureszenz-gestützte Durchflusszytometrie

Der gewaschene Transfektionsansatz mit 10⁶ K-562-Zellen wird mit anderen Zellen gemischt oder direkt zur Separation im PASIII-FACS-Gerät (PARTEC, Münster) eingesetzt. Die Anregung erfolgt durch einen 488 nm Argon-Laser. Die Emission wird bei 613 nm analysiert. Zusätzlich kann DAPI-Färbung der Zellkerne analysiert werden. Routinemäßig kann die Partikel bzw. Zellgröße bestimmt werden (Forewardscatter). Die FRET-positive Zeilpopulation wird gezählt und im Fraktionssammler aufgefangen. Die im Hüllstrom verdünnten Zellen werden je nach Zellzahl per Cytospin auf einen Objektträger zentrifugiert und im Fluoreszenzmikroskop kontrolliert. Die separierten Zellen können nun jeder gewünschten Diagnostik unterzogen werden. Referenzen Andrew P, Barnes WL. (2000) Förster energy transfer in an optical microcavity. Science. 290: 785-788.
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Claims

1. Verfahren zur Identifikation von Zielzellen mit folgenden Schritten

- in-situ Hybridisieren einer Zelityp spezifischen Nukleinsäure mit mindestens einer ersten Sonde mit einem Donor-Fluorophor und einer zweiten Sonde mit Akzeptor-Fluorophor, wobei das Emissionsspektrum des Donor-Fluorophor mit dem Anregunsspektrum des Akzeptorfluorophors mindestens überlappt;

- Anregen der Donor-Fluorophore und

- Nachweis der Emission der Akzeptor-Fluorophore.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Zelltyp spezifische mRNA.

3. Verfahren nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch γ-Globulin als Zelltyp spezifische mRNA und mindestens ein Oligonukleotid der SEQ. ID. No. 1 oder SEQ. ID. No. 2 als erste oder zweite Sonde.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch mindestens einen Donor-Fluorophor ausgewählt aus der Gruppe der Moleküle Fluoroscein (FITC), Morin Phosphin R3 oder BFP11 und mindestens einen Akzeptor-Fluorophor ausgewählt aus der Gruppe der Moleküle Rhodamin (Rox), Rhodamin (TRITC), Rhodamin B, QSY-7 dye, Thiazinrot R, Lissamin-Rhodamin (RB 200) oder RSGFP4.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch den Nachweis der Emission des Akzeptor-Fluorophors mittels Fluoreszenz-Spektroskopie.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch den Nachweis der Emission des Akzeptor-Fluorophors mittels Fluoreszenzmikroskopie.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch den Nachweis der Emission des Akzeptor-Fluorophors mittels fluoreszenzunterstützter Durchflußzytometrie.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch eine Kernfärbung oder eine FISH.

9. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur nicht-invasiven Pränataldiagnostik.

10. Kit zum Nachweis einer Nukleinsäure enthaltend ein erstes Oligonukleotid mit einer Donor-Fluorophore und ein zweites Ologonukleotid mit einer Akzeptorfluorophore, wobei das Emissionsspektrum der Donor- Fluorophore mit dem Anregungsspektrum der Akzeptor-Fluorophore mindestens überlappt.

11. Kit nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch mindestens einen Donor-Fluorophor ausgewählt aus der Gruppe der Moleküle Fluoroscein (FITC), Morin Phosphin R3 oder BFP11 und mindestens einen Akzeptor-Fluorophor ausgewählt aus der Gruppe der Moleküle Rhodamin (Rox), Rhodamin (TRITC), Rhodamin B, QSY-7 dye, Thiazinrot R, Lissamin-Rhodamin (RB 200) oder RSGFP4.

12. Kit nach Anspruch 10 oder 11, gekennzeichnet durch mindestens eines der Oligonukleotide der SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2.

13. Verwendung des Kits nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zum Nachweis fötaler mRNA.

14. Verwendung des Kits nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur nicht invasiven Pränataldiagnostik.

15. Verwendung des Kits nach Anspruch 12 zum Nachweis γ-Globulin spezifischer mRNA.